【発明の詳細な説明】
酵母における安定な抗体フラグメントの生産
本発明は、抗体フラグメントおよび類縁体の生産に関する。近年、抗体フラグ
メントの生産に相当の関心が向けられている。特に関心の高いフラグメントの１
つは、いわゆるＦｖフラグメントであり、これは、抗体の軽鎖の可変ドメインと
、会合するその抗体の重鎖の可変ドメインとからなるものである。抗体全体にお
いてこれらのドメインを会合させる分子間力は、Ｆｖフラグメントにおいてもそ
れらを一緒に保つ。
Ｆｖフラグメントの個々のドメインは、遺伝的に形質転換された生物により各
々発現させることができる。それらがいったん溶液中で共存すると、それらは偶
発的に会合し、所望のＦｖフラグメントを与える。
形質転換された微生物による単一の抗体ドメインの発現は、ヨーロッパ特許第
３６８６８４号（Ｍedical Ｒesearch Ｃouncil）において十分考察されている
。
軽鎖および重鎖からの必要な可変ドメインが溶液中に共存する場合、それらは
一般に偶発的に必要なＦｖフラグメントへと会合する。会合は、それらのドメイ
ンの濃度が高いことによって特に有利になる。しかし、両方の可変ドメインを等
量で溶液中で、そして会合に有利な適切な濃度で産生させることは簡単ではない
。１つの可能性は、それらを別個の宿主生物を用いて発現させ、次いでそれらを
一緒にすることである。しかし、これは、２つの宿主生物の形質転換を必要とし
、発現される可変ドメインの量は互いに一致しない可能性がある。さらに、軽鎖
なしでの重鎖の発現は、しばしばそれを発現する細胞にとって有害であり、その
ため工業的生産に好適な濃度を得ることが困難になると一般に考えられている。
別の可能性は、単一の形質転換された宿主が両方の可変ドメインをコードする
遺伝情報を含むように宿主生物を形質転換することである。これは、Ｒeichmann
ら（Ｊ.Ｍol.Ｂiol.203.825(1988)）に開示されたように、両方のドメインをコ
ードする遺伝情報を単一のベクター上に組み立てることにより達成される。しか
し、この場合には、宿主生物は２つの可変ドメインを等量で発現しない可能性が
あり、
そのため、非生産的な合成に細胞代謝を浪費することになり、この場合も一方の
鎖の余剰から細胞に害を与える危険がある。
これらの困難を回避する１つの方法は、ヨーロッパ特許第２８１６０４Ｂ号に
提案されており、これには、各可変ドメインの結合部分を、これらを結び付ける
連結(リンク)ペプチド配列とともに含む単一のポリペプチドの生産が開示されて
いる。このリンクペプチド配列は、単一ポリペプチドが発現された後に、２つの
可変ドメインの結合部分が会合してＦｖフラグメントのアナログ分子（いわゆる
単鎖Ｆｖフラグメント）を形成しうるように設計される。ヨーロッパ特許第２８
１６０４Ｂ号には、２つの重要な利点がある。第一は、２つのドメインが等量で
産生されることである。第二は、２つのドメインが、（連結されているために）
高い「局所的」濃度で産生され、したがって会合に非常に有利になることである
。
この従来技術においては、この単一ポリペプチド分子の設計はある妥協を必要
とすることが説明されている。連結領域は、軽鎖のＣ末端領域から重鎖のＮ末端
領域に広がるべきであることが教示されている。しかし、それは、これらの末端
領域の端をつなぐべきではない。これらの末端領域は天然の抗体においては（そ
して、完全Ｆｖフラグメントにおいても同様に）比較的遠く離れているからであ
る。
その代わりに、ペプチドリンクは、軽鎖のＣ末端からいくらか内側に間隔を置
いた地点から、重鎖のＮ末端からいくらか内側に間隔を置いた地点まで広がるべ
きであるが、これらは天然の抗体においては幾分比較的近傍にある地点である。
このことの結果は、軽鎖のＣ末端に隣接する部分と重鎖のＮ末端に隣接する部分
とは、発現されず、その代わりにリンクペプチドで置換されている、ということ
である。そうであっても、このペプチドリンクは、２つの可変ドメインがフォー
ルディングし互いに会合することを可能にするのに十分な長さであるように、注
意して設計されなければならない。
ＥＰ−Ａ−３１８５５４から分割されたＥＰ−Ａ−６２３６７９も、各可変ド
メインの結合部分を、それらをつなぐリンクペプチド配列とともに含む単一ポリ
ペプチドの発現を開示する。この書類は、リンクは少なくとも１０アミノ酸の長
さを有するべきであることを教示し、リンクペプチドは部位特異的切断剤により
認識されうる切断部位を含むことができることに言及している。これは後でＶH
およびＶLドメインを分離すること、あるいはそのリンカーをフォールディング
後に結合部位で切り出すことを可能にしうることが述べられている。この書類で
は、いかにしてそのような構築体が処理または利用されるかは明らかにされてい
ない。しかし、ＶHおよびＶLドメインを連結することは、結合特性にほとんどま
たは全く害がなく、改善さえする可能性があることを示唆している。
単鎖Ｆｖをコードする遺伝子構築体は、抗体フラグメントの生産においていく
つかの明確な利点を有するが、得られる単鎖Ｆｖタンパクは、軽鎖および重鎖の
間にリンクを持たないＦｖフラグメントと比較して、その性能においては失望さ
せるものである。これは、この２つの異なるタンパク構造の安定性（安定性は産
業上の応用について非常に重要な性能の基準である）を比較することにより以下
に説明される。３７℃で長い期間貯蔵した場合、単鎖Ｆｖフラグメントは通常の
（二本鎖）Ｆｖフラグメントよりも安定であるが、我々は、それらが一連の凍結
融解サイクルのような生物物理的ショックにより完全に不活性化されることを観
察した。これに対し、真の（二本鎖）Ｆｖフラグメントは、ほとんど活性を失わ
ずに凍結融解サイクルを耐え抜くことができる。この非常に驚くべき発見につい
ての可能な説明は、単鎖Ｆｖフラグメントは（リンカーを介した）その２つの成
分ドメインの共有結合によるカップリングのため変性に対して内在的により抵抗
性であり、そのため二本鎖Ｆｖよりも長い期間３７℃での貯蔵に耐えることがで
きるが、しかし、単鎖Ｆｖが生物物理的ショックにより完全に変性すると、リン
カーの存在が、生理学的状態に戻る際に起こるはずの再フォールディング過程に
干渉することである。これに対し、二本鎖Ｆｖは変性されることにより生物物理
的ショックに耐え、続いてうまく再フォールディングすることができる。どのよ
うな説明であれ、産業上応用することを意図された抗体フラグメントは、温度上
昇、凍結融解、または極端なｐＨのような変性の可能性の高い変動に対処するの
に十分に強固であるべきである。Ｆｖを変性させるのに十分な生物物理的ショッ
クは、例えば精製中にアフィニティカラムからＦｖを除去するために用いられる
可能性がある。結果として、自発的に再フォールディングする能力は、貴重であ
る。また、単鎖Ｆｖフラグメントは、非特異的結合を多く与える傾向を有し、こ
れは、通常は好ましくない。
本発明においては、重鎖および軽鎖の会合部分（associative portions）、例
えばそれらの可変ドメインの結合領域は、それらがリンクペプチドを通じてつな
がれている単一のポリペプチドの部分として発現される。しかし、この連結は、
そのポリペプチドを発現する形質転換生物により産生される酵素による切断のた
めの部位を含む。単鎖ポリペプチドの発現中または発現後に、それは、それが発
現された培養にいまだある間にこの切断部位で切断され、それにより、重鎖およ
び軽鎖の部分をお互いから切り離し、それらが偶発的に会合することを可能にす
る。
したがって、本発明は、抗体の軽鎖および重鎖の会合部分を含むＦｖ抗体フラ
グメントまたは他の生成物を、
−その２つの鎖のその部分をコードするヌクレオチド配列を、これらの間に挟
まれ、リンクペプチド配列をコードする付加的なヌクレオチド配列を用いて連結
し、
−宿主生物を形質転換して、上記連結したヌクレオチド配列を取り込ませ、
−上記形質転換生物を培養して、上記付加的なヌクレオチド配列によりコード
されるリンクペプチド配列により連結された上記軽鎖および重鎖の部分を含むポ
リペプチドを発現させること
により調製する方法であって、上記リンク配列が形質転換生物により産生され
る酵素により酵素的に切断されるように、リンクペプチド配列中に切断部位を含
むことを特徴とする方法を提供する。
したがって、本発明においては、形質転換生物は２つのペプチド鎖を合成し、
その両方が望ましいものであり、その両方が最終生成物になるが、それらは最初
はつながれており、それらの間の連結部の合成後に上記生物により互いに分離さ
れることは、認識されるべきである。発現された単一のポリペプチドは、短時間
は遷移状態として存在してもよく、その第二の鎖の合成中に切断が起こることも
可能である。これは、この単一の発現されたポリペプチドがそうでなければ宿主
生物に有害であるという問題を回避することができる。
切断を行う酵素は、形質転換生物の膜に存在する酵素であることができ、また
はその生物により産生された細胞外酵素であってもよい。この事象においては、
リンクペプチドの切断は、タンパクが膜を通して外に分泌される際に、または周
囲の培地中で、起こることになる。
本発明の方法は、一般に、抗体鎖の２つの部分の少なくとも１つ、おそらくは
両方が、リンクペプチドの残存物（非常に小さい可能性があるが）により延長さ
れた生成物をもたらす。完全に切断除去されるリンクペプチドを設計することも
（おそらくは不便だが）可能である。
本発明は、特にＦｖフラグメントの生産のために考えられている。２つの鎖の
会合部分は、その可変ドメインまたは少なくともその結合領域である。そうする
と、生成物は、可変ドメインの少なくとも１つ、おそらくは両方にリンクペプチ
ドの残存物が付着したＦｖ抗体フラグメントとなる。
重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの間のリンクを提供するペプチド配
列は、単一ポリペプチドの発現の後に切断されるので、それらの間のリンクペプ
チドの長さを選ぶ際に、選択の自由度が大きい。さらに、所望の可変ドメインの
末端部分を、それらの間のリンクの長さを減らすために、除く必要がない。
所望の可変ドメインの末端部分を除く必要はないが、それにもかかわらず、望
ましい場合には、これを行うことができる。一般に、ヌクレオチド配列は、少な
くとも抗体可変ドメインの結合領域をコードする。
本発明の１つの形態においては、抗体鎖間のリンクは十分に短く、例えば１０
アミノ酸未満であり、２つの鎖はリンクが切断されるまで会合できない。この結
果は、（フォールディングした）単鎖Ｆｖが一過的な生成物として産生されない
ことである。
軽鎖および重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列は、存在する遺伝
物質のクローニングにより得ることができる。これは、バイオテクノロジーの技
術分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うことができる
。この技術についての参考文献としては、Ｓaiki et al.,Ｓcience 230,1350(19
85);Ｓcharf et al.,Ｓcience 233,1076(1986);およびＳaiki et al.,Ｓcience 239
,487(1988)がある。
可変ドメインのクローニングに対するその応用は、Ｏrlandi,Ｗinter et al.,
ＰＮＡＳ ＵＳＡ 86,3833(1989)およびＥＰ−Ａ３６８６８４に記載されている
。
ＰＣＲ技術の基本は、
−核酸ストランド中の必要なヌクレオチド配列の露出、
−必要な配列の末端に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング
、および
−プライマーから伸長する相補的核酸ストランドの合成
を含む工程のサイクルの反復的な実行であり、これらの工程は、必要な配列の
１つの末端に隣接する１つの核酸ストランドにアニーリングすることができるプ
ライマーと、必要な配列の反対側の末端に隣接する相補的核酸ストランドにアニ
ーリングすることができる第二のプライマーとを利用して実施され、それにより
その２つのプライマーにより定められた末端部分を有する必要な配列である核酸
のストランドのクローンが生成される。
リンクペプチドをコードするリンクヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド
合成により直接作成することができる。
３つのヌクレオチド配列を組み立ててフレームを合わせた（in-frame）単一ヌ
クレオチド配列を形成することは、組換えＤＮＡ技術の標準的技法を用いて実施
することができる。これを容易にするために、ＰＣＲ反応に用いられるプライマ
ーが制限部位を提供すること、およびリンクヌクレオチド配列も制限部位を包含
することが好ましい。
組換えＤＮＡ技術の標準的技法を用いて、宿主生物をそのヌクレオチド配列で
形質転換することができる。
１つの可能性は、宿主生物がリンクペプチド中の切断部位を認識するプロテア
ーゼ酵素をも発現するように、宿主生物の遺伝物質を形質転換することである。
本発明の１つの展開において、リンクペプチドは、アッセイおよび／または精
製中にＦｖフラグメントの認識のために用いることができるアミノ酸の配列を包
含するように設計される。このような配列の認識は、切断後に利用されることに
なり、その段階で認識配列はＦｖフラグメントの１つの鎖に付着したリンクペプ
チドの残存物として存在するべきである。
本発明の別の展開においては、リンクペプチド配列は、２つの切断部位を包含
するように設計される。このペプチド配列がこれらの部位で切断される場合に、
その一部分は切り出される。結果として、形成される抗体フラグメントは、リン
クペプチドの非常に小さい残存物しか含まないか、あるいは全く残存物を含まな
い。
酵母は、現在、形質転換して、後に切断されるペプチド鎖を発現させるのに用
いるための生物として好ましい。特に、アルコール資化性（methylotropic）酵
母類、中でもＰichia pastorisおよびその近縁のＨansenula polymorphiaを用い
ることができる。
リンクペプチドを切断する好ましいプロテアーゼは、ＫＥＸ２タイプのもので
ある。プロテアーゼのこのグループの酵素は多くの生物で見出されている。これ
らは、ペプチド鎖のフォールディングにより隠されているのではなく、露出した
位置にあることを条件に、…Ｌｙｓ−Ａｒｇ…の特異的切断部位を認識し、その
隣接部を切断する。切断は、アルギニンの隣で起こり、
…Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｘ−…
が
…Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＣＯＯＨ＋Ｈ2Ｎ−Ｘ…
に切断される。ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、Ａｒｇ−ＣＯＯＨは、
切断後にこのアルギニン残基がＣ末端となることを示す。
形質転換生物内における発現および２つのペプチド鎖への切断の後には、一般
的には、所望のＦｖフラグメントをそれが形成された組成物中の他の成分から分
離する、収穫または回収の工程が続く。特に、これらは、望ましくは、切断の工
程を行った酵素から分離される。ポリペプチドのような生物学的分子の収穫のた
めの技術は周知である。アフィニティクロマトグラフィが広く使われている。
本発明は、２つの鎖の部分が更なるポリペプチドにより延長されている形態(
ボディ)の製造に応用することができる。これらは、第二の抗体の鎖の可変ドメ
インを含むことができ、したがって、Ｈolligerら、ＰＮＡＳ 90,6444(1993)に
記載されたジアボディ（diabodies）と類似の、２つの特異的結合アフィニティ
を有する生成物をもたらすことができる。繰り返すと、互いに会合する必要な２
つのポリペプチドは、単一のポリペプチドとして発現されるため、等量で生産さ
れるという利点がある。この場合には、連結される２つのポリペプチドは、それ
ぞれ少なく
とも１つの軽鎖およびそれと会合する少なくとも１つの重鎖を含むべきである。
本発明がジアボディの生産に応用される場合には、ポリペプチドを連結する(
そして最終的には切断される)リンクペプチド配列は、リンクが切断されるまで
ポリペプチドの会合が起こらないように十分に短いものであってよい。
本発明の実施態様を、付随する図面を参照しながら例として説明する。図面の
うち、図１から６は本発明の原理を説明し、図７から１２は本発明の一例を説明
し、図１３から１７は本発明のジアボディへの応用を説明する。より具体的には
、
−図１および２は、クローニングにより得られるＤＮＡ配列を示し、
−図３は、合成により作成されるＤＮＡのセンスストランドを示し、
−図４は、図１〜３の配列を連結することにより得られる長いＤＮＡ配列を示
し、
−図５は、図４のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドを示し、
−図６は、図５のポリペプチドから得られるＦｖフラグメントを示し、
−図７は、ＦｖＫＣ−IIから出発する、ＦｖＫＣ−II−ＫＥＸ２およびＹｅａ
ｒｓｔ−ＦｖＫＣ−II−ＫＥＸ２の構築の模式図である。
−図８は、ｐＣＵ１９中のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩフラグメント上のＦｖＫ
Ｃ−II遺伝子のアミノ酸配列に相当するヌクレオチド配列を示す。
−図９は、ｐＣＵ１９中のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩフラグメント上のＦｖＫ
Ｃ−II−ＫＥＸ２遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
−図１０は、ｐＣＵ１９中のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩフラグメント上の５’
ＳｎａＢＩ制限部位を含むＦｖＫＣ−II−ＫＥＸ２遺伝子のヌクレオチド配列お
よび対応するアミノ酸配列を示す。
−図１１は、形質転換Ｐichia細胞において産生されたタンパクをアフィニテ
ィクロマトグラフィにより回収したときに得られたクロマトグラムである。
−図１２は、溶出タンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。
−図１３は、ジアボディを生産するために用いるＤＮＡ配列を説明するもので
あり、
−図１４は、図１３のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドを示し、
−図１５は、図１４のポリペプチドから得られるジアボディを示す。
図１〜３により説明する本発明の実施態様においては、手順は、所望の特異的
を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを用いて開始する。
重鎖可変ドメインをコードする遺伝子（ＤＮＡ配列）は、Ｏrlandi,Ｗinter e
t al.,ＰＮＡＳ ＵＳＡ 86,3383(1989)およびＥＰ−Ａ−３６８６８４に記載さ
れた技法により、このハイブリドーマのゲノムからクローニングする。
ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを回収し、逆転写によりｃＤＮＡを作成する
ために用いる。次いで、このｃＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応により所望の
遺伝子をクローニングする。好適なプライマーは、ＶH1ＦＯＲ2およびＶH1ＢＡ
ＣＫ（ともにＥＰ−Ａ−３６８６８４に開示されている）である。
このようにして作成されたＤＮＡは、１つの末端（アンチセンスストランドの
５’末端）にＶH1ＦＯＲ2プライマーに相当する配列、およびセンスストランド
の５’末端にＶH1ＢＡＣＫプライマーに相当する配列を有する。これらの配列は
、それぞれＢｓｔＥIIおよびＰｓｔＩ認識部位を含む。
軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列は、相当する方法でハイブリ
ドーマゲノムからクローニングする。これを行う場合、ポリメラーゼ連鎖反応に
用いるプライマーは、ＥＰ−Ａ−３６８６８４に開示されているＶＫ１ ＦＯＲ
およびＶＫ１ ＢＡＣＫである。このクローニング工程で作成されたＤＮＡは、
１つの末端（アンチセンスストランドの５’末端）にＶＫ１ ＦＯＲプライマー
に相当する配列を有する。これは、ＢｇｌII認識部位を含む。センスストランド
の５’末端には、ＶＫ１ ＢＡＣＫプライマーにコードされ、ＰｖｕII認識部位
を含む配列がある。この配列を、模式的に図２に示す。
リンクペプチドをコードするヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド合成の
標準的技法を用いて合成する。例えば、Ａpplied Ｂiosystems(Ｗarrington,Ｕ
Ｋ)から市販されている自動合成機、化学試薬およびプロトコールを用いて合成
する。この配列は、その５’末端付近にＢｓｔＥII認識部位を有する。その配列
は、その３’末端付近にはＰｖｕII認識部位を有する。これらの２つの部位の中
間には、短いリンクペプチドを産生するためのコドンの配列が存在する。センス
ストランドにおいては、これらは、「…Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇ…」をコードする配列「…ＣＧＡ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＡＡ ＡＧＧ…」を含む。
これらの
５つのアミノ酸は、以下に述べるように、プロテアーゼ切断部位を提供する。こ
のヌクレオチド配列を、添付図面の図３に示す。
上述の（および添付図面の図１、２および３に示す）３つのヌクレオチド配列
を、続いて、図４に示すように、フレームを合わせて（in-frame）組み立て、リ
ンクペプチドをコードする配列が重鎖配列の５’末端と軽鎖配列の３’末端との
間に伸びる長い配列を形成する。
上述の設計を有する遺伝子カセット（すなわちフレームを合わせたヌクレオチ
ド配列）の構築は、分子生物学の標準的技法により行うことができる。例えば、
Ｃlackson et al.,Ｎature 352,p.624(1991)、特にその６２５頁には、そのリン
クペプチドにはここに述べるような切断配列は全く与えられていないものの、好
適な方法が記載されている。
得られたヌクレオチド配列は、図４に示すように、好ましくはポリメラーゼ連
鎖反応によりさらに増幅し、それからベクターに挿入し、宿主生物を形質転換す
るために用いる。
形質転換生物を培養し、重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、重鎖のＣ末端
がリンクペプチドを介して軽鎖可変ドメインのＮ末端にカップリングされている
ポリペプチドを発現させる。このポリペプチドを図５に示す。
図５に示すように、ＶHおよびＶLフラグメント間のペプチドリンクは短い。そ
のことは、これらのフラグメントが会合しうるのに十分な動きの自由を許さない
。
選択される宿主生物は、糸状菌類のＡspergillusであってもよい。この生物中
に天然に存在する酵素の１つはＫＥＸ２プロテアーゼである。上述したように、
このプロテアーゼは、露出された「…−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｘ−…」（ここで、Ｘ
は任意のアミノ酸を表す）配列中のアルギニンの隣でペプチド鎖を切断するよう
機能する。ＫＥＸ２タイプの酵素は、多くの異なる生物中に見出される。いった
んポリペプチドが形成されると、それは、ＡspergillusのＫＥＸ２プロテアーゼ
によりリンクペプチドの−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−配列の隣で切断される。実際、切断
は、１つのドメインおよびリンクペプチドの合成後、第二のドメインの合成が進
行している間に起こりうる。
軽鎖および重鎖可変ドメインは、ここで図６に図式で示すように会合すること
ができ、その天然の形にフォールディングされうる。重鎖可変ドメインのＣ末端
で、ペプチド鎖はリンクペプチドのフラグメントにより延長されている。このペ
プチドの残りは、軽鎖可変ドメインのＮ末端を延長している。これらの残存物は
「Ｒ」で示してある。
図７は、一例として、ペプチドホルモンに特異的なＦｖ（ＦｖＫＣと呼ぶ）の
生産に対する本発明の適用を説明する。この例においては、生産者である生物は
、アルコール資化性酵母Ｐichia pastorisであり、これはＫＥＸ２タイプのプロ
テアーゼを産生することが知られている。
１)ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の間に位置するＫＥＸ２プロセッシング部位（Ａｒｇ −Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）を含むＦｖをコードするＤＮＡ構築体の作 成
図７ａに示すように、ペプチドホルモンに対する特異性を有するＦｖ（ＦｖＫ
Ｃとして知られる）をコードするＤＮＡを、Ｗard et al.,Ｎature(1989)341,54
4の方法にしたがってＥ．coli発現プラスミド、ｐＵＣ１９において組み立てた
。Ｗardの文献におけるのと同じように、Ｆｖを、そのＶＬのＣ末端でペプチド
タッグにより標識した（Ｆｖ活性のアッセイを容易にするため）。この例におい
て使用したペプチド配列は、いわゆるヒドロフィルIIタッグ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−
Ｌｅｕ−Ｌｙｓ）であった。この配列は、以前Ｄavisらによる(1991)ＷＯ９１／
０８４８２において開示されたものである。図７ａに示すこの出発ＤＮＡ構築体
を、ＦｖＫＣ−IIと呼ぶ。図８は、ｐＵＣ１９中のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩフ
ラグメント上のＦｖＫＣ−II遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸
配列を示す。ｐｅｌＢリーダーおよびヒドロフィルIIタッグ配列を四角で囲んで
ある。関連制限部位は太字で下線を付して示す。
ＦｖＫＣ−IIＤＮＡを、Ｅ．coli中での生育により増幅し、プラスミドＤＮＡ
を回収した。ＶHおよびＶLの間のＤＮＡは、（図７ｂに示すように）ＢＳｔＥII
およびＳａｃＩで消化することにより除去した。次いで、これを、ＫＥＸ２タイ
プの切断部位、すなわち上述のＡｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列を
コードする合成ＢｓｔＥII／ＳａｃＩフラグメントで置き換えた（図７ｃ）。こ
の合成フラグメントは、以下のとおりの一対の相補的オリゴヌクレオチドである
Ｏligo１およびＯligo２から構成した：
完成されたＤＮＡ構築体は、ＦｖＫＣ−II−ＫＥＸ２と名付けた。図９は、ｐ
ＵＣ１９中のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩフラグメント上のＦｖＫＣ−II−ＫＥＸ
２遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。ｐｅｌＢリー
ダー、ＫＥＸ２部位およびヒドロフィルIIタッグ配列を四角で囲んである。関連
制限部位は太字で下線を付して示す。
２)Ｐichia発現ベクターへのＦｖＫＣ−II−ＫＥＸ２ＤＮＡ構築体の導入
ＤＮＡ構築体ＦｖＫＣ−II−ＫＥＸ２を、アルコール資化性酵母Ｐichiapasto ris
における産生のために発現ベクター（ｐＰＩＣ９）に挿入した。これを達成
するために、ＤＮＡ構築体の５’末端を、ｐＰＩＣ９ベクターと互換性のある制
限部位を含むように修飾しなければならなかった。（制限部位ＳｎａＢＩを選ん
だ。）この修飾は、ＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩフラグメントを除去し、ＳｎａＢＩ
部位を含む合成ＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩフラグメントに置き換えることによって
作成した（図７ｄ、ｅおよびｆを参照されたい）。この合成フラグメントは、以
下のとおりの一対の相補的オリゴヌクレオチドであるＯligo３およびＯligo４か
ら構成した：
完成されたＤＮＡ構築体は、Ｙｅａｓｔ−ＦｖＫＣ−II−ＫＥＸ２と名付けた
。図１０は、ｐＵＣ１９中のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩフラグメント上の５’Ｓ
ｎａＢＩ制限部位を含むＦｖＫＣ−II−ＫＥＸ２遺伝子のヌクレオチド配列およ
び対応するアミノ酸配列を示す。ＫＥＸ２部位およびヒドロフィルIIタッグ配列
を四角で囲んである。ＳｎａＢＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位は灰色の四角で囲ん
である。その他の関連制限部位は太字で下線を付して示す。
Ｙｅａｓｔ−ＦｖＫＣ−II−ＫＥＸ２構築体を、ｐＵＣ１９／Ｅ.coli中での
生育により増幅した。この構築体を、ＳｎａＢＩおよびＥｃｏＲＩで消化するこ
とによりプラスミドｐＵＣ１９から切り出した。（ＥｃｏＲＩは構築体の３’末
端
に天然に存在する。図７ｆを参照されたい。）切り出されたＤＮＡを、次いでＰ ichia
発現ベクター、ｐＰＩＣ９に連結した。（このベクターは、Ｉnvitrogen
Ｃorporation,Ｓan Ｄiego,ＵＳＡから市販されているＰichia発現キット（バー
ジョンＢ）の構成成分である。）
３)Ｐichiaからの活性ＦｖＫＣ−IIの産生および回収
Ｙｅａｓｔ−ＦｖＫＣ−II−ＫＥＸ２の挿入断片（インサート）を有するｐＰ
ＩＣ９ ＤＮＡを、ＢｇｌIIで消化することにより線状化した。次いで、Ｐichia
発現キット（バージョンＢ）とともに供給される指示書マニュアルにしたがって
、Ｐichia pastoris株ＧＳ１１５を、このＤＮＡで形質転換した。
指示書マニュアルにしたがって、５００mlの形質転換Ｐichia培養物を作成し
た。次いで、再びＩnvitrogenの指示書マニュアルにしたがって、これを遠心分
離し、１００mlの容量中でＦｖＫＣ−IIを発現するよう誘導した。誘導４８時間
後、細胞を遠心分離により除去した。上清６０mlを、ＣＮＢｒ活性化セファロー
ス４Ｂ（Ｐharmacia）上に固定化したペプチドホルモン（これに対してＦｖＫＣ
が結合する）を含むアフィニティクロマトグラフィカラムに注入した。カラムに
注入後、吸着剤をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで（非特異的
結合を排除するため）１カラム容量の１Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した。結合した
（したがって活性な）Ｆｖは、５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．２で溶出することに
より回収した。カラムからの溶出は、紫外線吸収により検出した。このクロマト
グラムを、図１１に示す。
回収した画分をトリス緩衝液で中和し、次いでＰＢＳに透析した。２つの画分
を採取した（図１１を参照されたい）。画分１は、２mlの容量であり、３６μg/
mlのタンパクを含有していた。画分２は、４mlの容量であり、７８μg/mlのタン
パクを含有していた。画分１および２を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。こ
れは、以下のとおりの５つのレーンを用いて行った：
１．Ｐharmacia低分子量マーカー
２．画分１
３．画分２
４．Ｅ.coliで発現された同じホルモンの単鎖Ｆｖ
５．別個の単鎖Ｆｖ、ＶH鎖およびＶL鎖（すべてＥ.coliで発現されたもの）
の混合物
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１２に再現してある。レーン２および３の両方に
ついて、等量の２つのタンパク鎖、ＶHおよびＶLが存在することがわかる。単鎖
Ｆｖは無視できる量しかなく、ペプチド鎖のランダムな切断に由来する（望まし
くない）低分子量のフラグメントは存在しない。
これらの鎖のいずれもが、それ自身でペプチドホルモンに結合できない（これ
らは、Ｆｖの形態に会合した場合のみ結合することができる）ので、Ｐichiaが
ＶＨ−ＫＥＸ２−ＶＬ−IIを合成したこと、このタンパクは切断されて等量のＶ
ＨおよびＶＬ−IIを生じたこと、およびこれらの２つの鎖が会合して活性なＦｖ
を生成し、したがってアフィニティカラムに適用されたことは明らかである。Ｆ
ｖは、カラムから溶出されたときに別個の鎖に解離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
別個の鎖として検出された。
図１３および１４は、図１５に示すようなジアボディの生産における本発明の
利用を説明する。これは、１つの抗体の可変ドメイン（ＶH1とＶL1）および第二
の抗体の可変ドメイン（ＶH2とＶL2）を含む人工的な構築体であり、この人工的
な構築体が２つの異なるエピトープに対して結合親和性を呈するようにしたもの
である。
本発明を利用してこの構築体を作成するためには、各々の重鎖可変ドメインお
よび各々の軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、従来記載されて
いるような方法でクローニングする。これらを、図１３に示す配置に組み立てる
。
この図に示すように、全体的なヌクレオチド配列は、一方の末端に１つの抗体
の重鎖可変ドメイン（ＶH1）をコードするヌクレオチド配列および第二の抗体の
軽鎖可変ドメイン（ＶL2）をコードするヌクレオチド配列を含む。これらのヌク
レオチド配列は、リンク１と名付けられた合成オリゴヌクレオチド配列を通じて
つながれている。これらのヌクレオチド配列を組み立てる方法は、一般的には従
来記載されているとおりであってよいが、リンク１配列はいかなるプロテアーゼ
切断部位もコードしてはならない。好適には、それはグリシンおよびセリンのみ
を含む。
第一の抗体の軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列（ＶL1）は、同
様に、リンク２と名付けられた合成ヌクレオチド配列を通じて第二の抗体の重鎖
可変ドメイン（ＶH2）をコードするヌクレオチド配列につながれる。
軽鎖可変ドメインの各々をコードする配列は、切断部位を含まないペプチド配
列をコードするリンク３として示されるリンク配列を通じてつながれる。リンク
３は、ここでは…Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−…をコードするとして例示されてい
るが、好適な切断部位を含む別のペプチドリンクをコードしていてもよい。これ
らのすべてのヌクレオチド配列が組み立てられたら、得られる配列を、宿主細胞
に取り込ませ、これを培養して図１４に示すポリペプチドを発現させる。次いで
、これをリンク３のアミノ酸配列を切るがリンク１またはリンク２を切らないよ
うに機能するプロテアーゼと接触させる。得られる２つのポリペプチドは、この
とき会合して図１５に示すジアボディを与えることができる。中央のリンク３ペ
プチドの残存物「Ｒ」は、ＶL1のＮ末端およびＶL2のＣ末端に広がる。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Production of stable antibody fragments in yeast
The present invention relates to the production of antibody fragments and analogs. In recent years, antibody flags
There is considerable interest in the production of mentments. One of the fragments of particular interest
One is the so-called Fv fragment, which combines the variable domain of the antibody light chain.
And the variable domain of the heavy chain of the antibody with which it is associated. For the whole antibody
And the intermolecular force that causes these domains to associate
Keep them together.
The individual domains of the Fv fragment are each transformed by the genetically transformed organism.
Can be expressed separately. Once they coexist in solution, they
Spontaneously associate to give the desired Fv fragment.
Expression of a single antibody domain by a transformed microorganism is described in European Patent No.
368684 (Medical Research Council)
.
If the necessary variable domains from the light and heavy chains coexist in solution, they will
It generally associates by accident with the required Fv fragment. Meeting their domain
This is particularly advantageous because of the high concentration of the catalyst. However, both variable domains are equal
It is not easy to produce in solution in volume and at the appropriate concentration to favor association
. One possibility is to express them using separate host organisms and then to express them.
It is to be together. However, this requires the transformation of two host organisms.
The amount of variable domains expressed may not match each other. Furthermore, the light chain
Without heavy chain is often harmful to the cells that express it,
Therefore, it is generally considered that it is difficult to obtain a concentration suitable for industrial production.
Another possibility is that a single transformed host encodes both variable domains
The transformation of a host organism to contain genetic information. This is Reichmann
(J. Mol. Biol.203.825 (1988)).
This is achieved by assembling the genetic information to be loaded on a single vector. Only
However, in this case, the host organism may not express the two variable domains in equal amounts.
Yes,
This leads to waste of cell metabolism for unproductive synthesis, again in this case
There is a risk of harming cells from excess chain.
One way to avoid these difficulties is described in EP 281 604B.
Proposed, which binds the binding part of each variable domain to
Disclosed is the production of a single polypeptide comprising with a linking peptide sequence
I have. This link peptide sequence, after a single polypeptide is expressed,
The binding portion of the variable domain associates with an analog molecule of the Fv fragment (so-called
(A single-chain Fv fragment). European Patent 28
The 1604B has two important advantages. First, the two domains are equal
Is to be produced. Second, the two domains (because they are linked)
It is produced at high "local" concentrations and is therefore very advantageous for association
.
In this prior art, the design of this single polypeptide molecule requires some compromise
Is explained. The connecting region extends from the C-terminal region of the light chain to the N-terminal of the heavy chain.
It is taught that it should span an area. But it is these ends
The edges of the area should not be connected. These terminal regions are (naturally) present in natural antibodies.
And for the complete Fv fragment as well).
You.
Instead, the peptide link is spaced somewhat inward from the C-terminus of the light chain.
From the point where it was, to a point some distance inward from the N-terminus of the heavy chain.
However, these are some relatively close points in natural antibodies.
The consequence of this is that the portion adjacent to the C-terminus of the light chain and the portion adjacent to the N-terminus of the heavy chain
Is not expressed, but is replaced by a link peptide instead
It is. Nevertheless, this peptide link is composed of two variable domains.
Note that they are long enough to allow them to
Must be designed with care.
EP-A-623679, which is divided from EP-A-318554, also has a variable domain.
A single polymorph containing the main binding moiety together with the linking peptide sequence connecting them
Disclosed is expression of a peptide. This document states that the link is at least 10 amino acids long
That the link peptide should be site-specific
It is mentioned that it can include a recognizable cleavage site. This will be VH
And VLSeparate domains or fold their linker
It is stated that it may be possible later to excise at the binding site. With this document
It is not clear how such constructs are processed or used.
Absent. But VHAnd VLLinking domains has almost no effect on binding properties.
Or no harm, suggesting that it could even improve.
Gene constructs encoding single-chain Fvs are useful in the production of antibody fragments
With some distinct advantages, the resulting single-chain Fv protein is light and heavy chain
Disappointed in its performance compared to Fv fragments with no link in between
It is something to make. This is because the stability of the two different protein structures (stability is
Is a very important performance criterion for industrial applications)
It is explained in. When stored at 37 ° C. for an extended period of time, single-chain Fv fragments
Although more stable than (double-stranded) Fv fragments, we
See that it is completely inactivated by biophysical shocks like the melting cycle
I thought. In contrast, the true (double-stranded) Fv fragment has almost no activity.
Can survive freeze-thaw cycles without the need for About this very amazing discovery
One possible explanation is that a single-chain Fv fragment is composed of its two components (via a linker).
More resistant to denaturation due to covalent coupling of the minute domains
And can withstand storage at 37 ° C. for longer than double-stranded Fv.
However, once the single-chain Fv is completely denatured by biophysical shock,
The presence of Kerr in the refolding process that should occur when returning to the physiological state
Is to interfere. On the other hand, the double-stranded Fv is bio-physical by denaturation.
It is able to withstand mechanical shock and subsequently successfully refold. What
Above all, antibody fragments intended for industrial application are
Deal with variations that are likely to denature, such as rising, freezing and thawing, or extreme pH
Should be strong enough. Sufficient biophysical shot to denature Fv
Is used, for example, to remove Fv from the affinity column during purification.
there is a possibility. As a result, the ability to spontaneously refold is valuable.
You. Also, single-chain Fv fragments tend to confer much non-specific binding,
This is usually not preferred.
In the present invention, associative portions of heavy and light chains, such as
For example, the binding regions of their variable domains are connected through a link peptide.
It is expressed as part of a single polypeptide that is stripped. However, this concatenation
Cleavage by enzymes produced by transformed organisms expressing the polypeptide
Site. During or after expression of the single-chain polypeptide, it is
Cleavage at this cleavage site while still in the displayed culture results in heavy chains and
And light chain parts from each other, allowing them to accidentally associate
You.
Accordingly, the present invention relates to Fv antibody fragments comprising the light and heavy chain association portions of an antibody.
Or other products,
The nucleotide sequence encoding that part of the two strands
Rarely, ligated with additional nucleotide sequence encoding link peptide sequence
And
Transforming the host organism to incorporate said linked nucleotide sequence,
Culturing the transformed organism and encoding it with the additional nucleotide sequence
Containing the light and heavy chain portions linked by the linked peptide sequence
Expressing the repeptide
Wherein the link sequence is produced by a transformed organism.
A cleavage site in the link peptide sequence so that it is
Providing a method characterized by:
Therefore, in the present invention, the transformed organism synthesizes two peptide chains,
Both are desirable and both end products, but they are initially
Are separated and separated from each other by the organism after the synthesis of the junction between them.
Should be recognized. A single expressed polypeptide can
May exist as a transition state, and cleavage may occur during the synthesis of the second strand.
It is possible. This means that this single expressed polypeptide would otherwise be the host
The problem of harm to living things can be avoided.
The enzyme that performs the cleavage can be an enzyme present on the membrane of the transformed organism,
May be an extracellular enzyme produced by the organism. In this event,
Cleavage of the link peptide occurs when the protein is secreted out through the membrane or
It will happen in the surrounding medium.
The method of the invention generally comprises at least one of the two parts of the antibody chain, possibly
Both are extended by link peptide remnants, which may be very small
Product. Designing link peptides that are completely cleaved off
Yes (possibly inconvenient).
The invention is specifically contemplated for the production of Fv fragments. Of two chains
The association moiety is the variable domain or at least the binding region. Do so
And the product is linked to at least one, and possibly both, of the variable domains.
Fv antibody fragments attached to the residue of the Fv antibody.
Peptide arrangement providing link between heavy and light chain variable domains
The rows are truncated after expression of a single polypeptide, so the link peptide between them is
When choosing the length of the tide, there is a great deal of freedom. In addition, the desired variable domain
The terminal portions need not be removed to reduce the length of the link between them.
It is not necessary to remove the terminal portion of the desired variable domain, but nonetheless,
This can be done if desired. Generally, the nucleotide sequence
It encodes at least the binding region of an antibody variable domain.
In one form of the invention, the links between the antibody chains are short enough, for example, 10
Less than an amino acid, the two chains cannot associate until the link is broken. This result
The result is that the (folded) single-chain Fv is not produced as a transient product
That is.
The nucleotide sequences coding for the light and heavy chain variable domains are
It can be obtained by cloning the substance. This is the technology of biotechnology
It can be performed by the polymerase chain reaction (PCR) well known in the art.
. References for this technology include Saiki et al., Science.230, 1350 (19
85); Scharf et al., Science233, 1076 (1986); and Saiki et al., Science.239
, 487 (1988).
Its application to variable domain cloning is described in Orlandi, Winter et al.,
PNAS USA86, 3833 (1989) and EP-A368686.
.
The basics of PCR technology are
Exposure of the required nucleotide sequence in the nucleic acid strand,
-Annealing of oligonucleotide primers flanking the required sequence ends
,and
-Synthesis of complementary nucleic acid strands extending from primers
Iterative execution of a cycle of steps including
A process that can anneal to one nucleic acid strand adjacent to one end
Animate the primer and complementary nucleic acid strand adjacent to the opposite end of the desired sequence.
Performed using a second primer that can be
A nucleic acid which is a necessary sequence having a terminal portion defined by the two primers
Clones are produced.
The link nucleotide sequence encoding the link peptide is an oligonucleotide
Can be created directly by synthesis.
Assemble three nucleotide sequences into a single in-frame
Forming the nucleotide sequence is performed using standard techniques of recombinant DNA technology.
can do. To facilitate this, primers used in PCR reactions
Provides a restriction site, and the linking nucleotide sequence also includes the restriction site.
Is preferred.
Using standard techniques of recombinant DNA technology, the host organism is
Can be transformed.
One possibility is that the host organism recognizes a cleavage site in the link peptide.
Transforming the genetic material of the host organism so that it also expresses the enzyme.
In one development of the invention, the link peptide is assayed and / or purified.
A sequence of amino acids that can be used for the recognition of Fv fragments during production.
Designed to include. Recognition of such sequences can be used after cleavage.
At this stage, the recognition sequence is a link peptide attached to one strand of the Fv fragment.
Should be present as a residue of the tide.
In another development of the invention, the link peptide sequence comprises two cleavage sites
Designed to be. When this peptide sequence is cleaved at these sites,
A part is cut out. As a result, the antibody fragment formed is
Contains very little or no residue of the peptide
No.
Yeast is currently used to transform and express peptide chains that are subsequently cleaved.
Preferred as a living organism. In particular, alcohol-utilizing (methylotropic) yeast
Motherhood, especiallyPichia pastorisAnd its relativesHansenula polymorphiaUsing
Can be
A preferred protease that cleaves the link peptide is of the KEX2 type.
is there. Enzymes in this group of proteases are found in many organisms. this
Et al., Not hidden by peptide chain folding,
Recognizing a specific cleavage site of... Lys-Arg.
Cut adjacent parts. The cleavage occurs next to arginine,
... Lys-Arg-X -...
But
... Lys-Arg-COOH + HTwoNX ...
Is cut off. Here, X represents an arbitrary amino acid, and Arg-COOH is
This shows that this arginine residue becomes C-terminal after cleavage.
After expression in the transformed organism and cleavage into two peptide chains,
Typically, the desired Fv fragment is separated from other components in the composition from which it was formed.
Release, harvesting or recovery steps follow. In particular, these are preferably
Is separated from the enzymatically processed enzyme. Harvest biological molecules such as polypeptides
The techniques for this are well known. Affinity chromatography is widely used.
The invention relates to forms in which the two chain parts are extended by further polypeptides (
Body). These are the variable domains of the second antibody chain.
And thus Holliger et al., PNAS90, 6444 (1993)
Two specific binding affinities, similar to the described diabodies
Can be obtained. Again, we need to meet each other 2
Two polypeptides are expressed as a single polypeptide and are therefore produced in equal amounts.
There is an advantage that it is. In this case, the two polypeptides to be linked are
Each less
It should include at least one light chain and at least one heavy chain associated therewith.
When the present invention is applied to the production of diabodies, polypeptides are linked (
The link peptide sequence remains until the link is broken.
It may be short enough such that polypeptide association does not occur.
Embodiments of the present invention will be described by way of example with reference to the accompanying drawings. Drawing
1 to 6 illustrate the principle of the present invention, and FIGS. 7 to 12 illustrate an example of the present invention.
13 to 17 illustrate the application of the present invention to diabodies. More specifically
,
1 and 2 show the DNA sequences obtained by cloning,
FIG. 3 shows the sense strand of DNA produced by synthesis,
FIG. 4 shows the long DNA sequence obtained by joining the sequences of FIGS.
And
FIG. 5 shows the polypeptide encoded by the DNA sequence of FIG. 4,
FIG. 6 shows an Fv fragment obtained from the polypeptide of FIG. 5,
FIG. 7 shows FvKC-II-KEX2 and Yea starting from FvKC-II
It is a schematic diagram of construction of rst-FvKC-II-KEX2.
FIG. 8 shows the FvK on HindIII-EcoRI fragment in pCU19.
2 shows a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of the C-II gene.
FIG. 9 shows the FvK on HindIII-EcoRI fragment in pCU19.
1 shows the nucleotide sequence of the C-II-KEX2 gene.
FIG. 10 shows the 5 ′ on the HindIII-EcoRI fragment in pCU19.
Nucleotide sequence and FvKC-II-KEX2 gene including SnaBI restriction site
And the corresponding amino acid sequence.
FIG. 11 shows the transformationPichiaAffinity analysis of proteins produced in cells
It is a chromatogram obtained when collected by chromatography.
FIG. 12 shows the SDS-PAGE analysis of the eluted protein.
FIG. 13 illustrates the DNA sequence used to produce diabodies.
Yes,
FIG. 14 shows the polypeptide encoded by the DNA sequence of FIG. 13,
FIG. 15 shows a diabody obtained from the polypeptide of FIG.
In the embodiment of the invention described by FIGS.
Starting with a hybridoma producing a monoclonal antibody having
The gene (DNA sequence) encoding the heavy chain variable domain can be found in Orlandi, Winter
t al., PNAS USA86, 3383 (1989) and EP-A-368684.
The hybridoma is cloned from the genome by a known technique.
MRNA is recovered from hybridoma cells and cDNA is prepared by reverse transcription
Used for Next, the desired cDNA is obtained from the cDNA by polymerase chain reaction.
Clone the gene. Suitable primers are VH1FOR2 and VH1BA
CK (both are disclosed in EP-A-368684).
The DNA thus prepared has one end (the antisense strand).
V at the 5 'end)H1Sequence corresponding to FOR2 primer, and sense strand
At the 5 'end ofH1It has a sequence corresponding to the BACK primer. These arrays
, Respectively, containing BstEII and PstI recognition sites.
The nucleotide sequence encoding the light chain variable domain is hybridized in a corresponding manner.
Clone from the dorma genome. If you do this, the polymerase chain reaction
The primer used is VK1 FOR disclosed in EP-A-368684.
And VK1 BACK. The DNA created in this cloning step
VK1 FOR primer at one end (5 'end of antisense strand)
Has a sequence corresponding to It contains a BglII recognition site. Sense strand
At the 5 'end is encoded by a VK1 BACK primer and has a PvuII recognition site.
There is an array containing This arrangement is schematically shown in FIG.
The nucleotide sequence encoding the link peptide is used for oligonucleotide synthesis.
Synthesize using standard techniques. For example, Applied Biosystems (Warrington, U.S.A.)
Synthesized using an automatic synthesizer, chemical reagents and protocols commercially available from K)
I do. This sequence has a BstEII recognition site near its 5 'end. The array
Has a PvuII recognition site near its 3 'end. In these two parts
In between, there is a sequence of codons to produce a short link peptide. sense
In the strand, these are "... Arg-Met-Asp-Lys-Ar
g ... ". The sequence includes" ... CGA ATG GAT AAA AGG ... ".
these
Five amino acids provide a protease cleavage site, as described below. This
Is shown in FIG. 3 of the accompanying drawings.
Three nucleotide sequences as described above (and shown in FIGS. 1, 2 and 3 of the accompanying drawings)
Then, as shown in FIG. 4, the frames are assembled (in-frame), and
The sequence encoding the amino acid peptide is located between the 5 'end of the heavy chain sequence and the 3' end of the light chain sequence.
Form a long array extending between them.
Gene cassettes (ie, framed nucleotides) having the above design
The construction of the sequence can be performed by standard techniques of molecular biology. For example,
Clackson et al., Nature352, p. 624 (1991), particularly on page 625,
The peptide does not have any cleavage sequences as described here, but
Suitable methods are described.
The resulting nucleotide sequence, as shown in FIG.
Amplify further by strand reaction, then insert into vector and transform host organism
Used to
Culturing the transformed organism, comprising the heavy and light chain variable domains, the C-terminus of the heavy chain
Is coupled to the N-terminus of the light chain variable domain via a link peptide
Express the polypeptide. This polypeptide is shown in FIG.
As shown in FIG.HAnd VLThe peptide links between the fragments are short. So
Does not allow enough freedom of movement for these fragments to be able to associate
.
The selected host organism is a filamentous fungusAspergillusIt may be. In this organism
One of the naturally occurring enzymes is KEX2 protease. As mentioned above,
This protease is exposed to the exposed "...- Lys-Arg-X -..." (where X
Means any amino acid) Cleaves the peptide chain next to arginine in the sequence
Function. KEX2 type enzymes are found in many different organisms. said
When a cancer polypeptide is formed, itAspergillusKEX2 protease
Cleaves next to the -Lys-Arg- sequence of the link peptide. In fact, cutting
Means that after the synthesis of one domain and the link peptide, the synthesis of the second domain proceeds.
It can happen while going.
The light and heavy chain variable domains now associate as shown schematically in FIG.
And can be folded into its natural form. C-terminal of heavy chain variable domain
Wherein the peptide chain is extended by a fragment of the link peptide. This page
The rest of the peptide extends the N-terminus of the light chain variable domain. These remnants
Indicated by "R".
FIG. 7 shows, by way of example, the Fv (referred to as FvKC) specific for peptide hormones.
The application of the present invention to production will be described. In this example, the producer organism is
, Alcohol-assimilating yeastPichia pastorisThis is a KEX2 type professional
It is known to produce thease.
1) KEX2 processing site located between VH and VL chains (Arg -Met-Asp-Lys-Arg) Success
As shown in FIG. 7a, Fv (FvK
DNA (known as C) is described in Ward et al., Nature (1989).341, 54
According to method 4E. FIG. coliExpression plasmid, assembled in pUC19
. As in the Ward literature, Fv is replaced by a peptide at the C-terminus of its VL.
Tagged (to facilitate assay of Fv activity). In this example
The peptide sequence used was a so-called Hydrophil II tag (Gly-Ser-
Gly-Ser-Gly-Asn-Ser-Gly-Lys-Gly-Tyr-
Leu-Lys). This sequence was previously described by Davids et al. (1991) WO91 /
08482. This starting DNA construct shown in FIG.
Is called FvKC-II. FIG. 8 shows the HindIII-EcoRI plasmid in pUC19.
Nucleotide sequence of FvKC-II gene on fragment and corresponding amino acid
Shows the sequence. box around the pelB leader and hydrophil II tag sequence
is there. Related restriction sites are shown in bold and underlined.
FvKC-II DNA,E. FIG. coliAmplified by growth in the plasmid DNA
Was recovered. VHAnd VLDNA during BStEII (as shown in FIG. 7b)
And by digestion with SacI. Next, this was used as a KEX2
Cleavage site, ie, the above-described Arg-Met-Asp-Lys-Arg sequence.
Replaced with the encoding synthetic BstEII / SacI fragment (FIG. 7c). This
Is a pair of complementary oligonucleotides as follows:
Consisting of Oligo1 and Oligo2:
The completed DNA construct was named FvKC-II-KEX2. FIG.
FvKC-II-KEX on HindIII-EcoRI fragment in UC19
The nucleotide sequence and the corresponding amino acid sequence of the two genes are shown. pelB Lee
, The KEX2 site and the Hydrophil II tag sequence are boxed. Relation
Restricted sites are shown in bold and underlined.
2) Introduction of FvKC-II-KEX2 DNA construct into Pichia expression vector
The DNA construct FvKC-II-KEX2 was converted to an alcohol-assimilating yeast.Pichiapasto ris
Was inserted into an expression vector (pPIC9) for production in. Achieve this
In order to achieve this, the 5 'end of the DNA construct was ligated with a control compatible with the pPIC9 vector.
And had to be modified to include a restriction site. (Select restriction site SnaBI
It is. This modification removes the HindIII / PstI fragment and removes the SnaBI
By replacing with a synthetic HindIII / PstI fragment containing the site
(See FIGS. 7d, e and f). This synthetic fragment is:
Oligo3 and Oligo4, a pair of complementary oligonucleotides as follows:
Composed of:
The completed DNA construct was named Yeast-FvKC-II-KEX2.
. FIG. 10 shows the 5'S on the HindIII-EcoRI fragment in pUC19.
nucleotide sequence of the FvKC-II-KEX2 gene containing the naBI restriction site and
And corresponding amino acid sequences. KEX2 site and Hydrophil II tag sequence
Is enclosed in a square. SnaBI and EcoRI restriction sites are boxed in gray.
It is. Other relevant restriction sites are shown in bold and underlined.
The Yeast-FvKC-II-KEX2 construct was cloned into pUC19 /E.coliIn
Amplified by growth. This construct is digested with SnaBI and EcoRI.
And was excised from plasmid pUC19. (EcoRI is the 3 'end of the construct
end
Naturally occurring in See FIG. 7f. ) The excised DNA is thenP ichia
The expression vector was ligated to pPIC9. (This vector is available from Invitrogen
Commercially available from Corporation, San Diego, USAPichiaExpression kit (bar
John B). )
3) Production and recovery of active FvKC-II from Pichia
PP having an insertion fragment (insert) of Yeast-FvKC-II-KEX2
IC9 DNA was linearized by digestion with BglII. ThenPichia
According to the instruction manual supplied with the expression kit (version B)
,Pichia pastorisStrain GS115 was transformed with this DNA.
500 ml of transformation according to the instruction manualPichiaMake a culture
Was. This was then centrifuged again according to the instruction manual for Invitrogen.
And induced to express FvKC-II in a volume of 100 ml. Induction 48 hours
Thereafter, the cells were removed by centrifugation. 60 ml of the supernatant is used for CNBr-activated Sepharose.
Peptide hormone immobilized on DNA 4B (Pharmacia) (in contrast to FvKC
Is bound) to the affinity chromatography column. On the column
After injection, the sorbent is washed with phosphate buffered saline (PBS) and then (non-specific
Washed with 1 column volume of 1M sodium chloride (to eliminate binding). Combined
Fv (and thus active) elutes at 50 mM glycine, pH 2.2.
Recovered. Elution from the column was detected by ultraviolet absorption. This chromato
The grams are shown in FIG.
The collected fractions were neutralized with Tris buffer and then dialyzed against PBS. Two fractions
(See FIG. 11). Fraction 1 has a volume of 2 ml and 36 μg /
It contained ml of protein. Fraction 2 has a volume of 4 ml and contains 78 μg / ml
It contained Parka. Fractions 1 and 2 were analyzed by SDS-PAGE. This
This was done using five lanes as follows:
1. Pharmacia low molecular weight marker
2. Fraction 1
3. Fraction 2
4.E.coliSingle-chain Fv of the same hormone expressed in
5. Separate single chain Fv, VHChain and VLChains (allE.coliExpressed in)
Mixture of
The result of SDS-PAGE is reproduced in FIG. In both lanes 2 and 3
Thus, equal amounts of two protein chains, VHAnd VLIs found to exist. Single chain
Fv is negligible and is derived from random cleavage of peptide chains (desired
No) No low molecular weight fragments are present.
Neither of these chains can bind to the peptide hormone by itself (this
Are able to bind only when associated with the Fv form)PichiaBut
VH-KEX2-VL-II was synthesized, this protein was cleaved and an equal amount of V
H and VL-II, and that these two chains associate to form an active Fv
It is clear that was applied to the affinity column. F
v dissociates into separate strands when eluted from the column and by SDS-PAGE
Detected as a separate strand.
FIGS. 13 and 14 illustrate the present invention in the production of diabodies as shown in FIG.
Explain usage. This is because the variable domain (VH1And VL1) And the second
Antibody variable domain (VH2And VL2) Is an artificial construct
Different constructs exhibit binding affinity for two different epitopes
It is.
To construct this construct using the present invention, each heavy chain variable domain and
And the nucleotide sequence encoding each light chain variable domain, as described previously.
Cloning method These are assembled in the arrangement shown in FIG.
.
As shown in this figure, the entire nucleotide sequence has one antibody at one end.
Heavy chain variable domain (VH1) And the nucleotide sequence encoding the second antibody
Light chain variable domain (VL2) Is included. These nuku
The leotide sequence is transmitted through a synthetic oligonucleotide sequence named Link 1.
They are connected. The method of assembling these nucleotide sequences generally follows
The Link 1 sequence may be any protease as described herein.
The cleavage site must not code. Preferably it is only glycine and serine
including.
The nucleotide sequence encoding the light chain variable domain of the first antibody (VL1)
Similarly, the heavy chain of the second antibody through a synthetic nucleotide sequence named Link 2.
Variable domain (VH2).
The sequence encoding each of the light chain variable domains is a peptide sequence that does not contain a cleavage site.
The columns are linked through a link array shown as link 3. Link
3 is illustrated here as coding for Gly-Lys-Arg-.
Alternatively, it may encode another peptide link containing a suitable cleavage site. this
Once all of these nucleotide sequences have been assembled, the resulting sequence is
And cultured to express the polypeptide shown in FIG. Then
This cuts the amino acid sequence of link 3 but does not cut link 1 or link 2.
Contact with a functional protease. The resulting two polypeptides are
Sometimes they can associate to give the diabody shown in FIG. 3 links in the center
The residue “R” of the peptide is VL1N-terminus and VL2To the C-terminus.
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(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:84）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ
，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ
Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ
Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ
，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 デイビス、ポール・ジェイムズ
英国、ベッドフォードシャー・エムケイ
43・７イーエックス、フェルマースハム、
ペイブンハム・ロード、“ザ・ホーソーン
ズ”（番地なし)
(72)発明者 バン・デル・ログト、コルネリス・ポー
ル・エリック
英国、エヌエヌ10・０ティーユー、ノーザ
ンツ、ラシュデン、ブルーベル・ライズ
１
(72)発明者 ホワイトラム、ゲイリー・クラーク
英国、レスター・エルイー３・６エイチピ
ー、レイチェスター、ポイニング・アベニ
ュー 20──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C12R 1:84) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE , LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT , LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN (72) Inventor Davis, Paul James UK, Bedfordshire MK 43.7 eX, Fermersham, Pavenham Road, "The Hawthorns" (no address) (72) ) Inventor Van der Logt, Cornelis Paul Eric UK, N.N. 10.0 T.U., Northern Switzerland, Rushden, Bluebell Rise 1 (72) Inventor Whitelam, Gary Clark UK, Lester Elley 3・ 6H, Rachester, Poining Avenue 20