JPH11500306A

JPH11500306A - バイナリーｂａｃベクター

Info

Publication number: JPH11500306A
Application number: JP8521711A
Authority: JP
Inventors: ハミルトン，キャロル・エム
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1995-01-13
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 1999-01-12
Also published as: DE69632576D1; EP0805851A4; EP0805851A1; EP0805851B1; US5733744A; DE69632576T2; ATE267871T1; WO1996021725A1; US5977439A

Abstract

(57)【要約】本発明は、異型ＤＮＡを植物細胞中に伝達するためのベクターに関する。このベクターは、大きいＤＮＡ挿入体でのゲノム・ライブラリーの構築のために修飾された細菌性人工染色体（ＢＡＣ）およびＡgrobacteriumによる植物形質転換のために修飾されたバイナリー（ＢＩＮ）ベクターに基づいている。本発明のＢＩＢＡＣベクターは、大きいＤＮＡ挿入体での植物ゲノム・ライブラリーの構築を可能にし、これはＡgrobacteriumによる形質転換により直接に導入され得る。

Description

【発明の詳細な説明】バイナリーＢＡＣベクター本出願の主題は米国政府の支持でなされた（米国科学財団植物科学センタ許可番号１７５−８３００−６５５０−３６１）。発明の分野本発明は、植物形質転換のためのベクター、特にバイナリーＢＡＣベクターおよび該ベクターの使用に関する。発明の背景本出願を通じて、様々の公表文献が関係し、その多くはカッコで示す。これらの文献は、詳細な説明の最後に完全引用として挙げる。これらの文献は全体として参照により本出願に合体される。植物分子生物学者および植物栽培家が今日直面している主要問題は、表現型によってのみ知られている農業的に重要な遺伝子をいかに固定するかである。表現型を調べることによりマップ・ベース・クローニングおよびトランスポゾン・ターゲティングが植物遺伝子クローンの同定を可能にはしているが、それは技術的に難しくそして手間のかかる方法である。今日までこのタイプの、僅かに少数の主な植物遺伝子がクローン化されているだけである(Martin et al.1993,Bent et al.1994,Jones et al.1994,Whitham et al.1994)。植物栽培家は、古典的な繁殖方法についての遺伝的変化に頼っている。最も効果的であるには、現在の植物栽培家は農業に重要な遺伝子の分子生物学を知る必要がある。望ましい特質をコードする遺伝子をクローン化すると、ある場合には、古典的な繁殖方法を回避して、直接に植物形質転換によりその特質を導入することが現在は可能である。将来には、古典的な植物繁殖法では達成することのできない品種、交叉適合のない品種から望ましい特質を導入できることが可能ですらある。農業的に重要な遺伝子のクローニングは植物学に新しい研究分野も開くであろう。マップ・ベース・クローニングの考えが最初に想定されたときに、興味ある領域における重複遺伝子クローンを連結する染色体ウォークが必然的であると考えられた。農作植物は、比較的大きいゲノムおよび高程度の反復ＤＮＡを有する傾向にあり、染色体ウォークをより長たらしくそして複雑なものにする特徴がある。幸いなことに、最近の手法の開発は、遺伝子に密接に結合した分子マーカーを同定することを可能にし、染色体ランディグの考えに導いている。染色体ランディングは、望む遺伝子に密接に結合したマーカーを取得するのが、あまり特徴が分かっていないゲノムにおいてさえも、困難でないとの事実に基づいている。ＲＡＰＤ（ランダム増幅多形ＤＮＡ）およびＡＦＬＰ（増幅フラグメント長さ、多形性）法を近同等ラインまたはバルク分離体の解析と併用して、望む遺伝子に非常に密接した分子マーカーを同定するのに用いることができる(W illiams et al.1990,Zabeau and Vos 1992,Martin et al.1991,Michelmore et a l.1991)。ゲノム・ライブラリーは、ポテンシャル・クローンを同定するために遺伝子の両側に位置するマーカーを用いてスクリーニングすることができる。現在、マップ・ベース・クローニングを大規模に利用するのに残っていた最も大きい障壁は、ポテンシャル・クローンが望む遺伝子を実際に所持しているかをいかに確かめるかである。今までのところ、その試みは、望む遺伝子を含有すると確信される一連のイースト人工染色体のサブクローン(ＹＡＣ)(Burke et al.1 987)を生成して、なされている。これらのサブクローンの各々は、期待する表現型の遺伝子転換植物を検定することにより遺伝子の存在（または不存在）を同定するために、個々に植物中に形質転換しなければならない。これは、非常に時間を費やすのみでなく、いかなるサブクローンもターゲット遺伝子の一部しか含有していなくて、形質転換／相補性実験において負の結果をもたらすことがあるので、危険性がある。もし、ターゲット遺伝子が多数のイントロンを含有し、ゲノムＤＮＡの大きいセグメント上に伸張していると、サブクローンのいずれも全遺伝子を含有するのに充分な大きさでなくなる。最も必要なのは、遺伝子確認のこの隘路を回避する技術である。大きいＤＮＡ構築物を植物に導入する能力は、植物形質転換を進める前に高分子量ＹＡＣまたはＢＡＣライブラリー・ベクターから得られるサブクローニングの量を低下せしめる。直接的に植物を形質転換するのに用いることができる高分子量ライブラリー・ベクターが理想的ではある。実際、高分子量ＤＮＡでもって植物を形質転換する技術の開発が、農業上重要な遺伝子の主要部分をつくりあげるＱＴＬｓ（定量的特質位置）のクローニングに必須であろう。高分子量ゲノム・ライブラリーについて存在するベクターのいずれもが植物の形質転換に適していない。Ａgrobacteriumによる植物形質転換に適した一連のコスミド・ライブラリー・ベクター（最大挿入サイズ４６ｋｂ）がＭa et al.(199 2)により構築された。しかし、小さい挿入サイズでは、Ａrabidopsisよりかなり大きいゲノムについては実用性がほとんどない。Ａrabidopsisは、そのゲノムの大きさが約１００メガ塩基対（Ｍｂｐ）と小さいが、他のより大きい植物は４− ２０−foldより大きいゲノムを有している(Bennett and Smith 1976)。最初の高分子量植物ゲノム・ライブラリーはＹＡＣベクターにおいて構築された。トマトからのＰｔｏ病抵抗遺伝子(Martin et al.1992)およびＡrabidopsisからのＲＰＳ２病抵抗遺伝子(Bent et al.1994)がＹＡＣライブラリーからクローンされている。しかし、ＹＡＣライブラリーは、構築し、保持し、そして利用するための主な出資であり、いくつかのＹＡＣライブラリーは、欠失、再構成およびキメラに苦しめられている(van Wordragen and Dons 1992)Hiei et al.1994)。最近、ＢＡＣライブラリーが約１８０ｋｂの平均挿入サイズでもってモロコシ (Woo et al.1994)およびコメ(Wang and Ronald 1994)について構築された。ＢＡＣライブラリーはＹＡＣライブラリーよりも構築、スクリーンおよび維持しやすいことが判明した。Ａgrobacterium tumefaciensは天然に生じる植物形質転換系である（Ｋado 19 91およびＺambryski 1988による総説を参照）。最近、Ｍiranda et al.は、少なくとも１７０ｋｂがＡgrobacteriumのＴｉプラスミドから植物ゲノムへ導入できたことを明らかにした(Miranda et al.1992)。高分子量でのＡgrobacteriumによる植物の形質転換についての最も劇的なポテンシャルは、Ａ.tumefaciensがＴ− ＤＮＡを植物ゲノムに線様式で伝達することが示されたことである。もし形質転換植物が植物ゲノムにおいて全ゲノム・ライブラリー挿入（無傷）を所有して生じるならば、非常な利点であろう。線式伝達が挿入の限界を除き先端切断遺伝子の可能性をなくし、非常に大きい遺伝子（もし存在するなら）または遺伝子クラスターを導入することを可能にするであろう。Ａgrobacteriumによる植物形質転換は、植物細胞に新しい遺伝子情報を導入するために最も広く用いられている技術である。Ａgrobacteriumによる形質転換は、タバコ、ペチュニアおよびトマトなどの品種において日常的に利用可能であり、相当の努力が、この技術を主な農作物（van ＷordragenおよびＤons 1992による総説）および単子葉植物に適用するのに、なされて来た。最近、コメのＡgrob acteriumによる形質転換が報告されている(Hiei et al.1994)。しかし、高分子量のＤＮＡ配列で植物を形質転換するためのベクターについては、なお必要性が継続している。発明の要旨本発明によりＡgrobacteriumによる植物形質転換のために設計された新しいＢＡＣライブラリー・ベクターを構築して、上記の必要性が充足される。各ＢＩＢＡＣライブラリー・クローンはＥscherichia coli中のプラスミドとして存在するので個々のクローンのＤＮＡは標準的プラスミド分離技術によって容易に分離することができる。このプラスミドＤＮＡは電気穿孔によってＡgrobacterium中に導入され得る。別法では、ＢＩＢＡＣライブラリークローンは、三親型交配によってＥ.coli宿主からＡgrobacteriumに伝達され得る。本発明は、異型ＤＮＡを植物細胞中に伝達するためのベクターを提供する。該ベクターは、Ｅscherichia coli宿主細胞における単一コピーとしての異型ＤＮＡを保持し得る複製の第１起源およびＡgrobacterium tumefaciens宿主細胞における単一コピーとしての異型ＤＮＡを保持し得る複製の第２起源を有する骨格を含んでいる。さらに該ベクターは、異型ＤＮＡの挿入のための唯一の複製エンドヌクレアーゼ***部位および唯一の複製エンドヌクレアーゼ***部位を両側からはさむ左・右ＡgrobacteriumＴ−ＤＮＡ境界配列を含む。Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、左および右のＴ−ＤＮＡ境界配列の間に位置する異型ＤＮＡを植物細胞に導入することを可能にする。該ベクターは、大きいＤＮＡ挿入の植物ゲノム・ライブラリーの構築を可能にする。個々のクローンは形質転換により植物に直接に導入され得る。図面の簡単な説明上記および他の本発明の特徴および利点は、添付の図面と共に下記の望ましい実施態様の詳細な説明により明らかになるであろう。図１はＢＩＢＡＣベクターのマップを表し、図２はＢＩＢＡＣベクターの構築についての方策を表わす。詳細な説明ＢＩＢＡＣと名付けられたベクターは、ＤＨ１０Ｂ（ｐＣＨ２３）なるＥsche richia coli株中のｐＣＨ２３なるプラスミドとして寄託された。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に従い、その必要条件充足すべく、Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection（ＡＴＣＣ），１２３０１Ｐarklawn Ｄrive，Ｒockville，Ｍaryland 20852にＡＴＣＣ受付番号６９７４３としてなされた。本発明は、異型ＤＮＡを植物細胞中に伝達するためのベクターに関する。該ベクターは複製の２起源を有する骨格を含有している。複製の第１起源は、Ｅsher ichia coli宿主細胞において単一コピーとして異型ＤＮＡを保持し得る。この出願を通じての使用において、他に明示しない限り、単一コピーとしての保持は、非複製細胞、すなわち細胞***を受けない細胞を意味する。細胞***中に、細胞毎のコピーは細胞毎にほぼ２完全コピーに増加する。複製の第２起源は、Ａgrob acterium tumefaciens宿主細胞において単一コピーとして異型ＤＮＡを保持し得る。該ベクターはまた、異型ＤＮＡの挿入のための唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂を有している。ベクターをコードするＤＮＡ配列中における特定の制限エンドヌクレアーゼのためのただ一つの解裂部位の存在は、“唯一の”制限エンドヌクレアーゼ解裂部位である。従って、この特定の制限エンドヌクレアーゼは、一つの場所すなわち“唯一の”部位においてのみＤＮＡを解裂する。異型ＤＮＡは、ベクターによって形質転換された特定の宿主細胞に通常は存在しないＤＮＡを意味する。該ベクターはまた、“唯一の”制限エンドヌクレアーゼ解裂部位を両側からはさむ左・右ＡgrobacteriumＴ−ＤＮＡ境界配列を含有する（Peralta and Ream 1 985）。これらの境界配列は、左および右Ｔ−ＤＮＡ境界配列の間に位置する異型ＤＮＡの植物細胞への導入を可能にする。Ｅsherichia coliおよびＡgrobacterium tumefaciensにおける高分子量ＤＮＡの安定な保持は、これらの高分子量ＤＮＡ配列が単一コピー・プラスミド上にあることから、可能である。これらの大きいＤＮＡ挿入の多数のコピーがあれば、宿主細胞が不安定となり植物形質転換に利用できなくなるであろう。本発明のベクター、すなわちＢＩＢＡＣベクターについての一つの実施態様において、唯一の制限エンドヌクレオターゼ解裂部位は、ＢａｍＨＩ解裂部位である。この解裂部位は、Ａgrobacterium tumefaciensＴ−ＤＮＡ境界配列間に存在し、異型ＤＮＡをベクター（ｓａｃＢ遺伝子）に合体さすための選択マーカーである。ＢａｍＨＩ解裂部位およびｓａｃＢ遺伝子は、異型ＤＮＡがＢａｍＨＩに挿入されたときにｓａｃＢ遺伝子が不活性化されるように、位置している。ＢＩＢＡＣベクターは、Ｅsherichia coli中の単一コピーとして異型ＤＮＡを保持するためにＡgrobacterium tumefaciensからの複製のＴ−起源およびＥsherichia coli中の単一コピーとして異型ＤＮＡを保持するためにＡgrobacterium tumefac iensからの複製Ｒi起源を含んでいる（Low 1972）。ＢＩＢＡＣベクターにおける左および右のＴ−ＤＮＡ境界配列は、オクトピン・プラスミドｐＴｉＡ６のＴＬ−ＤＮＡから誘導される。ＢＩＢＡＣベクターはまた、異型ＤＮＡの細菌細胞Ｅsherichia coliおよびＡ grobacterium tumefaciensへの導入のための選択マーカーを含んでいる。細菌選択マーカーはカナマイシン耐性遺伝子からなる。ＢＩＢＡＣベクターはまた、異型ＤＮＡの植物細胞への導入のための選択マーカーを含む。この選択マーカーは左および右Ｔ−ＤＮＡ境界配列の間に存在しなければならない。何故なら、境界配列によって囲まれている領域のみが植物宿主細胞に伝達されからである。従って、植物選択マーカーは、植物細胞への伝達するためのＴ−ＤＮＡ境界の間に存在しなければならない。ＢＩＢＡＣベクターにおいて、植物選択マーカーはカナマイシン耐性である（ＧＵＳ−ＮＰＴＩＩ構築により提供される）。他の適当な植物耐性マーカーに、ヒグロマイシン耐性（ＨＹＧ構築）およびホスフィノチリシン耐性（ＢＡＲ−ＧＵＳ構築）がある。ＢＩＢＡＣベクターはまた、接合伝達の起源（プラスミドＲＫ２からのｏｒｉＴ起源）を含む。この起源は、細菌接合によって直接的にＥsherichia coli宿主細胞からＡgrobacterium tumefaciens宿主細胞への異型ＤＮＡの伝達を可能にする。該ベクターは異型ＤＮＡを宿主細胞に導入するのに用いられる。従って、該ベクターはさらに、唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位に挿入された異型ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、当業者に既知の標準的クローニング手法を用いて、ベクター中に挿入される。これは一般的に、Maniatis et al.,Molebular Cloning:A La boratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N ew York(1982)に記載されているように、制限酵素（ＢＩＢＡＣ，ＢａｍＨＩの場合）およびＤＮＡリガーゼを使用することを含む。従って、ベクターはＥsher ichia coli、Ａgrobacterium tumefaciens及び／または植物細胞などの宿主細胞を形質転換するために用いられ得る。本発明のベクターにはいくつもの用途がある。一つは、ライブラリー・ベクターとしての使用である。植物からのゲノムＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ（ＢＩＢＡＣベクターの場合ＢａｍＨＩ）で切断される。植物の全ゲノムを集合的に表す制限フラグメントは、ＢＩＢＡＣベクター（ＢａｍＨＩによる切断で開かれている）中に各々リゲートされる。これは、ＢＩＢＡＣベクターにおけるライブラリーを生成する（一般的に、Current Protocols in Molecular Cloning,Ausub el,F.M.et al.,eds.,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(198 9)参照）。ライブラリーで扱いやすくするために、ベクターは一般的に細菌宿主細胞に保持される。Ｅsherichia coliがこのようなライブラリーの保持について標準的細菌宿主細胞である。ベクターＤＮＡは様々な既知技術によって細菌宿主細胞に導入し得る。それには、電気穿孔、塩化カルシウム形質転換および粒子衝撃形質転換などがある。形質転換された細菌細胞は、種々の選択的薬剤に対する生長能力によって同定される。従って、ベクターを含む細菌細胞は、そのカナマイシン耐性によって同定し得る。挿入された異型ＤＮＡの存在は、高レベルのスクロースに対する細菌の生長能力によって判明する。高レベルのスクロースに対する生長能力は、他の選択マーカー、ｓａｃＢ遺伝子の不活性化による。望む異型ＤＮＡを含有するポテンシャル・クローンは、プローブとして、密接に接合した分子マーカーまたは異型ＤＮＡを用いて、サーザン分析（Southern 1975）によって同定される。望むクローン（異型ＤＮＡ含有ベクター）は次の実験に用いられる。該ベクター、すなわち望む誘導クローンは、Ａgrobacterium tumefaciens中に導入され得る。この導入は、電気穿孔あるいは粒子衝撃を含む既知技術を用いて、行われる。ベクターをＡgrobacterium tumefaciens中に導入するために用いられる他の方法は、三親型交配である。三親型交配において、ベクター含有Ｅscherichia col i、ヘルパー・プラスミド含有の第２Ｅscherichia coliおよびＡgrobacteriumが結合されて、ＡgrobacteriumにベクターＤＮＡの導入が起きる。Ａgrobacterium は、ベクターＤＮＡの存在を調べるために選択マーカー（ＢＩＢＡＣベクター中のカナマイシン耐性など）を用いて、スクリーリングする。ベクターＤＮＡを含有するこれらの細胞は次の実験に用いる。該ベクター、すなわち望む誘導クローンは、植物細胞中に導入され得る。（一般的にPlant Molecular Biology Manual,2nd Edition,Gelvin,S.B.and Schilper oort,R.A.,Eds.,Kluwer Academic Press,Dordrecht,Netherlands(1994)）。ベクターまたはクローンの植物細胞中への導入についての一つの方法は、植物細胞のＡgrobacteriumによる形質転換（安定または暫定的）である。簡単には、植物の組織をベクター（その中に異型ＤＮＡ）で形質転換されたＡgrobacterium の接種材料と接触せしめる。一般的に、この方法は、細菌の懸濁液を植物組織に接種し、抗生物質のない再生培地で４８−７２時間、２５−２８℃で組織をインキュベートすることを含む。実際には、Ａgrobacterium tumefaciensによる形質転換方法は３工程を含む。最初にベクターＤＮＡがＥscherichia coli宿主細胞中で分析され、次いでＡgro bacterium宿主細胞中に導入され、これは植物細胞へのベクター中のＴ−ＤＮＡのＡgrobacteriumによる伝達に用いられる。一般的に、Ｔ−ＤＮＡ境界配列およびその間に存在するＤＮＡの部分のみが、かかるＡgrobacteriumによる伝達によって、植物細胞中に伝達される。従って、植物細胞への伝達のための異型ＤＮＡはすべて、Ｔ−ＤＮＡ境界配列間のベクター中に存在しなければならない。Ｔ−ＤＮＡ伝達の一つの標準的方法は、バイナリー・システムである。バイナリー・ベクターは、除去および統合に必要であり、境界間に挿入された異型ＤＮＡを有するＴ−ＤＮＡ境界を含む。Ｔiプラスミドの必須vir遺伝子はトランスで作用し、ヘルパー・プラスミドと呼ばれる分離プラスミド上に供給される。葉ディスク技法がＡgrobacteriumによる形質転換の接合に用いられる。簡単には、傷つけた植物細胞（葉、根、茎など）をＡgrobacterium細胞と共に培養して、Ａgrobacteriumから植物細胞へのＴ−ＤＮＡの伝達を起こさせる。数日後、植物組織を選択剤の含有のシュート−誘発培地に移す。Ｇｕｓ−ＮＰＴＩＩ植物選択マーカーを含有するＢＩＢＡＣベクターの場合、カナマイシン含有の培地が用いられ得る。シュートが形成された後、根の形成を促進する培地にシュートを移す。ベクターまたはクローンを植物細胞に導入する他の方法は、粒子衝撃によるなどの植物細胞核の形質転換による。ベクターまたはクローンを植物細胞に導入する他の方法は、植物細胞原形質（安定または暫定的）の形質転換による。植物原形質は、プラスマ膜によってのみ囲まれており、従って、異型ＤＮＡのようなマクロ分子を取り込む。これらの工学操作された原形質は、すべての植物を再生することができる。異型ＤＮＡの植物細胞への導入についての適当な方法には、電気穿孔およびＰＥＧ形質転換などがある。ベクターまたはクローンを植物細胞に導入する追加の他の方法は、粒子衝撃などの植物機能質（葉線体、またはミトコンドリア）の形質転換による。ベクターは植物機能質においては複製しないが、異型ＤＮＡは組換えによりゲノム中に合体され得る。本願を通じて適用されるように、電気穿孔は、形質転換の方法であって、その中において、一般的に高濃度のベクターＤＮＡ（異型ＤＮＡを含有）が宿主細胞の原形質または細菌細胞のサスペンションに加えられて、混合物に２００−６００Ｖ／ｃｍの電気場で衝撃が与えられる。電気穿孔に続いて形質転換細胞は、選択剤を含有する適当な培地に対する生長によって同定される。本願を通じて適用されるように、粒子衝撃（生体分解形質転換としても知られる）はいくつかの方法の一つで遂行される。最初の方法は、細胞における促進不活性または生物的活性粒子を含む。この技術は、すべてがＳanford et al.である米国特許第４,９４５,０５０および第５,１００,７９２に開示されている。これらを参照としてここに合体する。一般に、この方法は細胞における促進不活性または生物的活性粒子を、細胞の外表面に浸透し、その内部に合体するのに効果的な条件で、含む。不活性粒子が用いられるときは、ベクターは異型ＤＮＡ含有のベクターで粒子をコートすることにより細胞中に導入される。別法として、ターゲット細胞が粒子の動きにより細胞中にベクターが運ばれるように、ベクターによって囲まれ得る。生物的に活性な粒子（例えば、ベクターおよび異型ＤＮＡを含有する乾燥細菌細胞）も植物細胞中に動かされ得る。このように、本発明のベクターは種々の方法で様々な宿主細胞を形質転換するのに用いることができる。特に、望む遺伝子生産物をコードする異型ＤＮＡはＢＩＢＡＣベクターの唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位に挿入され得る。ベクターは、異型ＤＮＡを含有し、Ａgrobacterium tumefaciensを形質転換するのに、および／またはＥscherichia coliを形質転換するのに用いられる。それからＡgrobacterium tumefaciensは植物細胞を形質転換するのに用いられる。植物細胞への異型ＤＮＡの導入は、異型ＤＮＡによりコードされた遺伝子産生物の製造をＤＮＡが植物細胞中で発現したときに、可能にする。別法として、望む遺伝子産生物は、ＢＩＢＡＣベクター（唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位に挿入された遺伝子産生物をコードする異型ＤＮＡを有する）で直接、植物細胞を形質転換することにより、biolistic形質転換などにより、植物細胞に製造される。この方法はまた、異型ＤＮＡを植物細胞に導入することができ、ＤＮＡが植物細胞中で発現したときに、異型ＤＮＡによりコードされた遺伝子産生物の製造をもたらす。これらの方法を考慮すると、ベクターは植物遺伝子をその表現型によってクローン化するのに用いることができる。例えば、特定の植物はウイルスに感受性であることが見出されており、ウイルス抵抗性をコードする遺伝子は存在すると考えられる。ゲノム・ライブラリーはＢＩＢＡＣベクターにおいてつくられ、およびウイルス抵抗性遺伝子を潜在的にコードするＤＮＡのセグメントを含有するベクターが植物を形質転換するのに用いられる。次いで、形質転換された植物はウイルスに暴露される。植物のウイルス感染の特徴的な表現型特性を欠くことは、特定の異型ＤＮＡのＢＩＢＡＣベクターへの挿入によってウイルス抵抗性遺伝子が植物中に伝達されたことを示す。従って、ウイルス抵抗性遺伝子をコードする配列は、クローニング遺伝子のＢＩＢＡＣベクターの表現型を用いて、同定することができる。本出願を通して用いられるように、形質転換には暫定的または安定な形質転換のいずれもが含まれる。暫定的形質転換においては、異型ＤＮＡは、宿主細胞のＤＮＡ中に合体（安定な形質転換としての合体）されることなしに、宿主細胞に導入される。植物形質転換において、ＤＮＡは、暫定的に植物細胞中に導入することができるし、また安定的にも導入（すなわち、核ゲノム、原形質ゲノムまたはミトコンドリア・ゲノム中に合体）される。Ａgrobacteriumによる植物形質転換の場合、異型ＤＮＡは、暫定的に植物細胞中に導入されるか、または安定的に植物の核ゲノム中に導入（すなわち合体）される。Ａgrobacteriumによる植物形質転換は、植物の原形質またはミトコンドリア・ゲノム中に異型ＤＮＡを安定的に導入しない。ここで用いた形質転換は、特定のベクター／宿主組合せに利用されうるすべてのタイプの形質転換を含んでいる。実施例１ＢＩＢＡＣの構築ＢＩＢＡＣのライブラリー特徴はＳhizuya et al.(1992)に記載された細菌人工染色体クローニングシステムに基づいている。さらに、ベクターは既存の技術であるＡgrobacteriumによる植物形質転換のためのベクターである(Hoekema et al．1983)。要素の主な２グループはＢＩＢＡＣに合体されている。最初のグループは、その細菌宿主：Ｅ.coliおよびＡ.tumefaciensに必要とされる機能およびライブラリーを特徴づけるのを助ける特性機能を有している。第２グループは、Ａgrobac teriumによる植物形質転換を容易にすることを意図されたＢＩＢＡＣの特性を有している。ＢＩＢＡＣの地図を図１に示す。ＢＩＢＡＣの骨格は、Ｆファクター複製および保持に必要な最小領域を有する (O'Conner et al．1989)。ｐＢＡＣ１０８からのλｃｏｓＮおよびＰ１ｌｏｘＰ部位もＢＡＣ中に合体される。これらの部位は、挿入体の一方の端をアンカーし、制限エンドヌクレアーゼによる部分的消化の解析を容易にする唯一の制限部位として、機能する。ｃｏｓＮ部位は、バクテリアファージλターミナーゼにより解裂され得る(Rackwitz et al．1985)；ｌｏｘＰオリゴヌクレオチドの存在におけるバクテリアファージＰ１Ｃｒｅタンパク質によるｌｏｘＰ部位(Abremski et al．1983)。個々のクローンの制限地図は、間接エンド−標識および後の部分的消化によって定められた(Rackwitz et al．1985;Abremski et al．1983;Koh ara et al．1987)。挿入について正の選択を提供するマーカーはＢＩＢＡＣ中に合体される。このマーカーは、タンパク質レバンスクラーゼをコードするＢacillus amyloliquifa ciensからのｓａｃＢ遺伝子(Tang et al．1990)である。レバンスクラーゼは最初、スクロースによる誘導の後にＢacillus subtilisから分泌される５０ｋＤにタンパク質として同定された。この酵素はスクロースから種々のレセプターへのトランスフルクトリレーションに触媒として働く(Dedonder 1966)。Ｂ.subtilis のｓａｃＢ構造遺伝子はGay et al.(1983)によりクローン化された。次いで、寒天培地に５％スクロースが存在するとき、レバンスクラーゼの産生はＥ.coli、Ａ.tumefaciensおよびＲhizobium melilotiに致命的であることが見出された(Ga y et al．1985)。ｓａｃＢ遺伝子は、バクテリアファージＰ１クローニング・ベクターｐＡｄ１０ｓａｃＢＩＩからサブクローン化された(Pierce et al．1992)。（Ｂ.amylo liquifaciensおよびＢ.subtilis ｓａｃＢ遺伝子のコード領域は、ヌクレオチド・レベルで９０％の同等性を示す）。この構築は、ｓａｃＢ構造遺伝子のＢａｍＨＩクローニング部位領域および合成Ｅ.coliプロモータ上流を有する。ＢａｍＨＩクローニング部位は、染色体ウォークのためのＲＮＡプローブを生成せしめるのに用いられるＴ７およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ・プロモータで両側からはさまれる。ＢａｍＨＩクローニング部位はＢＩＢＡＣに特異的である。ＤＮＡフラグメントがＢａｍＨＩ部位に挿入されると、ｓａｃＢ遺伝子は不活性化され、５％スクロース含有の培地で生育されると該株は生存できる。ｓａｃＢ遺伝子は、ｐＣＨ１を生成するためにｐＢＡＣ１０８中に導入された。この構築物はＥ .coli株ＤＨ１０Ｂ中に電気穿孔され、得た株は、標準ＬＢ培地上および５％スクロース含有ＬＢ上に希釈液で平板培養することにより高スクロースに対する感受性について検定された。５％スクロース含有ＬＢ上に播かれた細胞は、標準ＬＢ培地上に播かれた細胞に比べて１０^-6より小さい平板培養効率を示した。従って、５％スクロース上への潜在的ライブラリーの平板培養は第一義的にゲノム・クローンを生じるはずである。ＢＩＢＡＣは、毛根疾患の原因であるＡ.rhizogenesのＲｉプラスミドからの複写起源領域を有する。ＴｉおよびＲｉプラスミドは異なる非適合性のグループに属し、そして一細胞中に安定して一緒に保持され得る(White and Nester 1980 ;Constantino et al．1980)。このことは、植物形質転換に使用されるＡ.tumefa ciens株が病毒力ヘルパー・プラスミドとしてｄisarmed Ｔｉプラスミドを含有する。ＢＩＢＡＣ中に合体される最小Ｒｉ起源領域は、Ａ.tumefaciensにおける細胞当り１−２コピーで、プラスミド複製および安定保持に充分であることが示されている(Jouanin et al．1985)。（細胞当り“２”コピーは、細胞複製中の重複ＤＮＡの存在をみるために含まれている）。最小Ｒｉ起源は、Ｊouanin et al.(1985)により特徴付けられたｐＬＪｂＢ１１からサブクローンされた。ｏｒｉＴカセットおよびＲｉ起源はｐＵＣ１９中で互いに隣接してクローン化され(Yanis ch-Perron et al．1985)、ｐＣＨ９をつくる。これは、単一単位としてのベクターに一つの因子が転移できるようになされた。ＢＩＢＡＣは、ＩｎｃＰグループの野生宿主領域プラスミドから誘導される接合伝達（ｏｒｉＴ）の起源を有する。すべての他の伝達機能がヘルパー・プラスミドによりｉｎｔｒａｎｓで提供されたとき、ｏｒｉＴは、共有結合された自己複写ＤＮＡの接合伝達を可能にする(Ditta et al．1980)。ＢＩＢＡＣのＲＫ２ｏｒｉＴは、ＨengenおよびＩyer(1992)により構築されたｐＮＨＫａｎ− ｏｒｉＴ中でＤＮＡカセットからサブクローンされる。ＢＩＢＡＣは、接合によりＡ.tumefaciensに伝達され得る。ＲＫ２ｏｒｉＴは、Ｅ.coliおよびＲhizob ium melilotiの染色体の接合伝達に作用するのに用いられている(Yakobson and Guiney 1984)。従って、高分子量ＤＮＡのＥ.coliからＡ.tumefaciensへの接合伝達は可能である。別法において、ＢＩＢＡＣクローンは電気穿孔によりＡgrob acterium中に導入され得る。ＭozoおよびＨooykaas(1991)は、２５０ｋｂの大きさのプラスミドを電気穿孔によりＡ.tumefaciens中に導入できることを報告している。植物形質転換におけるベクターの使用を容易にするためにＢＩＢＡＣ中に合体される特徴は、Ａ.tumefaciens Ｔ−ＤＮＡ境界および植物選択マーカーである。ＢＩＢＡＣの境界を選択するのに２つの基準がある。１）植物形質転換をできるだけ効率的にすること２）オクトピン型、ノパリン型および超病源型の病原遺伝子を保持するＡ.tumefaciens disarmed Ｔｉプラスミドと和合性のベクターをつくること。図２はＢＩＢＡＣの構築を示す。ＢＩＢＡＣの左・右境界配列がオクトピン・プラスミドｐＴｉＡ６のＴＬ−ＤＮＡから誘導される。右境界“オーバードライブ（overdrive）”配列が存在する(Peralta et al．1986;van Haaren et al．19 87)。ＢＩＢＡＣ中の境界は、コスミドｐＶＫ２３２にハイブリダイズしたプライマーを用いて、ＰｆｕポリメラーゼＰＣＲにより生成させられる(Knauf and N ester 1982)。プラスミドｐＶＫ２３２は完全ＴｉＡ６のＴＬ−ＤＮＡを含有する(de Vos et al．1981;Barker et al．1983;Gielen et al．1984)。合成ポリリンカーは、境界配列に結合し、植物選択マーカーの導入を容易にするために左・右境界配列に隣接した唯一クローニング部位を提供するように設計されている。これらは、図１においてＭＳＲ（マーカー部位右）およびＭＳＬ（マーカー部位左）と称せられる。ＰＣＲ生成境界およびポリリンカーは最初ｐＵＣ１９にクローン化された。結果として、左・右境界およびポリリンカーは、ｐＣＨ７中にＳａｌＩフラグメント上に保持される。ミニ−ＦｐＭＢＯ１３１のＳａｌＩ部位への、このフラグメントの次のクローニングを容易にするのに用いられた。ｓａｃＢ遺伝子は、Ｅ.coliのｐｃｎＢ株を形質転換し、３０℃で形質転換体をインキュベートすることによりｐＣＨ７中にクローン化された。もしｐＵＣ型プラスミドが３０℃で増殖すると、そのコピー数は細胞当たり８０から２０に減少する(Lin-Chao et al.1992)。ｐｃｎＢ（プラスミド・コピー数）突然変異は、ＣｏｌＥｌ型プラスミドのコピー数を細胞当たり約２０から約１に減少する(L opilato et al.1986)。これらの条件は、望む構築体、ｐＣＨ１０を得るのに用いられた。ｐＣＨ１０からのＳａｌＩフラグメントがｐＣＨ１３をつくるためにミニ−Ｆ中に導入されたとき、正のクローンがｓａｃマーカーをスクリーニングすることにより容易に同定された。ｏｒｉＴ／Ｒｉ起源フラグメントがｐＣＨ１６をつくるために、ミニ−ＦのＳａｌＩ端から３５ヌクレオチドにあるユニークＨｐａＩ部位に導入された。予備的実験で、クロラムフェニコールがＡgrobacte riumのいくつかの株について有用なマーカーでなかったので、ＢＩＢＡＣの骨格を完成するために、カナマイシン耐性遺伝子カセット(Smith and Crouse 1989) がミニ−ＦのクロラムフェニコールのＰｖｕII部位中にクローン化された。Ｔ−ＤＮＡの伝達は右境界に始まり、左境界の方向に進行するので、左境界の近くに位置する植物選択マーカーの伝達は、全Ｔ−ＤＮＡの伝達の指標である。従って、ＭＳＬに植物選択マーカーを有することが必須である。望むならば、第２植物選択マーカーがＭＳＬに導入される。いくつかの適用にとって、ＭＳＲでのＤｓエレメントの導入は有用であろう。ＧＵＳ−ＮＰＴＩＩ構築体(Datla et al．1991)は、Ｅ.coli β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）とネオマイシン・ホスフォトランスフェラーゼII（ＮＰＴII）間の２機能融合ペプチドである。この構築体が植物内で発現されたとき、形質転換植物はネオマイシン耐性であり、ＧＵＳ遺伝子の発現について検定される(Jefferson et al．1987)。このＧＵＳ−ＮＰＴＩＩ構築体はＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント上に保持される。フラグメントをクレノウで処置し、ＢＩＢＡＣ１をつくるために、ＭＳＬ部位でＳｒｆＩ部位中に連結した。他の植物選択マーカーを保持するいくつかのＢＩＢＡＣが構築されている。ＢＩＢＡＣ２はＭＳＬでＢＡＲ−ＧＵＳ構築体を保持する。ＢＡＲ−ＧＵＳ構築体 (Fromm et al．1990)は、殺草性ホスフィノスリチンに耐性を与えるホスフィノスリチン・アセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ）の遺伝子とＧＵＳ遺伝子との間の２機能融合ペプチドである。ＧＵＳ−ＮＰＴＩＩおよびＢＡＲ−ＧＵＳ構築体は、強力な二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター(Kay et al．1987)およびノパリン合成遺伝子から誘導される終了配列により推進される。さらに、ＡＭＶ（アルファルファ・モザイク・ウイルス）エンハンサーがＧＵＳ−ＮＰＴII構築体中に存在する。もし２植物選択マーカーをＢＩＢＡＣベクター中に望むときは、２構築体のプロモーターおよび転写終了配列は非相同的でなければならない。これは、安定性を低下するであろうベクター中の配列重複を防ぐためである。このことは、何か他の植物選択マーカーを合体するのを意図する場合には、考慮されるべきことである。さらに、植物選択マーカーのいかなる対も、ＢＩＢＡＣに向けられるべきであり、そうして収斂的に転写されないで、この立体配置が形質転換発現を与える(Jones et al．1992)。ＢＡＣにおいて、マーカーが２００ｋｂの植物ゲノムＤＮＡから分離されたら、このことは問題とならないようである。しかし、ベクターのみを用いた実験は弱点があろう。ＢＩＢＡＣ３は、ＭＳＲのＧＵＳ−ＮＰＴＩＩ構築体に加えてＭＳＬにＨＹＧ構築体を保持する。ハイグロマイシン・ホスフォトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）構築体はハイグロマイシン耐性をもたらす(Becker，et al．1992)。ＨＹＧ構築体はノパリン合成プロモーターおよびｐＡｇ７からの終了配列を有する。他の植物選択マーカーは、ユニーク・ポリリンカー部位の一つに容易に導入され得る。勿論植物選択マーカーは、ライブラリークローニング部位を唯一に保つように、ＢａｍＨＩ部位を有してはならない。実施例２ＢＩＢＡＣベクターの試験ＢＩＢＡＣ１は最初の試験に用いられている。ＢＩＢＡＣ１の物理地図が確立され、ベクター単独（ＤＮＡ挿入なしに）で期待したように機能する。これはＥ .coliおよびＡ.tumefaciens中で複写し、Ｔ−ＤＮＡをタバコに伝達し得る。タバコおよびイースト異型ＤＮＡがＢＩＢＡＣベクターのＢａｍＨＩ部位中に挿入されている。各々の得たクローン（ベクターおよび異型ＤＮＡを含む）は、電気穿孔によりＥscherichia coli株ＤＨ１０Ｂ中に導入された。Ｅ.coli株ＤＨ１０Ｂはゲノムライブラリーの構築に広く用いられていており、ＢＩＢＡＣクローンの大部分について安定性は問題と考えられない。ＤＨ１０Ｂ株は、ｍｃｒＡ，ｍｃｒＢ，ｍｃｒＣおよびｍｒｒなどの挿入体の安定性を増加するｒｅｃＡＩを含む。これらは併用的にメチル化シトシンおよびアデニン残基を含むＤＮＡの制限を防止する。この株を用いて、多くメチル化された植物ゲノムＤＮＡでもクローン化するのに問題がないはずである。三親型交配が得られたＥscherichia coli、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０７３（ストレプトマイシン耐性を有す(Leong et al．1982)）含有のＥscherichia coli、およびＡgrobacterium tumefaciensで行われた。ベクターのＡgrobacteri um tumefaciensへの伝達後、タバコ植物が下記の実施例３の方法を用いて形質転換された。形質転換植物は、ディスアーム・超病源型Ｔｉプラスミドを保持するＡgrobac terium株ＥＨＡ１０５(Hood et al．1993)、オクトピン型ディスアームＴｉプラスミドを保持するＬＢＡ４４０４(Ooms et al．1982)、ｐＭＰ９０、ノパリン型ディスアームＴｉプラスミドおよびＡ.tumefaciensのｒｅｃＡ株を保持するＧＶ３１０１(Koncz and Schell 1986)、およびｐＭＰ９０で形質転換されたＵＩＡ１４３(Farrand et al．1989)においてＢＩＢＡＣ１で得られている。ＢＩＢＡＣ１Ｔ−ＤＮＡに唯一のフラグメントの存在についてＰＣＲによりスクリーニングしたＢＩＢＡＣ１形質転換植物については、最初の９植物すべてが陽性であった。ＰＣＲ法は、安定的に形質転換されたＤＮＡを検出するのと同様に葉の組織に結合して残っているＡ.tumefaciens菌も検出するであろう。ＰＣＲの結果を確認するために、これらの植物からのゲノムＤＮＡは、プローブとしてＢＩＢＡＣ１Ｔ−ＤＮＡを用いてサザン解析の対象となる。実施例３タバコ植物の形質転換Ａgrobacterium株は、タバコ葉片のＡgrobacteriumによる形質転換によって植物体に導入された。形質転換植物はカナマイシン耐性についての選択により同定された。推定形質転換植物はＰＣＲでスクリーニングされた(Saiki 1988)。Ａgrobacteriumによる形質転換について用いられた方法は、下記のようにHors ch et al(1985)の修飾法である。Ａgrobacteriumによる葉移植片形質転換第１日若い、健康な植物（Ｎicotiana tabacum(tobacco)Petit Havanaなど）から若い葉を採取する。適当な量の大まかな見積もりとしては、１−２の標準な大きさのペトリ皿の底を覆うのに充分な表面積の葉を取得することである。滅菌蒸留水の約４００ｍｌを含む器（ジャー）に、漂白液４０ｍｌ、５％ＳＤＳ４ｍｌを加えて、約０.０５％ＳＤＳを得る。撹拌棒とすべての葉を容器に入れる。蓋をして、葉を傷めないように速度を加減しながら２０分間撹拌する。無菌空調帽中で、無菌蒸留水４００ｍｌ含有の容器に葉を移して水に浸す。葉を移す際には無菌ピンセットを用いる。容器を穏やかに振って葉を渦巻く。５分後、無菌蒸留水の第２容器に移す。さらに５分後、第３容器に移す。無菌空調帽中で働く準備ができるまで、葉はこの最終容器に浸しておく。蓋はしたままである。無菌空調帽中で次のことをする。細片を準備するために、葉を無菌ペトリ皿に移し、皿中で、上下逆にする（すなわち下面を上に）。無菌ピンセットで主脈をつかみ、無菌の小ナイフを用いて各々の主脈に対し直立した葉をいくつもの薄い細片に切断する。細片の幅は約５ｍｍでなければならない。別法として、無菌状態で無菌種子から生育した植物を直接、使用することができる。２再製プレートの各々の上に５細片を右側を上にして置く。これらを調整して、抗生物質のない培地上で非接種の葉が再生成するかどうかを調べる。１００× ２０ｍｍプレートを移植片に用いて、植物生育を可能にする。１００×２６ｍｍプレートも用いることができる（標準細菌プレートは１００×１５ｍｍ）。３再生プレートを採り、移植片の前−培養に用いる。各プレートで１５片を上下逆に置く。いくつかの材料が汚染または危険な状態になり、さらに材料が必要なときに前−培養する。註：葉の材料を上下逆にあるいは右側を下に前−培養されているかどうかは実際のところあまり問題でない。プロトコールは、上側が常に危険にさらされやすいので、上下逆を特定している。前−培養後に、接種すべきときに、損傷を受けた低表面を有する葉細片すなわちディスクは容易に判明する。その葉の移植片は廃棄する。上記のように作製した移植片のプレートをパラフィルムで密封し、２５−２８ ℃で光照射した培養器中に入れる（暗所で前−培養する研究者もある）。第２日電気穿孔したＡgrobacteriumを含有する単−筋条ＬＢｋａｎプレートを取る。２つの単−コロニーから、５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢ培地での５ｍｌ −夜培養を始める。複製チューブの作成を繰り返す。３０℃で振盪しながらインキュベートする。第３日カルベニシリンとカナマイシンまたはチミンチンとカナマイシンを含有する再生培地の２プレートの各々の上に右側を上にして葉の５細片を置く。調整して、なんらかの非接種組織が選択培地上にシュートを生育または形成していないかどうかを調べる。ある種の葉の細片は、右側を上に置いたときに、シュートをより生成する。従って、再生プレート上に細片は右側を上にして置くように指示されている。皿のまわりにパラフィルムをほどこす。Ａgrobacterium １：１０の一夜培養物２ｍｌをＭ５０培地１８ｍｌと混合して希釈する。希釈液を無菌ペトリ皿に注ぐ。明らかに損傷を受けているか、またはふくれていない葉細片は前−培養プレートから除く。健全な細片を希釈細菌培地に入れ、切断端が湿るように５秒以上ゆるやかに皿をまわす。（注意）すべての傷つけた端が接種材料で湿るのに要する時間以上には葉組織の培地中に放置しないこと。細菌の多い組織は難治性の感染を起こすことがある。細菌培養から組織を取り出し、無菌のワットマンＮｏ１フィルター紙上に置き、いくらかの過剰の細菌培養物をなくする。次いで、２再生プレート上（抗生物質なし）に１０細片を上下逆に置く。皿のまわりにパラフィルムをほどこし、皿の蓋側を上にしてインキュベートする。（いくつかの研究所で、特に再生が難しい植物種についてはナース細胞培養物を用いると助けになることが分かった。急速成長液体植物サスペンション培養物１−１.５ｍｌを再生プレートに加え、これを無菌ホワットマン＃１フィルター紙で完全に覆う。フィルター紙は細胞での移植片の汚染を防止する。次いで、細片をフィルター紙の頂上に置く。タバコ・サスペンション培養細胞は、これ細胞が２.４−Ｄを含有しない培地中で生育することから、しばしば用いられる。ナース培養で用いたら２.４−Ｄは植物再生を阻害するであろう。）第３日以後葉細片および／またはディスクを、細菌を殺すためにカルベニシリン５００ｕｇ／ｍｌまたはテメンチン１００μｇ／ｍｌおよびカナマイシン３００ｕｇ／ｍｌ含有の再生プレートに移し、カナマイシン耐性を表す形質転換細胞を選別する。葉組織を培地上に右側上に置く。さらに後に、シュートが２５−２８℃で光照射生育室内で２−３週間して葉組織上に形成し始める。２週間後、移植片をカルベニシリン（またはテメンチン）またはカナマイシンを有する新しい再生プレートに移す。頻繁に皿の観測を続ける。カルス塊が生成したときに、それ（葉組織なしに）をカルベニシリンおよびカナマイシンを有する新しい再生プレートに移す。さらに約１−２週間後にシュートがカルス上に生成する。シュートがカルスから切除するのに充分な大きさになったときに、切断して、カルベニシリンとカナマイシンまたはテメンチンとカナマイシンを有する根付け培地にシュートを移す。カルスはなおいくらかのＡgrobacteriumを含有していることもあるので、シュートがカルスで汚染されるのを避けることが重要である。カナマイシンを減量または使用しないと根付け過程を促進することがある。皿の観察を続ける。もしＡgrobacteriumのなんらかの生育がみられたら、シュートを直ちにカルベニシリンまたはテメンチンとカナマイシンを有する新しい根付け培地に移す。もしＡgrobacteriumの生育が少数のシュートに限定されておれば、Ａgrobacteriumの過生育のみられないシュートのみを新しい培地に移し、古い皿は破棄する。根が形成された後、抗生物質のない根付培地を含有するＭagentaボックスに小植物を移す。植物が４−５の葉をつけ、根が３−４ｃｍになったときに、鉢に土植えができる。鉢植え時にアガールを根から除く。各々の新しく鉢植えした植物をプラスチック・バッグに入れ、上部を縄で閉じる。徐々に（約２週間以上かけて）バッグを開くか、あるいは開口部が大きくなるようにバッグに切口を入れる。そしてバッグを取り除く。望ましい実施態様を詳細に図示し、記述したが、関連技術の当業者にとって、種々の変更、追加、代替などを本発明の精神から離れることなしになし得ることは明らかであろう。従って、それらは下記の請求項に定義する発明の範囲にあるものと考えられる。

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｅscherichia coli宿主細胞中で単一コピーとして異型ＤＮＡを保持し得る複製の第１起源、およびＡgrobacterium tumefaciens宿主細胞中で単一コピーとして異型ＤＮＡを保持し得る複製の第２起源を含む骨格、異型ＤＮＡの挿入のための唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位、および該唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位を両側からはさむ左および右のＡgr obacterium Ｔ−ＤＮＡ境界（該左および右のＴ−ＤＮＡ境界配列は、該左および右のＴ−ＤＮＡ境界配列の間に位置する異型ＤＮＡを植物細胞に挿入するのを可能にする）を含むベクターである、異型ＤＮＡを植物細胞に伝達するためのベクター。２．該複製第１起源がＥscherichia coliからのＦ起源を含む、請求項１のベクター。３．該複製第２起源がＡgrobacterium rhizogenesからのＲｉ起源を含む、請求項１のベクター。４．該複製第１起源がＥscherichia coliからのＦ起源および該複製第２起源がＡgrobacterium rhizogenesからのＲｉ起源を含む、請求項１のベクター。５．該唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部分がＢａｍＨＩ解裂部位を含む、請求項１のベクター。６．該左および右のＴ−ＤＮＡ境界配列がオクトピン・プラスミドｐＴｉＡ６のＴＬ−ＤＮＡから誘導される、請求項１のベクター。７．異型ＤＮＡを該ベクターに合体さすための選択マーカーをさらに含む、請求項１のベクター。８．該選択マーカーがｓａｃＢ遺伝子を含み、その中で、異型ＤＮＡが該ベクターの該唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位に挿入されたときに、該ｓａｃＢ遺伝子が不活性化される、請求項７のベクター。９．該異型ＤＮＡをＥscherichia coliに導入するための選択マーカーをさらに含む、請求項１のベクター。１０．該選択マーカーがカナマイシン耐性遺伝子である、請求項９のベクター。１１．該異型ＤＮＡをＡgrobacterium tumefaciensに導入するための選択マーカーをさらに含む、請求項１のベクター。１２．該選択マーカーがカナマイシン耐性遺伝子である、請求項１１のベクター。１３．該異型ＤＮＡを植物細胞中に導入するための選択マーカーをさらに含み、該選択マーカーが該左および右のＴ−ＤＮＡ境界配列の間に位置する、請求項１のベクター。１４．該選択マーカーが該左のＴ−ＤＮＡ境界配列に隣接して位置する、請求項１３のベクター。１５．該選択マーカーがカナマイシン耐性遺伝子を含む、請求項１３のベクター。１６．該カナマイシン耐性遺伝子がＧＵＳ−ＮＰＴＩＩ遺伝子を含む、請求項１５のベクター。１７．該選択マーカーがヒグロマイシン耐性遺伝子を含む、請求項１３のベクター。１８．該骨格が接合伝達の起源をさらに含む、請求項１のベクター。１９．該接合伝達の起源がプラスミドＲＫ２からのｏｒｉＴ起源を含む、請求項１８のベクター。２０．請求項１のベクターで形質転換された宿主細胞。２１．該唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位に挿入された異型ＤＮＡをさらに含む、請求項１のベクター。２２．請求項２１のベクターで形質転換された宿主細胞。２３．該宿主細胞がＥscherichia coliを含む、請求項２２の宿主細胞。２４．該宿主細胞がＡgrobacterium tumefaciensを含む、請求項２２の宿主細胞。２５．該宿主細胞が植物細胞を含む、請求項２２の宿主細胞。２６．異型ＤＮＡ遺伝子産生物をコードする該ＤＮＡを請求項１の該ベクターの唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位中に挿入し、該異型ＤＮＡをＥscherichia coli宿主細胞に導入するようにして、得たベクターで該Ｅscherichia coli宿主細胞を形質転換し、該異型ＤＮＡをＡgrobacterium tumefaciens宿主細胞に導入するようにして、得たＥscherichia coli細胞から分離されたベクターＤＮＡで該Ａgrobacterium tumefaciens宿主細胞を形質転換し、該異型ＤＮＡを植物細胞に導入するようにして、得たＡgrobacterium tumefac iens細胞で該植物細胞を形質転換し、該植物細胞中で該異型ＤＮＡによりコードされた遺伝子産生物を産生するように、該植物細胞中で該異型ＤＮＡを発現することを含む方法である、植物細胞中に異型ＤＮＡを導入し、それにより植物細胞中で遺伝子産生物を産生せしめる方法。２７．異型ＤＡＮ遺伝子産生物をコードする該ＤＮＡを請求項１の該ベクターの唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位中に挿入し、該異型ＤＮＡを植物細胞に導入するようにして、得たベクターで該植物細胞を形質転換し、該植物細胞中で該異型ＤＮＡによりコードされた遺伝子産生物を産生するように、該植物細胞中で該異型ＤＮＡを発現することを含む方法である、植物細胞中の遺伝子産生物を産生する方法。