JPH11502875A

JPH11502875A - 臨床用のマイクロカプセル封入遺伝子操作微生物

Info

Publication number: JPH11502875A
Application number: JP9526371A
Authority: JP
Inventors: トーマスエムエスチャン; サティアプラカシュ
Original assignee: マックギルユニヴァーシティー
Priority date: 1996-01-23
Filing date: 1997-01-20
Publication date: 1999-03-09
Anticipated expiration: 2017-01-20
Also published as: JP3228941B2; US6217859B1; WO1997026903A1; EP0876151A1; GB9601333D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、疾病により生ずる望ましくない化学物質及び／又はアミノ酸の除去のために患者に経口投与する組成物であって、患者に経口投与するための医薬上許容できる担体と結合して、望ましくない化学物質及び／又はアミノ酸を除去できるように担持され又はマイクロカプセルに封入された微生物を含む組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】臨床用のマイクロカプセル封入遺伝子操作微生物発明の背景 (a) 発明の分野本発明は、経口投与による臨床用のマイクロカプセル封入遺伝子操作微生物を使用する新たな概念に関する。 (b) 先行技術の記述分子生物学における最近の発達は、種々の遺伝子操作微生物に多くの特定化された機能を与えてきた。残念ながら、遺伝子操作微生物を患者の治療に使用することは困難である。微生物を人に非経口投与することは、たとえ極少量投与しても非常にリスクがあり、危険である。本発明によって、この問題は、遺伝子操作微生物をマイクロカプセルに封入し、経口的に投与することで解決された。マイクロカプセルは、微生物の漏出を防止すると共に、もし少量の漏出があっても、消化管は、非病原性微生物を安全に含有できるので安全である。本発明は、種々の遺伝子操作微生物を使用するためのモデル研究を記述する。更に詳細には、本発明は、実施例として、尿素やアンモニアを除去するための遺伝子操作バクテリアの使用について示している。尿素及びアンモニアの除去は、腎不全や肝不全の症例にそれぞれ必要である。***は、不十分な腎機能により引き起こされる。腎臓が弱ると、尿に通常排出される物質は、血液や体組織中に保持される。これは、血液中で通常測定可能な代謝物の濃度の増加を引き起こす。例えば、血液尿素窒素(BUN)レベルは、15mg％から100 〜300mg ％まで増加し、血清クレアチニンは、1.0mg ％から10〜25mg％まで増加した。同様に、肝不全におけるアンモニアレベルの上昇は明白である。高濃度のこれらの物質は、毒素又は毒物となり、器管不全から脳機能障害に至る多くの疾病を引き起こす代謝経路の妨害を切断する結果となる。オキシスターチ(oxystarch)及びウレアーゼリン酸ジルコニウムの経口給餌の使用を含め、いくつかの試みを、不必要な代謝物を体液区画から除去するために適用したが、成功しなかった。オキシスターチ及びウレアーゼリン酸ジルコニウムの必要量は、患者の日常的な治療に使用するには多すぎた。マイクロカプセルに封入する考えは、生存及び非生存のカプセルに封入した材料に特定の環境を提供するために確立されている（Chang，T.M.S．、Science、1 46、524〜525 頁、1964年）。以前の研究で、マイクロカプセル封入遺伝子操作バクテリア大腸菌 DH5 は、in vitroで尿素及びアンモニアを人工培地及び血漿から除去する優れた能力を有していることが示された（Prakash，S．and Chang, T.M.S．、Biotechnology and Bioengineering、46、621〜626 頁、1995年）。驚くべきことに、本発明によって、これらマイクロカプセル封入遺伝子操作微生物は、ごく少量を経口で与えた場合に、腎不全ラット（Prakash，S．、Chang, T.M.S．、Nature Medicine、2(8)、883〜887 頁、1996年）中の全身の尿素及びアンモニアを効果的に除去できることがはじめて証明された。この容量は、現在までに利用できるいかなる系よりも多かった。発明の概要本発明の一つの目的は、マイクロカプセル封入遺伝子操作微生物を経口給餌による種々の疾病の治療に使用する可能性を探索することにある。本発明の別の目的は、特に、カプセル封入遺伝子操作バクテリア細胞の、腎不全、肝不全、その他の疾病の治療に対する可能性を探索することに向けられ、これは、例えば、臨床実験において本発明を適用するのに役立つだろう。初期のin vitroの研究は、アルギン酸塩−ポリリジン−アルギン酸塩(APA)カプセル封入遺伝子操作大腸菌 DH5細胞は、尿素も（アンモニアを生成せずに）アンモニアもともに反応培地及び血漿から除去するのに非常に効果的であることを示した。しかしながら、当時、この細胞を患者に非経口的な注射により安全に使用する方法はなかった（Prakash，S、Chang，T.M.S．、Biotechnology and Bioe ngineering、46、621〜626 頁、1995年）。マイクロカプセルの製剤の工程要素及びin vitro実験での速度論の詳細は、同じ論文に記述されている（Prakash，S 、Chang，T.M.S．、Biotechnology and Bioengineering、46、621〜626 頁、199 5 年）。本発明によって、疾病により生ずる望ましくない化学薬品及び／又はアミノ酸の除去のために患者に経口投与する組成物が提供される。この組成物は、望ましくない化学薬品及び／又はアミノ酸が除去できるように、患者に経口投与するための医薬上許容できる担体と結合して、担持(entrap)され又はマイクロカプセルに封入された微生物を含む。本発明の一の態様によれば、この組成物は、微生物を保持でき、除去するための望ましくない分子がマイクロカプセル内に入ることができるようなマイクロカプセル材料を使用してマイクロカプセルに封入した微生物を有する。本発明に使用されるマイクロカプセル化材料には、制限がなく、ナイロン、シリコンゴム、ナイロン−ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジアリル）−アンモニウムクロライド、ヒドロキシ−エチルメタクリレートメチルメタクリレート、キトサン−カルボキシメチル−セルロース、アルギン酸塩−ポリリジン−アルギン酸塩を含む。本発明の他の態様に従うと、この組成物は、微生物を保持でき、除去するための望ましくない分子が侵入して微生物と接触することができるような担持材料を使用して、担体中に担持された微生物を有する。この微生物は、遺伝子操作されており、中でも、大腸菌 DH5細胞のようなものがある。望ましくない化学薬品は、尿素及び／又はアンモニア、フェニルアラニン、又はチロシンである。治療される疾病は、腎不全を引き起こす疾病、肝不全を引き起こす疾病、上昇したアンモニアレベルによる高アンモニア血症、フェニルケトン尿症、又はチロシン血症、及び特に黒色腫がある。図面の簡単な説明図１は、***ラットモデルの尿素曲線のグラフである。図２は、血漿尿素測定用の検量線を示す。図３は、正常な対照ラットと実験***ラットのモデルにおける血漿尿素の時間関数のグラフである。図４は、正常な対照ラットと実験***ラットのモデルにおける重量曲線のグラフである。図５は、実験***ラットモデルにおけるAPA-カプセル封入バクテリアの尿素除去曲線のグラフである。図６は、尿素除去に対するAPA-カプセル封入遺伝子操作バクテリアの経口給餌による処理の前、間、後における***ラットのアンモニア曲線のグラフである。図７は、実験***ラットモデルにおける遊離バクテリアの尿素除去曲線のグラフである。図８は、遊離バクテリア及びAPA-カプセル封入バクテリアの経口給餌による尿素除去の比較研究のグラフである。図９は、空のAPA マイクロカプセルと遺伝子操作バクテリア大腸菌 DH5細胞を含むAPA マイクロカプセルとを受けている対照ラットと実験腎不全ラットの生存曲線を示す。図10は、APA-カプセル封入バクテリア、ウレアーゼ−リン酸ジルコニウム及びオキシスターチの尿素除去効果の比較研究のグラフである。図11Ａ及び11Ｂは、マイクロカプセル封入装置の構成の模式的表示を示す。発明の詳細な説明遺伝子操作細胞を体に導入することの安全性の懸念から、この細胞を医学的な治療に使用することは避けられてきた。この問題を解決するために、遺伝子操作細胞を含む重合膜の人工細胞を、本発明によって調製した。経口的に与えると、この細胞は、マイクロカプセル中にいつでも残っていて、最後には、便中に*** される。この細胞が、腸を通る間、尿素のような小さな分子は、マイクロカプセル中に速やかに拡散し、遺伝子操作細胞と作用する。この作用により、腎不全ラットにおける高い血漿尿素レベルが正常なレベルに低下する。このことは、数多くの医学的用途に、他のタイプの遺伝子操作細胞を含む本発明を使用することに刺激的な意味を有するものである。本発明によって、マイクロカプセル封入遺伝子操作微生物を特別な臨床的用途で使用し、及びマイクロカプセル入りのものを経口投与で使用することが教示される。すなわち、本発明のマイクロカプセル封入遺伝子操作微生物の、体からの尿素及びアンモニアの除去に対する効率を、腎不全のモデル系を使用して試験した。この新しいアプローチは、全身の尿素及びアンモニアを、現存するいかなる系よりも低下させる能力を有していることを示した。これは、唯一現在利用できるオキシスターチやウレアーゼ−リン酸ジルコニウムよりも数百倍以上効率的である。この例に加えて、他のマイクロカプセル封入遺伝子操作微生物は、経口投与で、例えばフェニルケトン尿症におけるフェニルアラニンのような一定の不必要なアミノ酸を特異的に除去するために使用される。本発明に従って使用される適当な微生物は、制限はなく、尿素除去(UR)用としてクレブシエラ醸気菌、UR3 用としてプロテウス・ミラビリス、フェニルアラニン除去(PR)用としてフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)酵素に対する遺伝子を有する大腸菌、PR5 としてロドスポリジウム・トルボイデス(Rhodosporid ium toruboides)由来のPAL 酵素に対する遺伝子を有する大腸菌、UR6 用としてプロビデンシア・スチュアーティル(providencia stuartil)、及びUR用としてバシラス・パスツーリ(Bacillus pasteuri)を含む。本発明の一の態様に従って、アルギン酸塩−ポリリジン−アルギン酸塩のマイクロカプセルが使用された。しかしながら、微生物に対する他の多くのタイプのマイクロカプセルや担持の方法も使用できる。例えば、制限なく、マイクロカプセルは、ナイロン、シリコンゴム、ナイロンポリエチレンイミン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジアリル）−アンモニウムクロライド、ヒドロキシ−エチルメタクリレートメチルメタクリレート、キトサン−カルボキシメチル−セルロースから調製した。本発明の臨床用のあらゆる可能性を評価するのに適した動物モデルが必要とされた。従って、一つの最初の目標は、***に適した実験ラットモデルを入手することだった。２つの異なるアプローチを、適した動物モデルを作るために使用し、モデルＡ及びＢとした。モデルを作るために使用したラットは、300〜325g の雄ウィスターラットだった。手順の詳細を以下に示した。結果は（図１）、モデルＡが良好に保たれている(stands better)ことを示す（p=0.0001323、自由度＝6、一組のスチューデントｔ検定）。モデルＡは、右片側の腎摘出及び一部の左片側動脈、左静脈、左尿管結紮を含む。化学薬品：アルギン酸（低粘度、Lot 611994）及びポリ−Ｌ−リジン(MW16100、Lot 11H5 516)を、Kelco 及びSigma Chemical co.(St，Louis，MO，USA)からそれぞれ購入した。特別でない限り、化学薬品を商業的に入手し、かつ使用前に更に精製せず、及びこれら化学薬品は、分析試薬級だった。微生物及び培養条件：クレブシエラ醸気菌からのウレアーゼ遺伝子を含む、遺伝子操作バクテリア大腸菌DH5 を使用した。ルリア−ベルターニ(LB)増殖培地を、最初の細胞培養に使用した。LB培地の組成は、10.00g/lバクトトリプトン(bactotryptone)(Difco 製 )、5.00g/l バクト酵母抽出物(Difco製)、10.00g/l塩化ナトリウム(Sigma製)であった。ｐＨを、1.00N ＮａＯＨ約1.00mlを加えて7.5 に調製した。培地を、その後、キャッスルラボクレーブ(Castle Labclaves)中で30分間、121 ℃（250 ° Ｆ）で撹拌した。培養は、37℃の16.00ml 培養管中の5.0mlLB で、120rpmにした軌道撹拌器で行った。バイオマスの生成が大規模なので、マイクロカプセルに入れる目的で、100mlのLB培地を含む250ml エルレンマイヤーフラスコを使用した。マイクロカプセル封入手順：手短に言えば、大腸菌DH5 細胞を含む、アルギン酸塩−ポリ−Ｌ−リジン−アルギン酸塩(APA)-マイクロカプセルを、次のように調製した。バクテリア細胞を、オートクレーブしたアルギン酸ナトリウムの0.9 ％塩化ナトリウム溶液中で懸濁した。粘性アルギン酸塩−バクテリア懸濁液は、注射ポンプ（コンパクト注入ポンプモデル 975^TM、Harvard App，Co．MA）を使用して、23−ゲージ針を通して押し出した。16ゲージ針を通過する圧縮空気を使用して、23−ゲージ針の先端から出てくる液滴を剪断した。この２つの針を組み合わせて、液滴針の集合を作っている(図11A、11B)。液滴は、15分間静かに撹拌した塩化カルシウムの氷***液(1.4％)中でゲル化させた。塩化カルシウム中でのゲル化後、アルギン酸塩のゲルビーズを、ポリリジン(HEPES^TM緩衝生理食塩水中で 0.05 ％、ｐＨ7.20)で10分間被覆した。このビーズは、その後、HEPES^TMで洗浄し、アルギン酸塩溶液(0.1％)で4.00分間被覆した。アルギン酸塩−ポリ−Ｌ− リジン−アルギン酸塩のカプセルを、その後、3.00％クエン酸塩浴(1:1 HEPES^TM 緩衝生理食塩水中で3.00％、ｐＨ7.20)で洗浄して、マイクロカプセル中でゲルを液化させた。マイクロカプセルの形態を4℃で貯蔵し、実験に使用した。マイクロカプセル貯蔵条件：マイクロカプセル封入の後、マイクロカプセルを、しっかりと数回（２〜３回）滅菌水で洗浄した。このマイクロカプセルは、アグロバクテリウムの最小ブロス（AG最小培地）中で、４〜10℃で再懸濁した。この培地は、LB培地と異なり、大腸菌の増殖を補助しないが、生物学的活性を維持するために必要な全ての成分を含んでいる。使用前に、マイクロカプセルを通常の生理食塩水で洗浄して実験に使用した。 in vitroにおける尿素及びアンモニアの除去実験のための反応培地：全ての実験における反応培地は、1.00g/l グルコース、20.00mg/l 硫酸マグネシウム、30.00mg/l リン酸水素二カリウム、0.07mg/lビタミンＢ₁₂を有していた。必要であればろ過され、無菌化された尿素を、反応培地に加えて尿素濃度を10 0mg/dlとした。牛由来血漿を、血漿の尿素及びアンモニアの除去実験に使用し、ろ過滅菌尿素を血漿に加えた。このようにして、in vitroにおいて***患者の血漿の特徴を模倣した。 ***（ラット）の外科用モデル２つの異なる外科用のモデルを開発し、モデルＡ及びモデルＢとした。両モデルとも、300 〜340gの雄ウィスターマウスを使用した。***ラットモデルを治療するために適用された外科的手順の詳細は、次の通りである。モデルＡ：２工程の手順で、一つは右腎摘出を行い、もう一つは、左の動脈、静脈、尿管を部分的に結紮する手順を必要とする。この手順の詳細は、次の通りである。 i) 片側の（右）腎摘出：麻酔された動物を、尾部を外科医に向けて腹を横にして置く。右背側の腰部の毛を刈り取り、皮膚を外科的に洗浄して(scrub)入念にふき取った。２〜３cmの切り込みを、尾部から動物の右側の肋骨胸郭までの皮膚に入れる。その後、２〜３cmの切り込みを、その下にある筋肉壁に入れる。腎臓は、筋肉壁を通して貯蔵 (pool)し、腎臓の動脈、静脈、尿管を結紮し、腎臓を腎臓の間の血管と尿管とに切り込みを入れて除去し、結紮した残りの組織を腹膜腔に戻し、筋肉壁を縫合する。皮膚切開は、２〜３の創傷クリップで閉じる。 ii) 片側（左）腎臓の動脈／静脈／尿管／結紮：ラットの左側を、左腎摘出を行うように準備する。切り込み（２〜３cm）を筋肉壁に入れた後、左腎臓の動脈、静脈、及び尿管を捜し出す。先の丸い(blunt) ピンセットを使って、左腎臓の血管及び尿管を腹膜の結合組織から分離、分別する。腎臓の血管及び尿管は、無菌絹縫合を使用して部分的に結紮する。筋肉壁を縫合する。皮膚切開は、２〜３の金属創傷クリップで閉じる。モデルＢ：左腎動脈／静脈／尿管／結紮：麻酔された動物を、尾部を外科医に向けて腹を横にして置く。左背側の腰部の毛を刈り取り、皮膚を外科的に洗浄して入念にふき取った。２〜３cmの切り込みを、尾部から動物の左側の肋骨胸郭までの皮膚に入れる。２〜３cmの切り込みを、その下にある筋肉壁に入れ、左側の動脈、静脈、及び尿管を探し出す。先の丸いピンセットを使って、左腎臓の血管及び尿管を腹膜の結合組織から分離、分別する。左側の腎臓の血管及び尿管は、無菌絹縫合を使用して結紮する。筋肉壁を縫合する。皮膚切開は、２〜３の金属創傷クリップで閉じる。考察：本発明の主目的は、マイクロカプセル封入遺伝子操作微生物を経口で与えて使用して、種々の疾病を治療する、新しいアプローチの可能性を探求することにある。本研究の特別な目的は、腎不全や肝不全における尿素及びアンモニアレベルの管理に適した手段を見いだすことにある。従って、本発明によって、APA 膜中のクレブシエラ醸気菌からのウレアーゼ遺伝子を利用する尿素を含む、カプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5 細胞を調製し、経口投与でこの細胞を使用するために前もって作った。本発明に従って、マイクロカプセル封入遺伝子操作微生物を経口的に使用して、腎不全ラットを治療し、ラットの尿素及びアンモニアレベルを低下させることができることが示される。更に、本発明者は、APA-カプセル封入バクテリア及び遊離バクテリアの経口給餌はともに、実験***ラットモデルにおいて血漿尿素を減少することもはじめて報告する。シングルプールモデルを使用して、このラットモデルを評価する時、カプセル封入バクテリアは、一般に使用されるオキシスターチ及びウレアーゼリン酸ジルコニウムよりも大きい効果で尿素を除去できることがわかった。２日目の3.2 ±0.67尿素mg／バイオマスmg、４日目の8.00± 1.39mg／バイオマスmgの量を、カプセル封入バクテリアに対して観測した。オキシスターチ及びウレアーゼリン酸ジルコニウムは、一方で、0.103 尿素mg／オキシスターチmg、0.033 尿素mg／ウレアーゼ−リン酸ジルコニウムmgの除去能力を有しているにすぎない（Prakash、Chang、Biotechnology and Bioengineering、 46、621〜626 頁、1995年）。また、現在のオキシスターチ及びウレアーゼリン酸ジルコニウム系は、実際の治療中に利用できる必要のない特別な条件下で働く。例えば、オキシスターチは、特異的なｐＨでのみ結合する尿素及びアンモニアの十分な容量を有している。体液区画からアンモニアを速やかに除去することは、肝不全の間の精神的なダメージを防止するために要求される。本発明によって、アンモニア除去は、カプセル封入バクテリアで可能になることが示された。***ラットの血漿アンモニア濃度は、尿素除去実験中に519 〜560 ±51μM/l から144 ±24.70 μM/l まで減少した。これは、約73.30 ±4.57％の減少になる。尿素除去の点から、本発明のAPA-カプセル封入バクテリア及び遊離バクテリアの性質は（図８）、遊離バクテリアを越えるカプセル封入バクテリアの使用の利点を明確に示している。治療の開始時期において、遊離バクテリアは、マイクロカプセル封入バクテリアと比べて尿素除去能力が低い。これは、最初の通過の間に遊離バクテリアが死滅するためである。微生物の使用が要求されるいかなる治療においても、微生物が、体内にとどまらないことを確認することは重要である。従って、マイクロカプセル封入微生物は、大便中に***される。このように、給餌をやめるとすぐに、***ラットの体で製造された尿素によって尿素のレベルが治療前の***のレベルまで増加する結果になった。一方で、遊離バクテリアに対する治療が中止されると、微生物は体内にとどまり続け、数分は尿素レベルを低く維持し続ける（図８）。さらに、カプセル封入微生物は、遊離微生物よりも速やかに除去されるという利点を示す。この研究は、マイクロカプセルに封入した、一般的には遺伝子操作微生物、特に遺伝子操作バクテリアの経口給餌の治療上の有効性を示す。本研究は、腎不全、肝不全、その他の疾病の治療のための容易に投与できる経口の形態として、遺伝子操作バクテリアを含む経口マイクロカプセルの発達の基礎も提供する。本発明は、次に示す実施例についての言及により更に容易に理解できるが、これは、本発明を例証するのであって、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１マイクロカプセル封入遺伝子操作バクテリアの経口給餌による尿素及びアンモニアの除去実験手順：バクテリアは、ＬＢ培地で増殖させた。対数期のバクテリア細胞を、10000gで 20分間、４℃で遠心分離して収穫した。細胞の塊を５回滅菌した冷水で洗浄して培養成分を除去した。細胞を秤量し、遊離バクテリアによる尿素及びアンモニアの除去実験に使用した。マイクロカプセル封入尿素及びアンモニアの除去実験のために、同量の細胞を、マイクロカプセルに封入して使用した。全ての実験にわたって、反応器の容量とマイクロカプセル封入バクテリアの使用量との比を、一定に保った。マイクロカプセルに封入したin vivo 動物試験のために、対数期の遺伝子バクテリアを含むマイクロカプセルを、５ml注射器に入れた0.8 〜1.0ml 滅菌通常生理食塩水中で最初に懸濁した。浮いているマイクロカプセルを、***ラットに曲がった12G-3 1/2 ステンレス針を使って、強制的に経口的に給餌した。kg体重あたり11.15 ±2.25mgの対数期の遺伝子操作バクテリア大腸菌DH5 細胞をマイクロカプセルに入れたものを使用した。腎臓又は肝臓の機能にいかなる副作用もないと報告されている適量の薬剤を使って鎮静した後にラットの尾部から血液試料を取り出すことによりサンプリングを行った。薬剤は、ATRAVET^TM（アセプロマジン）及びKETASET^TM（ケタミン）を、濃度75mg/kg 及び 5〜9mg/9kg で筋肉内にそれぞれ使用した。小さな23G1精度のGLIDE^TM針と、10ccの注射器を使った。血液試料をEPPENDORFF^TMを使って直ちに遠心分離し、血漿を集めて尿素及びアンモニアについて分析した。尿素測定：尿素濃度を、Sigma Chemical Co．USAから購入したBUN キット及びPERKIN ELM ER LAMBDA^TM 4B 紫外分光光度計を使用した血液の定量測定に基づいて測定した。この方法を使用すると、血清又は血漿尿素を除タンパクせずに測定することができる。この方法において、尿素とジアセチルモノオキサミンとの反応は、桃色の色原体及びヒドロキシルアミンを与える。尿素濃度は、色生成強度と直接比例し、この強度は、分光光度計で 515〜540nm の間で測定できる。この方法は、単純、迅速、高感度で、アンモニウムイオンの存在に影響されない。尿素測定用の検量線を、標準尿素溶液の既知量を使用し、540nm の光学濃度で作成した（図２）。検量線を、全ての実験において尿素を定量するために使用した。アンモニア測定：アンモニア測定を、蛍光光散乱 MULTISTAT^TM III超遠心分析機を使用して分析した。この系の使用は、計測研究所(Instrumentation Laboratories)で、MULTIS TAT^TM III plus(Spokane、Wash.)、吸光度モードの超遠心分離分析機(MCA)(Sigm a procedure、catalogue 170-UV)で行った。この測定は、２−オキソグルタレートの還元的アミノ化に基づき、グルタレート脱水素酵素(GLDH)を使用して、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)を還元した。NADHの酸化による340nm での吸光度の減少は、アンモニア濃度と比例する。この方法は、その都度新しい検量線の準備が必要なので、検量線はその都度準備される。結果：本研究は、マイクロカプセル封入遺伝子操作微生物の、経口給餌による種々の疾病の治療への使用を探索するために計画された。即ち、本研究は、マイクロカプセル封入遺伝子操作バクテリア細胞の、臨床実験における腎不全、肝不全及び他の疾病の治療に対する将来の可能性を評価する。以前のin vitroでの研究は、アルギン酸塩−ポリ−Ｌ−リジン−アルギン酸塩 (APA)カプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5 細胞は、反応培地及び血漿の双方から尿素及びアンモニアを除去するのに極めて効果的であることが証明された（Prak ash，S．及びChang，T.M.S．、Biotechnology and Bioengineering、46、621〜6 26 頁、1995年）。マイクロカプセルの調製に含まれる工程の要素の詳細と、尿素及びアンモニア除去のin vitroでの速度論は、この論文に記述されている。本発明の臨床用の可能性を評価するために、適した動物モデルが要求される。従って、最初の目標は、***に適した実験ラットモデルを得ることにあった。適した***ラットモデルを作るための外科的方法が計画された。モデルを作るために使用されるラットは、300〜325gの雄ウィスターラットである。結果は、製法が、***ラットモデルを作るのに成功した方法であることを示す。部分的結紮は、腎臓組織の破壊の程度が異なる結果となった。これら実験ラットモデルの結果として、血漿尿素濃度の大きな変化が観測され、血漿尿素が最低17.61 ± 1.2mg/dl、最高172.28±40mg/dl だった。実験として、血漿尿素52.08 ±2.06mg /dl を有する動物のみを使用した。この***ラットモデルは、正常ラットと比較して高レベルの血漿を有ていた（図３）。さらに、上記動物は、実験に十分な時間生存できる。このモデルは、右腎摘出後、一部の左動脈、静脈、尿管を部分的に結紮したものに基づいている。実験ラットの体重曲線は以下の通りであり、その結果を図４に示す。本研究の主目的は、実験において、カプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5 の経口投与が全身の尿素レベルを減少できるか否かを見るのに十分長く生存できる動物腎不全モデルを得ることにあった。実験を、マイクロカプセル封入遺伝子操作細胞の、***ラットにおける尿素除去への使用を評価するために計画した。前述した実験モデルを、この研究に使用した。加えて、実験ラットをそれ自身対照として治療前の尿素レベルをモニターする傍ら、正常ラット及びバクテリアの入っていない空マイクロカプセルを受け入れる***ラットは、双方とも対照として使用した。全ての実験研究の間で、対照ラットと腎摘出ラットに、22.5％のタンパク質を含む通常飼料(Purina Mi lls, LaSalle，Qc)を給餌した。対数期アルギン酸塩−ポリ−Ｌ−アルギン酸塩をマイクロカプセル封入バクテリアの11.15 ±2.25mg/kg 体重の量を、高レベルの血漿尿素（血漿尿素濃度52.08 ±2.06％mg、9.10±0.71％mgの正常ラットの血漿尿素と比較して）を有する26日齢の腎摘出ラット群に毎日強制的に給餌した。図５の結果は、バクテリアは、血漿尿素濃度を治療の最初の48時間で52.08 ±2. 06から37.53 ±3.31mg/dl、翌日には13.34 ±2.24mg/dl、７日後には10.58 ±0. 85mg/dl に低下することができたことを示す。毎日給餌治療を続けていれば、尿毒症ラットにおける血漿尿素レベルを21日間は正常値に非常に近く維持できた。高い尿素レベルに戻るのは、治療をやめたときに観測される。尿素レベルは、20 .11 ±1.80mg/dl に戻り、ちょうど次の日から７日までそれぞれ、24.52 ±3.25 mg/dl、37.60 ±8.21mg/dl、47.57 ±2.26mg/dl、48.92 ±2.09mg/dl、53.80 ± 2.18mg/dl、53.69 ±2.59mg/dl に戻った。２匹の動物が、治療停止により８日目に死んだ。解剖研究では、出血性腸、結合しつぶれた肺、及び液体のたまった胸腔の症状を伴う典型的な***死を示した。肺体液中の尿素濃度は、最高で17 7.21±12.90mg/dl(n=2)に到達した。更に、全体の50％の動物が、治療停止から最初の29日で死んだ。類似の実験を、APA カプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5 細胞によって尿素除去する間のアンモニアの結果を観測するために行った。これは、肝不全におけるこの系の使用の可能性を探索するためにも行った。結果（図６）は、常に539 ±51 mM存在するアンモニアレベルが、144 ±24.70mM に減少し、治療の全期間において一定に残存していたことを示す。図７で得られたデータは、遊離バクテリアも血漿尿素を減少させることができたことを示す。遊離細胞での実験中、バクテリアの使用量は、APA マイクロカプセルに封入した研究と同じだった。遊離バクテリアとAPA カプセル封入バクテリアとの尿素除去の速度を比較すると（図８）、全体的な速度は、類似していることがわかった。しかしながら、当初は、遊離バクテリアに除去される尿素の割合が、APA カプセル封入バクテリアに除去される割合より非常に小さかった。遊離バクテリアでは、１日目に20.28 ±1.06％、２日目には68.29 ±4.30％除去した（APA カプセル封入バクテリアの36.34 ±4.70％、80.49 ±2.96％と比較して）。更に、処理後期において、APA カプセル封入バクテリア中の血漿尿素濃度の増加率は、遊離バクテリアで観測されるよりも非常に高い。実験は、長期治療の効果をフォローするためにも計画された。結果は、治療された実験ラットモデルに対する生存曲線としてプロットする（図９）。結果は、全ての治療された動物は、朱治療動物の50％生存に比べて、治療から最初の27日間生存していたことを示す。結果は、また、治療した群の動物中で、非常に高い生存率を示し、これは、マイクロカプセル封入遺伝子操作バクテリアを経口投与で受けている動物の治療した群において、非常に低い生存を示す実験腎不全ラット群と比較しても、87.5％に及ぶ高い生存率を示している。空のカプセルしか受け取っていない実験腎不全ラット群は、最初の21日で25％の動物が死に、29日後に50％が、41日後に75％の動物が死んだ。シングルプールモデルを使用して、APA カプセル封入遺伝子操作バクテリアに除去された尿素を計算し、他の入手可能な対応する経口吸収剤と比較した（図１０）。計算では、70kgの人へ4.2g／日のバイオマスを経口投与すると、血漿尿素濃度が100mg/dlから10mg/dl に低下することを示す。これは、患者中の血漿尿素濃度を100mg/dlから10mg/dl に低下させるために要求される、オキシスターチ約388g及びマイクロカプセル封入ウレアーゼリン酸ジルコニウム1212g の量と比べて、はるかに少ない投与量である。オキシスターチ及びマイクロカプセル封入ウレアーゼリン酸ジルコニウムの要求される投与量は、患者に日常的な毎日の使用に対する投与量としては多すぎて許容されない。一方で、発明者の研究では、非常に少量のマイクロカプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5 細胞が、***ラットにおいて正常な尿素レベルを維持できることを示している。結論：本実施例は、マイクロカプセルに封入し、遺伝子を操作したバクテリア細胞の経口給餌により尿素及びアンモニアを除去する新たな方法について記述した。このAPA-カプセル封入遺伝子操作大腸菌DH5 細胞は、***ラットモデルの体液区画からの尿素を効率的に低下した。尿素減少は、マイクロカプセル封入が消化管において微生物を保護するので、マイクロカプセル封入工程によって改善された。カプセル封入バクテリアは、最初の48時間で全血漿尿素の36.34 ±4.70％を、２日目には血漿尿素の80.49 ±2.96％を減少できた。同様の条件下で、同じバクテリアは、血漿アンモニアを48時間の治療で519 ±51.26 μM/L から144.00 ±24.70 μM/L に低下できた。バクテリア細胞は、アンモニアを製造せず、この細胞の代謝性窒素として尿素を使用する。本発明は、この新しいアプローチが、尿素及びアンモニア除去に対して通常のオキシスターチ及びウレアーゼリン酸ジルコニウムのアプローチよりも数百倍以上の効果があることを示す。従って、本発明は、実験***ラットにおける尿素及びアンモニア***の除去に対する、マイクロカプセル封入遺伝子操作バクテリア大腸菌DH5 細胞の経口給餌の初期治療の可能性を示す。本発明は、また、将来の臨床用の遺伝子操作細胞の他のタイプを含む経口マイクロカプセルの発展に対する基礎を提供する。本発明が、それ自身特別な態様について記述されているが、更に修飾でき、この出願は、一般にこの発明の原理に従い、及び本発明が関係する技術における公知又は慣習的な経験からくるものとして、及びここで前述した重要な特徴に適用され、従属請求項の範囲に従って、この開示から出発するものを含む、いかなる改変、使用、用途をもカバーするものである。

【手続補正書】【提出日】１９９８年７月２３日【補正内容】請求の範囲１．疾病により生ずる望ましくない化学物質を患者の体から除去するために該患者に経口投与する組成物において、該患者に経口投与するための医薬上許容できる担体と、該望ましくない化学物質を除去できるように担持され又はマイクロカプセルに封入された遺伝子操作微生物を含み、該望ましくない化学物質の除去が、望ましくない化学物質濃度の治療的に許容されるレベルまで低下することを特徴とする、当該組成物。２．該微生物が、微生物を保持でき、除去するための望ましくない化学物質がマイクロカプセル内に入ることができるようなマイクロカプセル材料を使用してマイクロカプセル化されている、請求項１に記載の組成物。３．該微生物が、微生物を保持でき、除去するための望ましくない化学物質が侵入して担持微生物と接触することができるような担持材料を使用して、担体中に担持されている、請求項１記載の組成物。４．該望ましくない化学物質が、尿素及び又はアンモニアである、請求項３に記載の組成物。５．該疾病が、腎不全を引き起こす疾病である、請求項４に記載の組成物。６．該疾病が、肝不全を引き起こす疾病である、請求項４に記載の組成物。７．該疾病が、高いアンモニアレベルを伴う高アンモニア血症である、請求項４に記載の組成物。８．該微生物が、遺伝子操作大腸菌DH5 細胞である、請求項３に記載の組成物。９．該微生物が、ナイロン、シリコンゴム、ナイロン−ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジアリル）−アンモニウムクロライド、ヒドロキシ−エチルメタクリレートメチルメタクリレート、キトサン−カルボキシメチル−セルロース、アルギン酸塩−ポリリジン−アルギン酸塩からなる群から選ばれた材料を使用してマイクロカプセルに封入されている、請求項２に記載の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．疾病により生ずる望ましくない化学物質及び／又はアミノ酸の除去のために患者に経口投与する組成物において、該患者に経口投与するための医薬上許容できる担体と、該望ましくない化学物質及び／又はアミノ酸を除去できるように担持され又はマイクロカプセルに封入された微生物を含むことを特徴とする、当該組成物。２．該微生物が、微生物を保持でき、除去するための望ましくない分子がマイクロカプセル内に入ることができるようなマイクロカプセル材料を使用してマイクロカプセル化されている、請求項１に記載の組成物。３．該微生物が、微生物を保持でき、除去するための望ましくない分子が侵入して担持微生物と接触することができるような担持材料を使用して、担体中に担持されている、請求項１に記載の組成物。４．該微生物が、遺伝子操作されている、請求項１に記載の組成物。５．該望ましくない化学薬品が、尿素及び／又はアンモニアである、請求項４に記載の組成物。６．該疾病が、腎不全を引き起こす疾病である、請求項５に記載の組成物。７．該疾病が、肝不全を引き起こす疾病である、請求項５に記載の組成物。８．該疾病が、高いアンモニアレベルを伴う高アンモニア血症である、請求項５に記載の組成物。９．該微生物が、遺伝子操作大腸菌DH5 細胞である、請求項４に記載の組成物。 10．該微生物が、ナイロン、シリコンゴム、ナイロン−ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジアリル）−アンモニウムクロライド、ヒドロキシ−エチルメタクリレートメチルメタクリレート、キトサン−カルボキシメチル−セルロース、アルギン酸塩−ポリリジン−アルギン酸塩からなる群から選ばれた材料を使用してマイクロカプセルに封入されている、請求項２に記載の組成物。 11．該望ましくないアミノ酸がフェニルアラニンであり、該疾病がフェニルケトン尿症である、請求項４に記載の組成物。 12．該望ましくないアミノ酸がチロシンであり、該疾病がチロシン血症及び黒色腫である、請求項４に記載の組成物。