JPH11500227A - 炭水化物不足トランスフェリンアッセイ - Google Patents
炭水化物不足トランスフェリンアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、トランスフェリン含有体液中の炭水化物不足トランスフェリンの評価方法を提供し、この方法は、i)上記体液のまたは上記体液から、トランスフェリン含有液体サンプルを得ること;ii)上記サンプルを鉄イオン源と接触させること;iii)続いて、上記サンプルをアニオン性イオン交換樹脂と、炭水化物不足トランスフェリンが該樹脂に保持されるような pH で接触させること;iv)続いて、上記樹脂を、炭水化物不足トランスフェリンを該樹脂から溶出液へ放出させるのに有用な溶離液と接触させること;v)テトラおよびペンタシアロトランスフェリンを実質的には含まない上記溶出液の容量を回収すること;および vi)上記溶出液の容量中のトランスフェリン変異体含量を評価することの工程を含む。上記溶出液に少なくとも一部のトリアシロトランスフェリンを含ませることにより、比較的単純な評価技術、例えば比濁法をアッセイに用いることが可能である。
Description
【発明の詳細な説明】
炭水化物不足トランスフェリンアッセイ
本発明は、炭水化物不足トランスフェリン(CDT)を評価するためのアッセイ
方法、およびこのアッセイを行うためのキットおよび装置に関する。
血清トランスフェリンは、80kD の分子量を有し、二つの N- 連結の多糖鎖を
有する一本のポリペプチド鎖からなる糖タンパクである。これらの多糖鎖は、分
岐状であり、かつ末端シアル酸残基を有する5つのアンテナで終わる。
Wong および Regoeczi は、Int.J.Peptide Res.9: 241-248(1977)において
、ヒトトランスフェリンは天然では不均一であり、シアル化の異なるレベルに伴
って変異体の形態で存在する。事実、6 種のこのような変異体、ペンタシアロ、
テトラシアロ、トリシアロ、ジシアロ、モノシアロおよびアシアロトランスフェ
リンが存在するようである。
正常な健康個体においては、テトラシアロ変異体が支配するように見える。し
かしながら、アシアロ、モノシアロ、ジシアロ、およびある程度まではトリシア
ロ変異体がアルコール中毒者の血液中に上昇したレベルで存在することが見出さ
れている (van Eijk et al の Clin Chim Acta 132: 167-171(1983)、Stibler
の Clin Chim 37: 2029-2037(1991)および Stibler et al の”Carbohydrate-
deficient transferrin(CDT)in serum as a marker of high alcohol consump
tion”,Advances in the Biosciences,(Ed Nordmann et al),Pergamon,1988
,Vol.71,pages 353-357参照)。
アシアロ、モノシアロ、ジシアロおよびトリシアロ変異体を、ここでは、炭水
化物不足トランスフェリンまたは CDT という。
CDT は、アルコール消費、特に慢性アルコール消費を検出およびモニタするた
めの有効なマーカーであることが見出されており、従来の試験(例えばGGT また
は MCV)とは異なり、肝臓病を伴う患者における高アルコール摂取のスクリーニ
ングのために使用できる。
結果として、CDT のための幾つかの診断アッセイが、特許および科学文献に記
載されている。
us-A-4626355(Joustra)において、Pharmacia AB はクロマトグラフィーアッ
セイを説明しており、このクロマトグラフィーでは、希薄血清サンプルを、カラ
ムおよびサンプルの pH およびイオン含量のバランスをとってアニオン性イオン
交換カラムに通し、アシアロ、モノシアロおよびジシアロ CDT を定組成処理に
て溶離させる一方、トリシアロおよび”正常な”テトラおよびペンタ変異体はカ
ラムに保持されるようにする。この溶出液の CDT 含量は、抗体を担持する固相
上での CDT および放射性標識トランスフェリンの競合的固定化により決定され
る。
”Rate nephelemetric determination of carbohydrate-deficient transferr
in”という表題の最近のポスターにおいて、Laboratoire de Biochimie CHU Tro
useau,Tours,Centre の Schellenberg 、Martin、Benard、Circaud および We
ill、La Membrolle sur Choisille の Louis Sevestre および Gagny,France
の Beckman France は、同様の定組成クロマトグラフィー分離を説明しており、
このクロマトグラフィーでは、希薄血清をアニオン性イオン交換カラムに通し、
正常なトランスフェリン変異体が保持され、CDT が溶離される。この溶出液をポ
リエチレングリコールと混合し、遠心分離し、抗-トランスフェリン抗体を上澄
みに加え、CDT 含量をネフェロメトリー(nephelometry)により評価する。
Heil et al は、Anaesthetist 43: 447-453(1994)において、CDT 測定のため
の更なる定組成クロマトグラフィー手法を報告した。彼らの手法では、希薄血清
サンプルをアニオン性イオン交換樹脂に通し、同様に正常なトランスフェリン変
異体を保持する一方、CDT の通過を可能にしている。この溶出液のCDT 含量は、
免疫比濁アッセイ(immunoturbidimetric assay)手法において CDT 濃度をラテ
ックス粒子で強調することにより決定される。
WO-91/19983(Sundrehagen)において、Axis Research AS は別の CDT アッセ
イを記載しており、このアッセイでは、希薄血清サンプル(この中でトランスフ
ェリン変異体は、全変異体と反応性の標識された(例えば蛍光物質標識)抗体ま
たは抗体フラグメントによって結合される)を、アニオン性イオン
交換樹脂に通し、溶出液の標識物濃度を溶出液フラクションの関数として決定(
例えば蛍光測定により)する。このアッセイは、異なる変異体:標識結合パート
ナー複合体では、溶離速度が異なることに基づいている。
上述のアッセイ手法の全ては、診断研究所で普通に用いられる多くの自動マル
チタスク診断装置に直接適用できない比較的に複雑な手順に基づくものである。
我々は、例えば Heil et al(上記)で要求されるようなシグナル増幅ステッ
プなしで、単純な測定技術、例えば比濁法(turbidimetry)の使用を可能にする
簡単な方法で CDT を評価できることを見出した。
従って、一つの観点からみて、本発明は、トランスフェリン含有体液中の炭水
化物不足トランスフェリンの評価方法を提供し、この方法は、
i) 上記体液または上記体液からトランスフェリン含有液体サンプルを得るこ
と;
ii) 上記サンプルを鉄イオン源と接触させること;
iii) 続いて、上記サンプルをアニオン性イオン交換樹脂と、炭水化物不足トラ
ンスフェリンが該樹脂に保持されるような pH で接触させること;
iv) 続いて、上記樹脂を、炭水化物不足トランスフェリンを該樹脂から溶出液
へ放出させるのに有用な溶離液と接触させること;
v) テトラおよびペンタシアロトランスフェリンを実質的に含まない上記溶出
液の容量を回収すること;および
vi) 上記溶出液の容量中のトランスフェリン変異体含量を評価することの工程
を含んでいる。
本発明のアッセイで用いられる体液は、例えば滑液または羊水のような全ての
トランスフェリン含有液であってよく;しかしながら、アルコール消費または濫
用の調査のためには、この液は一般的に血液である。この場合、液体サンプルは
無細胞であることが好ましい。血清または血漿のいずれか、すなわち血液由来の
トランスフェリンを含有する液体が好ましい。
トランスフェリン変異体が鉄イオン担持した場合、および樹脂に適用する前
に液体サンプルを鉄イオン源、例えば水性 Fe(III)溶液または微粉状の可溶性
鉄塩と接触させる場合、クロマトグラフィー技術が有効に作用する。一般的に、
この段階ではサンプルの不要な希釈を避けることが望ましいが、必須ではない。
サンプルの鉄処理は、サンプルの pH を CDT 変異体がイオン交換樹脂に保持さ
れるぐらい十分に高いレベルに調節するのに同時に用いてもよい。たとえ競合ア
ニオン、例えば血漿塩化物イオンの高い濃度がトランスフェリンの樹脂固定化を
低減させるように作用できるとしても、それでもなお、十分に高い pH において
CDT が樹脂に保持されることを見出した。用いられる特定のpH は、樹脂の性質
、サンプルの希釈、およびサンプル(またはサンプル担持前の樹脂)の競合アニ
オン含量に依存する。しかしながら、一般的には少なくとも 6.2、好ましくは 6
.5〜10、特に 6.8〜7.5 、例えば約 7.0 の pH が用いられる。従って、事実上
、pH およびイオン強度が一緒になって、CDT が樹脂に保持されるようにする。
好ましい見地において、10μL 〜2.5mL の血液サンプルは、4μL 〜1mL、好ま
しくは 50〜500 μL 、特に約 100〜200 μL の血漿または血清サンプルを提供
するために用いられ、これは例えば pH 7.0 の比較的低い競合アニオン含量緩衝
液を含有する鉄とインキュベートされる。この段階では、鉄含有緩衝液により容
積比で 1:8 まで、好ましくは 1:1〜1:5 、特に約 1:2 に希釈される。
緩衝剤、例えばトリス[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン]およびビス
-トリス[ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ-トリス(ヒドロキシメチル)メタン]
、および鉄イオン源(例えば FeCl3)の他に、緩衝液は pH 調節用の酸、例えば
HCl および鉄の安定剤、例えばクエン酸塩およびマレイン酸塩を含有すること
ができる。しかしながら、競合アニオン、例えば塩化物(またはシアニド、スル
フェートなど)の濃度は低く保つべきであり、このようなアニオンの鉄塩は、ト
ランスフェリンの鉄担持に要求される濃度を超えて大過剰に用いるべきではない
。
鉄イオン源とともに数分、例えば 2〜30分、好ましくは 5〜10分間インキュ
ベートされたサンプルは、次いでイオン交換樹脂に適用される。
この目的のために、帯電形態にある全てのアニオン性イオン交換樹脂を使用で
きる。好適なこのような材料は、三級および四級アミン樹脂、および特にSweden
の Pharmacia AB より入手可能な PBE94 、DEAE-Sepharose または Q-Sepharos
e および Perseptive Inc,USA より入手可能な Poros 50 HQなどの材料である
。速い流れの Q-Sepharose は、広い pH 範囲にわたり正に帯電するため、特に
好ましい。
一般的に樹脂は、均一にパックされたカラム中にあり、例えば与えられた樹脂
容積を装填し、放置して落ち着かせ、それから低圧で固められる。この樹脂の上
部には、樹脂を定位置に保持し、かつ、サンプルまたは溶離液の導入後に毛管力
により樹脂に空気が入るのを防ぐ役割を果たす多孔質要素、例えば不活性なナイ
ロンまたはポリエチレンのメッシュ、フィルターまたはフリットを置くことが好
ましい。このようにして、溶出液の容量は、添加される溶離液の容量により単純
に制御され、従って注意深く溶離液容量を制御すると、自動的に溶出液容量が制
御され、これにより、放出溶離液に関しては、所定の CDT が溶出液に放出され
たパーセントが制御される。カラムは、二つの多孔質要素、例えば多孔質フリッ
ト、例えば Atlanta,Ga,USA の Porex より入手可能なPorex フリットの間に
配置された樹脂を有することが好ましい。実際にはさらに、このようなカラムは
低イオン強度輸送緩衝液、例えば上述した鉄含有インキュベーション緩衝液と同
じ pH を有するビス-トリス緩衝液が予備担持されて提供されることが好ましい
。
用いられる樹脂容積は、樹脂に適用するサンプル容量並びに樹脂の性質に依存
する。サンプル中の実質的に全てのトランスフェリンを吸収するのに十分である
べきである。200 μL の血清サンプルについては、直径 5mm の管に充填された
1mL の樹脂で足りることが分かった。しかしながら、1.24 cm の樹脂を充填した
内径 7mm の管を用いることが好ましい。
サンプルを樹脂に適用する前に、先ず輸送緩衝液は流れ出るまま放置する。
サンプルの樹脂への適用に続いて、溶出液を捨てる。次いで、トランスフェリ
ン変異体が放出されない程度に十分に高い pH を有する低イオン強度溶離液(す
なわちアニオン、例えば樹脂への結合の際にトランスフェリン変異体と競合する
塩化物を比較的に含まないもの)、例えば pH 6.2 以上、好ましくは 6.25 〜 6
.5 のビス-トリスまたはトリス緩衝液で樹脂をフラッシュすることが好ましい。
このようにして、未結合の材料および血漿アニオンをカラムからフラッシュでき
る。1mL の樹脂カラムについては、0.3〜5mL、好ましくは2mL のフラッシュ容量
が都合良く用いられる。ここでも、溶出液は捨てられる。
それから樹脂を、例えばその低い pH および/または競合アニオン(例えば、
塩化物、シアニド、スルフェートなど)の高含量により、結合したトランスフェ
リンを放出するように作用する溶離液(放出溶離液)と接触させ、CDT 変異体を
含有する溶出液の容量を回収する。好ましいように、放出溶離液の pH およびイ
オン強度が”正常な”(テトラシアロおよびペンタシアロ)トランスフェリンを
放出するぐらいであるならば、回収された容量がこのような”正常な”トランス
フェリンを実質的に含まないようにするため、トランスフェリン放出を検定する
ことが重要である。これは、模範的なカラムにテトラシアロ-トランスフェリン
を担持させ、溶出液の容量フラクションを回収し、どのフラクションでテトラシ
アロ変異体が溶出し始めるかを決定することにより容易に行うことができる。従
って、用いられる放出溶離液の容量は、アシアロ、モノシアロおよびジシアロ、
および好ましくはトリシアロ変異体を溶出液中に存在させるが、”正常な”変異
体を実質的に含まない溶出液が得られるような容量に設定できる。樹脂が装填さ
れたカラムは、この手段により製造バッチ基準で検定すべきである。
放出溶離液は、検定されたマイクロピペットを用いて処理し、正確な容量が処
理されるのを保証することが好ましい。処理される容量は、望まれる(すなわち
検定)容量の好ましくは 3% 以内、より好ましくは 1〜2% 以内である。
放出溶離液および CDT 担持樹脂は、望まれる(検定)値の好ましくは 5℃以
内、例えば 25 ℃、より好ましくは 1℃以内の温度にあるべきである。
放出溶離液は、一般的に5.0 〜6.8 、好ましくは 5.5〜6.5 、特に好ましくは
5.9〜6.3 、とりわけ約 6.0 の pH を有する。放出溶離液の pH は、望まれる
値の好ましくは 0.03 pH 単位以内にあるべきである。溶離液もまた、好ましく
は緩衝されており、インキュベーションおよびフラッシュ溶離液におけるよりも
高い緩衝剤含量、例えば約 50mM ビス-トリスが一般的に好ましい。従って、放
出溶離液は、樹脂中で pH 傾斜(勾配)を生じさせ、トランスフェリン変異体を
溶出液に連続的に放出させ、これにより検定カラムに対してCDT フラクションを
選択することが可能になる。放出溶離液中の競合アニオン含量は、アニオンおよ
び樹脂の性質、そしてまた緩衝剤の性質および濃度に依存する。pH 調節用に用
いられる HCl に由来する塩化物に加えて、50mM ビス-トリスで緩衝された放出
溶離液については、1.5 〜25mM、特に 3〜15mM、より好ましくは 3〜10mM、とり
わけ 5〜7mM の塩化物含量(例えば NaCl として)を、都合良く用いることがで
きる。放出溶離液の塩化物含量は、望まれる値の好ましくは 1mM 以内であるべ
きである。
1mL の Q-Sepharose カラムの例として、50mM ビス-トリス、6mM NaCl、pH 6.
0 の放出溶離液 3mL により、CDT フラクションが 2mL の回収溶出液中に単離可
能であることが分かった。同様に、以下に記載する実施例5は、アシアロ〜トリ
シアロ変異体がどのようにして Poros 50 HQ から 3mL の回収溶出液中に溶出で
きるかを示す。
上述より、体液サンプル(例えば血液)から回収溶出液まで通過する際に体液
中の CDT 変異体の希釈度が比較的小さいことが明らかである。これは、本発明
の重要な特徴の一つである。従って例えば、500 μL の血液は 200μL の血清を
与えることができ、これから当然の順序で2000μL の CDT 含有溶出液が得られ
る。実際は、100 μL 程度に少ない血清で十分である。血清(または血漿)から
溶出液への容量希釈は、好ましくは 50:1 以下、特に好ましくは25:1 以下、と
りわけ 15:1 以下である。
CDT 変異体を含有する回収溶出液は、次いでCDT 含量について評価される。こ
れは、全ての標準的な免疫アッセイ技術、例えば ELISA または放射性免疫アッ
セイ技術によって行うことができる。しかしながら、本発明のアッセイ法の重要
な利点は、更なる分離工程を必要としないアッセイ法(例えばネフェロメトリー
)の使用を可能にすること、および特に CDT 含量の比濁法による決定を可能に
することである。これは重要である。なぜならば、一般的にネフェロメトリーは
比濁法よりも、体液サンプル中の不透明度生成に対する感度が高いプローブであ
るが、この技術は検出装置のために非線形光路を要求し、従ってサンプルを通過
する光路が線形である現存するマルチタスク吸光度測定ベースの診断アッセイ装
置内に含ませるように改造することが容易ではないためである。
比濁法またはネフェロメトリーのいずれかによる CDT 決定に関して、一般的
に不透明度は溶出液を抗-トランスフェリン抗体または抗体フラグメント、例え
ば Copenhagen,Denmark の Deko より市販されているようなウサギ抗-ヒトトラ
ンスフェリン抗体と接触させることで生成される。Deko 抗体は、トランスフェ
リンに特異的であり、溶出液に存在することのある他の血液タンパクとは交差反
応を示さない。用いられる抗体量は、不透明度がフック効果から生じ、これによ
り複数のトランスフェリン結合が不透明化中心を生成するため、トランスフェリ
ン含有の標準サンプルに対して最適化されるべきことはもちろんである。
ルーチンの比濁法およびネフェロメトリーアッセイとしては、重合体状不透明
強調剤、例えばポリエチレングリコールなどを溶出液に添加することが好ましい
。
このような測定技術を用いて CDT 含量の決定を行う際に、動力学的な読み取
りモードを用いることができるのはもちろんである。
ネフェロメトリーまたは比濁法で測定を行う前に、溶出液、抗体および強調剤
を短時間、例えば 5分〜 1時間、好ましくは約 10 分間インキュベートすべきで
ある。
不透明度の決定に用いられる光は、適当な波長を有するべきである。この点に
関し、我々は、405nm フィルターまたはより好ましくは 340nm フィルターの使
用が特によい結果を与えることを見出した。
一般的に、評価されるサンプルの他に、既知のトランスフェリン含量の検量サ
ンプルも、本発明のアッセイ法を行う際に評価される。このような決定は、検量
曲線をプロットするために用いることができ、これから、評価されるサンプルの
CDT 含量を決定できる。トランスフェリン含量が 0.05mg/mL まで(例えば、0.0
02、0.01、0.02 および 0.03mg/ml)である検量サンプルを用いることが好ましい
。(これらでは、樹脂カラムを通しての”正常な”変異体の除去が行われないの
はもちろんである。)
さらに、本発明のアッセイ法において、サンプルの全トランスフェリン含量は
、例えばクロマトグラフィーにかけない希釈アリコートを用い、同じアッセイ手
順(すなわち比濁法など)を用いて決定することが好ましい。このようにして、
CDT 含量は、全トランスフェリンのパーセント(%CDT)として求められる。%CDT
は、全 CDT よりも正確なアルコール消費のマーカーであり、6%は閾値を表す。
更なる観点から見ると、本発明は、本発明に係る診断アッセイ用のキットを提
供し、このキットは:
pH が少なくとも 6.2、好ましくは約 7.0 である鉄イオンを含有する緩衝され
たインキュベーション溶液;
好ましくは、既知濃度のトランスフェリン溶液、およびより好ましくはある範
囲のトランスフェリン濃度を有するこのような溶液のセット;
サンプル導入部および溶出液除去部を有する容器に充填されたアニオン性イオ
ン交換樹脂;
好ましくは、上記樹脂よりトランスフェリンを放出させるには不十分な pH お
よびイオン強度を有するフラッシュ溶離液;
上記樹脂よりトランスフェリンを放出させるのに十分な pH およびイオン強度
を有する放出溶離液;
好ましくは、光透過性の溶出液受器;
好ましくは、抗-トランスフェリン抗体または抗体フラグメント;および
好ましくは、不透明度強調剤を備えている。
一つの特に好ましいキットは、単にインキュベーション溶液、樹脂(その容器
中)、フラッシュ溶離液および放出溶離液を備えている。
望まれるならば、トランスフェリン含有体液サンプルを受け、それを鉄含有イ
ンキュベーション溶液とインキュベートし、インキュベートされた溶液をアニオ
ン性イオン交換樹脂に適用し、所望により樹脂をフラッシュし、放出溶離液を適
用し、CDT 含有溶出液を回収し、不透明化抗-トランスフェリン抗体または抗体
フラグメントを適用し、そして溶出液中の CDT 含量を測定するための自動装置
を構成することができる。このような装置も、本発明の範囲に含まれるものと見
なされる。
従来は、トリシアロトランスフェリン変異体がアルコール消費または濫用の指
標となるか否かについて疑問視されてきた。一方では、Van Eijk et al は、彼
らの 1983 年の論文”The microheterogeneity of human transferrins in biol
ogical fluids”in Clin.Chim.Acta 132: 167-171(1983)において、”アル
コール中毒者ではジシアロトランスフェリンの濃度が高いことが既に報告されて
いるが、・・・CIE[crossed immunoelectric focussing]法により、トリ-、モ
ノ-およびアシアロトランスフェリンのバンドも上昇したことを明らかにした”
と主張した。しかしながら他方では、Pharmacia AB は、彼らの特許 US-A-46263
55(Joustra)において、アシアロ、モノシアロおよびジシアロ変異体をトリシ
アロ、テトラシアロおよびペンタシアロ変異体から定組成クロマトグラフィーに
より分離する方法を記載しており、アルコール消費が高い場合にアシアロ、モノ
シアロおよびジシアロ変異体が上昇したレベルで生じるという知見を得ているが
、”過剰のアルコール消費に関しては何の臨床上の関連性を有さない他のイソト
ランスフェリンは、ペンタシアロ、テトラシアロおよびトリシアロトランスフェ
リンである”と主張している。
より最近の Biolin Medical の特許出願 WO95/04932 でさえも、同様にアシ
アロ、モノシアロおよびジシアロトランスフェリンのみがアルコール中毒のため
のマーカーであることを指摘した。
結果として、以前は、大きな重要性が体液中のトリシアロトランスフェリン含
量と結び付けられなかったことは明らかである。
我々は、トリシアロトランスフェリン含量が、たとえ他の CDT 変異体が存在
しなくても、アルコール中毒の強い指標となること、および他の CDT 変異体と
組み合わせると、アルコール中毒者と非飲酒者または社交的飲酒者との間で、ア
シアロ、モノシアロおよびジシアロ変異体のみのアッセイにより可能であるより
も著しく明らかな相違が得られることを見出した。
幾らかまたは全てのトリシアロトランスフェリンを評価される CDT フラクシ
ョンに含ませることで、先行技術より単純で操作がより迅速だが本質的にあまり
正確ではないアッセイ技術(例えば比濁法など)を用いることが可能であり、そ
れでもなお、同様に良好なまたはより向上した信頼値を有する結果が達成される
。
従って、更なる観点から見ると、本発明は、アルコール消費のアッセイ方法を
提供し、この方法は、血液由来の体液サンプルを、そのデシアロトランスフェリ
ン含量について評価することを含み、上記デシアロトランスフェリンがトリシア
ロトランスフェリン、および所望により、かつ好ましくは1以上のジシアロ、モ
ノシアロおよびアシアロトランスフェリン、特に好ましくはこれら3つ全部を含
むことを特徴としている。
この方法において、評価されたデシアロトランスフェリン含量は、好ましくは
全トランスフェリン含量のパーセントとして(例えば %CDT として)決定され、
評価されたデシアロトランスフェリンが、アシアロ、モノシアロおよびジシアロ
、および 50% のトリシアロ変異体からなる場合に、6% はアルコール中毒の指標
である閾値と見なされる。
あるいは、本発明は、アルコール消費のためのアッセイ方法を提供し、この方
法は、
体液のまたは体液由来の、かつ、テトラ-およびペンタシアロトランスフェ
リンを含有する第一のトランスフェリン含有液体サンプルを得ること;
上記第一のサンプルから、例えばカラムからの溶出により第二のトランスフェ
リン含有液体サンプルを得ること、ここで該第二のサンプルはテトラ-およびペ
ンタシアロトランスフェリンを実質的に含まず、かつ、少なくとも 1mg/L、好ま
しくは 2mg/L のトランスフェリン含量を有し;および
上記第二のサンプルのトランスフェリン含量を比濁法により評価することを含
む。
特に我々は、トリシアロトランスフェリンをアッセイ中に含ませることで、ア
ルコール中毒者と他の肝臓疾患を持つ人々との区別が向上することを見出した。
これらの方法において、デシアロトランスフェリンは、好ましくは全トランス
フェリンのパーセントとして評価される。これより好ましくないが、実際の濃度
(すなわち単位容積当りの質量)として評価することもできる。用いられるアッ
セイ技術は、全ての便利な技術であってよいが、ここで記載された技術、あるい
は US-A-4626355 、WO91/19983、WO95/04932、Schellenberg et al(上記)また
は Heil et al(上記)に記載された技術が特に好ましい。
本発明の方法において、好ましくは低シアル化アシアロトランスフェリンと、
特に1以上、とりわけアシアロ、モノシアロおよびジシアロトランスフェリンの
3 つ全部と組み合わせた、トリシアロトランスフェリンのフラクションのみ(
主フラクション、例えば25〜95% 、好ましくは30〜70% 、特に40〜60% およびと
りわけ好ましくは約50% ではあるが)を評価することが特に好ましい。
このトリシアロ変異体の部分的評価は、本発明の方法において、トリシアロ変
異体の必要なフラクションのみを溶出液に放出させる放出溶離液の容量を選択す
ることにより、容易に達成することができる。装置は、どの容量の放出溶離液が
トリシアロ変異体の望まれるフラクショを放出するのに必要とされるかを決定す
るために、ここで記載したように容易に検量することができる。
トリシアロ変異体の主フラクションを評価するこの方法は、特に有利である。
なぜならば、テトラシアロ変異体による潜在的な汚染を回避するからであり
(ここで挙げたタイプのミニカラムは一般的に HPLC より低い分解能を有するの
で)、一般的にトリシアロ変異体より著しく存在量が少ない低脱シアル化変異体
に対してアッセイの感度を更に高くするからである。
本発明を、以下の実施例および添付した図面を参照してさらに詳しく説明する
。
図1は、405nm での吸収をトランスフェリン含量の関数として示す典型的な比
濁法の検量曲線である。
図2、3および5は、非アルコール中毒者または完全禁酒者(NA またはTA)、
社交的飲酒者(SD)、アルコール中毒者(AL)および妊娠女性(PW)に関する %CD
T としての試験結果を示すグラフであり、これらの図において0-2-s Trf または
2シアロは、評価した CDT がアシアロ、モノシアロおよびジシアロ変異体を含
むことを示し、0-3-s Trf または2 シアロ +100% 3-s は、評価した CDT がトリ
シアロ変異体も含むことを示す。
図4は、450nm で測定されたジシアロ、トリシアロ、テトラシアロおよびペン
タシアロ変異体のピークを示す HPLC クロマトグラムである。
図6は、本発明により試験した 18 サンプルに関する結果の比較を示すグラフ
であり、アシアロ、モノシアロ、ジシアロおよび 50% トリシアロ変異体を評価
し、また HPLCにより同様に試験して評価した。
図7は、本発明の方法において使用できるミニカラムの概略断面図である。実施例1 アッセイキット 装 置
−試験管(ナイロントップフィルタで覆われた1 mL Q-セファロース(Phar
macia)を含む5 mm径)
−4 μl〜3 mlのピペット
または:体積 100μl、200μl、2ml および 3 ml 用マルチピペット
−ラック(試験管用75 X 12mm)
−マイクロタイタープレート
−マイクロタイタープレート用リーダー(405nm フィルタ)試 薬
溶液A:
10mM ビストリス(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノトリス(ヒドロキ
シメチル)メタン)
1.5mM アジ化ナトリウム
0.05% Tween 20
1 M HCl ad pH 7.0
0.4mM トリス塩基(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)
0.075mM FeCl3
0.075mM クエン酸ナトリウム
0.2mM マレイン酸
脱イオンH2O q.s.
溶液B:
10mM ビストリス(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノトリス(ヒドロキ
シメチル)メタン)
3.1mM アジ化ナトリウム
0.1% Tween 20
1 M HCl ad pH 6.25
脱イオンH2O q.s.
溶液C:
50mM ビストリス(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノトリス(ヒドロキ
シメチル)メタン)
3.1mM アジ化ナトリウム
0.05% Tween 20
1 M HCl ad pH 6.00
15mM NaCl 添加
脱イオンH2O q.s.
ヒト正常血清(検定用)2.17 mg/ml トランスフェリンを含む
比濁試薬
900 μl 0.1 M PEG-PBS pH 8.2
100 μl ウサギ抗-ヒトトランスフェリン(Dako)
0.1 M PEG-PBS pH 8.2は以下の成分からなる:
91.8mM リン酸水素二ナトリウム
8.3mM リン酸二水素ナトリウム*2H2O
3.1mM ポリエチレングリコール
3.1mM アジ化ナトリウム
2 M NaOH ad pH 8.2
脱イオンH2O q.s. 実施例2 他のアッセイキット 装 置
−カラム(ナイロントップフィルタで覆われた 0.5 mL Poros 50 HQ(Perse
ptive Inc.USA)を含む 5 mm 径)
−4 μl〜3 ml のピペット
または:体積 100μl、200μl、2 ml および 3 ml 用マルチピペット
−ラック(試験管用75X12mm)
−マイクロタイタープレート
−マイクロタイタープレート用リーダー(405nm フィルタ)試 薬
溶液A:
10mM ビストリス(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノトリス(ヒドロキ
シメチル)メタン)
1.5mM アジ化ナトリウム
0.05% Tween 20
1 M HCl ad pH 7.0
0.4mM トリス塩基(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)
0.15mM FeCl3
0.15mMクエン酸ナトリウム
0.4mM マレイン酸
脱イオンH2O q.s.
溶液B:
10mM ビストリス(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノトリス(ヒドロキ
シメチル)メタン)
3.1mM アジ化ナトリウム
0.1% Tween 20
1 M HCl ad pH 6.25
脱イオンH2O q.s.
溶液C:
50mM ビストリス(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノトリス(ヒドロキ
シメチル)メタン)
3.1mM アジ化ナトリウム
0.05% Tween 20
1 M HCl ad pH 6.00
15mM NaCl 添加
脱イオンH2O q.s.
ヒト正常血清(検定用)2.17 mg/ml トランスフェリンを含む
比濁試薬
900 μl 0.1 M PEG-PBS pH 8.2
100 μl ウサギ抗-ヒトトランスフェリン(Dako)
0.1 M PEG-PBS pH 8.2は以下の成分からなる:
91.8mM リン酸水素二ナトリウム
8.3mM リン酸二水素ナトリウム*2H2O
3.1mM ポリエチレングリコール
3.1mM アジ化ナトリウム
2 M NaOH ad pH 8.2
脱イオンH2O q.s. 実施例3 検定用試料およびカラムの調製
ヒト正常血清を用いて4個の検定用試料を調製する。希釈に関しては表1参照
カラムの調製
試験すべきサンプル各々に付き1個のカラムを用いる。最初に上部ストッパ、
次に底部ストッパを取外して余分の移動用緩衝液を溶離させ、この溶離液を廃棄
する。調製されたカラムは、2時間以内に使用しなければならない。実施例4 サンプル試験手順
−サンプル手順
1.試験管中にて、400 μl の溶液A(実施例1のもの)に、200μlの
血清を加える。混合する。
2.室温にて 5〜10 分間インキュベートする。
−カラム分離
1.加えられた全ての溶液はカラムから自由に溶離させなければならな
い。
2.500 μl のインキュベートしたサンプルをカラムに加える。
3.2.1ml の溶液Bを加える前に、トップフィルタ中にサンプルを沈ま
せる。
4.溶液Bをトップフィルタに沈ませる。カラムの下の試験管を交換す
る。この時点までに溶離した溶液は廃棄しなければならない。3ml の溶液C(実
施例1のもの)を各カラムに添加する。2ml の溶出液Cを収集する。
−測定
1.100 μl の各検定用試料、および 100μl のカラム分離からの溶出
液Cをマイクロタイタープレートの分離ウェルに加える。
2.各ウェルに 100μl の比濁試薬を加える。
3.室温にて 10 分間インキュベートする。
4.405nm フィルターを備えたリーダーを用いて結果を読み取る。
5.非線形回帰を用い検量曲線を確定する。図1は典型的な検量曲線を
示す。
6.血清サンプル中の CDT を検量曲線から計算する。実施例5 サンプル試験手順
−サンプル手順
1.試験管中にて、200μl の溶液A(実施例2のもの)に、100μlの
血清を加える。混合する。
2.室温にて5 〜10分間インキュベートする。
−カラム分離
1.加えられた全ての溶液はカラムから自由に溶離させなければならな
い。
2.200 μl のインキュベートしたサンプルをカラムに加える。
3.1.0ml の溶液Bを加える前に、トップフィルタ中にサンプルを沈ま
せる。
4.溶液Bをトップフィルタに沈ませる。カラムの下の試験管を交換す
る。この時点までに溶離した溶液は廃棄しなければならない。3ml の溶液C(実
施例2のもの)を各カラムに添加する。3ml の溶出液Cを収集する。
−測定
1.100 μl の各検定用試料、および 100μl のカラム分離からの溶出
液Cをマイクロタイタープレートの分離ウェルに加える。
2.各ウェルに100μl の比濁試薬を加える。
3.室温にて 10 分間インキュベートする。
4.405nm フィルターを備えたリーダーを用いて結果を読み取る。
5.非線形回帰を用い検量曲線を確定する。図1は典型的な検量曲線を
示す。
6.血清サンプル中の CDT を検量曲線から計算する。実施例6 アシアロ、モノシアロ、ジシアロおよびトリシアロトランスフェリンに付いての アッセイに対するアシアロ、モノシアロおよびジシアロトランスフェリンに付い てのアッセイの比較
3つのテストグループからの血清サンプルを、WO 95/04932 で説明されたHPLC
技術を用いて、アシアロ、モノシアロ、ジシアロおよびトリシアロトランスフ
ェリンに付いて分析した。以下の表2および図2に示された結果は、アシアロ+
モノシアロ+ジシアロ(0-2 sTr)含有量およびアシアロ+モノシアロ+ジシア
ロ+トリシアロ(0-3 sTr)含有量を全トランスフェリンのパーセントを表して
いる。表2は、それ独自で得られたトリシアロトランスフェリンパーセント含有
量も含んでいる(3 sTr)。
第一グループは、非飲酒者(ND)であり、如何なるアルコール摂取も拒否す
る 12 人であった。26 人の第二グループは、社交的飲酒者(SD)であった。標
準的な日々の基準において >60g のアルコールを摂取する 24 人を第三グループ
(アルコール中毒者(A))とした。
実施例7 他のアッセイキット 装 置
−カラム(ナイロントップフィルタで覆われた 0.5 mL POROS HQ50(Persep
tive Inc.USA)を含む 5 mm 径)
−4 μl〜3 ml のピペット
または:体積 100μl、200 μl、2 ml および 3 ml 用マルチピペット
−ラック(試験管用 75 X 12mm)
−マイクロタイタープレート
−マイクロタイタープレート用リーダー(405nm フィルタ)試 薬
溶液1
10mM ビストリス(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノトリス(ヒドロキ
シメチル)メタン)
3.1mM アジ化ナトリウム
0.05% Tween 20
1 M HCl ad pH 7.0
0.4mM トリス塩基(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)
0.075mM FeCl3
0.075mM クエン酸ナトリウム
0.2mM マレイン酸
脱イオンH2O q.s.
溶液2
50mM ビストリス(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノトリス(ヒドロキ
シメチル)メタン)
3.1mM アジ化ナトリウム
0.05% Tween 20
1 M HCl ad pH 6.00
約5 mM NaCl 添加
脱イオンH2O q.s.
ヒト正常血清(検定用)2.17mg/mlトランスフェリンを含む
比濁試薬
900 μl 0.1 M PEG-PBS pH 8.2
100 μl ウサギ抗- ヒトトランスフェリン(Dako)
0.1 M PEG-PBS pH 8.2 は以下の成分からなる:
91.8mM リン酸水素二ナトリウム
8.3mM リン酸二水素ナトリウム*2H2O
3.1mM ポリエチレングリコール
3.1mM アジ化ナトリウム
2 M NaOH ad pH 8.2
脱イオンH2O q.s. 実施例8 検定用試料およびカラムの調製
ヒト正常血清を用いて4個の検定用試料を調製する。希釈に関しては表3参照
カラムの調製
試験すべきサンプル各々に付き1個のカラムを用いる。最初に上部ストッパ、
次に底部ストッパを取外して余分の移動用緩衝液を溶離させ、この溶出液を廃棄
する。調製されたカラムは、2時間以内に使用しなければならない。実施例9 サンプル試験手順
−サンプル手順
1.試験管中にて、500 μl の溶液1に、200 μl の血清を加える。混
合する。
2.室温にて 5〜10 分間インキュベートする。
−カラム分離
1.加えられた全ての溶液はカラムから自由に溶離させなければならな
い。
2.500 μl のインキュベートしたサンプルをカラムに加える。
3.1.0ml の溶液2を加える前に、トップフィルタ中にサンプルを沈ま
せる。
4.溶液2をトップフィルタに沈ませる。カラムの下の試験管を交換す
る。この時点までに溶離した溶液は廃棄しなければならない。2.0ml の溶液2を
各カラムに添加する。2ml の溶出液2を収集する。
−測定
1.200 μl の各検定用試料、および 200μl のカラム分離からの溶
出液2をマイクロタイタープレートの分離ウェルに加える。405nm で読み取る。
2.各ウェルに 100μl の比濁試薬を加える。
3.室温にて 15 分間インキュベートする。
4.405nm フィルターを備えたリーダーを用いて結果を読み取り、工程
1で計算されたバックグラウンドを減ずる。
5.非線形回帰を用い検量曲線を確定する。図1は典型的な検量曲線を
示す。
6.血清サンプル中の CDT を検量曲線から計算する。実施例10
完全禁酒者(TA)、健康な社交的飲酒者(SD)(アルコール消費量 60g/日未
満)および重度飲酒者(AL)(アルコール消費量 60g/日を超える)からの血清
サンプルを、実施例9の方法で試験した。アシアロ、モノシアロ、ジシアロおよ
び 50% トリシアロトランスフェリンを CDT のパーセントで表した結果は、図3
に示される。これらの結果は、HPLC によって得られた結果(図6参照)と良好
な相関関係を示し、社交的飲酒者と重度飲酒者とをよく区別した。また、完全禁
酒者と社交的飲酒者との間にも、%CDT においてやや違いがあった。PW カテゴリ
ーは、全ての方法で擬似陽性が見られる妊娠女性のためのものであった。
一般的には、男性に付いての 6% CDT の参考限界は、アルコール乱用を区別す
るために効果的であることが判る。実施例11 HPLC 分離
血清サンプルは、重度の飲酒習慣により病院に収容された 17 人のアルコール
中毒患者からのものであり、全てが入院の時近くまで飲酒を行なっていた。さら
に、穏やかなアルコール消費習慣(平均的な基準で <60 g/日)を有する
健康な 25 人(社交的飲酒者)から血清をサンプリングした。さらに、9人の完
全禁酒者からの血清サンプルを収集した。
120 μl の血清サンプルを、24μl のマレイン酸- クエン酸 Fe(III)塩(9.25
mM)溶液で、鉄飽和のために予備処理した。その後、100mg デキストラン/ml 水
の溶液 1.3μl および CaCl2 147 mg/ml 水の溶液 16 μl を、120μl 血清毎に
加えた。
サンプルを1時間冷蔵庫内に保存した後に遠心し、上澄み液 100μl を水で2.
15 ml に希釈し、次いでクロマトグラフィーのために、2.0ml を POROSHQ10(Pe
rseptive Inc.,USA)カラム(0.5 cm X 0.5cm)に供給した。
トランスフェリン変異体は、20mM Bis-Tris pH=6.1 緩衝液システムにおける
Cl--濃度勾配を用いて溶離させた。トランスフェリンの異なる変異体からの 450
nm 吸収信号を記録し、各変異体の量比をピーク積算によって計算した。
各サンプルの診療情報は、アシアロ、モノシアロおよびジシアロトランスフェ
リンの全量の量比(%CDT)と相関関係を示した。
図4は、450nm での HPLC カラムからの溶離パターンを示す。点線は、Cl-濃
度勾配である。電荷の違いにより、低シアル酸含有トランスフェリン変異体が最
初に溶離する。増加する Cl- 濃度勾配によって、より高シアル酸含有のトラン
スフェリン分子が溶離する。
トランスフェリンの異なるフラクションにおける、トランスフェリン含有量比
を積算および定量した後、HPLC クロマトグラムからの値を、%CDT として計算し
、この値には 3-シアロトランスフェリンフラクションの異なる量比(30%、60%
および 100%)を含めた。図5は、飲酒習慣サブグループに対し
て相関関係にある、3-シアロトランスフェリンフラクションの異なる量比を含む
ことの効果を示している。3-シアロトランスフェリンフラクションを含めた場合
には、非飲酒者とアルコール中毒患者との間のより明確な区別が達成でき、アッ
セイのより良好な感度および特異性を与えた。実施例12
(ベストモード)他のアッセイキット 装 置
−カラム(内径 7mm)、ポリエチレン上部および下部多孔質フリット(Porex、
Atlanta,Ga,USA)間に 0.5 mL POROS HQ50(Perseptive Biosystems を含む、
カラムは Pierce Company,USA から入手可能
−実施例8と同様に調製した4つの検定用試料
−4 μl〜3 ml のピペット
または:体積 100μl、200 μl、2 ml および 3 ml 用マルチピペット
−ラック(試験管用 75 X 12mm)
−マイクロタイタープレート
−マイクロタイタープレート用リーダー(405nm フィルタ)試 薬
溶液1
10mM ビストリス(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノトリス(ヒドロキ
シメチル)メタン)
3.1mM アジ化ナトリウム
0.05% Tween 20
1 M HCl ad pH 7.0
0.8mM トリス塩基(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)
0.15mM FeCl3
0.15mM クエン酸ナトリウム
0.4mM マレイン酸
脱イオンH2O q.s.
溶液2
50mM ビストリス(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノトリス(ヒドロキ
シチル)メタン)
3.1mM アジ化ナトリウム
0.05% Tween 20
1 M HCl ad pH 6.00
約5 mM NaCl 添加
脱イオンH2O q.s.
比濁試薬
900 μl 0.3M Tris/PEG pH 7.4
100 μl ウサギ抗-血清トランスフェリン(Dako)
0.3 M Tris/PEG pH 7.4 は以下の成分からなる:
0.3M Tris.HCl
6% ポリエチレングリコール(PEG 8000)
3.1mM アジ化ナトリウム
2M NaOH ad pH 7.4
脱イオンH2O q.s.
図7を参照して説明すると、ここには 7mm 内径カラム1が示されており、こ
のカラムは、サンプル導入口2および溶出液口3を備え、多孔性フリット5およ
び6の間に配置された 1.24cm 樹脂4を含んでいる。
カラムの調製
試験すべきサンプル各々に付き1個のカラムを用いる。最初に上部ストッパ、
次に底部ストッパを取外して余分の移動用緩衝液を溶離させ、この溶出液を廃棄
する。調製されたカラムは、2時間以内に使用しなければならない。サンプル試験手順
−サンプル手順
1.試験管中にて、500 μl の溶液1に、100 μl の血清を加える。混
合する。
2.室温にて 5〜10 分間インキュベートする。
−カラム分離
1.加えられた全ての溶液はカラムから自由に溶離させなければならな
い。
2.500 μl のインキュベートしたサンプルをカラムに加える。
3.1.0ml の溶液2を加える前に、トップフィルタ中にサンプルを沈ま
せる。
4.溶液2をトップフィルタに沈ませる。カラムの下の試験管を交換す
る。この時点までに溶離した溶液は廃棄しなければならない。2.0ml の溶液2を
各カラムに添加する。2ml の溶出液2を収集する。
−測定
1.200 μl の各検定用試料、および 200μl のカラム分離からの溶出
液2をマイクロタイタープレートの分離ウェルに加える。405nmで読み取る。
2.各ウェルに100μl の比濁試薬を加える。
3.室温にて 15 分間インキュベートする。
4.405nm フィルターを備えたリーダーを用いて結果を読み取り、工程
1で計算されたバックグラウンドを減ずる。
5.非線形回帰を用い検量曲線を確定する。図1は典型的な検量曲線を
示す。
6.血清サンプル中の CDT を検量曲線から計算する。
−%CDT 決定
1.上記「サンプル手順」からのインキュベートされたサンプルから50
μL を取り、2 mL の溶液2に加える。
2.得られた混合物から 100μl を取り、マイクロタイタープレートの
ウェルに加え、上記「測定」の工程1〜6のように測定し、全トランスフェリン
(TT)値を得る。
3.%CDT を、[9.76(CDT/TT)-1.73](ここで、CDT および TT は、CDT
および TT 各々の測定値である)として計算する。実施例13
社会飲酒者(SD)および重度飲酒者(AL)からの血清サンプルを、実施例12の
方法を用いて、HPLC および従来の特別 IEF システム(等電点電気泳動/レーザ
デンシオメトリー法)と比較することにより、試験した。
HPLC 分析は以下のとおりである:
装 置:
分析 HPLC 分離を、Parmacia Biotech(Uppsla,Sweden)からの標準 FPLC シ
ステムを用いて行なった。
UV-M 検出器のモニター波長は、水銀光学を用いた 5 mm パスレングスフロー
セルで、0.001 Åのフルスケール感度において、450nm であった。Pharmacia HR
5/5カラム(50 mm × 5mm i.d.)を、最終ゲル高さ 60mm ま
で、Poros HQ 10(Persptive Biosystems)の 10 μm 粒子で高流速充填(7-9ml
/min)した。
カラムを室温(20〜25℃)で操作した。
データ/ピーク評価は、Nelson datamodule を用いて行なった。各クロマトグ
ラムは、手動的方法により、ベースライン積分された。
試 薬:
分析試薬級化合物を用いた。水性溶液は Milli-Q システム(Millipore,Mitf
ord MA)からの超純水を用いて調製した。全ての緩衝液/溶液は、0.22μm(孔
サイズ)フィルタを通してろ過し、使用前に超音波によって脱気した。
FeCl3 6 H2o、NaCl、クエン酸三ナトリウム二水和物、HCl(Titrisol,1N)お
よび MeOH を Merck(Darmstadt,F.R.G.)から購入した。デキストランサルフ
ェートおよび bis-tris は Fluka(Buchs,Switzerland)から購入した。Trizma
-塩基、マレイン酸および CaCl2 は、Sigma(St.Louis,MO)から購入した。
サンプル調製:
血清アリコートは、分析前に -20 ℃で3ヵ月未満の間貯蔵した。
室温にて解凍した血清の 150μl アリコートを、30μl の 9.25 mM FeCl3-tri
s-マレイン酸溶液と、簡単に振盪混合した後、試験管にキャップをし、次いで室
温(20〜25℃)で30分間インキュベートした。インキュベートの後、血清サンプ
ルに、リポタンパク沈澱媒介物として、1.6 μl(100g/l)のデキストランサル
フェートを加え、かつ遅滞なく 7.5μl CaCl2(147 g/l)を加えた。
サンプルを 4〜6 ℃で1時間冷蔵した後、 4〜6 ℃にて遠心(5000×g,15分
間)して沈澱したリポタンパクを除去した。
130 μl の透明な上澄みを注ぎ出し、19.5 倍の水で希釈し、10 分遅れてシリ
ンジフィルター(0.22μm 孔サイズ)でろ過し、クロマトグラフ用カラムに注入
した。
調製したサンプルは、分析前に、如何なる CDT 含有量の検出可能な変化もな
く 4〜6 ℃で一夜保存できた。
クロマトグラフ条件:
同種形態(isoform)のトランスフェリンは、多段塩濃度勾配溶離を用い、2
つの緩衝液システムにおいて分離した。
移動相Aは 20mM bis-tris 緩衝液、pH 6.20 であった。移動相Bは、17.5g/L
NaCl(300 mM)を含む 20 mM bis-tris 緩衝液、pH 5.60 であった。緩衝液 PH
対温度の厳密なコントロールを行なった。
再生/洗浄溶液Cは、メタノールおよび 1N 塩酸(体積比 50/50)であった。
分離は、2.0 ml/min の流速で、表5に示される濃度勾配プロフィールにて行な
った。
2ml のサンプルの注射が、溶離液希釈、分解能および信号強度に関連して、最
適であることが判った。表6に示される手動再生/洗浄手順により、カラム背面
圧(colum buck pressure)が 4 Mpa を越える前に、100 個の患者サンプルを分
析できた。この時点で、製造者の指示書にしたがって、カラムの酵素処理を行な
った。
比較実験結果は、以下の表7に示した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 9516885.2
(32)優先日 1995年8月17日
(33)優先権主張国 イギリス(GB)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
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C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
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TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,SZ,U
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,TM),AL,AM,AT,AU,AZ,BB,BG
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,LU,LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX,
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G,SI,SK,TJ,TM,TR,TT,UA,UG
,US,UZ,VN
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. トランスフェリン含有体液中の炭水化物不足トランスフェリンの評価方法 であって、 i) 上記体液のまたは上記体液から、トランスフェリン含有液体サンプルを得 ること; ii) 上記サンプルを鉄イオン源と接触させること; iii) 続いて、上記サンプルをアニオン性イオン交換樹脂と、炭水化物不足トラ ンスフェリンが該樹脂に保持されるような pH で接触させること; iv) 続いて、上記樹脂を、炭水化物不足トランスフェリンを該樹脂から溶出液 へ放出させるのに有用な溶離液と接触させること; v) テトラおよびペンタシアロトランスフェリンを実質的に含まない上記溶出 液の容量を回収すること;および vi) 上記溶出液の容量中のトランスフェリン変異体含量を評価すること の工程を含む上記評価方法。 2. 工程 iv)において、上記樹脂を、該樹脂からテトラ-およびペンタシアロ トランスフェリンを実質的に含まない溶出液のみを放出させるのに十分であるよ うに予め決定された量の上記溶離液と接触させることを特徴とする請求項1記載 の方法。 3. 上記溶離液の上記量が、上記溶離液により上記樹脂から放出可能なトリシ アロトランスフェリンの 30〜70% を放出させるのに十分であるように予め決定 されることを特徴とする請求項2記載の方法。 4. 上記溶離液の上記量が、上記溶離液により上記樹脂から放出可能なトリシ アロトランスフェリンの 40〜60% を放出させるのに十分であるように予め決定 されることを特徴とする請求項2記載の方法。 5. 上記体液が血液であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の 方法。 6. 上記液体サンプルが血清または血漿であることを特徴とする請求項5記載 の方法。 7. 工程 ii)において、上記液体サンプルを水性 Fe(III)溶液と接触させる ことを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 8. 工程 ii)と iii)との間で2〜30分の時間間隔を置くことを特徴とする請 求項7記載の方法。 9. 上記サンプルを接触させる上記樹脂の pH が 6.8〜7.5 の範囲であること を特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の方法。 10. 上記樹脂が三級または四級アミン樹脂であることを特徴とする請求項1〜 9のいずれかに記載の方法。 11. 上記溶離液が 5.5〜6.5 の pH を有することを特徴とする請求項1〜10 のいずれかに記載の方法。 12. トランスフェリン変異体含量がネフェロメトリーまたは比濁法で評価され ることを特徴とする請求項1〜 11 のいずれかに記載の方法。 13. 上記溶出液中の不透明度が、上記溶出液を抗-トランスフェリン抗体また は抗体フラグメントと接触させることにより生成されることを特徴とする請求項 12 記載の方法。 14. 上記溶出液に重合体状の不透明度強調剤を添加することを特徴とする請求 項 13 記載の方法。 15. 上記溶出液への上記抗体または抗体フラグメントおよび上記強調剤の添加 と、ネフェロメトリーまたは比濁法によるトランスフェリン変異体含量の測定と の間に、5 〜60分の時間間隔を置くことを特徴とする請求項 14 記載の方法。 16. 約 405nm または約 340nm の波長の光を、ネフェロメトリーまたは比濁法 によるトランスフェリン変異体含量の測定に用いることを特徴とする請求項 12 〜15 のいずれかに記載の方法。 17. 工程 vi)において、上記溶出液中で少なくとも 1mg/L のトランスフェリ ン変異体含量を比濁法により評価することを特徴とする請求項1〜 16 のいずれ かに記載の方法。 18. 上記サンプルの全トランスフェリン含量をも評価し、炭水化物不足トラン スフェリン含量を、この全トランスフェリン含量に対するパーセントとして決定 することを特徴とする請求項1〜 17 のいずれかに記載の方法。 19. 診断アッセイ用のキットであって、 少なくとも 6.2 の pH を有する鉄イオンを含有する緩衝されたインキュベー ション溶液; 所望により、既知濃度のトランスフェリン溶液; サンプル導入部および溶出液除去部を有する容器に充填されたアニオン性イオ ン交換樹脂; 所望により、上記樹脂よりトランスフェリンを放出させるには不十分な pH およびイオン強度を有するフラッシュ溶離液; 上記樹脂よりトランスフェリンを放出させるのに十分な pH およびイオン強度 を有する放出溶離液; 所望により、光透過性の溶出液受器と; 所望により、抗-トランスフェリン抗体または抗体フラグメント;および 所望により、不透明度強調剤を備えている上記キット。 20. 上記インキュベーション溶液、上記樹脂、上記フラッシュ溶離液および上 記放出溶離液を含有する請求項 19 記載のキット。 21. 上記導入部を通してサンプルまたは溶離液を導入した後に、空気が上記樹 脂に入るのを実際に防止するのに有用な多孔性フィルター要素が、上記樹脂のサ ンプル導入部の端部近辺に配設されていることを特徴とする請求項 19 または 2 0 記載のキット。 22. アルコール消費のアッセイ方法であって、 血液由来の体液サンプルを、そのデシアロトランスフェリン含量について評価 することを含み、上記デシアロトランスフェリンがトリシアロトランスフェリン 、および所望により1以上のジシアロ、モノシアロおよびアシアロトランスフェ リンを含むことを特徴とする上記アッセイ方法。 23. 上記サンプル中の全トランスフェリン含量のパーセントとして評価され、 上記体液サンプル中のデシアロトランスフェリン含量が、アシアロ、モノシアロ 、ジシアロおよび 40〜60% のトリシアロ変異体で与えられることを特徴とする 請求項 22 記載の方法。 24. アルコール消費のアッセイ方法であって、 体液のまたは体液由来の、かつ、テトラ-およびペンタシアロトランスフェ リンを含有する第一のトランスフェリン含有液体サンプルを得ること; 上記第一のサンプルから、第二のトランスフェリン含有液体サンプルを得るこ と、ここで該第二のサンプルはテトラ-およびペンタシアロトランスフェリンを 実質的に含まず、かつ、少なくとも 1mg/L のトランスフェリン含量を有し;お よび 上記第二のサンプルのトランスフェリン含量を比濁法により評価すること を含むことを特徴とする上記方法。
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