JPH11500306A - バイナリーbacベクター - Google Patents
バイナリーbacベクターInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、異型DNAを植物細胞中に伝達するためのベクターに関する。このベクターは、大きいDNA挿入体でのゲノム・ライブラリーの構築のために修飾された細菌性人工染色体(BAC)およびAgrobacteriumによる植物形質転換のために修飾されたバイナリー(BIN)ベクターに基づいている。本発明のBIBACベクターは、大きいDNA挿入体での植物ゲノム・ライブラリーの構築を可能にし、これはAgrobacteriumによる形質転換により直接に導入され得る。
Description
【発明の詳細な説明】
バイナリーBACベクター
本出願の主題は米国政府の支持でなされた(米国科学財団植物科学センタ許可
番号175−8300−6550−361)。
発明の分野
本発明は、植物形質転換のためのベクター、特にバイナリーBACベクターお
よび該ベクターの使用に関する。
発明の背景
本出願を通じて、様々の公表文献が関係し、その多くはカッコで示す。これら
の文献は、詳細な説明の最後に完全引用として挙げる。これらの文献は全体とし
て参照により本出願に合体される。
植物分子生物学者および植物栽培家が今日直面している主要問題は、表現型に
よってのみ知られている農業的に重要な遺伝子をいかに固定するかである。表現
型を調べることによりマップ・ベース・クローニングおよびトランスポゾン・タ
ーゲティングが植物遺伝子クローンの同定を可能にはしているが、それは技術的
に難しくそして手間のかかる方法である。今日までこのタイプの、僅かに少数の
主な植物遺伝子がクローン化されているだけである(Martin et al.1993,Bent et
al.1994,Jones et al.1994,Whitham et al.1994)。
植物栽培家は、古典的な繁殖方法についての遺伝的変化に頼っている。最も効
果的であるには、現在の植物栽培家は農業に重要な遺伝子の分子生物学を知る必
要がある。望ましい特質をコードする遺伝子をクローン化すると、ある場合には
、古典的な繁殖方法を回避して、直接に植物形質転換によりその特質を導入する
ことが現在は可能である。将来には、古典的な植物繁殖法では達成することので
きない品種、交叉適合のない品種から望ましい特質を導入できることが可能です
らある。農業的に重要な遺伝子のクローニングは植物学に新しい研究分野も開く
であろう。
マップ・ベース・クローニングの考えが最初に想定されたときに、興味ある領
域における重複遺伝子クローンを連結する染色体ウォークが必然的であると考え
られた。農作植物は、比較的大きいゲノムおよび高程度の反復DNAを有する傾
向にあり、染色体ウォークをより長たらしくそして複雑なものにする特徴がある
。幸いなことに、最近の手法の開発は、遺伝子に密接に結合した分子マーカーを
同定することを可能にし、染色体ランディグの考えに導いている。
染色体ランディングは、望む遺伝子に密接に結合したマーカーを取得するのが
、あまり特徴が分かっていないゲノムにおいてさえも、困難でないとの事実に基
づいている。RAPD(ランダム増幅多形DNA)およびAFLP(増幅フラグ
メント長さ、多形性)法を近同等ラインまたはバルク分離体の解析と併用して、
望む遺伝子に非常に密接した分子マーカーを同定するのに用いることができる(W
illiams et al.1990,Zabeau and Vos 1992,Martin et al.1991,Michelmore et a
l.1991)。ゲノム・ライブラリーは、ポテンシャル・クローンを同定するために
遺伝子の両側に位置するマーカーを用いてスクリーニングすることができる。
現在、マップ・ベース・クローニングを大規模に利用するのに残っていた最も
大きい障壁は、ポテンシャル・クローンが望む遺伝子を実際に所持しているかを
いかに確かめるかである。今までのところ、その試みは、望む遺伝子を含有する
と確信される一連のイースト人工染色体のサブクローン(YAC)(Burke et al.1
987)を生成して、なされている。これらのサブクローンの各々は、期待する表現
型の遺伝子転換植物を検定することにより遺伝子の存在(または不存在)を同定
するために、個々に植物中に形質転換しなければならない。これは、非常に時間
を費やすのみでなく、いかなるサブクローンもターゲット遺伝子の一部しか含有
していなくて、形質転換/相補性実験において負の結果をもたらすことがあるの
で、危険性がある。もし、ターゲット遺伝子が多数のイントロンを含有し、ゲノ
ムDNAの大きいセグメント上に伸張していると、サブクローンのいずれも全遺
伝子を含有するのに充分な大きさでなくなる。
最も必要なのは、遺伝子確認のこの隘路を回避する技術である。大きいDNA
構築物を植物に導入する能力は、植物形質転換を進める前に高分子量YACまた
はBACライブラリー・ベクターから得られるサブクローニングの量を低下せし
める。直接的に植物を形質転換するのに用いることができる高分子量ライブラリ
ー・ベクターが理想的ではある。実際、高分子量DNAでもって植物を形質転換
する技術の開発が、農業上重要な遺伝子の主要部分をつくりあげるQTLs(定
量的特質位置)のクローニングに必須であろう。
高分子量ゲノム・ライブラリーについて存在するベクターのいずれもが植物の
形質転換に適していない。Agrobacteriumによる植物形質転換に適した一連のコ
スミド・ライブラリー・ベクター(最大挿入サイズ46kb)がMa et al.(199
2)により構築された。しかし、小さい挿入サイズでは、Arabidopsisよりかなり
大きいゲノムについては実用性がほとんどない。Arabidopsisは、そのゲノムの
大きさが約100メガ塩基対(Mbp)と小さいが、他のより大きい植物は4−
20−foldより大きいゲノムを有している(Bennett and Smith 1976)。最初の高
分子量植物ゲノム・ライブラリーはYACベクターにおいて構築された。トマト
からのPto病抵抗遺伝子(Martin et al.1992)およびArabidopsisからのRP
S2病抵抗遺伝子(Bent et al.1994)がYACライブラリーからクローンされて
いる。しかし、YACライブラリーは、構築し、保持し、そして利用するための
主な出資であり、いくつかのYACライブラリーは、欠失、再構成およびキメラ
に苦しめられている(van Wordragen and Dons 1992)Hiei et al.1994)。
最近、BACライブラリーが約180kbの平均挿入サイズでもってモロコシ
(Woo et al.1994)およびコメ(Wang and Ronald 1994)について構築された。BA
CライブラリーはYACライブラリーよりも構築、スクリーンおよび維持しやす
いことが判明した。
Agrobacterium tumefaciensは天然に生じる植物形質転換系である(Kado 19
91およびZambryski 1988による総説を参照)。最近、Miranda et al.は、少な
くとも170kbがAgrobacteriumのTiプラスミドから植物ゲノムへ導入でき
たことを明らかにした(Miranda et al.1992)。高分子量でのAgrobacteriumによ
る植物の形質転換についての最も劇的なポテンシャルは、A.tumefaciensがT−
DNAを植物ゲノムに線様式で伝達することが示されたことである。もし形質転
換植物が植物ゲノムにおいて全ゲノム・ライブラリー挿入(無傷)を所有して生
じるならば、非常な利点であろう。線式伝達が挿入の限界を除き先端切断遺伝子
の可能性をなくし、非常に大きい遺伝子(もし存在するなら)または遺伝子クラ
スターを導入することを可能にするであろう。
Agrobacteriumによる植物形質転換は、植物細胞に新しい遺伝子情報を導入す
るために最も広く用いられている技術である。Agrobacteriumによる形質転換は
、タバコ、ペチュニアおよびトマトなどの品種において日常的に利用可能であり
、相当の努力が、この技術を主な農作物(van WordragenおよびDons 1992によ
る総説)および単子葉植物に適用するのに、なされて来た。最近、コメのAgrob
acteriumによる形質転換が報告されている(Hiei et al.1994)。
しかし、高分子量のDNA配列で植物を形質転換するためのベクターについて
は、なお必要性が継続している。
発明の要旨
本発明によりAgrobacteriumによる植物形質転換のために設計された新しいB
ACライブラリー・ベクターを構築して、上記の必要性が充足される。各BIB
ACライブラリー・クローンはEscherichia coli中のプラスミドとして存在す
るので個々のクローンのDNAは標準的プラスミド分離技術によって容易に分離
することができる。このプラスミドDNAは電気穿孔によってAgrobacterium中
に導入され得る。別法では、BIBACライブラリークローンは、三親型交配に
よってE.coli宿主からAgrobacteriumに伝達され得る。
本発明は、異型DNAを植物細胞中に伝達するためのベクターを提供する。該
ベクターは、Escherichia coli宿主細胞における単一コピーとしての異型DN
Aを保持し得る複製の第1起源およびAgrobacterium tumefaciens宿主細胞にお
ける単一コピーとしての異型DNAを保持し得る複製の第2起源を有する骨格を
含んでいる。さらに該ベクターは、異型DNAの挿入のための唯一の複製エンド
ヌクレアーゼ***部位および唯一の複製エンドヌクレアーゼ***部位を両側から
はさむ左・右AgrobacteriumT−DNA境界配列を含む。T−DNA境界配列は
、左および右のT−DNA境界配列の間に位置する異型DNAを植物細胞に導入
す
ることを可能にする。
該ベクターは、大きいDNA挿入の植物ゲノム・ライブラリーの構築を可能に
する。個々のクローンは形質転換により植物に直接に導入され得る。
図面の簡単な説明
上記および他の本発明の特徴および利点は、添付の図面と共に下記の望ましい
実施態様の詳細な説明により明らかになるであろう。
図1はBIBACベクターのマップを表し、図2はBIBACベクターの構築
についての方策を表わす。
詳細な説明
BIBACと名付けられたベクターは、DH10B(pCH23)なるEsche
richia coli株中のpCH23なるプラスミドとして寄託された。この寄託は、
特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に従い、その必
要条件充足すべく、American Type Culture Collection(ATCC),12
301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852にATCC受付番号6
9743としてなされた。
本発明は、異型DNAを植物細胞中に伝達するためのベクターに関する。該ベ
クターは複製の2起源を有する骨格を含有している。複製の第1起源は、Esher
ichia coli宿主細胞において単一コピーとして異型DNAを保持し得る。この出
願を通じての使用において、他に明示しない限り、単一コピーとしての保持は、
非複製細胞、すなわち細胞***を受けない細胞を意味する。細胞***中に、細胞
毎のコピーは細胞毎にほぼ2完全コピーに増加する。複製の第2起源は、Agrob
acterium tumefaciens宿主細胞において単一コピーとして異型DNAを保持し得
る。
該ベクターはまた、異型DNAの挿入のための唯一の制限エンドヌクレアーゼ
解裂を有している。ベクターをコードするDNA配列中における特定の制限エン
ドヌクレアーゼのためのただ一つの解裂部位の存在は、“唯一の”制限エンドヌ
クレアーゼ解裂部位である。従って、この特定の制限エンドヌクレアーゼは、一
つの場所すなわち“唯一の”部位においてのみDNAを解裂する。異型DNAは
、
ベクターによって形質転換された特定の宿主細胞に通常は存在しないDNAを意
味する。
該ベクターはまた、“唯一の”制限エンドヌクレアーゼ解裂部位を両側からは
さむ左・右AgrobacteriumT−DNA境界配列を含有する(Peralta and Ream 1
985)。これらの境界配列は、左および右T−DNA境界配列の間に位置する異
型DNAの植物細胞への導入を可能にする。
Esherichia coliおよびAgrobacterium tumefaciensにおける高分子量DNA
の安定な保持は、これらの高分子量DNA配列が単一コピー・プラスミド上にあ
ることから、可能である。これらの大きいDNA挿入の多数のコピーがあれば、
宿主細胞が不安定となり植物形質転換に利用できなくなるであろう。
本発明のベクター、すなわちBIBACベクターについての一つの実施態様に
おいて、唯一の制限エンドヌクレオターゼ解裂部位は、BamHI解裂部位であ
る。この解裂部位は、Agrobacterium tumefaciensT−DNA境界配列間に存在
し、異型DNAをベクター(sacB遺伝子)に合体さすための選択マーカーで
ある。BamHI解裂部位およびsacB遺伝子は、異型DNAがBamHIに
挿入されたときにsacB遺伝子が不活性化されるように、位置している。BI
BACベクターは、Esherichia coli中の単一コピーとして異型DNAを保持す
るためにAgrobacterium tumefaciensからの複製のT−起源およびEsherichia
coli中の単一コピーとして異型DNAを保持するためにAgrobacterium tumefac
iensからの複製Ri起源を含んでいる(Low 1972)。BIBACベクターにおけ
る左および右のT−DNA境界配列は、オクトピン・プラスミドpTiA6のT
L−DNAから誘導される。
BIBACベクターはまた、異型DNAの細菌細胞Esherichia coliおよびA
grobacterium tumefaciensへの導入のための選択マーカーを含んでいる。細菌選
択マーカーはカナマイシン耐性遺伝子からなる。BIBACベクターはまた、異
型DNAの植物細胞への導入のための選択マーカーを含む。この選択マーカーは
左および右T−DNA境界配列の間に存在しなければならない。何故なら、境界
配列によって囲まれている領域のみが植物宿主細胞に伝達されからである。従っ
て、植物選択マーカーは、植物細胞への伝達するためのT−DNA境界の間に存
在しなければならない。BIBACベクターにおいて、植物選択マーカーはカナ
マイシン耐性である(GUS−NPTII構築により提供される)。他の適当な
植物耐性マーカーに、ヒグロマイシン耐性(HYG構築)およびホスフィノチリ
シン耐性(BAR−GUS構築)がある。
BIBACベクターはまた、接合伝達の起源(プラスミドRK2からのori
T起源)を含む。この起源は、細菌接合によって直接的にEsherichia coli宿主
細胞からAgrobacterium tumefaciens宿主細胞への異型DNAの伝達を可能にす
る。
該ベクターは異型DNAを宿主細胞に導入するのに用いられる。従って、該ベ
クターはさらに、唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位に挿入された異型DN
Aを含む。DNAは、当業者に既知の標準的クローニング手法を用いて、ベクタ
ー中に挿入される。これは一般的に、Maniatis et al.,Molebular Cloning:A La
boratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N
ew York(1982)に記載されているように、制限酵素(BIBAC,BamHIの
場合)およびDNAリガーゼを使用することを含む。従って、ベクターはEsher
ichia coli、Agrobacterium tumefaciens及び/または植物細胞などの宿主細胞
を形質転換するために用いられ得る。
本発明のベクターにはいくつもの用途がある。一つは、ライブラリー・ベクタ
ーとしての使用である。植物からのゲノムDNAは制限エンドヌクレアーゼ(B
IBACベクターの場合BamHI)で切断される。植物の全ゲノムを集合的に
表す制限フラグメントは、BIBACベクター(BamHIによる切断で開かれ
ている)中に各々リゲートされる。これは、BIBACベクターにおけるライブ
ラリーを生成する(一般的に、Current Protocols in Molecular Cloning,Ausub
el,F.M.et al.,eds.,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(198
9)参照)。
ライブラリーで扱いやすくするために、ベクターは一般的に細菌宿主細胞に保
持される。Esherichia coliがこのようなライブラリーの保持について標準的細
菌宿主細胞である。ベクターDNAは様々な既知技術によって細菌宿主細胞に導
入し得る。それには、電気穿孔、塩化カルシウム形質転換および粒子衝撃形質転
換などがある。形質転換された細菌細胞は、種々の選択的薬剤に対する生長能力
によって同定される。従って、ベクターを含む細菌細胞は、そのカナマイシン耐
性によって同定し得る。挿入された異型DNAの存在は、高レベルのスクロース
に対する細菌の生長能力によって判明する。高レベルのスクロースに対する生長
能力は、他の選択マーカー、sacB遺伝子の不活性化による。望む異型DNA
を含有するポテンシャル・クローンは、プローブとして、密接に接合した分子マ
ーカーまたは異型DNAを用いて、サーザン分析(Southern 1975)によって同
定される。望むクローン(異型DNA含有ベクター)は次の実験に用いられる。
該ベクター、すなわち望む誘導クローンは、Agrobacterium tumefaciens中に導
入され得る。この導入は、電気穿孔あるいは粒子衝撃を含む既知技術を用いて、
行われる。
ベクターをAgrobacterium tumefaciens中に導入するために用いられる他の方
法は、三親型交配である。三親型交配において、ベクター含有Escherichia col
i、ヘルパー・プラスミド含有の第2Escherichia coliおよびAgrobacteriumが
結合されて、AgrobacteriumにベクターDNAの導入が起きる。Agrobacterium
は、ベクターDNAの存在を調べるために選択マーカー(BIBACベクター中
のカナマイシン耐性など)を用いて、スクリーリングする。ベクターDNAを含
有するこれらの細胞は次の実験に用いる。
該ベクター、すなわち望む誘導クローンは、植物細胞中に導入され得る。(一
般的にPlant Molecular Biology Manual,2nd Edition,Gelvin,S.B.and Schilper
oort,R.A.,Eds.,Kluwer Academic Press,Dordrecht,Netherlands(1994))。
ベクターまたはクローンの植物細胞中への導入についての一つの方法は、植物
細胞のAgrobacteriumによる形質転換(安定または暫定的)である。簡単には、
植物の組織をベクター(その中に異型DNA)で形質転換されたAgrobacterium
の接種材料と接触せしめる。一般的に、この方法は、細菌の懸濁液を植物組織に
接種し、抗生物質のない再生培地で48−72時間、25−28℃で組織をイン
キュベートすることを含む。
実際には、Agrobacterium tumefaciensによる形質転換方法は3工程を含む。
最初にベクターDNAがEscherichia coli宿主細胞中で分析され、次いでAgro
bacterium宿主細胞中に導入され、これは植物細胞へのベクター中のT−DNA
のAgrobacteriumによる伝達に用いられる。一般的に、T−DNA境界配列およ
びその間に存在するDNAの部分のみが、かかるAgrobacteriumによる伝達によ
って、植物細胞中に伝達される。従って、植物細胞への伝達のための異型DNA
はすべて、T−DNA境界配列間のベクター中に存在しなければならない。
T−DNA伝達の一つの標準的方法は、バイナリー・システムである。バイナ
リー・ベクターは、除去および統合に必要であり、境界間に挿入された異型DN
Aを有するT−DNA境界を含む。Tiプラスミドの必須vir遺伝子はトランスで
作用し、ヘルパー・プラスミドと呼ばれる分離プラスミド上に供給される。
葉ディスク技法がAgrobacteriumによる形質転換の接合に用いられる。簡単に
は、傷つけた植物細胞(葉、根、茎など)をAgrobacterium細胞と共に培養して
、Agrobacteriumから植物細胞へのT−DNAの伝達を起こさせる。数日後、植
物組織を選択剤の含有のシュート−誘発培地に移す。Gus−NPTII植物選
択マーカーを含有するBIBACベクターの場合、カナマイシン含有の培地が用
いられ得る。シュートが形成された後、根の形成を促進する培地にシュートを移
す。
ベクターまたはクローンを植物細胞に導入する他の方法は、粒子衝撃によるな
どの植物細胞核の形質転換による。
ベクターまたはクローンを植物細胞に導入する他の方法は、植物細胞原形質(
安定または暫定的)の形質転換による。植物原形質は、プラスマ膜によってのみ
囲まれており、従って、異型DNAのようなマクロ分子を取り込む。これらの工
学操作された原形質は、すべての植物を再生することができる。異型DNAの植
物細胞への導入についての適当な方法には、電気穿孔およびPEG形質転換など
がある。
ベクターまたはクローンを植物細胞に導入する追加の他の方法は、粒子衝撃な
どの植物機能質(葉線体、またはミトコンドリア)の形質転換による。ベクター
は植物機能質においては複製しないが、異型DNAは組換えによりゲノム中に合
体され得る。
本願を通じて適用されるように、電気穿孔は、形質転換の方法であって、その
中において、一般的に高濃度のベクターDNA(異型DNAを含有)が宿主細胞
の原形質または細菌細胞のサスペンションに加えられて、混合物に200−60
0V/cmの電気場で衝撃が与えられる。電気穿孔に続いて形質転換細胞は、選
択剤を含有する適当な培地に対する生長によって同定される。
本願を通じて適用されるように、粒子衝撃(生体分解形質転換としても知られ
る)はいくつかの方法の一つで遂行される。最初の方法は、細胞における促進不
活性または生物的活性粒子を含む。この技術は、すべてがSanford et al.であ
る米国特許第4,945,050および第5,100,792に開示されている。こ
れらを参照としてここに合体する。一般に、この方法は細胞における促進不活性
または生物的活性粒子を、細胞の外表面に浸透し、その内部に合体するのに効果
的な条件で、含む。不活性粒子が用いられるときは、ベクターは異型DNA含有
のベクターで粒子をコートすることにより細胞中に導入される。別法として、タ
ーゲット細胞が粒子の動きにより細胞中にベクターが運ばれるように、ベクター
によって囲まれ得る。生物的に活性な粒子(例えば、ベクターおよび異型DNA
を含有する乾燥細菌細胞)も植物細胞中に動かされ得る。
このように、本発明のベクターは種々の方法で様々な宿主細胞を形質転換する
のに用いることができる。特に、望む遺伝子生産物をコードする異型DNAはB
IBACベクターの唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位に挿入され得る。ベ
クターは、異型DNAを含有し、Agrobacterium tumefaciensを形質転換するの
に、および/またはEscherichia coliを形質転換するのに用いられる。それか
らAgrobacterium tumefaciensは植物細胞を形質転換するのに用いられる。植物
細胞への異型DNAの導入は、異型DNAによりコードされた遺伝子産生物の製
造をDNAが植物細胞中で発現したときに、可能にする。
別法として、望む遺伝子産生物は、BIBACベクター(唯一の制限エンドヌ
クレアーゼ解裂部位に挿入された遺伝子産生物をコードする異型DNAを有する
)
で直接、植物細胞を形質転換することにより、biolistic形質転換などにより、
植物細胞に製造される。この方法はまた、異型DNAを植物細胞に導入すること
ができ、DNAが植物細胞中で発現したときに、異型DNAによりコードされた
遺伝子産生物の製造をもたらす。
これらの方法を考慮すると、ベクターは植物遺伝子をその表現型によってクロ
ーン化するのに用いることができる。例えば、特定の植物はウイルスに感受性で
あることが見出されており、ウイルス抵抗性をコードする遺伝子は存在すると考
えられる。ゲノム・ライブラリーはBIBACベクターにおいてつくられ、およ
びウイルス抵抗性遺伝子を潜在的にコードするDNAのセグメントを含有するベ
クターが植物を形質転換するのに用いられる。次いで、形質転換された植物はウ
イルスに暴露される。植物のウイルス感染の特徴的な表現型特性を欠くことは、
特定の異型DNAのBIBACベクターへの挿入によってウイルス抵抗性遺伝子
が植物中に伝達されたことを示す。
従って、ウイルス抵抗性遺伝子をコードする配列は、クローニング遺伝子のB
IBACベクターの表現型を用いて、同定することができる。
本出願を通して用いられるように、形質転換には暫定的または安定な形質転換
のいずれもが含まれる。暫定的形質転換においては、異型DNAは、宿主細胞の
DNA中に合体(安定な形質転換としての合体)されることなしに、宿主細胞に
導入される。植物形質転換において、DNAは、暫定的に植物細胞中に導入する
ことができるし、また安定的にも導入(すなわち、核ゲノム、原形質ゲノムまた
はミトコンドリア・ゲノム中に合体)される。Agrobacteriumによる植物形質転
換の場合、異型DNAは、暫定的に植物細胞中に導入されるか、または安定的に
植物の核ゲノム中に導入(すなわち合体)される。Agrobacteriumによる植物形
質転換は、植物の原形質またはミトコンドリア・ゲノム中に異型DNAを安定的
に導入しない。ここで用いた形質転換は、特定のベクター/宿主組合せに利用さ
れうるすべてのタイプの形質転換を含んでいる。
実施例1BIBACの構築
BIBACのライブラリー特徴はShizuya et al.(1992)に記載された細菌人
工染色体クローニングシステムに基づいている。さらに、ベクターは既存の技術
であるAgrobacteriumによる植物形質転換のためのベクターである(Hoekema et
al.1983)。
要素の主な2グループはBIBACに合体されている。最初のグループは、そ
の細菌宿主:E.coliおよびA.tumefaciensに必要とされる機能およびライブラ
リーを特徴づけるのを助ける特性機能を有している。第2グループは、Agrobac
teriumによる植物形質転換を容易にすることを意図されたBIBACの特性を有
している。BIBACの地図を図1に示す。
BIBACの骨格は、Fファクター複製および保持に必要な最小領域を有する
(O'Conner et al.1989)。pBAC108からのλcosNおよびP1 lox
P部位もBAC中に合体される。これらの部位は、挿入体の一方の端をアンカー
し、制限エンドヌクレアーゼによる部分的消化の解析を容易にする唯一の制限部
位として、機能する。cosN部位は、バクテリアファージλターミナーゼによ
り解裂され得る(Rackwitz et al.1985);loxPオリゴヌクレオチドの存在に
おけるバクテリアファージP1 Creタンパク質によるloxP部位(Abremski
et al.1983)。個々のクローンの制限地図は、間接エンド−標識および後の部
分的消化によって定められた(Rackwitz et al.1985;Abremski et al.1983;Koh
ara et al.1987)。
挿入について正の選択を提供するマーカーはBIBAC中に合体される。この
マーカーは、タンパク質レバンスクラーゼをコードするBacillus amyloliquifa
ciensからのsacB遺伝子(Tang et al.1990)である。レバンスクラーゼは最
初、スクロースによる誘導の後にBacillus subtilisから分泌される50kDに
タンパク質として同定された。この酵素はスクロースから種々のレセプターへの
トランスフルクトリレーションに触媒として働く(Dedonder 1966)。B.subtilis
のsacB構造遺伝子はGay et al.(1983)によりクローン化された。次いで、寒
天培地に5%スクロースが存在するとき、レバンスクラーゼの産生はE.coli、
A.tumefaciensおよびRhizobium melilotiに致命的であることが見出された(Ga
y et al.1985)。
sacB遺伝子は、バクテリアファージP1クローニング・ベクター pAd
10sacBIIからサブクローン化された(Pierce et al.1992)。(B.amylo
liquifaciensおよびB.subtilis sacB遺伝子のコード領域は、ヌクレオチド
・レベルで90%の同等性を示す)。この構築は、sacB構造遺伝子のBam
HIクローニング部位領域および合成E.coliプロモータ上流を有する。Bam
HIクローニング部位は、染色体ウォークのためのRNAプローブを生成せしめ
るのに用いられるT7およびSP6RNAポリメラーゼ・プロモータで両側から
はさまれる。BamHIクローニング部位はBIBACに特異的である。DNA
フラグメントがBamHI部位に挿入されると、sacB遺伝子は不活性化され
、5%スクロース含有の培地で生育されると該株は生存できる。sacB遺伝子
は、pCH1を生成するためにpBAC108中に導入された。この構築物はE
.coli株DH10B中に電気穿孔され、得た株は、標準LB培地上および5%ス
クロース含有LB上に希釈液で平板培養することにより高スクロースに対する感
受性について検定された。5%スクロース含有LB上に播かれた細胞は、標準L
B培地上に播かれた細胞に比べて10-6より小さい平板培養効率を示した。従っ
て、5%スクロース上への潜在的ライブラリーの平板培養は第一義的にゲノム・
クローンを生じるはずである。
BIBACは、毛根疾患の原因であるA.rhizogenesのRiプラスミドからの
複写起源領域を有する。TiおよびRiプラスミドは異なる非適合性のグループ
に属し、そして一細胞中に安定して一緒に保持され得る(White and Nester 1980
;Constantino et al.1980)。このことは、植物形質転換に使用されるA.tumefa
ciens株が病毒力ヘルパー・プラスミドとしてdisarmed Tiプラスミドを含有
する。BIBAC中に合体される最小Ri起源領域は、A.tumefaciensにおける
細胞当り1−2コピーで、プラスミド複製および安定保持に充分であることが示
されている(Jouanin et al.1985)。(細胞当り“2”コピーは、細胞複製中の
重複DNAの存在をみるために含まれている)。最小Ri起源は、Jouanin et
al.(1985)により特徴付けられたpLJbB11からサブクローンされた。or
iT
カセットおよびRi起源はpUC19中で互いに隣接してクローン化され(Yanis
ch-Perron et al.1985)、pCH9をつくる。これは、単一単位としてのベクタ
ーに一つの因子が転移できるようになされた。
BIBACは、Inc Pグループの野生宿主領域プラスミドから誘導される
接合伝達(oriT)の起源を有する。すべての他の伝達機能がヘルパー・プラ
スミドによりin transで提供されたとき、oriTは、共有結合された
自己複写DNAの接合伝達を可能にする(Ditta et al.1980)。BIBACのR
K2 oriTは、HengenおよびIyer(1992)により構築されたpNHKan−
oriT中でDNAカセットからサブクローンされる。BIBACは、接合によ
りA.tumefaciensに伝達され得る。RK2 ori Tは、E.coliおよびRhizob
ium melilotiの染色体の接合伝達に作用するのに用いられている(Yakobson and
Guiney 1984)。従って、高分子量DNAのE.coliからA.tumefaciensへの接合
伝達は可能である。別法において、BIBACクローンは電気穿孔によりAgrob
acterium中に導入され得る。MozoおよびHooykaas(1991)は、250kbの大き
さのプラスミドを電気穿孔によりA.tumefaciens中に導入できることを報告して
いる。
植物形質転換におけるベクターの使用を容易にするためにBIBAC中に合体
される特徴は、A.tumefaciens T−DNA境界および植物選択マーカーである
。BIBACの境界を選択するのに2つの基準がある。1)植物形質転換をでき
るだけ効率的にすること 2)オクトピン型、ノパリン型および超病源型の病原
遺伝子を保持するA.tumefaciens disarmed Tiプラスミドと和合性のベクター
をつくること。
図2はBIBACの構築を示す。BIBACの左・右境界配列がオクトピン・
プラスミドpTiA6のTL−DNAから誘導される。右境界“オーバードライ
ブ(overdrive)”配列が存在する(Peralta et al.1986;van Haaren et al.19
87)。BIBAC中の境界は、コスミドpVK232にハイブリダイズしたプラ
イマーを用いて、PfuポリメラーゼPCRにより生成させられる(Knauf and N
ester 1982)。プラスミドpVK232は完全TiA6のTL−DNAを含有す
る(de Vos et al.1981;Barker et al.1983;Gielen et al.1984)。合成ポリリ
ンカーは、境界配列に結合し、植物選択マーカーの導入を容易にするために左・
右境界配列に隣接した唯一クローニング部位を提供するように設計されている。
これらは、図1においてMSR(マーカー部位右)およびMSL(マーカー部位
左)と称せられる。PCR生成境界およびポリリンカーは最初pUC19にクロ
ーン化された。
結果として、左・右境界およびポリリンカーは、pCH7中にSalIフラグ
メント上に保持される。ミニ−F pMBO131のSalI部位への、このフ
ラグメントの次のクローニングを容易にするのに用いられた。
sacB遺伝子は、E.coliのpcnB株を形質転換し、30℃で形質転換体
をインキュベートすることによりpCH7中にクローン化された。もしpUC型
プラスミドが30℃で増殖すると、そのコピー数は細胞当たり80から20に減
少する(Lin-Chao et al.1992)。pcnB(プラスミド・コピー数)突然変異は
、ColEl型プラスミドのコピー数を細胞当たり約20から約1に減少する(L
opilato et al.1986)。これらの条件は、望む構築体、pCH10を得るのに用
いられた。pCH10からのSalIフラグメントがpCH13をつくるために
ミニ−F中に導入されたとき、正のクローンがsacマーカーをスクリーニング
することにより容易に同定された。oriT/Ri起源フラグメントがpCH1
6をつくるために、ミニ−FのSalI端から35ヌクレオチドにあるユニーク
HpaI部位に導入された。予備的実験で、クロラムフェニコールがAgrobacte
riumのいくつかの株について有用なマーカーでなかったので、BIBACの骨格
を完成するために、カナマイシン耐性遺伝子カセット(Smith and Crouse 1989)
がミニ−FのクロラムフェニコールのPvuII部位中にクローン化された。
T−DNAの伝達は右境界に始まり、左境界の方向に進行するので、左境界の
近くに位置する植物選択マーカーの伝達は、全T−DNAの伝達の指標である。
従って、MSLに植物選択マーカーを有することが必須である。望むならば、第
2植物選択マーカーがMSLに導入される。いくつかの適用にとって、MSRで
のDsエレメントの導入は有用であろう。GUS−NPTII構築体(Datla et
al.1991)は、E.coli β−グルクロニダーゼ(GUS)とネオマイシン・ホス
フォトランスフェラーゼII(NPTII)間の2機能融合ペプチドである。この構
築体が植物内で発現されたとき、形質転換植物はネオマイシン耐性であり、GU
S遺伝子の発現について検定される(Jefferson et al.1987)。このGUS−N
PTII構築体はEco RI−HindIIIフラグメント上に保持される。
フラグメントをクレノウで処置し、BIBAC1をつくるために、MSL部位で
SrfI部位中に連結した。
他の植物選択マーカーを保持するいくつかのBIBACが構築されている。B
IBAC2はMSLでBAR−GUS構築体を保持する。BAR−GUS構築体
(Fromm et al.1990)は、殺草性ホスフィノスリチンに耐性を与えるホスフィノ
スリチン・アセチルトランスフェラーゼ(BAR)の遺伝子とGUS遺伝子との
間の2機能融合ペプチドである。GUS−NPTIIおよびBAR−GUS構築
体は、強力な二重CaMV35Sプロモーター(Kay et al.1987)およびノパリ
ン合成遺伝子から誘導される終了配列により推進される。さらに、AMV(アル
ファルファ・モザイク・ウイルス)エンハンサーがGUS−NPTII構築体中に
存在する。
もし2植物選択マーカーをBIBACベクター中に望むときは、2構築体のプ
ロモーターおよび転写終了配列は非相同的でなければならない。これは、安定性
を低下するであろうベクター中の配列重複を防ぐためである。このことは、何か
他の植物選択マーカーを合体するのを意図する場合には、考慮されるべきことで
ある。さらに、植物選択マーカーのいかなる対も、BIBACに向けられるべき
であり、そうして収斂的に転写されないで、この立体配置が形質転換発現を与え
る(Jones et al.1992)。BACにおいて、マーカーが200kbの植物ゲノム
DNAから分離されたら、このことは問題とならないようである。しかし、ベク
ターのみを用いた実験は弱点があろう。
BIBAC3は、MSRのGUS−NPTII構築体に加えてMSLにHYG
構築体を保持する。ハイグロマイシン・ホスフォトランスフェラーゼ(HYG)
構築体はハイグロマイシン耐性をもたらす(Becker,et al.1992)。HYG構築
体はノパリン合成プロモーターおよびpAg7からの終了配列を有する。他の植
物選択マーカーは、ユニーク・ポリリンカー部位の一つに容易に導入され得る。
勿論植物選択マーカーは、ライブラリークローニング部位を唯一に保つように、
BamHI部位を有してはならない。
実施例2BIBACベクターの試験
BIBAC1は最初の試験に用いられている。BIBAC1の物理地図が確立
され、ベクター単独(DNA挿入なしに)で期待したように機能する。これはE
.coliおよびA.tumefaciens中で複写し、T−DNAをタバコに伝達し得る。タ
バコおよびイースト異型DNAがBIBACベクターのBamHI部位中に挿入
されている。各々の得たクローン(ベクターおよび異型DNAを含む)は、電気
穿孔によりEscherichia coli株DH10B中に導入された。E.coli株DH10
Bはゲノムライブラリーの構築に広く用いられていており、BIBACクローン
の大部分について安定性は問題と考えられない。DH10B株は、mcrA,m
crB,mcrCおよびmrrなどの挿入体の安定性を増加するrecAIを含
む。これらは併用的にメチル化シトシンおよびアデニン残基を含むDNAの制限
を防止する。この株を用いて、多くメチル化された植物ゲノムDNAでもクロー
ン化するのに問題がないはずである。
三親型交配が得られたEscherichia coli、ヘルパープラスミドpRK207
3(ストレプトマイシン耐性を有す(Leong et al.1982))含有のEscherichia
coli、およびAgrobacterium tumefaciensで行われた。ベクターのAgrobacteri
um tumefaciensへの伝達後、タバコ植物が下記の実施例3の方法を用いて形質転
換された。
形質転換植物は、ディスアーム・超病源型Tiプラスミドを保持するAgrobac
terium株EHA105(Hood et al.1993)、オクトピン型ディスアームTiプラ
スミドを保持するLBA4404(Ooms et al.1982)、pMP90、ノパリン型
ディスアームTiプラスミドおよびA.tumefaciensのrecA株を保持するGV
3101(Koncz and Schell 1986)、およびpMP90で形質転換されたUIA
143(Farrand et al.1989)においてBIBAC1で得られている。
BIBAC1 T−DNAに唯一のフラグメントの存在についてPCRにより
スクリーニングしたBIBAC1形質転換植物については、最初の9植物すべて
が陽性であった。PCR法は、安定的に形質転換されたDNAを検出するのと同
様に葉の組織に結合して残っているA.tumefaciens菌も検出するであろう。PC
Rの結果を確認するために、これらの植物からのゲノムDNAは、プローブとし
てBIBAC1 T−DNAを用いてサザン解析の対象となる。
実施例3タバコ植物の形質転換
Agrobacterium株は、タバコ葉片のAgrobacteriumによる形質転換によって植
物体に導入された。形質転換植物はカナマイシン耐性についての選択により同定
された。推定形質転換植物はPCRでスクリーニングされた(Saiki 1988)。
Agrobacteriumによる形質転換について用いられた方法は、下記のようにHors
ch et al(1985)の修飾法である。
Agrobacteriumによる葉移植片形質転換
第1日
若い、健康な植物(Nicotiana tabacum(tobacco)Petit Havanaなど)から若
い葉を採取する。適当な量の大まかな見積もりとしては、1−2の標準な大きさ
のペトリ皿の底を覆うのに充分な表面積の葉を取得することである。
滅菌蒸留水の約400mlを含む器(ジャー)に、漂白液40ml、5%SD
S4mlを加えて、約0.05%SDSを得る。撹拌棒とすべての葉を容器に入
れる。蓋をして、葉を傷めないように速度を加減しながら20分間撹拌する。無
菌空調帽中で、無菌蒸留水400ml含有の容器に葉を移して水に浸す。葉を移
す際には無菌ピンセットを用いる。容器を穏やかに振って葉を渦巻く。5分後、
無菌蒸留水の第2容器に移す。さらに5分後、第3容器に移す。無菌空調帽中で
働く準備ができるまで、葉はこの最終容器に浸しておく。蓋はしたままである。
無菌空調帽中で次のことをする。細片を準備するために、葉を無菌ペトリ皿に移
し、皿中で、上下逆にする(すなわち下面を上に)。無菌ピンセットで主脈をつ
かみ、無菌の小ナイフを用いて各々の主脈に対し直立した葉をいくつもの薄い細
片に切断する。細片の幅は約5mmでなければならない。
別法として、無菌状態で無菌種子から生育した植物を直接、使用することがで
きる。
2再製プレートの各々の上に5細片を右側を上にして置く。これらを調整して
、抗生物質のない培地上で非接種の葉が再生成するかどうかを調べる。100×
20mmプレートを移植片に用いて、植物生育を可能にする。100×26mm
プレートも用いることができる(標準細菌プレートは100×15mm)。
3再生プレートを採り、移植片の前−培養に用いる。各プレートで15片を上
下逆に置く。いくつかの材料が汚染または危険な状態になり、さらに材料が必要
なときに前−培養する。
註:葉の材料を上下逆にあるいは右側を下に前−培養されているかどうかは実際
のところあまり問題でない。プロトコールは、上側が常に危険にさらされやすい
ので、上下逆を特定している。前−培養後に、接種すべきときに、損傷を受けた
低表面を有する葉細片すなわちディスクは容易に判明する。その葉の移植片は廃
棄する。
上記のように作製した移植片のプレートをパラフィルムで密封し、25−28
℃で光照射した培養器中に入れる(暗所で前−培養する研究者もある)。
第2日
電気穿孔したAgrobacteriumを含有する単−筋条LBkanプレートを取る。
2つの単−コロニーから、50μg/mlカナマイシン含有LB培地での5ml
−夜培養を始める。複製チューブの作成を繰り返す。30℃で振盪しながらイン
キュベートする。
第3日
カルベニシリンとカナマイシンまたはチミンチンとカナマイシンを含有する再
生培地の2プレートの各々の上に右側を上にして葉の5細片を置く。調整して、
なんらかの非接種組織が選択培地上にシュートを生育または形成していないかど
うかを調べる。
ある種の葉の細片は、右側を上に置いたときに、シュートをより生成する。従
って、再生プレート上に細片は右側を上にして置くように指示されている。
皿のまわりにパラフィルムをほどこす。
Agrobacterium 1:10の一夜培養物2mlをM50培地18mlと混合し
て希釈する。希釈液を無菌ペトリ皿に注ぐ。
明らかに損傷を受けているか、またはふくれていない葉細片は前−培養プレー
トから除く。健全な細片を希釈細菌培地に入れ、切断端が湿るように5秒以上ゆ
るやかに皿をまわす。
(注意)すべての傷つけた端が接種材料で湿るのに要する時間以上には葉組織の
培地中に放置しないこと。細菌の多い組織は難治性の感染を起こすことがある。
細菌培養から組織を取り出し、無菌のワットマンNo1フィルター紙上に置き
、いくらかの過剰の細菌培養物をなくする。次いで、2再生プレート上(抗生物
質なし)に10細片を上下逆に置く。
皿のまわりにパラフィルムをほどこし、皿の蓋側を上にしてインキュベートす
る。
(いくつかの研究所で、特に再生が難しい植物種についてはナース細胞培養物
を用いると助けになることが分かった。急速成長液体植物サスペンション培養物
1−1.5mlを再生プレートに加え、これを無菌ホワットマン#1フィルター
紙で完全に覆う。フィルター紙は細胞での移植片の汚染を防止する。次いで、細
片をフィルター紙の頂上に置く。タバコ・サスペンション培養細胞は、これ細胞
が2.4−Dを含有しない培地中で生育することから、しばしば用いられる。ナ
ース培養で用いたら2.4−Dは植物再生を阻害するであろう。)
第3日以後
葉細片および/またはディスクを、細菌を殺すためにカルベニシリン500u
g/mlまたはテメンチン100μg/mlおよびカナマイシン300ug/m
l含有の再生プレートに移し、カナマイシン耐性を表す形質転換細胞を選別する
。葉組織を培地上に右側上に置く。
さらに後に、
シュートが25−28℃で光照射生育室内で2−3週間して葉組織上に形成し
始める。2週間後、移植片をカルベニシリン(またはテメンチン)またはカナマ
イシンを有する新しい再生プレートに移す。
頻繁に皿の観測を続ける。カルス塊が生成したときに、それ(葉組織なしに)
をカルベニシリンおよびカナマイシンを有する新しい再生プレートに移す。
さらに約1−2週間後にシュートがカルス上に生成する。シュートがカルスか
ら切除するのに充分な大きさになったときに、切断して、カルベニシリンとカナ
マイシンまたはテメンチンとカナマイシンを有する根付け培地にシュートを移す
。カルスはなおいくらかのAgrobacteriumを含有していることもあるので、シュ
ートがカルスで汚染されるのを避けることが重要である。カナマイシンを減量ま
たは使用しないと根付け過程を促進することがある。
皿の観察を続ける。もしAgrobacteriumのなんらかの生育がみられたら、シュ
ートを直ちにカルベニシリンまたはテメンチンとカナマイシンを有する新しい根
付け培地に移す。もしAgrobacteriumの生育が少数のシュートに限定されておれ
ば、Agrobacteriumの過生育のみられないシュートのみを新しい培地に移し、古
い皿は破棄する。
根が形成された後、抗生物質のない根付培地を含有するMagentaボックスに小
植物を移す。
植物が4−5の葉をつけ、根が3−4cmになったときに、鉢に土植えができ
る。鉢植え時にアガールを根から除く。各々の新しく鉢植えした植物をプラスチ
ック・バッグに入れ、上部を縄で閉じる。徐々に(約2週間以上かけて)バッグ
を開くか、あるいは開口部が大きくなるようにバッグに切口を入れる。そしてバ
ッグを取り除く。
望ましい実施態様を詳細に図示し、記述したが、関連技術の当業者にとって、
種々の変更、追加、代替などを本発明の精神から離れることなしになし得ること
は明らかであろう。従って、それらは下記の請求項に定義する発明の範囲にある
ものと考えられる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.Escherichia coli宿主細胞中で単一コピーとして異型DNAを保持し得 る複製の第1起源、およびAgrobacterium tumefaciens宿主細胞中で単一コピー として異型DNAを保持し得る複製の第2起源を含む骨格、 異型DNAの挿入のための唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位、および 該唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位を両側からはさむ左および右のAgr obacterium T−DNA境界(該左および右のT−DNA境界配列は、該左およ び右のT−DNA境界配列の間に位置する異型DNAを植物細胞に挿入するのを 可能にする)を含むベクターである、異型DNAを植物細胞に伝達するためのベ クター。 2.該複製第1起源がEscherichia coliからのF起源を含む、請求項1のベ クター。 3.該複製第2起源がAgrobacterium rhizogenesからのRi起源を含む、請 求項1のベクター。 4.該複製第1起源がEscherichia coliからのF起源および該複製第2起源 がAgrobacterium rhizogenesからのRi起源を含む、請求項1のベクター。 5.該唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部分がBam HI解裂部位を含む 、請求項1のベクター。 6.該左および右のT−DNA境界配列がオクトピン・プラスミドpTiA6 のTL−DNAから誘導される、請求項1のベクター。 7.異型DNAを該ベクターに合体さすための選択マーカーをさらに含む、請 求項1のベクター。 8.該選択マーカーがsacB遺伝子を含み、その中で、異型DNAが該ベク ターの該唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位に挿入されたときに、該sac B遺伝子が不活性化される、請求項7のベクター。 9.該異型DNAをEscherichia coliに導入するための選択マーカーをさら に含む、請求項1のベクター。 10.該選択マーカーがカナマイシン耐性遺伝子である、請求項9のベクター 。 11.該異型DNAをAgrobacterium tumefaciensに導入するための選択マー カーをさらに含む、請求項1のベクター。 12.該選択マーカーがカナマイシン耐性遺伝子である、請求項11のベクタ ー。 13.該異型DNAを植物細胞中に導入するための選択マーカーをさらに含み 、該選択マーカーが該左および右のT−DNA境界配列の間に位置する、請求項 1のベクター。 14.該選択マーカーが該左のT−DNA境界配列に隣接して位置する、請求 項13のベクター。 15.該選択マーカーがカナマイシン耐性遺伝子を含む、請求項13のベクタ ー。 16.該カナマイシン耐性遺伝子がGUS−NPTII遺伝子を含む、請求項 15のベクター。 17.該選択マーカーがヒグロマイシン耐性遺伝子を含む、請求項13のベク ター。 18.該骨格が接合伝達の起源をさらに含む、請求項1のベクター。 19.該接合伝達の起源がプラスミドRK2からのoriT起源を含む、請求 項18のベクター。 20.請求項1のベクターで形質転換された宿主細胞。 21.該唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位に挿入された異型DNAをさ らに含む、請求項1のベクター。 22.請求項21のベクターで形質転換された宿主細胞。 23.該宿主細胞がEscherichia coliを含む、請求項22の宿主細胞。 24.該宿主細胞がAgrobacterium tumefaciensを含む、請求項22の宿主細 胞。 25.該宿主細胞が植物細胞を含む、請求項22の宿主細胞。 26.異型DNA遺伝子産生物をコードする該DNAを請求項1の該ベクター の唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位中に挿入し、 該異型DNAをEscherichia coli宿主細胞に導入するようにして、得たベク ターで該Escherichia coli宿主細胞を形質転換し、 該異型DNAをAgrobacterium tumefaciens宿主細胞に導入するようにして、 得たEscherichia coli細胞から分離されたベクターDNAで該Agrobacterium tumefaciens宿主細胞を形質転換し、 該異型DNAを植物細胞に導入するようにして、得たAgrobacterium tumefac iens細胞で該植物細胞を形質転換し、 該植物細胞中で該異型DNAによりコードされた遺伝子産生物を産生するよう に、該植物細胞中で該異型DNAを発現すること を含む方法である、植物細胞中に異型DNAを導入し、それにより植物細胞中 で遺伝子産生物を産生せしめる方法。 27.異型DAN遺伝子産生物をコードする該DNAを請求項1の該ベクター の唯一の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位中に挿入し、 該異型DNAを植物細胞に導入するようにして、得たベクターで該植物細胞を 形質転換し、 該植物細胞中で該異型DNAによりコードされた遺伝子産生物を産生するよう に、該植物細胞中で該異型DNAを発現すること を含む方法である、植物細胞中の遺伝子産生物を産生する方法。
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