JPH11505426A - 核酸単離法 - Google Patents
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.粒子状の支持体への核酸物質の吸着工程を含む、サンプル内に存在する核酸 物質の水性相での単離方法において、 吸着試薬の製造工程(a)において、機能化された粒子状のポリマーを含む粒子 状の支持体の不連続相と水性連続相から成るゾルを含む吸着試薬が入手可能であ り、該ポリマーは(1)アクリルアミドまたはアクリルアミド誘導体の第一の水溶 性モノマー、(2)少なくとも一つの架橋剤、および(3)少なくとも第二のカチオン 性の水溶性機能的モノマーの重合によって得られ、該ポリマーは25と45℃の間の 所定の下部臨界溶解温度(LCST)を持っており、 接触工程(b)において、吸着試薬を核酸物質を含むサンプルと接触させ、 (b)による接触のための吸着工程(c)において、反応媒体に対して少なくとも一 つの以下のパラメーターが選択され、 ・高くとも7に等しいpH ・高くとも10-2Mに等しいイオン強度 ・ポリマーのLCST未満の温度 分離工程(d)において、吸着が起こったことが必要に応じて観察された後に、 不連続相を連続相から分離し、 脱着工程(e)において、10-2M以上のイオン強度までイオン強度を増大すること による粒子状支持体からの脱着により、核酸物質を引き離すことを特徴とする単 離方法。 2.脱着工程(e)に対して、pHと温度から選択された少なくとも一つのパラメー ターを、さらに以下のように変化させる: ・7より高いpHまでpHを増大する ・ポリマーのLCSTより高い温度まで温度を増大する ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 3.粒子状支持体への核酸物質の吸着工程を含む、サンプル内に存在する核酸物 質の水性相での単離方法において、 吸着試薬の製造工程(a)において、機能化された粒子状のポリマーを含む粒子 状 の支持体の不連続相と水性連続相から成るゾルを含む吸着試薬が入手可能であり 、該ポリマーは(1)アクリルアミドまたはアクリルアミド誘導体の第一の水溶性 モノマー、(2)少なくとも一つの架橋剤、および(3)少なくとも第二のカチオン性 の水溶性機能的モノマーの重合によって得られ、該ポリマーは25と45℃の間の所 定の下部臨界溶解温度(LCST)を持っており、 接触工程(b)において、吸着試薬を核酸物質を含むサンプルと接触させ、 (b)による接触のための吸着工程(c)において、反応媒体に対して高くとも10-2 Mと等しいイオン強度を選択し、 分離工程(d)において、吸着が起こったことが必要に応じて観察された後に、 不連続相を連続相から分離することを特徴とする単離方法。 4.(b)による接触のための吸着工程(c)において、反応媒体に対して少なくとも 一つの以下のパラメーター ・高くとも7に等しいpH ・ポリマーのLCST未満の温度 を加えて選択することを特徴とする請求項3に記載の方法。 5.(1)アクリルアミドまたはアクリルアミド誘導体の第一の水溶性モノマー、( 2)少なくとも一つの架橋剤、および(3)少なくとも第二のカチオン性の水溶性機 能的モノマーの重合によって得られる機能化した粒子状ポリマーより成る粒子状 の支持体で、該ポリマーは25と45℃の間、好ましくは30と40℃の間の所定の下部 臨界溶解温度(LCST)を持つことを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の方 法。 6.粒子状支持体が、加えて、上記粒子状ポリマーで完全にまたは部分的に被覆 された有機または無機コアを含み、該コアは上記核酸物質に関してポリマーの吸 着性を変えないことを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の方法。 7.コアがポリスチレンコアであることを特徴する請求項6に記載の方法。 8.コアが磁性化合物を含むことを特徴とする請求項6または7に記載の方法。 9.核酸物質と特異的にハイブリダイズできる少なくとも一つのプローブ、およ び/または一つのプライマーを工程(b)の前のサンプルに、またはステップ(b)の 後、特にステップ(c)またはステップ(d)の後の反応媒体に加えることを特徴とす る請求項1から8のいずれかに記載の方法。 10.(b)と(c)で、ハイブリダイゼーション試薬を得るためにプローブとプライマ ーより成る核酸物質に吸着試薬を接触させ、 (b')において、吸着が起こり、反応媒体からハイブリダイゼーション試薬を分 離したことが随意に観察された後、ハイブリダイゼーションまたはプライマーの 伸長のために適したコンディションの下で、少なくとも一つの核酸または核酸断 片を含む媒質と上記ハイブリダイゼーション試薬を接触させることを特徴とする 請求項1から8のいずれかに記載の方法 11.ポリマーのLCSTが30から40℃の間であることを特徴とする請求項1から10の いずれかに記載の方法。 12.第一のモノマー(1)が、N-アルキルアクリルアミドとN,N-ジアルキルアクリ ルアミドから選択されることを特徴とする請求項1から11のいずれかに記載の方 法。 13.第一のモノマー(1)が、N-イソプロピルアクリルアミド、N-エチルメタクリ ルアミド、N-n-プロピルアクリルアミド、N-n-プロピルメタクリルアミド、N-イ ソプロピルメタクリルアミド、N-シクロプロピルアクリルアミド、N,N-ジエチル アクリルアミド、N-メチル-N-イソプロピルアクリルアミド、N-メチル-N-n-プロ ピルアクリルアミドから選択され、第一のモノマーは好ましくはN-イソプロピル アクリルアミド(NIPAM)であることを特徴とする請求項12に記載の方法。 14.第二の機能的なモノマー(類)は、アクリル酸とメタクリル酸誘導体、塩化2- アミノエチルメタクリル酸(AEM)、N-ビニルピリジン誘導体、トリアルキルアン モニウム誘導体、および塩化イソチオウロニウム誘導体から選択されることを特 徴 とする請求項1から13のいずれかに記載の方法。 15.水溶性架橋剤(2)が、N,N-メチレンビスアクリルアミド(MBA)、エチレングリ コールジメタクリラートから選択されることを特徴とする請求項1から14のいず れかに記載の方法。 16.重合開始剤が塩化2,2'-アゾビスアミジノプロパン(V50)のような水溶性、中 性、カチオン性の開始剤であることを特徴とする請求項1から15のいずれかに記 載の方法。 17.分離工程(d)後に、イオン強度、pHそして温度から選択される少なくとも一 つのパラメーターを以下のように ・10-2Mより高いイオン強度までイオン強度を増大する ・7より高いpHまでpHを増大する ・ポリマーのLCSTより高い温度まで温度を増大する 変化させることによって、粒子状の支持体から脱着により核酸物質を引き離すこ とによる脱着工程を含むことを特徴とする請求項3に記載の方法。 18.分離工程(d)は、好ましくは遠心分離、濾過、沈殿、沈降、そして磁場の応 用から選択される方法にしたがって実施されることを特徴とする請求項1から17 のいずれかに記載の方法。
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