JPH11500612A

JPH11500612A - バチルスプロテアーゼ

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Publication number: JPH11500612A
Application number: JP8523909A
Authority: JP
Inventors: オートトルプ，ヘレ; スパールコンラッド，ラーズ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1996-02-08
Publication date: 1999-01-19
Anticipated expiration: 2016-02-08
Also published as: WO1996024666A1; BR9607403A; EP0809694A1; AR002962A1; JP3574140B2; AU4534896A; CA2212456C; MX9705968A; CA2212456A1; ATE313624T1; DE69635608D1; DE69635608T2; CN1094975C; EP0809694B1; CN1173895A

Abstract

(57)【要約】本発明は、新しバチルス種（Bacillus sp.）Ｉ612 の株から得られる界面活性プロテアーゼの分野に関する。更に、本発明に、前記プロテアーゼを調製するための方法、界面活性酵素としての前記プロテアーゼの使用、及び本発明のプロテアーゼを含む界面活性組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】バチルスプロテアーゼ発明の分野本発明は、バチルス種（Bacillus sp.）の種から得られうる界面活性プロテアーゼに関する。更に詳しくは、本発明は、バチルス種Ｉ612 の株由来の新規なアルカリプロテアーゼに関する。更に、本発明は、前記プロテアーゼを調製するための方法、界面活性酵素としての前記プロテアーゼの使用、及び本発明のプロテアーゼを含む界面活性組成物に関する。発明の背景界面活性酵素は、20年超の間、市販されており、現在、世界じゅうにわたって、粉体及び液体界面活性剤の両方中の通常の界面活性剤成分として十分に確立されている。製剤を洗浄するのに用いられる酵素は、プロテアーゼ、リバーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、及び他の酵素のような多くの異なる酵素、又はそれらの混合物を含む。商業的に、最も重要な酵素はプロテアーゼである。界面活性プロテアーゼは、天然に見い出されるプロテアーゼの単離し、次に界面活性剤中でテストすることにより発展してきた。ほとんどの界面活性プロテアーゼは、バチルス（Bacillus）属のメンバーから得られる。市販のプロテアーゼ製品の例は、その全てがNOVO Nordisk A/S(Denmark)により供されるALCALASE^TM、ESPERASE^TM及びSAVINASE^TMである。ALCALASE^TMプロテアーゼは、バチルス・リケニホルミス（Ba cillus licheniformis ）種の株により産生される。ESPERASE^TM及びSAVINASE^TMプロテアーゼは、好アルカリ性バチルスの株の培養により得られる。洗浄のしきたり、特に用いられる洗浄温度、用いる水の硬度、及び界面活性剤の成分は、国の間で極めて種々である。典型的な条件を以下に概説する。 −低いpH及び低い水の硬度：米国及びアジアにおける液体界面活性剤； −低いpH及び高い水の硬度：ヨーロッパにおける液体界面活性剤； −高いpH及び低い水の硬度：米国及びアジアにおける粉体界面活性剤； −高いpH及び高い水の硬度：ヨーロッパにおける粉体界面活性剤（界面活性剤における低いpHは、典型的には8.0 〜9.5 の範囲、特に約９のpHであり；界面活性剤における高いpHは、典型的に10〜11.5の範囲、特に約10.5のpH である。低い水の硬度は典型的に３〜６°dHの範囲であり；高い水の硬度は、典型的には15〜20°dHの範囲、特に約18°dHである）。更に、界面活性剤の組成物は、その洗浄過程をより環境にやさしくするために、ここ数年、変化している。全てのこれらの界面活性剤産業における差及び変化は、その分野を極めて複雑なものにする。それゆえ、特定の指定された条件のセットにおいて最適に作用する新しいプロテアーゼを見い出すことが、常に必要とされている。発明の概要本発明の目的は、中程度から低い洗浄温度において改良された洗浄性能を有する新規の界面活性プロテアーゼを提供することである。従って、第１の態様において、本発明者らは、バチルス種Ｉ612 ，DSM9701 の株由来のプロテアーゼのそれと同一又は部分的に同一な免疫化学的特性を有することを特徴とするプロテアーゼを提供する。第２の態様において、本発明は、バチルス種Ｉ612 の株により表されるバチルス種の株の単離された生物学的に純粋な培養物に関する。更に特定の態様において、本発明は、バチルス種Ｉ612 ，DSM9701 の株、又はその突然変異体もしくは変異体に関する。第３の態様において、本発明は、前記プロテアーゼを調製するための方法であって、該方法が、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地中でバチルス種Ｉ612 のプロテアーゼ産生株を培養した後、要求される酵素を回収することを含むことを特徴とする方法に関する。より特定の態様において、バチルス種Ｉ 612 ，DSM9701 又はその突然変異体もしくは変異体、又はバチルス種Ｉ612 由来のプロテアーゼのそれと同一もしくは部分的に同一な免疫化学的特性を有するプロテアーゼをコードする遺伝子を有する他の宿主生物が培養される。第４の態様において、界面活性酵素としての前記酵素の使用がクレームされる。より特定の態様において、本発明は、前記プロテアーゼを含む界面活性組成物及び界面活性添加物を提供する。第５の態様において、本発明は、前記プロテアーゼを加えることを含む洗浄法を提供する。図面の簡単な説明本発明は、添付の図面を引用することにより、更に詳説される。図１は、温度と、本発明による酵素（基質としての１％のカゼインでpH9.5 における実施例１により得られた酵素調製物）の蛋白質分解活性と、の間の関係を示す。図２は、pHと、本発明による酵素（基質としての１％のカゼインで、25℃において実施例１により得られた酵素調製物の蛋白質分解活性と、の間の関係を示す。発明の詳細な記載微生物本発明の酵素を産生することができる本発明の新規の微生物は、土壌のサンプルが単離された株により供される。バチルス種Ｉ612は、受託番号DSM9701 でDSM −Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH に、1995 年１月30日に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って寄託した。本発明の微生物は、バチルス属に属する好気性胞子形成性バクテリアである。形態学的には、0.8 〜1.0 ミクロンの直径と２〜５ミクロンの長さを有する運動性ロッドとして記載することができる。その胞子は、中心から背近くに胞子嚢をふくらませない円柱から楕円のものである。増殖のための最適温度は25〜35℃であり、そして増殖のための最適温度は25〜35℃であり、そして増殖のための最適 pHは、７〜9.5 の範囲内で、pH10では少しだけ増殖する。微生物の培養本発明の微生物は、他の本質的栄養素と一緒に、同化可能な炭素及び窒素を含む栄養培地であって、当該技術の原理に従って作られた培地中で、好気性条件下で培養することができる。適切な炭素源は、スクロース、グルコース及びスターチのような炭水化物又は穀物類、麦芽、コメ及びモロコシ類のような材料を含む炭水化物である。培地中に組み込まれる炭水化物濃度は、例えば25％の上限及び１〜５％の下限で広範囲で種々であり得るが、通常８〜10％が適していよう。ここでその割合（％）は、グルコースの当量として計算される。栄養培地中の窒素源は、無機及び／又は有機質のものであり得る。適切な無機窒素源は、硝酸塩及びアンモニウム塩である。有機窒素源のいくつかが、バクテリアの培養に関連する発酵過程に規則的に用いられる。具体的な例は、大豆ミール、綿の種子のミール、ピーナッツミール、カゼイン、コーン、コーンスチープ液、イースト抽出液、尿素、及びアルブミンである。更に、栄養培地は、通常の微量物質も含む。本発明の新規のバチルス種は、増殖のために、中性pH最適性を有する。それゆえ、培養は好ましくはpH７〜９において行われる。タンク発酵における培養のために、人工的なエレーションを用いることが必要である。エレーションの比率は、慣用的なタンク発酵に用いられるそれと同様である。発酵の後、液体酵素濃縮物は、ブイヨンからの粗材料の除去、又は必要に応じて例えば低温でのエバポレーション又は逆浸透によるブイヨンの濃縮により、作ることができる。固体酵素調製物は、Na₂SO₄のような塩又はエタノールもしくはアセトンのような水混和性溶媒での沈殿により、精製され及び／又は濃縮されたブイヨンから調製することができる。噴霧乾燥のような適切な乾燥方法によるブイヨン中の水の除去も用いることができる。蛋白質分解活性のためのアッセイ蛋白質分解活性は、基質としてカゼインを用いて測定される。１カゼインプロテアーゼ単位(CPU)は、標準条件、即ち25℃でpH9.5 で30分間のインキュベーション下で分当り（セリン標準との比較により測定される）第１アミノ基１mMを遊離する酵素の量として定義される。分析方法を記録するホルダーAF228 は、NOVO Nordisk A/S(Denmark)へ要求することにより利用できる。そのホルダーは引用により本明細書に組み込まれる。酵素本発明の酵素は、新規の界面活性プロテアーゼである。それは、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地中で、本発明の微生物、好ましくはバチルス種Ｉ612 ，DSM9701,又はその突然変異体もしくは変異体を培養することにより得られうる。本発明のプロテアーゼは、以下に記載される物理的−化学的特性を特徴とし得る。物理的−化学的特性 31KD の分子量がSDS-PAGEにより測定され得、約8.0 のpIが LKB A テアーゼ活性は、PMSF，α−１−アンチトリプシン、及びEDTAにより阻害される。大豆蛋白質インヒビターはプロテアーゼ活性に影響を与えない。本発明のプロテアーゼがPMSFとEDTAとの両方により阻害されるという見い出された結果は極めて驚くべきものであり、PMSFによる阻害は、そのプロテアーゼが、セリンプロテアーゼであるが、通常、セリンプロテアーゼはEDTAを許容し、そして更に本発明のプロテアーゼがEDTAにより阻害され、同時に実施例２に示されるように極めて優れた洗浄作用体であることは極めて異例である。温度活性関係を、基質としての１％のカゼイン及びpH9.5 において測定した。先に記載される蛋白質分解活性のためのアッセイをインキュベーション温度を10 〜70℃の間隔で変化させる改良を加えて用いた。結果を図１に示す。その酵素10℃未満から約40℃の温度で蛋白質分解活性を有し、約30℃に最適温度を有することが図１に示される。プロテアーゼは40℃において20％未満の活性を有することが図１から見ることができる。 pHへの活性の依存性を６〜11のpH範囲において予め決定されたpH値に調節された緩衝液を用いて同じ手順により決定した。結果を図２に示す。その酵素は、pH７〜pH9.5 の範囲内の最適pHで６未満から約10のpH値において蛋白質分解活性を有することがこの図から示される。本発明のプロテアーゼは、中程度のイオン強度及び中程度のpH並びに中程度〜低い洗浄温度で、界面活性剤における特別の能力を有する。免疫化学特性本発明のプロテアーゼは、バチルス種Ｉ612 ，DSM9701 の株由来のプロテアーゼのそれと同一又は部分的に同一（即ち少なくとも部分的に同一）の免疫化学特性を有する。種々のバチルスプロテアーゼについての免疫化学特性は、実際、極めて識別できる特徴であり：先に開示されるpH最適値、温度最適値、pI等はいくらか同じであるが、異なる免疫化学的特性は、種々の界面活性剤で極めて異なる安定性を生ずる。免疫化学特性は、交差反応同一性テストにより免疫学的に決定するこができる。同一性テストは、公知であるオクタロニ−二重免疫拡散法により、又はN．H． Axelsen（Handbook of Immunoprecipitaion-In Gel Techniques ；Blackwell Sc ientific Publications(1983)，Chapters５及び14）に従う双頭交差免疫電気泳動により行うことができる。“抗原同一性”及び“部分的抗原同一性”という用語は、同本chapter ５，19及び20に記載される。単一特異性抗血清を、本発明の精製されたプロテアーゼでウサギを免疫化することによって、先に言及される方法に従って作った。その免疫原をフロイントのアジュバントと混合し、毎２週ごとにウサギに皮下注入した。８週間の全免疫化期間の後、抗血清を得、それから、N．H．Axelsen（前掲）により記載されるようにイムノグロブリンを調製した。先に記載されるオクタロニ−二重免疫拡散テストを用いて本発明のプロテアーゼは、周知のセリンプロテアーゼ： −ALCALASE^TM（NOVO Nordisk A/Sから市販） −SAVINASE^TM（NOVO Nordisk A/Sから市販） −ESPERASE^TM（NOVO Nordisk A/Sから市販） −Subtilisin NOVO（NOVO Nordisk A/Sから市販）、 −KAZUSASE^TM（SHOWA DENKO から市販）、 −バチルスプロテアーゼ（WO 92/07067 に記載）、 −バチルスプロテアーゼ（WO 92/17576 に記載）、 −バチルスプロテアーゼ（WO 92/17577 に記載）、 −バチルスプロテアーゼ（WO 92/17578 に記載）、 −バチルスプロテアーゼ（WO 93/18140 に記載）、 −バチルスプロテアーゼ（WO 93/24623 に記載）、 −バチルスプロテアーゼ（WO 94/01532 に記載）、及び −バチルスプロテアーゼ（WO 95/07350 に記載）、と交差反応しなことを示した。種々のバチルスプロテアーゼは、多くのバラエティーのある種々の界面活性剤を許容し、そしてバチルスプロテアーゼ間を区別する今日の最も優れた方法の１つは免疫化学的同一性法である。界面活性組成物本発明によれば、本プロテアーゼは、典型的には、界面活性組成物、例えば皿洗い又は洗濯用界面活性組成物の構成物であり得る。これにより、それは非ダスト性粒子、安定化された液体、又は保護された酵素の形態で界面活性組成物中に含まれ得る。非ダスト性粒子は、例えばUS4,106,991 及び4,661,452(両方NOVO I ndustri A/S)に開示されるように製造することができ、そして必要に応じて当該技術で周知である方法により被覆することができる。ワックス様の被覆材料の例は、平均分子量1000〜20000 のポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50エチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール；そのアルコールが12〜20炭素原子を含み、15〜80エチレンオキシド単位を有するエトキシ化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ-、ジ-及びトリグリセリドである。流動床技術による適用に適したフィルム形成性被覆材料の例は、特許GB1483591 に供される。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、プロピレングリコールのようなポリオール、糖もしくは糖アルコール、乳酸又はホウ酸を加えることにより安定化され得る。他の酵素安定剤は当該技術で公知である。保護された酵素は、EP238,216 に開示される方法に従って調製することができる。本発明の界面活性組成物は、いずれかの慣用的形態において、例えば粉体、粒体、ペースト又は液体としてのものであり得る。液体界面活性剤は典型的には70 ％までの水及び０〜30％の有機溶媒を含む水性；又は非水性であり得る。界面活性組成物は、その各々がアニオン性、非イオン性、カチオン性、又は双性イオン性であり得る１以上の界面活性剤を含む。界面活性剤は、通常、直鎖アルキルベンゼンスルホネート(LAS)、α−オレフィンスルホネート(AOS)、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）（AS）、アルコールエトキシスルフェート(AEOS又はAES )、第２アルカンスルホネート(SAS)、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−もしくはアルケニルコハク酸、又はセッケンのような０〜50％のアニオン性界面活性剤を含むであろう。それは、（WO 92/06154 に記載されるような）アルコールエトキシレート（AEO 又はAE）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミン、脂肪酸モノエタノールアミド、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アシドのような０〜40％の非イオン性界面活性剤を含むことができる。本界面活性組成物は、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ及びオキシダーゼ、例えばラッカーゼのような１以上の他の酵素を更に含むことができる。本界面活性剤は、ゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリロトリ酢酸(NTA)、エチレンジアミンテトラ酢酸（EDT A）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTMPA)、アルキルもしくはアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は層状シリケート（例えばHoechst からのSKS-６）のような１〜65％の界面活性剤ビルダー又は錯体化剤を含むことができる。本界面活性剤はビルドされていない、即ち本質的に界面活性剤ビルダーを含まないものでもあり得る。本界面活性剤は１以上のポリューを含むことができる。その例は、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ポリ（ビニルピロリドン）(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ（ビニルアルコール）(PVA)、ポリアクリレートのようなポリカルボキシレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー並びにラウリルメタクリル酸／アクリル酸コポリマーを含むことができる。本界面活性剤は、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）又はノナノイロキシベンゼンスルホネート（NOBS）のような過酸形成性漂白アクティベーターと組み合わせることができるペルボレート又はペルカーボネートのようなH₂O 源を含むことができる漂白システムを含むことができる。あるいは、漂白システムは、例えばアミド、イミド、又はスルホンタイプのペルオキシ酸を含むことができる。本発明の界面活性組成物の酵素は、慣用的な安定剤、例えばプロピレングリコールもしくはグリセロールのようなポリオール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又は例えば芳香族ホウ酸エステルのようなホウ酸誘導体を用いて安定化することができ、その組成物は例えばWO 92/19709 及びWO 92/19708 に記載されるように製剤化することができる。本界面活性剤は、例えば布帛コンディショナー含有クレー、泡ブースター、泡抑制剤、防腐剤、汚れ懸濁剤、抗−汚れ−再貯蔵剤、染料、殺菌剤、光沢剤、又は香料のような他の慣用的な界面活性成分も含むことができる。（濃縮に用いる水溶液中で測定された）pHは、通常、中性又はアルカリ性、例えば７〜11の範囲であろう。本発明の範囲内の界面活性組成物の特定の形態は、以下のものを含む。１）次のものを含む少くとも600／ｌのかさ密度を有する粒体として製剤化された界面活性組成物２）次のものを含む少くとも600 ｇ／ｌのかさ密度を有する粒体として製剤化された界面活性組成物３）次のものを含む少くとも600 ｇ／ｌのかさ密度を有する粒体として製剤化された界面活性組成物４）次のものを含む少くとも600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒体として製剤化された界面活性組成物５）次のものを含む水溶液界面活性組成物６）次のものを含む水性構造の液体界面活性組成物７）次のものを含む少くとも600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒体として製剤化された界面活性組成物８）次のものを含む粒体として製剤化された界面活性組成物９）次のものを含む粒体として製剤化された界面活性組成物 10）次のものを含む水溶液界面活性組成物 11）次のものを含む水溶液界面活性剤 12）次のものを含む少くとも600 ｇ／ｌのかさ密度を有する粒体として製剤化された界面活性組成物 13）直鎖アルキルベンゼンスルホネートの全部又は一部が（Ｃ₁₂ _〜Ｃ₁₈）アルキルスルフェートにより置換されている１）〜12）に記載される界面活性製剤 14）次のものを含む少くとも600 ｇ／ｌのかさ密度を有する粒体として製剤化された界面活性組成物 15）次のものを含む少くとも600 ｇ／ｌのかさ密度を有する粒体として製剤化された界面活性組成物 16）付加的な構成物又は既に特定された漂白システムのための基質のいずれかとして安定化又は被包された過酸を含む１）〜15）に記載の界面活性製剤。 17）過ホウ酸塩が過炭酸塩により置換されている１）、３）、７）、９）及び 12）に記載の界面活性組成物。 18）マンガン触媒を更に含む１）、３）、７）、９）、12）、14）及び15）に記載の界面活性組成物。マンガン触媒は、例えば“Efficient manganese cataly sts for Low-temperature bleaching ”（Nature 369，1994，637 〜639 頁）に記載される化合物の１つであり得る。 19）例えば直鎖アルコキシ化第１アルコール、ビルダーシステム（例えばホスフェート）、酵素及びアルカリのような液体非イオン性界面活性剤を含む非水性界面活性剤液として製剤化された界面活性組成物。本発明のプロテアーゼは、界面活性剤中に慣用的に用いられる濃度で組み込むことができる。本発明の界面活性組成物において、プロテアーゼは洗浄液のリッター当り0.00001 〜１mgのプロテアーゼ（純粋な酵素蛋白質として計算）に相当する量で添加することができる。本発明は、以下の実施例において更に詳説され、それは請求される本発明の範囲を限定するいずれの手段となることも意図しない。実施例１バチルス種Ｉ612 ，DSM 9701を、次の組成（リッター当り）：の培地100 mlを含む500 mlじゃま板エーレンマイヤーフラスコ中で、ロータリー振とうテーブル（300 rpm）上で30℃で培養した。培地中のスターチにα−アミラーゼを溶かし、その培地を45分間、120 ℃に加熱することにより滅菌する。滅菌後、培地のpHを、重炭酸ナトリウムの１Ｍ溶液10mlを加えることにより9. 0 に調節する。培養（３日間）の後、そしてその固体材料を分離した後、慣用的なクロマトグラフィー法によりプロテアーゼを精製した。培養ブイヨン2.5 ｌからの収量は45CPU/ｌで50mlであった。SDS- PAGEにより判断して純度は90％超であった。本実施例に従って調製された調製物の特徴は、本明細書で早期と言及され、ここに引用される。実施例２バチルス種Ｉ612 プロテアーゼの（25℃における）洗浄性能 10分間、25℃で一定温度でモデル洗浄システムにおいて草の汁で汚した綿で、洗浄能力テストを行った。１，２，7.5 ，20，及び50mMのプロテアーゼ濃度においてテストを行った。テストに2.0 ｇ／ｌのアメリカンタイプ粉体界面活性組成物を用いた。その界面活性剤には、本発明のプロテアーゼを加える前にはいずれの酵素も含んでいない。その界面活性剤を約６°dH(German Hardness)の水中に溶かした。洗浄液のp Hは10であった。繊維／洗浄液比率は洗浄液のリッター当り約５ｇの繊維であった。各々の酵素濃度のために、２つの独立したテストを行った。布帛洗浄の後、その布を20分間、水直水を流して洗い、次に空気乾燥した。本発明のプロテアーゼ及びSavinase^TMの能力を、Datacolor Elrephometer 2000 で測定した460 nmにおける緩和度（％Ｒ）の変化（ΔＲ）により評価した。ここで ΔＲはプロテアーゼを加えたものでの洗浄の後の緩和からプロテアーゼを加えていないものでの洗浄の後の緩和を引いたものである。これらのテストの結果を次の表１に示す（２つのテストの平均）。 ΔＲ（バチルス種Ｉ612 ）は全ての測定したプロテアーゼ濃度において、ΔＲ（Savinase^TM）より高い、即ち本発明のプロテアーゼは全ての測定された濃度においてより優れた洗浄性能を有することを表１から見ることができる。実施例３バチルス種Ｉ612 プロテアーゼの（15℃における）洗浄能力 10分間、15℃で一定温度で、モル洗浄システムにおいて、草の汁で汚した綿で洗浄能力テストを行った。２，7.5 ，20、及び50mMのプロテアーゼ濃度でテストを行った。次の組成：直鎖アルキルベンゼンスルホネート 0.3 ｇ／ｌアルコールエトキシレート 0.04 ｇ／ｌセッケン 0.1 ｇ／ｌ Na₂SO₄ 0.3 ｇ／ｌ Na₂CO₃ 0.4 ｇ／ｌゼオライト 0.6 ｇ／ｌクエン酸 0.08 ｇ／ｌカルボキシメルセルロース 0.006 ｇ／ｌポリカルボキシレート 0.083 ｇ／ｌを有する2.0 ｇ／ｌの界面活性剤をテストに用いた。その界面活性剤を約６°dH (German Hardness)の水に溶かした。洗浄液のpHをpH 10に調節した。繊維／洗浄液比率は、洗浄液のリッター当り約５ｇの繊維であった。各々の酵素濃度について２つの独立したテストを行った。布帛洗浄の次に、その布を20分間、水直水を流して洗い、次に空気乾燥した。本発明のプロテアーゼ及びSavinase^TMの能力を、Data color Elrephometer 2000 で測定した460 nmにおける緩和度（％Ｒ）の変化（OR）により評価した。ここで ΔＲは、プロテアーゼを加えたものでの洗浄後の緩和度からプロテアーゼを加えなかったものでの洗浄後の緩和度を引いたものである。これらのテストの結果を次の表２に示す（２つのテストの平均）。 ΔＲ（バチルス種Ｉ612 ）は、全ての測定されたプロテアーゼ濃度においてΔ Ｒ（Savinase^TM）より高い、即ち本発明のプロテアーゼは、15℃において、全ての測定された濃度においてより優れた洗浄能力を有することが表２から見ることができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年２月６日【補正内容】請求の範囲１．バチルス種（Bacillus sp.）Ｉ612 ，DSM9701 株由来のプロテアーゼの免疫化学特性と同一又は部分的に同一の免疫化学特性を有することを特徴とし、（ａ）31kDの見掛け分子量；（ｂ）約8.0のpl；（ｃ）（25℃で及び基質としてカゼインを用いての） pH ７〜pH9.5 の範囲の至適pH；（ｄ）（pH9.5 で及び基質としてカゼインを用いての）約30℃における至適温度及び40℃における20％活性（ｅ）PMSF及びEDTAにより阻害されることを更に特徴とするプロテアーゼ。２．バチルス種Ｉ612 ，DSM9701 株から得られうることを特徴とする請求項１に記載のプロテアーゼ。３．バチルス種Ｉ612 ，DSM9701 株により表されるバチルス種の株の単離された生物学的に純粋な培養物。４．請求項１又は２のいずれかに記載のプロテアーゼを調製するための方法であって、該方法が、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地中で請求項３に記載のバチルス種のプロテアーゼ産生株を培養し、次に要求される酵素を回収することを含むことを特徴とする方法。５．バチルス種Ｉ612 ，DSM9701 又は請求項１に記載のプロテアーゼをコードする遺伝子を有する他の宿主生物が培養されることを特徴とする請求項４に記載の方法。６．界面活性酵素としての請求項１又は２のいずれかに記載のプロテアーゼの使用。７．請求項１又は２のいずれかに記載のプロテアーゼを含む界面活性組成物。８．１以上の他の酵素、特にアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、及びオキシダーゼを更に含むことを特徴とする請求項７に記載の界面活性組成物。９．非ダスト性粒状体、液体、特に安定化液、スラリー、又は保護された酵素の形態で供されることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載のプロテアーゼを含む界面活性添加物。 10．請求項１又は２のいずれかに記載のプロテアーゼを添加することを含むことを特徴とする洗浄方法。 11．請求項７又は８のいずれかに記載の界面活性組成物を添加することを含むことを特徴とする請求項10に記載の洗浄方法。 12．請求項９に記載の界面活性添加物を添加することを含むことを特徴とする請求項10に記載の洗浄方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．バチルス種（Bacillus sp.）Ｉ612 ，DSM9701 株由来のプロテアーゼの免疫化学特性と同一又は部分的に同一の免疫化学特性を有することを特徴とするプロテアーゼ。２．（ａ）31kDの見掛け分子量；（ｂ）約8.0 のpI；（ｃ）（25℃で及び基質としてカゼインを用いての） pH 7〜pH9.5 の範囲の至適pH；（ｄ）（pH9.5 で及び基質としてカゼインを用いての）約30℃における至適温度及び40℃における20％活性（ｅ）PMSF及びEDTAにより阻害されることを更に特徴とする請求項１に記載のプロテアーゼ。３．前記プロテアーゼが、バチルス種Ｉ612 株により表されるバチルス種の株から得られうるか、又はバチルス種Ｉ612 ，DSM9701株由来のプロテアーゼの免疫化学特性と同一又は部分的に同一な免疫化学特性を有するプロテアーゼをコードする遺伝子を有する他の宿主生物から得られうることを特徴とする請求項１又は２に記載のプロテアーゼ。４．バチルス種Ｉ612 ，DSM9701 株、又はその突然変異体もしくは変異体から得られうることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のプロテアーゼ。５．バチルス種Ｉ612 ，DSM9701 株により表されるバチルス種の株の単離された生物学的に純粋な培養物。６．前記株がバチルス種Ｉ612 ，DSM9701 株、又はその突然変異体もしくは変異体であることを特徴とする請求項５に記載の培養物。７．請求項１〜４のいずれかに記載のプロテアーゼを調製するための方法であって、該方法が、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地中で請求項５又は６のいずれかに記載のバチルス種のプロテアーゼ産生株を培養し、次に要求される酵素を回収することを含むことを特徴とする方法。８．バチルス種Ｉ612 ，DSM9701 又はその突然変異体もしくは変異体、又はバチルス種Ｉ612 由来のプロテアーゼの免疫化学特性と同一もしくは部分的に同一な免疫化学特性を有するプロテアーゼをコードする遺伝子を有する他の宿主生物が培養されることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．界面活性酵素としての請求項１〜４のいずれかに記載のプロテアーゼの使用。 10．請求項１〜４のいずれかに記載のプロテアーゼを含む界面活性組成物。 11．１以上の他の酵素、特にアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、及びオキシダーゼを更に含むことを特徴とする請求項10に記載の界面活性組成物。 12．非ダスト性粒状体、液体、特に安定化液、スラリー、又は保護された酵素の形態で供されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のプロテアーゼを含む界面活性添加物。 13．請求項１〜４のいずれかに記載のプロテアーゼを添加することを含むことを特徴とする洗浄方法。 14．請求項10又は11のいずれかに記載の界面活性組成物を添加することを含むことを特徴とする請求項13に記載の洗浄方法。 15．請求項12に記載の界面活性添加物を添加することを含むことを特徴とする請求項13に記載の洗浄方法。