JPH11506360A

JPH11506360A - 最終滅菌骨原性デバイスおよびその調製

Info

Publication number: JPH11506360A
Application number: JP8529785A
Authority: JP
Inventors: エム．タッカー，マジョリー; シー．ルーガー，デイビッド; ティー．サンパス，クバー
Original assignee: Stryker Corp
Current assignee: Stryker Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-06-08
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: EP1334733B1; EP0837701A1; JP3483870B2; ATE232401T1; EP1334733A2; US6028242A; EP1334733A3; DE69636824T2; AU714963B2; US6013856A; US20020106394A1; AU6333596A; EP0837701B1; WO1996040297A1; DE69626205D1; ATE350068T1; DE69636824D1; JP2002191686A; US6461630B1; US5674292A

Abstract

(57)【要約】哺乳動物に移植するための最終滅菌骨原性デバイスが開示される。そのデバイスは生物活性骨原性タンパク質と不溶性キャリアとの組み合わせを含み、組み合わせ後、イオン化放射線への曝露、例えばガンマ線または電子線への曝露により滅菌される。本発明の最終滅菌デバイスは、それらが哺乳動物への移植後に、骨形成を誘導することが特徴である。また、本発明の最終滅菌デバイスを哺乳動物のあらかじめ選定された位置に移植することにより、哺乳動物に骨形成を誘導する方法も開示されている。また本発明の最終滅菌デバイスを調製する方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】最終滅菌骨原性デバイスおよびその調製発明の技術分野本発明は一般に骨原性デバイスの分野に関し、そしてより特定すると、哺乳動物に移植後、骨形成を誘導し得る最終滅菌骨原性デバイスに関する。発明の背景治療用デバイス、より特定すると骨原性デバイスは、典型的には意図されたレシピエントに移植する前に滅菌される。滅菌は、デバイスが潜在的な病原体、またはその他の生物感染性物質を意図された患者に導入しないことを保証するために必要である。不溶性のキャリア材料と組み合わされた骨原性タンパク質を含む骨原性デバイスは、哺乳動物のあらかじめ選択された位置（例えば骨折部位）に骨形成を誘導するのに有用である。それ故、キャリア材料と骨原性タンパク質とは、典型的には別々に滅菌され、次いで滅菌移植可能デバイスを製造するために組み合わされる。しかしながら、この方法は、得られたデバイスの滅菌性を保証し得ない。 2個以上の部品(component)を含むデバイスを滅菌する最も望ましい方法は、当該分野で「最終滅菌」と呼ばれるプロセスによる。このプロセスにより、デバイスは調合後、すなわちデバイス中にすべての部品を相互に組み合わせた後に滅菌される。最終滅菌に用いるために多様な物理的および化学的手法が開発されており、例えばそれらは化学物質または熱に曝露、またはイオン化または非イオン化放射線に曝露することを含む。しかしながら、これらの方法は固有の問題を有し得る。例えば、化学滅菌に有用な化学試薬、または反応副生成物は意図されたレシピエントに有害で有り得る。従って、このような化学物質はデバイスの移植前に除去しなければならない。エチレンオキシドとホルムアルデヒドとが滅菌試薬として普通に使用される試薬である。しかしながら、どちらもアルキル化剤であり、従って生物活性分子を修飾し不活化し得る。さらにこれらの化学物質は共に発癌性物質であり突然変異誘発物質である（Davisら、（1973年）「Microbiology、第２版」、Harper and Row Publishers）。同様に、デバイスが生物活性タンパク質を必要とする場合、タンパク質が変性し、その結果、熱に曝露することで不活化され得るため、デバイスを高温に曝すことは望ましくない。イオン化および非イオン化放射線に曝露することによる対象物の滅菌は、潜在的に毒性のある化学物質を加える必然性がなくなるが、放射線エネルギーおよび/または酸素フリーラジカルを含むその副生物はタンパク質のコンフォーメーションを変化させる可能性があり、従ってタンパク質を損傷または不活化し得る。さらに、ある種の医学的に重要なポリマー、例えばポリウレタンまたはポリメチルメタクリレートをガンマ線に曝露することは、ポリマーに当座または長期の物理的変化を与える結果となり得る。従って、哺乳動物のあらかじめ選ばれた位置に移植した場合、その位置に骨を生成し得る最終滅菌骨原性デバイスを提供することが、本発明の目的の一つである。他の目的は、デバイスの生物活性および/または生体適合性を損なわずに最終滅菌骨原性デバイスの一般的プロセスを提供することである。また、本発明の他の目的は、哺乳動物のあらかじめ選ばれた位置に、本発明の最終滅菌デバイスを用いて骨形成を誘導する方法を提供することである。本発明のこれらの目的および特徴は、以下の説明、図面および請求の範囲で明らかになるであろう。発明の要旨不溶性キャリア材料と組み合わせて生物活性タンパク質、例えば骨原性タンパク質を含む最終滅菌治療用デバイス、特に骨原性デバイスは、イオン化放射線に曝露して滅菌した場合、哺乳動物に移植すると骨および/または軟骨を誘導し得るということが見出された。生物活性タンパク質をイオン化放射線に曝すと、タンパク質を化学修飾および不活化する結果となる事が知られているため、この発見は予想外である。その最も広い局面で、本発明は、哺乳動物に移植した場合、骨および/または軟骨生成を誘導する、哺乳動物に移植するための最終滅菌骨原性デバイスを提供する。このデバイスは（a）不溶性キャリアと生物活性骨原性タンパク質とを組み合わせて、骨原性デバイスを形成する工程、および次いで（b）骨原性タンパク質の生物活性を維持しながらデバイスを滅菌する条件下で、工程（a）の組み合わせをイオン化放射線に曝露する工程により製造される。得られた滅菌デバイスは最終滅菌されているが、哺乳動物に移植後なお、骨および/または軟骨形成を誘導し得ることを特徴とする。本明細書で用いられる「滅菌」という用語は、骨原性デバイスと関連した実質的にすべての生存生物、特に微生物、ウイルスおよび他の病原体を除去するための物理的または化学的手段のいずれかを用いる行動または方法のことである。本明細書で使用される滅菌されたデバイスとは、FDA（Federal Drug Administrati on）規格で測定して10^-6の滅菌保証レベルを達成したデバイスを含むことが意図される。本明細書で使用する「最終滅菌」という用語は、本発明のデバイスの制作における最終工程において、不溶性キャリア材料が骨原性タンパク質と組み合わされた後に滅菌される工程を言う。本明細書で使用される「イオン化放射線」という用語は、物（例えば本明細書で意図される治療用デバイス）を通過するときに直接イオン化を生じるに十分なエネルギーを有する粒子またはフォトンを言う。本明細書で使用される「骨原性デバイス」という用語は、哺乳動物に移植した場合、骨形成を誘導する能力を有するいずれものデバイスを言う。本明細書に記載するデバイスはまた、滑膜性連結環境中の肋軟骨下骨表面のような哺乳動物の無血管部位に移植した場合、関節軟骨形成を誘導する能力を有する。本明細書で使用する「骨」という用語は、主としてヒドロキシアパタイト・コラーゲン（主にＩ型コラーゲン）の形の沈着カルシウムおよびリン酸塩と、骨芽細胞、骨細胞および溶骨細胞、ならびに真正軟骨性骨の内部で形成する骨髄組織のような骨細胞との複合体を含む石灰化（鉱物化）結合組織を言う。本明細書で使用される「軟骨」という用語は、コラーゲンのフィブリル（主としてII型コラーゲンと共に他の少数のタイプ、例えばIX型およびXI型）、種々のプロテオグリカン（例えばコンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸およびデルマタン硫酸プロテオグリカン）、他のタンパク質および水を含む細胞外網目構造に埋め込まれた軟骨細胞を含むタイプの結合組織を言う。「関節軟骨」とはヒアリンまたは関節軟骨を言い、連結部の骨の連結表面を覆い、骨と骨が直接接触しないで連結部を可動とし、それにより向き合う骨の表面が摩耗したり損傷したりするのを防止する無血管性の非鉱物化組織である。最も正常で健康な関節軟骨は「ヒアリン」と呼ばれ、すなわち、すりガラスのような外観特性を有する。生理的条件下では、軟骨組織は下地の鉱物化した骨の表面、肋軟骨下骨の上にあり、高度に血管化した小骨を含む。これらの高度に血管化した小骨は、拡散し得る養分を上にかぶさる軟骨に提供し得るが、間葉幹細胞には提供し得ない。本明細書で使用される「骨原性タンパク質」という用語は、哺乳動物中に移植した場合、軟骨性骨形成の結果生じる細胞事象の発達カスケードを生成し得る任意のタンパク質を意味する。軟骨性骨分化中に生じる発達カスケードは、間葉細胞の化学走性、原始細胞の軟骨細胞および骨芽細胞への増殖、軟骨の分化、血管侵襲、骨形成、再構築、および最終的に骨髄分化からなると理解される。結果的に軟骨性骨生成となる上記事象カスケードを誘導し得る真正骨原性因子が、現在同定、単離され、クローン化されている。天然にはジスルフィド結合した２量体タンパク質として生じるこれらのタンパク質は、当該分野で「骨原性」タンパク質、「骨誘導性」タンパク質および「骨形態形成」タンパク質と呼ばれている。骨原性タンパク質は、例えば、公知の骨形態形成タンパク質および／または本明細書に記載のおよび／または当該分野におけるその等価物のいずれかであり得、そして天然起源材料、組換え材料、およびその他の方法で製造された組織形態形成を誘導し得る任意の材料を含む。本明細書で定義される骨原性タンパク質はまた、適当なインビボ無血管位置に関節軟骨形成を誘導することができる。本明細書で使用される「キャリア材料」は、浸潤する細胞の付着、増殖および分化のための間隙を有する材料を意味すると理解される。それはインビボで生分解性であり、生体適合性である。すなわち、移植拒絶となり得る抗体刺激性を全く持たない。好ましくは、キャリアは不溶性材料を含み、さらに移植したとき、所望の置換骨または軟骨組織を実質的に模倣する形状および寸法を有するように処方される。キャリアはさらに、置換される組織に対し特異的であり、かつ／または同じ組織型に由来する残部を含む。好ましい実施態様において、骨原性タンパク質とキャリア材料との重量比は、約1:1〜約1:250,000（例えば約1mgタンパク質：1mgキャリア〜約4ngタンパク質〜1mgキャリア）の範囲以内であり、最も好ましくは約1：40〜約1：50,000（例えば約25μgタンパク質：1mgキャリア〜約20ngタンパク質〜1mgキャリア）の範囲である。一つの実施態様において、イオン化放射線は電子線である。別の実施態様において、ガンマ線がイオン化放射線の好ましい線源である。任意の従来のガンマ線または電子線生成装置を本発明の実施に使用し得ると期待される。さらに、イオン化放射線の好ましい照射量は、約0.5〜約4.0メガラドの範囲内、最も好ましくは約2.0〜約3.5メガラドの範囲で提供されるが、それは本明細書に記載した装置に対してFDAが要請する滅菌保証レベルである10^-6を達成するに十分な照射量である。しかしながら、特定のデバイスに対し10^-6の滅菌保証レベルを得るに必要な照射量は、その開示が本明細書中に参考として援用される1992年出版の「Asso ciation for the Advancement of Medical Instrumentation」で決められ得る。別の実施態様において、不溶性キャリア材料はさらに粒子化し得る多孔性材料を含む。微孔は好ましくは、遊走原始細胞がマトリックス中に入り込み、続いて分化および増殖ができるに十分な寸法を有する。あるいは、不溶性キャリア材料を、粒子状材料をインビボでの意図された用途、例えば骨の欠損を接続するに適した形状に細密充填して加工することもできる。多孔性粒子または充填粒子は、好ましくは約70〜約850ミクロン以内の範囲、最も好ましくは約125〜約450ミクロンの範囲の粒径を有する。別の実施態様において、キャリア材料は関節軟骨デバイスの一部として処方される。デバイスは、失活(devitalized)軟骨組織、または他の不活性の非鉱物化マトリックス材料および骨原性タンパク質から形成することができ、次いでそのデバイスをシート状に肋軟骨下骨表面に置く。あるいは、処方したデバイスを粉砕し、または機械的に研磨して、骨の表面に適用するために本明細書の記載通りにペーストまたはゲル状に処方し得る粒子を製造し得る。不溶性キャリア材料は、非タンパク質ベースポリマー、例えばポリ乳酸、ポリ酪酸、ポリグリコール酸および/またはその混合物を含む合成ポリマー、および/ または一つ以上の天然起源分子、例えばヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、コラーゲンおよびその混合物を含み得る。コラーゲンが、現在好ましいキャリア材料である。当業者は、天然および/または合成材料を賢明に選ぶことにより、所望のインビボ物理的および化学的性質を有するポリマー材料を創製し得る。例えば、自己由来コラーゲンは合成ポリマー（コポリマーを含む）と混合されて、増強されたインビボ生分解速度を有するマトリックスを製造し、かつ/または本発明のデバイスを移植中により容易に操作できるようにする好ましい操作性を改善することができる。例えば、粒子状コラーゲン含有デバイスは、粒子をペースト状またはゲル状物質に結合させる役割のある一つ以上の部品と組み合わせられ得る。本発明で十分に特徴づけされる結合材料には、例えば、カルボキシメチルセルロース、グリセロール、ポリエチレングリコールなどが含まれる。あるいは、デバイスは、所望の物理的特性を提供する合成マトリックス中に分散した骨原性タンパク質を含み得る。本発明の方法およびデバイスで有用な骨原性タンパク質は、天然起源であろうが合成で調製されようが、哺乳動物に移植したとき、接近可能な原始細胞の召集 (recruitment)を誘導し、その増殖を刺激し、軟骨細胞および骨芽細胞への分化を誘導し、さらに中間の軟骨、血管新生、骨新生、再構築、および最終的には骨髄分化を誘導し得る。タンパク質はまた、適当な局所環境に置かれた場合、肋軟骨下骨表面上に新しい関節軟骨組織形成の誘導能を有する。好ましい骨原性タンパク質には、例えば、OP-1、OP-2、BMP-2、BMP-3、BMP-4 、BMP-5、BMP-6またはその機能的等価物のホモまたはヘテロダイマーが含まれる。これらのタンパク質は、当該分野では、TGF−βスーパー遺伝子ファミリーの「Vg／dpp」タンパク質サブファミリーの一員であると言われる。別の局面で、本発明は哺乳動物中に骨形成および／または関節軟骨形成を誘導する方法を提供する。その方法は、（a）哺乳動物の予め選択された位置に本発明の最終滅菌デバイスを移植する工程、および（b）デバイスに予め選択された位置に適当な組織形成を誘導させる工程を包含する。別の局面で、本発明は哺乳動物に移植するに適した最終滅菌骨原性デバイスを製造する一般的な手順を提供する。その方法は、（a）生物活性骨原性タンパク質を提供する工程；（b）骨原性タンパク質を不溶性キャリア材料と組み合わせる工程；および（c）組み合わせを、タンパク質の生物活性を維持しながら組み合わせを最終滅菌するに十分な量のイオン化放射線に曝露する工程を包含する。そのプロセスは迅速、温和であり、従来の照射デバイスを用いて行われる。本発明は滅菌プロセスとその方法で製造される滅菌された製品を意図するものである。図面の簡単な説明付属する図面と共に読めば、本発明の上記およびその他の目的、その様々な特徴、ならびに発明それ自体を、以下の説明からより完全に理解し得る。図１はラット骨芽細胞アッセイにおけるアルカリホスファターゼ活性を刺激するための、照射および非照射骨原性デバイスから抽出された試料の能力を示すグラフである。黒塗り三角形を有する線はOP−1を含まない対照マトリックスから抽出された試料を表す。黒塗り正方形を有する線は、未処理OP−1の試料を示す。十字印を有する線は第1の未照射OP−1含有デバイスから抽出された試料を示す。アスタリスクを有する線は、第1の照射OP−1含有デバイスから抽出された試料を示す。白抜き正方形を有する線は、第2の未照射OP−1含有デバイスから抽出された試料を示す。斜め十字印を有する線は、第2の照射OP−1含有デバイスから抽出された試料を示す。発明の詳細な説明イオン化放射線に曝露することにより最終滅菌され、キャリア材料と組み合わされた骨原性タンパク質を含む骨原性デバイスは、滅菌後生物活性を維持し、哺乳動物に移植した場合、軟骨性骨形成および／または軟骨形成の誘導能を有することが発見された。イオン化放射線はタンパク質構造を改変し、それにより生物活性を破壊し得るので、その発見は予想外である。本明細書に記載される一般的手順は、デバイスに組み込まれた骨原性タンパク質の生物活性を維持しながら、骨原性デバイスの滅菌性を確実にする。その手順には、不溶性キャリア材料と生物活性骨原性タンパク質とを組み合わせる工程、および次いでこの組み合わせをイオン化放射線に曝露して最終滅菌し、それにより哺乳動物に移植後、骨形成を誘導する滅菌デバイスを製造する工程が含まれる。この方法は、様々な骨原性タンパク質、キャリアマトリックス、およびそれらの処方物に使用され得る。その方法はまた、インビボで無血管部位に関節軟骨形成の誘導能を有するデバイスの製作に使用し得る。インビボで骨および関節軟骨形性活性を有する最終滅菌骨原性デバイスの調製、適切な骨原性タンパク質、キャリア材料の性質および特性、タンパク質改変を最小にする処理、最終滅菌を可能にする条件、および本明細書中で請求された主題の製造法および使用法を含む本発明の性質および有用性に関するその他の局面は、以下の記載でさらに理解される。Ｉ骨原性タンパク質本明細書で定義されるように、本発明の組成物および方法に有用な骨原性タンパク質には、マトリックスと共に哺乳動物に移植した場合、軟骨性骨活性を有し、「TGF−β様」タンパク質の「スーパーファミリー」のサブクラスを含む2量体タンパク質のファミリーが含まれる。成熟した天然型の天然起源骨原性タンパク質は、SDS−PAGEで測定して典型的には約30〜60kDaの見かけの分子量を有するグリコシル化2量体である。還元すると、30kDaタンパク質は約16kDaおよび18kDaの見かけ分子量を有する、2個のグリコシル化ペプチドサブユニットを生じる。還元状態では、タンパク質は検知し得る骨原性活性を持たない。また骨原性活性を有する非グリコシル化タンパク質2量体は、約27kDaの見かけの分子量を有する。還元すると、27kDaタンパク質は約14kDa〜16kDaの分子量を有する2個の非グリコシル化ポリペプチドを生じる。有用な配列には、DPP（Drosophila起源）、Vgl（ Xenopus起源）、Vgr-1（マウス起源）、OP-1およびOP-2タンパク質（米国特許第 5,011,691号参照）、ならびにBMP2、BMP3、BMP4（WO88/00205号、米国特許第5,0 13,649号およびWO91/18098号参照）、BMP5およびBMP6（WO90/11366号、PCT/US90 /01630）、BMP8およびBMP9と呼ばれるタンパク質のC末端102アミノ酸配列を含むものが含まれる。タンパク質のこのファミリーの構成員は、C末端領域に、保存された6個または 7個のシステインの骨格を共有する。例えば、本明細書で「OPS」と呼ばれる6システイン骨格残基を定義する米国特許第5,266,683号（その開示は本明細書中で参考として援用される）中の配列番号1の残基335-431、またはその中の配列番号 1の残基330-431（7システイン骨格を定義する102アミノ酸を含む）を参照のこと。このタンパク質ファミリーには、所定のタンパク質のより長い型、および系統発生型が含まれる。系統発生型とは、例えば、種および対立遺伝子変異体および生合成突然変異体のことである。これらは、保存されたC末端システイン骨格を変更し得るような付加および欠損突然変異体および変異体を含む。この改変によって、タンパク質が、マトリックスと一緒に哺乳動物に移植した場合、哺乳動物において骨形成を誘導できるコンフォーメーションを有する2量体種をなお形成できることが前提になる。さらに、本発明のデバイスに有用な骨原性タンパク質は、異なったグリコシル化パターンおよび異なったN末端を有する型を含み得る。骨原性タンパク質は、天然起源であるか、または生合成的に誘導され得、原核または真核宿主細胞中の組換えDNAの発現で製造され得る。そのタンパク質は単一種、例えばホモ2量体として、または混合種、例えばヘテロ2量体として組み合わされて、活性である。一つの実施態様において、本明細書で意図される骨原性タンパク質はOP-1またはOP-1関連配列を包含する。有用なOP-1配列は、米国特許第5,011,691号、第5,0 18,753号および第5,266,683号；Ozkaynakら、（1990）EMBO J．9:2085-2093；およびSampathら、（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90：6004-6008に詳しく述べられ、その開示は本明細書で参考として援用される。OP-1関連配列には、異種ホモログ、例えばDrosophilia由来の60A（Whartonら、（1991）Proc．Natl．A cad．Sci．USA 88：9214-9218）およびC末端7システインドメインでOP-1と60％より高い同一性、好ましくは少なくとも65％の同一性を共有するタンパク質が含まれる。OP-1関連配列の例には、OP-2、BMP5、BMP6およびその種ホモログVgr-1 （Lyonsら、（1989）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：4554-4558；Celesteら、（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：9843-9847；およびPCT国際出願WO93/ 00432号；Ozkaynakら、（1992）J．Biol．Chem．267：13198-13205）が含まれる。当業者に理解されるように、キメラ構築物は、新規配列を作出するために、異なる形態形成タンパク質配列の様々な部分を組み合わせて、標準的な生物分子学および突然変異誘発技術を用いて作出され得、これらの型のタンパク質も本明細書で意図される。さらに別の好ましい局面では、骨原性的に活性な2量体の一方または双方のポリペプチド鎖は、OP-1の活性領域をコードする核酸配列に相補的なDNAまたはRNA 配列に対し、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。本明細書で使用されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、37℃で終夜40％ホルムアミド、5×SSPE、5 ×Denhardt溶液、および0.1％SDS中でのハイブリダイゼーション、および50℃での0.1×SSPE、0.1%SDS中での洗浄と定義される。上記アミノ酸配列およびDNA配列の情報、当該分野の技術レベル、および骨原性タンパク質についての数多くの刊行物（米国特許第5,011,691号および公開PCT /US89/01469号（1989年10月19日公開）を含む）の開示が与えられると、本発明のデバイスに有用な骨原性タンパク質の少なくとも活性ドメイン、およびその様々なアナログ（種および対立遺伝子変異体および遺伝子操作された突然変異を含む変異体を含む）、ならびに融合タンパク質、成熟タンパク質の切形型、欠失および付加突然変異体、および本発明のデバイスおよび方法に使用し得る類似の構造体をコードする様々なDNAが構築され得る。その上、DNAハイブリダイゼーションプローブは、これらのタンパク質のいずれかの断片に由来し得るか、またはOP Sとして上記に定義された属配列から新たに設計され得る。これらのプローブは次に本発明の補綴デバイスに有用なさらなる骨原性タンパク質を同定するために、異なるゲノムおよびcDNAライブラリーをスクリーンするのに使用され得る。 DNAは、ゲノムおよびcDNA単離、合成オリゴヌクレオチドからの合成DNAの構築、およびカセット突然変異誘発技術を含む周知のDNA操作技術を用いて当業者によって製造し得る。15〜100マーのオリゴヌクレオチドがDNA合成装置で合成され得、トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液中でポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により精製され得る。次にDNAは、ゲルから電気溶出され得る。重複オリゴマーをT4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、より大きいブロック中にライゲートし得、これをPAGEで精製し得る。次に適当に同定されたクローン由来のDNAを単離し、（好ましくは発現ベクター中に）サブクローンし、そして配列決定し得る。目的とする配列を含むプラスミドを、次いでタンパク質発現およびさらなる特性付けのために適当な宿主細胞中にトランスフェクトし得る。宿主は原核または真核細胞で有り得るが、それは前者がタンパク質をグリコシル化できないことが、タンパク質の形態形成活性を破壊しないためである。有用な宿主細胞にはE．coli、Saccharomyces、昆虫、バキュロウイルス細胞系、ミエローマ細胞、CHO細胞および様々な他の哺乳動物細胞が含まれる。ベクターはさらに、転写プロモーターおよび終結配列、エンハンサー配列、好ましいリボソーム結合部位配列、好ましいmRNAリーダー配列、タンパク質分泌のための好ましいシグナル配列などを含む、組換えタンパク質の正しい発現を促進する様々な配列をコードし得る。目的とする遺伝子をコードするDNA配列はまた、潜在的に阻害する配列を除去し、または望ましくない2次構造の形成を最小にするように操作され得る。組換え骨原性タンパク質はまた、融合タンパク質として発現され得る。翻訳された後、タンパク質は細胞そのものから精製され得るか、または培地から回収され得る。生物活性タンパク質形態はすべて、ジスルフィド結合によって接合されるか、または他の方法で会合される2量体種を含むが、それらは適当な真核細胞内または個々のサブユニットの発現後インビトロで、1種以上の様々な組換えポリペプチド鎖を折りたたみ、酸化して製造される。E．coliおよび様々な異なった哺乳動物細胞中で組換えDNAから発現される骨原性タンパク質の詳細な記載は、米国特許第5,266,683号に開示されている。あるいは、骨原性ポリペプチド鎖は、当業者に周知の従来のペプチド合成技術を用いて化学的に合成され得る。例えば、タンパク質は、固相ペプチド合成装置上で、標準操作手順を用いて完全な状態(intact)でまたは部分的に合成し得る。次いで、出来上がった鎖を脱保護し、HPLC（高圧液体クロマトグラフィー）で精製する。タンパク質が部分的に合成された場合、その部分を標準の方法を用いてペプチド結合し完全なタンパク質を形成し得る。一般的に、骨原性タンパク質を製造する方法は従来法であり、本発明の一部を構成しない。II ．キャリアマトリックス材料 A ．マトリックスの一般的な考察当業者に明らかなように、マトリックスが細胞を浸潤および増殖させるための足場として作用するのに十分な3次元構造を有し、インビボで生体吸収性で生体適合性があるならば、本明細書で開示されるマトリックスについて使用される基材それ自体の正確な性質は、新しい骨または関節軟骨組織形成を誘導するためのデバイスの究極の能力の決定因子ではない。本発明では、基材は、その上で骨原性タンパク質により媒介されるある種の細胞事象が生じ得る足場の役割を果たす。骨原性タンパク質に対する特異的応答は、究極的には移植部位での内因性ミクロ環境および応答する細胞の発達能で指令される。また当業者に明らかなように、本明細書で開示されるマトリックスに利用される基材の正確な選択は、部分的には、修復すべき欠陥の型、欠陥部位での血管新生の程度のような解剖学的考察などに依存する。マトリックスの形状、粒子サイズ、表面電荷の存在、および多孔度（細胞浸潤間隙）はすべて、マトリックスの性能が良好であるために重要である。マトリックスを、形成すべき新しい骨または関節軟骨組織の所望の形に成形することが好ましい。ラットでの研究は、新しい骨は移植されたデバイスの寸法を本質的に有して形成されることを示す。マトリックスは、例えばコラーゲンで緩く接着した粒子状材料から構成される形状保持固体を包含し得る。それはまた、成形した多孔性固体、または周囲組織により所定位置に保持された単なる細密充填粒子の凝集も包含し得る。マトリックスはさらに、浸潤する細胞の付着および増殖を可能にするに十分な間隙を有する、不溶性の非粒子状固体も包含し得る。特に本明細書の記載通りに調製される場合、破壊された(masticated)筋肉または失活した生物学的に不活性な組織が使用され得る。その骨髄腔を浄化し、そこにキャリアおよび分散された骨原性タンパク質を充填した場合、大きな同種異系骨インプラントもマトリックス用キャリアとして作用し得る。あるいは、骨インプラントがそれ自体キャリアとして作用し得、そのような場合、骨原性タンパク質は骨インプラントの表面上に直接被覆され得る。骨原性デバイスを処方して哺乳動物中に新規な骨組織を形成する場合、現在好ましいマトリックス材料は、本明細書の記載通りに処理した、失活し鉱物除去した異種骨組織である。処方したデバイスは、多様な臨床環境に有用な移植可能材料となる。様々な整形外科法、歯周療法術および再構築法における骨形成用マトリックスとしての用途に加えて、マトリックスはまた、持続放出キャリア、またはインプラントのコラーゲン性被覆としても使用され得る。マトリックスは、手術に前もって所望のように成形され得るか、または手術中に医者または技術者により成形され得る。従って、材料は、局所、皮下、腹腔内、または筋肉内インプラントのために使用され得、非癒着性の骨折を繋ぎ合わせ、または骨欠陥を埋めるように成形され得る。 B ．天然起源マトリックス適切な同種異系または異種マトリックスは、本明細書で以下に説明するように、当該分野で周知の方法を用いて作製され得る。特定すると、その方法は、組織の細胞非構造性成分を、組織を失活させるように抽出するように設計される。得られた材料は、細胞により浸潤され得る間隙を規定し、かつ非構造性関連成分が涸渇されている細胞マトリックスを含む。非鉱化組織を失活させる現在好ましい方法は、組織を固定する当該分野で使用される方法論に従う。組織を、組織に含有する水をエタノールと実質的に置換し、組織の細胞構造を破壊するに十分な時間、非極性溶剤（例えば、95％エタノール）に曝す。典型的には、約4〜40℃の範囲の温度で組織を200プルーフエタノールに数日曝すが、この際、溶液を新しいエタノールと、組織の液体含有量が70〜 90％エタノールを含むような時間まで、6〜12時間おきに取り替えるよう注意する。典型的には3〜4日の処理が適当である。加える液体の容積は、組織を浸すに十分な量より多くなければならない。処理した組織を次いで凍結乾燥する。得られた乾燥マトリックスは非構造成分が実質的に涸渇されているが、組織に由来する細胞内および細胞外の両マトリックス成分を保持している。処理した同種異系または異種マトリックスは、哺乳動物中に新しい骨または関節軟骨を形成するためのデバイスを作製するために特に有用であると想起される。骨原性デバイスは、同種異系移植修復を増強するために、同種異系骨から処方され得る。失活した同種異系または異種キャリア材料はまた、骨原性タンパク質と組み合わせて、大きな骨欠陥のための構造支持体を提供する固形の再吸収可能なマトリックスを提供し得る。同様に、同種異系関節軟骨デバイスは、失活させた軟骨組織、またはその他の不活性な非鉱化マトリックス材料および骨原性タンパク質から形成され得、そのデバイスはシートとして肋軟骨下骨表面上に置かれ得る。あるいは、処方されたデバイスは、粉砕または機械的に研磨されて、骨表面に適用するために本明細書の記載通りにペーストまたはゲルに処方され得る粒子を生じ得る。 C ．骨由来マトリックス以下は、鉱化組織、特に同種異系または異種骨組織から適当なマトリックスを作製する現在の好ましい方法を提供する。 C.1 鉱物除去骨マトリックス鉱物除去骨マトリックス、好ましくはウシ骨マトリックスは、既に公開されている方法により調製される（Sampathら、（1983）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80: 6591-6595）。ウシ骨幹骨を地方の屠殺場から得、採取したばかりで用いる。骨は、筋肉と脂肪とを除去し、骨膜を取り除き、加圧冷水で骨髄除去し、冷無水エタノールに浸し、−20℃で貯蔵する。次いで、それらを乾燥し、粉砕により破断し、そして大型のミルで粉末化する。液体窒素を用いて加熱を防ぐように注意する。粉末化した骨を70〜850μm、好ましくは150〜420μmの粒子サイズに製粉し、３容量のクロロホルム：メタノール(３：１)で約２時間の洗浄を２回行って脱脂する。次いで、粒子状骨を、１容量の無水アルコールで洗浄し、１容量の無水エーテルで乾燥し、脱脂骨粉を生じる。脱脂骨粉を次いで、４℃で40分間、 10容量の0.5Ｎ HClを用いた連続した４回の処理により鉱物除去する。最後に、大量の水を用いる洗浄により、鉱物除去骨粉を中和する。 C.2 グアニジン抽出このように調製した鉱物除去骨マトリックスを、４℃で16時間、５容量の４Ｍグアニジン-HCl、50mM Tris-HCl、pH7.0で抽出する。懸濁液を濾過する。不溶物を集め、マトリックスの調製に使用した。得られる材料は、天然にはほとんどコラーゲン性であり、骨形成活性または軟骨形成活性を有していない。 C.3 マトリックス処理全ての骨マトリックスの主要成分は、Ｉ型コラーゲンである。コラーゲンに加えて、上述のように抽出した鉱物除去骨は、その容積当たり５％を占める非コラーゲン性タンパク質を含んでいる。異種マトリックスでは、これらの非コラーゲン性成分は、強い抗原となり得、そして免疫原および／または阻害成分になり得る。これらの成分はまた、骨分化の発達カスケードを干渉することにより、同種異系インプラントにおける骨形成を阻害し得る。コラーゲンフィブリル改変剤でのマトリックス粒子の処理は、マトリックスから望ましくない可能性のある成分を引き出し、そしてマトリックス材料の表面構成を改変する。有用な薬剤は、酸、有機溶媒、または加熱水性媒体を含む。種々の処理を以下に記載する。鉱物除去されグアニジン抽出された骨コラーゲン粒子においてこれらのフィブリル改変剤が有する影響の詳細な物理的分析は、同時係属中の米国特許出願第483,913号（1990年２月22日出願）に開示されている。フィブリル改変剤との接触後、処理されたマトリックスを洗浄し、いかなる抽出成分をも除去する。簡潔には、マトリックスをTBS（Tris緩衝化生理食塩水）１ｇ/200ml中に懸濁し、４℃で２時間撹拌する；または６Ｍ尿素、50mM Tris-HC l、500mM NaCl、pH7.0（UTBS）中で、室温で(RT)30分間（pHを中和するのに十分な時間）撹拌する。材料を遠心分離により採集し、上述の条件を用いて再洗浄し、遠心分離により再採集する。得られた材料を水で洗浄し、次いで凍結乾燥する。 C.3.1. 酸処理 C.3.1a. トリフルオロ酢酸トリフルオロ酢酸(TFA)は、非酸化性の強酸で、これは、タンパク質に対する公知の膨潤剤であって、コラーゲンフィブリルを改変する。上述のようにして調製されたウシ骨残渣を篩にかけ、適切なサイズの粒子を集める。これらの粒子を種々の比率（1.0％〜100％）のトリフルオロ酢酸および水（v/v）で、０℃または室温で１〜２時間、絶えず撹拌しながら抽出する。処理されたマトリックスを濾過し、凍結乾燥し、または水／塩で洗浄し、次いで凍結乾燥する。 C.3.1b. フッ化水素トリフルオロ酢酸と同様に、フッ化水素（HF）は強酸であり、かつ膨張剤であり、そしてこれはまた、粒子内表面構造を改変し得る。フッ化水素はまた、公知の脱グリコシル化剤である。このように、フッ化水素は、これらのマトリックスの骨形成活性を、グアニジン抽出後もなおこれらのマトリックスに結合したいずれもの糖タンパク質の抗原性炭水化物含有物を除去することにより増大するように機能し得る。上述のようにして調製したウシ骨残渣を篩にかけ、そして適切なサイズの粒子を集める。試料をＰ₂Ｏ₅上で真空乾燥させ、反応容器に移し、そして−70℃で試料上で蒸留することにより無水フッ化水素（10〜20ml/gマトリックス）に曝す。この容器を０℃にまで温めさせ、次いで反応混合物をこの温度で120分間撹拌する。真空でのフッ化水素のエパポレーション後、残渣を真空でKOHペレット上で完全に乾燥し、いかなる微量の酸をも除去する。脱グリコシル化の程度は、非共有結合により結合している炭水化物を除去するために適切に試料を洗浄した後、フッ化水素で処理する前および後に採取したマトリックス試料の炭水化物分析から決定され得る。ＨＦ処理材料からのSDS抽出タンパク質は、ConAブロッティングにより決定されるように、炭水化物反応に対して陰性である。次いで、脱グリコシル化骨マトリックスを、TBS（Tris緩衝化生理食塩水）またはUTBS中で２回洗浄し、次いで水で洗浄し、次いで凍結乾燥する。しかし、他の酸処理もまた、 HFおよびTFAに加えて想起される。 C.3.2 溶媒処理 C.3.2a. ジクロロメタンジクロロメタン(DCM)は、タンパク質をその一次構造に影響を与えることなく変性し得る有機溶媒である。この膨潤剤は、自動ペプチド合成における一般試薬であり、成分を除去する洗浄工程において一般に用いられる。上述のように調製されたウシ骨残渣を篩にかけ、そして適切なサイズの粒子を100％DCM、または好ましくは99.9％DCM／0.1％TFA中でインキュベートする。マトリックスを膨潤剤と、０℃または室温で１〜２時間インキュベートする。あるいは、マトリックスをインキュベートせずに短時間の洗浄（各回20分）で、少なくとも３回上記薬剤で処理する。 C.3.2b. アセトニトリルアセトニトリル(ACN)は、タンパク質をその一次構造に影響を与えることなく変性し得る有機溶媒である。これは、高速液体クロマトグラフィーで用いられる一般試薬であり、疎水性相互作用を妨害することによりシリカベースカラムからタンパク質を溶出するのに用いられる。上述のように調製した適切なサイズのウシ骨残渣粒子を100％ACN（1.0g/30ml）、または好ましくは99.9％ACN／0.1％TFA で、室温で１〜２時間、絶えず撹拌しながら処理する。処理されたマトリックスを、次いで、水、尿素緩衝液、または４Ｍ NaClで洗浄し、次いで凍結乾燥する。あるいは、ACNまたはACN/TFA処理マトリックスを洗浄せずに凍結乾燥し得る。 C.3.2c. イソプロパノールイソプロパノールもまた、タンパク質をその一次構造に影響を与えることなく変性し得る有機溶媒である。これは、シリカHPLCカラムからタンパク質を溶出するのに用いられる一般試薬である。上述のように調製した適切なサイズのウシ骨残渣粒子を100％イソプロパノール（1.0g/30ml）、または好ましくは0.1％ TFA の存在下で、室温で１〜２時間、絶えず撹拌しながら処理する。次いで、マトリックスを、凍結乾燥する前に水、尿素緩衝液、または４Ｍ NaClで洗浄する。 C.3.2d. クロロホルムクロロホルムもまた、上述の試薬と同様に、ウシマトリックスの表面領域を増大させるために、そのまままたは酸性化した後のいずれかで用いられる。上述のような処理は、移植前に材料に病原体がないことを確実にするために有効である。 C.3.3 熱処理現在最も好ましい薬剤は、水のような加熱された水性フィブリル改変媒体であり、マトリックス粒子の表面積および多孔度を増大させる。現在最も好ましい水性媒体は、pHが約4.5未満（例えば、約pH2.0〜pH4.0の範囲内；加熱前にコラーゲンの「膨潤」を助長し得る）である酸性水性媒体である。0.1％の酢酸（約３のpHを有する）が現在最も好ましい。0.1M酢酸もまた用いられ得る。種々の量の脱脂鉱物除去グアニジン抽出骨コラーゲンを、水ジャケットを有するガラスフラスコ内で絶えず撹拌しながら水性媒体（１ｇマトリックス／30ml水性媒体）中で加熱し、所定の温度で所定の時間の間、維持する。好ましい処理時間は約１時間であるが、約0.5〜２時間の間の曝露時間が許容できるようである。用いられる温度は、約37℃〜65℃の範囲内の温度で一定に保つ。現在好ましい熱処理温度は、約45℃〜65℃の範囲内である。熱処理後、マトリックスを濾過し、洗浄し、凍結乾燥し、そしてインプラントのために用いる。酸性水性媒体を用いる場合、マトリックスはまた、好ましくは、洗浄および凍結乾燥の前に中和する。現在好ましい中和緩衝液は、200mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0である。マトリックスを中和するために、マトリックスは、好ましくは、温度処理の後にまず冷却させ、次いで酸性水性媒体（例えば、0.1％酢酸）を除去し、中和緩衝液と取り替え、そしてマトリックスを約30 分間撹拌する。次いで、中和緩衝液を除去し、マトリックスを洗浄し、凍結乾燥し得る。マトリックスはまた、汚染重金属を除去するように処理され得る。これは、例えば、マトリックスを金属イオンキレート化剤に曝すことによる。例えば、0.1 ％酢酸での温度処理の後、マトリックスを、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)ナトリウムを含有する中和緩衝液（例えば、200mMリン酸ナトリウム、5mM EDTA、p H7.0）中で中和し得る。5mM EDTAは、約100倍モル過剰のキレート化剤を、これまでに試験した最も汚染されたマトリックスに存在する残留重金属に提供する。中和後の続くマトリックス洗浄は、EDTAの大半を取り除くようである。マトリックス粒子のEDTA処理は、試験した全ての金属（Sb、As、Be、Cd、Cr、Cu、Co、Pb 、Hg、Ni、Se、Ag、Zn、Tl）の残留重金属含有量を約1ppm未満に減少させる。ED TA処理マトリックスでのバイオアッセイは、金属イオンキレート化剤での処理が骨誘導活性を阻害しないことを示す。コラーゲンマトリックス材料は、好ましくは、水に不溶で、非接着性粒子を含む微粉の形態をとり得る。これはまた、新規な骨成長または持続放出が望ましい場合、周囲組織により所定位置に保持される体積内に単に詰め込むことにより用いられ得る。あるいは、この粉末は、体によって容易に吸収される、例えばゼラチンまたはポリ乳酸コーティングにおいてカプセル化され得る。粉末は、例えば、可溶性種生体適合性コラーゲンを用いて粒子を粒子間接着することにより、所定の体積に成形されて、その形で保持され得る。材料はまた、シート状、棒状、ビーズ状、または他の巨視的形状(macroscopic shape)でも製造され得る。 D ．合成マトリックス天然起源マトリックスの代替として、または天然起源マトリックスと組み合わせて使用する補助材として、適切なマトリックスはまた、所望の置換組織の寸法に合うように形成または成形され得る3次元足場構造を作出する役割をする一つ以上の材料を用いて、新規に処方され得る。好ましくは、マトリックスは、誘導される組織と同じ組織型由来の、および/またはその特性を有する、またはそれに特異的な残基も包含する。ある場合は、肋軟骨下骨表面上に関節軟骨を形成する場合と同じく、浸潤した細胞を付着させるに十分な3次元足場構造を規定し、そして非鉱化材料で構成されるマトリックスと組み合わせた骨原性タンパク質が、十分で有り得る。コラーゲン；グリコール酸、乳酸および酪酸のホモポリマーまたはコポリマー（それらの誘導体を含む）；およびセラミックス（例えば、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウムおよび他のリン酸カルシウムおよびそれらの組み合わせ）を（制限なしに）含む材料の任意の一つまたは組み合わせが、有利に使用され得る。合成マトリックスの組織特異性成分は、上記のように同種異系または異種組織を失活させて、次いで残りの不溶性マトリックスを粉砕または機械的に破砕することにより容易に得られ得る。この粒子状材料は、次に本明細書中に記載のものを含む、一つ以上の構造材料と組み合わせられ得る。あるいは、組織特異性成分は、当該分野で十分に特徴づけされている標準抽出法を用いて、処理マトリックスからさらに精製され得、そして標準分析法を用いて、各精製工程で抽出された材料はその組織特異性能について試験され得る。典型的な組織抽出プロトコルについては、例えばSampathら、（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．78：7599-7603 および米国特許第4,968,590号（その開示は本明細書で参考として援用される）参照。例えば、置換関節軟骨が、例えば、組織の裂け目または局部表皮欠陥を補修するために、または年齢、疾病または外傷のために現在消耗された関節軟骨表面の高さを増すために現存の接合部で所望される場合、合成マトリックスが望ましいとされ得る。このような関節軟骨層の「表面再生」は、一つの実施態様では、本明細書の記載通りに同種異系または異種関節軟骨組織のシートを処理し、得られたマトリックスを骨原性タンパク質で被覆し、処方されたデバイスをそれが標準正像手術技法(orthoscopic surgical techniques)を用いて接合部に導入されるように巻き上げ(rolling up)、その部位に提供されれば、関節骨表面上の層としてそのデバイスを広げる(unrolling)ことにより、本発明の方法および組成物を用いて行い得る。別の実施態様では、デバイスは、ペーストまたは接合部の関節骨表面上に、標準正像手術法を用いて注入できる注入可能なゲル状物質として処方される。この実施態様では、処方は、マトリックスおよび骨原性タンパク質の両方、ならびに粒子をペースト状またはゲル状物質中に結合させる役割をする一つ以上の組成物を含む、粉砕されたまたは他に機械的に破砕されたデバイスを含み得る。当該分野で十分に特徴づけされた結合材料には、例えば、カルボキシメチルセルロース、グリセロール、ポリエチレングリコールなどが含まれる。あるいは、デバイスは、所望の物理的特性を提供する合成マトリックス中に分散した骨原性タンパク質を含み得る。例えば、軟骨または骨に対し組織特異性を有する合成マトリックスは、WO91/1 8558号（1991年12月21日公開）に記載されている。簡単に言えば、マトリックスは、生体適合性生分解性コラーゲンおよび組織特異性細胞付着因子としての適当な組織特異性グリコサミノグリカンの多孔性架橋構造ポリマーを含む。多数の供給源に由来するコラーゲンが使用され得、これらは、不溶性コラーゲン、酸可溶コラーゲン、中性または塩基性水溶液に可溶なコラーゲン、ならびに市販のそれらのコラーゲンを含む。グリコサミノグリカン（GAG）またはムコ多糖は、組織特異性分布を有する動物起源のヘキソサミン含有多糖であり、従ってモルフォゲン刺激分化細胞の組織特異性決定を援助するために用いられ得る。GAGとの反応はまた、他の価値のある特性を有する、すなわち動物ホストからの免疫反応（異物反応）を誘発しないコラーゲンを提供する。化学的には、GAGは、グリコシド結合をし、ヘキソウロン酸またはヘキソース部分のいずれかと多少とも規則的に繰り返すヘキソサミン残基でなる（例えば、 Dodgsonら、「Carbohydrate Metabolism and its Disorders」；Dickensら編集、vol.１、Academic Press(1968)を参照）。有用なGAGには、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、デルマタン硫酸およびケラチン硫酸が含まれる。他のGAGもまた本明細書に記載のマトリックスの形成のために使用され得、当業者は日常的に行われる以上の実験を用いなくても他の適切なGAGを知っているか、または確認することが可能である。ムコ多糖のより詳細な記述に関しては、Aspinall、「Polysaccharides」、Perga mon Press、Oxford(1970)参照のこと。コラーゲンは酸性水溶液中好ましくは希酢酸溶液中でGAGと反応し得る。コラーゲン水性分散液中にGAGを滴下することにより、GAGで被覆された絡み合ったコラーゲンフィブリルの共沈殿が得られる。次いで、この絡み合った繊維の塊を微細線維の均一な分散液を形成するようにホモジェナイズし、次いで濾過、乾燥し得る。コラーゲン−GAG生成物の不溶性は、これらの材料を共有結合架橋することにより、所望の程度に生じさせ得、このことはまた、これらの材料の再吸収に対する抵抗性を生じる役目を果たす。一般には、コラーゲンを架橋するに適した任意の共有結合架橋法がこれらの複合材料を架橋するにも適切であるが、熱脱水法による架橋が好ましい。乾燥時には、架橋粒子は、約500μmの直径を有する本質的に球状である。走査型電子顕微鏡では、表面に約20μm、内部に40μmの微孔が見られる。内部は繊維状およびシート状の双方でできており、細胞付着表面を提供する。空孔は相互に繋がり、粒子の内部まで細胞が接近できる。材料はほぼ99.5％の空孔体積を有するようであり、このことは、材料を、ミクロキャリアの１グラム当たりに生育し得る潜在的な細胞量に関して非常に効率のよいものとしている。他の有用な合成マトリックスは、グリコール酸、乳酸および／または酪酸でなるポリマーのような生体適合性のインビボ生分解性合成ポリマー（コポリマーおよびその誘導体を含む）から処方されたマトリックスである。これらのポリマーは、当該分野で十分に記載され、市販されている。例えば、ポリ−D,Lラクチド：グリコリドの50：50混合物がBoehringer Ingelheim（例えばRG503、RG506、RG 502HおよびRG503H）およびBirmingham Polymers（例えばLactel）から市販されている。さらに80％ポリラクチド／2％グリコシドまたはポリ−3-ヒドロキシ酪酸を含むポリマーがPolyScience、Inc.より購入され得る。ポリマー組成物は一般に球状形態で得られ、骨原性デバイスは好ましくは有機溶剤と組み合わせて（例えばエタノール−トリフルオロ酢酸溶液(EtOH/TFA)中で）、水性条件下で製造される。さらに、特定のポリマー組成物のモルフォロジーを、例えば多孔性を増すように、当該分野で公知の多数の特定の溶剤処理のいずれかを用いて変化させ得る。III ．骨原性デバイスの製造上記の天然起源タンパク質および組換えタンパク質、ならびに他の構造体は、本明細書および／または米国特許第5,266,683号（その開示は本明細書中で参考として援用される）記載の方法のいずれかを用いて、適切なマトリックス調製物中に組み合わせて分散させ得る。典型的には、骨原性タンパク質を適切な溶剤中に溶解し、マトリックスと組み合わせる。成分を会合させる。典型的には、組み合わせた材料を次に凍結乾燥し、その結果、骨原性タンパク質がマトリックスの表面の上に配置されるか、またはそこに吸着される。有用な可溶化溶剤には、エタノール／トリフルオロ酢酸溶液（例えば47.5％EtOH／0.01％TFA）；アセトニトリル／TFA溶液;エタノール;含水エタノール；または水性緩衝液が含まれるが、それに限定されない。酸性緩衝液中の処方物は、OP−1のマトリックス表面上への吸着を容易にし得る。本発明のデバイスにとって、有用な処方プロトコルは、エタノール／TFA溶液中（例えば30〜50%EtOH／0.01〜0.1％TFA）でのマトリックスおよび骨原性タンパク質の2 4時間のインキュベーション後、凍結乾燥することである。この手順は、70〜90 ％のタンパク質をマトリックス表面上に吸着または沈殿させるに十分である。使用される骨原性タンパク質の量は、使用するデバイスの大きさ、および骨原性タンパク質の比活性に依存する。大きなインプラントにはより多量が使用され得る。大きな骨欠陥についての臨床処方物は現在、コラーゲンマトリックス1gあたり約2.5mgの骨原性タンパク質を含む。1 ．エタノールトリフルオロ酢酸凍結乾燥この手順では、骨原性タンパク質をエタノールトリフルオロ酢酸溶液（47.5%E tOH／0.01％THF）中に可溶化し、キャリア材料に加える。スラリー(flurry)を混合し、次いで凍結乾燥する。この方法が現在のところ好ましい。2 ．アセトニトリルトリフルオロ酢酸凍結乾燥これは、アセトニトリル−トリフルオロ酢酸(ACN/TFA)溶液を用いて骨原性タンパク質を可溶化し、次いでキャリア材料に加える上記手順の変法である。試料を多数回激しく攪拌し、次に凍結乾燥する。3 ．エタノール沈殿マトリックスをグアニジン−HClに溶解した骨原性タンパク質に加える。試料を攪拌し、低温（例えば4℃）でインキュベートし、再攪拌する。冷無水エタノール（5容量）を混合物に加え、次いで攪拌し、好ましくは20℃で30分間インキュベートする。遠心分離後（マイクロフュージ、高速）、上清をデカントする。再構成マトリックスを冷濃縮含水エタノール（85％EtOH）で2回洗浄し、次いで凍結乾燥する。4 ．尿素凍結乾燥尿素緩衝液中で調製されるこれらの骨原性タンパク質では、タンパク質をマトリックス材料と混合し、多数回攪拌し、次いで凍結乾燥する。凍結乾燥材料は「そのまま」、インプラント用に使用し得る。5 ．緩衝液凍結乾燥生理学的緩衝液中の骨原性タンパク質調製物も、マトリックスと攪拌し、凍結乾燥して、骨原性活性処方物を生成し得る。さらに、本明細書記載の手順は、持続放出目的のため、他の活性治療薬、ホルモンおよび様々な生物活性種をマトリックスに吸着させるために使用し得る。例えば、骨原性タンパク質に加えて、種々の成長因子、ホルモン、酵素、治療用組成物、抗生物質、またはその他の生物活性薬剤もまた、基材上に吸着され得るか、または内部に含浸され得、移植されてマトリックスが徐々に吸収されるとき、経時的に放出され得る。従って、EGF、PDGF、IGF、FGF、TGF−αおよびTGF−β のような種々の既知の成長因子がインビボで放出され得る。マトリックスはまた、化学療法剤、インスリン、酵素、酵素阻害剤、または走化−化学誘引因子を放出させるためにも使用され得る。IV ．滅菌処方に続いて、得られた骨原性デバイスをイオン化放射線に曝露して、例えば電子線またはガンマ線に曝露して滅菌する。デバイスに関連した酸素原子から高エネルギー酸素イオンおよびラジカルが発生し得るので、照射前に残存空気をデバイスから除去しなければならない。任意の形態のパッケージングが、そのパッケージングが滅菌法および貯蔵条件下での滅菌性の維持に適合性があるならば、本発明の骨原性デバイスを保持するために使用され得る。好ましくは、本発明のデバイスをパッケージするために止め栓付きバイアルが使用される。滅菌は、デバイスをバイアルに密封した後、常法で行われる。現在好ましいアプローチでは、密封前に真空によってバイアルから空気を排気する。しかしながら、さらなる予防策として、密封前に排気バイアルに不活性ガス（例えばヘリウム、ネオン、アルゴン、または窒素）を満たし得る。あるいは、バイアルは、密封前に不活性ガスで単にパージされ得る。密封したデバイスを続いて、例えば電子線またはガンマ線照射に曝露して最終滅菌する。デバイスを製造中に、例えば製造プロセス中の集中ライン工程(integ ral inline step）として滅菌し得るか、またはあるいは、デバイスを製造後、照射のために商用滅菌サービス（例えばIsomedix（Northboro、MA）またはRTI− Process Technology（Rockaway、NJ））へ送付し得る。本発明のデバイスは、典型的には、バイオメカニカルデバイスの滅菌について Federal Drug Administrationにより要請されるように、約10^-6の滅菌保証レベルを提供するに十分な線量で照射される。特定のデバイスを滅菌するに必要な実際の線量は、参考テキスト「Association for the Advancement of Medical Inst rumentation Guidlines」(1992年出版)を参照して容易に決定され得る。その中には、デバイスの特定の生物負荷のための所定の滅菌保証レベルを達成するために必要な放射線線量を決定するためのガイドラインが提供される。本発明のデバイスを滅菌するための線量は、約0.5〜約4.0メガラドの範囲内であり、最も好ましくは約2.0〜約3.5メガラドの範囲内である。実施例本発明を実施するために現在意図される最良の態様を構成する本発明の骨原性デバイスを製造し使用する手段、ならびにこれらの組成物の性質および用途に関する他の材料の局面（請求した主題の製造法および使用法を含む）は、以下の記述からより理解される。本発明は、このような実施例、またはこれらの実施例に示された特定の詳細に制限されないことが理解される。実施例1．OP-1およびウシコラーゲンキャリア材料を含む最終滅菌骨原性デバイスの生物活性鉱物除去しグアニジン抽出したウシマトリックスを、本明細書記載のエタノール／TFAプロトコルを用い、OP-1の量を増やしながら処方した。簡単に言えば、エタノール／TFA中に可溶化したOP−1をウシコラーゲンキャリア材料と共に3時間インキュベートした。混合物をOP−1マトリックススラリーとして凍結し、真空下で乾燥した。処方後、各デバイスをガラスバイアルに移し、デバイスのいくつかには水を加えた。次に、デバイスを密封前に5分間ヘリウムでパージした。バイアルをゴム膜で閉じ、密封した。試料を以下の条件の一つで2.5メガラドのガンマ線に曝露した：ドライアイス上で乾燥、ドライアイス上で湿潤、または室温で乾燥。得られたデバイスをラット皮下アッセイで骨生成能について評価した。インビボ骨誘導をSampathら（前述）の記載通りにアッセイした。簡単に言えば、最終滅菌デバイスを、エーテル麻酔下でレシピエントラットに皮下移植した。28〜32 日齢の雄のLong-Evansラットを使用した。無菌条件下で、胸郭上の皮膚に縦の切れ目（1cm）を入れ、鈍切開でポケットを作製した。約25mgの試験デバイスをポケット中に深く移植し、切開部を金属製皮膚クリップで閉じた。移植の日を実験のゼロ日とした。インプラントを第12日に取り除いた。異方向性(heterotropic) 部位によって、正方向性(orthotropic)部位を使用することによって起こり得る不確かさを生じさせずに、骨誘導を調べることができる。骨誘導活性を、アルカリホスファターゼアッセイおよび第12日インプラントのカルシウム含有量によって生化学的に測定した。アルカリホスファターゼ活性は、インプラントをホモジェナイズした後、分光学的に測定した。組織学に骨発達を示さないインプラントは、これらのアッセイ条件下でアルカリホスファターゼ活性をほとんどまたは全く有さない。このアッセイは、インプラントをラットから除去した後、骨形成を迅速に定量し、その概算値を得るために有用である。一方、カルシウム含有量はインプラント中に形成された骨の量に比例する。従って、ラットにおける第12日のインプラントのカルシウム含有量を測定して、骨形成を計算する。移植が成功したことは、インプラントがタンパク質誘導軟骨性骨発達の各段階を通じて制御された進行を示すことで特徴づけられ、それは（1）第1日の多形核白血球による一過性浸潤；（2）第2〜3日の間葉細胞遊走および増殖；（3）第5 〜6日の軟骨細胞出現；（4）第7日の軟骨マトリックス形成；（5）第8日の軟骨石灰化；（6）第9および10日の血管侵襲、骨芽細胞の出現、および新骨の形成；（7）第12〜18日の破骨細胞の出現、骨再構築および移植マトリックスの分解；および(8)第21日の小骨中の造血骨髄分化を含む。組織切片を作製し、染色を行い、インプラント中の骨生成度を測定した。インプラントをBouins液中で固定化し、パラフィン包埋し、6〜8μmの切片に切断した。トルイジンブルーまたはヘモトキシリン／エオシン染色は、軟骨性骨の最終的な発達を明瞭に示す。インプラントが新たに誘導された骨を含むかどうかを決定するには、第12日インプラントで通常十分である。アッセイ結果を以下の表1 〜4にまとめる。表1〜4に示したデータは、OP−1含有デバイスが生物活性を保持していることから明らかなように、骨原性デバイスがガンマ線照射で滅菌され得ることを示している。いくつかのグループでは骨原性能の低下が見られた。一般に、ドライアイス上で湿潤状態で照射した試料が最高の活性を保持していた。実施例2．骨原性デバイスから空気を除去するための別法実施例1は、ある特定の環境下ではガンマ線照射が照射デバイスの生物活性を減少させることを示している。これらの結果は、照射前のデバイスからの空気除去が不完全であったことに起因し得る。生物活性減少を最小限にする試みとして、照射前にデバイスから空気を除去するための別なアプローチを用いた。第一の方法では、バイアルを含むデバイスを凍結乾燥器を用いて100ミクロンH g未満に排気し、密封前にバイアルをこれらの条件下に5分間おいた。第2の方法では、バイアルを含むデバイスを凍結乾燥器中で100ミクロンHg未満に排気し、これらの条件下に試料を5分間おき、次いで密封前にバイアルに2分間ヘリウムをフラッシュした。得られた試料を2.5メガラドのガンマ線で照射し、続いて実施例1の記載通りにラット皮下アッセイを用いて生物活性を分析した。結果を表5にまとめる。キャリアマトリックス材料に対する損傷を、マトリックスをPBSで抽出することにより評価し、得られた溶液の吸光度を測定し可溶化タンパク質の量を決定した。選出された抽出液をアミノ酸組成について解析したが、これは可溶化タンパク質がコラーゲン由来であり、出発キャリアマトリックス材料の1〜2％を表すことを示唆した。結果は、ヘリウムパージ後ドライアイス上で照射した試料が最も高いレベルの生物活性を保持していたことを示す。しかしながら、結果は、室温で真空下に照射されたデバイスも相当レベルの生物活性を示すことを示している。実施例3 最終滅菌デバイスの再現性標準処方プロトコルを用いて5つのロットのデバイスを製造した。簡単に言えば、47.5％エタノール／0.01％TFAに可溶化したOP-1をウシコラーゲンキャリアマトリックスと3時間インキュベートした。混合物をOP-1／マトリックススラリーとして凍結し、真空下で乾燥した。処方後、各デバイスをガラス血清バイアルに移し、バイアルを真空下に密封し、2.5〜3.0メガラドのガンマ線照射で滅菌した。デバイスはすべてガラス処方容器中で4℃で処方した。OP-1のマトリックスへの結合の程度、および照射および非照射デバイスからのOP-1の回収を示す結果を表6に示す。 3時間のインキュベーション後の溶液中に残留するOP-1の量（デバイスの凍結乾燥前）は、処方に用いたOP-1とキャリアマトリックスとの比に依存し、OP-1の濃度が高いほどマトリックスに結合したOP-1の割合が少なかった。臨床試験用デバイスを処方するために使用された比として、2.5mgのOP-1を1gのマトリックスと処方した場合、3時間のインキュベーション後53〜64％のOP-1がマトリックスに結合した。滅菌前および後にデバイスから回収されたOP-1の量はデバイスのロット間で一貫しており、デバイス製造の再現性を示している。実施例1〜2に示したデータは、ある条件下では照射はデバイスの生物学的効力を低下させ得ることを示唆している。これらの実験を、OP-1とコラーゲンマトリックスキャリア材料とのより高い重量比で処方したデバイスを評価するために拡張した。処方デバイスの生物活性に対する照射の影響を、ラット皮下アッセイで評価した。これらのデバイスはマトリックスで希釈し、特に、照射デバイスを照射マトリックスで、非照射マトリックスを非照射マトリックスで希釈し、3.12mg のOP-1と25mgのマトリックスとをラットに移植するようにした。アッセイの飽和を避けるためにデバイスを希釈した。各アッセイの結果を表7に示す。照射および非照射デバイスの生物活性には何らの違いも見られなかった。実施例4 別なキャリア材料による処方の希釈照射に伴うデバイスの生物活性に何らかの変化が起こったかどうかをさらに評価するため、最終処方濃度で3.1μgのOP-1／25mgマトリックスおよび1.5μgのOP -1／25mgマトリックスとなるように、照射および非照射デバイスを照射マトリックスおよび非照射マトリックスで希釈する実験を別途行った。照射および非照射デバイス試料を照射マトリックスおよび非照射マトリックスの双方で希釈した。試料をラット皮下アッセイを用いて評価し、結果を表8に示す。データは照射デバイスの生物学的効力を示す。デバイスの照射に伴う変化を測定するまた別な方法は、OP-1を照射デバイスから溶出し、それをHPLC、免疫ブロットおよび細胞アッセイで解析することであった。結果は、デバイスの照射が、HPLCで溶出し検出される30〜50％量のOP-1を減少させることを示している。HPLCからの画分を集め、免疫ブロットで分析した。照射後のOP-1溶出物は、HPLCから照射前の試料と同じ位置に溶出した。従って回収率の減少は照射OP-1の溶出位置の変化によるものではない。デバイスの試料を 2%SDSで抽出し、これらの抽出物を免疫ブロットおよび細胞アッセイで分析した。SDSでデバイスから溶出されたOP-1の免疫ブロット解析によれば、免疫ブロット上のタンパク質パターンは、照射の前および後で実質的に同じであるように見え、最終滅菌後に溶出されたOP-1の大部分に有意な物理的変化がないことを示している。 2つのロットのコラーゲン含有デバイス（すなわちロット番号P002-3M13D1（第 1デバイス）およびP002-4,5M13D4（第２デバイス））からのOP-1を、2％SDSで抽出した。これらの抽出物をラット骨芽細胞富化細胞アッセイでアッセイしたが、 OP-1の添加はアルカリホスファターゼの増加をもたらした（図１）。双方の場合で、照射デバイスからの抽出物の活性は、非照射対照からの抽出物の約70％であった。さらに、非照射デバイスに対する照射デバイスからのOP-1の回収の割合は、HPLCで分析すると、ロット番号P002-3M13D1とP002-4,5M13D4のデバイスでそれぞれ75％および68％であった。等価性本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく他の特定の形態でも具象化され得る。従って、本実施態様は、あらゆる局面で説明のためのものであり、制限するものではなく、本発明の範囲は上述の記載でなくむしろ添付の請求の範囲で示され、従って、請求の範囲と等価な意味および範囲内にあるすべての変更は、その中に包含されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者サンパス，クバーティー. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02053，メドウェイ，スプリングストリート６

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物に移植するための最終滅菌骨原性デバイスであって；（a）不溶性の合成ポリマーキャリア材料と、該キャリア材料中に配置されて哺乳動物中に移植された場合、軟骨性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有する単離された生物活性骨原性タンパク質とを組み合わせて含む骨原性デバイスを提供する工程；および（b）工程（a）の骨原性デバイスを、デバイスを滅菌するに十分な量のイオン化放射線に曝露し、それにより哺乳動物における軟骨性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有する最終滅菌骨原性デバイスを製造する工程により製造される、デバイス。２．前記不溶性キャリアがポリ乳酸、ポリ酪酸、ポリグリコール酸またはその混合物を含む、請求項１に記載のデバイス。３．哺乳動物に移植するための最終滅菌骨原性デバイスであって；（a）不溶性のポリマーキャリア材料と、該キャリア材料中に配置されて哺乳動物中に移植された場合、軟骨性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有する単離された生物活性骨原性タンパク質とを組み合わせて含む骨原性デバイスを提供する工程；および（b）工程（a）のデバイスを、デバイスを滅菌するに十分な量のイオン化放射線に曝露し、それにより哺乳動物における軟骨性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有する最終滅菌骨原性デバイスを製造し、ここで該最終滅菌骨原性デバイスは、滅菌前の骨原性デバイスの少なくとも約20％の生物活性を有する、工程により製造されるデバイス。４．前記キャリア材料と前記骨原性タンパク質とが重量比で約1：1〜約250,000 ：1の範囲で組み合わされる、請求項1または3に記載のデバイス。５．キャリアと骨原性タンパク質との前記重量比が、約40：1〜約50,000：1の範囲である、請求項4に記載のデバイス。６．前記イオン化放射線がガンマ線である、請求項1または3に記載のデバイス。７．前記イオン化放射線が約0.5〜約4.0メガラドの範囲内の線量で与えられる、請求項6に記載のデバイス。８．前記イオン化放射線が約2.0〜約3.5メガラドの範囲内の線量で与えられる、請求項7に記載のデバイス。９．前記イオン化放射線が電子線である、請求項1または3に記載のデバイス。 10．前記イオン化放射線が約0.5〜約4.0メガラドの範囲内の線量で与えられる、請求項9に記載のデバイス。 11．前記イオン化放射線が約2.0〜約3.5メガラドの範囲内の線量で与えられる、請求項10の記載のデバイス。 12．前記不溶性キャリア材料が多孔性粒子を含む、請求項1または3に記載のデバイス。 13．前記不溶性キャリア材料が充填粒子を含む、請求項1または3に記載のデバイス。 14．前記不溶性キャリア材料が約70〜約850μmの範囲内の粒子サイズを有する粒子を含む、請求項1または3に記載のデバイス。 15．前記不溶性キャリア材料が約125〜約450μmの範囲内の粒子サイズを有する粒子を含む、請求項14に記載のデバイス。 16．前記不溶性キャリア材料がインビボ生分解性ポリマーを含む、請求項1または3に記載のデバイス。 17．前記不溶性キャリア材料が合成ポリマーを含む、請求項3に記載のデバイス。 18．前記不溶性キャリア材料がポリ乳酸、ポリ酪酸、ポリグリコール酸、またはその混合物を含む、請求項17に記載のデバイス。 19．前記不溶性キャリア材料が天然ポリマー材料を含む、請求項3に記載のデバイス。 20．前記天然ポリマー材料がヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、コラーゲンまたはその混合物を含む、請求項19に記載のデバイス。 21．前記天然ポリマー材料が同種異系または異種骨である、請求項19に記載のデバイス。 22．前記骨原性タンパク質がOP-1、OP-2、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6 、BMP-8、BMP-9、DPP，Vg1、Vgr-1またはそれらの機能的等価物である、請求項1 または3に記載のデバイス。 23．前記骨原性タンパク質がホモダイマーである、請求項22に記載のデバイス。 24．前記骨原性タンパク質がOP-1またはその機能的等価物である、請求項1または3に記載のデバイス。 25．前記骨原性タンパク質がホモダイマーである、請求項24に記載のデバイス。 26．前記最終滅菌骨原性デバイスが哺乳動物の無血管位での関節軟骨形成の誘導能を有する、請求項1または3に記載のデバイス。 27．前記骨原性タンパク質がOP-1、OP-2、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6 、BMP-8、BMP-9、DPP、Vg1、Vgr-1またはそれらの機能等価物である、請求項26 に記載のデバイス。 28．前記骨原性タンパク質がOP-1またはその機能的等価物である、請求項26に記載のデバイス。 29．哺乳動物のあらかじめ選定した位置での軟骨性骨または関節軟骨の形成の誘導に使用するための、請求項1または3に記載の最終滅菌骨原性デバイス。 30．前記関節軟骨形成が哺乳動物の無血管位で行われる、請求項29に記載の使用。 31．前記骨原性タンパク質がOP-1またはその機能的等価物である、請求項29に記載の使用。 32．哺乳動物のあらかじめ選定した位置に軟骨性骨または関節軟骨の形成を誘導するための医薬の製造に使用するための、請求項1または3に記載の最終滅菌骨原性デバイス。 33．前記関節性軟骨形成が哺乳動物の無血管位で行われる、請求項32に記載の使用。 34．前記骨原性タンパク質がOP-1またはその機能的等価物である、請求項32に記載の使用。 35．哺乳動物に移植するための最終滅菌骨原性デバイスの製造法であって；（a）不溶性の合成ポリマーキャリア材料と、該キャリア材料中に配置されて哺乳動物中に移植された場合、軟骨性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有する単離された生物活性骨原性タンパク質とを組み合わせて含む骨原性デバイスを提供する工程；および（b）工程（a）の骨原性デバイスを、デバイスを滅菌するに十分な量のイオン化放射線に曝露し、それにより哺乳動物における軟骨性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有する最終滅菌骨原性デバイスを製造する工程を含む、方法。 36．哺乳動物に移植するための最終滅菌骨原性デバイスの製造法であって；（a）不溶性のポリマーキャリア材料と、該キャリア材料中に配置されて哺乳動物中に移植された場合、軟骨性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有する単離された生物活性骨原性タンパク質とを組み合わせて含む骨原性デバイスを提供する工程；および（b）工程（a）のデバイスを、デバイスを滅菌するに十分な量のイオン化放射線に曝露し、それにより哺乳動物における軟骨性骨形成または関節軟骨形成の誘導能を有する最終滅菌骨原性デバイスを製造し、ここで該最終滅菌骨原性デバイスは、滅菌前の骨原性デバイスの少なくとも約20％の生物活性を有する、工程を含む、方法。 37．前記骨原性タンパク質が、OP-1、OP-2、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP- 6、BMP-8、BMP-9、DPP、Vg1、Vgr-1またはそれらの機能的等価物である、請求項 35または36に記載の方法。 38．前記骨原性タンパク質がOP-1またはその機能的等価物である、請求項35または36に記載の方法。