JPH11501311A

JPH11501311A - 皮膚イソホスホジエステラーゼの阻害剤を含んでなる皮膚疾患を治療するための組成物

Info

Publication number: JPH11501311A
Application number: JP8526738A
Authority: JP
Inventors: セオビック，ジョージ; アンドレ，パトリス
Original assignee: パルファン、クリスチャン、ディオール
Priority date: 1995-03-08
Filing date: 1996-03-06
Publication date: 1999-02-02
Also published as: EP0813418A2; WO1996027384A3; WO1996027384A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、活性成分としてヒト皮膚イソＰＤＥの特異的阻害剤、および皮膚科学的に許容可能なキャリヤーを含んでなる、皮膚疾患を改善するための組成物に関する。本発明はまた、この組成物を適用することを特徴とする皮膚疾患の改善の方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】皮膚イソホスホジエステラーゼの阻害剤を含んでなる皮膚疾患を治療するための組成物発明の分野本発明は、一般的には局所に塗布することによって皮膚の炎症および刺激を治療する方法に関する。この組成物は、天候、日光、化学薬品または老化によって生じる損傷に関する皮膚疾患を改善するための化粧品にも有用である。先行技術の背景多数の細胞機能の第二のメッセンジャーまたはレギュレーターとしてのサイクリックＡＭＰまたはサイクリック３′５′−アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の役割は、現在では一般に認められている。細胞中のｃＡＭＰの濃度は、アデニルシクラーゼによる細胞でのその形成および酵素ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）によるその加水分解の速度によって変化することが確かめられている(R.W．Butc her 等，J．Biol．Chem.，241，1651，1966)。初期の研究は総て飽和基質(satur ating substrates)を用いて行われたので、ＰＤＥ活性の速度論的に異なる形態がほとんどの組織に存在することが確かめられたのは、ごく最近であった(W.J． Thompson，Biochem.，10，31，1971)。初期の研究において、カフェイン、テオフィリンおよび幾つかの他のキサンチンが、高濃度でＰＤＥを阻害することが見いだされた。ＰＤＥの多様形態、またはいわゆるイソＰＤＥの発見により、可能な治療用途を目的として様々なイソＰＤＥの選択的阻害剤を得ることが試みられている（G．Cehovic等，サイクリックヌクレオチド研究の進歩(Adv．Cyclic Nucleotides Res.)，第１巻，５２１，１９７２，Raven Press ，ニューヨーク、およびStefanovich ，サイクリックヌクレオチドおよび治療用途(Cyclic Nucleotides and Therapeutic Appl ications)，A.G．Robinson and G．Cehovic監修，Pergamon Press，Oxford,１９７８）。ある種のホルモンおよび抗炎症薬は、イン・ビボでは炎症および免疫応答の性質および強度の調節によって作用することも認められた。この調節は、サイクリックＡＭＰの一般的な阻害作用によって媒介される。また、サイクリックＡＭＰの細胞内濃度は、炎症過程中にアデニルシクラーゼ活性の減少またはＰＤＥ濃度の増加によって減少させることができることが報告されている(M．Hitchcock，J ．of Immunol.，188，557，1977)。サイクリックＡＭＰは、多量の非特異的ＰＤＥ阻害薬テオフィリンまたはカフェインと共に、炎症の幾つかの症状を緩和することができることが以前に認められていた。また、幾つかの極めて強力なサイクリックＡＭＰ誘導体（すなわち、ジブチリルまたはモノブチリルサイクリックＡＭＰ）を局所的に用いることによって、皮膚炎症を防止および／または改善することができた（米国特許第４，２０８，４０６号明細書）。本発明は、植物からイソＰＤＥの極めて活性でかつ特異的な阻害剤の単離に基づいた改良された組成物に関する。幾つかの報告および実験データーは、サイクリックＡＭＰが年齢と共に減少し、ＰＤＥは年齢と共に増加することを示していた(S.K．Puri and L．Volicer，M echanisms of Aging and Dev.，15，239，1981; A．Birkenfeld and A．Ben-Zvi ，Clinical Experimental Immunology，55，651，1984; K．Tobise等，Circ．Re s.，74,596，1994)。イソＰＤＥ阻害剤を添加することによってサイクリックＡＭＰの作用が強化され、年齢と共に低化する正常な皮膚の機能も改善される。発明の概要本発明は、皮膚炎の治療用組成物、および天候、化学薬品または老化によって生じた損傷に関する皮膚疾患の防止および改善に関する。ヒトの皮膚におけるＰＤＥの膨大な研究により、ヒトの皮膚から新規なイソＰＤＥが単離され、精製された。この単離は、等電点電気泳動の新規な方法によって行われた(Rotofor Bio Rad)。本発明者らは、ヒトの皮膚におけるイソＰＤＥは男女で異なることを見いだした。女性のイソＰＤＥは、ｐＨが約５．５であり、男性ではｐＨ６．５である。この差により、これら２種類のＰＤＥを分離し、特異的なイソＰＤＥ阻害剤を選択するのに用いることができた。ヒトの皮膚から単離されたこれらの新規なイソＰＤＥを基質として用いることによって、本発明者らは、いくつかの種類の異なる植物抽出物を試験した。ヒトの皮膚のイソＰＤＥに最も活性なものは、Ginkgo Biloba からのフラボノイド抽出物、すなわちアメントフラボン(Amentoflavone)、ビロベチン(Bilobetine)およびGinkgo Biloba ビフラボノイド(Biflavonoid)、および緑茶(Green Tea)およびオルトシフォン(Orthosiphon)からの抽出物またはその活性成分であった。ＨＰＬＣによって精製したこれらの抽出物、または純粋な生成物の幾つかを、ヒトの皮膚のイソＰＤＥを阻害するその効力について試験した。ビロベチンおよびアメントフラボンは、粗製のGinkgo Biloba 抽出物と同様なＰＤＥの阻害における効力を示した。このGinkgo Biloba 抽出物は、１〜１０μ ｇ／ｍｌの濃度で活性であった。この極めて高い効力は、更に精製することなくそれを使用することができることを示している。幾つかの特異的なＰＤＥ阻害剤を用いることによって、本発明者らは、この新規なヒトの皮膚のイソＰＤＥが、群番号４またはｃＡＭＰに特異的なイソ酵素類に属することを確かめた。本発明は、活性成分としてヒトの皮膚のイソＰＤＥの特異的阻害剤、および皮膚科学的に許容可能なキャリヤーを含有する皮膚状態の改善のための組成物、およびこの組成物の塗布を含む皮膚疾患の改善の方法に関する。本発明による組成物は、エマルジョン、クリーム、ゲル、泡沫（foam）、またはローションの形態とすることができる。特に、本発明は、女性のヒト皮膚のイソＰＤＥまたは男性のヒト皮膚のイソＰＤＥの特異的阻害剤を含んでなる組成物に関する。「ヒトの皮膚のイソＰＤＥの特異的阻害剤」とは、非特異的ＰＤＥ阻害薬であることが知られているテオフィリンより上記のイソＰＤＥで良好な阻害を示すインヒビターを意味する。上記組成物は、サイクリックＡＭＰ、または米国特許第３，９７８，２１３号明細書および米国特許第４，２０８，４０６号明細書に記載のその類似体または誘導体の一つを含むこともできる。 Ginkgo Biloba 抽出物を用いるイン・ビボでの研究は、Ｕ．Ｖ．を照射したモルモットで行った。局所的に適用される０．０１％の濃度のGinkgo Biloba 抽出物は、明らかに紫外線によって生じた紅斑を減少させた。サイクリックＡＭＰを０．１％添加することにより、効力が増強された。極めて低濃度のGinkgo Biloba 抽出物は、イン・ビボおよびイン・ビトロにおいて皮膚イソＰＤＥに対する相対的阻害特異性を示している。上記の組成物は、皮膚の炎症の治療に特に有用であるが、風、寒さ、化学薬品、日光、虫さされ、またはウルシ（poison oak）またはツタウルシ（poison ivy ）のような他の刺激物質、空調、汚染およびその他（クロトン油、カラシ油など）によって引き起こされる皮膚疾患の改善にも特に有用である。この組成物は、老化した皮膚における正常な生理機能を改善するのにも有用である。寒さ、風、日光、化学薬品、空調、汚染および他の皮膚にストレスを与える条件、および老化によって生じる軽度の皮膚炎症または刺激には、０．０１％の濃度のGinkgo Biloba 抽出物または他の特異的な阻害剤を０．１％のサイクリックＡＭＰと共に含むクリーム、ゲル、ローション、エマルジョン、泡沫またはスプレーの局所適用が好ましい。図面の簡単な説明図１は、ThompsonＰＤＥアッセイ法を用いるヒトの女性皮膚の画分に対するRo tofor 上でのホスホジエステラーゼの分析結果を示す。ｘ軸は、画分番号を示す。ｙ軸は、左側に１０³ｃｐｍで表したそれぞれの画分の放射能を示し、右側にはそれぞれの画分のｐＨを示す。図２は、ヒト男性皮膚に相当することを除き、図２と同様である。図３は、ヒト皮膚からのイソＰＤＥに対する幾つかの植物抽出物の阻害作用を示す。抽出物は、下記の通りである。Ｉ Ginkgo Biloba ビフラボノイド II カンゾウ III アメントフラボン IV カルコーン(Chalcone)。ｘ軸は、抽出物の濃度を示す（μｇ／ｍｌ）。ｙ軸は、阻害率を示す。図４は、モルモットに、 −０．１％ｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、 −０．０１％Ginkgo Biloba（ＧＢ）、 −０．０１％Ginkgo Biloba および０．１％ｃＡＭＰ(ＧＢ＋ｃＡＭＰ) −プラシーボ（ＰＬ）、を含む各クリームを局所塗布した後、紫外線によって誘発された紅斑の検討の結果を示す。ｘ軸は、時で表した適用後の時間を表す。ｙ軸は、％で表した相当する０時測定に対する紅斑の比率を表す。ヒト皮膚からの様々なイソホスホジエステラーゼ（イソＰＤＥ）の単離および精製の検討皮膚の多くの重要な機能は、アデニルサイクリック系によって制御されている。細胞の機能的活性は、サイクリックＡＭＰの濃度によって変化する。その濃度、すなわちｃＡＭＰは、サイクリックヌクレオチドの合成対ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）によるその加水分解の速度に依存する。近年、幾つかのタイプのイソＰＤＥの同定において、重要な進歩がなされた。しかしながら、多くの問題が未解決のままであり、例えば、イソＰＤＥは比較的大きなタンパク質分子であり（ＭＷ約５０〜１１０ｋＤ）、それらは安定ではなく−２０℃で凍結してもその生物活性を極めて速やかに喪失し、また、多くの実験室は異なる分離および単離の方法を用いており、様々な実験室から得られた異なるイソＰＤＥを明確に分類することは未だ極めて困難である。ヒト皮膚からのＰＤＥの単離は、これまでは全く報告されていなかった。数年間、本発明者らはイソＰＤＥの単離および精製の様々な方法を検討した。本発明者らは、Rotofor 装置(Bio Rad)による等電点電気泳動法が特に有利であることを見いだした。総てのタンパク質はｐＨに依存する正味の電荷を有することに基づいた等電点電気泳動によるタンパク質の分離。タンパク質を、確定したｐＨグラディエントにより電気泳動を行うと、タンパク質の真の電荷が０となるｐＨに到達するまで移動する。その点において、それは移動を停止し、集束するといわれる。両性電解質が存在すると、グラディエントが更に長時間保持され、タンパク質が集束するまで更にゆっくり移動することができる。ほとんどのイソＰＤＥ酵素は分子量が極めて接近しており（６０〜７０ｋＤ）、ＰＤＥの分離のほとんどの方法は分子量の差に基づいているので、分離が困難である。 Rotofor 装置には、膜によって分離された２０個の区画がある。電気泳動の終了時に（２〜３時間）、これらの２０個の区画の溶液を（真空によって）２０本の試験管に送出する。ｐＨを測定した後、得られた画分を、ThompsonＰＤＥアッセイ法(W.J．Thompson，Biochem.，10，31，1971)を用いて様々な基質（ＣＡ＋／カルモジュリンまたはｃＧＭＰの存在下でのｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ）でそれらの加水分解活性を分析する。通常は、得られた画分の５０〜１００μｌをそれぞれの分析に用いる。それぞれの画分の総容積は１．９〜３．０ｍｌで変化する。残りの溶液を−２０℃で保存し、または凍結乾燥装置(lyiophilizer freeze dryer )4.5（Labconco）で凍結乾燥する。 Rotofor での精製および濃縮の後、イソＰＤＥを用いて様々なＰＤＥ阻害剤、特に幾つかの植物抽出物の作用を検討した。活性の検討により、新規なイソＰＤＥの特異活性を示す。最も重要かつ予想外の発見は、男性の皮膚からの主要ｃＡＭＰイソＰＤＥは、女性の皮膚からのものとは異なることであった。女性でのｃＡＭＰイソＰＤＥの主要ピークは、Rotofor 分離により画分６および７に位置し、ｐＨ５．０〜６．０、特にｐＨ５．２〜５．８に相当する（図１）。男性皮膚の抽出物では、主要ｃＡＭＰイソＰＤＥピークは画分９および１０にあり、ｐＨ６．０〜７．０、特にｐＨ６．０〜６．５に相当する（図２）。ｃＡＭＰおよびイソＰＤＥの全スペクトルは、男女間で明らかに異なっている。ヒト皮膚からのこれらの異なるイソＰＤＥの精製および分離により、植物抽出物からの様々なＰＤＥ阻害剤または幾つかの強力なキサンチン誘導体の、ヒト皮膚からの新規なイソＰＤＥに対する阻害剤としてのそれらの効力についての作用を検討することができる。ヒト皮膚のイソＰＤＥの様々なＰＤＥ阻害剤の検討様々なＰＤＥ（牛肉心臓からの標準ＰＤＥ(Sigma)）を用いることによって、またはラットまたはモルモットの脳のＰＤＥから、本発明者らは、ＰＤＥを用いた様々な効力を観察した。本発明者らは、多種多様な植物抽出物（ほとんどが葉または根からの抽出物）も検討した。また本発明者らは、用いたイソＰＤＥが女性の皮膚または男性由来のものであるかどうかに応じて差も観察した。表１にヒト女性の皮膚からのイソＰＤＥに対する各種の植物抽出物の阻害を示す。女性皮膚のイソＰＤＥの最も活性な阻害剤の中には、特にGinkgo Biloba から抽出したフラボノイドがあった。本発明者らは、いくつかの画分をＨＰＬＣによって精製し、ヒト皮膚のイソＰＤＥに対するそれらの効力を検討した。最も活性なものは、Ginkgo Biloba ビフラボノイドおよびアメントフラボンであった（図３）。 Ginkgo Biloba ビフラボノイドは、ヒト皮膚のイソＰＤＥに対して極めて高い阻害活性を示した。これは０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度で活性であった。５０パーセント（５０％）阻害は、イン・ビトロで１０μｇ／ｍｌの濃度で得られた。本発明者らは、幾つかのキサンチン誘導体（テオフィリン、アミノフィリン）と組み合わせたｃＡＭＰの抗炎症効果を以前に報告し（特許を獲得し）た。Gink go Biloba の抗ＰＤＥ効力（キサンチンの４０倍を越える効力）は、他の総ての化合物を超越していた。Ginkgo Biloba およびその類似体は、ヒト皮膚のイソＰＤＥの特異的阻害剤であると思われる。この理由により、追加の検討を行い、クリームの形態でモルモットに局所塗布することによって抗炎症作用を試験した。ＰＤＥの多様な形態の存在により、反応速度特性および薬理および生理学的メディエイターに対する感受性に基づいて５種類の異なる種類（Ｉ〜Ｖ）に分類された (G.A.Beavo and R．Reifsnyder，Trends Pharmacol．Sci.，11，150，19 90)。最近、幾つかのアイソザイム選択的阻害剤が開発された(C.D．Nicholson a nd M．Shahid，Pulmonary Pharmacol.，7，1，1994)。本発明者らは、ヒト皮膚から単離された新規なイソＰＤＥに対するこれらの選択的な阻害剤の幾つかの効果を検討し、牛肉心臓からのＰＤＥ(Sigma)に対するそれらの作用と比較した。第IV類、すなわちRolipramおよびRO-20-174 に対する特異的阻害薬によって極めて高い阻害効果が得られ、他の阻害剤の活性は低いことが判った。基質として牛肉心臓ＰＤＥ(Sigma)を用いることによって、Rolipra mおよびRO-20-174 では、実質的な阻害は見られなかった。Bilobetin(Ginkgo Bi loba画分)は、皮膚のイソＰＤＥに対して極めて高い阻害効果を生じた。この結果に基づいたＰＤＥの本発明者らのヒト皮膚イソ型は、RolipramおよびGinkgo B iloba およびBilobetineに対する感受性によってＰＤＥ第IV群に分類することができる。イン・ビボで局所適用した後のモルモットにおける紫外線（Ｕ．Ｖ．）によって誘発される紅斑サイクリックＡＭＰ単独およびGinkgo Biloba と組み合わせたものの抗炎症作用を、紫外線光（Ｕ．Ｖ．）によって誘発される紅斑について検討した。方法：それぞれの実験では、１０匹の雌モルモットを用いた。試験の前に、背部の毛を刈り取り、残っている毛は市販の脱毛剤を用いて除去した。最低でも２時間後に、モルモットを拘束ホルダーで１３〜１５ｃｍの距離からＵ．Ｖ．に５分間暴露した。背部皮膚を、直径が１．３ｃｍの４個の孔を対称的に配置して含む半円筒型ベークライトシールドで被覆した。皮膚反応性の部位毎の変動を最小にするため、試験品の投与を試験部位について交互にした。Ｕ．Ｖ．ランプG.E.モデルRSK6を用い、Ｕ．Ｖ．暴露の直後に、クリームを局所塗布し（０．１ｍｌ／部位）、適当な試験部位について手袋をした指で緩やかに伸ばした。塗布の６０分後に、残っているクリームをティシューで緩やかに拭き取った。クリームの塗布は、６０、１２０および１８０分で繰り返した。試験部位を、局所適用から０、６０、１２０、１８０および２４０分後、および２４時間後に評価した。負の（プラシーボ）対照部位は、それぞれの動物について含めた。総ての試験部位は、下記のように等級付けを行った。０＝紅斑なし、１＝皮膚がピンクに見える（僅かに認知できる）、２＝赤色の十分に明確な紅斑、３＝ビート赤、中〜重度の紅斑、４＝ビート赤、重度の紅斑〜わずかな焼痂形成。何回かの実験で、ｃＡＭＰ単独はＵ．Ｖ．紅斑を減少させ、Ginkgo Biloba は最初の３時間は同じ効果を有することが確かめられた。この研究では、プラシーボはクリーム処方物（組成についての表２）からなり、これは総ての他の試験品の基剤として用いた。０．１％ｃＡＭＰクリーム単独では塗布から３時間後の紅斑を減少させ（表３）、Ginkgo Biloba クリーム単独は、塗布から２時間後には紅斑を有意に減少させ、４時間に亙って活性が増強された。活性増加は、０．１％ｃＡＭＰと０．０１％Ginkgo Biloba との組み合わせで明らかであった。更に重要なことは、一つの生成物の使用は長期間になることが予想されるが、それぞれのクリームの短期間の投与の後に上記の結果が得られるという事実である。それによって、０．１％ｃＡＭＰと０．０１％Ginkgo Biloba との組み合わせでは効力増強効果が予想され、０．１％ｃＡＭＰと０．０１％Ginkgo Biloba との組み合わせでは３時間後には紅斑を１００％まで完全に減少させた。図４は、ｃＡＭＰおよびGinkgo B iloba を含むクリームの局所塗布の後の紅斑の減少を示している。最近、G．Dent 等，Lung，172，129，1994は、「肺線維芽細胞の低ＫｍＡＭＰＰＤＥ活性は、完全な細胞をＩＢＭＸまたは他のサイクリックＡＭＰ増強剤に暴露した後に増加した。この明らかなフィードバック機構は、細胞のサイクリックＡＭＰのホメオスタシスの維持に関与することがある」ことを報告した。長期実験でのＰＤＥ阻害剤単独（ｃＡＭＰなし）を用いた場合の効果がより弱いという本発明者らの観察は、この報告と一致している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 45/00 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ 9/99 9/99 // Ｃ０７Ｄ 311/30 Ｃ０７Ｄ 311/30

Claims

【特許請求の範囲】１．活性成分としてヒト皮膚のイソＰＤＥの特異的阻害剤および皮膚科学的に許容可能なキャリヤーを含んでなる、皮膚状態を改善するための組成物。２．特異的阻害剤が、女性ヒト皮膚イソＰＤＥの特異的阻害剤である、請求の範囲第１項に記載の組成物。３．特異的阻害剤が、男性ヒト皮膚イソＰＤＥの特異的阻害剤である、請求の範囲第１項に記載の組成物。４．組成物が、サイクリックＡＭＰまたはその誘導体も含む、請求の範囲第１項に記載の組成物。５．特異的阻害剤として、 −有効なGinkgo Biloba 抽出物、またはその活性成分、 −有効な緑茶抽出物、またはその活性成分、および −有効なオルトシフォン抽出物、またはその活性成分、から選択される化合物、または抽出物を含む、請求の範囲第１項に記載の組成物。６．特異的阻害剤として、アメントフラボンまたはビロベチンを含む、請求の範囲第１項に記載の組成物。７．エマルジョン、クリーム、ゲル、泡沫またはローションの形態での、請求の範囲第１項に記載の組成物。８．風、寒さ、化学薬品、日光、虫さされ、またはウルシ（poison oak）またはツタウルシ（poison ivy）のような他の刺激物質、空調、汚染およびその他（クロトン油、カラシ油など）によって引き起こされる皮膚疾患を改善し、老化した皮膚における生理機能を改善し、皮膚の炎症を治療する皮膚状態の改善方法であって、請求の範囲第１項に記載の組成物を適用することを特徴とする、方法。９．請求の範囲第２項に記載の組成物を適用することを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の方法。１０．請求の範囲第３項に記載の組成物を適用することを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の方法。１１．請求の範囲第４項に記載の組成物を適用することを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の方法。１２．請求の範囲第５項に記載の組成物を適用することを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の方法。１３．請求の範囲第６項に記載の組成物を適用することを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の方法。１４．請求の範囲第７項に記載の組成物を適用することを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の方法。１５．ヒト皮膚のイソＰＤＥの特異的阻害剤の選択法であって、上記イソＰＤＥを使用することを特徴とする、方法。１６．女性のヒト皮膚から抽出することができ、等電点が５．０〜６．０であり、ｃＡＭＰ特異的イソ酵素に分類することができる、女性ヒト皮膚のイソＰＤＥ。１７．男性のヒト皮膚から抽出することができ、等電点が６．０〜７．０であり、ｃＡＭＰに特異的なイソ酵素に分類することができる、男性ヒト皮膚のイソＰＤＥ。