【発明の詳細な説明】
Gタンパク質レセプターHTNAD29
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に
関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒトの7-膜貫通型レセプタ
ーである。この膜貫通レセプターは、時々本明細書以下で「Gタンパク質PAFレ
セプター」といわれる血小板活性化因子レセプターとして推定的に同定されてい
る。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。
多数の医学的に重要な生物学的プロセスが、Gタンパク質および/またはセカ
ンドメッセンジャー(例えば、cAMP)を含むシグナル伝達経路に関与するタンパ
ク質により媒介されることは、十分に確立されている(Lefkowitz,Nature,351
:353-354(1991))。本明細書中では、これらのタンパク質を、Gタンパク質を用
いた経路に関与するタンパク質またはPPGタンパク質という。これらのタンパク
質のいくつかの例としては、GPCレセプター(例えば、アドレナリン作用性薬剤
およびドーパミンに対するGPCレセプター(Kobilka,B.K.ら,PNAS,84:46-50(1
987); Kobilka,B.K.ら,Science,238:650-656(1987); Bunzow,J.R.ら,Natur
e,336:783-787(1988)))、Gタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質(
例えば、ホスホリパーゼC、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ
)、ならびにアクチュエータータンパク質(actuator protein)(例えば、プロ
テインキナーゼAおよびプロテインキナーゼC)(Simon,M.I.ら,Science,252
:802-8(1991))が挙げられる。
例えば、シグナル伝達の1つの形態では、ホルモン結合の効果は、細胞内にお
ける酵素アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性化は
、ヌクレオチドGTPの存在に依存し、そしてGTPはまた、ホルモン結合に影響を与
える。Gタンパク質は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結させ
る。Gタンパク質は、ホルモンレセプターにより活性化されると、GTPを結合型G
DPに
変換することが示された。次いで、GTPを有する形態は、活性化されたアデニル
酸シクラーゼに結合する。GTPのGDPへの加水分解は、Gタンパク質それ自体によ
り触媒され、Gタンパク質を基底の不活性な形態に戻す。従って、Gタンパク質
は、シグナルをレセプターからエフェクターに中継する中間物として、およびシ
グナルの持続時間を制御する時計としての2つの役割を果たす。
Gタンパク質共役型レセプターの膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、
7つの推定上の膜貫通ドメインを有するものとして特徴づけられている。これら
のドメインは、細胞外または細胞質ループにより結合された膜貫通αヘリックス
を表すと考えられる。Gタンパク質共役型レセプターは、ホルモン、ウイルス、
増殖因子および神経レセプターのような広範囲の生物学的に活性なレセプターを
含む。
Gタンパク質共役型レセプターは、少なくとも8つの分岐した親水性ループを
結合する、約20〜30アミノ酸のこれらの7つの保存された疎水性の範囲を含むも
のとして特徴づけられている。共役型レセプターのGタンパク質ファミリーの例
として、ドーパミンレセプターが挙げられる。これは、精神病的および神経学的
障害を処置するために使用される神経弛緩性薬物に結合する。このファミリーの
メンバーの他の例としては、カルシトニン、アドレナリン作用性、エンドセリン
、cAMP、アデノシン、ムスカリン様、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン
、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子-1レセプ
ター、およびロドプシン、臭気物質、サイトメガロウイルスレセプターなどが挙
げられる。
大部分のGタンパク質共役型レセプターは、機能的なタンパク質構造を安定化
させると考えられるジスルフィド結合を形成する最初の2つの細胞外ループの各
々に単一の保存されたシステイン残基を有する。7つの膜貫通領域はTM1、TM2、
TM3、TM4、TM5、TM6、およびTM7と命名されている。TM3は、シグナル伝達に関連
付けられている。
システイン残基のリン酸化および脂質化(パルミチル化またはファルネシル化)
は、いくつかのGタンパク質共役型レセプターのシグナル伝達に影響を与え得る
。大部分のGタンパク質共役型レセプターは、第3の細胞質ループおよび/
またはカルボキシ末端内に潜在的なリン酸化部位を含有する。いくつかのGタン
パク質共役型レセプター(例えば、β-アドレノレセプター)について、プロテ
インキナーゼAおよび/または特異的なレセプターキナーゼによるリン酸化は、
レセプター脱感作を媒介する。
Gタンパク質共役型レセプターのリガンド結合部位は、いくつかのGタンパク
質共役型レセプター膜貫通ドメインにより形成される親水性受口(socket)を含有
すると考えられ、この受口はGタンパク質共役型レセプターの疎水性残基により
囲まれている。各Gタンパク質共役型レセプター膜貫通ヘリックスの親水性側は
内側に向いており、そして極性リガンド結合部位を形成すると仮定されている。
TM3は、リガンド結合部位(例えば、TM3のアスパラギン酸残基を含む)を有する
として、いくつかのGタンパク質共役型レセプターにおいて関連付けられている
。さらに、TM5のセリン、TM6のアスパラギン、およびTM6またはTM7のフェニルア
ラニンまたはチロシンはまた、リガンド結合に関連する。
Gタンパク質共役型レセプターは、ヘテロ三量体のGタンパク質により種々の
細胞内の酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合し得る
(Johnsonら、Endoc.,Rev.,10:317-331(1989)を参照のこと)。異なるGタンパ
ク質のαサブユニットは、細胞内で種々の生物学的機能を調節するための特定の
エフェクターを優先的に刺激する。Gタンパク質共役型レセプターの細胞質残基
のリン酸化は、いくつかのGタンパク質共役型レセプターのGタンパク質結合の
調節のための重要な機構として同定されている。Gタンパク質共役型レセプター
は、哺乳動物宿主内の多数の部位において見出されている。
本発明の1つの局面によれば、新規の成熟レセプターポリペプチド、ならびに
それらの生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なフラグメント、アナロ
グおよび誘導体が提供される。本発明のレセプターポリペプチドはヒト起源であ
る。
本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドをコードする単
離された核酸分子が提供され、この核酸分子は、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、
ならびにそれらのアンチセンスアナログ、および生物学的に活性で、かつ診断ま
たは治療に有用なそれらのフラグメントを含む。
本発明のさらなる局面によれば、前記ポリペプチドの発現およびその後の前記
ポリペプチドの回収を促進する条件下で、本発明のレセプターポリペプチドをコ
ードする核酸配列を含む組換え原核生物宿主細胞および/または組換え真核生物
宿主細胞を培養する工程を包含する組換え技術によって、このようなレセプター
ポリペプチドを産生するためのプロセスが提供される。
本発明のなおさらなる局面によれば、このようなレセプターポリペプチドに対
する抗体が提供される。
本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、そし
てそれを活性化するか、またはその活性化を阻害する化合物をスクリーニングす
る方法が提供される。
本発明のなお別の実施態様によれば、血小板凝集による血友病の防止および/
または処置において、ならびに創傷治癒を促進することにおいて有用である本発
明のレセプターポリペプチドに結合し、そしてそれを活性化する化合物を宿主に
投与するプロセスが提供される。
本発明のなお別の実施態様によれば、アレルギー、炎症、血管形成後の再狭窄
、不安定狭心症、心筋梗塞、および血栓卒中(thrombotic stroke)または血栓塞
栓卒中(thromboembolytic stroke)の防止および/または処置において有用であ
る、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、そしてその活性化を阻害する化
合物を宿主に投与するプロセスが提供される。
本発明のなお別の局面によれば、本発明のポリヌクレオチド配列に特異的にハ
イブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。
本発明のなお別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードする核酸配
列における変異に関連する疾患を検出するための、およびレセプターポリペプチ
ドの可溶性形態の変化したレベルを検出するための診断的アッセイが提供される
。
本発明のなおさらなる局面によれば、このようなレセプターポリペプチド、ま
たはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、DN
Aの合成およびDNAベクターの製造に関するインビトロの目的のために利用するた
めのプロセスが提供される。
本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであ
るはずである。
以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により包囲
されるような本発明の範囲を限定することを意味しない。
図1は、血小板活性化因子レセプターとして推定的に同定されている本発明の
Gタンパク質レセプターのcDNA配列、および対応する推定アミノ酸配列を示す。
アミノ酸の標準1文字略語を使用する。配列決定を、373自動DNAシーケンサー(A
pplied Biosystcms,Inc.)を用いて行った。
図3は、本発明のGタンパク質レセプター(上の行)とヒトPAFレセプター(
下の行)との間のアミノ酸アラインメントを例示する。
本発明の1つの局面によれば、図1の推定のアミノ酸配列(配列番号2)を有
する成熟ポリペプチド、または1995年6月1日にATCC受託番号第 号として
寄託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単
離された核酸(ポリヌクレオチド)が提供される。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、白血球、肺、および
腎臓において見出され得る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト甲状腺由来のcD
NAライブラリーで発見された。これは構造的にGタンパク質PAFレセプターファ
ミリーに関連する。これは、337アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープ
ンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、ヒトPAFレセプターに最も
高い程度の相同性を示し、334アミノ酸の領域にわたって29.375%の同一性およ
び53.438%の類似性を有する。
本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA(このDNAは、cDNA、ゲノ
ムDNA、および合成DNAを含む)の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖で
あり得、そして一本鎖の場合には、コード鎖または非コード(アンチセンス)鎖
であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図1(配列番号1)
に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得るか、あ
るいはそのコード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図1(配
列番号1)のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異な
るコード配列であり得る。
図1(配列番号2)の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされ
る成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る:成熟ポ
リペプチドのコード配列のみ;成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなるコ
ード配列;成熟ポリペプチドのコード配列(および必要に応じてさらなるコード
配列)ならびに非コード配列(例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドの
コード配列の5'および/または3'非コード配列)。
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ
ドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列およ
び/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。
本発明はさらに、図1(配列番号2)の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの
改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在
する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり
得る。
従って、本発明は、図1(配列番号2)に示すものと同じ成熟ポリペプチド、
または寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの改変体を含む
。この改変体は、図1(配列番号2)のポリペプチドまたは寄託したクローンの
cDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログを
コードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、およ
び付加または挿入改変体を含む。
本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図1(配列番号1)に
示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝
子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改
変体は、1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレ
オチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的
に変化させない。
ポリヌクレオチドはまた、本発明の全長ポリペプチドのTMおよび細胞内ドメイ
ンから切断されたポリペプチドの細胞外部分であるPAFレセプターポリペプチド
の可溶性形態をコードし得る。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする
マーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列
は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供
する、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。ある
いは、例えばマーカー配列は、哺動物宿主(例えば、COS-7細胞)が使用される
場合は、赤血球凝集素(HA)タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ赤血球
凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する(Wilson,I.ら、Cell,37:7
67(1984))。
本発明はさらに、配列間に少なくとも70%、好ましくは少なくとも90%、およ
びより好ましくは少なくとも95%の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配
列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中
上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件
」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも95%、そして好ましくは
少なくとも97%の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好ましい
実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポ
リヌクレオチドは、図1(配列番号1)のcDNAまたは寄託したcDNAによりコード
される成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保
持する(すなわち、ポリペプチドは、例えば、セカンドメッセンジャー応答を誘
発することにより膜結合性PAFレセプターとして機能しなくても、レセプターに
対するリガンドを結合する能力を保持することにより可溶性PAFレセプターとし
て機能する)。
あるいは、ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズ
し、本明細書中上記したように、それに対して同一性を有し、そして活性を保持
してもよく、または保持しなくてもよい、少なくとも20塩基、好ましくは少なく
とも30塩基、そしてより好ましくは少なくとも50塩基を有し得る。例えば、その
ようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドの回収用の配列番号1の
ポリヌクレオチドに対するプローブ、またはその改変体のプローブ、あるいは診
断プローブ、またはPCRプライマーとして用いられ得る。
従って、本発明は、配列番号2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に対して少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも90%、およびより好ま
しくは少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチドならびにそのフラグメ
ント(このフラグメントは、少なくとも30塩基、および好ましくは少なくとも50
塩基を有する)ならびにこのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
プチドに関する。
本明細書中でいう寄託物(単数または複数)は、特許手続き上の微生物の寄託
の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物は、当
業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そして米国特許法第112条の下で
寄託が必要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオ
チドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、
本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中の配列の任意の記載とのい
かなる矛盾も抑えている。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実
施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわ
けではない。
本発明はさらに、図1(配列番号2)の推定のアミノ酸配列を有するか、また
は寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するPAFレセプターポリペ
プチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導
体に関する。
用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図1(配列番号
2)のポリペプチドまたは寄託したcDNAにコードされるポリペプチドをいう場合
、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性(すなわち、
PAFレセプターとしての機能)を保持するか、あるいは、ポリペプチドがGタン
パク質PAFレセプター(例えば、このレセプターの可溶性形態)として機能しな
くても、レセプターに対するリガンドを結合する能力を保持するか、のいずれか
であるポリペプチドを意味する。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合
成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
図1(配列番号2)のポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログ
または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、
もしくはアナログは、(i)1つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非
保存アミノ酸残基(好ましくは保存アミノ酸残基)で置換され、そしてこのよう
な置換されるアミノ酸残基は遺伝的コードによりコードされ得るアミノ酸残基で
あってもよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは(ii)1つ以上のアミノ
酸残基が置換基を含有するもの、あるいは(iii)成熟ポリペプチドが、ポリペプ
チドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような
別の化合物と融合されているもの、あるいは(iv)その中にさらなるアミノ酸が、
成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製のために使用される成熟ポリ
ペプチドに融合されているもの、あるいは(v)ポリペプチドのフラグメントが可
溶性であり(すなわち膜結合性ではない)、さらにリガンドを膜結合性レセプタ
ーに結合させるものであり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナロ
グは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形
態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。
本発明のポリペプチドは、配列番号2のポリペプチド(特に成熟ポリペプチド
)ならびに少なくとも70%の類似性(好ましくは少なくとも70%の同一性)を配
列番号2のポリペプチドに対して有し、そしてより好ましくは少なくとも90%の
類似性(より好ましくは少なくとも90%の同一性)を配列番号2のポリペプチド
に対して有し、そしてなおより好ましくは少なくとも95%の類似性(なおより好
ましくは少なくとも95%の同一性)を配列番号2のポリペプチドに対して有する
ポリペプチドを含み、そして一般に少なくとも30アミノ酸およびより好ましくは
少なくとも50アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を含む。
当該分野において公知なように、2つのポリペプチド間の「類似性」は、1つ
のポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第2のポリ
ペプチドの配列と比較することにより決定される。
本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成により対応
する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメン
トは全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポ
リヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを
合成するために使用され得る。
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するDNAのセグメン
トを意味する;これは、コード領域の前および後(リーダーおよびトレイラー)
の領域ならびに個々のコードセグメント(エクソン)の間の介在配列(イントロ
ン)を含む。
用語「単離された」は、物質がその本来の環境(例えば、天然に存在する場合
は、天然の環境)から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動
物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離
されていないが、天然の系において共存する物質の幾らかまたは全てから分離さ
れている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。この
ようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして/またはこのような
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてそのよ
うなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないため、なお単離され
得る。
本発明のポリペプチドは、配列番号2のポリペプチド(特に成熟ポリペプチド
)ならびに少なくとも70%の類似性(好ましくは少なくとも70%の同一性)を配
列番号2のポリペプチドに対して有し、そしてより好ましくは90%の類似性(よ
り好ましくは少なくとも90%の同一性)を配列番号2のポリペプチドに対して有
し、そしてなおより好ましくは少なくとも95%の類似性(なおより好ましくは少
なくとも95%の同一性)を配列番号2のポリペプチドに対して有するポリペプチ
ドを含み、そしてまた一般に少なくとも30アミノ酸およびより好ましくは少なく
とも50アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を有するこのようなポリペ
プチドの部分を含む。
当該分野において公知なように、2つのポリペプチド間の「類似性」は、1つ
のポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第2のポリ
ペプチドの配列と比較することにより決定される。
本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成により対応
する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメン
トは、全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明の
ポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチド
を合成するために使用され得る。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター
を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプ
チドの産生に関する。
宿主細胞は、本発明のベクター(これは、例えば、クローニングベクターまた
は発現ベクターであり得る)を用いて遺伝子操作される(形質導入されるか、ま
たは形質転換されるか、またはトランスフェクトされる)。ベクターは、例えば
、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主
細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、または本発明
の遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養され得
る。培養条件(例えば、温度、pHなど)は、発現のために選択される宿主細胞に
以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するため
に用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現す
るための種々の発現ベクターのいずれか1つに含まれ得る。このようなベクター
は、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列を包含する。このよ
うなベクターは、例えば、SV40の誘導体;細菌性プラスミド;ファージDNA;バ
キュロウイルス;酵母プラスミド;プラスミドおよびファージDNAの組み合わせ
に由来するベクター、ウイルスDNA(例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏
痘ウイルス、および仮性狂犬病)である。しかし、宿主において複製可能で、か
つ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。
適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配
列は、当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入さ
れる。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。
発現ベクター中のDNA配列は、mRNAの合成を指示する適切な発現制制配列(プ
ロモーター)に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代表的な例と
しては、以下が挙げられ得る:LTRまたはSV40プロモーター、E.coli lacまたはt rp
、λファージPLプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞あるい
はそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモ
ーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写
ターミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列
を含有し得る。
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のため
の表現型特性(例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼま
たはネオマイシン耐性、あるいは例えばE.coliにおけるテトラサイクリン耐性ま
たはアンピシリン耐性)を提供する1つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。
本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列また
は制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質
を発現させるために用いられ得る。
適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る:細菌細胞(例えば、E.coli
、Streptomyces、Salmonella typhimurium);真菌細胞(例えば酵母);
昆虫細胞(例えば、DrosophilaおよびSpodoptera Sf9);動物細胞(例えば、CH
O、COSまたはBowes黒色腫);アデノウイルス;植物細胞など。適切な宿主の選
択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した1つ以上の配列を含む
組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター(例えば、プラスミドベクターま
たはウイルスベクター)を包含し、このベクターの中に、本発明の配列が正方向
または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物
はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列(例えば、プロモーターを包含
する)を含む。非常に多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公
知であり、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌
性:pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pblues
cript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene);ptrc99a、pKK
223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性:pWLNEO、pSV2CAT、pOG4
4、pXT1、pSG(Stratagene);pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、他
の任意のプラスミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、かつ
存続可能である限り、使用され得る。
プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベク
ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子
から選択され得る。2つの適切なベクターは、PKK232-8およびPCM7である。特に
よく知られた細菌性プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PLおよ
びtrpを含む。真核生物プロモーターは、CMV即時初期型、HSVチミジンキナーゼ
、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチ
オネインIを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当
業者のレベル内である。
さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。
宿主細胞は、高等真核生物細胞(例えば、哺乳動物細胞)または下等真核生物細
胞(例えば、酵母細胞)であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞(例え
ば、細菌細胞)であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエ
レクトロポレーションにより達成され得る(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,B
asic Methods in Molecular Biology,(1986))。
宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法で、組換え配列によりコードされる
遺伝子産物を産生し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド
合成機により合成的に産生され得る。
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプ
ロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物
に由来するRNAを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得
る。原核生物宿主および真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクター
および発現ベクターは、Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual
,第2版,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)(この開示は、本明細書中に参考
として援用される)に記載されている。
本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクタ
ーにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAの
シス作用エレメントであり、通常は約10〜300bpであり、これはプロモーターに
作用してその転写を増大させる。例として、複製起点のbp100〜270の後期側のSV
40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製
起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが
挙げられる。
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点お
よび選択マーカー(例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisi ae
のTRP1遺伝子)、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来
のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、中でも解糖酵素(例え
ば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK))、α因子、酸性ホスファターゼ、ま
たは熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。異種構造配
列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに好ましくは、翻訳タンパク質
をペリプラズム腔または細胞外培地への分泌を指向し得るリーダー配列と適切な
相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴(例えば、発現さ
れた組換え産物の安定化または簡略化された精製)を与えるN末端同定ペプチド
を含む融合タンパク質をコードし得る。
細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み
取り相で、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタンパ
ク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築される。ベクターは、
1つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望さ
れる場合は宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のた
めに適切な原核生物宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimur ium
、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種
々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。
代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、
周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝的エレメントを含む市販
のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。こ
のような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Upp
sala,Sweden)およびGEM1(Promega Biotec,Madison,WI,USA)を含む。これら
のpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と
組み合わされる。
適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖に続いて、
選択されたプロモーターは適切な手段(例えば、温度シフトまたは化学的誘導)
により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
細胞は、代表的には遠心分離により回収され、物理的手段または化学的手段に
より破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音
波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法によ
り破砕され得る。このような方法は当業者に周知である。
種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い
られ得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman,Cell,23: 175(1981)に記載され
るサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細
胞株(例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株)が含まれる。哺乳動
物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならび
に任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部
位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および5'フランキング
非転写配列をまた含有する。SV40スプライス部位に由来するDNA配列、およびポ
リアデニル化部位は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するために使用され
得る。
本発明のGタンパク質PAFレセプターポリペプチドは、以下を含む方法により
組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る:硫安沈殿またはエタノー
ル沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセル
ロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレ
クチンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ(refold
ing)工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的
に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。
本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物
であり得るか、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主(例えば、培養物中の
細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞)から組換え技術により産生
され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化されないかもしれない。本発
明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトの疾患に対する処置お
よび診断の発見のための試験試薬および試験物質として使用され得る。
本発明のGタンパク質PAFレセプターは、本発明のレセプターポリペプチドを
活性化する化合物(アゴニスト)、または本発明のレセプターポリペプチドの活
性化を阻害する化合物(アンタゴニスト)をスクリーニングするためのプロセス
において使用され得る。
一般的に、このようなスクリーニング手順は、その表面で本発明のレセプター
ポリペプチドを発現する適切な細胞を提供することを含む。このような細胞とし
ては、哺乳動物、酵母、drosophila、またはE.coli由来の細胞が挙げられる。特
に、本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドは、細胞をトランスフェ
クトし、それにより、Gタンパク質PAFレセプターを発現させるのに用いられる。
次いで、発現されたレセプターを、試験化合物と接触させて、結合、機能的反応
の刺激または阻害を観察する。
1つのこのようなスクリーニング手順は、本発明のGタンパク質PAFレセプタ
ーを発現するためにトランスフェクトされるメラニン保有細胞の使用を含む。こ
のようなスクリーニング技術は、PCT WO 92/01810(1992年2月6日公開)に記
載されている。
従って、例えば、このようなアッセイは、レセプターリガンドおよびスクリー
ニングされるべき化合物の両方と、レセプターをコードするメラニン保有細胞と
を接触させることにより、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する
化合物をスクリーニングするために使用され得る。リガンドにより生じるシグナ
ルの阻害は、化合物がこのレセプターの潜在的なアンタゴニストであること、す
なわち、レセプターの活性化を阻害することを示す。
このスクリーニングは、このような細胞とスクリーニングされるべき化合物と
を接触させ、そしてそのような化合物がシグナルを生じるか、すなわち、このよ
うな化合物がレセプターを活性化するかを決定することによりレセプターを活性
化する化合物を決定するために用いられ得る。
他のスクリーニング技術は、例えば、Science、第246巻、181〜296頁(1989年
10月)に記載されるように、レセプターの活性化により引き起こされる細胞外の
pH変化を測定する系において、Gタンパク質PAFレセプターを発現する細胞(例
えば、トランスフェクトCHO細胞)の使用を含む。例えば、化合物は、本発明の
レセプターポリペプチドを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセン
ジャー応答(例えば、シグナル伝達またはpH変化)は、潜在的な化合物がレセプ
ターを活性化するか、または阻害するかを決定するために測定され得る。
別のこのようなスクリーニング技術は、Gタンパク質PAFレセプターをコード
するRNAをXenopus卵母細胞に導入し、一時的にレセプターを発現させることを含
む。次いでそのレセプター卵母細胞は、レセプターの活性化を阻害すると考えら
れている化合物をスクリーニングする場合にはレセプターリガンドおよびスクリ
ーニングされる化合物と接触され得、続いて、カルシウムシグナルの阻害または
活性化の検出が行われる。
別のスクリーニング技術は、そのレセプターがホスホリパーゼCまたはDと連
結しているGタンパク質PAFレセプターの発現を包含する。このような細胞の代
表例としては、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細胞などが挙げられ得る。スクリ
ーニングは、本明細書中上記のように、レセプターの活性化またはホスホリパー
ゼの2次シグナルに由来するレセプターの活性化の阻害の検出により達成され得
る。
別の方法は、細胞表面にレセプターを有する細胞への標識リガンドの結合の阻
害を決定することによる、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する
化合物、アンタゴニストのスクリーニングを包含する。このような方法は、細胞
がその表面にレセプターを発現するようにGタンパク質PAFレセプターをコード
するDNAで真核細胞をトランスフェクトする工程、および標識形態の公知のリガ
ンドの存在下で細胞と化合物とを接触させる工程を包含する。リガンドは、例え
ば、放射能により標識され得る。標識リガンドがレセプターに結合する量は、例
えば、レセプターの放射能の測定により測定される。レセプターに結合する標識
リガンドの減少により決定されるようにこの化合物がレセプターに結合する場合
、標識リガンドのレセプターへの結合は阻害される。
Gタンパク質PAFレセプターは、哺乳動物宿主において遍在性であり、そして
多くの病的な状態を含む、多くの生物学的機能を担う。従って、一方でGタンパ
ク質PAFレセプターを刺激し、そして他方でGタンパク質PAFレセプターをの機能
を阻害し得る化合物および薬物を見出すことが望ましい。
例えば、Gタンパク質PAFレセプターを活性化する化合物は、治療目的(例え
ば、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、尿停留(urinary retention
)、および骨粗鬆症の処置)に用いられ得る。
一般に、Gタンパク質PAFレセプターの活性化を阻害する化合物は、種々の治
療目的(例えば、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前
立腺肥大、ならびに精神病および神経性疾患(精神***病、躁病性興奮、うつ病
、譫妄、痴呆、またはハンチントン舞踏病またはGilles dila Tourett症候群の
ような重篤な精神遅滞、ジスキネジーなどを含む)の処置)に用いられ得る。G
タンパク質PAFレセプターを阻害する化合物はまた、内因性食欲不振を逆転する
ことおよび過食症の制御において有用である。
抗体は本発明のGタンパク質PAFレセプター、またはいくつかの場合には、オ
リゴヌクレオチドをアンタゴナイズし得る。これらは、Gタンパク質PAFレセプ
ターに結合するが、Gタンパク質PAFレセプターの活性を阻害するようなセカン
ドメッセンジャー応答を惹起しない。抗体は、一般に抗体の抗原結合部位に会合
する独特の決定基を認識する抗イディオタイプ抗体を包含する。潜在的なアンタ
ゴニスト化合物もまた、Gタンパク質PAFレセプターのリガンドに密接に関連す
るタンパク質、すなわち、リガンドのフラグメントを含み、これは生物学的機能
を欠失しており、そしてGタンパク質PAFレセプターに結合するときに応答を惹
起しない。
アンチセンス技術の使用によって調製されたアンチセンス構築物は、アンチセ
ンス技術は、三重らせん形成もしくはアンチセンスDNAまたはRNAを介して遺伝子
発現を制御するために用いられ得る。これらの方法の両方は、ポリヌクレオチド
がDNAまたはRNAに結合することに基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コード部分は、長さが約10〜40塩基
対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNAオリ
ゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され
(三重らせん−Leeら、Nucl.Acids Res.,6:3073(1979); Cooneyら、Science,
241:456(1988);およびDervanら、Science,251: 1360(1991)を参照のこと)、そ
れにより、転写およびGタンパク質PAFレセプターの産生を妨げる。アンチセン
スRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてmRNA分
子のGタンパク質PAFレセプターへの翻訳をブロックする(アンチセンス−Okano
、J.Neurochem.,56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibi
tors of Gene Expression,CRC Press,Boca Raton,FL(1988))。上記のオリゴ
ヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、それによって、アンチセンスRNAまた
はDNAが、Gタンパク質PAFレセプターの産生を阻害するためにインビボで発現さ
れ得る。
Gタンパク質PAFレセプターに結合する小分子は、リガンドのレセプターへの
接近を不可能にし、その結果、正常な生物学的活性が妨げられる。例えば、小ペ
プチドまたはペプチド様分子はまた、本発明のレセプターポリペプチドの活性化
を阻害するために使用され得る。
可溶性形態のGタンパク質PAFレセプター(例えば、このレセプターのフラグ
メント)は、本発明のポリペプチドに対するリガンドに結合し、そしてこのリガ
ンドが、膜結合性Gタンパク質PAFレセプターと相互作用するのを妨げることに
よりレセプターの活性化を阻害するために使用され得る。
本発明はまた、Gタンパク質PAFレセプターに結合し得ることが知られていな
いリガンドが、このようなレセプターに結合し得るか否かを決定するための方法
を提供する。この方法は、リガンドのGタンパク質PAFレセプターに対する結合
を許容する条件下で、Gタンパク質PAFレセプターを発現する哺乳動物細胞とリ
ガンドとを接触させる工程、レセプターに結合するリガンドの存在を検出する工
程、これによりリガンドがGタンパク質PAFレセプターに結合するか否かを決定
する工程を包含する。アゴニストおよび/またはアンタゴニストを決定するため
の上記の系はまた、レセプターに結合するリガンドを決定するために使用され得
る。
本発明はまた、レセプターをコードするmRNAの存在を検出することにより、細
胞表面上に本発明のGタンパク質PAFレセプターポリペプチドの発現を検出する
方法を提供する。この方法は、細胞から全RNAを得る工程、ハイブリダイズ条件
下で、そのように得られたmRNAと、レセプターをコードする核酸分子の配列内に
含まれる配列と特異的にハイブリダイズし得る少なくとも10ヌクレオチドの核酸
分子を含む核酸プローブとを接触させる工程、プローブにハイブリダイズしたmR
NAの存在を検出する工程、およびそれにより細胞によるレセプターの発現を検出
する工程を包含する。
本発明はまた、本発明のレセプターポリペプチドに関連するレセプターを同定
する方法を提供する。これらの関連するレセプターは、低ストリンジェンシーク
ロスハイブリダイゼーションにより、本発明のGタンパク質PAFレセプターポリ
ペプチドに対する相同性により、あるいは関連する天然のリガンドまたは合成の
リガンドと相互作用するレセプターおよび/または本発明のGタンパク質PAFレセ
プターポリペプチドの遺伝子的または薬理学的遮断後に類似の挙動を誘発するレ
セプターを同定することにより同定され得る。
上記のスクリーニング法により同定されるアゴニストは、血小板凝集を誘導す
ることによる血友病を処置し、そして創傷治癒を刺激するために使用され得る。
Gタンパク質PAFレセプターに対するアンタゴニスト化合物は、血管形成後の
再狭窄、不安定狭心症、血栓卒中または血栓塞栓卒中、アレルギー、炎症および
心筋梗塞を予防および/または処置するために使用され得る。
アンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア(例えば、本明細書上記に記
載のもの)を有する組成物において使用され得る。
アンタゴニストまたはアゴニストは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用
いられ得る。このような組成物は、治療的有効量のポリペプチド、および薬学的
に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理
食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、
およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投
与の様式に合わせるべきである。
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の1つまたはそれ以上の成分で満たされ
た1つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器
(単数または複数)に関して、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販
売を統制する政府機関により規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は
、ヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を表
す。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物と併用して用いられ得る
。
薬学的組成物は、例えば、局所、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、
または皮内経路による便利な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の症状
の処置および/または予防に有効な量で投与される。一般に、薬学的組成物は少
なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは1日に約
8mg/kg体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、1日に約10μg
/kg体重から約1mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮される。
Gタンパク質PAFレセプターポリペプチド、およびアンタゴニストまたはアゴ
ニスト(これらはポリペプチドである)はまた、本発明に従って、インビボでの
このようなポリペプチドの発現により用いられ得る。これはしばしば「遺伝子治
療」と呼ばれる。
従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド(DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細胞
はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該
分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを
含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作
され得る。
同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分
野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発
明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するた
めの産生細胞は、インビボで細胞を操作するため、およびインビボでのポリペプ
チドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペ
プチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業
者には明らかなはずである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レ
トロウイルス以外のもの(例えば、アデノウイルス)であり得る。これは、適切
な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得
る。
本明細書中上記のレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイ
ルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫
ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血症ウイ
ルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、
骨髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが挙げられるが、これら
に限定されない。1つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクター
は、モロニーマウス白血病ウイルスに由来する。
ベクターは、1つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモータ
ーとしては、Millerら、Biotechniques、第7巻、第9号、980-990(1989)に記載
のレトロウイルスLTR;SV40プロモーター;およびヒトサイトメガロウイルス(CM
V)プロモーター、または他の任意のプロモーター(例えば、真核生物細胞プロモ
ーター(ヒストン、pol III、およびβ-アクチンプロモーターを含むが、これら
に限定されない)のような細胞プロモーター)が挙げられるが、これらに限定さ
れない。使用され得る他のウイルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロ
モーター、チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、およびB19パルボウイルスプロ
モーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は
、本明細書中に含まれる教示から当業者に明らかである。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下
にある。使用され得る適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモータ
ー(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター);または異種プロモーター
(例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター);RSウイルス(RSV)プロモ
ーター;誘導性プロモーター(例えば、MMTプロモーター、メタロチオネインプ
ロモーター);ヒートショックプロモーター;アルブミンプロモーター;ApoAI
プロモーター;ヒトグロビンプロモーター;ウイルスチミジンキナーゼプロモー
ター(例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター);レトロウイル
スLTR(本明細書上記に記載の改変レトロウイルスLTRを含む);βアクチンプロ
モーター:およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これらに限定
されない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天
然のプロモーターであり得る。
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株に形質導入し、
プロデューサー細胞株を形成するために使用される。トランスフェクトされ得る
パッケージング細胞の例としては、Miller、Human Gene Therapy、第1巻、5-14
頁(1990)(その全体が参考として本明細書中に援用される)に記載のPE501 PA31
7、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP-e
nvAm12、およびDAN細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは
、当該分野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞を形質導入し得る。こ
のような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCa
PO4沈澱が挙げられるが、これらに限定されない。1つの代替として、レトロウ
イルスプラスミドベクターは、リポソームにカプセル化され得るか、またはPAF
を脂質に結合し得、次いで宿主に投与され得る。
プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列(単数または複
数)を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、このような
レトロウイルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで、真核
生物細胞を形質導入するために使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、
ポリペプチドをコードする核酸配列(単数または複数)を発現する。形質導入さ
れ得る真核生物細胞としては、胚芽幹細胞、胚芽肉腫細胞、ならびに造血幹細胞
、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上
皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明はまた、診断としての本発明の遺伝子の使用を意図する。例えば、いく
つかの疾患は、遺伝性欠損遺伝子から生じる。これらの遺伝子は、正常な遺伝子
の配列と欠損遺伝子の配列とを比較することにより検出され得る。その後に、「
変異体」遺伝子は、異常なレセプター活性に関連することが確認され得る。さら
に、変異体レセプター遺伝子は、変異を確認するか、または同定するためのなお
別の手段としての機能的アッセイ系(例えば、比色定量アッセイ、MacConkey
プレート上での発現、HEK293細胞のレセプター損株における相補性実験)におけ
る発現に適切なベクターに挿入され得る。一旦「変異体」遺伝子が同定されると
、「変異体」レセプター遺伝子のキャリアのための集団がスクリーニングされ得
る。
本発明の遺伝子における変異を有する個体は、種々の技術によりDNAレベルで
検出され得る。診断のために用いられる核酸は、患者の細胞(例えば、血液、尿
、唾液、組織生検物質、および剖検物質由来のものを含むが、これらに限定され
ない)より得られ得る。ゲノムDNAは、検出のために直接使用され得るか、また
は分析前にPCRを用いることにより酵素的に増幅され得る(Saikiら、Nature、32
4:163-166(1986))。RNAあるいはcDNAはまた、同じ目的のために使用され得る。
例として、本発明の核酸に相補的なPCRプライマーが、本発明の遺伝子における
変異を同定および解析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正
常な遺伝子型との比較における増幅された産物のサイズの変化により検出され得
る。点変異は、放射性標識された本発明のRNAまたは、あるいは、放射性標識さ
れた本発明のアンチセンスDNA配列に、増幅されたDNAをハイブリダイズさせるこ
とにより同定され得る。完全に対合した配列は、RNaseA消化または融解温度の
差により、誤対合した二本鎖と区別され得る。このような診断は、出生前の試験
または新生児の試験のためにも特に有用である。
対照遺伝子と「変異体」遺伝子との間の配列差異は、直接DNA配列決定法によ
り明らかにされ得る。さらに、クローニングされたDNAセグメントは、特異的なD
NAセグメントを検出するためのプローブとして使用され得る。この方法の感度は
、PCRと組み合わせた場合、非常に増強される。例えば、プライマー配列は、二
本鎖PCR産物または改変PCRより作製された一本鎖鋳型分子と共に使用される。配
列決定は、放射標識ヌクレオチドを用いた従来の手順によるか、または蛍光タグ
を用いた自動配列決定手順により行われる。
DNA配列の差異に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲル
におけるDNAフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により達成され
得る。特異的な位置での配列変化はまた、核保護アッセイ(例えば、RNaseおよ
びS1保護)または化学切断法(例えば、cottonら、PNAS,USA,85:4397-4401 198
5)により明らかにされ得る。
さらに、いくつかの疾患は、mRNAにおける変化により検出され得る遺伝子発現
の変化の結果であり、すなわち遺伝子発現の変化によって特徴づけられる。ある
いは、本発明の遺伝子は、この型のレセプターに関連する機能の減少を示す個体
を同定するための参照として使用され得る。
本発明はまた、種々の組織における本発明のPAFレセプターポリペプチドの可
溶性形態の変化したレベルを検出するための診断アッセイに関する。宿主に由来
するサンプル中の可溶性レセプターポリペプチドのレベルを検出するために使用
されるアッセイは、当業者に周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結
合アッセイ、ウェスタンブロット分析、および好ましくはELISAアッセイを含む
。
ELISAアッセイは、PAFレセプターポリペプチドの抗原に特異的な抗体、好まし
くはモノクローナル抗体を調製する工程を最初に含む。さらに、このモノクロー
ナル抗体に対するレセプター抗体が調製される。放射能、蛍光、またはこの実施
例において西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような検出可能な試薬がレセプタ
ー抗体に付着される。ここでサンプルは、宿主から取り出され、そして固体支持
体(例えば、サンプル中のタンパク質に結合するポリスチレンディッシュ)上で
インキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意の遊離のタンパク質結合部
位は、非特異的タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン)とインキュベートす
ることにより被覆される。次いで、モノクローナル抗体は、ディッシュ内でイン
キュベートされ、この間、モノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに付
着された任意のGタンパク質PAFレセプタータンパク質に付着する。全ての非結
合モノクローナル抗体は、緩衝液により洗い流される。ここで西洋ワサビペルオ
キシダーゼに連結されたレポーター抗体はディッシュ内に入れられ、これにより
PAFレセプタータンパク質に結合した任意のモノクローナル抗体へレポーター抗
体が結合する。次いで、付着されなかったレポーター抗体は洗い流される。次い
で、ペルオキシダーゼ基質は、ディッシュに添加され、そして所定の期間におけ
る発色量が、標準曲線と比較した場合の所定容量の患者サンプルに存在するPAF
レセプタータンパク質の測定値である。
本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染
色体の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし得る
。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色***
置の標識に利用可能な実際の配列データ(反復多型)に基づいた染色体標識試薬
はほとんどない。本発明に従うDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と
疾患に関する遺伝子とを相関させることにおける重要な第1段階である。
簡潔に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー(好ましくは15〜25bp)を
調製することにより染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析が、ゲ
ノムDNA内で1より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化
するプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマ
ーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用
される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグ
メントを生じる。
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当て
るための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明
を使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大き
なゲノムクローンのプールを用いて部分的局在性の決定(sublocalization)が達
成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング計画
は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別した(flow-sorted
)染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築
するためのハイブリダイゼーションによる前選択を包含する。
cDNAクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼー
ション(FISH)は、1工程で正確な染色***置を提供するために使用され得る。こ
の技術は、50または60塩基という短いcDNAで使用され得る。この技術の総説とし
ては、Vermaら,Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques,Pergamon
Press,New York(1988)を参照のこと。
一旦配列が正確な染色***置にマップされると、配列の染色体上での物理的な
位置を遺伝的地図のデータと相関させられ得る。このようなデータは、例えば、
V.McKusick,Mendelian Inheritance in Man に見出される(Johns Hopkins Uni
versity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)。次いで、同
一の染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析(物理的に隣
接した遺伝子の同時遺伝)により同定される。
次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNA配列またはゲノム配列の差異を決定
する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるがいずれ
の正常な個体にも観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるようであ
る。
物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患
に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的
原因遺伝子の1つであり得る。(これは、1メガベースのマッピング解像度で、
そして20kbあたり1遺伝子と仮定する。)
このポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらの
アナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させる
ための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗
体、またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗
体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの
産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグ
メントの産生のために使用され得る。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポ
リペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ
得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた
抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグ
メントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体
を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチド
を発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。
モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体
を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohle
rおよびMilstein,1975,Nature,256: 495-497)、トリオーマ技術、ヒトB細胞
ハイブリドーマ技術(Kozborら,1983,Immunology Today 4: 72)、およびヒトモ
ノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら,1985,Mono
clonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,77-96頁)が挙げら
れる。
単鎖抗体を産生するために記載された技術(米国特許第4,946,778号)を、本発
明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る
。また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性のポリペプチド産物に
対するヒト化抗体の発現に使用され得る。
本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する;しかし、本発明はこのよ
うな実施例に限定されないことが理解されるべきである。すべての部分または量
は、他に明記しない限り重量基準である。
以下の実施例の理解を容易にするために、頻繁に現れる特定の方法および/ま
たは用語が記載される。
「プラスミド」は、小文字のpの前および/またはそれに続く大文字および/
または数字を示すことにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販
であり、制限無く公的に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手
可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプ
ラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。
DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触
媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市
販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者
に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には1μgのプラスミドまた
はDNAフラグメントには、約2単位の酵素が約20μlの緩衝溶液中で使用される。
プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的には、代表的には5〜5
0μgのDNAが20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の制限
酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃で約
1時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の説
明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲル上で直接電
気泳動して所望のフラグメントを単離する。
切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら,Nucleic Acids Res.,8: 4
057(1980)により記載される8%ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。
「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは2つの相
補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成さ
れ得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、5'リン酸を有さず、従ってキ
ナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連
結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに
連結する。
「連結」は、2つの二本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形
成するプロセスをいう(Maniatis,Tら、前出、146頁)。他に提供されていなけれ
ば、連結は公知の緩衝液および条件で、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラ
グメント0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ(「リガーゼ」)を用いて達成さ
れ得る。
別に記載しない限り、形質転換はGraham,F.およびVan der Eb,A.,Virology
,52:456-457(1973)の方法に記載のように実施された。
実施例1 Gタンパク質共役型レセプターHTNAD29(PAFレセプター)の細菌発現および精製
PAFレセプターをコードするDNA配列(ATCC受託番号第 号)を、プロセス
されたGタンパク質の5'配列(シグナルペプチド配列を除く)およびPAFレセプ
ター遺伝子に対して3'のベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて最初に増幅する。PAFレセプターに対応するさらなるヌクレオチド
を、それぞれ5'および3'配列に添加する。5'オリゴヌクレオチドプライマー
は、配列5'CGAATTCCTCCATGAACAGCACATGTATT3'を有し、これはEcoRI制限酵素部
位、それに続くプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から始まる
18ヌクレオチドのGタンパク質PAFレセプターコード配列を含む。3'配列、5'C
GGAAGCTTCGTCAAGGACCTCTAATTCC3'は、HindIII部位に相補的な配列を含み、そし
て続いてPAFレセプターをコードするの18ヌクレオチドを含む。制限酵素部位は
、細菌発現ベクターpQE-9(Qiagen,Inc.Chatsworth,CA)上の制限酵素部位に
対応する。pQE-9は、抗生物質耐性(Ampr)、細菌の複製起点(ori)、IPTG調節
可能プロモーターオペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(RBS)、6-Hisタ
グ、および制限酵素部位をコードする。次いで、pQE-9を、EcoRIおよびHindIII
で消
化する。増幅配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードす
る配列とインフレームで挿入する。次いで、連結混合物を用いて、E .coli株 M1
5/rep 4(Qiagen,Inc.)をSambrook,J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory M
anual,Cold Spring Laboratory Press,(1989)に記載の手順により形質転換す
る。M15/rep4はプラスミドpREP4の多数のコピーを含有する。これは、lacIリプ
レッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性(Kanr)を付与する。形質転換
体をLBプレート上で増殖するそれらの能力により同定し、そしてアンピシリン/
カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、そして制限酵
素分析により確認する。所望の構築物を含むクローンを、Amp(100μg/ml)とKa
n(25μg/ml)との両方を補充したLB培地における液体培養で一晩(O/N)増殖さ
せる。O/N培養物を用いて1:100〜1:250の比で大規模な培養物に接種する。細胞
を、600の光学密度(O.D.600)が0.4と0.6との間になるまで増殖させる。次いで
、IPTG(「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」)を加えて1mMの最終
濃度にする。IPTGは、lacIリプレッサーを不活性化することにより、P/Oを解放
(clear)し遺伝子発現の増加を誘導する。細胞をさらに3〜4時間増殖させる
。次いで、細胞を遠心分離により収集する。細胞ペレットをカオトロピック薬剤
6MグアニジンHCl中で可溶化する。明澄化後、可溶化Gタンパク質PAFレセプタ
ーを、6-Hisタグを含有するタンパク質により堅く結合し得る条件下で、ニッケ
ル−キレートカラム上でのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製する(Ho
chuli,Eら、J.Chromatography 411: 177-184(1984))。PAFレセプターを6Mグ
アニジンHCl(pH5.0)でカラムから溶出し、そして再生の目的で、3MグアニジンH
Cl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン(還元型)、および2mMグルタ
チオン(酸化型)に調整する。この溶液中での12時間のインキュベーションの後
、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析する。
実施例2 COS 細胞中での組換えPAFレセプターの発現
プラスミド、PAFレセプターHAの発現を、ベクターpcDNAI/Amp(Invitrogen)
から誘導する。ベクターpcDNAI/Ampは以下を含有する:1)SV40複製起点、2)
アンピシリン耐性遺伝子、3)E.coli複製起点、4)ポリリンカー領域、SV40
イントロン、およびポリアデニル化部位が続くCMVプロモーター。PAFレセプター
前駆体全体およびその3'末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするD
NAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。それゆえ、
組換えタンパク質発現はCMVプロモーター下に支配される。HAタグは、先に記載
された(I.Wilson、H.Niman、R.Heighten、A Cherenson、M.Connolly、およ
びR.Lerner、1984,Cell 37,767)ようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパ
ク質由来のエピトープに対応する。本発明者らの標的タンパク質へのHAタグの融
合により、HAエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出
が可能になる。
プラスミド構築ストラテジーを以下に記載する:
PAFレセプターをコードするDNA配列(ATCC受託番号第 号)を、以下の2
つのプライマーを用いてクローン化された最初のESTにおけるPCRにより構築した
:5'プライマー(5'GTCCAAGCTTGCCACCATGAACAGCACATGTATT3')は、HindIII部
位、それに続く開始コドンから始まるPAFレセプターコード配列の18ヌクレオチ
ドを含む;3'配列、5'CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCAAGGACCT
CTAATTCCATA3'は、XhoI部位、翻訳停止コドン、HAタグ、およびPAFレセプター
コード配列の最後の18ヌクレオチド(停止コドンは含まない)に相補的な配列を
含む。それゆえ、PCR産物は、部位、インフレームで融合したHAタグが続くレセ
プターコード配列、HAタグに隣接する翻訳終結停止コドン、およびXhoI部位を含
む。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクター (pcDNAI/Amp)を、HindIIIおよび
XhoI制限酵素を用いて消化し、そして連結した。連結混合物を、E.coli SURE株
(Stratagene Cloning Systems,11099 North Torrey Pines Road,La Jolla,C
A 92037より入手可能)に形質転換し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレ
ートに播種し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体か
ら単離し、そして正しいフラグメントの存在を制限酵素分析で調べた。組換えPA
Fレセプターの発現のために、COS細胞をDEAE-DEXTRAN法(J.Sambrook、E.Frit
sch,T.Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring La
boratory Press,(1989))により発現ベクターでトランスフェクトした。PAF
レセプターHAタンパク質の発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出した
(E.Harlow,D.Lane,Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbo
r Laboratory Press,(1988))。細胞を、トランスフェクションの2日後、35S-
システインで8時間標識した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性
剤(RIPA緩衝液(150mM NaCl、1% NP-40、0.1% SDS、1% NP-40、0.5% DOC
、50mM Tris(pH7.5))で溶解した(Wilson,I.ら、同上37:767(1984))。細胞溶解
物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体を用いて沈降させた。
沈降したタンパク質を15% SDS-PAGEゲルにおいて分析した。
実施例3 バキュロウイルス発現系を用いるGタンパク質共役型レセプター(PAFレセプター )のクローニングおよび発現
全長のPAFレセプタータンパク質をコードするDNA配列(ATCC受託番号第
号)を、この遺伝子の5'配列および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチド
プライマーを用いて増幅した:
5'プライマーは、配列5'CGGGATCCCTCCATGAACAGCACATGTATT3' を有し、そし
てBamHI制限酵素部位(太字)と、それに続く真核生物細胞における翻訳の開始
に効率的なシグナルに類似する4つのヌクレオチド(J.Mol.Biol.1987,196
,947-950,Kozak,M.)、およびすぐ後ろにこのPAFレセプター遺伝子の最初の1
8ヌクレオチド(翻訳の開始コドン「ATG」に下線を付する)を含有する。
3'プライマーは、配列5'CGGGATCCCGCTCAAGGACCTCTAATTCCATA3'を有し、そ
して制限エンドヌクレアーゼBamHIの切断部位およびこのPAFレセプター遺伝子の
3'非翻訳配列に相補的な18ヌクレオチドを含む。増幅した配列を、市販のキッ
ト(「Geneclean」BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)を用いて、1%アガロースゲ
ルから単離した。次いで、このフラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIで消化
し、そして上記のように精製した。このフラグメントを、F2と呼ぶ。
ベクターpRG1(pVL941ベクターの改変体、下記)を、バキュロウイルス発現系
を用いるPAFレセプタータンパク質の発現のために用いる(総説について、Summe
rs,M.D.およびSmith,G.E.1987,Amanual of methods for baculovirus vect
ors and insect cell culture procedures,Texas Agricultural Experimental
Station Bulletin No.1555を参照のこと)。この発現ベクターは、Autographa
californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の強力なポリヘドリンプロモーター
、それに続く制限エンドヌクレアーゼBamHIの認識部位を含む。シミアンウイル
ス(SV)40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。
組換えウイルスを容易に選択するために、E.coli由来のβ-ガラクトシダーゼ遺
伝子をポリヘドリンプロモーターと、それに続くポリヘドリン遺伝子のポリアデ
ニル化シグナルと同方向に挿入する。ポリヘドリン配列を、コトランスフェクト
した野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列に両端で
隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターが、pRG1の代わりに用いられ
得る。例えば、pAc373、pVL941、およびpAcIM1である(Luckow,V.A.およびSumm
ers,M.D.、Virology,170:31-39)。
プラスミドを制限酵素BamHIで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔
ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、DNAを、上記のように
、1%アガロースゲルから単離した。このベクターDNAをV2と呼ぶ。
フラグメントF2および脱リン酸化したプラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用い
て連結した。次いで、E.coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIを用い
て、PAFレセプター遺伝子を有するプラスミド(pBacPAF receptor)を含む細菌
を同定した。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認した。
5μgのプラスミドpBacPAF receptorを、リポフェクション法(Felgnerら Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413-7417(1987))を用いて、1.0μgの市販の線
状化したバキュロウイルス(「BaculoGoldTM baculovirus DNA」,Pharmingen,
San Diego,CA.)とともにコトランスフェクトした。
1μgのBaculoGoldTMウイルスDNAおよび5μgのプラスミドpBacPAF receptorを
、50μlの無血清Grace培地(Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)を含
むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、10μlのリポ
フェクチンおよび90μlのGrace培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間イ
ンキュベートした。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清を含まな
いGrace培地1mlを含有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞(
AT
CC CRL 1711)に滴下して加えた。プレートを、新たに加えられた溶液を混合す
るために、前後に振動させた。次いでプレートを、27℃で5時間インキュベート
した。5時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10%
ウシ胎児血清を補充した1mlのGrace昆虫培地を添加した。プレートをインキュ
ベーターに戻し、そして27℃で4日間培養を続けた。
4日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith(前出)による記載と同様
にプラークアッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラークの容易な
単離を可能にする、「Blue Gal」(Life Technologies Inc.,Gaithersburg)を
有するアガロースゲルを用いた。(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、
Life Technologies Inc.、Gaithersburgが配布する昆虫細胞培養およびバキュロ
ウイルス学の使用者ガイド(9〜10頁)においても見い出され得る)。
ウイルスの連続希釈物を細胞に加えた4日後、青く染色されたプラークをエッ
ペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、
200μlのGrace培地を含むエッペンドルフチューブ中で再懸濁した。寒天を、短
かい遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35mm
ディッシュに播種されたSf9細胞に感染させるために用いた。4日後、これらの
培養ディッシュの上清を収集し、次いで4℃で保存した。
Sf9細胞を、10%熱不活化FBSを補充したGrace培地中で増殖させた。細胞を、
感染多重度(M0I)2で、組換えバキュロウイルスV-PAFレセプターで感染させた
。6時間後、培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900
II培地(Llfe Technologies Inc.,Gaithersburg)に置き換えた。42時間後、5
μCiの35S-メチオニンおよび5μCiの35Sシステイン(Amersham)を添加した
。細胞をさらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により収集し、
そして標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可
視化した。
実施例4 遺伝子療法を介しての発現
線維芽細胞を、皮膚生検により被験体から得る。得られた組織を、組織培養培
地中に置き、そして小片に分ける。組織の小塊(small chunk)を、組織培養フ
ラスコの湿潤表面に置き、およそ10片をそれぞれのフラスコ中に置く。フラスコ
の上下を逆さにし、密閉し、そして室温にて一晩置く。室温にて24時間後、フラ
スコを逆さにし、そして組織の塊をフラスコの底に固着したままにし、そして新
鮮な培地(例えば、10%FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するH
amのF12培地)を添加する。次いで、これを37℃にておよそ1週間インキュベー
トする。この時点で、新鮮な培地を添加し、その後数日毎に取り替える。さらに
2週間培養後、線維芽細胞の単層が出現する。単層をトリプシン処理し、そして
より大きなフラスコ中に掻き落とす。
モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復に隣接するpMV-7(Kirschmeier,P.
T.ら,DNA,7: 219-25(1988))を、EcoRIおよびHindIIIで消化し、その後仔ウシ
腸ホスファターゼを用いて処理する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、
そしてガラスビーズを用いて精製する。
本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、それぞれ5'末端配列および3'末
端配列に対応するPCRプライマーを用いて増幅する。5'プライマーはEcoRI部位
を含み、そして3'プライマーはさらにHindIII部位を含む。T4 DNAリガーゼの存
在下で、等量のモロニーマウス肉腫ウイルスの線状骨格ならびにEcoRIおよびHin
dIIIフラグメントを一緒に加える。得られた混合物を、2つのフラグメントの連
結に適切な条件下で維持する。連結混合物を用いて細菌HB101を形質転換し、次
いでこれを、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する
目的のために、カナマイシンを含有する寒天上にプレーティングする。
アンホトロピックなpA317またはGP+am12パッケージング細胞を、10%仔ウシ血
清(CS)、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するDulbecco改変Eagle
培地(DMEM)中でコンフルエントな密度になるまで組織培養物中で増殖させる。
次いで、遺伝子を含むMSVベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞
をベクターを用いて形質導入する。この時、パッケージング細胞は、遺伝子を含
有する感染性のウイルス粒子を産生する(この時、パッケージング細胞は、プロ
デューサー細胞と呼ばれる)。
新鮮な培地を、形質導入したプロデューサー細胞に添加し、その後、培地を、
コンフルエントなプロデューサー細胞の10cmプレートから収集する。感染性のウ
イルス粒子を含有する使用済みの培地を、ミリポアフィルターを通して濾過して
、剥離したプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を用いて線維芽細胞を
感染させる。培地を、サブコンフルエントな線維芽細胞のプレートから除去し、
そして迅速にプロデューサー細胞からの培地と置き換える。この培地を除去し、
そして新鮮な培地で置き換える。ウイルスの力価が高い場合、実質的に全ての線
維芽細胞が感染し、そして選択は必要ない。力価が非常に低い場合、選択マーカ
ー(例えば、neoまたはhis)を有するレトロウイルスベクターを使用することが
必要である。
次いで、操作された線維芽細胞を、単独で、またはcytodex3マイクロキャリア
ービーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後のいずれかで宿主に注入す
る。この時、線維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。
本発明の多数の改変および変更が、上記の教示を参照して可能であり、従って
、添付する請求の範囲の範囲内で、本発明は特記した以外の方法で実施され得る
。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
A61K 45/00 AED C12P 21/02 C
48/00 ACB C12Q 1/68 A
C07K 14/705 G01N 33/15 Z
16/28 33/50 T
C12N 5/10 33/53 D
C12P 21/02 C12P 21/08
C12Q 1/68 A61K 39/395 D
G01N 33/15 C12N 5/00 B
33/50 A61K 37/02 ADS
33/53 ABF
// C12P 21/08 ABE
(C12P 21/02 ABS
C12R 1:91)
A61K 39/395
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,MW,SD,SZ,UG),
AM,AT,AU,BB,BG,BR,BY,CA,C
H,CN,CZ,DE,DK,ES,FI,GB,GE
,HU,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LK,
LT,LU,LV,MD,MG,MN,MW,MX,N
O,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SI
,SK,TJ,TT,UA,US,UZ,VN
(72)発明者 フルドナー,レベッカ エイ.
アメリカ合衆国 バージニア 20838,バ
ーネスビル,バーネスビル ロード
18040,ピー.オー.ボックス 306