JPH1146777A - Production of human b cell differentiation factor - Google Patents
Production of human b cell differentiation factorInfo
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- JPH1146777A JPH1146777A JP9335748A JP33574897A JPH1146777A JP H1146777 A JPH1146777 A JP H1146777A JP 9335748 A JP9335748 A JP 9335748A JP 33574897 A JP33574897 A JP 33574897A JP H1146777 A JPH1146777 A JP H1146777A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトＢ細胞分化活
性因子の製造方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing a human B cell differentiation activating factor.
【０００２】[0002]
【従来の技術】Ｂ細胞分化因子（B cell differentiati
on Factor : BCD F : 特にマウスではT cell Replacing
Factor （ＴＲＦ）ともよばれ、また最近はＩＬ−５と
も呼ばれている）は、Ｔ細胞系列から産生され、Ｂ細胞
に直接作用し、これを抗体産生細胞に分化・誘導するポ
リペプチドからなる因子である。2. Description of the Related Art B cell differentiati
on Factor: BCD F: T cell Replacing especially in mice
Factor (TRF), also recently called IL-5) is a factor consisting of a polypeptide that is produced from the T cell lineage, acts directly on B cells, and differentiates and induces them into antibody-producing cells. It is.
【０００３】抗体は、生体に侵入する細菌、ウイルスあ
るいは癌細胞などの生体異物と反応し、これらを不活性
化したり排除したりする機能をもっている。Ｂ細胞分化
因子は、特定抗原（生体異物）に特異的なＢ細胞クロー
ン即ち特定抗原に感作されたＢ細胞クローンを抗体産生
細胞に誘導して、該抗原に対する抗体を産生させること
から、ＢＣＤＦは、種々の感染症および癌の治療の面か
ら有用な物質である。即ち、ＢＣＤＦは、この因子の生
体内での過少によってひきおこされると考えられる自己
免疫疾患や免疫不全症等の診断、治療のみならず種々の
感染症や癌の治療に利用できることが期待される。[0003] Antibodies have the function of reacting with xenobiotics such as bacteria, viruses or cancer cells that invade the living body and inactivating or eliminating them. The B cell differentiation factor induces a B cell clone specific to a specific antigen (xenobiotic), that is, a B cell clone sensitized to a specific antigen, into an antibody-producing cell to produce an antibody against the antigen. Is a substance useful in treating various infectious diseases and cancer. That is, it is expected that BCDF can be used not only for the diagnosis and treatment of autoimmune diseases and immunodeficiencies and the like, but also for the treatment of various infectious diseases and cancer, which are considered to be caused by the in vivo shortage of this factor. .
【０００４】ＢＣＤＦの活性には、種特異性があるとい
われている。従って本因子をヒトにおける上記のような
疾患、感染症、癌などの診断あるいは治療に用いるため
には、ヒト由来のＢＣＤＦを使用することが望まれる。
これまで、ＢＣＤＦあるいはＴＲＦに関していくつかの
研究がなされている。まず、マウスのＢＣＤＦ（もしく
はＴＲＦ）については、R.W.Duttonら（Prog.Immunol.,
１, 355 (1971)) およびA.Schimpl およびE.WecKer
（Nature, 237 ,15 (1972))によって報告された。その
後、ヒトにおいてもマウスのＢＣＤＦ（もしくはＴＲ
Ｆ）に相当する物質の存在がGeha, R.S.ら（J.Exp.Me
d., 138 , 1230(1973)), Fauci, A.S. ら（J.Immunol.,
117 , 2100 (1976))およびHirano, T.ら（J.Immunol.,
119 , 1235 (1977))によって報告されているが、以下
に述べるように構造についても不明な点が多く、また、
関与する遺伝子も不明のため、混沌とした状態である
（Kishimoto, T., Ann.Rev.Immunol., ３, 133 (198
5)) 。It is said that the activity of BCDF has species specificity. Therefore, in order to use this factor for diagnosis or treatment of the above-mentioned diseases, infectious diseases, cancers and the like in humans, it is desired to use human-derived BCDF.
So far, some research has been conducted on BCDF or TRF. First, regarding the BCDF (or TRF) of mice, RWDutton et al. (Prog. Immunol.,
1 , 355 (1971)) and A. Schimpl and E. WecKer
(Nature, 237 , 15 (1972)). Thereafter, in humans, mouse BCDF (or TR
F) is the presence of a substance equivalent to Geha, RS et al. (J. Exp. Me
d., 138 , 1230 (1973)), Fauci, AS et al. (J. Immunol.,
117 , 2100 (1976)) and Hirano, T. et al. (J. Immunol.,
119 , 1235 (1977)), but there are many unclear points about the structure as described below.
Since the genes involved are unknown, they are in a chaotic state (Kishimoto, T., Ann. Rev. Immunol., 3 , 133 (198
Five)) .
【０００５】従来、ヒトＢＣＤＦを得るには、ヒト末梢
血より分離した正常ヒトＴ−細胞をマイトゲン刺激して
培養することにより、その培養上清から得る方法がとら
れている（Hirano, T.ら、J.Immunol., 126 , 517 (198
1)およびRalph, P. ら、J.Immunol. 132 , 1858 (198
4))。上記のRalph, P. らは、マイトゲン刺激した正常
ヒトＴ細胞の３ｌの培養上清から、硫安沈澱、ＤＥＡＥ
セルロースカラムクロマトグラフィー（ＤＥ−５２）、
ウルトロゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＡ４
４）、ブルーアガロースおよびレッドアガロースによる
アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどにより約１１，０００倍まで精製
し、ゲル濾過法による分子量が約２０，０００であるこ
とを測定したが、純粋なＢＣＤＦを得るまでには至って
おらず、また得られた量も極微量（３ｌの培養上清から
４．２μｇ）であった。Hitherto, human BCDF has been obtained by culturing normal human T-cells isolated from human peripheral blood with mitogen stimulation to obtain the resulting culture supernatant (Hirano, T. et al., Supra). J. Immunol., 126 , 517 (198
1) and Ralph, P. et al., J. Immunol. 132 , 1858 (198
Four)). The above Ralph, P. et al. Reported that ammonium sulfate precipitation, DEAE was performed from 3 l of culture supernatant of mitogen-stimulated normal human T cells.
Cellulose column chromatography (DE-52),
Ultrogel column chromatography (AcA4
4) Purification was performed up to about 11,000 times by affinity chromatography using blue agarose and red agarose, reversed-phase high performance liquid chromatography, and the like, and the molecular weight was determined to be about 20,000 by gel filtration. BCDF had not been obtained, and the amount obtained was very small (4.2 μg from 3 l of culture supernatant).
【０００６】また、Okada, M. ら（J.Exp.Med., 157 ,
583 (1983)) は、正常ヒトＴ細胞とヒトＴ細胞株ＣＥＭ
−ＡＧR とを融合して得たヒトＴ細胞融合株の培養液か
らヒトＢＣＤＦを得る方法を報告しているが、一般にヒ
ト融合細胞株は、継代培養中に物質の産生能が低下する
傾向があり、実用面での物質生産には不向きと考えられ
る。ヒトＢＣＤＦには、ＢＣＤＦＩとＢＣＤＦIIの二種
類があり、各々の性質は下記の様に報告されている（Te
ranishi, T. らJ.Immunol., 128 , 1903 (1982) および
Hirano, T.ら、J.Immunol. 132 , 229 (1984)) 。即
ち、Further, Okada, M. et al. (J. Exp. Med., 157 ,
583 (1983)) describes normal human T cells and human T cell line CEM.
-AG R and have reported a method for obtaining human BCDF from a culture of human T cell fusion strain was obtained by fusing the generally human fusion cell line, producing ability of a substance is reduced during subculture It tends to be unsuitable for practical material production. There are two types of human BCDF, BCDFI and BCDFII, and the properties of each are reported as follows (Te
ranishi, T. et al., J. Immunol., 128 , 1903 (1982) and
Hirano, T. et al., J. Immunol. 132 , 229 (1984)). That is,
【０００７】ＢＣＤＦＩ： 分子量：２０，０００（ゲル濾過法） ＰＩ：６．５〜８．０ 作用：スタフィロコッカス アウレウス コワンＩ（St
aphylococcus aureusCowan Ｉ（ＳＡＣ））刺激Ｂ細胞
（ブラスト化Ｂ細胞）を免疫グロブリン（Ｉｇ）産生細
胞に分化・誘導する。 ＢＣＤＦII： 分子量：２２，０００、３６，０００（ゲル濾過法） ＰＩ：５〜６ 作用 １）ＥＢウイルスでトランスフォームさせたＢリ
ンパ芽球様細胞（Ｂ−ＬＣＬ）にＩｇＧ産生を誘導す
る。 ２）ＢＣＤＦＩ存在下にＳＡＣで刺激されたＢ細胞のＩ
ｇ産生細胞への分化を増強する（ＢＣＤＦII単独ではこ
の作用はない）。BCDFI: Molecular weight: 20,000 (gel filtration method) PI: 6.5-8.0 Action: Staphylococcus aureus Cowan I (St
aphylococcus aureusCowan I (SAC)) stimulates B cells (blasted B cells) to differentiate and induce into immunoglobulin (Ig) producing cells. BCDFII: molecular weight: 22,000, 36,000 (gel filtration method) PI: 5-6 action 1) Induces IgG production in B lymphoblastoid cells (B-LCL) transformed with EB virus. 2) I of BACs stimulated with SAC in the presence of BCDFI
It enhances differentiation into g-producing cells (BCDFII alone does not have this effect).
【０００８】最近、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬ
Ｖ）によりトランスフォームされたヒトＴ細胞の１株Ｖ
Ｔ−１を用いたヒトＢＣＤＦの生産方法が報告されてい
る（岸本忠三、平野俊夫、特開昭６１−１１５０２４お
よび特開昭６１−１１５０２５号）。これらの出願の発
明者らは、ＶＴ−１細胞の無血清培養上清１０ｌより、
限外濾過、ＡｃＡ−３４ゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィー、クロマトフォカシング、逆相クロマトグラフィー
を用いて、１０４２倍まで精製し（収率１．８％）、ヒ
トＢＣＤＦの分子量は３．５±０．５×１０4 ダルトン
（ゲル濾過法）または２．２±０．２×１０4 ダルトン
（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）、等電点は
４．９〜５．１、またＮ末端部分のアミノ酸配列は、Pr
o-Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-Ser-Lys-Asp-Val-Ala-Ala-
であると報告している。Recently, human T-cell leukemia virus (HTL)
V) one strain of human T cells transformed by V)
Methods for producing human BCDF using T-1 have been reported (Tadazo Kishimoto, Toshio Hirano, JP-A-61-115024 and JP-A-61-115025). The inventors of these applications found that from 10 l of serum-free culture supernatant of VT-1 cells,
Purification was performed up to 1042 times (1.8% yield) using ultrafiltration, AcA-34 gel filtration column chromatography, chromatofocusing, and reverse phase chromatography, and the molecular weight of human BCDF was 3.5 ± 0. 5 × 10 4 daltons (gel filtration method) or 2.2 ± 0.2 × 10 4 daltons (SDS polyacrylamide electrophoresis method), isoelectric point of 4.9 to 5.1, and amino acid sequence of N-terminal part Is Pr
o-Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-Ser-Lys-Asp-Val-Ala-Ala-
Is reported.
【０００９】この精製ＢＣＤＦは、その活性をＥＢウイ
ルスでトランスフォームさせた細胞であるＣＥＳＳのＩ
ｇＧ生産量を指標にして精製している点および分子量や
ＰＩ値などからＢＣＤＦIIと考えられる。一方、前記の
Ralph, p. らが報告したヒトＢＣＤＦの分子量はゲル濾
過法で２０，０００ダルトンである。これはＢＣＤＦＩ
と考えられるが、その構造やその他の物理化学的性質は
明らかにされていない。また、上記のＶＴ−１細胞を用
いたＢＣＤＦの生産方法は、既述のヒト末梢血からの細
胞やヒトＴ融合細胞を用いた方法に比べ改善はされてい
るが、多量の培養上清から得られるＢＣＤＦ量は極微量
であり、またＨＴＬＶ感染細胞を出発原料としている点
からも医薬を目的とする工業的生産には向いていない。
このように、ヒトＢ細胞分化因子（ＢＣＤＦ）に関して
は、その構造が明らかにされていないばかりか、物理化
学的性質ならびに機能について不明な点が多い。また、
それを大量に生産し実用に供することは従来の技術では
不可能であった。[0009] The purified BCDF is obtained by transforming the activity of CESS I, a cell transformed with the EB virus.
It is considered to be BCDFII from the point of purification using gG production as an index and from the molecular weight and PI value. On the other hand,
The molecular weight of human BCDF reported by Ralph, p. Et al. Is 20,000 daltons by gel filtration. This is BCDFI
However, its structure and other physicochemical properties have not been clarified. The BCDF production method using the VT-1 cells described above has been improved as compared with the method using cells from human peripheral blood and human T fusion cells as described above. The amount of BCDF obtained is extremely small, and it is not suitable for industrial production for pharmaceuticals because HTLV-infected cells are used as a starting material.
As described above, the structure of human B-cell differentiation factor (BCDF) has not been elucidated, and there are many unclear points regarding its physicochemical properties and functions. Also,
It was impossible with conventional techniques to produce it in large quantities and put it to practical use.
【００１０】[0010]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子組み
換え技術を駆使し、これらの問題を解決しようとするも
のである。即ち、本発明はヒトＢＣＤＦ高生産細胞から
ＢＣＤＦ ｍＲＮＡを単離し、ＢＣＤＦ生産を支配する
ＢＣＤＦ遺伝子（即ちＤＮＡ配列）、あるいはまた染色
体由来のＢＣＤＦ遺伝子を明らかにすると共に、ＢＣＤ
Ｆ分子の構造（アミノ酸配列）を明らかにすることによ
り、組み換えＤＮＡ技術でＢＣＤＦの大量生産および医
薬などへの応用の可能性を提供しようとするものであ
る。尚、本発明におけるヒトＢ細胞分化因子はＢＣＤＦ
Ｉに相当するものであるが、本発明と同様な手法により
他のＢＣＤＦの構造も明らかにすることも出来よう。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention aims to solve these problems by making full use of gene recombination technology. That is, the present invention isolates BCDF mRNA from human BCDF-high producing cells, and clarifies the BCDF gene (ie, DNA sequence) that controls BCDF production or the chromosome-derived BCDF gene.
By elucidating the structure (amino acid sequence) of the F molecule, it is intended to provide the possibility of mass production of BCDF and application to medicine and the like by recombinant DNA technology. The human B cell differentiation factor according to the present invention is BCDF.
Although it corresponds to I, the structure of another BCDF could be clarified by the same method as the present invention.
【００１１】[0011]
【課題を解決するための手段】ヒトＢＣＤＦ遺伝子の調製と塩基配列の決定 本発明のヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡは、既に本発明者らに
よって調製されたマウスのＢ細胞分化因子の遺伝子（ｃ
ＤＮＡ）がクローニングされたプラスミドｐＳＰ６Ｋ−
ｍＴＲＦ２３（特願昭６１−１５７２２７号明細書）の
ＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩ断片（マウスのＢ細胞分化因子の
遺伝子の全コーディング領域を含んでいる）をプローブ
として以下に述べるようにして得ることができる。尚、
プラスミドｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３が導入されている
大腸菌（ＨＢ１０１／ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３）は、
ＳＢＭ２８５と命名され、微工研にＦＥＲＭ Ｐ−８８
２８の受託番号を得て寄託されている。 Preparation of Human BCDF Gene and Determination of Nucleotide Sequence The human BCDF cDNA of the present invention is a mouse B cell differentiation factor gene (c) already prepared by the present inventors.
DNA) cloned plasmid pSP6K-
The BamHI-AccI fragment of mTRF23 (Japanese Patent Application No. 61-157227) (containing the entire coding region of the mouse B cell differentiation factor gene) can be obtained as a probe as described below. still,
Escherichia coli (HB101 / pSP6K-mTRF23) into which the plasmid pSP6K-mTRF23 has been introduced,
Named SBM285 and FERM P-88
28 deposit numbers have been deposited.
【００１２】先ず、ヒト染色体ＤＮＡに、マウスのＢ細
胞分化因子遺伝子とハイブリダイズする配列が存在する
かどうかを確かめるため、例えば正常ヒト胎盤細胞より
抽出したＤＮＡをＰｖｕIIあるいはＰｓｔＩで消化し、
上記のプラスミドｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３のＢａｍＨ
Ｉ−ＡｃｃＩ断片をニックトランスレイション法により
32Ｐでラベル後、これをプローブとしてサザーンブロッ
トハイブリダイゼイション（Southern blot hybridizat
ion ）を行う。ヒト胎盤からのＤＮＡをＰｖｕIIで消化
した場合は３．０kbのＤＮＡ断片が、またＰｓｔＩで消
化した場合は４．１kbのＤＮＡ断片が上記プローブとハ
イブリダイズすることが認められ、ヒト染色体にマウス
のＢ細胞分化因子遺伝子と類似の配列をもつＤＮＡが存
在することが確認される。この結果は、上記のプローブ
を用いてヒトのＢＣＤＦ ｃＤＮＡをクローニングでき
ることを示すものである。First, in order to confirm whether or not a sequence hybridizing to a mouse B cell differentiation factor gene exists in human chromosomal DNA, for example, DNA extracted from normal human placental cells is digested with PvuII or PstI.
BamH of the above plasmid pSP6K-mTRF23
The I-AccI fragment was obtained by the nick translation method.
After labeling with 32 P, use this as a probe for Southern blot hybridizatization.
ion). When DNA from human placenta was digested with PvuII, a 3.0 kb DNA fragment was found to hybridize with the probe, and when digested with PstI, a 4.1 kb DNA fragment was found to hybridize with the above probe. It is confirmed that there is a DNA having a sequence similar to the B cell differentiation factor gene. This result indicates that human BCDF cDNA can be cloned using the above probe.
【００１３】次に上記知見をもとにヒトＢＣＤＦのｃＤ
ＮＡライブラリーを調製する。先ず、Maeda, M. ら（J.
Exp.Med., 162 , 2169 (1985))によって確立されている
ヒトＴ細胞株ＡＴＬ−２の培養細胞から常法（Nikaido,
T. ら、Nature, 311 , 631(1984)) に従い、ポリ
（Ａ）+ ＲＮＡを調製し、ｐＣＤベクターを用いるOkay
ama-Berg法（Okayama, H. 及びBerg, P., Mol.cell.Bio
l., ３, 280 (1983)) に準じ、ｃＤＮＡライブラリーを
調製する。[0013] Next, based on the above findings, the human BCDF cD
Prepare NA library. First, Maeda, M. et al. (J.
Exp. Med., 162 , 2169 (1985)), using a conventional method (Nikaido,
According to T. et al., Nature, 311 , 631 (1984)), poly (A) + RNA is prepared, and Okay using pCD vector is prepared.
ama-Berg method (Okayama, H. and Berg, P., Mol. cell. Bio
l., 3 , 280 (1983)), to prepare a cDNA library.
【００１４】次にこのｃＤＮＡライブラリーをいくつか
の群に分け、それらからプラスミドＤＮＡを分離し、Ｓ
ａｌＩまたはＢａｍＨＩで消化したのち、上記のプロー
ブ（ 32ＰでラベルされたＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩ ＤＮＡ
断片）とサザーンブロットハイブリダイゼイション（So
uthern, E.M., J.Mol.Biol., 98, 503 (1975)) を行
い、マウスのＢ細胞分化因子の遺伝子とハイブリダイズ
するＤＮＡ断片をもつ群を選択する。続いて、ポジティ
ブとなった群の各クローンについて、上記のプローブを
用いて同様にサザーンブロットハイブリダイゼイション
を行うことにより、上記プローブとハイブリダイズする
クローンを選択する。Next, several cDNA libraries were prepared.
, And plasmid DNA was separated therefrom, and S
After digestion with all or BamHI,
( 32BamHI-AccI DNA labeled with P
Fragment) and Southern blot hybridization (So
uthern, E.M., J. Mol. Biol.,98, 503 (1975))
Hybridization with mouse B cell differentiation factor gene
The group having the DNA fragment to be selected is selected. Then, positive
Probe for each clone in the
Similarly using Southern blot hybridization
To hybridize with the above probe
Select a clone.
【００１５】このポジティブなクローンには、ヒトＢＣ
ＤＦのｃＤＮＡ遺伝子をもつプラスミドが含まれている
と考えられる。このようにして得られるポジティブなク
ローンの一つ（ｐｈ−ＩＬ−５−３０）がもつプラスミ
ドはｐＣＤＶＴＲＦと命名され、またそのプラスミドを
大腸菌ＨＢ１０１株へ導入した形質転換体（ＨＢ１０１
／ｐＣＤＶＴＲＦ）はＳＢＭ２８６と命名され、微工研
にＦＥＲＭ ＢＰ−１１７１の受託番号を得て寄託され
ている。次にポジティブなクローンのプラスミドについ
て、制限酵素解析および上記プローブとのハイブリダイ
ゼーションにより、確かにマウスＢ細胞分化因子遺伝子
と類似したヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡがクローン化されて
いることを確認し、以下に記すようにそのＤＮＡの塩基
配列を決定するとともに、そのＤＮＡがヒトＢＣＤＦ活
性を有する蛋白質（ポリペプチド）を生産する遺伝子で
あるかを調べる。The positive clones include human BC
It is considered that a plasmid having the DF cDNA gene was included. The plasmid of one of the positive clones thus obtained (ph-IL-5-30) is named pCDVTRF, and a transformant obtained by introducing the plasmid into Escherichia coli HB101 (HB101)
(/ PCDVTRF) is designated as SBM286, and has been deposited with the Japan Fine Art Institute under the accession number of FERM BP-1171. Next, the plasmid of the positive clone was confirmed by restriction enzyme analysis and hybridization with the probe to confirm that a human BCDF cDNA similar to the mouse B-cell differentiation factor gene had been cloned. First, the nucleotide sequence of the DNA is determined, and it is checked whether the DNA is a gene that produces a protein (polypeptide) having human BCDF activity.
【００１６】先ず、常法に従いそのクローンのプラスミ
ド（例えば、ｐｈ−ＩＬ−５−３０）の制限酵素切断マ
ップを調べた後、ｐｈ−ＩＬ−５に挿入されているｃＤ
ＮＡ（ヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡ遺伝子を含む）を一旦ｐ
ＵＣ１８等の適当なプラスミドのＢａｍＨＩサイトにク
ローニングしなおし、ジデオキシ法（Sanger, F.ら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci. USA, 74, 5463 (1977))に従って、
上記ｃＤＮＡの塩基配列をきめる。本発明者らの実験に
よれば、上記方法によって、ヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡを
含む図１のｃＤＮＡ塩基配列が得られた。First, the restriction enzyme cleavage map of the plasmid (for example, ph-IL-5-30) of the clone is examined according to a conventional method, and then the cD inserted into ph-IL-5 is examined.
NA (including human BCDF cDNA gene)
The clone was re-cloned into the BamHI site of an appropriate plasmid such as UC18 and the dideoxy method (Sanger, F. et al., Pr.
oc.Natl.Acad.Sci. USA, 74 , 5463 (1977))
The nucleotide sequence of the above cDNA is determined. According to the experiments of the present inventors, the above-mentioned method resulted in the cDNA base sequence of FIG. 1 containing the cDNA of human BCDF.
【００１７】ヒトＢ細胞分化因子をコードする領域の決
定 上記で得られたｃＤＮＡ塩基配列にヒトＢ細胞分化因子
をコードする領域が含まれることは、次のようにして決
定した。即ち、この塩基配列のオープンリーディングフ
レームを探すとともに、既に本発明者らによって決定さ
れているマウスＢ細胞分化因子遺伝子の塩基配列と比較
することにより、ヒトＢ細胞分化因子（ヒトＢＣＤＦ）
ポリペプチドをコードする領域とアミノ酸配列を決定す
る（図２）。そして、そのコーディング領域のアミノ酸
配列およびヒトＢＣＤＦが細胞外に分泌される蛋白質で
あることから、ヒトＢＣＤＦの前駆体ポリペプチドは、
Ｎ末端側に１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチド
（リーダー配列）を含む１３４個のアミノ酸からなるポ
リペプチドであることが分かった（図３参照）。即ち、
図３のアミノ酸配列のうち２０〜１３４番目が成熟ヒト
ＢＣＤＦポリペプチドである。 Determination of the region encoding human B cell differentiation factor
May include the region encoding the human B cell differentiation factor for cDNA nucleotide sequence obtained in a constant above was determined as follows. That is, while searching for the open reading frame of this nucleotide sequence and comparing it with the nucleotide sequence of the mouse B cell differentiation factor gene already determined by the present inventors, human B cell differentiation factor (human BCDF)
The region encoding the polypeptide and the amino acid sequence are determined (FIG. 2). And since the amino acid sequence of the coding region and human BCDF are proteins extracellularly secreted, the precursor polypeptide of human BCDF is:
It was found to be a polypeptide consisting of 134 amino acids including a signal peptide (leader sequence) consisting of 19 amino acids on the N-terminal side (see FIG. 3). That is,
In the amino acid sequence of FIG. 3, positions 20 to 134 are the mature human BCDF polypeptide.
【００１８】前駆体のアミノ酸配列中には、２ヵ所Ｎ−
グリコシル化可能部位（４７番および９０番のＡｓｎ）
および後述するとおり少なくとも１ケ所のＯ−グリコシ
ル化可能部位（２２番のＴｈｒ）があり、ここに糖鎖が
付加されることを考えると、上記の成熟ヒトＢＣＤＦポ
リペプチドの計算分子量（１３，１４９）は、既に報告
されているヒトＢＣＤＦＩ（糖鎖が付加されている）の
分子量（約２０，０００）と矛盾は無い。尚、図３に示
すポリペプチドのＮ末端のＭｅｔ（メチオニン）は、翻
訳後の修理過程（post translational modification pr
ocess ）で、フォルミル化やアセチル化されることがあ
り、またＭｅｔが取り除かれたりすることもある。ま
た、上記の成熟ヒトＢＣＤＦポリペプチドのＮ末端のア
ミノ酸も同様な過程でアセチル化されることがある。In the amino acid sequence of the precursor, two positions N-
Glycosylation site (Asn at positions 47 and 90)
And at least one O-glycosylation-possible site (No. 22 Thr) as described later, and considering that a sugar chain is added thereto, the calculated molecular weight (13,149) of the mature human BCDF polypeptide described above. ) Is consistent with the previously reported molecular weight (about 20,000) of human BCDFI (to which a sugar chain is added). The N-terminal Met (methionine) of the polypeptide shown in FIG.
ocess), may be formylated or acetylated, and Met may be removed. Also, the amino acid at the N-terminus of the mature human BCDF polypeptide described above may be acetylated in a similar process.
【００１９】一方、前記のプラスミドｐｈ−ＩＬ−５−
３０に挿入されているｃＤＮＡ、即ち上記の如く同定し
たＤＮＡがヒトＢＣＤＦ活性を有する蛋白質（ポリペプ
チド）を生産する遺伝子であることは当該遺伝子を組み
込んだ発現ベクターによって形質転換された宿主細胞が
産生する蛋白質の活性を測定することによって知ること
ができるが、また以下のようにしても調べられる。On the other hand, the plasmid ph-IL-5-
The fact that the cDNA inserted in No. 30, ie, the DNA identified as described above, is a gene for producing a protein (polypeptide) having human BCDF activity is produced by a host cell transformed with an expression vector incorporating the gene. The activity can be determined by measuring the activity of the protein, but can also be determined as follows.
【００２０】即ち、先ずプラスミドｐｈ−ＩＬ−５−３
０に挿入されているヒトＢＣＤＦｃＤＮＡ全部を含むＢ
ａｍＨＩ ＤＮＡ断片をｐＳＰ６４ベクターに再クロー
ンする。ｐＳＰ６４は、挿入された外来遺伝子がＳＰ６
プロモーター支配下にのみ発現されうるように改良され
たベクターであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＰ６ＲＮＡポ
リメラーゼ存在下に挿入された外来遺伝子のｍＲＮＡを
合成することができる（Krieg, P.A. およびMelton, D.
A., Nucl.Acid.Res., 12, 7057 (1984) 、およびKonars
ka, M.M.ら、Cell, 38, 731 (1984)) 。That is, first, the plasmid ph-IL-5-3
B containing the entire human BCDF cDNA inserted at 0
The amHI DNA fragment is recloned into the pSP64 vector. pSP64 has an inserted foreign gene of SP6.
It is an improved vector that can be expressed only under the control of a promoter, and can synthesize mRNA of a foreign gene inserted in the presence of SP6 RNA polymerase in vitro (Krieg, PA and Melton, D. et al.
A., Nucl.Acid.Res., 12 , 7057 (1984), and Konars.
ka, MM et al., Cell, 38 , 731 (1984)).
【００２１】次にこのようにして、上記のｃＤＮＡから
ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製されるｍＲＮＡ溶液を、アフリ
カツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞（ｏｏｃｙ
ｔｅ）に注射して培養し、培養上清に分泌されてくるｍ
ＲＮＡからの翻訳産物（蛋白質）のＢＣＤＦ活性を測定
する。ヒトＢＣＤＦ（特にヒトＢＣＤＦＩ）活性は、既
に記載したように、Staphylococcus aureus Cowan Ｉ
（ＳＡＣ）で刺激したヒトＢ細胞のＩｇＭ産生誘導能を
コントロールと比較して調べることにより測定される。
このようにして上記のｃＤＮＡが、ヒトＢＣＤＦ活性を
有する蛋白質（ポリペプチド）を生産する遺伝子である
ことが確かめられるとともに、本発明のＤＮＡによる特
許請求の範囲に示すようなヒトＢＣＤＦポリペプチドの
大量生産の可能性を示す。Next, the mRNA solution prepared in vitro from the above-mentioned cDNA is used to prepare Xenopus oocytes (oocy).
te), and culture is performed.
The BCDF activity of a translation product (protein) from RNA is measured. Human BCDF (especially human BCDFI) activity, as previously described, was measured by Staphylococcus aureus Cowan I
It is determined by examining the ability of human B cells stimulated with (SAC) to induce IgM production in comparison with a control.
Thus, the above-mentioned cDNA was confirmed to be a gene for producing a protein (polypeptide) having human BCDF activity, and the DNA of the present invention produced a large amount of human BCDF polypeptide as defined in the claims. Shows the possibility of production.
【００２２】ヒトＢＣＤＦの発現 本発明によれば、上記のようにして調製された、遺伝子
配列を使用することにより、ヒトＢＣＤＦを製造するこ
とが可能である。例えば、ヒトＢＣＤＦをコードする遺
伝子としてｃＤＮＡを使用する場合には、ｃＤＮＡの
５′側上流に適当な他のプロモーター（例えばＳＶ４０
由来のプロモーター）を挿入した発現ベクターを造成
し、適当な細胞（例えば、酵母細胞、大腸菌細胞、或い
はＣＯＳ−Ｉ細胞やＣＨＯ細胞等の動物細胞）でヒトＢ
細胞を分化させる蛋白質をつくることもできる。この場
合、前駆体蛋白質をコードするＤＮＡ領域を用いること
が好ましいが、成熟形蛋白質（ポリペフチド）をコード
するｃＤＮＡ領域を用いてもよい。また、当該蛋白質を
コードするＤＮＡの直近の５′上流に、適当な制限酵素
（例えばＨｉｎｄIII ）切断部位を適当な方法、例えば
部位特異的ミュータジェネシス（site directed mutage
nesis ）法を用いて設けておくと外来プロモーターの導
入が容易である。 Expression of Human BCDF According to the present invention, human BCDF can be produced by using the gene sequence prepared as described above. For example, when cDNA is used as a gene encoding human BCDF, another suitable promoter (eg, SV40
An expression vector into which a human B-derived promoter has been inserted is inserted into an appropriate cell (eg, a yeast cell, an E. coli cell, or an animal cell such as a COS-I cell or a CHO cell).
It can also make proteins that differentiate cells. In this case, a DNA region encoding the precursor protein is preferably used, but a cDNA region encoding the mature protein (polypeptide) may be used. In addition, an appropriate restriction enzyme (for example, HindIII) cleavage site may be placed in an appropriate manner by a suitable method, for example, site-directed mutagenesis (site-directed mutagenesis) immediately 5 ′ upstream of the DNA encoding the protein.
nesis), it is easy to introduce a foreign promoter.
【００２３】本発明によれば、ｃＤＮＡを用いる代わり
に、ヒト染色体からイントロンを含むヒトＢＣＤＦ遺伝
子を調製し、これを用いて、上記と同様にしてヒトＢ細
胞を分化する蛋白質を製造することもできる。即ち、ヒ
トＢＣＤＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を上記ｃＤＮＡをプ
ローブとして、適当なヒト遺伝子ライブラリー（例え
ば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）のヒト遺伝子ラ
イブラリー）から分離し、次にｃＤＮＡの場合と同様、
ヒトＢＣＤＦをコードするＤＮＡ領域の５′上流に適当
なプロモーターを挿入した発現ベクターを造成し、この
発現ベクターによって形質転換あるいはトランスフェク
ションされた細胞を培養することにより、ヒトＢＣＤＦ
を効率よく製造することができる。According to the present invention, instead of using cDNA, it is also possible to prepare a human BCDF gene containing introns from human chromosomes and use it to produce a protein that differentiates human B cells in the same manner as described above. it can. That is, a DNA fragment containing the human BCDF gene is separated from an appropriate human gene library (for example, a human gene library of Maniatis) using the above cDNA as a probe, and then, as in the case of cDNA,
By constructing an expression vector having an appropriate promoter inserted 5 'upstream of the DNA region encoding human BCDF, and culturing cells transformed or transfected with this expression vector,
Can be manufactured efficiently.
【００２４】この場合の宿主細胞は、好ましくはスプラ
イス能力のある細胞が使用される。特に動物細胞が好ま
しい。なお、ヒト染色体由来のＢＣＤＦ遺伝子が組み込
まれた発現ベクター（ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎ
ｅ）が導入されている大腸菌（ＨＢ１０１／ｐｄＫＣＲ
−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ）は、ＳＢＭ ２９３と命名さ
れ、微工研に国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７７を
得て寄託されている。In this case, a host cell having splicing ability is preferably used. Particularly, animal cells are preferable. In addition, an expression vector (pdKCR-hIL-5gen) in which a BCDF gene derived from a human chromosome was integrated.
e) into which E. coli (HB101 / pdKCR) has been introduced.
-HIL-5gene) is designated as SBM 293 and has been deposited with the Japan Institute of Metals and Materials under International Accession No. FERM BP-1477.
【００２５】組換えヒトＢＣＤＦの精製 上記のようにして造成された動物細胞が産生する組換え
ヒトＢＣＤＦは、適当な方法、例えばモノクローナル抗
体を用いたアフィニティークロマトグラフィーやゲル濾
過、逆相高速液体クロマトグラフィーなどによって精製
することができる。本発明者らは、このようにして精製
・純化された組換えヒトＢＣＤＦを、アミノ酸配列分析
や電気泳動分析にかけ、このアミノ酸配列分析の結果お
よびヒトＢＣＤＦをコードする遺伝子の塩基配列からの
推定（例えば図２参照）に基づいて、成熟型ヒトＢＣＤ
Ｆのポリペフチド部分の構造は、前記のとおり図３の第
２０番のＩｌｅから第１３４番のＳｅｒまでの配列を有
することを明らかにすると共に、その２次元的配列の推
定も行った（図１６）。以下、実施例をもって本発明を
説明する。 Purification of Recombinant Human BCDF Recombinant human BCDF produced by the animal cells constructed as described above can be produced by an appropriate method, for example, affinity chromatography using a monoclonal antibody, gel filtration, reversed-phase high-performance liquid chromatography. It can be purified by chromatography or the like. The present inventors applied the purified and purified recombinant human BCDF to amino acid sequence analysis or electrophoretic analysis, and estimated the results from the amino acid sequence analysis and the nucleotide sequence of the gene encoding human BCDF ( For example, see FIG.
The structure of the polypeptide portion of F was revealed to have a sequence from Ile at position 20 to Ser at position 134 in FIG. 3 as described above, and its two-dimensional sequence was estimated (FIG. 16). ). Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples.
【００２６】[0026]
（１）ヒトＢＣＤＦ遺伝子の確認 先に、本発明者らは、マウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）の産生
を司る遺伝子、即ちＤＮＡ配列を同定した（特願昭６１
−１５７２２７号明細書）。そしてこの遺伝子によって
産生されるマウスＴＲＦは、ＴＲＦ活性〔１）マウス慢
性Ｂ白血病細胞（ＢＣＬ1 ）をＩｇＭ抗体産生細胞に分
化させる活性、２）抗原（ＤＮＰ−ＫＬＨ）感作させた
マウス脾臓内Ｂ細胞を抗原（ＤＮＰ−オバルブミン）で
刺激し、特異的抗体（抗ＤＮＰ−ＩｇＧ）産生細胞に分
化させる活性、３）ｉｎ ｖｉｖｏで活性化したＢ細胞
ブラストのＩｇＭ合成誘導活性〕およびＢＣＧＦII活性
〔１）ＢＣＬ1 細胞の***促進、２）デキストラン硫酸
刺激休止Ｂ細胞の***促進〕をもっていることを明らか
にした。(1) Confirmation of human BCDF gene Prior to the present inventors, the present inventors identified a gene that controls the production of mouse BCDF (TRF), that is, a DNA sequence (Japanese Patent Application No. Sho 61).
-157227). The mouse TRF produced by this gene has a TRF activity [1) an activity of differentiating mouse chronic B leukemia cells (BCL 1 ) into IgM antibody-producing cells, and 2) a mouse spleen sensitized with antigen (DNP-KLH). Activity of stimulating B cells with antigen (DNP-ovalbumin) to differentiate into specific antibody (anti-DNP-IgG) -producing cells, 3) IgM synthesis-inducing activity of B cell blast activated in vivo] and BCGFII activity [ 1) mitogenesis of BCL 1 cells and 2) mitogenesis of dextran sulfate-stimulated resting B cells].
【００２７】マウスＴＲＦ ｍＲＮＡに相補するｃＤＮ
Ａを含むプラスミドｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３をＢａｍ
ＨＩおよびＡｃｃＩで消化して、６５４bpよりなるＢａ
ｍＨＩ−ＡｃｃＩフラグメントを分離した。マウスＢＣ
ＤＦ（ＴＲＦ）の全コーディング領域を含んでいる、こ
のフラグメントをニックトランスレイションによって 32
Ｐでラベルしたものをプローブにしてヒト染色体ＤＮＡ
のサザンブロットハイブリダイゼーションを常法（Sout
hern, E.M., J.Mol.Biol., 98, 503 (1975))に従って
行った。CDN complementary to mouse TRF mRNA
A containing plasmid pSP6K-mTRF23 in Bam
After digestion with HI and AccI, a 654 bp Ba
The mHI-AccI fragment was separated. Mouse BC
This includes the entire coding region of the DF (TRF).
Fragment by nick translation 32
Human chromosomal DNA using P as a probe
Southern blot hybridization of
hern, E.M., J.Mol.Biol.,98, 503 (1975))
went.
【００２８】ヒト染色体ＤＮＡは正常ヒト胎盤よりYaoi
ta, Y.およびHonjo, T. (Biomed.Res., １, 164 (198
0)) に準じて抽出したのち、各々２μｇをＰｖｕIIまた
はＰｓｔＩで消化してサザンブロットハイブリダイゼー
ションのために０．６％アガロースゲルで電気泳動し
た。泳動後、ゲル中のＤＮＡはニトロセルロースフィル
ター（Schleicher & Schuel (Dassel)) に移し上記のプ
ローブとハイブリダイズさせた。Human chromosomal DNA was obtained from normal human placenta
ta, Y. and Honjo, T. (Biomed. Res., 1 , 164 (198
After extraction according to (0)), 2 μg of each was digested with PvuII or PstI and electrophoresed on a 0.6% agarose gel for Southern blot hybridization. After the electrophoresis, the DNA in the gel was transferred to a nitrocellulose filter (Schleicher & Schuel (Dassel)) and hybridized with the above probe.
【００２９】洗浄条件を０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳ
Ｃ（ＳＳＣ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ−０．０１５Ｍクエ
ン酸ナトリウム）、５０℃、４５分で行うと、ＰｖｕII
で消化した場合には３．０kbのＤＮＡフラグメントが、
そしてＰｓｔＩで消化した場合には４．１kbのＤＮＡフ
ラグメントがマウスＢＣＤＦプローブとハイブリダイズ
することが判明した。このプローブは、マウス染色体Ｄ
ＮＡのフラグメントには、よりストリンジェント（ｓｔ
ｒｉｎｇｅｎｔ）な条件でもハイブリダイズすることよ
り、ヒト染色体ＤＮＡ中にマウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）ｃ
ＤＮＡと全く同一ではないが相同性の高い配列があるこ
とが判明し、このプローブを用いてヒトＢＣＤＦのｃＤ
ＮＡクローンのスクリーニングが可能であると判断し
た。The washing conditions were 2 × SS containing 0.1% SDS.
C (SSC: 0.15 M NaCl-0.015 M sodium citrate) at 50 ° C. for 45 minutes gives PvuII
When digested with, a DNA fragment of 3.0 kb,
When digested with PstI, it was found that the 4.1 kb DNA fragment hybridized with the mouse BCDF probe. This probe is used for mouse chromosome D
The fragments of NA are more stringent (st
), mouse BCDF (TRF) c in human chromosomal DNA.
It was found that there was a sequence that was not completely identical to DNA but had a high homology, and the probe was used to detect the cD of human BCDF.
It was determined that screening of NA clones was possible.
【００３０】（２）ヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡクローンの
分離 ヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡライブラリーは下記の如く作成
した。M.Maeda ら（J.Exp.Med., 162 , 2169 (1985))が
成人性Ｔ細胞白血病患者の血液より樹立したヒトＴ細胞
株ＡＴＬ−２をＲＰＭＩ １６４０＋１０％牛胎児血清
の培地中、３７℃、５％ＣＯ2 中で培養して細胞を集め
た。この細胞より常法（Nikaido, T. ら、Nature, 311
, 631 (1984)) に従い、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを調製し
た。このポリ（Ａ）+ ＲＮＡ ３μｇを用いてｃＤＮＡ
ライブラリーを作成したが、方法はｐＣＤベクターを用
いるOkayama-Berg法（Okayama, H. およびBerg, P., Mo
l.Cell.Biol., ３, 280 (1983)) に準じ、大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株）の形質転換体として２×１０
5 個の独立のｃＤＮＡクローンを得た。(2) Human BCDF cDNA clone
A cDNA library of the isolated human BCDF was prepared as follows. M. Maeda et al. (J. Exp. Med., 162 , 2169 (1985)) developed a human T cell line ATL-2 established from the blood of an adult T-cell leukemia patient in a medium containing RPMI 1640 + 10% fetal bovine serum. The cells were collected by culturing at 5 ° C. in 5% CO 2 . From these cells, a conventional method (Nikaido, T. et al., Nature, 311
, 631 (1984)), and poly (A) + RNA was prepared. Using 3 μg of this poly (A) + RNA, cDNA
A library was prepared, but the method was based on the Okayama-Berg method using a pCD vector (Okayama, H. and Berg, P., Mo.
l. Cell. Biol., 3 , 280 (1983)) and E. coli (E.
E. coli HB101 strain)
Five independent cDNA clones were obtained.
【００３１】この２×１０5 個のｃＤＮＡクローン中に
ヒトＢＣＤＦ遺伝子に相当するｃＤＮＡが存在するかど
うかを調べるため、全形質転換体の混合物からプラスミ
ドＤＮＡを調製し、各々２μｇのＤＮＡをＳａｌＩまた
はＢａｍＨＩで消化し、上記の方法によりサザンブロッ
トハイブリダイゼーションを行った。その結果、ｐＣＤ
ベクターに１カットを入れるＳａｌＩ消化では４．１kb
のＤＮＡフラグメントがハイブリダイズし、これに対し
てインサートされたｃＤＮＡのほぼ両端の位置で切断す
るＢａｍＨＩ消化では１．０kbのＤＮＡフラグメントが
ハイブリダイズすることが判った。In order to examine whether or not cDNA corresponding to the human BCDF gene exists in the 2 × 10 5 cDNA clones, plasmid DNA was prepared from the mixture of all the transformants, and 2 μg of each DNA was replaced with SalI or After digestion with BamHI, Southern blot hybridization was performed by the method described above. As a result, pCD
4.1 kb for SalI digestion, which inserts one cut into the vector
It was found that a 1.0 kb DNA fragment hybridized by BamHI digestion in which the DNA fragment was cut at almost both ends of the inserted cDNA.
【００３２】これらの結果からｃＤＮＡライブラリー中
にヒトＢＣＤＦ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を持つクロ
ーンが含まれていることが示唆された。そこで前記マウ
スのプローブを用いて上記の２×１０5 個のｃＤＮＡク
ローンを常法のコロニーハイブリダイゼイション（Hana
han, D. およびMeserlson M., Gene, 10, 63 (1980))に
準じてスクリーニングした。スクリーニングの結果２９
クローンがマウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）ｃＤＮＡプローブ
とハイブリダイズし、この２９クローンのプラスミドＤ
ＮＡのエンドヌクレアーゼ切断マップおよびエンドヌク
レアーゼで消化したＤＮＡフラグメントの上記プローブ
を用いたサザンハイブリダイゼーションの結果、この２
９クローンは全て同一と判断された。From these results, it was suggested that the cDNA library contained a clone having a DNA sequence corresponding to the human BCDF gene. Then, using the mouse probe, the above 2 × 10 5 cDNA clones were subjected to colony hybridization (Hana
Screening was performed according to Han, D. and Meserlson M., Gene, 10 , 63 (1980)). Screening results 29
The clone hybridized with a mouse BCDF (TRF) cDNA probe, and the plasmid D of the 29 clones was hybridized.
As a result of Southern hybridization of the DNA fragment digested with the endonuclease of the NA and the DNA fragment digested with the endonuclease using the above probe,
All nine clones were determined to be identical.
【００３３】（３）ヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡの塩基配列
決定およびヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡのポリペプチドのア
ミノ酸配列 上記２９クローンのうちの一つｐｈ−ＩＬ−５−３０を
更に詳細に調べた。制限エンドヌクレアーゼ切断マップ
を常法に従い調べた後、ｐｈ−ＩＬ−５−３０に挿入さ
れたｃＤＮＡを一旦ｐＵＣ１８プラスミドのＢａｍＨＩ
サイトにサブクローニングし、ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を
常法に従いジデオキシ法（Sanger, F.ら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci. USA, 74, 5463 (1977))によって決定した。そ
の結果、挿入されたｃＤＮＡはポリＡテールを除く８１
６の塩基対よりなることが判った。(3) Base sequence of human BCDF cDNA
Determination and Analysis of Polypeptides of Human BCDF cDNA
The amino acid sequence One of the 29 clones, ph-IL-5-30, was examined in more detail. After examining the restriction endonuclease cleavage map according to a conventional method, the cDNA inserted into ph-IL-5-30 was once transformed into BamHI of pUC18 plasmid.
The DNA sequence of the cDNA was subcloned into the site, and the DNA sequence of the cDNA was analyzed by the dideoxy method (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Ac.
ad.Sci. USA, 74 , 5463 (1977)). As a result, the inserted cDNA was 81% excluding the poly-A tail.
It was found to consist of 6 base pairs.
【００３４】この結果とマウスのＢＣＤＦ（ＴＲＦ）の
ＤＮＡ配列を比較することによってヒトＢＣＤＦのコー
ディング領域を決定し、ヒトＢＣＤＦの前駆体が１３４
個のアミノ酸からなると決定された。ヒトＢＣＤＦはＴ
細胞外に分泌されるためにこの１３４個のアミノ酸配列
中、Ｎ末端配列にシグナル配列を含むことが予想され、
成熟したヒトＢＣＤＦは上記１３４個のアミノ酸配列中
２０番目のアミノ酸から１３４番目までのアミノ酸より
なるポリペプチドを含む分子であると考えられる。By comparing the result with the DNA sequence of mouse BCDF (TRF), the coding region of human BCDF was determined.
Amino acids. Human BCDF is T
In order to be secreted extracellularly, the N-terminal sequence of the 134 amino acid sequence is expected to contain a signal sequence,
Mature human BCDF is considered to be a molecule containing a polypeptide consisting of the 20th to 134th amino acids in the 134 amino acid sequence.
【００３５】このアミノ酸配列中には、２ヵ所のＮ−グ
リコシル化可能部位（図３中、４７番および９０番のＡ
ｓｎ）および少なくとも１ケ所のＯ−グリコシル化可能
部位（図３中、２２番目のＴｈｒ）があり、この付加の
可能性のある糖の分子量とポリペプチドの分子量（２０
番〜１３４番のポリペプチドで１３，１４９）を加算す
ると、ＢＣＤＦＩの分子量として報告されている２０，
０００に矛盾しない。マウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）と比較
すると、前駆体ではヒトＢＣＤＦのアミノ酸数は一つ多
い。ヒトＢＣＤＦの二個所のＮ−グリコシル化の可能サ
イトはマウスＢＣＤＦの１番目と３番目のＮ−グリコシ
ル化可能サイトと一致する。マウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）
中の三つのシステイン残基のうち、Ｃ末端側の二つのシ
ステイン残基はヒトＢＣＤＦにおいても保存されてい
る。マウスおよびヒトのＢＣＤＦのコーディング領域の
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は各々７８％および７
０％の相同性を持つ。In this amino acid sequence, two N-glycosylation sites (A and B at positions 47 and 90 in FIG. 3)
sn) and at least one site capable of O-glycosylation (Thr at position 22 in FIG. 3), and the molecular weight of the sugar and the molecular weight of the polypeptide (20)
Addition of 13,149) for polypeptides Nos. 134 to 134 gives the reported molecular weight of BCDFI 20,
000. Compared to mouse BCDF (TRF), the precursor has one more amino acid in human BCDF. The two possible N-glycosylation sites of human BCDF coincide with the first and third N-glycosylation possible sites of mouse BCDF. Mouse BCDF (TRF)
Of the three middle cysteine residues, the two cysteine residues on the C-terminal side are also conserved in human BCDF. The nucleotide and amino acid sequences of the coding region of mouse and human BCDF are 78% and 7%, respectively.
Has 0% homology.
【００３６】ｐｈ−ＩＬ−５−３０のＰｓｔＩフラグメ
ント（５１５bp）をニックトランスレイションによって
32Ｐでラベルしたものをプローブに用いて前記のヒト染
色体ＤＮＡのＰｖｕIIまたはＰｓｔＩで消化したＤＮＡ
フラグメントについて前記のとおりサザンブロットハイ
ブリダイゼーションを行った結果、マウスＢＣＤＦプロ
ーブを用いた時と同様、それぞれ４．１kbおよび３．０
kbのフラグメントとハイブリダイズした。ヒトのプロー
ブを用いた場合、洗浄条件を０．１×ＳＳＣ−０．１％
ＳＤＳ、６５℃、４５分というストリンジェントな条件
にしても充分なハイブリダイズがなされた。The PstI fragment (515 bp) of ph-IL-5-30 was nick-translated.
DNA digested with PvuII or PstI of the above human chromosomal DNA using a probe labeled with 32 P as a probe
The fragment was subjected to Southern blot hybridization as described above, and as a result, as in the case of using the mouse BCDF probe, 4.1 kb and 3.0 kb, respectively.
Hybridized with the kb fragment. When a human probe is used, the washing condition is 0.1 × SSC-0.1%
Even under the stringent conditions of SDS, 65 ° C. and 45 minutes, sufficient hybridization was performed.
【００３７】また、このヒトのプローブを用いてＡＴＬ
−２ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを常法に従い（Thomas, D.D.,
Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 77, 5201 (1980))、ノーザ
ンブロットハイブリダイゼーションを行った結果１．０
kbのただ１本のバンドを認めた。このことは、本発明者
らが同定したヒトＢＣＤＦ遺伝子がヒト染色体ＤＮＡ配
列中、マウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）遺伝子に特異的な相同
遺伝子であること、またこのヒトＢＣＤＦ遺伝子からは
ただ一種類のｍＲＮＡのみしか翻訳されていないことを
示している。The ATL was prepared using this human probe.
-2 poly (A) + RNA was prepared according to a conventional method (Thomas, DD,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 , 5201 (1980)).
Only one band of kb was observed. This indicates that the human BCDF gene identified by the present inventors is a homologous gene specific to the mouse BCDF (TRF) gene in the human chromosomal DNA sequence, and that only one type of mRNA is obtained from the human BCDF gene. Only that it has been translated.
【００３８】（４）ヒトＢＣＤＦ活性の測定 上記のようにして同定したヒトＢＣＤＦ遺伝子がその生
産を支配しているポリペプチドあるいはそのポリペプチ
ドよりなる物質にヒトＢＣＤＦＩ活性があることを以下
の方法で確認した。プラスミドｐｈ−ＩＬ−５−３０の
ヒトＢＣＤＦｃＤＮＡインサート全部と小部分のベクタ
ーＤＮＡを含むＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントをｐＳ
Ｐ６４ベクターに再クローンした。このプラスミドをＳ
ａｌＩで消化した後、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用い
てｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡを合成させた（Krieg,
P.A. およびMelton, D.A., Nucleic Acid Res., 12, 7
057 (1984) ；およびKonarska, M.M.ら、Cell, 38, 731
(1984)) 。(4) Measurement of Human BCDF Activity The polypeptide which controls the production of the human BCDF gene identified as described above or a substance comprising the polypeptide has the human BCDF activity by the following method. confirmed. The BamHI DNA fragment containing the entire human BCDF cDNA insert of plasmid ph-IL-5-30 and a small portion of the vector DNA was pS
Recloned into the P64 vector. This plasmid is called S
After digestion with all, mRNA was synthesized in vitro using SP6 RNA polymerase (Krieg,
PA and Melton, DA, Nucleic Acid Res., 12 , 7
057 (1984); and Konarska, MM et al., Cell, 38 , 731.
(1984)).
【００３９】このようにして調製したｍＲＮＡ溶液をア
フリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞（ｏｏ
ｃｙｔｅ）に注射し、２０℃４８時間培養後、培養液中
に分泌された生成物を集めて遠心分離して、その上清を
濃縮装置（Centricon 10；Amicon社製）で４倍に濃縮し
たものをヒト・リコンビナントＢＣＤＦとして、以下の
実験に用いた。このヒト・リコンビナントＢＣＤＦがＢ
ＣＤＦＩ活性を持つか否かをＳＡＣで刺激したヒトＢ細
胞のＩｇＭ産生誘導能で調べた。ヒトＢ細胞に富むフラ
クションを正常ヒト血液からSaiki, O. およびRalph,
P., Eur.J.Immunol., 13, 31 (1984))に準じて調製
し、１×１０5 細胞／１００μｌの細胞をＳＡＣ（０．
００１〜０．００２５％）で刺激した。次いで上記ヒト
・リコンビナントＢＣＤＦを１５％濃度になるよう添加
し、３７℃、５％ＣＯ 2 下、６日間培養した。The thus prepared mRNA solution is
Xenopus oocyte (oo)
cyte) and after culturing at 20 ° C. for 48 hours,
The product secreted in is collected and centrifuged.
Concentrate 4 times with a concentrator (Centricon 10; Amicon)
Was used as human recombinant BCDF,
Used for experiments. This human recombinant BCDF is B
Human B cells stimulated with SAC to determine whether they have CDFI activity
The vesicles were examined for their ability to induce IgM production. Hula rich in human B cells
Of normal human blood from Saiki, O. and Ralph,
P., Eur.J.Immunol.,13, 31 (1984))
And 1 × 10Five Cells / 100 μl of cells were applied to SAC (0.
(001-0.0025%). Then the above human
・ Add recombinant BCDF to 15% concentration
And 37 ° C, 5% CO Two And cultured for 6 days.
【００４０】培養上清中のＩｇＭ量をエンザイムイムノ
アッセイキットで測定したところ、１１０ng／ウェルの
値が認められ、コントロールが約５０ng／ウェルであっ
たのに対し、有意にＩｇＭ産生が誘導された。この誘導
はＩＬ−２（５０ｕ／ml）添加によって１３５ng／ウェ
ルまで増強された。コントロールにもＩｇＭ産生が認め
られたのは、完全にＴ細胞を含まないＢ細胞フラクショ
ンを得ることが困難なためと考えられる。When the amount of IgM in the culture supernatant was measured using an enzyme immunoassay kit, a value of 110 ng / well was recognized, and the control was about 50 ng / well, whereas the production of IgM was significantly induced. This induction was enhanced to 135 ng / well by the addition of IL-2 (50 u / ml). The reason why IgM production was also observed in the control is considered to be because it was difficult to obtain a B cell fraction completely containing no T cells.
【００４１】（５）ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子の単離・
同定 既に、実施例（１）で正常ヒト胎盤細胞の染色体にヒト
ＢＣＤＦ遺伝子の存在を認めていたが、ここでは別の供
給源からヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子を単離した。即ち、
その供給源として、ヒト胎児肝臓ＤＮＡのＡｌｕＩ−Ｈ
ａｅIII 部分消化断片を持つシャロン４Ａファージライ
ブラリー（Maniatis, T.ら、Cell, 15,687-702(197
8))、ヒト胎盤ＤＮＡのＥｃｏＲＩ部分消化断片をもつ
シャロン４Ａファージライブラリー（Yaoita, Y.および
Honjo, T., Biomed.Res.１, 164(1980) に準じて作製）
およびヒトＩｇＥ産生ミエローマ細胞株２６６Ｂ１のＤ
ＮＡのＥｃｏＲＩ部分消化断片を持つシャロン４Ａファ
ージライブラリー（Nishida, Y. ら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA, 79, 3833-3837(1982))を選んだ。(5) Isolation of human BCDF chromosome gene
Identification Although the presence of the human BCDF gene in the chromosome of normal human placental cells was already confirmed in Example (1), the human BCDF chromosomal gene was isolated from another source here. That is,
The source is AluI-H of human fetal liver DNA.
aeIII Sharon 4A phage library with partially digested fragments (Maniatis, T. et al., Cell, 15 , 687-702 (197
8)), a Sharon 4A phage library with EcoRI partially digested fragments of human placental DNA (Yaoita, Y. and
Honjo, T., Biomed. Res. 1 , 164 (1980))
And D of human IgE-producing myeloma cell line 266B1
A Sharon 4A phage library having a partially digested EcoRI fragment of NA (Nishida, Y. et al., Proc. Natl. Acad. S.
ci.USA, 79 , 3833-3837 (1982)).
【００４２】次に、この３種のライブラリーを用いて、
既述のヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断
片（５１５bp）をプローブとしてファージのスクリーニ
ングを、ベクトンおよびデービス（Becton, W.D.および
Davis, R.W., Science, 196, 180-182(1977))の方法に
準じて行った。胎児肝臓、胎盤及びミエローマの各々の
ライブラリーより各５×１０5 個のファージプラークを
スクリーニングしてプローブとハイブリダイズする３個
のクローンλ１２（胎児肝臓ライブラリーより）、λ２
２（胎盤ライブラリーより）およびλ３８（ミエローマ
ライブラリーより）を得た。Next, using these three libraries,
Screening of phage using the PstI-PstI fragment (515 bp) of the human BCDF cDNA described above as a probe was performed by Becton and Davis (Becton, WD and
Davis, RW, Science, 196 , 180-182 (1977)). 3 clones λ12 (from fetal liver library), λ2, which screen 5 × 10 5 phage plaques from each library of fetal liver, placenta and myeloma and hybridize with the probe
2 (from the placenta library) and λ38 (from the myeloma library).
【００４３】続いて、この３個のクローンの制限エンド
ヌクレアーゼ切断地図を常法に従い作製し、ヒトＢＣＤ
Ｆ ｃＤＮＡのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片をプローブとし
て用いたサザンブロットハイブリダイゼーション（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ）分析した。分析のストラテジーおよびヒトＢＣＤＦ
遺伝子の構成を図４に示すが、図中Ｅ，ＨおよびＢは各
々ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩによる切
断部位を示し、黒ボックス部はエクソン領域を示す。こ
の分析の結果によれば、これら３個のクローンのインサ
ートは互いにオーバーラップしており、図４に示す各ク
ローンに共通の３．２kb ＢａｍＨＩ断片のみが上記の
プローブとハイブリダイズした。従ってこの３．２kb
ＢａｍＨＩ断片にヒトＢＣＤＦをコードする全てのエク
ソンが含まれていると考え、この３．２kb ＢａｍＨＩ
断片を分離し、ＨｉｎｄIII で消化後２つになった１．
６kb断片の各々をｐＵＣ１８ベクターにサブクローニン
グした。Subsequently, restriction endonuclease cleavage maps of these three clones were prepared according to a conventional method, and human BCD was prepared.
Southern blot hybridization using a PstI-PstI fragment of F cDNA as a probe (So
Uthern blot hybridizatio
n) Analyzed. Analytical strategies and human BCDF
FIG. 4 shows the structure of the gene. In the figure, E, H and B indicate sites cut by EcoRI, HindIII and BamHI, respectively, and the black box indicates an exon region. According to the results of this analysis, the inserts of these three clones overlapped each other, and only the 3.2 kb BamHI fragment common to each clone shown in FIG. 4 hybridized with the above probe. Therefore, this 3.2 kb
It is thought that the BamHI fragment contains all exons encoding human BCDF, and this 3.2 kb BamHI
The fragments were separated and duplicated after digestion with HindIII.
Each of the 6 kb fragments was subcloned into the pUC18 vector.
【００４４】次いで、Yanisch-Perron, C.ら（Gene, 3
3, 103-119(1985))に従い、上で得られた２個の１．６k
b断片をクローンしたプラスミドの各々を両端からエク
ソヌクレアーゼIII 及びVII で消化して、ユニディレク
ショナルディリーション（ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａ
ｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）ミュータントクローンのシリー
ズを作製した。このミュータントプラスミドのインサー
トのヌクレオチド配列は、常法（Sanger, F.ら、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA, 74, 5463-5469(1977) に従い、ジデ
オキシチェインターミネーション（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃ
ｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）法によって決定し
た。Next, Yanisch-Perron, C. et al. (Gene, 3
3 , 103-119 (1985)) and the two 1.6k obtained above.
Each of the plasmids from which the b-fragment was cloned was digested from both ends with exonucleases III and VII to obtain a unidirectional deletion.
A series of mutant clones was made. The nucleotide sequence of the insert of this mutant plasmid can be determined by standard methods (Sanger, F. et al., Proc.
Atid. Acad. Sci. USA, 74 , 5463-5469 (1977), dideoxy chain termination (dioxy c
(Hin-termination) method.
【００４５】ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子の制限エンドヌ
クレアーゼ地図及び４個のエクソンと３個のイントロン
の配置（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）も、ヌクレオチド
配列分析のストラテジーと共に図４に示す。また、実際
のヒトＢＣＤＦ遺伝子を含むＢａｍＨＩ ３．２kb断片
のヌクレオチド配列を図５〜図９に示す。ここで明らか
になったヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子上のエクソン部分の
ヌクレオチド配列は、先に明らかにしたヒトＢＣＤＦ
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と完全に一致した。The restriction endonuclease map of the human BCDF chromosome gene and the organization of the four exons and three introns are also shown in FIG. 4, along with the strategy for nucleotide sequence analysis. The nucleotide sequence of a 3.2 kb BamHI fragment containing the actual human BCDF gene is shown in FIGS. The nucleotide sequence of the exon part on the human BCDF chromosome gene identified here is based on the human BCDF identified earlier.
It completely matched the nucleotide sequence of the cDNA.
【００４６】上記の結果から、染色体遺伝子において、
第１エクソンは、ヒトＢＣＤＦ前駆体ポリペプチド鎖の
Ｎ末端側の第１アミノ酸（Ｍｅｔ）から第４８アミノ酸
（Ｇｌｕ）迄を、第２エクソンは第４９アミノ酸（Ｔｈ
ｒ）から第５９アミノ酸（Ａｓｎ）迄を、第３エクソン
は第６０アミノ酸（Ｈｉｓ）から第１０２アミノ酸（Ｌ
ｙｓ）迄を、そして第４エクソンは第１０３アミノ酸
（Ｌｙｓ）から第１３４アミノ酸（Ｓｅｒ）迄をそれぞ
れコードしていることが分かった。すなわち、ヒトＢ細
胞分化因子は図５〜図９に示すヒト染色体遺伝子のＢａ
ｍＨＩ ３．２kb断片において、図５の５３５番目のＡ
から、図８の２２１３番目のＴの間にコードされている
ことが判明した。From the above results, in the chromosomal gene,
The first exon is from the first amino acid (Met) to the 48th amino acid (Glu) on the N-terminal side of the human BCDF precursor polypeptide chain, and the second exon is the 49th amino acid (Th).
r) to amino acid 59 (Asn), exon 3 is amino acid 60 (His) to amino acid 102 (L
ys) and exon 4 encodes amino acids 103 (Lys) to 134 (Ser), respectively. That is, the human B cell differentiation factor is Ba of the human chromosome gene shown in FIGS.
In the mHI 3.2 kb fragment, A at position 535 in FIG.
From this, it was found that the code was coded during the 2213th T in FIG.
【００４７】（６）ヒトＢＣＤＦ発現ベクターの造成 実施例（２）で取得したヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡおよび
実施例（５）で取得したヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子を用
いて、次の４種類の動物細胞発現ベクターを作製した。 ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ−ｄｈｆｒ ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒ(6) Construction of Human BCDF Expression Vector Using the human BCDF cDNA obtained in Example (2) and the human BCDF chromosome gene obtained in Example (5), the following four types of animal cell expression vectors were prepared. Produced. pdKCR-hIL-5 cDNA pdKCR-hIL-5 cDNA-dhfr pdKCR-hIL-5gene pdKCR-hIL-5gene-dhfr
【００４８】Ａ）ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡおよ
びｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ−ｄｈｆｒの作製
（図１０） 実施例（２）で、オカヤマ−ベルグ法（Okayama, H. お
よびBerg, P., Mol.Cell Biol., ３，280(1983))に従
い、ｐＣＤベクターにｃＤＮＡをクローニングし、Ｅ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１形質転換クローンｐｈ−ＩＬ−５
−３０を得た。このクローンよりプラスミドを分離し、
ＢａｍＨＩ消化およびＰｓｔＩでの部分消化を行い、ヒ
トＢＣＤＦの全コーディング領域を含むｃＤＮＡである
ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を得た。この断片をファージ
Ｍ１３ｍｐ１９ＤＮＡのＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩサイト間
にクローニングし、Ｍ１３ｍｐ１９−ｈＩＬ−５ｃＤＮ
Ａを得た。A) pdKCR-hIL-5 cDNA and
Of pdKCR-hIL-5 cDNA-dhfr
(FIG. 10) In Example (2), cDNA was cloned into a pCD vector according to the Okayama-Berg method (Okayama, H. and Berg, P., Mol. Cell Biol., 3 , 280 (1983)), and E. .
E. coli HB101 transformed clone ph-IL-5
-30 was obtained. Isolate the plasmid from this clone,
BamHI digestion and partial digestion with PstI were performed to obtain a BamHI-PstI fragment which was a cDNA containing the entire coding region of human BCDF. This fragment was cloned between the BamHI and PstI sites of the phage M13mp19 DNA, and M13mp19-hIL-5cDN.
A was obtained.
【００４９】次いで、ヒトＢＣＤＦコーディング領域の
直近の５′上流にＨｉｎｄIII サイトを導入する目的
で、図１１に示すヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡのＤＮＡ配列
中の２重下線を引いた部位で、同図に示す配列と逆方向
のＤＮＡストランドとハイブリダイズする３０ｍｅｒの
オリゴヌクレオチド： ５′−GCAGAACGTTTCAAGCTTATGAGGATGCTT−３′ （下線部のＡＡＧＣＴＴはＨｉｎｄIII 切断配列を示
す）を用いて常法（Messing, J. in Methods in Enzymo
logy, vol. 101 Part C, pp62-65 (Academic Press, E
d. Wu, R.））に従い、部位特異的ミュータジェネシス
を行い、クローンＭ１３ｍｐ１９−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ
（ＨｉｎｄIII ）を得た。Next, in order to introduce a HindIII site immediately 5 ′ upstream of the human BCDF coding region, the double underlined site in the human BCDF cDNA DNA sequence shown in FIG. 30-mer oligonucleotide that hybridizes with the DNA strand in the opposite direction to that of 5'-GCAGAACGTTTC AAGCTT ATGAGGATGCTT-3 '
logy, vol. 101 Part C, pp62-65 (Academic Press, E
d. Wu, R.)), site-specific mutagenesis was performed and clone M13mp19-hIL-5 cDNA
(HindIII) was obtained.
【００５０】このファージＤＮＡをＨｉｎｄIII で消化
し、ヒトＢＣＤＦの全コーディング領域に相当するｃＤ
ＮＡを含むＨｉｎｄIII 断片をベクターｐｄＫＣＲ（Ni
kaido, T. ら、Nature, 311, 631−635 (1984)：ｐｄＫ
ＣＲベクターはｐＫＣＲベクターのｐＢＲ３２２部分が
ｐＢＲ３２７に置換したベクターである）のＨｉｎｄII
I サイトに正しい方向に導入し、発現ベクターｐｄＫＣ
Ｒ−ｈＩＬ−５−ｃＤＮＡを作製した。This phage DNA was digested with HindIII, and cD corresponding to the entire coding region of human BCDF was obtained.
The HindIII fragment containing NA is transferred to the vector pdKCR (Ni
Kaido, T. et al., Nature, 311, 631-635 (1984): pdK.
The CR vector is a vector in which the pBR322 portion of the pKCR vector is replaced with pBR327).
Introduction into the I site in the correct direction, the expression vector pdKC
R-hIL-5-cDNA was prepared.
【００５１】次に、この発現ベクターｐｄＫＣＲ−ｈＩ
Ｌ−５ｃＤＮＡのＳａｌＩサイトにジヒドロ葉酸レダク
ターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａ
ｓｅ：ｄｈｆｒ）遺伝子発現ユニットを導入する目的
で、ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡプラスミドをＳａ
ｌＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで切断部位を粘
着末端とした。ｄｈｆｒ遺伝子発現ユニットは、ｐＳＶ
2 ｄｈｆｒ（ＢＲＬ Ｉｎｃ．）のＰｖｕIIサイトにＢ
ａｍＨＩリンカーを付加したプラスミドｐＳＶ2ｄｈｆ
ｒ−ＢＬを作製し、これをＢａｍＨＩで消化後、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで切断部位を粘着末端として、ｄｈｆ
ｒ遺伝子発現ユニット断片を分離した。この断片を先に
得た１カットの入ったｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ
に連結して、ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５−ｄｈｆｒを作製
した。Next, the expression vector pdKCR-hI
Dihydrofolate reductase (dihydrofolate reductase) is added to the SalI site of L-5 cDNA.
(se: dhfr) In order to introduce a gene expression unit, pdKCR-hIL-5 cDNA plasmid was
After digestion with I1, the cleavage site was made sticky with T4 DNA polymerase. The dhfr gene expression unit is pSV
2 dhfr (BRL Inc.) PvuII site
plasmid pSV 2 dhf with amHI linker added
After preparing r-BL and digesting it with BamHI, T4D
Dhf
The r gene expression unit fragment was isolated. This fragment was obtained from the pdKCR-hIL-5 cDNA containing one cut previously obtained.
To create pdKCR-hIL-5-dhfr.
【００５２】Ｂ）ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ及び
ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５−ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒの作製
（図１２） 実施例（５）で得たヒトＢＣＤＦ遺伝子を有するファー
ジクローンλ１２から、ヒトＢＣＤＦをコードする全遺
伝子領域を含む３．２kbＢａｍＨＩ断片を分離してｐＵ
Ｃ１８ベクターにサブクローニングし、形質転換体ｐＵ
Ｃ１８−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅを得た。この形質転換体の
プラスミドをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し、ヒト
ＢＣＤＦをコードする全遺伝子領域を含むＢａｍＨＩ−
ＰｓｔＩ断片（２．２kb）を得た。この断片をファージ
Ｍ１３ｍｐ１９ＤＮＡのＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩサイト間
にクローニングし、Ｍ１３ｍｐ１９−ｈＩＬ−５ｇｅｎ
ｅを得た。B) pdKCR-hIL-5gene and
Production of pdKCR-hIL-5-gene-dhfr
(FIG. 12) From the phage clone λ12 having the human BCDF gene obtained in Example (5), a 3.2 kb BamHI fragment containing the entire gene region encoding human BCDF was isolated and pU
Subcloned into C18 vector and transformant pU
C18-hIL-5gene was obtained. The plasmid of this transformant was digested with BamHI and PstI, and BamHI-containing the entire gene region encoding human BCDF.
A PstI fragment (2.2 kb) was obtained. This fragment was cloned between the BamHI and PstI sites of the phage M13mp19 DNA, and M13mp19-hIL-5gen was cloned.
e was obtained.
【００５３】次いで、前記Ａ）と同様に、部位特異的ミ
ュータジェネシスを行い、ヒトＢＣＤＦコーディング領
域の直近の５′上流にＨｉｎｄIII サイトが導入された
クローンＭ１３ｍｐ１９−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ（Ｈｉｎ
ｄIII ）を得た。このファージＤＮＡをＢａｍＨＩとＰ
ｓｔＩで消化し、ヒトＢＣＤＦ遺伝子をｐＵＣ１９にサ
ブクローニングして得たプラスミドｐＵＣ１９−ｈＩＬ
−５ｇｅｎｅ（ＨｉｎｄIII ）を更にＨｉｎｄIII で部
分的に消化して、ヒトＢＣＤＦをコードする全遺伝子領
域をベクターｐｄＫＣＲのＨｉｎｄIII サイトに正しい
方向で導入して、発現ベクターｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５
ｇｅｎｅを作製した。Next, site-specific mutagenesis was carried out in the same manner as in the above A), and a clone M13mp19-hIL-5gene (Hin) in which a HindIII site was introduced immediately 5 ′ upstream of the human BCDF coding region.
dIII) was obtained. This phage DNA was converted to BamHI and P
Plasmid pUC19-hIL obtained by digesting with stI and subcloning the human BCDF gene into pUC19
-5gene (HindIII) was further partially digested with HindIII to introduce the entire gene region encoding human BCDF into the HindIII site of the vector pdKCR in the correct orientation, and the expression vector pdKCR-hIL-5 was obtained.
gene was prepared.
【００５４】次いでこの発現ベクターのＮｒｕＩサイト
にｄｈｆｒ遺伝子発現ユニットを導入する目的でｐｄＫ
ＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅプラスミドをＮｒｕＩで消化
し、生成した粘着末端に前記Ａ）で得られたｄｈｆｒ遺
伝子発現ユニット断片を連結させて、ｐｄＫＣＲ−ｈＩ
Ｌ−５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒを作製した。以上で作製した
４種の発現ベクターは、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉ
ｒｕｓ４０）アーリープロモーターによりヒトＢＣＤＦ
およびｄｈｆｒの発現が司られており、また、ＳＶ４０
の複製オリジンを含んでいる。さらに、発現量を増強さ
せるため、ヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡ及びヒトＢＣＤＦ遺
伝子共に５′および３′非翻訳領域の不必要な部分が除
去されている。Next, in order to introduce a dhfr gene expression unit into the NruI site of this expression vector, pdK was introduced.
The CR-hIL-5gene plasmid was digested with NruI, and the resulting dhfr gene expression unit fragment obtained in A) was ligated to the sticky end thus produced.
L-5gene-dhfr was prepared. The four types of expression vectors prepared above were SV40 (Simian vi)
rus40) human BCDF by early promoter
And dhfr expression, and SV40
Contains a replication origin. Furthermore, in order to enhance the expression level, unnecessary portions of the 5 'and 3' untranslated regions of both human BCDF cDNA and human BCDF gene have been removed.
【００５５】（７） 動物細胞によるヒトＢＣＤＦの発
現 実施例（６）で作製されたヒトＢＣＤＦ発現ベクターを
用いて、ＣＯＳ−Ｉ細胞およびＣＨＯ細胞でヒトＢＣＤ
Ｆの発現を行わせた。動物細胞株ＣＯＳ−Ｉ（サル腎臓
細胞）は、１０％の牛胎児血清を含むダルベッコの修正
エッセンシャル培地で継代を行い、５０〜７０％コンフ
ルエントの状態の細胞を用いて、Graham, F. L. および
van der Eb, A. J. (Virology, 52, 456−467 (1973)）
に準じて、リン酸カルシウム法でトランスフェクション
を行った。直径１０cmの培養シャーレの細胞当たり各々
１０μｇの、実施例（６）で得られた４種類の発現ベク
ターを使用した。(7) Generation of human BCDF by animal cells
Using the human BCDF expression vector prepared in the present Example (6), human BCCD was expressed in COS-I cells and CHO cells.
Expression of F was performed. The animal cell line COS-I (monkey kidney cells) was passaged in Dulbecco's Modified Essential Medium containing 10% fetal calf serum, and using 50-70% confluent cells, Graham, FL and
van der Eb, AJ (Virology, 52, 456-467 (1973))
The transfection was performed according to the calcium phosphate method according to the method described above. Four types of the expression vectors obtained in Example (6) were used in an amount of 10 μg per cell in a culture dish having a diameter of 10 cm.
【００５６】３日間、３７℃、５％ＣＯ2 下で培養を行
い、上清のＢＣＤＦ活性を調べると共に、細胞からFree
man ら（Proc.Natl.Acad.Sci. USA,80,4094 （1983））
に従ってＲＮＡを抽出した。得られたＲＡＮを用いて、
Nambu,J.R.ら（Cell, 35,47-56（1983））に従いノーザ
ンブロット分析を行い（２０μｇＲＮＡ／レーン）、ヒ
トＢＣＤＦｍＲＮＡの発現量を調べた。用いたプローブ
は、ヒトＢＣＤＦの全コーディング領域を含むＭ１３ｍ
ｐ１９−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ（ＨｉｎｄIII ）の、Ｈｉ
ｎｄIII −ＰｓｔＩ断片である。ＣＨＯ（チャイニーズ
ハムスター卵巣）細胞での発現はＣＨＯｄｈｆｒ- 株を
用いて行った。細胞は１０％の牛胎児血清を含むＭＥＭ
α+ （ＧＩＢＣＯ）で継代をし、上記と同様にトランス
フェクションを行った。用いた発現ベクターはｐｄＫＣ
Ｒ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ−ｄｈｆｒおよびｐｄＫＣＲ−
ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒである。The cells were cultured for 3 days at 37 ° C. in 5% CO 2 , and the BCDF activity of the supernatant was examined.
man et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 , 4094 (1983))
RNA was extracted according to the following procedure. Using the obtained RAN,
Northern blot analysis (20 μg RNA / lane) was performed according to Nambu, JR et al. (Cell, 35 , 47-56 (1983)) to examine the expression level of human BCDF mRNA. The probe used was M13m containing the entire coding region of human BCDF.
Hi of p19-hIL-5 cDNA (HindIII)
ndIII-PstI fragment. Expression in CHO (Chinese Hamster Ovary) cells was performed using the CHOdhfr − strain. Cells were MEM containing 10% fetal calf serum
The cells were passaged with α + (GIBCO), and transfection was performed in the same manner as described above. The expression vector used was pdKC
R-hIL-5 cDNA-dhfr and pdKCR-
hIL-5gene-dhfr.
【００５７】トランスフェクション後４８時間培養を行
い、weissman, C. (Nucleic AcidsRes. 11, 687 (198
3)) に従い、１０％透析牛胎児血清を含むＭＥＭα
- （ＧＩＢＣＯ）で培養選別後、培養液にメトトレキセ
ート０．１μＭを添加し、更に数日培養を行ってメトト
レキセートに耐性のコロニーを分離し、継代後その上清
のＢＣＤＦ活性を調べた。高発現細胞株を得る目的で、
Simonsen, C.C.およびLevinson, A.D. (Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA, 80, 2495-2499 (1983)) に従い、継代培養
液に更に高濃度のメトトレキセートを段階的に１mMまで
添加し、ヒトＢＣＤＦ産生細胞株を樹立した。After transfection, the cells were cultured for 48 hours, and then cultured in Weissman, C. (Nucleic Acids Res. 11 , 687 (198
According to 3)), MEMα containing 10% dialyzed fetal bovine serum
- (GIBCO) after culture screening, methotrexate 0.1μM was added to the culture solution, methotrexate colonies resistant to separation performed several more days in culture was examined BCDF activity of passages after the supernatant. In order to obtain high expression cell lines,
Simonsen, CC and Levinson, AD (Proc. Natl. Aca
In accordance with d. Sci. USA, 80 , 2495-2499 (1983)), a higher concentration of methotrexate was added stepwise to 1 mM to the subculture to establish a human BCDF-producing cell line.
【００５８】ヒトＢＣＤＦのアッセイ方法は、T cell r
eplacing factor の活性測定方法をとり、Kinashi,T.ら
（Nature,324,70-73（1986））にしたがった。アッセイ
に用いた細胞は、ＢＣＬ1 マウス慢性Ｂ白血病細胞（in
vivo 継代株或いはＢＣＬ1クローン５Ｂ1 ｂ（ＡＴＣ
Ｃ ＴＩＢ１９７））であり、この細胞をサンプル希釈
系列と混和し、５×１０-3個／２００μl ずつ９６穴平
底プレート中で４８時間５％ＣＯ2 、３７℃で培養し
た。The assay method for human BCDF is described in T cell r
The activity of the eplacing factor was measured according to Kinashi, T. et al. (Nature , 324 , 70-73 (1986)). The cells used in the assay, BCL 1 murine chronic B leukemia cells (in
vivo Tsugidaikabu or BCL 1 clone 5B 1 b (ATC
CTIB197)), and the cells were mixed with the sample dilution series, and cultured at 37 ° C. in 5% CO 2 at 5 × 10 −3 cells / 200 μl for 48 hours in a 96-well flat bottom plate.
【００５９】培地は１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−
１６４０であり、５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノ
ール、５０Ｕ／mlのペニシリンＧ、５０μg ／mlのスト
レプトマイシンを含んでいる。４８時間後、細胞を遠心
で集め、ハンクス液で洗浄後、２００μl ／穴に懸濁
し、その半量の１００μl の細胞を用いてプロテインＡ
プラークアッセイをGronowicz,E.ら（Eur.J.Immunol.,
6 ,588-590（1976））に従って行い、ＩｇＭ産生細胞数
を測定した。ＢＣＬ1 細胞がマウス由来であるため、上
記アッセイ法ではヒトＢＣＤＦの測定感度はマウスＢＣ
ＤＦに比して劣る（精製標品を用いた結果では、約１／
１００が、測定可能であった。The medium was RPMI-containing 10% fetal calf serum.
1640, containing 5 × 10 −5 M 2-mercaptoethanol, 50 U / ml penicillin G, 50 μg / ml streptomycin. After 48 hours, the cells were collected by centrifugation, washed with Hanks' solution, suspended in 200 µl / well, and half of the cells (100 µl) were used for protein A.
The plaque assay was performed according to Gronowicz, E. et al. (Eur. J. Immunol.,
6 , 588-590 (1976)), and the number of IgM producing cells was measured. Since BCL 1 cells are derived from mice, the measurement sensitivity of the human BCDF in the above assay mice BC
Inferior to DF (about 1 /
100 were measurable.
【００６０】ＣＯＳ−Ｉ細胞をｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５
ｃＤＮＡ及びｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅの発現ベ
クターでトランスフェクションし、３日後の両細胞のヒ
トＢＣＤＦ ｍＲＮＡをノーザンブロット分析により分
析すると、両者共に１kbに相当する位置にハイブリダイ
ゼーションバンドを認めた。このことはＣＯＳ−Ｉ細胞
中でヒトＢＣＤＦ遺伝子の転写物が正しくスプライスさ
れていることを示した。又ヒトＢＣＤＦ ｍＲＮＡの発
現量は、驚くべきことに、ＣＯＳ−Ｉ／ｐｄＫＣＲ−ｈ
ＩＬ−５ｇｅｎｅの方がＣＯＳ−Ｉ／ｐｄＫＣＲ−ｈＩ
Ｌ−５ｃＤＮＡに比して約２０倍高かった。The COS-I cells were transformed into pdKCR-hIL-5
Transfection with cDNA and pdKCR-hIL-5gene expression vector, and analysis of human BCDF mRNA in both cells 3 days later by Northern blot analysis revealed a hybridization band at a position corresponding to 1 kb in both cases. This indicated that the transcript of the human BCDF gene was correctly spliced in COS-I cells. Also, the expression level of human BCDF mRNA was surprisingly, COS-I / pdKCR-h
IL-5gene has COS-I / pdKCR-hI
It was about 20 times higher than L-5 cDNA.
【００６１】また、ＢＣＤＦ活性を表すプロティンＡ・
プラークアッセイ（ＰＦＣ Ｎｏ．）でも、上記ノーザ
ンブロット分析と同様の傾向が観察された。即ち、両発
現ベクターでトランスフェクションし、３日間培養した
ＣＯＳ−Ｉ細胞の培養上清の２０％と共に培養したＢＣ
Ｌ1 細胞のプラーク形成数を調べたところ表１に示すよ
うに、コントロール（宿主細胞ＣＯＳ−Ｉ）との差で比
較すると、ＣＯＳ−Ｉ／ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎ
ｅの方が、ＣＯＳ−Ｉ／ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮ
Ａより約１７倍も高いプラーク形成数を与えた。Further, protein A.
In the plaque assay (PFC No.), the same tendency as in the Northern blot analysis was observed. That is, BC transfected with both expression vectors and cultured with 20% of the culture supernatant of COS-I cells cultured for 3 days.
L 1 as shown in Table 1 were examined plaque formation number of cells, when compared with the difference between the control (host cell COS-I), COS-I / pdKCR-hIL-5gen
e is COS-I / pdKCR-hIL-5cDN
It gave a plaque formation number about 17 times higher than A.
【００６２】[0062]
【表１】 [Table 1]
【００６３】このことは、ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅ
ｎｅの方がｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡによるより
トランスフェクション効率が高いことに起因する可能性
を否定は出来ないが、むしろヒトＢＣＤＦ遺伝子のイン
トロン部分にＳＶ４０プロモータに働く未知の増強機能
が存在していることを示唆している。This means that pdKCR-hIL-5ge
ne cannot be ruled out to be due to higher transfection efficiency than with pdKCR-hIL-5 cDNA, but an unknown enhancing function acting on the SV40 promoter exists in the intron of the human BCDF gene. Suggest that.
【００６４】（８）ヒトＢＣＤＦの精製と物性 ＣＯＳ−Ｉ細胞をｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅでト
ランスフェクションし、３日間後の培養液６４０ｍl
（直径１０ｃｍの培養シャーレ６４枚分）よりヒトＢＣ
ＤＦの精製を行った。培養液を遠心後、上清をラット抗
マウスＢＣＤＦ（ＩＬ−５）モノクローナル抗体を担体
セルロファイン（チッソ（株））に結合させたアフィニ
ティーカラム（３mlベッド容量）にかけ、ヒトＢＣＤＦ
をカラムに吸着させた（ヒトＢＣＤＦによるＢＣＬ1 細
胞のＩｇＭ産生細胞への変換は、抗マウスＢＣＤＦ抗体
により完全に抑制されたので、本アフィニティーカラム
を精製に使用した）。(8) Purification and physical properties of human BCDF COS-I cells were transfected with pdKCR-hIL-5gene, and 640 ml of the culture solution after 3 days.
(For 64 culture dishes with a diameter of 10 cm)
DF was purified. After the culture solution is centrifuged, the supernatant is applied to an affinity column (3 ml bed capacity) in which a rat anti-mouse BCDF (IL-5) monoclonal antibody is bound to a carrier Cellulofine (Chisso Corporation), and human BCDF is added.
It was adsorbed on a column (conversion to IgM-producing cells of the BCL 1 cells by human BCDF Since was completely inhibited by anti-mouse BCDF antibody, using the affinity column purification).
【００６５】次いでこのカラムを次の順序に従って洗浄
した。 １Ｍ ＮａＣｌ ５０ml、 ０．５％ ＮＰ−４０，５０ml、 ＰＢＳ（ph７．２），５０ml、 Ｈ2 Ｏ，５０ml。Next, the column was washed in the following order. 1M NaCl 50ml, 0.5% NP- 40,50ml, PBS (ph7.2), 50ml, H 2 O, 50ml.
【００６６】次に、４mlの１Ｍ酢酸を使って吸着された
ヒトＢＣＤＦを溶出し、溶出液をスピードバックコンセ
ントレーターによって１００μl まで濃縮した。この濃
縮液をSuperose１２カラム（ファルマシア）を２連結し
たＨＰＬＣにかけ、ゲル濾過による精製を行った。カラ
ムは予め、ＰＢＳ（pH７．２）で平衡化を行い、同じ緩
衝液で溶出した（流速０．３ml／分）。溶出液をＯＤ
210 とバイオアッセイでモニターし、活性画分を分子量
４０Ｋ付近に回収した。その溶出パターンを図１３に示
す。図中、斜線部分はＢＣＤＦ活性を有する画分を示
し、実線は蛋白質を、点線はＢＣＤＦ活性を各々示し、
矢印は標準分子量蛋白質（分子量マーカー）の溶出位置
を示す。Next, the adsorbed human BCDF was eluted using 4 ml of 1M acetic acid, and the eluate was concentrated to 100 μl using a speed back concentrator. This concentrated solution was subjected to HPLC in which two Superose 12 columns (Pharmacia) were connected, and purification by gel filtration was performed. The column was previously equilibrated with PBS (pH 7.2) and eluted with the same buffer (flow rate 0.3 ml / min). OD eluate
Monitored by bioassay with 210 , the active fraction was collected around 40K molecular weight. The elution pattern is shown in FIG. In the figure, hatched portions indicate fractions having BCDF activity, solid lines indicate proteins, and dotted lines indicate BCDF activity, respectively.
Arrows indicate elution positions of standard molecular weight proteins (molecular weight markers).
【００６７】この活性画分をセンシューパックＶＰ−３
０４−１２５１（センシュー科学、プロテインＣ4 に相
当）による逆相ＨＰＬＣにかけた。吸着されたヒトＢＣ
ＤＦを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）存在下、溶
出液のアセトニトリル濃度を０％から８０％に直線的に
上昇させることにより溶出した（流速０．５ml／分）。
その溶出パターンを図１４に示す。図中、斜線部分は、
ＢＣＤＦ活性を有する画分を示し、点線はアセトニトリ
ルの濃度を示す。精製されたヒトＢＣＤＦはアセトニト
リル５５％付近の溶出位置に回収された。収量は約３μ
ｇであった。This active fraction was subjected to Senshu Pack VP-3.
04-1251 was subjected to reverse phase HPLC on a (Senshu Scientific, corresponds to protein C 4). Adsorbed human BC
DF was eluted in the presence of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) by linearly increasing the acetonitrile concentration of the eluate from 0% to 80% (flow rate: 0.5 ml / min).
The elution pattern is shown in FIG. In the figure, the shaded area is
The fraction having BCDF activity is shown, and the dotted line shows the concentration of acetonitrile. The purified human BCDF was recovered at an elution position near 55% of acetonitrile. The yield is about 3μ
g.
【００６８】こうして、精製されたヒトＢＣＤＦについ
て、０．１５μｇ／５０μｌ／レーンでＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分子量測定を行った。
その泳動パターンを図１５に示す。図中、４）は分子量
マーカーのレーンであり、１）〜３）のレーンには次の
処理を行った精製ヒトＢＣＤＦを泳動させた。 １）精製直後のサンプル、２−メルカプトエタノール及
び熱による処理をしていない、 ２）精製直後のサンプル、２−メルカプトエタノール処
理を行い、熱処理はしていない、 ３）精製後溶出液中で、４℃２週間保存したサンプル、
２−メルカプトエタノール及び熱による処理をしていな
い、The purified human BCDF was subjected to molecular weight measurement by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis at 0.15 μg / 50 μl / lane.
The migration pattern is shown in FIG. In the figure, 4) is a lane of a molecular weight marker, and lanes 1) to 3) were subjected to purified human BCDF subjected to the following treatment. 1) A sample immediately after purification, not treated with 2-mercaptoethanol and heat, 2) A sample immediately after purification, treated with 2-mercaptoethanol and not heat-treated, 3) In the eluate after purification, Sample stored at 4 ℃ for 2 weeks,
Not treated with 2-mercaptoethanol and heat,
【００６９】図１５に示すとおり、２−メルカプトエタ
ノール処理及び熱処理をしないヒトＢＣＤＦサンプルで
はゲル濾過の結果と一致して約４０Ｋの単一バンドを示
したが、このサンプルを２−メルカプトエタノール処理
をすると（熱処理はしない）、ゲル上の分子量は約２０
Ｋの単一バンドとなった。また、溶出液（０．１％ＴＦ
Ａ、約５５％アセトニトリル）中、４℃で２週間保持し
た後にも酸化的条件にもかかわらずゲル上の分子量は約
２０Ｋの単一バンドとなった。このことは活性体のヒト
ＢＣＤＦが単量体の分子量約２０Ｋよりなる２量体（分
子量約４０Ｋ）であることを示す。As shown in FIG. 15, the human BCDF sample not treated with 2-mercaptoethanol and heat-treated showed a single band of about 40K in agreement with the result of gel filtration. However, this sample was treated with 2-mercaptoethanol. Then (no heat treatment), the molecular weight on the gel is about 20
It became a single band of K. The eluate (0.1% TF
(A, about 55% acetonitrile), after 2 weeks at 4 ° C., the molecular weight on the gel remained a single band of about 20K despite oxidative conditions. This indicates that the active human BCDF is a dimer having a molecular weight of about 20K (molecular weight of about 40K).
【００７０】精製したヒトＢＣＤＦの２μｇ（単量体と
して約１００ｐｍｏｌｅ）を使い、Ｎ末端アミノ酸配列
の決定をHewick, R. M. ら（J. Biol. Chem., 256, 799
0-7997（1981））に準じて、ガス−フェイズプロテイン
シークエンサーを用いて行った。各サイクルで得られた
フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を逆相系
ＨＰＬＣで分析し、Ｎ末端より２７番目のアミノ酸迄の
配列を第２表に示すとおり決定した。Using 2 μg of purified human BCDF (about 100 pmole as monomer), the N-terminal amino acid sequence was determined by Hewick, RM et al. (J. Biol. Chem., 256, 799).
0-7997 (1981)) using a gas-phase protein sequencer. The phenylthiohydantoin (PTH) amino acid obtained in each cycle was analyzed by reversed-phase HPLC, and the sequence from the N-terminal to the 27th amino acid was determined as shown in Table 2.
【００７１】[0071]
【表２】 [Table 2]
【００７２】この結果は、実施例（３）で示したヒトＢ
ＣＤＦ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列から予想した１３
４個のアミノ酸からなるヒトＢＣＤＦ前駆体は、動物細
胞からの分泌時にＮ末端より１９番目のアミノ酸である
アラニンのＣ末端でリーダー配列が切断され（図３）、
ＣＯＳ−Ｉ細胞あるいはおそらくそのナチュラルなソー
スであるＴ細胞からは、イソロイシンをＮ末端アミノ酸
に持ち、単量体が１１５個のアミノ酸からなる２量体の
糖蛋白質として分泌されることを示すものである。This result is similar to that of human B shown in Example (3).
13 predicted from the nucleotide sequence of CDF cDNA
In the human BCDF precursor consisting of 4 amino acids, the leader sequence is cleaved at the C-terminal of alanine, which is the 19th amino acid from the N-terminus during secretion from animal cells (FIG. 3),
COS-I cells or possibly their natural source, T cells, have isoleucine at the N-terminal amino acid and indicate that the monomer is secreted as a dimeric glycoprotein of 115 amino acids. is there.
【００７３】なお、７番目、１４番目および２０番目に
スレオニン（Ｔｈｒ）が検出されたにもかかわらず、塩
基配列からスレオニンと判断される３番目のアミノ酸が
検出されなかったことは、この３番目のアミノ酸残基に
糖鎖が付加されていることを強く示している。この糖鎖
はＯ−グリコシド結合で付加していると考えられる。以
上よりＣＯＳ−Ｉ細胞によって発現された成熟した組換
え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ヒトＢＣＤＦの性質を次
に示すが、単量体のアミノ酸配列の推定された２次元的
配列を図１６に示す。It should be noted that although threonine (Thr) was detected at the seventh, fourteenth, and twentieth positions, the third amino acid judged to be threonine from the nucleotide sequence was not detected. Strongly indicates that a sugar chain has been added to the amino acid residue. This sugar chain is considered to be added via an O-glycoside bond. The properties of mature recombinant (recombinant) human BCDF expressed by COS-I cells are shown below. The deduced two-dimensional sequence of the amino acid sequence of the monomer is shown in FIG.
【００７４】 Ｎ末端アミノ酸配列がイソロイシンよ
り始まる一種類であること、自然状態での分子量は約４
０Ｋであり、２−メルカプトエタノール処理又は０．１
％ＴＦＡ−５５％アセトニトリルでの長時間処理後では
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で約２０Ｋ
を示すことから、ヒトＢＣＤＦのペプチド部分はホモダ
イマーよりなる。 成熟したヒトＢＣＤＦのペプチド部分はイソロイシ
ンから始まる１１５個のアミノ酸よりなり、単量体のペ
プチド部分の分子量は１３，１４９である。The N-terminal amino acid sequence is one type starting with isoleucine, and the molecular weight in the natural state is about 4
0K, 2-mercaptoethanol treatment or 0.1
-20K on SDS-polyacrylamide electrophoresis gel after prolonged treatment with% TFA-55% acetonitrile
Therefore, the peptide portion of human BCDF consists of a homodimer. The peptide portion of mature human BCDF consists of 115 amino acids starting with isoleucine, and the molecular weight of the monomeric peptide portion is 13,149.
【００７５】 成熟したヒトＢＣＤＦは２量体性の糖
蛋白質である。このことは、成熟ヒトＢＣＤＦのアミノ
酸配列中Ｎ末端から２８番目及び７１番目のアスパラギ
ンがＮ−グリコシド化を受ける可能性のある配列である
こと、又３番目のスレオニンがアミノ酸配列決定におい
て検出出来なかったことより、Ｏ−グリコシド化を受け
ていると考えられること、単量体の分子量がＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動ゲル上で約２０Ｋであ
り、ペプチド部分の分子量１３，１４９と開きがあるこ
となどから推察される。従って、成熟ヒトＢＣＤＦ単量
体には分子量の合計が約７，０００弱の糖鎖が結合して
いると考えられる。[0075] Mature human BCDF is a dimeric glycoprotein. This indicates that the asparagine at positions 28 and 71 from the N-terminus in the amino acid sequence of mature human BCDF are likely to undergo N-glycosidation, and that the threonine at position 3 cannot be detected in the amino acid sequencing. Therefore, it is considered that O-glycosidation has occurred, the molecular weight of the monomer is about 20K on the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel, and the molecular weight of the peptide portion is 13,149, which is different from that of the peptide part. Inferred from such. Therefore, it is considered that a sugar chain having a total molecular weight of about less than 7,000 is bound to the mature human BCDF monomer.
【００７６】 成熟ヒトＢＣＤＦのアミノ酸配列中、
Ｎ末端から４４番目及び８６番目のシステインの状態は
不明であるが、０．１％ＴＦＡ−５５％アセトニトリル
の長時間処理で酸化条件にもかかわらず、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動ゲル上で単量体に相当する
分子量を示すことから、２量体の形成は分子間のＳ−Ｓ
架橋によるものではないと考えられる。しかし、２−メ
ルカプトエタノール処理で速やかにＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動ゲル上で単量体に解離することよ
り、Ｓ−Ｓ架橋が単量体の分子内に存在し、２量体形成
に必要なコンフォメーション保持を司っていることが考
えられる。これらの観察より４４番目のシステインと８
６番目のシステインは分子内架橋を形成しているのでは
ないかと推察される。In the amino acid sequence of mature human BCDF,
The status of the cysteines at positions 44 and 86 from the N-terminus is unknown, but the cysteines at 0.1% TFA-55% acetonitrile were treated on a SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel despite prolonged treatment under oxidizing conditions. It shows the molecular weight corresponding to the dimer, so that the formation of the dimer is due to the intermolecular SS
It is not due to crosslinking. However, the two-mercaptoethanol treatment promptly dissociates the monomer on the SDS polyacrylamide gel electrophoresis gel, so that the SS crosslink exists in the monomer molecule and is necessary for dimer formation. It is thought that it is responsible for conformation retention. From these observations, cysteine at position 44 and 8
It is speculated that the sixth cysteine may form an intramolecular crosslink.
【００７７】 ヒトＢＣＤＦ遺伝子の解析から判った
エクソン−イントロン構造より、成熟ヒトＢＣＤＦの第
１アミノ酸（Ｉｌｅ）から第２９アミノ酸（Ｇ１ｕ）迄
が第１エクソン、第３０アミノ酸（Ｔｈｒ）から第４０
アミノ酸（Ａｓｎ）迄が第２エクソン、第４１アミノ酸
（Ｈｉｓ）から第８３アミノ酸（Ｌｙｓ）迄が第３エク
ソン、第８４アミノ酸（Ｌｙｓ）から第１１５アミノ酸
（Ｓｅｒ）が第４エクソンに由来している。 ヒトＢＣＤＦの精製は、ＣＯＳ−Ｉ細胞のトランジ
エント・エクスプレッション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）による培養液６４０mlから出発し
て、純粋なヒトＢＣＤＦを約３μｇ得た。ＣＯＳ−Ｉ細
胞のトランスフォーメーションの効率が約１０-3である
ことを考えると、ＣＨＯ／ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅ
ｎｅ−ｄｈｆｒ細胞株の発現量はヒトＢＣＤＦの医療等
へのより広範囲の利用を目的とした生産株となり得ると
考えられる。From the exon-intron structure found from the analysis of the human BCDF gene, the first amino acid (Ile) to the 29th amino acid (G1u) of the mature human BCDF correspond to the 1st exon and the 30th amino acid (Thr) to the 40th amino acid.
Amino acids (Asn) are derived from the second exon, 41st amino acids (His) to 83rd amino acids (Lys) are derived from the 3rd exon, 84th amino acids (Lys) to 115th amino acids (Ser) are derived from the 4th exon. I have. Purification of human BCDF can be accomplished by the transient expression of COS-I cells.
Starting from 640 ml of culture by xpression, approximately 3 μg of pure human BCDF were obtained. Considering that the transformation efficiency of COS-I cells is about 10 -3 , CHO / pdKCR-hIL-5ge
It is thought that the expression level of the ne-dhfr cell line can be a production strain for the purpose of utilizing human BCDF for a wider range of uses in medicine and the like.
【００７８】[0078]
【発明の効果】本発明によればヒトＢＣＤＦＩ活性を示
す物質をコードするＤＮＡ配列およびそのポリペプチド
部分の構造が明らかにされ、ＤＮＡ組み換え技術を用い
たヒトＢＣＤＦの大量生産の可能性が提供された。本発
明の方法で得られる組換えヒトＢＣＤＦは、感染症や免
疫不全症などの治療に有用な薬剤として、そのまま或い
は薬学的に許容できる担体とともに薬剤組成物として患
者に投与することが可能である。Industrial Applicability According to the present invention, the structure of a DNA sequence encoding a substance exhibiting human BCDFI activity and the structure of its polypeptide portion are clarified, and the possibility of mass production of human BCDF using DNA recombination technology is provided. Was. The recombinant human BCDF obtained by the method of the present invention can be administered to a patient as it is or as a pharmaceutical composition together with a pharmaceutically acceptable carrier, as a drug useful for the treatment of infectious diseases and immunodeficiencies. .
【図１】図１は、クローン化されたｐｈ−ＩＬ−５−３
０に挿入されているヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡ遺伝子を含
むｃＤＮＡの塩基配列図である。FIG. 1 shows the cloned ph-IL-5-3.
FIG. 2 is a nucleotide sequence diagram of a cDNA containing a human BCDF cDNA gene inserted in 0.
【図２】図２は、図１の塩基配列中のヒトＢＣＤＦポリ
ペプチドをコードする領域を、そのコードするアミノ酸
配列とともに示す図である。FIG. 2 is a view showing a region encoding a human BCDF polypeptide in the nucleotide sequence of FIG. 1 together with the amino acid sequence encoded by the region.
【図３】図３は、図２の下段に示したアミノ酸配列（ヒ
トＢＣＤＦ前駆体のアミノ酸配列）中における、成熟ヒ
トＢＣＤＦポリペプチド部分およびリーダー配列部分を
説明するための図である。FIG. 3 is a diagram for explaining a mature human BCDF polypeptide portion and a leader sequence portion in the amino acid sequence shown in the lower part of FIG. 2 (amino acid sequence of a human BCDF precursor).
【図４】図４は、ヒトＢＣＤＦ遺伝子の塩基配列解析の
ストラテジーおよび当該遺伝子の構成を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing a strategy for analyzing the nucleotide sequence of a human BCDF gene and the structure of the gene.
【図５】図５は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。FIG. 5 shows the human BCDF chromosome gene (BamH
1 is a diagram showing a part of the entire base sequence of I 3.2 kb fragment).
【図６】図６は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。FIG. 6 shows the human BCDF chromosome gene (BamH
1 is a diagram showing a part of the entire base sequence of I 3.2 kb fragment).
【図７】図７は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。FIG. 7 shows the human BCDF chromosome gene (BamH
1 is a diagram showing a part of the entire base sequence of I 3.2 kb fragment).
【図８】図８は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。FIG. 8 shows the human BCDF chromosome gene (BamH
1 is a diagram showing a part of the entire base sequence of I 3.2 kb fragment).
【図９】図９は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。FIG. 9 shows the human BCDF chromosome gene (BamH
1 is a diagram showing a part of the entire base sequence of I 3.2 kb fragment).
【図１０】図１０は、ｃＤＮＡ発現ベクターｐｄＫＣＲ
−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡおよびｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃ
ＤＮＡ−ｄｈｆｒ構築の過程を示す図である。FIG. 10 shows a cDNA expression vector pdKCR.
-HIL-5 cDNA and pdKCR-hIL-5c
It is a figure which shows the process of DNA-dhfr construction.
【図１１】図１１は、ファージＭ１３ｍｐ１９ＤＮＡの
ＢａｍＨＩとＰｓｔＩサイトに挿入されるヒトＢＣＤＦ
ｃＤＮＡの塩基配列を示す図である。FIG. 11 shows human BCDF inserted into BamHI and PstI sites of phage M13mp19 DNA.
It is a figure which shows the base sequence of cDNA.
【図１２】図１２は、ヒトＢＣＤＦ発現ベクターｐｄＫ
ＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅおよびｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−
５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒ構築の過程を示す図である。FIG. 12 shows a human BCDF expression vector pdK.
CR-hIL-5gene and pdKCR-hIL-
It is a figure which shows the process of 5gene-dhfr construction.
【図１３】図１３は、組換えヒトＢＣＤＦのＳｕｐｅｒ
ｏｓｅ１２ＨＰＬＣカラムでのゲル濾過による溶出パタ
ーンを示すグラフである。FIG. 13 shows the recombinant human BCDF Super.
It is a graph which shows the elution pattern by the gel filtration in anose12HPLC column.
【図１４】図１４は、組換えヒトＢＣＤＦのセンシュー
パックＶＰ−３０４−１２５１カラムでの逆相ＨＰＬＣ
による溶出パターンを示すグラフである。FIG. 14 shows reverse phase HPLC of a recombinant human BCDF on a Sensepak VP-304-1251 column.
4 is a graph showing an elution pattern according to the present invention.
【図１５】図１５は、精製された成熟組換えヒトＢＣＤ
ＦのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動染色パター
ンを示す図である。FIG. 15 shows purified mature recombinant human BCD.
It is a figure which shows the SDS polyacrylamide gel electrophoresis staining pattern of F.
【図１６】図１６は、成熟型組換えヒトＢＣＤＦ単量体
のポリペプチド部分のアミノ酸配列の推定された２次元
構造を示す図である。FIG. 16 is a diagram showing a deduced two-dimensional structure of the amino acid sequence of the polypeptide portion of the mature recombinant human BCDF monomer.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI C12P 21/02 C12N 5/00 B // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:91)
Claims (8)
であって、前記のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含
んで成るベクターにより形質転換された宿主細胞を培養
し、該培物から前記ヒトＢ細胞分化因子又はその前駆体
を採取することを特徴とする方法。1. The following amino acid sequence (I): A method for producing a human B cell differentiation factor or a precursor thereof, comprising the steps of: culturing a host cell transformed with a vector comprising the DNA encoding the amino acid sequence; A method comprising collecting a differentiation factor or a precursor thereof.
ある、請求項１又は２に記載の方法。3. The method according to claim 1, wherein the vector is ph-IL-5-30.
アミノ酸配列（Ｉ′）をコードしており、且つイントロ
ンを含有するヒト染色体由来のＤＮＡを含んで成る発現
ベクターにより形質転換された動物細胞を培養し、そし
て培養物からヒトＢ細胞分化因子を採取することを特徴
とする方法。4. The following amino acid sequence (I '): A method for producing a human B-cell differentiation factor, comprising: an animal cell transformed with an expression vector encoding the amino acid sequence (I ') and containing a human chromosome-derived DNA containing an intron. And collecting a human B cell differentiation factor from the culture.
の分子量が約２万の糖蛋白質である請求項４に記載の方
法。5. The method according to claim 4, wherein the human B cell differentiation activating factor is a glycoprotein whose monomer has a molecular weight of about 20,000.
５ｇｅｎｅまたはｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ−ｄ
ｈｆｒで表される、請求項４又は５に記載の製造法。6. The expression vector is pdKCR-hIL-
5gene or pdKCR-hIL-5gene-d
The method according to claim 4, wherein the method is represented by hfr.
子の遺伝子が、次式（III)： 【化５】 【化６】 【化７】 （式中、アミノ酸配列を併記した領域はエクソンを示
し、塩基配列のみを記した領域はイントロンを示す。）
で表される塩基配列で示されることを特徴とする特許請
求の範囲第１１項記載の方法。7. The gene for a human B cell differentiation activating factor containing an intron is represented by the following formula (III): Embedded image Embedded image (In the formula, a region in which an amino acid sequence is shown indicates an exon, and a region in which only a base sequence is shown indicates an intron.)
The method according to claim 11, wherein the method is represented by a base sequence represented by:
はＣＨＯ ｄｈｆｒ - で表される細胞である請求項４〜
７のいずれか１項に記載の方法。8. The animal cell line may be COS-I, CHO or
Is CHO dhfr -A cell represented by the formula:
8. The method according to any one of items 7 to 7.
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