JPH11506792A - 皮膚疾患治療のためのビタミンｄ４誘導体の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規な１α−ヒドロキシビタミンＤ₄および新規な類似体である１，２５ヒドロキシビタミンＤ₄よび１，２４ジヒドロキシビタミンＤ₄が提供される。これらは、カルシウム代謝疾患および種々の皮膚疾患を治療する医薬組成物の活性化合物として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 皮膚疾患治療のためのビタミンＤ４誘導体の使用 技術分野 本発明は生物学的に活性なビタミンＤ₄化合物に関する。より具体的には本発 明は、新規な１α−ヒドロキシビタミンＤ₄およびその合成に使用される新規な 中間体、新規な１，２５ジヒドロキシビタミンＤ₄および新規な１，２４ジヒド ロキシビタミンＤ₄に関する。 本発明はまた、医薬的に有効量の新規な１α−ヒドロキシビタミンＤ₄化合物 を含む医薬組成物、および該新規な化合物の医薬的有効量を投与することによっ て異常なカルシウム代謝を制御する方法に関する。 背景 ビタミンＤは動物およびヒトのカルシウム代謝の調節に重要であることが分か っている（Harrison's Principals of Internal Medicine（ハリソンの主内科学 ）：11部、“Disorders of Bone and Mineral Metabolism(骨疾患と無機質代謝) 335 章”、E．Braunwaldら編、pp.1880-1865、McGraw-Hill 刊、ニューヨーク(1 987)参照）。ビタミンＤの最も一般的に知られている２つの有用な形態はビタミ ンＤ₃およびビタミンＤ₂である。ビタミンＤ₃は動物およびヒトの皮膚で内因的 に合成され、一方、ビタミンＤ₂は植物によって供給されるビタミンＤの形態で ある。ビタミンＤ₂は、Ｃ２２とＣ２３との間に二重結合を含むという点と、さ らにＣ２４メチル基を含むという点でビタミンＤ₃と異なる。ヒトおよびラット では、ビタミンＤ₃とビタミンＤ₂は同等な生物学的能力を有する。 照射２２，２３−ジヒドロ−エルゴステロールまたは２２，２３−ジヒドロビ タミンＤ₂または２２，２３−ジヒドロエルゴカルシフェロールとしても知られ るビタミンＤ₄は、Ｃ２４メチル基を含む点でビタミンＤ₃と異なる。ビタミンＤ₄ は１９３６年に初めて記載された(W．Grab，Z．Physiol．Chem.，243:63(1936) ; F.G．McDonald，J．Biol．Chem.，114:IVX(1936); A．Windaus & G．Trautman n，Z．Physiol．Chem.，247:185-188(1937))。これらの文献では、 ラットの場合ビタミンＤ₄の活性はビタミンＤ₃の１／３または３／４で、ニワト リの場合ビタミンＤ₃の１／１０または１／５と報告され、ビタミンの生物学的 活性に関していくぶん不一致がある。 ビタミンＤ₄の生物学的活性についてより信頼性の高い研究がデルーカらによ って行われた（DeLucaら、Arch．Biochem．Biophys.，124:122-128(1968)）。著 者らはビタミンＤ₄はビタミンＤ₃より活性が低いことを確認した。デルーカらの 報告によれば、彼らの実験ではラットの場合ビタミンＤ₄の活性はビタミンＤ₃ま たはビタミンＤ₂の２／３で、ニワトリの場合ビタミンＤ₃の１／５であった。 デルーカらは、“ビタミンＤ₄が最初に記載（Windhaus & Trautmann）されて 以来、見たところその合成はほとんど使用されなかった”という事実に言及し、 “それは、おそらくビタミンＤ₄には学問的興味しかないという事実によるもの であろう”と説明している。 出願人らの知るところでは、デルーカらの報告以来新たなビタミンＤ₄の研究 について認識していないので、ビタミンＤ₄は依然として“単なる学問的興味” として止まっている。実際、メルクインデックスはビタミンＤ₄に関して“その 生物学的活性は疑わしい”と述べている（Merck Index，S．Budavari編、11版、 Merck & Co.,刊、Rahway，ニュージャージ(1989)、pp.1679，#9930）。 デルーカらはビタミンＤ₃の活性形態（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃） （米国特許第3697559 号）およびその合成前駆体(１α−ヒドロキシビタミンＤ₃ )(米国特許第3741996 号)を発見したので、興味の大半はこれら活性なビタミン Ｄ₃代謝物の治療的用途を開発することに集中した。残念ながら、ビタミンＤ₃代 謝物が治療薬剤として極めて有望であったが、一方、その有望さはこれら薬剤の 強い毒性のために完全には認知されなかった。例えば、毒性によってビタミンＤ₃ 、その活性形および類似体の骨損失防止または損失骨再生の有効性は制限され る。有効な骨損失防止または骨再生のためにこれらの薬剤に求められる用量では 、高カルシウム血症および高カルシウム尿症が問題となることが多くの研究によ って示唆されている。日量２μｇ／日（幾つかの研究ではこの用量は骨損失防止 に有効であることが示された）の１α−ヒドロキシビタミンＤ₃は約６７％の患 者に毒性をもたらすことが報告された。現在必要とされているものは、治 療薬として実際に役立つ毒性の低い生物学的に有効なビタミンＤ代謝物である。 発明の要旨 本発明の新規な化合物、１α−ヒドロキシビタミンＤ₄、１，２５−ジヒドロ キシビタミンＤ₄および１，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄はビタミンＤ₄の生 物学的な活性形である。本発明者らは、ビタミンＤ₄のこれら活性形が、以前に 報告されたビタミンＤ₄のバイオアッセイを基に予測されたものよりはるかに強 い生物学的能力を発揮することを見出した。本発明者らはまた、生物学的に活性 を有するこの新規な化合物は、それらの生物学的能力を基に予測されたものより もはるかに毒性が低いことを見出した。高い活性と低い毒性というこの組み合わ せによって、本発明の化合物はカルシウム代謝疾患の治療薬として有用なものに なった。本発明の新規な化合物は、異常なカルシウム代謝によって誘発される疾 患に対する医薬組成物の活性な化合物として有利に用いられる。 本発明の新規な化合物を調べるために、それらの製造工程を樹立することが必 要であった。１α−ヒドロキシビタミンＤ₄は合成によって製造され、当該合成 過程で新規な中間体もまた製造された。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₄お よび１，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄は、１α−ヒドロキシビタミンＤ₄の代 謝の生物学的産物として分離される。 本発明の具体的応用、組成物の種々の変型および物理的化学的特性に関する他 の利点並びにより完全な理解は、添付の図面とともに以下の詳細な説明を検討す ることによって得られるであろう。 図面の簡単な説明 本発明は以下では添付の図面とともに詳述するが、全体を通して同じ名称は同 じ構成成分を指す。 図１は、ビタミンＤ₄合成の製造工程を示す。 図２は、Ｄ₄を用いて開始する１α−ヒドロキシビタミンＤ₄合成の製造工程を 示す。 詳細な説明 本発明は、合成１α−ヒドロキシビタミンＤ₄（１α−ＯＨ−Ｄ₄）化合物とと もにビタミンＤ₄のトシル化誘導体および環状誘導体を提供する。 本明細書で用いられるように、“生物学的活性”または“生物学的に活性”と いう用語は、代謝に影響を与えるような生化学的特性、例えば血清カルシウム濃 度に影響を与えるか、または適切なレセプタータンパク質に結合する（例えばビ タミンＤレセプタータンパク質に結合する）生化学的特性を指すために用いられ る。 本発明の特徴の１つは下記一般式（Ｉ）の生物学的に活性な化合物である： 式中、Ｒ₁はＨまたはＯのいずれか、Ｒ₂はＨまたはＯのいずれか並びにその塩、 水和物および溶媒化物である。式（Ｉ）の化合物の中で好ましいものは、Ｒ₁お よびＲ₂がともにＨであるもの、Ｒ₁＝ＯＨでＲ₂＝Ｈであるもの、およびＲ₁＝Ｏ Ｈであるものである。 本発明の別の特徴は式（Ｉ）の化合物の製造を含む。１α−ヒドロキシビタミ ンＤ₄（すなわちＲ₁およびＲ₂がＨである式（Ｉ）の化合物）の合成は、図１お よび２に示した模式図にしたがって達成される。合成では開始物質としてエルゴ ステロールが用いられる。エルゴステロールは、バートンらの方法（Bartonら、 JCS Perkin I，1976,821-826）と同様な方法を用いて、６段階の工程で側鎖が飽 和され２２，２３−ジヒドロエルゴステロール（VIII）が得られる。続いて２２ ，２３−ジヒドロエルゴステロールを文献(Windausら、Z．Physiol．Chem.，147 :185(1937))にしたがって照射し、ビタミンＤ₄〔２２，２３−ジヒドロエ ルゴカルシフェロール〕（XI）が得られる。図２に示したように、その後パーレ ンの方法（Paarenら、J．Org．Chem，45:3253(1980)）と同様な方法を用いて、 ビタミンＤ₄を４段階工程でヒドロキシル化して１α−ヒドロキシビタミンＤ₄が 得られる。 特に、エルゴステロールはアセチル化されて３β−酢酸塩を生じる。この酢酸 エルゴステロールに５，６二重結合の位置でヒドロキシハロゲン付加を実施し、 ６α−クロロ−５α−ヒドロキシ誘導体を形成する。このクロロヒドリンを還元 し、さらに再アセチル化で５α−ヒドロキシ（すなわち５α−オール）誘導体を 得る。この５α−オールに水素を付加し側鎖を飽和させる。得られた３β−アセ トキシエルゴスト−７エン−５α−オールを還元して２２，２３デヒドロエルゴ ステロールアセテートとし、これを順次還元して２２，２３デヒドロエルゴステ ロールが得られる。続いて２２，２３デヒドロエルゴステロールを照射してビタ ミンＤ₄を形成する。この後ビタミンＤ₄をトシル化して３β−トシルビタミンＤ₄ が得られる。このトシル化物を加溶媒分解により入れ換えて６−メトキシ−３ ，５−シクロビタミンＤ₄を得る。このシクロビタミンＤ₄にアリル位置酸化を実 施して１α−ヒドロキシシクロビタミン誘導体を得る。引き続いてこの１α−ヒ ドロキシシクロビタミン誘導体を加溶媒分解して、ディールス・アルダー型反応 に付す。この反応によって、５−メトキシ基が除去され、１α−ヒドロキシビタ ミンＤ₄（５，６−シス）が５，５トランス−１α−ヒドロキシビタミンＤ₄から 分離される。 １α−ヒドロキシビタミンＤ₄の１，２４ジヒドロビタミンＤ₄および１，２５ ジヒドロキシビタミンＤ₄代謝物は、１α−ヒドロキシ誘導体をヒト肝細胞とと もに保温してこれらの細胞を培養し、１，２４ジヒドロキシまたは１，２５ジヒ ドロキシビタミンＤ₄を回収することによって合成される。ビタミンＤレセプタ ータンパク結合テストを用いて、これら代謝物は生物学的に活性を有することが 決定される。 式（Ｉ）の化合物は重要な薬理的活性、すなわちカルシウム代謝（特に血清カ ルシウム濃度）の制御薬剤としての活性を有することが分かった。特に、式（Ｉ ）の化合物は、ビタミンＤ欠乏のラットで血清カルシウム濃度を高める。さらに ま た、式（Ｉ）の化合物は毒性が低いことが分かったが、このことはそれらの医薬 的特性を高める。ＬＤ₅₀試験で測定したとき式（Ｉ）の化合物は毒性を有するが 、この毒性は対応するビタミンＤ₂化合物のそれと同じで、対応するビタミンＤ₃ 化合物のそれより低い。したがって、本発明の化合物は種々の臨床医学分野およ び獣医学分野に応用可能で、特にカルシウムおよび燐の異常代謝の治療に有用で ある。 また別の特徴では、本発明は、例えば異常なカルシウム代謝（例えば肝不全、 腎不全、胃腸不全などによって惹起される）を治療するためにカルシウム代謝を 調節する方法を含む。式（Ｉ）の化合物は、ビタミンＤ欠乏疾患および関連疾患 （例えば腎性骨ジストロフィー、脂肪便、鎮痙薬性骨軟化症、低リン酸血症性ビ タミンＤ抵抗性くる病、骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイ ド誘発性骨粗鬆症および骨重量の低下を特徴とする他の病的状態を含む）、擬似 欠乏性（ビタミンＤ依存性）くる病、栄養性および吸収不良性くる病、上皮小体 機能低下症による二次的骨軟化症および骨減少症、手術後上皮小体機能低下症、 特発性上皮小体機能低下症、仮性上皮小体機能低下症およびアルコール中毒症） の予防的および治療的処置のために用いることができる。 式（Ｉ）の化合物（好ましくはＲ₁またはＲ₂がＯＨ）、例えば１α、２４ジヒ ドロキシビタミンＤ₄は、過剰増殖性皮膚疾患（例えば乾癬）、湿疹、適切な皮 膚硬度の欠如、水分過剰、皮脂分泌の治療に重要である。そのような皮膚疾患の 治療に用いられる特に好ましいものは、１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄ の（Ｒ）立体異性型、すなわち１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシビタミンＤ₄で 実質的にその（Ｓ）型を含まないか、または少量の（Ｓ）型と結合しているもの である。したがって、本発明は、皮膚疾患に罹患している患者に治療的に有効量 の式（Ｉ）の化合物（好ましくはＲ₁またはＲ₂がＯＨである）、例えば１α、２ ４−ジヒドロキシビタミンＤ₄を投与することによる当該皮膚疾患の治療方法を 提供する。より好ましくは、１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシビタミンＤ₄（実 質的にその（Ｓ）型を含まない）である式（Ｉ）の化合物である。 式（Ｉ）の化合物（好ましくはＲ₁またはＲ₂がＯＨ）、例えば１α，２４ジヒ ドロキシビタミンＤ₄はさらにまた、悪性細胞（すなわち癌細胞）の過剰増殖 活性の抑制に重要である。換言すれば、式（Ｉ）の化合物（特に例えば１α，２ ４ジヒドロキシビタミンＤ₄）は、悪性細胞に曝したとき抗増殖性薬剤として作 用する。抗増殖性薬剤として用いられる特に好ましいものは１α，２４ジヒドロ キシビタミンＤ₄の（Ｒ）立体異性体、すなわち１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキ シビタミンＤ₄で、実質的にその（Ｓ）型を含まないか、または少量の（Ｓ）型 と結合しているものである。したがって、本発明は、有効量の式（Ｉ）の化合物 （好ましくはＲ₁またはＲ₂がＯＨである式（Ｉ）の化合物（例えば１α，２４ジ ヒドロキシビタミンＤ₄））を用いて悪性細胞（例えばヒト癌細胞）を処理する （すなわちそれらの過剰増殖活性を抑制する）方法を提供する。より好ましいも のは、１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシビタミンＤ₄で実質的にその（Ｓ）型を 含まない式（Ｉ）の化合物である。当該有効量の範囲は約１μｇ／回から約５０ ０μｇ／回の範囲である。癌のこれら治療で特に重要なものは、皮膚癌の治療を 目的とした式（Ｉ）の化合物の使用で、これは本発明のまた別の特徴である。 特に式（Ｉ）の化合物は乳癌および大腸癌の治療に重要である。本発明の別の 特徴は、乳癌および大腸癌の患者に治療的有効量の式（Ｉ）の化合物、好ましく はＲ₁たはＲ₂がＯＨである式（Ｉ）の化合物（例えば１α，２４ジヒドロキシビ タミンＤ₄）を投与することによる、乳癌および大腸癌の過剰増殖性細胞作用を 治療する方法である。より好ましいものは、１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシビ タミンＤ₄で実質的にその（Ｓ）型を含まない式（Ｉ）の化合物である。 式（Ｉ）の化合物は、さらに非癌性皮膚疾患、例えば皮膚炎（接触性および異 所性）の治療に有用である。 式（Ｉ）の化合物は、例えば異常なカルシウム代謝によって生じる疾患に用い る場合、既知のビタミンＤ₃の活性類似体と較べて副作用が少なく毒性が低い医 薬組成物の活性化合物として有用である。これらの医薬組成物は本発明のまた別 の特徴である。 本発明の薬理学的に活性な化合物は、患者（例えばヒトを含む哺乳動物）に投 与する医薬の製造を目的とした通常の調剤方法にしたがって加工することができ る。例えば、式（Ｉ）の化合物は、通常の賦形剤（例えば医薬的に許容できる担 体物質）との混合物として用いてもよい。これら担体物質は、当該活性化合物と 有害な反応を生じない、経腸的（例えば経口）、非経口的、または局所的適用に 適切である。 適切な医薬的に許容される担体には水、塩類溶液、アルコール、アラビアゴム 、植物油（例えばトウモロコシ油、綿実油、ピーナツ油、オリーブ油、ココナッ ツ油）、魚肝油、油状エステル（例えばポリソルベート(Polysorbate)８０）、 ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えば乳糖、アミロースまたは 澱粉）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘稠パラフィン、脂肪酸 モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒ ドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに 限られるものではない。 当該医薬調製物は滅菌可能で所望の場合は補助剤とともに混合してもよい。補 助剤は例えば潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調節用塩類、緩 衝液、着色剤、香料および／または１つまたは２つ以上の他の活性化合物、例え ばビタミンＤ₃またはＤ₂およびそれらの１α−ヒドロキシル付加代謝物、共役エ ストロジェンまたはその同等物、抗エストロジェン、カルシトニン、ビホスホネ ート、カルシウム補充剤、コバロミン、百日咳菌毒素およびホウ素である。 非経口的用途のために特に適切なものは、注射可能な滅菌溶液（好ましくは油 質溶液または水性溶液）の他に懸濁剤、乳剤または埋め込み物（座薬を含む）で ある。アンプルは便利な単回投与形態である。 癌（例えば皮膚癌、乳癌および大腸癌）の治療では、式（Ｉ）の化合物、好ま しくは１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄，より好ましくは１α，２４（Ｒ ）−ジヒドロキシビタミンＤ₄（実質的にその（Ｓ）型を含まない）の非経口投 与量は約０．５μｇから約５０μｇ／回である。 増殖過剰皮膚疾患（例えば乾癬）の治療では、式（Ｉ）の化合物、好ましくは １α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄、より好ましくは１α，２４（Ｒ）−ジ ヒドロキシビタミンＤ₄（実質的にその（Ｓ）型を含まない）の非経口投与量は 約０．５μｇから約５０μｇ／回である。 経腸的用途に特に適切なものは、錠剤、糖衣丸、液体、ドロップ、座薬、ロゼ ンジ、粉末またはカプセルである。シロップ、エリキシルまたは類似物は甘味担 体が必要な場合に用いることができる。 徐放性または放出誘導組成物の製剤化もまた可能である。これらは、例えばリ ポゾームまたは活性化合物が別々に分解される被覆物、例えば微細被包化、多層 コーティングなどで保護されているようなものである。 局所的用途には、適切な非噴霧性の粘稠性、半固体または固体形状を用いるこ とができるが、これらは局所適用に合致し、流動的粘稠性（好ましくは水より大 なもの）を有する担体に含有させることができる。適切な製剤には、溶液、懸濁 剤、乳剤、クリーム、軟膏、パウダー、塗布剤、エアーゾル、経皮用絆創膏など が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの製剤は所望の場合に は滅菌するか、または補助剤（例えば保存料、安定剤、解乳化剤、湿潤剤など） と混合する。 皮膚疾患の治療に有用な本発明の化合物の局所用調製物はまた、上皮形成誘発 剤(例えばレチノイド(例えばビタミンＡ))、クロマノール（例えばビタミンＥ） 、β作動薬（例えばイソプロテレノール）または環状アデノシン一燐酸(ｃＡＭ Ｐ))、抗炎症剤（例えば副腎皮質ホルモン（例えばヒドロコルチゾンもしくはそ の酢酸塩、またはデキサメタゾン）および角質組織形成剤（例えばコールタール またはアントラリン）を含有することができる。そのような薬剤の有効量は、例 えばビタミンＡは組成物の重量で約０．００３から約３％、ビタミンＥは約０． １から約１０％、イソプロテレノールは約０．１から約２％、ｃＡＭＰは約０． １から約１％、ヒドロコルチゾンは約０．２５％から約５％、コールタールは約 ０．２％から約２０％、アントラリンは約０．００５％から約２％である。 皮膚疾患の局所治療では、式（Ｉ）の化合物、好ましくは１α，２４−ジヒド ロキシビタミンＤ₄、より好ましくは１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシビタミン Ｄ₄（実質的にその（Ｓ）型を含まない）の局所適用組成物中の投与量は、約１ μｇから約１００μｇ／グラム組成物である。 癌（すなわち皮膚癌、乳癌および大腸癌）の治療では、式（Ｉ）の化合物、好 ましくは１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄，より好ましくは１α，２４（ Ｒ）−ジヒドロキシビタミンＤ₄（実質的にその（Ｓ）型を含まない）の局所適 用組成物中の投与量は、約１μｇから約１００μｇ／グラム組成物である。 増殖過剰皮膚疾患（例えば乾癬）の治療では、式（Ｉ）の化合物、好ましくは １α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄、より好ましくは１α，２４（Ｒ）−ジ ヒドロキシビタミンＤ₄（実質的にその（Ｓ）型を含まない）の局所用組成物中 の投与量は、約１μｇから約１００μｇ／グラム組成物である。 直腸投与では、化合物は、座薬基剤（例えばカカオ油または他のトリグリセリ ド）を含有する医薬組成物として形成される。保存期間を延長させるために、組 成物に抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシアニソールまたは ヒドロキノン）を含有させることができる。 本発明の医薬組成物は経口投与が好ましい。一般に、本発明の化合物は、約０ ．５μｇから約２５μｇを含む単回投与形態として医薬的に許容できる投与１回 分の担体中に分散される。本発明の化合物の投与量は、一般に約０．０１から約 ０．５μｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．０４から約０．３μｇ／ｋｇ／日であ る。 個々の事例において実際に好ましい量は、用いられる個々の化合物、個々の製 剤化組成物、適用態様、処置される器官の位置と機構によって変動することは理 解されよう。例えば、個々の患者についての具体的な投与量は年令、体重、一般 的な健康状態、性別、食事、投与のタイミングと態様、排出速度、併せて用いら れる医薬および治療の対象となっている個々の疾患の重篤度によって変動する。 ある患者に必要な投与量は通常の考察、例えば本発明の化合物と既知の薬剤のそ れぞれ異なる活性を慣習的な方法（例えば通常の適切な薬理学的プロトコル）を 用いて比較することによって決定することができる。 さらにまた別の特徴として、本発明の化合物は獣医用組成物、例えば低カルシ ウム血症の予防または治療のための家畜用飼料組成物としても有利に用いること ができる。一般に、本発明の化合物は、当該動物用飼料を普通に消費したとき動 物に約０．０１から約０．５μｇ／ｋｇ／日を提供できるように飼料に調合され る。 以下の実施例は単に本開示の未だ詳述されていない部分の説明を目的とし、い かなる意味においても制限を目的とするものではない。以下の実施例では、別に 指定しないかぎり温度は全て℃で表され、割合および％は全て重量による。陽子 核磁気（¹ＨＮＭＲ）スペクトルは、IBM Sy-200（200mHz）およびアスペクト300 0コンピュータ支援Bruker Am-400(400mHz)を用い、内部標準としてＣＨＣｌ₃を 含むＣＤＣｌ₃中で記録した。赤外線スペクトルは、サンプルを臭化カリウム（ ＫＢｒ）ペレットまたは液体として用いてフーリェ変換（ＦＴＩＲ）により記録 した。質量スペクトルは、Finnigan MAT-90 質量計測器を用いて２０ｅＶ／Ｃｌ で記録した。融点は、Hoover-Thomas(毛細管)Uni-MeltおよびFisher-Johns融点 装置で決定した。実施例１：１α−ヒドロキシビタミンＤ₄の合成 １００ｇ（０．２５モル）のエルゴステロールを６００ｍｌの無水ピリジンお よび６８ｍｌ（０．７モル）の無水酢酸に溶解させ、エルゴステロール（II）を エルゴステロールアセテートに変換した。この溶液を室温で一晩攪拌し、その後 １．２Ｌの氷を加えて溶液を冷却し沈殿物を得た。この沈殿物を１回４００ｍｌ の水で５回、さらに４００ｍｌのＣＨ₃ＣＮで１回洗浄した。生じた生成物を風 乾し、７９ｇのエルゴステロールアセテートを白色結晶固体として得た（７１％ ）。これは以下の特性を有する；融点（m.p.）：１６９−１７１℃；¹ＨＮＭＲ ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）、δｐｐｍ２．０５（３Ｈ，ｓ，３β−ＣＨ₃Ｃ Ｏ）４．６５−４．７５（１Ｈ，ｍ，３α−Ｈ）、５．１５−５．２５（２Ｈ，ｍ ，２２−Ｈおよび２３−Ｈ）、５．４（１Ｈ，ｄ，６−Ｈ）、５．６（１Ｈ，ｄ ，７−Ｈ）；ＦＴＩＲ〔ＫＢｒ〕：１７３４ｃｍ^-1（Ｃ＝Ｏストレッチング） ９６８ｃｍ^-1（Ｃ−Ｈベンディング）。 エルゴステロールアセテート（III）（２５ｇｍ、０．０６２Ｍ）を２．５Ｌ の新しく蒸留した脱酸素トルエンに溶解させた。この溶液に２４０ｍｌの乾燥Ｃ Ｈ₂Ｃｌ₂に溶解した９ｍｌ（０．１１１モル）の塩化クロミルを窒素下で３０分 かけて−７８℃で添加した。この反応系をさらに１５分−７８℃で攪拌し、続い てエタノール中の水素化ホウ素ナトリウムの飽和溶液６２ｍｌを一度に加えた。 さらに１５分間−７８℃で攪拌した後、反応溶液を３ＮのＨＣｌ（３Ｌ）とベン ゼン（３Ｌ）の二相系に注入した。有機相を分離し、続いて水（２Ｌ）、塩水溶 液で２回（２×１Ｌ）洗浄し、さらに無水ＭｇＳｏ₄で乾燥させた。この乾燥溶 液を濾過し真空中で濃縮した。粗結晶生成物を続いてＣＨ₃ＣＮ（２８０ ｍｌ）で処理し、このようにして得たスラリーを濾過して１２．５ｇの白色結晶 ３β−アセトキシ−６α−クロロエルゴスタ−７，２２−ジエン−５α−オール （IV）を得た（４１％）。これは以下の特性を有する；m.p.：１９０−１９２℃ ；¹ＨＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）、δｐｐｍ２．０５（３Ｈ，ｓ，３ β−ＯＡｃ）、４．６５（１Ｈ，ｄ，６β−Ｈ）５．１（１Ｈ，ｓ，７−Ｈ）、 ５．１−５．３（２Ｈ，ｍ，２２−Ｈおよび２３−Ｈ）；ＦＴＩＲ〔ＫＢｒ〕： １７３２ｃｍ^-1（Ｃ＝Ｏストレッチング）、９６８ｃｍ^-1（Ｃ−Ｈベンディング ）、３４３７ｃｍ^-1（Ｏ−Ｈストレッチング）。 乾燥ＴＨＦ（９００ｍｌ）中の３β−アセトキシ６α−クロロエルゴスタ−７ ，２２−ジエン−５α-オール（IV）（２１．４ｇ、０．００４４モル）を室温 で乾燥ＴＨＦ（７５０ｍｌ）中の水素化アルミニウムリチウム（２．６６ｇ、０ ．０７モル）の攪拌懸濁液に窒素下で徐々に添加した。この混合物を３時間還流 させて０℃に冷却した。過剰な水素化物を飽和Ｎａ₂ＳＯ₄溶液で分解した。無水 Ｎａ₂ＳＯ₄に通して濾過し、濾過物を乾燥させて固体を得た。これを無水酢酸（ １１０ｍｌ）および乾燥ピリジン（２２０ｍｌ）で０℃で直接処理した。減圧下 で溶媒を除去して酢酸付加物、３β−アセトキシエルゴスタ−７，２２−ジエン −５α−オール（V）（１２．７５ｇ、６１％）を得た。これは以下の特性を有 する；m.p.：２２９−２３２℃；ＦＴＩＲ〔ＫＢｒ〕：１７３６ｃｍ^-1（Ｃ＝Ｏ ストレッチング）、３４６０ｃｍ^-1（Ｏ−Ｈストレッチング）、９７２ｃｍ^-1（ Ｃ−Ｈベンディング）。 ３β−アセトキシエルゴスタ−７，２２−ジエン−５α−オール(V)（２．５ ｇ、０．００５５モル）を新しく調製したＰｔＯ₂とともに酢酸エチル（８２０ ｍｌ）中で水素ガス（１５ｐｓｉ）下で１６時間攪拌した。濾過して触媒を除去 し、濾過物を乾燥させて粗酢酸付加物を得た。これをＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、シリ カゲル上でクロマトグラフィーを実施した。ＣＨ₂Ｃｌ₂による溶出によって実質 的に純粋な３β−アセトキシエルゴスタ−７エン−５α−オール（VI）（２．１ ５ｇ、８５％）を白色結晶物として得た。これは以下の特性を有する；m.p.：２ ２８−２３２℃；¹ＨＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）、δｐｐｍ２．０５ （３Ｈ，ｓ，３β−ＯＡｃ）、５．０５−５．２０（２Ｈ，ｍ ，３α−Ｈおよび７−Ｈ）；ＦＴＩＲ〔ＫＢｒ〕：１７３６ｃｍ^-1（Ｃ＝Ｏス トレッチング）、３４６２ｃｍ^-1（Ｏ−Ｈストレッチング）。 乾燥ピリジン中の再蒸留塩化チオニル（９．７ｍｌ）を乾燥ピリジン（８００ ｍｌ）中の３β−アセトキシエルゴスタ−７エン−５α−オール（VI）（１２． ０ｇ、０．０２６２モル）に添加した。２．５時間後、この溶液を氷冷水（１． ５Ｌ）で希釈し、エーテルで２回（２．５Ｌ＋１．５L）抽出した。一つにまと めたエーテル抽出物をＮａＨＣＯ₃溶液（１．０Ｌ×２）で、続いて１ＮのＨＣ ｌ（１．５Ｌ×２）さらに水（１Ｌ）で洗浄した。このエーテル溶液を乾燥Ｍｇ ＳＯ₄で乾燥させ、濾過し減圧下で乾燥させて粗生成物を得た。これをＣＨ₃ＣＮ （１００ｍｌ）でスラリーにした。濾過により生成物を集め、ＣＨ₃ＣＮから再 結晶化して４．５ｇ（３９％）の白色結晶２２，２３−ジヒドロエルゴステリル アセテート(VII)を得た。これは以下の特性を有する；m.p.：１４４−１４７℃ ；¹ＨＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）、δｐｐｍ２．０５（３Ｈ，ｓ，３ β−ＯＡｃ）、４．６５−４．７５（１Ｈ，ｍ，３α−Ｈ）、５．４（１Ｈ，ｄ ，６−Ｈ）、５．６（１Ｈ，ｄ，７−Ｈ）；ＦＴＩＲ〔ＫＢｒ〕：１７３４ｃｍ^-1 （Ｃ＝Ｏストレッチング）。 ２２，２３−ジヒドロエルゴステリルアセテート（VII）（４．８ｇ、０．０ ０１１モル）を乾燥エーテル（１．１Ｌ）中の水素化アルミニウムリチウム（２ ．５ｇ、０．０６６モル）の攪拌懸濁液に室温で一時に加えた。５ＮのＮａＯＨ を添加し過剰な水素化アルミニウムリチウムを分解し、続いて水（５００ｍｌ) を加えた。この水溶液をエーテルで抽出した（２５０ｍｌ×４）。１つにまと めたエーテル抽出物および１つにまとめた有機相を塩水溶液（１Ｌ）で洗浄し、 そのＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。減圧下でエーテルを蒸発させ、化合物２２，２３ −ジヒドロエルゴステロール（VIII）（４．１ｇ、９４％）を白色結晶物として 得た。これは以下の特性を有する；m.p.：１４７−１５０℃；¹ＨＮＭＲ：（４ ００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）、δｐｐｍ３．６−３．７（１Ｈ，ｍ，３α−Ｈ）、 ５．４（１Ｈ，ｄ，６−Ｈ）、５．６（１Ｈ，ｄ，７−Ｈ）；ＦＴＩＲ〔ＫＢｒ 〕：３４００ｃｍ^-1（Ｏ−Ｈストレッチング）。 ２２，２３−ジヒドロエルゴステロール（VIII）（２．０ｇ、５．０mmol）を ジエチルエーテルおよびベンゼン（４：１、６００ｍｌ）の溶液に溶解させ、攪 拌しながら水冷クォーツ容器中でアルゴン下で３時間照射（Hannovia液浸ランプ 、４５０ワット）を実施した。この溶液を真空中で濃縮してゴム状固体を得た。 これを１００ｍｌのエタノールに再溶解し、アルゴン下で８時間還流させて加熱 した。続いてこの溶液を真空中で濃縮し、残留物をシリカゲルカラムに吸着させ 、ヘキサン中の３０％酢酸エチルで溶出させて、収量１．２ｇ（６０％）でビタ ミンＤ₄（２２，２３−ジヒドロエルゴカルシフェロール）（IX）を得た。これ は以下の特性を有する；¹ＨＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）、δｐｐｍ０ ．５５（３Ｈ，ｓ，１８−Ｈ₃）０．７８（６Ｈ，ｄｄ，２６−Ｈ₃および２７− Ｈ₃）０．８７（３Ｈ，ｄ，２１−Ｈ₃）０．９３（３Ｈ，ｄ，２８−Ｈ₃）３． ９４（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）４．８２（１Ｈ、ｍ（シャープ）、１９−Ｈ）、５． ０４（１Ｈ、ｍ（シャープ）、１９−Ｈ）、６．０４（１Ｈ、ｄ、７−Ｈ）６． ２４（１Ｈ、ｄ、６−Ｈ）。 １０ｍｌの乾燥ピリジン中のビタミンＤ₄（IX）（３．０ｇ、７．５mmol）の 攪拌溶液に新しく再結晶化させた塩化ｐ−トルエンスルホニル（３．６ｇ、１９ mmol）を０℃で添加した。この反応混合物を５℃で２４時間攪拌し、続いて混合 物を氷上に注いで反応を停止させ、攪拌しながらＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ）を 飽和させた。この水性懸濁液をＣＨ₂Ｃｌ₂（３×３００ｍｌ）で抽出した。１つ にまとめた有機抽出物を１０％ＨＣｌで洗浄し（３×２００ｍｌ）、ＮａＨＣＯ₃ （３×２００ｍｌ）を飽和させ、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ真空中で濃縮して、新 規な中間化合物ビタミンＤ₄トシレート（X）（３．５ｇ、８４％）を得た。これ は以下の特性を有する；¹ＨＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）、δｐｐｍ０ ．５４（３Ｈ，ｓ，１８−Ｈ₃）０．７８（６Ｈ，ｄｄ，２６−Ｈ₃および２７− Ｈ₃）０．８７（３Ｈ，ｄ，２１−Ｈ₃）、０．９６（３Ｈ、ｄ、２８−Ｈ₃）２ ．４５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ₃（トシレート））４．６８（３Ｈ、ｍ、３−Ｈ）４． ８２（１Ｈ、ｍ（シャープ）、１９−Ｈ）５．０４（１Ｈ、ｍ（シャープ）、１ ９−Ｈ）、５．９５（１Ｈ、ｄ、７−Ｈ）、６．０９（１Ｈ、ｄ、６−Ｈ）７． ３４および７．７９（４Ｈ、ｄ、芳香性）。 メタノール中のＮａＨＣＯ₃（１７ｇ、２０２mmol）の攪拌懸濁液に乾燥 ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）中のビタミンＤ₄トシレート（X）（３．５ｇ、６．３mm ol）溶液を滴下しながら添加した。反応混合物をアルゴン下で一晩還流させ、そ の後室温に冷却し、約５０ｍｌとなるよう真空中で濃縮した。この反応濃縮物を エーテル（６００ｍl）で希釈し、水（３×３００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄上 で乾燥させ真空中で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムに通し、ヘキサン中の １０％酢酸エチルで溶出させて、新規な中間化合物３，５シクロビタミンＤ₄（X I）（重い油）を収量１．５ｇ（５８％）で得た。これは以下の特性を有する；¹ ＨＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）、δｐｐｍ０．５５（３Ｈ，ｓ，１８ −Ｈ₃）０．７８（６Ｈ，ｄｄ，２６−Ｈ₃および２７−Ｈ₃）、０．８７（３Ｈ ，ｄ，２１−Ｈ₃）、０．９４（３Ｈ、ｄ、２８−Ｈ₃）、３．２８（３Ｈ、ｓ， ＯＣＨ₃）４．２（１Ｈ、ｄ、６−Ｈ）、４．９１（１Ｈ、ｍ（シャープ）、１ ９−Ｈ）、４．９８（１Ｈ、ｄ、７−Ｈ）、５．０８（１Ｈ、ｍ（シャープ）、 １９−Ｈ）。 ３つの頸部をもつフラスコに入れた乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５０ｍｌ）中の二酸化 セレニウム（０．２２ｇ、２mmol）の攪拌懸濁液に、トルエン（３Ｍ）（２．６ ｍｌ、７．８mmol）中の無水tert−ブチルヒドロペルオキシドを加えた。この混 合物を３時間アルゴン下で攪拌した。続いてピリジン（０．３ｍｌ、３．７mmol ）を加え、その後シクロビタミンＤ₄（XI）（１．５ｇ、３．６mmol）をＣＨ₂Ｃ ｌ₂（５０ｍｌ）中の溶液として導入した。３０分攪拌後、１０％のＮａＯＨ水 溶液（２００ｍｌ）を加えた。この反応混合物を続いてエーテル（５００ｍｌ） で希釈し、相を分離させた。有機相を１０％ＮａＯＨ（３×２００ｍｌ）、水（ ２×２００ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ溶液（２×２００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳ Ｏ₄上で乾燥させ真空中で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムに吸着させ、ヘ キサン中の３０％酢酸エチルで溶出させて新規な中間化合物１α−ヒドロキシ３ ，５−シクロビタミンＤ₄（XII）（油）（０．４５ｇ、２９％）を得た。これは 以下の特性を有する；¹ＨＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）、δｐｐｍ０． ５４（３Ｈ，ｓ，１８−Ｈ₃）０．７８（６Ｈ，ｄｄ，２６−Ｈ₃および２７−Ｈ₃ ）０．８６（３Ｈ，ｄ、２１−Ｈ₃）０．９５（３Ｈ、ｄ、２８−Ｈ₃）３．２ ６（３Ｈ、ｓ，ＯＣＨ₃）４．２ （１Ｈ、ｄ、６−Ｈ）４．２２（１Ｈ、ｍ、１−Ｈ）、４．９５（１Ｈ、ｄ、７ −Ｈ）、５．１８（１Ｈ、ｄ、１９−Ｈ）５．２５（１Ｈ、ｄ、１９Ｈ）。 ジメチルスルホキシド（４．５ｍｌ）および氷酢酸（３．６ｍｌ）の溶液中の １α−ヒドロキシ３，５−シクロビタミンＤ₄（XII）（０．４５ｇ、１．０５mm ol）の溶液をアルゴン下で１時間５０℃に加熱した。続いて反応混合物を氷と飽 和ＮａＨＣＯ₃溶液（１００ｍｌ）上に注ぎ、エーテル（３×２００ｍｌ）で抽 出した。１つにまとめたエーテル抽出物を飽和ＮａＨＣＯ₃溶液（３×２００ｍ ｌ）、水（３×２００ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ溶液（３×２００ｍｌ）で洗浄 した。ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、真空中で濃縮して５，６−シスおよび５，６− トランス１α−ヒドロキシビタミンＤ₄（¹ＨＮＭＲで約４：１）を０．４ｇ（９ ２％）の収量で得た。５，６−シスおよび５，６−トランス１α−ヒドロキシビ タミンＤ₄（０．４ｇ、０．９７mmol）の混合物を酢酸エチル（２５ｍｌ）に溶 解させ、新しく再結晶化させた無水マレイン酸（０．０８ｇ、０．８mmol）で処 理した。この反応混合物をアルゴン下で２４時間加熱した。真空中で溶媒を蒸発 させた後、粗混合物をシリカゲルカラム上で溶媒として酢酸エチルとヘキサン（ １：１）を用いてクロマトグラフィーを行い、収量９０ｍｇ（２３％）でビタミ ンＤ₄の新規な活性型、５，６−シス１α−ヒドロキシビタミンＤ₄（XIII）を得 た。これは以下の特性を有する；m.p.：１２８−１３０℃；ＩＲｖ_max（ニート ）：３４００ｃｍ^-1（ＯＨストレッチング）；¹ＨＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，Ｃ ＤＣｌ₃）、δｐｐｍ０．５５（３Ｈ，ｓ，１８−Ｈ）０．７９（６Ｈ，ｄｄ， ２６−Ｈ₃および２７−Ｈ₃）０．８７（３Ｈ、ｄ、２１−Ｈ₃）０．９４（３Ｈ 、ｄ、２８−Ｈ₃）、４．２４（１Ｈ、ｍ、３−Ｈ）、４．４４（１−Ｈ）、５ ．０２（１Ｈ、ｍ（シャープ）、１９−Ｈ）、５．３４（１Ｈ、ｍ（シャープ） 、１９−Ｈ）、６．０２（１Ｈ，ｄ，７−Ｈ）、６、４（１Ｈ、ｄ，６Ｈ）；質 量スペクトル〔Ｃｌ〕ｍ／ｅ（相対的濃度）：４１５（Ｍ＋１、４１％）３９７ 、（Ｍ＋１−ＯＨ１００％）、３７９（２７％）、１３５（２２％）。実施例２：１α−ヒドロキシビタミンＤ₄の生物学的試験 離乳したばかりの雄のラット（ホルツマン系、Holtzman Company、マジソン、 ウィスコンシン）を適切なカルシウム（０．４７％）および燐（０．３％）を含 むビタミンＤ欠乏食で飼育した。３−４週間以内に、この飼料によって低血清カ ルシウムと発育不良を特徴とする極度のビタミンＤ欠乏症が誘発された。この飼 料で飼育後４週間でラットの血清カルシウム値は７ｍｇ／ｍｌ未満であった。こ れらのラットを続いて４群に分け、担体（例えばココナッツ油）を含む１α−ヒ ドロキシビタミンＤ₄または担体（コントロール）を１４日間毎日経口的に投与 した。最後の投与後２４時間して、ラットを殺処分し血中カルシウムを標準的な 実験室手技で測定した。これらの測定値の結果を表１に示す。 表１の結果は、１α−ヒドロキシビタミンＤ₄はビタミンＤ欠乏ラットの血清 カルシウムの増加に有効であることを示し、さらにその反応は用量依存性である ことを示している。驚くべきことに、この反応レベルは、１，２５ジヒドロキシ ビタミンＤ₃についてWientroub らが報告したもの（上記で述べたものと同様な 実験条件下でビタミンＤ欠乏ラットに投与された）と比較して優れているようで ある（S．Wientroub，P.A．Price，A.H．Reddi，“The Dichotomy in the Effec ts of 1,25 dihydroxy vitamin D₃ and 24,25 dihydroxy vitamin D₃ on Bone G amma-Carboxyglutamic Acid-Containing Protein in Serumand Bone in vitamin D-Deficient Rats”（ビタミンＤ欠乏ラットの血清および骨中の骨ガンマカル ボキシグルタミン酸タンパクに対する１，２５ジヒドロキシビタミンＤ₃と２４ ，２５ジヒドロキシビタミンＤ₃の二分された効果）、Calcif．Tissue Int．40: 166-172(1987)）。実施例３：毒性試験 既知の方法を用いて平均致死量（ＬＤ₅₀）を測定してラットにおける経口急性 毒性を調べた。ラットは標準的な実験室用飼料で８−１０週間飼育した。それぞ れの性別の５匹の動物に１α−ＯＨ−Ｄ₄の経口投与１回を与え、１４日間観察 し死亡数を記録した。ＬＤ₅₀値は雄で１．０ｍｇ／ｋｇ、雌で３．０ｍｇ／ｋｇ であることが分かった。 出願人らが行った比較では、同じ条件下での１α−ヒドロキシビタミンＤ₂の ＬＤ₅₀値は、それぞれ雄および雌で１．７および１．８ｍｇ／ｋｇであることが 分かった。１α−ヒドロキシビタミンＤ₂の毒性は、１α−ヒドロキシビタミン Ｄ₃よりも少ないと以前に報告された(G.Sjoden，C．Smith，U．Lindgren & H.F ．DeLuca，Proc．Soc．Experimental Biol．Med.，178:432-436(1985))。実施例４：１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₄の生成と分離 本発明の１α−ヒドロキシビタミンＤ₄を代謝して１，２５ジヒドロキシビタ ミンＤ₄を含むいくつかの生成物を生じる培養ヒト肝細胞とともに当該１α−ヒ ドロキシビタミンＤ₄を保温する。この１，２５代謝物を高圧液体クロマトグラ フィーで分離し精製し、ガスクロマトグラフィー質量分析で同定する。結合実験 によって、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ₄は哺乳類のビタミンＤレセプター タンパクと良好な結合親和性を有することが明らかになり、それが生物学的に活 性を有することが示唆された。使用方法は文献に記載されたものと同様である(S trugnellら、Biochem．Pharm.，40:333-341(1990))。実施例５：１，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄の生成と分離 １，２４−ヒドロキシビタミンＤ₄の生成および分離は上記実施例４に記載し たように達成される。本発明の１α−ヒドロキシビタミンＤ₄を代謝して１，２ ４ジヒドロキシビタミンＤ₄を含むいくつかの生成物を生じる培養ヒト肝細胞と ともに当該本発明の１α−ヒドロキシビタミンＤ₄を保温する。この１，２４代 謝物を高圧液体クロマトグラフィーで分離し精製し、ガスクロマトグラフィー質 量分析で同定する。当該新規な代謝物との結合実験によって、該代謝物は哺乳類 のビタミンＤレセプタータンパクと良好な結合親和性を有することが明らかにな り、このことは当該薬剤が生物学的に活性を有することを示唆する。実施例６：高カルシウム血症試験 雌のラットをカルシウム（０．８％）と燐（０．６％）を含む市販の飼料で飼 育する。このラットを４群に分け、各群に担体（例えばココナッツ油）を含む１ α−ＯＨＤ₄または担体のみ（コントロール）のいずれかを毎日経口的に投与す る。最後の投与後２４時間して、ラットを殺処分し、血清カルシウムを標準的な 方法で測定する。 この工程によって血清カルシウム濃度は、２．５μｇ／ｋｇ／日までの１α− ＯＨ−Ｄ₄の投与量では影響を受けないか、またはわずかに上昇することが明ら かになった。実施例７：他の生物学的試験 雄の離乳ラットをビタミンＤ欠乏、低カルシウム（０．０２％）飼料で飼育す る。４週間経過後、このラットを４群に分け、担体（例えばエタノール）を含む １α−ＯＨＤ₄または担体のみ（コントロール）のいずれかを静脈投与する。投 与後１６時間して、ラットを殺処分し、マーティンとデルーカの方法(Martin & DeLuca，Am．J．Physiol.，216:1352-1359)にしたがい外転十二指腸サックを用 いて腸のカルシウム輸送を測定する。 この方法によって腸のカルシウム輸送が用量依存態様で亢進されることが明ら かになった。実施例８： ５５才から７５才の閉経後骨粗鬆症の外来患者で臨床実験が実施される。この 実験には３つの治療群に任意に分けた１２０人の患者が含まれ、実験は１２から ２４か月継続される。この治療群のうち２群は、一定量の１α−ビタミンＤ₄（u ,i,d.；３．０μｇ／ｋｇを越える２通りの異なる投与量レベル）を与えられ、 他の群は対応する偽薬を投与される。患者は全て通常の食事によるカルシウム摂 取（５００から８００ｍｇ／日）を維持し、カルシウム補充剤の使用を控える。 効能は、（ａ）全身骨、橈骨、大腿骨および／または脊椎骨の鉱質密度（Ｘ線吸 収測定法（DEXA）で測定）、（ｂ）腸骨稜の骨生検および(c)血清オステオカル シンの測定について患者群を処置前と処置後で比較することによって評価する。 安全性は、尿中ヒドロキシプロリン排出、血清および尿中カルシウムレベル、ク レアチニンクリアランス、血中尿素窒素並びに他の日常的な測定を比較すること によって評価する。 この実験によって、１α−ビタミンＤ₄で処置された患者は、全身骨、橈骨、 大腿骨および／または脊椎骨密度は、偽薬処置患者に較べて著しい増加を示すこ とが明らかになった。処置患者はまた、血清オステオカルシンの顕著な上昇を示 した。処置患者の骨生検によって、１α−ビタミンＤ₄は正常な骨形成を促進す ることが示された。安全性指標のモニタリングによって、高カルシウム血症、高 カルシウム尿症または１α−ビタミンＤ₄療法による他の一切の代謝攪乱の傾向 は些少であることが確認された。実施例９： ５５才から６０才の健常な閉経後女性で臨床実験を実施する。この実験では任 意に２つの治療群に分けられた８０人が含まれ、実験は１２から２４か月継続さ れる。１つの治療群は一定量の１α−ビタミンＤ₄（u.i.d.;３．０μｇ／日を越 える投与レベル）を与えられ、他の群は対応する偽薬を与えられる。この実験は 上記実施例２で示したように実施される。 この実験によって、１α−ビタミンＤ₄処置患者は、基準値と比較して全身骨 、橈骨、大腿骨および／または脊椎骨密度の損失が減少することが明らかになっ た。対照的に、偽薬処置患者は基準値と比較してこれらのパラメーターにおいて 顕著な損失を示した。安全性指標のモニタリングによって、この投与量レベルで の１α−ビタミンＤ₄の長期的投与の安全性が確認された。実施例１０： １２ヵ月にわたる偽薬コントロール二重盲検臨床試験を腎疾患をもつ３０人の 男女で実施する。これらの男女は長期的に血液透析を受けている。全患者が８週 間のコントロール期間を経る。この期間に彼らは維持量のビタミンＤ₃（４００ ＩＵ／日）を与えられる。このコントロール期間の後、患者は任意に２つの処置 群に分けられる。１群は一定量の１α−ビタミンＤ₄（u.i.d.;３．０μｇ／日よ り多い投与量）を与えられ、他の群は適合する偽薬を与えられる。両処置群は維 持量のビタミンＤ₃の投与を受け、食事性カルシウムの通常の摂取を維持してカ ルシウム補充剤の使用を控える。効能は、（ａ）腸カルシウム吸収の 直接測定、（ｂ）全身骨、橈骨、大腿骨および／または脊椎骨の鉱質密度、およ び(c)血清カルシウムおよびオステオカルシンの測定について２つの患者群を処 置前と処置後で比較することによって評価する。安全性は、血清カルシウムの通 常のモニタリングによって評価する。 この臨床データの分析によって、１α−ビタミンＤ₄は顕著に血清オステオカ ルシンレベルおよび腸のカルシウム吸収（単一または二重同位元素技術を用いて 測定）を増加させることが示された。この化合物で処置された患者は、正常な血 清カルシウムレベルを示し、さらに基準値と比較して全身骨、橈骨、大腿骨およ び／または脊椎骨密度について安定した値を示す。対照的に、偽薬で処置された 患者はしばしば低カルシウム血症を示し、全身骨、橈骨、大腿骨および／または 脊椎骨密度について顕著な減少を示す。処置群の高カルシウム血症の傾向は些少 である。実施例１１ ： １．０ｍｇの１α，２４−ジヒドロキシ−ビタミンＤ₄を１ｇのアーモンド油 に溶解させて局所用クリームを調製する。この溶液に４０ｇの鉱物油と２０ｇの 自己乳化蜜ろうを加える。この混合物を加熱して融解させる。生じたクリームは 、クリーム１ｇにつき約１０μｇの１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄を含 む。実施例１２： ３０ｇのアーモンド油に１α，２４−ジヒロキシビタミンＤ₄を溶解させて軟 膏を調製する。溶解させるために十分に暖めた７０ｇの白色軟パラフィンをこの 溶液に加える。この軟膏をよく混合し冷却させる。当該軟膏は軟膏１ｇにつき約 １０μｇの１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄を含む。実施例１３： ０．５gのアデノシンと２．０ｇのパパベリン基剤（両方とも最小量のジメチ ルスルホキシドに溶解）を実施例１２の軟膏に十分に混合しながら加える。当該 付加成分は約０．５重量％（アデノシン）および２重量％（パパベリン）の範囲 で含まれる。実施例１４： 最小量の植物油に溶解した１００００ＵのビタミンＡを実施例１２の軟膏に十 分に混合しながら加える。得られた軟膏は、軟膏１ｇにつき約１００Ｕのビタミ ンＡを含んでいる。実施例１５： 皮膚用ローションは、１００ｇの乾燥プロピレングリコールに１．０ｍｇの１ α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄を溶解させて調製する。ローションは褐色 びんで冷蔵庫に保存する。当該ローションは、ローション１ｇにつき１０μｇの １α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄を含んでいる。実施例１６： １ｇのアーモンド油に０．２ｍｇの１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄を 溶解させる。この溶液に４０ｇの鉱物油と２０ｇの自己乳化蜜ろうを加え、さら に４０ｍｌの熱水を加える。この混合物をよく混合し、クリーム１ｇにつき約２ ．０μｇの１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄を含む化粧用クリームを製造 する。実施例１７： 実施例１６にしたがって調製した化粧用クリームに１００ｍｇのアデノシンを 加える。このクリームをよく混合する。当該クリームは０．１重量％のアデノシ ンを含んでいる。実施例１８： １００μｇの１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄を３０ｇのアーモンド油 に溶解して軟膏を調製する。このように調製した溶液に、溶解させるために十分 に暖めた７０ｇの白色軟パラフィンを添加する。この軟膏をよく混合し、さらに 冷却する。このようにして製造した軟膏は、軟膏１ｇにつき約１．０μｇの１α ，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄を含んでいる。実施例１９： 実施例１８の化粧用軟膏に最小量の植物油に溶解した２００Ｕ／ｇのビタミン Ａを十分に混合しながら添加する。実施例２０： １００ｇの乾燥プロピレングリコールに３００μｇの１α，２４−ジヒドロキ シビタミンＤ₄を溶解させて化粧用ローションを調製する。このローションは褐 色びんに入れ冷蔵庫で保存する。当該ローションは、ローション１ｇにつき約０ ．３μｇの１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄を含んでいる。実施例２１：皮膚病理組織学試験 １α，２４−ジヒドロキシビタミン₄含有組成物を皮膚炎（接触性および異所 性）の局所治療における当該組成物の治療効能について評価する。被験組成物は 、ワセリン−アーモンド油を基剤にした軟膏１ｇにつき１０μｇの１α，２４− ジヒドロキシビタミンＤ₄を含む軟膏である。コントロール組成物は、活性成分 の１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄を含まないという点を除き同一である 。患者は外来診療所で治療を受ける。患者には１日に２回該調製物を使用するよ うに指示を与える。 該軟膏は、可能な限りただ１ヵ所の病巣または当該疾患領域に用る。軟膏とそ の容器は治療開始前に重量を計量し、さらに治療終了後に再び計量するために一 切の未使用内容物は容器に戻す。 治療病巣領域を測定し記録し、必要な場合には該病巣の写真を適切な“コント ロール病巣”とともに撮影する。コントロール病巣は、好ましくは同じサイズで 同じ進行段階の病巣で、さらに当該病巣の近辺にあるかまたは対称的に反対側に ある病巣である。当該病巣を次に撮影する場合に再現可能なように関連する撮影 方法の詳細（距離、アパーチャー、アングル、背景など）を記録する。軟膏は１ 日に２回使用し、好ましくは被覆しない。“コントロール”病巣は未処置のまま とするが、それが可能でない場合は用いた治療を記録する。 紅斑、結痂および肥厚の評価は、該病巣の０から３までの等級付けによる重篤 度とともに医師が毎週実施する。最終評価は、通常４−６週間の治療後に実施す る。１α，２４−（ＯＨ）₂Ｄ₄で処置した病巣はコントロール病巣よりも低いス コアを有していた。高カルシウム血症の些少の傾向もまた認められた。実施例２２：上皮細胞の分化と増殖試験 最初にラインワルトとグリーンが記載した系(Rheinwald & Green，Cell 6:331 (1975))に既知の修正を加えてヒトケラチノサイトを培養する。エタノールに溶 解した１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄を細胞に添加し、エタノール濃度 が０．５％ｖ／ｖを越えないようにして０．０５から５μｇ／ｍｌの種々の濃度 をつくる。コントロール培養には最終濃度０．５％ｖ／ｖでエタノールを補充す る。 培養中の上皮細胞の分化と増殖を以下により調べる： １．角質化膜の定量； ２．平板に付着した細胞の細胞密度の定量； ３．トランスグルタミナーゼ活性のモニタリング；または ４．³Ｈチミジンの取り込みによるＤＮＡ合成のモニタリング １α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄とともに保温した培養は、コントロー ル培養よりも角質化膜が多く、付着細胞は少なく、トランスグルタミナーゼ活性 は高く、ＤＮＡ合成は少ない。実施例２３：ＨＬ−６０細胞分化アッセイにおける１α，２４−（ＯＨ）₂Ｄ₄の 活性 デルーカとオストロム（H.F．DeLuca & V.K．Ostrom，Prog．Clin．Biol．Res .，259:41-55(1988)）が記載したように、ＨＬ−６０細胞分化アッセイで１α， ２４−（ＯＨ）₂Ｄ₄についてドースレスポンス実験を実施する。この実験では、 陽性コントロールとして１α，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃を用い、適切な溶媒を陰性コ ントロールとして用いる。以下の変数を評価する：非特定酸エステラーゼ活性、 ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）還元およびチミジン取り込み。結果は、 １α，２４−（ＯＨ）₂Ｄ₄はＨＬ−６０前骨髄細胞の単球への分化を促進する強 い活性を有することを示した。実施例２４：ヒト癌細胞株における１α，２４−（ＯＨ）₂Ｄ₄の抗増殖活性 一連のヒト癌細胞株で１α，２４−（ＯＨ）₂Ｄ₄についてドースレスポンス実 験を実施する。これらの細胞株には、文献(H.L．Shlehら、Chem．Biol．Interac t.，81:35-55(1982))に記載されているように以下の株、ＢＣＡ−１また はＺＲ−７５−１（乳癌）およびＣＯＬ−１（大腸癌）が含まれるが、これらに 限定されるものではない。これらの結果によってチミジン取り込みで判定したと き、１α，２４−（ＯＨ）₂Ｄ₄強い（さらに可逆性の）抗増殖活性を有すること が示された。実施例２５：乾癬の治療 １α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄含む経口投与製剤の治療効能について 皮膚炎（接触性および異所性）の治療を二重盲検試験によって評価する。被験製 剤は１．０から１０．０μｇの１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄含んでい る。患者は外来診療所で治療を受け、実験集団とコントロール集団に分けられる 。彼らは朝食前の朝に１日１回該医薬を服用するように指示される。 それぞれの患者（実験およびコントロール群）で、通常は布で覆った病巣を含 む皮膚領域が選択され、患者には試験のために選択した皮膚領域を日光に曝さな いよう指示を与える。病巣領域を吟味して記録し、さらに当該病巣の写真を撮影 する。当該病巣を次に撮影する場合に再現可能なように関連する撮影方法の詳細 （距離、アパーチャー、アングル、背景など）を記録する。 紅斑、結痂および肥厚の評価は医師が毎週実施する。最終評価は、通常４−６ 週間の治療後に実施する。これらの試験の結果は、１α，２４−（ＯＨ）₂Ｄ₄を 毎日傾向投与することによってコントロール患者と比較して紅斑、結痂および肥 厚の程度が減少することを示した。 本発明を上記に詳述し、さらにある程度特定して例示してきたが、これまで詳 述してきたものに適用可能な種々の改変（変更、付加および省略を含む）につい ては当業者には明白であろう。したがって、これらの改変はまた本発明に包含さ れ、本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ビショップ チャールズ ダブリュー アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53719 マディソン ラ ポイント テラ ス ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記式（Ｉ）の化合物の有効量でヒト皮膚癌細胞を処置することを含むヒト 皮膚癌細胞の過剰増殖活性を抑制する方法。 （式中、Ｒ₁はＨまたはＯＨのいずれかで、Ｒ₂はＨまたはＯＨのいずれか並び にその塩、水和物および溶媒和物である。） ２．下記式（Ｉ）の化合物の治療的有効量を皮膚疾患を罹患する患者に投与する ことを含む皮膚疾患の治療方法。 （式中、Ｒ₁はＨまたはＯＨのいずれかで、Ｒ₂はＨまたはＯＨのいずれか並び にその塩、水和物および溶媒和物である。） ３．下記式（Ｉ）の化合物の治療的有効量を皮膚炎を罹患する患者に投与するこ とを含む皮膚炎の治療方法。 （式中、Ｒ₁はＨまたはＯＨのいずれかで、Ｒ₂はＨまたはＯＨのいずれか並び にその塩、水和物および溶媒和物である。） ４．下記式（Ｉ）の化合物の治療的有効量を乾癬を罹患する患者に投与すること を含む乾癬の治療方法。 （式中、Ｒ₁はＨまたはＯＨのいずれかで、Ｒ₂はＨまたはＯＨのいずれか並び にその塩、水和物および溶媒和物である。） ５．下記式（Ｉ）の化合物の治療的有効量をヒトに投与することを含む、ヒト皮 膚癌の細胞増殖作用、乾癬、湿疹、皮膚の水分過剰および皮脂分泌を軽減させる ためにヒトを処置する方法。 （式中、Ｒ₁はＨまたはＯＨのいずれかで、Ｒ₂はＨまたはＯＨのいずれか並び にその塩、水和物および溶媒和物である。） ６．下記式（Ｉ）の化合物の有効量をヒトに投与することを含むある効果を患者 で達成する方法であって、当該効果が皮膚癌、乾癬、湿疹、皮膚の水分過剰また は皮脂分泌の治療であり、当該量が細胞の増殖活性を抑制させるために十分で、 それによって当該効果を達成する前記ある効果を達成する方法。 （式中、Ｒ₁はＨまたはＯＨのいずれかで、Ｒ₂はＨまたはＯＨのいずれか並び にその塩、水和物および溶媒和物である。） ７．式（Ｉ）の化合物が１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ₄である請求の範 囲第１、２、３、４、５または６項のいずれかに記載の方法。 ８．式（Ｉ）の化合物が１α，２４（Ｒ）−ジヒドロキシビタミンＤ₄で、その （Ｓ）型を実質的に含まない請求の範囲第１、２、３、４、５または６項のいず れかに記載の方法。 ９．当該量が局所的に投与される請求の範囲第１、２、３、４、５または６項の いずれかに記載の方法。 10．さらに当該投与段階が、レチノイド、クロマノール、β作動薬、抗炎症剤、 角質形成剤およびその組み合わせから成る群から選ばれる第二の薬剤を投与する ことを含む請求の範囲第９項の方法。 11．当該量が経口的に投与される請求の範囲第１、２、３、４、５または６項の いずれかに記載の方法。 12．当該量が非経口的に投与される請求の範囲第１、２、３、４、５または６項 のいずれかに記載の方法。 13．当該組成物が、医薬的に許容できる担体中に１α，２４−ジヒドロキシビタ ミンＤ₄の（Ｒ）立体異性を含み、その（Ｓ）型異性体を含まない改良された 治療用組成物。 14．当該組成物が局所組成物であって、さらに当該１α，２４−ジヒドロキシビ タミンＤ₄が約１μｇから１００μｇ／グラム組成物の濃度で含まれる請求の範 囲第１３項の組成物。