JPH1138008A - Detecting method for autoantibody and detecting reagent - Google Patents
Detecting method for autoantibody and detecting reagentInfo
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- JPH1138008A JPH1138008A JP19096097A JP19096097A JPH1138008A JP H1138008 A JPH1138008 A JP H1138008A JP 19096097 A JP19096097 A JP 19096097A JP 19096097 A JP19096097 A JP 19096097A JP H1138008 A JPH1138008 A JP H1138008A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、自己抗体を検出す
る検出方法および検出試薬に関する。[0001] The present invention relates to a detection method and a detection reagent for detecting an autoantibody.
【０００２】[0002]
【従来の技術】癌の発症は遺伝子の何らかの異常によっ
て起こることが知られており、特に、遺伝子の転写レベ
ルでの変動異常が癌の発症の主たる原因と考えられてい
る。本発明者は、肝臓癌で特異的に発現する遺伝子とし
てＧＡＤＩＩ遺伝子を単離し、その塩基配列および該遺
伝子がコードするアミノ酸配列を決定した。本発明者
は、そのアミノ酸配列からなる組み換え体ＧＡＤＩＩ蛋
白質を作製し、国際出願公開番号ＷＯ９７／１０３３３
号公報に開示した。また、本発明者らにより、ラットで
はＣＳＡＤ（ＧＡＤＩＩと同じ）蛋白質に対する自己抗
体が発現していることが開示されている（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６巻、５２３０−５２３７ペー
ジ（１９９６年））。2. Description of the Related Art It is known that the onset of cancer is caused by some abnormality in a gene. In particular, abnormal fluctuation in the transcription level of a gene is considered to be the main cause of the onset of cancer. The present inventors isolated the GADII gene as a gene specifically expressed in liver cancer, and determined the nucleotide sequence and the amino acid sequence encoded by the gene. The present inventors have prepared a recombinant GADII protein comprising the amino acid sequence, and have published International Application Publication No. WO97 / 10333.
No. published in Japanese Patent Publication No. In addition, the present inventors have disclosed that autoantibodies to CSAD (same as GADII) protein are expressed in rats (Cancer).
Research, Vol. 56, pp. 5230-5237 (1996)).
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、或る特定
の疾患、例えば、肝臓癌や自己免疫疾患を発病している
ヒトにおいてヒトＧＡＤＩＩ蛋白質と反応する抗体が体
内に存在する、すなわち抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体が体
内に存在するのではないかと考えた。本発明は、ヒトの
体液や組織抽出液から抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を検出
することを課題とする。そして、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己
抗体を検出し、その発生量を健常人での発生量と比較す
ることにより、前記特定の疾患、例えば、肝臓癌や自己
免疫疾患を診断することが可能であることを示すことを
課題とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present inventors have found that antibodies reacting with the human GADII protein are present in the body in humans who develop certain diseases, for example, liver cancer and autoimmune diseases, that is, anti-antibodies. It was thought that human GADII autoantibodies might be present in the body. An object of the present invention is to detect an anti-human GADII autoantibody from a human body fluid or tissue extract. Then, by detecting the anti-human GADII autoantibody and comparing the amount generated with that in a healthy person, it is possible to diagnose the specific disease, for example, liver cancer or an autoimmune disease. The task is to show.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトの体内に
存在する抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を、ヒトＧＡＤＩＩ
蛋白質と反応させることにより検出することを開示する
ものである。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to an anti-human GADII autoantibody existing in the human body,
It is to disclose that detection is performed by reacting with a protein.
【０００５】本発明は、配列表の配列番号１に記載した
アミノ酸から成るヒトＧＡＤＩＩ蛋白質（以降、ヒトＧ
ＡＤＩＩということがある）とヒトの体液または組織抽
出液とを反応させ、ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質と反応する抗
ヒトＧＡＤＩＩ抗体を、該体液または該組織抽出液から
分離して検出する検出方法に関するものである。ここ
で、抗ヒトＧＡＤＩＩ抗体はヒトＧＡＤＩＩ蛋白質に対
して天然にヒト体内、特に体液内または組織内に存在す
る抗体であり、自己抗体である。The present invention relates to a human GADII protein (hereinafter referred to as human G
ADII) and a human body fluid or tissue extract, and an anti-human GADII antibody that reacts with human GADII protein is separated from the body fluid or the tissue extract and detected. . Here, the anti-human GADII antibody is an antibody that naturally exists in the human body, particularly in a body fluid or tissue, against the human GADII protein, and is an autoantibody.
【０００６】また、本発明は、ヒトの体液または組織抽
出液に存在することが前記の検出方法によって確認され
た抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体と抗原抗体反応することが
可能な蛋白質であって、かつ該蛋白質が配列表の配列番
号１に記載のアミノ酸配列における連続する８アミノ酸
残基以上のアミノ酸配列からなる蛋白質に関するもので
ある。この蛋白質は、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体の検出
に使用することができる。[0006] The present invention also relates to a protein capable of performing an antigen-antibody reaction with an anti-human GADII autoantibody confirmed to be present in a human body fluid or tissue extract by the above detection method, and The present invention relates to a protein consisting of an amino acid sequence of 8 or more consecutive amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. This protein can be used to detect anti-human GADII autoantibodies.
【０００７】また、本発明は、ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質と
反応する自己抗体を検出する検出試薬であって、前記に
記載の蛋白質を含むことを特徴とする検出試薬に関する
ものである。さらに、本発明は、前記検出試薬を用い
て、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を検出する検出方法に関
するものである。[0007] The present invention also relates to a detection reagent for detecting an autoantibody that reacts with a human GADII protein, which comprises the protein described above. Furthermore, the present invention relates to a detection method for detecting an anti-human GADII autoantibody using the detection reagent.
【０００８】また、本発明は前記の検出試薬を含むこと
を特徴とする検出キットに関するものである。さらに、
本発明は前記検出キットを用いて抗ヒトＧＡＤＩＩ自己
抗体を検出する検出方法に関するものである。[0008] The present invention also relates to a detection kit comprising the above-mentioned detection reagent. further,
The present invention relates to a detection method for detecting an anti-human GADII autoantibody using the detection kit.
【０００９】[0009]
【発明の実施の形態】本発明者は、ヒトＧＡＤＩＩ蛋白
質を利用して、ヒトの体液または組織抽出液から抗ヒト
ＧＡＤＩＩ自己抗体の検出ができないか検討した。ま
ず、ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質とヒトの血清を反応させるこ
とを試みた。具体的にはＥＬＩＳＡ法を試行した結果、
血清中に抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体が天然に存在するこ
とを確認した。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present inventor examined whether it is possible to detect an anti-human GADII autoantibody from a human body fluid or tissue extract using human GADII protein. First, an attempt was made to react human GADII protein with human serum. Specifically, as a result of trying the ELISA method,
It was confirmed that anti-human GADII autoantibodies were naturally present in the serum.
【００１０】本発明において、ヒト体液中または組織抽
出液中からヒトＧＡＤＩＩ蛋白質と反応する抗体を検出
する方法は、一般に抗原−抗体反応を利用する方法が使
用可能である。体液または組織抽出液中の抗ヒトＧＡＤ
ＩＩ自己抗体を検出するには、抗原を標識しておくこと
あるいは自己抗体と結合もしくは反応する物質、例えば
標識化された二次抗体、抗原アナログまたはプロテイン
ＧもしくはプロテインＡを用いることが可能である。抗
原アナログは、ペプチド、修飾ペプチド、高分子有機化
合物等がある。標識の手段としては蛍光物質（ＦＩＴＣ
やローダミン等）等を用いることが可能であり、これ以
外にも、放射性同位元素（ＲＩ）、酵素（アルカリフォ
スファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）等）またはアビジンもしくはビオチンが利用
される。また、二次抗体としては、抗ヒトＩｇ抗体等の
抗原特異性の広いものが好ましい。In the present invention, a method utilizing an antigen-antibody reaction can be generally used as a method for detecting an antibody that reacts with the human GADII protein from a human body fluid or tissue extract. Anti-human GAD in body fluids or tissue extracts
To detect II autoantibodies, it is possible to label the antigen or use a substance that binds or reacts with the autoantibody, such as a labeled secondary antibody, antigen analog or protein G or protein A. . Antigen analogs include peptides, modified peptides, high molecular weight organic compounds, and the like. As a means for labeling, a fluorescent substance (FITC
And rhodamine) can be used. In addition, radioisotopes (RI), enzymes (such as alkaline phosphatase (AP), horseradish peroxidase (HRP)), avidin or biotin are also used. As the secondary antibody, one having a wide antigen specificity such as an anti-human Ig antibody is preferable.
【００１１】酵素反応を利用する方法としては、例え
ば、ＥＬＩＳＡ法、免疫凝集法、ウェスタンブロット
法、フローサイトメトリーを用いた免疫反応分子の同定
方法又はそれらに類似する方法が挙げられる。前記以外
に、抗体を検出する方法としては、ウェスタンブロッテ
ィング法が使用可能であり、その結果現れるバンドの画
像情報ををイメージスキャナでコンピュータにデータと
して取り込み、コンピュータ上でバンドの密度を定量化
することも可能である。[0011] Examples of the method using an enzyme reaction include an ELISA method, an immunoagglutination method, a Western blot method, a method for identifying an immunoreactive molecule using flow cytometry, or a method similar thereto. In addition to the above, as a method for detecting an antibody, a Western blotting method can be used, and the image information of the resulting band is captured as data by a computer using an image scanner, and the band density is quantified on a computer. Is also possible.
【００１２】また、抗体を検出する方法として免疫沈降
法も使用可能である。本発明の場合、検体に、抗原とな
るヒトＧＡＤＩＩをビーズ等に結合させて見かけ上大き
な分子としたものを加えて、抗原抗体反応によりヒトＧ
ＡＤＩＩに結合または会合した抗体を遠心分離等により
分離することが可能である。[0012] Immunoprecipitation can also be used as a method for detecting antibodies. In the case of the present invention, human GADII serving as an antigen is bound to beads or the like to form an apparently large molecule.
Antibodies bound or associated with ADII can be separated by centrifugation or the like.
【００１３】一般に、抗原において、ある抗体により認
識される部位はアミノ酸数でいうと４アミノ酸程度と言
われている。分子量の小さなポリペプチドの場合、好ま
しくは８アミノ酸残基以上からなるポリペプチドであれ
ば、該ポリペプチドを免疫することにより該ポリペプチ
ドに対する抗体が得られることが知られている。したが
って、本発明において、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を検
出するには、必ずしも配列表の配列番号１に記載したア
ミノ酸配列の全長からなるヒトＧＡＤＩＩでなくとも、
その一部分であって、８アミノ酸残基以上からなる蛋白
質には、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を検出することがで
きる蛋白質が存在することが予想される。実際に、この
蛋白質を得るためには、まず全長のヒトＧＡＤＩＩで抗
ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を検出し、その自己抗体によ
り、ヒトＧＡＤＩＩの一部分である蛋白質であって該自
己抗体と反応するものをスクリーニングして得ることが
出来る。スクリーニング時の検出方法は、一般に、前記
の抗原−抗体反応を利用する方法が使用可能である。In general, in an antigen, the site recognized by a certain antibody is said to be about 4 amino acids in terms of the number of amino acids. In the case of a polypeptide having a small molecular weight, it is known that an antibody against the polypeptide can be obtained by immunizing the polypeptide, preferably a polypeptide consisting of 8 amino acid residues or more. Therefore, in the present invention, in order to detect an anti-human GADII autoantibody, it is not always necessary to use human GADII consisting of the full-length amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
It is expected that a protein which is a part of the protein and comprises 8 amino acid residues or more can detect an anti-human GADII autoantibody. Actually, in order to obtain this protein, first, an anti-human GADII autoantibody is detected with full-length human GADII, and the autoantibody is used to screen for a protein that is a part of human GADII and reacts with the autoantibody. Can be obtained. As a detection method at the time of screening, generally, the above-mentioned method utilizing the antigen-antibody reaction can be used.
【００１４】前記の配列表の配列番号１に記載したアミ
ノ酸配列からなるヒトＧＡＤＩＩの一部分であって、８
アミノ酸残基以上からなる蛋白質の作製には、公知の方
法が使用可能である。例えば、アミノ酸数が少ないとき
は、ペプチドシンセサイザーにより化学合成することが
可能である。A part of human GADII consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the above sequence listing,
Known methods can be used to prepare proteins consisting of amino acid residues or more. For example, when the number of amino acids is small, it can be chemically synthesized using a peptide synthesizer.
【００１５】また、比較的大きな蛋白質（３０アミノ酸
程度より多くのアミノ酸からなる蛋白質）の場合は、配
列表の配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子（ヒ
トＧＡＤＩＩ遺伝子）を鋳型にしてＰＣＲ法により好み
の部位または全長を増幅し、該増幅して得られた遺伝子
を適当な制限酵素部位等で切断して短くし、該短くした
遺伝子を導入した形質転換体を作製し、該形質転換体に
蛋白質を作製させ、該形質転換体から蛋白質を回収して
精製することにより、目的とする蛋白質を得ることがで
きる。In the case of a relatively large protein (a protein consisting of more than about 30 amino acids), PCR is performed by using a gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 (human GADII gene) as a template. To amplify the desired site or full length, cut the gene obtained by the amplification with an appropriate restriction enzyme site or the like to shorten it, prepare a transformant into which the shortened gene has been introduced, and prepare the transformant. Then, the target protein can be obtained by recovering the protein from the transformant and purifying the protein.
【００１６】本発明の抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を検出
する検出試薬は、前記の蛋白質を含むことを特徴とし、
該蛋白質以外に該試薬に含まれるのが好ましい物質は、
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシ貝ヘモシアニン
（ＫＬＨ）、スキムミルク等、一般に使用されているも
のが使用可能である。[0016] A detection reagent for detecting an anti-human GADII autoantibody of the present invention comprises the above-mentioned protein,
Substances preferably contained in the reagent other than the protein include:
Commonly used ones such as bovine serum albumin (BSA), keyhole limpet hemocyanin (KLH), and skim milk can be used.
【００１７】また、本発明の検出キットに含まれる要素
は前記の検出試薬の他、反応条件に適した緩衝液、ブロ
ッキング溶液、界面活性剤、発色試薬（酵素基質）、酵
素液等が挙げられる。発色剤として蛍光試薬を使用する
場合は、蛍光増強試薬、蛍光退色防止剤を使用すること
が好ましい。The components contained in the detection kit of the present invention include, in addition to the above detection reagents, buffers, blocking solutions, surfactants, color reagents (enzyme substrates), enzyme solutions, etc., which are suitable for the reaction conditions. . When a fluorescent reagent is used as a color former, it is preferable to use a fluorescent enhancer and a fluorescent anti-fading agent.
【００１８】[0018]
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに詳述す
るが、本発明はこの例に限定されるものではない。な
お、酵素に関しては、特に記載がない限り、宝酒造社製
のものを、当該酵素の使用説明書にしたがって用いた。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples. In addition, about the enzyme, the thing made from Takara Shuzo Co., Ltd. was used according to the instruction manual of the said enzyme, unless there is particular description.
【００１９】Ｉ．ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質の作製 １．ヒトＧＡＤＩＩ遺伝子導入形質転換体の調製 １）工業技術院生命科学研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５６５３で寄託されているヒトＧＡＤＩＩ遺伝子
（配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝
子）を導入した形質転換大腸菌ＪＭ１０９から、アルカ
リ法（『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃ
ｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ』１．３３−１．４３ページ）
によりプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクタ
ー）を回収した。I. Preparation of human GADII protein Preparation of human GADII gene-introduced transformant 1) Accession number FERM B from National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
From the transformed Escherichia coli JM109 into which the human GADII gene (gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) deposited in P-5653 was introduced, an alkaline method (“Molecular Cloning Sec”) was performed.
on Edition ”, pages 1.33-1.43)
The plasmid (pBluescriptII vector) was recovered by the procedure described above.
【００２０】２）ヒトＧＡＤＩＩ遺伝子を、図１に示さ
れるヒスチジンタグを導入したｐＥＴ３ａベクターに組
み込んだ。以下にその詳細を記す。 （１）まず、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを、
ＰＣＲ法（『Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ』ｃｈａｐｔ
ｅｒ１５に記載）により、次の式（１）及び式（２）の
塩基配列のプライマーを用いて、ヒトＧＡＤＩＩ遺伝子
の第一メチオニン部分をコードする塩基配列の前にＥｃ
ｏＲＩサイトを導入して増幅した。式（１）の塩基配列
を配列表の配列番号３に、式（２）の塩基配列を配列表
の配列番号４に示す。 ５’ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＣＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＡＡＡ ＣＣ Ａ ＣＴＣ ＡＧＡ Ａ ３’ ・・・式（１） ５’ＧＣＡ ＣＴＧ ＡＣＣ ＡＧＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＣ ３’ ・・・式（２）2) The human GADII gene was inserted into the histidine tag-introduced pET3a vector shown in FIG. The details are described below. (1) First, the pBluescriptII vector is
PCR method (“Current Protocols i
nmolecular biology ”chapter
er15), a primer having the nucleotide sequence of the following formula (1) or (2) was used to add Ec before the nucleotide sequence encoding the first methionine portion of the human GADII gene.
An oRI site was introduced for amplification. The nucleotide sequence of formula (1) is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, and the nucleotide sequence of formula (2) is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. 5 'GAA TTC CCC ATG GCT GAC TCA AAACC ACTCTC AGA A 3' ... Formula (1) 5 'GCA CTG ACC AGA AAT GGC AC 3' ... Formula (2)
【００２１】（２）増幅された遺伝子をＥｃｏＲＩおよ
びＳａｃＩで切断して切り出した。 （３）別に、ヒトＧＡＤＩＩ遺伝子を挿入したｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩのヒトＧＡＤＩＩ遺伝子のＣ末端側
に存在する残りの部分をＢｇｌＩＩで切断した。その
後、クレノーフラグメントで平滑化した後、ＳａｃＩで
切断して遺伝子を切り出した。 （４）（２）で切り出した遺伝子と（３）で切り出した
遺伝子とをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｐａｃｋ（登録商標、日
本ジーン社製）を用いてその取扱説明書に従い連結し、
ヒトＧＡＤＩＩ遺伝子を作製した。 （５）図１に示すヒスチジンタグを導入したｐＥＴ３ａ
ベクターをＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩで切断した後、脱リン
酸化処理を行った。(2) The amplified gene was cut out with EcoRI and SacI. (3) Separately, pBlu into which the human GADII gene has been inserted
The remaining part of Escript II at the C-terminal side of the human GADII gene was digested with BglII. Then, after blunting with Klenow fragment, the gene was cut out by cutting with SacI. (4) The gene excised in (2) and the gene excised in (3) are ligated using Ligation Pack (registered trademark, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) according to the instruction manual, and
The human GADII gene was created. (5) pET3a into which the histidine tag shown in FIG. 1 has been introduced
After cutting the vector with EcoRI and SmaI, a dephosphorylation treatment was performed.
【００２２】（６）（４）で作製したヒトＧＡＤＩＩ遺
伝子と（５）で作製されたベクターとを、Ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ Ｐａｃｋ（登録商標、日本ジーン社製）を用いて
その取扱説明書に従い連結した。なお、前記過程でのベ
クターに挿入された遺伝子の確認は、挿入断片の塩基配
列を読み取って行った。 （７）ヒトＧＡＤＩＩ遺伝子を組み込んだプラスミド
（ｐＥＴ３ａベクター）を『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ』ｃｈａｐ
ｔｅｒ１に記載の方法で大量調製した。(6) The human GADII gene prepared in (4) and the vector prepared in (5) are ligated with Ligati.
The connection was made using on Pack (registered trademark, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) according to the instruction manual. The identification of the gene inserted into the vector in the above process was performed by reading the base sequence of the inserted fragment. (7) Plasmid (pET3a vector) into which the human GADII gene has been inserted is referred to as "Molecular Cl
oning Second Edition 'cap
A large amount was prepared by the method described in ter1.
【００２３】２．ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質の調製 １）大量調製したプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳに導入した。 ２）該大腸菌をアンピシリン１００μｇ／ｍｌ、クロラ
ムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で培養
し、分光光度計（ベックマン社製）で濁度が６００ｎｍ
の波長で０．５になった時点でＩＰＴＧを０．５ｍＭに
なるように加え、ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質の発現誘導を行
った。この培養は計４ｌ行った（８００ｍｌ×５本）。2. Preparation of human GADII protein 1) Large-scale preparation of plasmid was performed using Escherichia coli BL21 (DE
3) Introduced into pLysS. 2) The Escherichia coli was cultured in an LB medium containing 100 μg / ml of ampicillin and 25 μg / ml of chloramphenicol, and the turbidity was 600 nm using a spectrophotometer (manufactured by Beckman).
When the wavelength reached 0.5 at the above wavelength, IPTG was added to 0.5 mM to induce the expression of human GADII protein. This culture was performed for a total of 4 l (800 ml x 5 tubes).
【００２４】３）２時間後、遠心分離により大腸菌を回
収し、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ７．９、 １０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、
０．５Ｍ ＮａＣｌ、 ０．１％ ＮＰ４０、 ５ｍ
Ｍ ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、 １ｍＭ
ＰＭＳＦ）に懸濁した後４℃でソニケーションにより大
腸菌を破砕し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ ＸＬ−
８０を使用し、５０．２Ｔｉローターで１８００ｒｐ
ｍ、４℃で１５分間遠心分離した。その後、上清を取
り、１Ｍイミダゾール（ｐＨ７．５）を終濃度１０ｍＭ
になるように加え、Ｎｉ−アガロース（登録商標、キア
ゲン社製）を用いて、非変性条件で取扱い説明書の通り
に精製した。また、沈殿物を６Ｍ塩酸グアジニンに溶解
し、Ｎｉ−アガロース（キアゲン製）を用いて、変性条
件で取扱い説明書の通りに精製した。以降の操作では沈
殿物から変性条件で精製したヒトＧＡＤＩＩ蛋白質を用
いた。3) After 2 hours, the E. coli was recovered by centrifugation, and Lysis Buffer (10 mM Tris) was used.
-HCl pH 7.9, 10% Glycerol,
0.5M NaCl, 0.1% NP40, 5m
M 2-Mercaptoethanol, 1 mM
After suspension in E. coli (PMSF), E. coli was disrupted by sonication at 4 ° C., and Beckman Optima XL-
80, 1800 rpm with 50.2Ti rotor
and centrifuged at 4 ° C. for 15 minutes. Thereafter, the supernatant was removed, and 1 M imidazole (pH 7.5) was added to a final concentration of 10 mM.
And purified using Ni-agarose (registered trademark, manufactured by QIAGEN) under non-denaturing conditions according to the instruction manual. The precipitate was dissolved in 6M guanidine hydrochloride and purified using Ni-agarose (manufactured by Qiagen) under denaturing conditions as described in the instruction manual. In the subsequent operations, human GADII protein purified from the precipitate under denaturing conditions was used.
【００２５】４）精製された標品の一部を、２×ＳＤＳ
サンプルバッファーと等量ずつ混合し、３分間沸騰水中
でボイルした後、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にか
け、クマシーブリリアントブルーで染色したところ、５
２ｋＤ付近にバンドが現れ、得られた蛋白質がヒトＧＡ
ＤＩＩ蛋白質であることが確認された。 ５）次に残った精製ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質を４）と同様
に２×ＳＤＳサンプルバッファーで処理し、５ｍｍゲル
厚の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、泳動終了
後ゲルを４℃にて０．２５ＭのＫＣｌで３０分間染色を
行った。５２ｋＤ付近の白く染色された目的のバンドを
カッターナイフで切り出し、そのバンドをカッターナイ
フでさらに細かく刻んだ。バイオラッド社製のモデル４
２２エレクトロエリューターを用い、取扱説明書に従い
２０ｍＡで８時間蛋白質の溶出を行った後、溶出された
蛋白質を回収した。前記によりヒトＧＡＤＩＩ蛋白質
（配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなる蛋白質）
を得た。4) A part of the purified sample was subjected to 2 × SDS
The mixture was mixed with an equal amount of the sample buffer, boiled in boiling water for 3 minutes, subjected to 10% SDS-PAGE electrophoresis, and stained with Coomassie brilliant blue.
A band appears around 2 kD, and the obtained protein is human GA.
It was confirmed to be a DII protein. 5) Next, the remaining purified human GADII protein was treated with 2 × SDS sample buffer in the same manner as in 4) and subjected to 10% SDS-PAGE electrophoresis with a 5 mm gel thickness. Was stained with KCl for 30 minutes. The target band which was dyed white at around 52 kD was cut out with a cutter knife, and the band was further finely cut with the cutter knife. Bio-Rad model 4
After elution of the protein at 20 mA for 8 hours using a 22 Electro-Eluter according to the instruction manual, the eluted protein was collected. As described above, human GADII protein (protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing)
I got
【００２６】ＩＩ．抗ＧＡＤＩＩ抗体の検出１ 肝臓癌が疑われる人４８名について血清を得て、ＥＬＩ
ＳＡ法により血清中から抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体の検
出を行った。コントロールとして健常人７人の血清を用
いた。以下にその方法を示す。II. Detection of anti-GADII antibody 1 Serum was obtained from 48 people suspected of having liver cancer, and ELI was obtained.
The anti-human GADII autoantibody was detected from the serum by the SA method. Serum of seven healthy persons was used as a control. The method is described below.
【００２７】１．抗原のコーティング 抗原としてＧＡＤＩＩ蛋白質を用意し、抗原濃度が１０
μｇ／ｍｌとなるように抗原液を調製した。この抗原液
を９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ入
れ、４℃で一晩置き、コーティングした。1. Coating of antigen GADII protein was prepared as an antigen, and the antigen concentration was 10
An antigen solution was prepared at a concentration of μg / ml. 100 μl of this antigen solution was added to each well of a 96-well plate, and left at 4 ° C. overnight for coating.
【００２８】２．ブロッキング前記のプレートの抗原液
を捨て、プレートが乾かないうちにブロッキング液（ブ
ロックエース（登録商標、雪印乳業社製）を純粋で４倍
希釈したもの）を各ウェルに２００μｌずつ加え室温で
２時間置き、ブロッキングした。2. Blocking Discard the antigen solution of the above plate, add 200 μl of a blocking solution (purified and diluted 4-fold of Block Ace (registered trademark, manufactured by Snow Brand Milk Products)) to each well before the plate dries, and add 2 μl at room temperature for 2 hours. Placed and blocked.
【００２９】３．抗原抗体反応 ブロッキング液を捨てた後、プレートが乾かないうち
に、ヒト血清（１００倍希釈したもの）を各ウェルに５
０μｌずつ加え２時間置き、抗原抗体反応させた。ヒト
血清を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ ＰＢＳ（−）
で４回洗浄した。3. Antigen-Antibody Reaction After discarding the blocking solution, human serum (100-fold diluted) was added to each well before the plate dried.
0 μl each was added and left for 2 hours to allow an antigen-antibody reaction. Discard human serum and add 0.05% Tween20 PBS (-)
And washed 4 times.
【００３０】４．二次抗体反応 ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ抗体液をＰＢＳ（−）で５００
倍希釈し、各ウェルに５０μｌずつ加え、室温で１時間
置き、ヒト血清中のＩｇＧと反応させた。ＨＲＰ結合抗
ヒトＩｇＧ抗体液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ（−）で７回洗浄した。4. Secondary antibody reaction HRP-conjugated anti-human IgG antibody solution was
The solution was diluted twice, added to each well in an amount of 50 μl, left at room temperature for 1 hour, and reacted with IgG in human serum. The HRP-bound anti-human IgG antibody solution was discarded, and 0.05% Tween 20 was added.
Washed 7 times with PBS (-).
【００３１】５．発色反応 ＯＰＤ（オルトフェニルジアミン、和光純薬社製）を１
錠を０．１Ｍ ＰＣＢ３０ｍｌおよびＨ2Ｏ2１２μｌに
溶解した液を各ウェルに１００μｌずつ加え、室温で発
色するまで反応させた。２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を各ウェルに５
０μｌずつ加え発色反応を停止させた。5. Color reaction OPD (orthophenyldiamine, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
A solution prepared by dissolving the tablets in 30 ml of 0.1 M PCB and 12 μl of H 2 O 2 was added to each well in an amount of 100 μl, and reacted at room temperature until the color developed. 2N H 2 SO 4 is added to each well for 5 times.
The color reaction was stopped by adding 0 μl each.
【００３２】６．吸光度測定 ４９０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（クラボ
ウ社製）で測定した。吸光度測定の結果、健常人７名の
血清のＥＬＩＳＡの結果の平均値を取り、それを正常平
均値とした。また、前記健常人７名での結果の標準偏差
を取り、正常標準偏差とした。肝臓癌患者の血清のＥＬ
ＩＳＡの結果については、４９０ｎｍにおける結果が、
「（正常平均値）＋（正常標準偏差）×２」の範囲外に
なるものを陽性とし、「正常平均値」と「（正常平均
値）＋（正常標準偏差）×２」の間になるものを擬陽性
とした。6. Absorbance measurement The absorbance at 490 nm was measured with a plate reader (manufactured by Kurabo Industries). As a result of the absorbance measurement, the average value of the ELISA results of the sera of seven healthy persons was taken, and the average value was taken as a normal average value. In addition, the standard deviation of the results of the above-mentioned seven healthy persons was taken as a normal standard deviation. EL of serum from liver cancer patients
Regarding the result of ISA, the result at 490 nm
Those that are out of the range of “(normal average value) + (normal standard deviation) × 2” are regarded as positive, and fall between “normal average value” and “(normal average value) + (normal standard deviation) × 2”. Those were false positives.
【００３３】肝臓癌が疑われる人４８名の血清について
のＥＬＩＳＡ法の結果と、他の診断方法により肝臓癌と
診断された結果とを対比して表１に示す。また、肝臓癌
特異的な蛋白質として知られているＡＦＰまたはＰＩＶ
ＫＡ−ＩＩの検出の結果も表１に示す。Table 1 shows a comparison of the results of the ELISA method for the sera of 48 persons suspected of having liver cancer with the results of diagnosis of liver cancer by other diagnostic methods. AFP or PIV known as a liver cancer-specific protein
Table 1 also shows the results of KA-II detection.
【００３４】[0034]
【表１】 [Table 1]
【００３５】肝臓癌が疑われるごく初期の段階におい
て、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体の検出方法結果が陽性ま
たは擬陽性となった人は、最終的に肝臓腫瘍有り（肝臓
癌）と診断された人においては３０人中９人であり、そ
の比率は３０％を占める。これは従来使用されているＡ
ＦＰやＰＩＶＫＡ−ＩＩよりも高い陽性率となってお
り、本発明の自己抗体の検出方法が肝臓癌の診断方法の
一つとして使用できるものであることを示している。In the very early stage of suspecting liver cancer, a person who has a positive or false positive result of the method for detecting an anti-human GADII autoantibody is a person finally diagnosed as having a liver tumor (liver cancer). 9 out of 30 people, accounting for 30%. This is the A
The positive rate is higher than that of FP or PIVKA-II, indicating that the method for detecting an autoantibody of the present invention can be used as one of the diagnostic methods for liver cancer.
【００３６】また、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体の検出結
果が陽性となった人は、肝臓癌と診断された人において
は３０人中６人であり、最終的に肝臓腫瘍無し（肝臓癌
でない）と診断された人は１８人中１人であることも、
本発明の抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体の検出が肝臓癌の診
断方法の一つとして使用できるものであることを示して
いる。In addition, 6 out of 30 persons diagnosed with liver cancer had a positive detection result of anti-human GADII autoantibody, and finally, there was no liver tumor (no liver cancer). One in 18 people was diagnosed,
This shows that the detection of the anti-human GADII autoantibody of the present invention can be used as one of the diagnostic methods for liver cancer.
【００３７】ＩＩＩ．抗ＧＡＤＩＩ抗体の検出２ 自己免疫疾患患者１１１人について血清を得て、ＥＬＩ
ＳＡ法により血清中から抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体の検
出を行った。コントロールとして正常人（自己免疫疾患
に罹患していない人）２０人の血清を用いた。以下にそ
の方法を示す。III. Detection of anti-GADII antibody 2 Serum was obtained from 111 autoimmune disease patients, and
The anti-human GADII autoantibody was detected from the serum by the SA method. As a control, the sera of 20 normal persons (persons not suffering from an autoimmune disease) were used. The method is described below.
【００３８】１．抗原のコーティング 抗原としてＧＡＤＩＩ蛋白質を用意し、抗原濃度が１０
μｇ／ｍｌとなるように抗原液を調製した。この抗原液
を９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ入
れ、４℃で一晩置き、コーティングした。1. Coating of antigen GADII protein was prepared as an antigen, and the antigen concentration was 10
An antigen solution was prepared at a concentration of μg / ml. 100 μl of this antigen solution was added to each well of a 96-well plate, and left at 4 ° C. overnight for coating.
【００３９】２．ブロッキング 前記のプレートの抗原液を捨て、プレートが乾かないう
ちにブロッキング液（ブロックエース（登録商標、雪印
乳業社製）を純粋で４倍希釈したもの）を各ウェルに２
００μｌずつ加え室温で２時間置き、ブロッキングし
た。2. Blocking Discard the antigen solution of the above plate, and add a blocking solution (purified 4-fold diluted Block Ace (registered trademark, manufactured by Snow Brand Milk Products)) to each well before the plate is dried.
The solution was added in an amount of 00 μl each and left at room temperature for 2 hours to perform blocking.
【００４０】３．抗原抗体反応 ブロッキング液を捨てた後、プレートが乾かないうち
に、ヒト血清（１００倍希釈したもの）を各ウェルに５
０μｌずつ加え２時間置き、抗原抗体反応させた。ヒト
血清を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ ＰＢＳ（−）
で４回洗浄した。3. Antigen-Antibody Reaction After discarding the blocking solution, human serum (100-fold diluted) was added to each well before the plate dried.
0 μl each was added and left for 2 hours to allow an antigen-antibody reaction. Discard human serum and add 0.05% Tween20 PBS (-)
And washed 4 times.
【００４１】４．二次抗体反応 ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ抗体液をＰＢＳ（−）で５００
倍希釈し、各ウェルに５０μｌずつ加え、室温で１時間
置き、ヒト血清中のＩｇＧと反応させた。ＨＲＰ結合抗
ヒトＩｇＧ抗体液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ（−）で７回洗浄した。4. Secondary antibody reaction HRP-conjugated anti-human IgG antibody solution was
The solution was diluted twice, added to each well in an amount of 50 μl, left at room temperature for 1 hour, and reacted with IgG in human serum. The HRP-bound anti-human IgG antibody solution was discarded, and 0.05% Tween 20 was added.
Washed 7 times with PBS (-).
【００４２】５．発色反応 ＯＰＤ（オルトフェニルジアミン、和光純薬社製）を１
錠を０．１Ｍ ＰＣＢ３０ｍｌおよびＨ2Ｏ2１２μｌに
溶解した液を各ウェルに１００μｌずつ加え、室温で発
色するまで反応させた。２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を各ウェルに５
０μｌずつ加え発色反応を停止させた。5. Color reaction OPD (orthophenyldiamine, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
A solution prepared by dissolving the tablets in 30 ml of 0.1 M PCB and 12 μl of H 2 O 2 was added to each well in an amount of 100 μl, and reacted at room temperature until the color developed. 2N H 2 SO 4 is added to each well for 5 times.
The color reaction was stopped by adding 0 μl each.
【００４３】６．吸光度測定 ４９０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（クラボ
ウ社製）で測定した。吸光度測定の結果、正常人２０名
の血清のＥＬＩＳＡの結果の平均値を取り、それを正常
平均値とした。また、前記正常人２０名での結果の標準
偏差を取り、正常標準偏差とした。自己免疫疾患患者の
血清のＥＬＩＳＡの結果については、４９０ｎｍにおけ
る結果が、「（正常平均値）＋（正常標準偏差）×２」
の範囲外になるものを陽性とした。結果を表２に示す。6. Absorbance measurement The absorbance at 490 nm was measured with a plate reader (manufactured by Kurabo Industries). As a result of the absorbance measurement, the average value of the ELISA results of the sera of 20 normal subjects was taken, and the average value was taken as the normal average value. In addition, the standard deviation of the results of the 20 normal subjects was taken and defined as a normal standard deviation. Regarding the results of ELISA of sera from patients with autoimmune diseases, the results at 490 nm were “(normal mean value) + (normal standard deviation) × 2”.
Those that were out of the range were defined as positive. Table 2 shows the results.
【００４４】[0044]
【表２】 [Table 2]
【００４５】ＳＬＥ、強皮症または多発性筋炎もしくは
皮膚性炎の患者においては、陽性率（被検者中陽性とな
った患者の数）は０％であった。一方、慢性関節リウマ
チの患者においては陽性率は８．３％であり、自己免疫
性肝炎の患者においては陽性率は８．８％であった。ま
た、１例ながら原発胆汁性肝硬変の患者でも陽性となる
結果が得られた。以上の結果より、陽性となった血清が
採取された患者は自己免疫疾患、特に、慢性関節リウマ
チ、自己免疫性肝炎または原発胆汁性肝硬変が疑われ
る。このことは、本発明の自己抗体の検出方法が自己免
疫疾患、特に、慢性関節リウマチ、自己免疫性肝炎また
は原発胆汁性肝硬変の診断方法の一つとして使用できる
ものであることを示している。In patients with SLE, scleroderma or polymyositis or dermatitis, the positive rate (the number of patients who tested positive) was 0%. On the other hand, the positive rate was 8.3% in patients with rheumatoid arthritis, and 8.8% in patients with autoimmune hepatitis. In addition, a positive result was obtained in one patient with primary biliary cirrhosis. From the above results, patients from whom positive serum was collected are suspected of having an autoimmune disease, particularly rheumatoid arthritis, autoimmune hepatitis or primary biliary cirrhosis. This indicates that the method for detecting an autoantibody of the present invention can be used as a method for diagnosing an autoimmune disease, in particular, rheumatoid arthritis, autoimmune hepatitis or primary biliary cirrhosis.
【００４６】[0046]
【発明の効果】本発明により、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗
体をヒト体液または組織抽出液から検出することが可能
となる。そして、肝臓癌が疑われる患者の体液または組
織抽出液から前記自己抗体の発生量を健常人での発生量
と比較することにより肝臓癌の診断を行うことが可能と
なる。According to the present invention, anti-human GADII autoantibodies can be detected from human body fluids or tissue extracts. Then, liver cancer can be diagnosed by comparing the amount of the autoantibody generated from the body fluid or tissue extract of a patient suspected of having liver cancer with the amount generated in a healthy person.
【００４７】また、本発明により、自己免疫疾患が疑わ
れる患者の体液または組織抽出液から前記自己抗体の発
生量を正常人での発生量と比較することにより自己免疫
性疾患、特に慢性関節リウマチ、自己免疫性肝炎または
原発性肝硬変の診断を行うことが可能となる。Further, according to the present invention, the amount of the autoantibody generated from a body fluid or tissue extract of a patient suspected of having an autoimmune disease is compared with the amount generated in a normal person to obtain an autoimmune disease, particularly rheumatoid arthritis. This makes it possible to diagnose autoimmune hepatitis or primary cirrhosis.
【００４８】[0048]
配列番号：１ 配列の長さ：４９３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Ala Asp Ser Glu Ala Leu Pro Ser Leu Ala Gly Asp Pro Val Ala 1 5 10 15 Val Glu Ala Leu Leu Arg Ala Val Phe Gly Val Val Val Asp Glu Ala 20 25 30 Ile Gln Lys Gly Thr Ser Val Ser Gln Lys Val Cys Glu Trp Lys Glu 35 40 45 Pro Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu Asp Leu Glu Leu Arg Ser Gln Gly 50 55 60 Glu Ser Gln Lys Gln Ile Leu Glu Arg Cys Arg Ala Val Ile Arg Tyr 65 70 75 80 Ser Val Lys Thr Gly His Pro Arg Phe Phe Asn Gln Leu Phe Ser Gly 85 90 95 Leu Asp Pro His Ala Leu Ala Gly Arg Ile Ile Thr Glu Ser Leu Asn 100 105 110 Thr Ser Gln Tyr Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Met Glu 115 120 125 Glu Glu Val Leu Arg Lys Leu Arg Ala Leu Val Gly Trp Ser Ser Gly 130 135 140 Asp Gly Ile Phe Cys Pro Gly Gly Ser Ile Ser Asn Met Tyr Ala Val 145 150 155 160 Asn Leu Ala Arg Tyr Gln Arg Tyr Pro Asp Cys Lys Gln Arg Gly Leu 165 170 175 Arg Thr Leu Pro Pro Leu Ala Leu Phe Thr Ser Lys Glu Cys His Tyr 180 185 190 Ser Ile Gln Lys Gly Ala Ala Phe Leu Gly Leu Gly Thr Asp Ser Val 195 200 205 Arg Val Val Lys Ala Asp Glu Arg Gly Lys Met Val Pro Glu Asp Leu 210 215 220 Glu Arg Gln Ile Gly Met Ala Glu Ala Glu Gly Ala Val Pro Phe Leu 225 230 235 240 Val Ser Ala Thr Ser Gly Thr Thr Val Leu Gly Ala Phe Asp Pro Leu 245 250 255 Glu Ala Ile Ala Asp Val Cys Gln Arg His Gly Leu Trp Leu His Val 260 265 270 Asp Ala Ala Trp Gly Gly Ser Val Leu Leu Ser Gln Thr His Arg His 275 280 285 Leu Leu Asp Gly Ile Gln Arg Ala Asp Ser Val Ala Trp Asn Pro His 290 295 300 Lys Leu Leu Ala Ala Gly Leu Gln Cys Ser Ala Leu Leu Leu Gln Asp 305 310 315 320 Thr Ser Asn Leu Leu Lys Arg Cys His Gly Ser Gln Ala Ser Tyr Leu 325 330 335 Phe Gln Gln Asp Lys Phe Tyr Asp Val Ala Leu Asp Thr Gly Asp Lys 340 345 350 Val Val Gln Cys Gly Arg Arg Val Asp Cys Leu Lys Leu Trp Leu Met 355 360 365 Trp Lys Ala Gln Gly Asp Gln Gly Leu Glu Arg Arg Ile Asp Gln Ala 370 375 380 Phe Val Leu Ala Arg Tyr Leu Val Glu Glu Met Lys Lys Arg Glu Gly 385 390 395 400 Phe Glu Leu Val Met Glu Pro Glu Phe Val Asn Val Cys Phe Trp Phe 405 410 415 Val Pro Pro Ser Leu Arg Gly Lys Gln Glu Ser Pro Asp Tyr His Glu 420 425 430 Arg Leu Ser Lys Val Ala Pro Val Leu Lys Glu Arg Met Val Lys Glu 435 440 445 Gly Ser Met Met Ile Gly Tyr Gln Pro His Gly Thr Arg Gly Asn Phe 450 455 460 Phe Arg Val Val Val Ala Asn Ser Ala Leu Thr Cys Ala Asp Met Asp 465 470 475 480 Phe Leu Leu Asn Glu Leu Glu Arg Leu Gly Gln Asp Leu 485 490 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 493 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Protein Sequence Met Ala Asp Ser Glu Ala Leu Pro Ser Leu Ala Gly Asp Pro Val Ala 1 5 10 15 Val Glu Ala Leu Leu Arg Ala Val Phe Gly Val Val Val Asp Glu Ala 20 25 30 Ile Gln Lys Gly Thr Ser Val Ser Gln Lys Val Cys Glu Trp Lys Glu 35 40 45 Pro Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu Asp Leu Glu Leu Arg Ser Gln Gly 50 55 60 Glu Ser Gln Lys Gln Ile Leu Glu Arg Cys Arg Ala Val Ile Arg Tyr 65 70 75 80 Ser Val Lys Thr Gly His Pro Arg Phe Phe Asn Gln Leu Phe Ser Gly 85 90 95 Leu Asp Pro His Ala Leu Ala Gly Arg Ile Ile Thr Glu Ser Leu Asn 100 105 110 Thr Ser Gln Tyr Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Met Glu 115 120 125 Glu Glu Val Leu Arg Lys Leu Arg Ala Leu Val Gly Trp Ser Ser Gly 130 135 140 Asp Gly Ile Phe Cys Pro Gly Gly Ser Ile Ser Asn Met Tyr Ala Val 145 150 155 160 Asn Leu Ala Arg Tyr Gln Arg Tyr Pro Asp Cys Lys Gln Arg Gly Leu 165 170 175 Arg Thr Leu Pro Pro Leu Ala Leu Phe Thr Ser Lys Glu Cys His Tyr 180 185 190 Ser Ile Gln Lys Gly Ala Ala Phe Leu Gly Leu Gly Thr Asp Ser Val 195 200 205 Arg Val Val Lys Ala Asp Glu Arg Gly Lys Met Val Pro Glu Asp Leu 210 215 220 Glu Arg Gln Ile Gly Met Ala Glu Ala Glu Gly Ala Val Pro Phe Leu 225 230 235 240 Val Ser Ala Thr Ser Gly Thr Thr Val Leu Gly Ala Phe Asp Pro Leu 245 250 255 Glu Ala Ile Ala Asp Val Cys Gln Arg His Gly Leu Trp Leu His Val 260 265 270 Asp Ala Ala Trp Gly Gly Ser Val Leu Leu Ser Gln Thr His Arg His 275 280 285 Leu Leu Asp Gly Ile Gln Arg Ala Asp Ser Val Ala Trp Asn Pro His 290 295 300 Lys Leu Leu Ala Ala Gly Leu Gln Cys Ser Ala Leu Leu Leu Gln Asp 305 310 315 320 Thr Ser Asn Leu Leu Lys Arg Cys His Gly Ser Gln Ala Ser Tyr Leu 325 330 335 Phe Gln Gln Asp Lys Phe Tyr Asp Val Ala Leu Asp Thr Gly Asp Lys 340 345 350 Val Val Gln Cys Gly Arg Arg Val Asp Cys Leu Lys Leu Trp Leu Met 355 360 365 Trp Lys Ala Gln Gly Asp Gln Gly Leu Glu Arg Arg Ile Asp Gln Ala 370 375 380 Phe Val Leu Ala Arg Tyr Leu Val Glu GluMet Lys Lys Arg Glu Gly 385 390 395 400 400 Phe Glu Leu Val Met Glu Pro Glu Phe Val Asn Val Cys Phe Trp Phe 405 410 415 Val Pro Pro Ser Leu Arg Gly Lys Gln Glu Ser Pro Asp Tyr His Glu 420 425 430 Arg Leu Ser Lys Val Ala Pro Val Leu Lys Glu Arg Met Val Lys Glu 435 440 445 Gly Ser Met Met Ile Gly Tyr Gln Pro His Gly Thr Arg Gly Asn Phe 450 455 460 Phe Arg Val Val Val Ala Asn Ser Ala Leu Thr Cys Ala Asp Met Asp 465 470 475 480 Phe Leu Leu Asn Glu Leu Glu Arg Leu Gly Gln Asp Leu 485 490
【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：１９２６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 CGGCGCGCCT GTAATCCCAG CACTCTGGGA GACCGAGATT CTTGGTTGAT GCAAATCAAA 60 TAGAGATCCT G ATG GCT GAC TCA GAA GCA CTC CCC TCC CTT GCT GGG GAC 110 CCA GTG GCT GTG GAA GCC TTG CTC CGG GCC GTG TTT GGG GTT GTT GTG 158 GAT GAG GCC ATT CAG AAA GGA ACC AGT GTC TCC CAG AAG GTC TGT GAG 206 TGG AAG GAG CCT GAG GAG CTG AAG CAG CTG CTG GAT TTG GAG CTG CGG 254 AGC CAG GGC GAG TCA CAG AAG CAG ATC CTG GAG CGG TGT CGG GCT GTG 302 ATT CGC TAC AGT GTC AAG ACT GGT CAC CCT CGG TTC TTC AAC CAG CTC 350 TTC TCT GGG TTG GAT CCC CAT GCT CTG GCC GGG CGC ATT ATC ACT GAG 398 AGC CTC AAC ACC AGC CAG TAC ACA TAT GAA ATC GCC CCC GTG TTT GTG 446 CTC ATG GAA GAG GAG GTG CTG AGG AAA CTG CGG GCC CTG GTG GGC TGG 494 AGC TCT GGG GAC GGA ATC TTC TGC CCT GGT GGC TCC ATC TCC AAC ATG 542 TAT GCT GTA AAT CTG GCC CGC TAT CAG CGC TAC CCG GAT TGC AAG CAG 590 AGG GGC CTC CGC ACA CTG CCG CCC CTG GCC CTA TTC ACA TCG AAG GAG 638 TGT CAC TAC TCC ATC CAG AAG GGA GCT GCG TTT CTG GGA CTT GGC ACC 686 GAC AGT GTC CGA GTG GTC AAG GCT GAT GAG AGA GGG AAA ATG GTC CCC 734 GAG GAT CTG GAG AGG CAG ATT GGT ATG GCC GAG GCT GAG GGT GCT GTG 782 CCG TTC CTG GTC AGT GCC ACC TCT GGC ACC ACT GTG CTA GGG GCC TTT 830 GAC CCC CTG GAG GCA ATT GCT GAT GTG TGC CAG CGT CAT GGG CTA TGG 878 CTG CAT GTG GAT GCT GCC TGG GGT GGG AGC GTC CTG CTG TCA CAG ACA 926 CAC AGG CAT CTC CTG GAT GGG ATC CAG AGG GCT GAC TCT GTG GCC TGG 974 AAT CCC CAC AAG CTC CTC GCA GCA GGC CTG CAA TGC TCT GCA CTT CTT 1022 CTC CAG GAT ACC TCG AAC CTG CTC AAG CGC TGC CAT GGG TCC CAG GCC 1070 AGC TAC CTT TTC CAG CAG GAC AAG TTC TAC GAT GTG GCT CTG GAC ACG 1118 GGA GAC AAG GTG GTG CAG TGT GGC CGC CGT GTG GAC TGT CTG AAG CTG 1166 TGG CTC ATG TGG AAG GCA CAG GGC GAT CAA GGG CTG GAG CGG CGC ATC 1214 GAC CAG GCC TTT GTC CTT GCC CGG TAC CTG GTG GAG GAA ATG AAG AAG 1262 CGG GAA GGG TTT GAG CTA GTC ATG GAG CCT GAG TTT GTC AAT GTG TGT 1310 TTC TGG TTC GTA CCC CCC AGC CTG CGA GGG AAG CAG GAG AGT CCA GAT 1358 TAC CAC GAA AGG CTG TCA AAG GTG GCC CCC GTG CTC AAG GAG CGC ATG 1406 GTG AAG GAG GGC TCC ATG ATG ATT GGC TAC CAG CCC CAC GGG ACC CGG 1454 GGC AAC TTC TTC CGT GTG GTT GTG GCC AAC TCT GCA CTG ACC TGT GCT 1502 GAT ATG GAC TTC CTC CTC AAC GAG CTG GAG CGG CTA GGC CAG GAC CTG 1550 TGA GCCTTCTCTG TCTTGCTGCC GGCCTTGATA CCACCCCTCA CCCGCAGAGT 1603 CACTGCATTC CCTCCCAGCC TTTGAGGCCG GGTGCAGTGG CTCACGCCTG TAATCCCAGC 1663 ACTTTGGGAG GCCGAGGCGG GTGGATCACT TGAGGTCAGG AGTTCGAGAC CAGCCTGGCC 1723 AATAAGGTGA AACCCTGTCT CTACTAAAAA TACAAAAATT AGCCGAGCAT GGTGGCCTGT 1783 GCCTGTAAAC CCAGCTACTC AGGAGGTTGG GGCAGAATTG CTTGAACCCA GGGGGCAGAG 1843 GTTGCAGTGA GCCGAGATTG CACCCCTGCA CTCCAGGCTG GGCAACAGTA CGAGACTCTG 1903 TTCCAAAAAA AATAAAAAAG CCG 1926SEQ ID NO: 2 Sequence length: 1926 Sequence type: number of nucleic acid chains: double-stranded Topology: linear Sequence type: cDNA to mRNA sequence CGGCGCGCCT GTAATCCCAG CACTCTGGGA GACCGAGATT CTTGGTTGAT GCAAATCAAA 60 TAGAGATCCT G ATG GCT GAC TCA GAA GCA CTC CCC TCC CTT GCT GGG GAC 110 CCA GTG GCT GTG GAA GCC TTG CTC CGG GCC GTG TTT GGG GTT GTT GTG 158 GAT GAG GCC ATT CAG AAA GGA ACC AGT GTC TCC CAG AAG GTC TGT GAG 206 TGG AAG GAG CCT GAG GAG CTG AAG CAG CTG CTG GAT TTG GAG CTG CGG 254 AGC CAG GGC GAG TCA CAG AAG CAG ATC CTG GAG CGG TGT CGG GCT GTG 302 ATT CGC TAC AGT GTC AAG ACT GGT CAC CCT CGG TTC TTC AAC CAG CTC 350 TTC TCT GTG GAT CCC CAT GCT CTG GCC GGG CGC ATT ATC ACT GAG 398 AGC CTC AAC ACC AGC CAG TAC ACA TAT GAA ATC GCC CCC GTG TTT GTG 446 CTC ATG GAA GAG GAG GTG CTG AGG AAA CTG CGG GCC CTG GTG GGC TGG 494 AGC TCT GAC GGA ATC TTC TGC CCT GGT GGC TCC ATC TCC AAC ATG 542 TAT GCT GTA AAT CTG GCC CGC TAT CAG CGC TAC CCG GAT TGC AAG CAG 590 AGG GGC CTC CGC ACA CTG CCG CCC CTG GCC CTA TTC ACA TCG AAG GAG 638 TGT CAC TAC TCC ATC CAG AAG GGA GCT GCG TTT CTG GGA CTT GGC ACC 686 GAC AGT GTC CGA GTG GTC AAG GCT GAT GAG AGA AAA ATG GTC CCC 734 GAG GAT CTG GAG AGG CAG ATT GGT ATG GCC GAG GCT GAG GGT GCT GTG 782 CCG TTC CTG GTC AGT GCC ACC TCT GGC ACC ACT GTG CTA GGG GCC TTT 830 GAC CCC CTG GAG GCA ATT GCT GAT GTG TGC CGT CAT GGG CTA TGG 878 CTG CAT GTG GAT GCT GCC TGG GGT GGG AGC GTC CTG CTG TCA CAG ACA 926 CAC AGG CAT CTC CTG GAT GGG ATC CAG AGG GCT GAC TCT GTG GCC TGG 974 AAT CCC CAC AAG CTC CTC GCA GGC CAA TGC TCT GCA CTT CTT 1022 CTC CAG GAT ACC TCG AAC CTG CTC AAG CGC TGC CAT GGG TCC CAG GCC 1070 AGC TAC CTT TTC CAG CAG GAC AAG TTC TAC GAT GTG GCT CTG GAC ACG 1118 GGA GAC AAG GTG GTG CAG TGC CGT GTG GAC TGT CTG AAG CTG 1166 TGG CTC ATG TGG AAG GCA CAG GGC GAT CAA GGG CTG GAG CGG CGC ATC 1214 GAC CAG GCC TTT GTC CTT GCC CGG TAC CTG GTG GAG GAA ATG AAG AAG 1262 CGG GAA GGG TTT GAG CTA GT C ATG GAG CCT GAG TTT GTC AAT GTG TGT 1310 TTC TGG TTC GTA CCC CCC AGC CTG CGA GGG AAG CAG GAG AGT CCA GAT 1358 TAC CAC GAA AGG CTG TCA AAG GTG GCC CCC GTG CTC AAG GAG CGC ATG 1406 GTG AAG GAG GGC ATG ATG ATT GGC TAC CAG CCC CAC GGG ACC CGG 1454 GGC AAC TTC TTC CGT GTG GTT GTG GCC AAC TCT GCA CTG ACC TGT GCT 1502 GAT ATG GAC TTC CTC CTC AAC GAG CTG GAG CGG CTA GGC CAG GAC CTG GTCTGTCGCTCTCTC CCACCCCTCA CCCGCAGAGT 1603 CACTGCATTC CCTCCCAGCC TTTGAGGCCG GGTGCAGTGG CTCACGCCTG TAATCCCAGC 1663 ACTTTGGGAG GCCGAGGCGG GTGGATCACT TGAGGTCAGG AGTTCGAGAC CAGCCTGGCC 1723 AATAAGGTGA AACCCTGTCT CTACTAAAAA TACAAAAATT AGCCGAGCAT GGTGGCCTGT 1783 GCCTGTAAAC CCAGCTACTC AGGAGGTTGG GGCAGAATTG CTTGAACCCA GGGGGCAGAG 1843 GTTGCAGTGA GCCGAGATTG CACCCCTGCA CTCCAGGCTG GGCAACAGTA CGAGACTCTG 1903 TTCCAAAAAA AATAAAAAAG CCG 1926
【００５０】配列番号：３ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GAATTCCCCA TGGCTGACTC AAAACCACTC AGAASEQ ID NO: 3 Sequence length: 34 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid sequence GAATTCCCCA TGGCTGACTC AAAACCACTC AGAA
【００５１】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GCACTGACCA GAAATGGCACSEQ ID NO: 4 Sequence length: 20 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid sequence GCACTGACCA GAAATGGCAC
【図１】ヒスチジンタグを導入したｐＥＴ３ａベクター
を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing a pET3a vector into which a histidine tag has been introduced.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐々木 功典 山口県字部市小串1144番地 山口大学医学 部第二病理学講座内 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor, Kosunori Sasaki 1144 Kogushi, Jibu-shi, Yamaguchi Pref.
Claims (8)
列から成る蛋白質とヒトの体液または組織抽出液とを反
応させて、該体液または該組織抽出液中に存在し、かつ
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列から成る蛋白
質と反応する自己抗体を検出する検出方法。1. A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is reacted with a human body fluid or tissue extract to be present in the body fluid or the tissue extract, and the sequence of the sequence listing is present. A detection method for detecting an autoantibody that reacts with a protein consisting of the amino acid sequence of No. 1.
存在し、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列から
成る蛋白質と反応し、かつ肝臓癌で発生量が増加する自
己抗体を検出することを特徴とする請求項１に記載の検
出方法。2. An autoantibody which is present in a body fluid or tissue extract of a liver cancer patient, reacts with a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and increases the amount of liver cancer to be detected. The detection method according to claim 1, wherein:
液中に存在し、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列から成る蛋白質と反応し、かつ自己免疫疾患で発生量
が増加する自己抗体を検出することを特徴とする請求項
１に記載の検出方法。3. An autoantibody which is present in a body fluid or a tissue extract of an autoimmune disease patient, reacts with a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and has an increased amount due to the autoimmune disease The detection method according to claim 1, wherein the detection is performed.
列における連続する８アミノ酸残基以上のアミノ酸配列
からなる蛋白質であって、請求項１ないし３のいずれか
一項に記載の検出方法により存在が確認されたヒトの体
液または組織抽出液に存在する自己抗体と抗原抗体反応
することが可能であることを特徴とする蛋白質。4. A protein comprising a continuous amino acid sequence of eight or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein the protein is obtained by the detection method according to any one of claims 1 to 3. A protein characterized by being capable of antigen-antibody reaction with an autoantibody present in a human body fluid or tissue extract whose presence has been confirmed.
し、かつ配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列から
なる蛋白質と反応する自己抗体を検出する検出試薬であ
って、請求項４に記載の蛋白質を含むことを特徴とする
検出試薬。5. A detection reagent for detecting an autoantibody which is present in a human body fluid or tissue extract and reacts with a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. A detection reagent comprising the protein according to claim 1.
存在し、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列から
なる蛋白質と反応し、かつ肝臓癌で発生量が増加する自
己抗体を検出することを特徴とする請求項５に記載の検
出試薬。6. An autoantibody which is present in a body fluid or tissue extract of a liver cancer patient, reacts with a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and increases the amount of liver cancer to be detected. The detection reagent according to claim 5, wherein
液中に存在し、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列からなる蛋白質と反応し、かつ自己免疫疾患で発生量
が増加する自己抗体を検出することを特徴とする請求項
５に記載の検出試薬。7. An autoantibody which is present in a body fluid or a tissue extract of a patient with an autoimmune disease, reacts with the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and has an increased amount due to the autoimmune disease The detection reagent according to claim 5, wherein the reagent is detected.
の検出試薬を含むことを特徴とする検出キット。A detection kit comprising the detection reagent according to any one of claims 5 to 7.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19096097A JPH1138008A (en) | 1997-07-16 | 1997-07-16 | Detecting method for autoantibody and detecting reagent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19096097A JPH1138008A (en) | 1997-07-16 | 1997-07-16 | Detecting method for autoantibody and detecting reagent |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1138008A true JPH1138008A (en) | 1999-02-12 |
Family
ID=16266546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19096097A Pending JPH1138008A (en) | 1997-07-16 | 1997-07-16 | Detecting method for autoantibody and detecting reagent |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1138008A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013506837A (en) * | 2009-10-05 | 2013-02-28 | アンバージェン， インコーポレイテッド | Method for diagnosing primary biliary cirrhosis (PBC) using autoantigen |
| JP2013083644A (en) * | 2011-10-07 | 2013-05-09 | Korea Center For Disease Control And Prevention | DEMENTIA DIAGNOSIS KIT CONTAINING NEW Aβ22(pE)-42 PEPTIDE TO BE SPECIFICALLY COUPLED WITH AMYLOID β ANTIBODY IN BLOOD AS ACTIVE INGREDIENT |
-
1997
- 1997-07-16 JP JP19096097A patent/JPH1138008A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013506837A (en) * | 2009-10-05 | 2013-02-28 | アンバージェン， インコーポレイテッド | Method for diagnosing primary biliary cirrhosis (PBC) using autoantigen |
| US11885802B2 (en) | 2009-10-05 | 2024-01-30 | Ambergen, Inc. | Method for diagnosing primary biliary cirrhosis (PBC) using novel autoantigens |
| JP2013083644A (en) * | 2011-10-07 | 2013-05-09 | Korea Center For Disease Control And Prevention | DEMENTIA DIAGNOSIS KIT CONTAINING NEW Aβ22(pE)-42 PEPTIDE TO BE SPECIFICALLY COUPLED WITH AMYLOID β ANTIBODY IN BLOOD AS ACTIVE INGREDIENT |
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