JPH11346799A - Rapid identification of serum type by strain analysis of enterovirus - Google Patents
Rapid identification of serum type by strain analysis of enterovirusInfo
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- JPH11346799A JPH11346799A JP15638798A JP15638798A JPH11346799A JP H11346799 A JPH11346799 A JP H11346799A JP 15638798 A JP15638798 A JP 15638798A JP 15638798 A JP15638798 A JP 15638798A JP H11346799 A JPH11346799 A JP H11346799A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、エンテロウイルス
の血清型同定法に関する。[0001] The present invention relates to a method for serotyping enteroviruses.
【０００２】[0002]
【従来の技術】エンテロウイルスは、"intestine"を意
味するギリシャ語である"enteron"にその命名が由来す
るように、主として腸管系細胞に感染し、小児麻痺、無
菌性髄膜炎、ヘルパンギーナ、上気道炎、手足口病、下
痢症、発疹症、心筋炎、肺炎や気管支炎など多彩な臨床
症状を引き起こす原因ウイルスである。エンテロウイル
スは酸に耐性であるため容易に胃を通過してその増殖の
場である腸管部(lower intestinal tract)に到達するこ
とができる。また、肝炎の病因であったり(CAV4, CAV
9)、EV70やCAV24変異株のように急性出血性結膜炎の世
界的大流行を引き起こしたりすることもある。一つのウ
イルス属がこれほどの多くの異なった臨床症状を引き起
こす例は他にない。従って、このウイルスは、ウイルス
検査機関で分離されることが最も多いウイルスの一つ
で、国内での分離報告は毎年およそ4000〜6000件にのぼ
る。BACKGROUND OF THE INVENTION Enteroviruses primarily infect intestinal cells, as their name derives from the Greek word "enteron" meaning "intestine", and affect pediatric paralysis, aseptic meningitis, herpangina, It is a causative virus that causes various clinical symptoms such as respiratory tract disease, hand-foot-and-mouth disease, diarrhea, rash, myocarditis, pneumonia and bronchitis. Enteroviruses are resistant to acids and can easily pass through the stomach and reach the lower intestinal tract where they multiply. It is also the cause of hepatitis (CAV4, CAV
9) In some cases, acute hemorrhagic conjunctivitis, such as EV70 and CAV24 mutants, can cause a worldwide pandemic. There is no other case in which one virus genus causes so many different clinical symptoms. Therefore, this virus is one of the viruses that are most often isolated by virus testing laboratories, and there are approximately 4,000 to 6,000 isolated reports annually in Japan.
【０００３】エンテロウイルスは、ピコルナウイルス科
(family Picornaviridae)エンテロウイルス属(genus En
terovirus)に含まれるプラス一本鎖ＲＮＡをゲノムに持
つ小形球形ウイルスである。ヒトでは、ポリオウイルス
１〜３型、コクサッキーウイルスA1〜A22およびA24、コ
クサッキーウイルスB1〜B6、エコーウイルス1〜9、11〜
27および29〜34、エンテロウイルス68〜71の６８種の血
清型に分類されている。コクサッキーウイルスA23はエ
コーウイルス9、エコーウイルス10はレオウイルスタイ
プ１、エコーウイルス28はヒトライノウイルス1Aである
ことが後に判明し、これらは現在欠番になっている。臨
床症状からこれらのウイルスの血清型を推定することは
困難で、分離ウイルスの同定は型特異的免疫血清を用い
た中和試験によって行われている。[0003] Enteroviruses are of the Picornaviridae family.
(family Picornaviridae) Enterovirus genus (genus En
terovirus) is a small spherical virus having a genome with the plus single-stranded RNA contained in the virus. In humans, poliovirus types 1-3, coxsackieviruses A1-A22 and A24, coxsackieviruses B1-B6, echoviruses 1-9, 11-
27 and 29-34, and are classified into 68 serotypes of enteroviruses 68-71. Coxsackievirus A23 was later found to be Echovirus 9, Echovirus 10 was Reovirus Type 1 and Echovirus 28 was Human Rhinovirus 1A, which are now missing. It is difficult to estimate the serotypes of these viruses from clinical symptoms, and the identification of the isolated viruses is performed by neutralization tests using type-specific immune sera.
【０００４】エンテロウイルスは他の多くのＲＮＡウイ
ルス同様、ウイルスの遺伝子自体がコードするＲＮＡ依
存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製される。しかしな
がら、この酵素は校正(proofreading)機能を持たないた
めＲＮＡ合成の過程で生じた塩基変異は子孫ウイルスの
遺伝子内に蓄積される。従って、アミノ酸変異を伴った
塩基変異がウイルス構造蛋白質領域に生じた場合、いわ
ゆる難中和性ウイルスが生じる可能性がある。これは、
表現型(phenotype)を指標にした中和試験に常に付きま
とう固有の問題点である。Enteroviruses, like many other RNA viruses, are replicated by an RNA-dependent RNA polymerase encoded by the viral gene itself. However, since this enzyme does not have a proofreading function, base mutations generated during the process of RNA synthesis accumulate in progeny virus genes. Therefore, when a base mutation accompanied by an amino acid mutation occurs in the virus structural protein region, a so-called slightly neutralizing virus may be generated. this is,
This is an inherent problem that always accompanies the phenotype-based neutralization test.
【０００５】一方、エンテロウイルスの分子生物学的見
地からの分類が試みられているが（P. Muir et al., 19
98, Clin. Microbiol. Rev., 11: 202-227; R.R. Rueck
ert,1996, Fields Virolgy, 3rd. ed., Lippincott-Rav
en Publishers, 609-654; T. Poyry et al., 1996, J.
Gen. Virol., 77: 1699-1717; T. Pulli et al., 1995,
Virology, 212: 30-38）、血清型を同定するには十分
なものとは言えず、特に、P. Muirらによれば、エンテ
ロウイルスの遺伝型の系統樹による分類は血清型を反映
しないとされている。On the other hand, attempts have been made to classify enteroviruses from the viewpoint of molecular biology (P. Muir et al., 19).
98, Clin. Microbiol. Rev., 11: 202-227; RR Rueck
ert, 1996, Fields Virolgy, 3rd.ed., Lippincott-Rav
en Publishers, 609-654; T. Poyry et al., 1996, J.
Gen. Virol., 77: 1699-1717; T. Pulli et al., 1995,
Virology, 212: 30-38), which is not sufficient to identify serotypes. In particular, according to P. Muir et al., Phylogenetic tree typing of enterovirus genotypes does not reflect serotypes. Have been.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の様な
問題点のないエンテロウイルスの迅速かつ簡易な血清型
同定法を提供することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a rapid and simple method for serotyping enteroviruses which does not have the above-mentioned problems.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、日本の流
行で分離が報告されているエンテロウイルスのＶＰ４全
領域の塩基配列を解析したところ、この塩基配列の分子
系統解析により血清型が同定できるという知見を得、こ
の知見に基づき、本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors analyzed the nucleotide sequence of the entire VP4 region of the enterovirus, which has been reported to be isolated in the Japanese epidemic, and identified the serotype by molecular phylogenetic analysis of this nucleotide sequence. The inventor found that the present invention can be performed, and based on this finding, completed the present invention.
【０００８】かくして、本発明は、エンテロウイルスの
ＶＰ４領域の塩基配列に基づいて分子系統解析を行い、
エンテロウイルスの血清型を同定することを特徴とする
エンテロウイルスの血清型同定法（以下、本発明同定法
ともいう）を提供する。[0008] Thus, the present invention provides a molecular phylogenetic analysis based on the nucleotide sequence of the VP4 region of enterovirus,
Provided is a method for identifying a serotype of an enterovirus, which is characterized by identifying a serotype of an enterovirus (hereinafter, also referred to as the identification method of the present invention).
【０００９】本発明同定法において、ＶＰ４領域の塩基
配列は、試料からＲＮＡを調製し、調製されたＲＮＡか
らｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによって
ＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅し、増幅さ
れた産物を用いて塩基配列解析を行うことにより得るこ
とができる。In the identification method of the present invention, the nucleotide sequence of the VP4 region is obtained by preparing RNA from a sample, obtaining cDNA from the prepared RNA, and amplifying the nucleotide sequence containing the nucleotide sequence of the VP4 region by PCR from the obtained cDNA. Then, it can be obtained by performing a nucleotide sequence analysis using the amplified product.
【００１０】ＰＣＲに使用されるプライマーとしては、
配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーおよび配
列番号２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられ
る。[0010] Primers used for PCR include:
A primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 are exemplified.
【００１１】[0011]
【発明の実施の形態】本発明同定法は、エンテロウイル
スの血清型を同定するために、エンテロウイルスのＶＰ
４領域の塩基配列に基づいて分子系統解析を行うことを
特徴とする。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The identification method of the present invention is used to identify the serotype of enterovirus,
It is characterized in that molecular phylogenetic analysis is performed based on the base sequences of the four regions.
【００１２】本明細書において、ＶＰ４領域とは、エン
テロウイルスのキャプシドを形成するタンパク質の一つ
であるＶＰ４タンパク質（６９アミノ酸）をコードする
領域（２０７ｂｐ）を意味する。また、ＶＰ４領域の塩
基配列とは、ＶＰ４領域の全領域の塩基配列または血清
型を反映するのに十分な長さ（通常、２０ｂｐ以上）を
有するその一部を意味する。In the present specification, the VP4 region means a region (207 bp) encoding a VP4 protein (69 amino acids) which is one of the proteins forming the capsid of enterovirus. Further, the nucleotide sequence of the VP4 region means a part of the nucleotide sequence of the entire VP4 region or a portion having a length (usually 20 bp or more) sufficient to reflect the serotype.
【００１３】ＶＰ４領域の塩基配列を得る方法は特に限
定されないが、血清型の未同定のエンテロウイルスを含
む試料からＶＰ４領域の塩基配列を得る場合には、以下
の方法によることが好ましい。すなわち、試料からＲＮ
Ａを調製し、調製されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得ら
れたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域の塩基配列
を含む塩基配列を増幅し、増幅された産物を用いて塩基
配列解析を行う方法である。The method for obtaining the nucleotide sequence of the VP4 region is not particularly limited. However, when the nucleotide sequence of the VP4 region is obtained from a sample containing an unidentified serotype enterovirus, the following method is preferably used. That is, RN
In this method, A is prepared, cDNA is prepared from the prepared RNA, a base sequence including the base sequence of the VP4 region is amplified from the obtained cDNA by PCR, and base sequence analysis is performed using the amplified product.
【００１４】試料は、エンテロウイルスを含むかまたは
含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例
としては、咽頭拭い液、髄液、水泡内容物などの臨床材
料、または、これらの臨床材料より分離されたウイルス
培養液などを挙げることができる。これらの試料からの
ＲＮＡの調製は公知の方法により行うことができる。ま
た、ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製方法も公知である。Ｐ
ＣＲは、このｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＰ４領域の塩基配
列を含む塩基配列を増幅できるように選択されたオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして、公知のＰＣＲの方法
に従って行うことができる。また、ＲＮＡから逆転写(R
T)-PCRにより同一反応系でｃＤＮＡの取得及びＤＮＡの
増幅を行うこともできる。The sample is not particularly limited as long as it contains or may contain an enterovirus. Examples thereof include clinical materials such as throat swabs, cerebrospinal fluid, and blister contents, and clinical materials such as these. Examples include a virus culture solution separated more. Preparation of RNA from these samples can be performed by a known method. Methods for preparing cDNA from RNA are also known. P
CR can be performed according to a known PCR method using this cDNA as a template and an oligonucleotide selected so as to amplify a nucleotide sequence containing the nucleotide sequence of the VP4 region as a primer. In addition, reverse transcription (R
It is also possible to obtain cDNA and amplify DNA in the same reaction system by T) -PCR.
【００１５】増幅産物の取得は、アガロースゲル電気泳
動で分離し、ゲルから切り出して抽出精製するなどの公
知の方法で行うことができる。通常には、エンテロウイ
ルスの既知の塩基配列と、用いたプライマーの塩基配列
とから予測できる長さの増幅産物を取得する。The amplification product can be obtained by a known method such as separation by agarose gel electrophoresis, cutting out from the gel, and extracting and purifying. Usually, an amplification product having a length predictable from the known base sequence of the enterovirus and the base sequence of the primer used is obtained.
【００１６】ＶＰ４領域の全領域を含む塩基配列を増幅
できるように選択されたオリゴヌクレオチドの例として
は、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドが挙げられる。Examples of oligonucleotides selected so as to amplify the nucleotide sequence containing the entire VP4 region include an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 Is mentioned.
【００１７】ＰＣＲによる増幅は２段階で行ってもよ
く、例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオ
リゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第１回目の
ＰＣＲを行った後、配列番号１に示す塩基配列からなる
オリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第２
回目のＰＣＲを行ってもよい。２段階の増幅を行うこと
によって、一層特異的に目的の塩基配列を増幅すること
が可能になる。Amplification by PCR may be performed in two stages. For example, the first PCR using an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 as primers After the above, the oligonucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3
A second PCR may be performed. By performing the two-stage amplification, the target base sequence can be more specifically amplified.
【００１８】増幅産物の塩基配列の決定は公知の方法に
よって行うことができる。決定された塩基配列の内、Ｖ
Ｐ４領域の塩基配列を系統解析に用いる。本発明同定法
において、ＶＰ４領域の塩基配列に基づく系統解析は、
公知の系統解析法によって行うことができる。このよう
な方法としては、Higgins法、ならびに、２−パラメー
ター法を用いたUPGMA法およびN-J法などが挙げられ、ま
た、これらの方法により系統解析を行うためのソフトウ
ェアが市販されている（DNASIS(日立ソフトウェアエン
ジニアリング)、SINCA(富士通)など）。The nucleotide sequence of the amplification product can be determined by a known method. Of the determined base sequence, V
The base sequence of the P4 region is used for phylogenetic analysis. In the identification method of the present invention, phylogenetic analysis based on the nucleotide sequence of the VP4 region
It can be performed by a known systematic analysis method. Such methods include the Higgins method, the UPGMA method and the NJ method using a two-parameter method, and software for performing phylogenetic analysis by these methods is commercially available (DNASIS ( Hitachi Software Engineering), SINCA (Fujitsu), etc.).
【００１９】血清型は、系統解析においてそれぞれの血
清型の標準株と一定値以上のホモロジーを示す、また
は、一定値以上の確率で他の血清型のクラスターと区別
されるか否かによって決定できる。一定値とは、系統解
析により得られた系統樹において各血清型に属する株が
それぞれ単一のクラスターを形成するような値であれば
よい。The serotype can be determined based on whether or not the serotype shows homology of a certain value or more with a standard strain of each serotype in a phylogenetic analysis, or is distinguished from clusters of other serotypes with a certain probability or more. . The constant value may be any value as long as strains belonging to each serotype form a single cluster in a phylogenetic tree obtained by phylogenetic analysis.
【００２０】より具体的には、ホモロジーで８０％以
上、ブーツストラップ法で他のクラスターから区別され
る確率が９０％以上という値があげられる。例えば、エ
ンテロウイルス標準株４４血清型（６０株）の系統解析
によると、血清型は８４％のホモロジーで区別され、分
離株を加えたブーツストラップでは、１００％の確率で
他の血清型と区別された。More specifically, the value is such that the homology is 80% or more, and the probability of being distinguished from other clusters by the bootstrap method is 90% or more. For example, according to the phylogenetic analysis of the enterovirus standard strain 44 serotype (60 strains), the serotype is distinguished by 84% homology, and the bootstrap to which the isolate is added is distinguished from other serotypes by 100% probability. Was.
【００２１】[0021]
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明す
るが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る
一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明
の範囲が何ら限定されるものではない。EXAMPLES Next, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are provided only for helping to specifically recognize the present invention, and the scope of the present invention is thereby reduced. It is not limited at all.
【００２２】[0022]
【実施例１】 エンテロウイルスＶＰ４全領域の塩基配
列解析 日本の流行で分離が報告されているエンテロウイルスの
ＶＰ４全領域の塩基配列解析をするために、ウイルスと
して、以下の標準株、すなわち、コクサッキーA群ウイ
ルス(CAV)として、CAV2、CAV3、CAV4、CAV5、CAV6、CAV
7、CAV8およびCAV10の８株、コクサッキーB群ウイルス
(CBV)として、CBV2およびCBV6の２株、ならびに、エコ
ーウイルス(ECV)として、ECV1、ECV2、ECV3、ECV4、ECV
5、ECV7、ECV13、ECV14、ECV17、ECV18、ECV19、ECV2
0、ECV24、ECV25およびECV30の１６株、総計２６の血清
型株を用いた。Example 1 Nucleotide Sequence Analysis of Enterovirus VP4 All Region In order to analyze the nucleotide sequence of enterovirus VP4 entire region that has been reported to be isolated in the Japanese epidemic, the following standard strains as viruses, namely, Coxsackie A group Virus (CAV), CAV2, CAV3, CAV4, CAV5, CAV6, CAV
7, 8 strains of CAV8 and CAV10, Coxsackie group B virus
(CBV) as two strains, CBV2 and CBV6, and as echovirus (ECV), ECV1, ECV2, ECV3, ECV4, ECV
5, ECV7, ECV13, ECV14, ECV17, ECV18, ECV19, ECV2
A total of 26 serotype strains were used, including 0, ECV24, ECV25 and ECV30.
【００２３】臨床検体として、咽頭拭い液、髄液、水泡
内容物、および、これらの臨床材料より分離されたウイ
ルス培養液を用いた。咽頭拭い液および水泡内容物はそ
れぞれ１．５ｍｌのＴＥ溶液(10 mM Tris-HCl, 1 mM ED
TA (pH 8.0))に懸濁し、−８０℃で保存して用いた。As a clinical specimen, a pharyngeal swab, cerebrospinal fluid, blister contents, and a virus culture solution separated from these clinical materials were used. The pharyngeal swab and blister contents were each 1.5 ml of TE solution (10 mM Tris-HCl, 1 mM ED
TA (pH 8.0)) and stored at -80 ° C for use.
【００２４】それぞれの検体１００μｌからスマイテス
トＲキット（住友金属工業）を用いて、ＲＮＡを抽出
し、乾固後のＲＮＡに、８μｌのRNaseフリーの蒸留水
と、１μｌのリボヌクレアーゼインヒビター（40 U/μ
l）(Promega)と、１μｌの５０μＭ下流プライマー（OL
68-1、5'GGTAA(C/T)TTCCACCACCA(A/G/C/T)CC3'、20mer
(配列番号１)）とを加え溶解させた。１００℃で１分間
加熱後、氷中にて急冷した。これに、１０×Taq緩衝液
（100 M Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2,
0.01%(w/v) gelatin）２μｌ、10 mM dNTPs２μｌ、Ｍ
−ＭＬＶ由来の逆転写酵素(200 U/μl)(BRL)１μｌ、お
よび、RNaseフリーの蒸留水４μｌを加え、３７℃、６
０分間の反応条件でｃＤＮＡを合成した。RNA was extracted from 100 μl of each sample using a Sumitest R kit (Sumitomo Metal Industries, Ltd.), and 8 μl of RNase-free distilled water and 1 μl of ribonuclease inhibitor (40 U / μ
l) (Promega) and 1 μl of 50 μM downstream primer (OL
68-1, 5'GGTAA (C / T) TTCCACCACCA (A / G / C / T) CC3 ', 20mer
(SEQ ID NO: 1)) and dissolved. After heating at 100 ° C. for 1 minute, the mixture was rapidly cooled in ice. To this, 10 × Taq buffer (100 M Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 ,
0.01% (w / v) gelatin) 2 μl, 10 mM dNTPs 2 μl, M
-Add 1 μl of MLV-derived reverse transcriptase (200 U / μl) (BRL) and 4 μl of RNase-free distilled water, and add
CDNA was synthesized under the reaction conditions of 0 minutes.
【００２５】ウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列を増幅
するため、エンテロウイルスに共通な配列のある5'非翻
訳領域およびVP2領域に設定したプライマーを用いてＰ
ＣＲを行った。第１回(1st)ＰＣＲは、上記で得られた
反応液５μｌに、１０×Taq緩衝液４．５μｌ、４０μ
Ｍ上流プライマー（EVP2、5'CCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAA
T3'、25mer(配列番号２)）０．５μｌ、蒸留水３９．７
５μｌおよびAmpli TaqDNAポリメラーゼ(5U/μl)(Roche
Diagnostic Systems)０．２５μｌを加え、ミネラルオ
イルを重層し、GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELME
R)を用いて、９５℃３０秒で変性、５５℃３０秒でアニ
ーリングおよび７２℃１分間で伸長のサイクルを４０サ
イクルの条件で行った。第２回(2nd)ＰＣＲは、1st Ｐ
ＣＲで得られた反応液５μｌに１０×Taq緩衝液４．５
μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰｓ１μｌ、５０μＭ上流プライ
マー(EVP4、5'CTACTTTGGGTGTCCGTGTT3'、20mer(配列番
号３))０．５μｌ、５０μＭ下流プライマー(OL68-1)
０．５μｌ、蒸留水３８．２５μｌおよびAmpli Taq DN
Aポリメラーゼ(5U/μl)０．２５μｌを加え、1st ＰＣ
Ｒと同じ条件で行った。ＰＣＲ産物は、３％アガロース
ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色後、
紫外線で検出した。In order to amplify the nucleotide sequence of the entire VP4 region of the virus, the primers set in the 5 ′ untranslated region having a sequence common to the enterovirus and the VP2 region were used.
CR was performed. In the first (1st) PCR, 4.5 μl of 10 × Taq buffer, 40 μl of 10 × Taq buffer were added to 5 μl of the reaction solution obtained above.
M upstream primer (EVP2, 5'CCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAA
T3 ′, 25mer (SEQ ID NO: 2)) 0.5 μl, distilled water 39.7
5 μl and Ampli Taq DNA polymerase (5 U / μl) (Roche
Diagnostic Systems) was added, and mineral oil was overlaid. GeneAmp PCR System 9600 (PERKIN ELME
Using R), denaturation at 95 ° C. for 30 seconds, annealing at 55 ° C. for 30 seconds, and elongation at 72 ° C. for 1 minute were performed under 40 cycles. The second (2nd) PCR is 1st P
5 μl of the reaction solution obtained by CR was added to 10 × Taq buffer solution 4.5.
μl, 10 mM dNTPs 1 μl, 50 μM upstream primer (EVP4, 5′CTACTTTGGGTGTCCGTGTT3 ′, 20mer (SEQ ID NO: 3)) 0.5 μl, 50 μM downstream primer (OL68-1)
0.5 μl, 38.25 μl of distilled water and Ampli Taq DN
Add 0.25 μl of A polymerase (5 U / μl) and add 1st PC
Performed under the same conditions as R. PCR products were separated by 3% agarose gel electrophoresis, and after ethidium bromide staining,
Detected by ultraviolet light.
【００２６】この条件でのＰＣＲでは、1st ＰＣＲで約
７５０ｂｐ、2nd ＰＣＲで約６５０ｂｐ（5'非翻訳領域
の一部、ＶＰ４全領域およびＶＰ２領域のＮ末端側約１
／３を含む）が増幅される。今回用いた全ての標準株お
よび分離ウイルス株において増幅が確認できた。In the PCR under these conditions, the first PCR is about 750 bp, the second PCR is about 650 bp (part of the 5 ′ untranslated region, the entire VP4 region and the N-terminal side of the VP2 region.
/ 3) are amplified. Amplification was confirmed in all the standard strains and the isolated virus strains used this time.
【００２７】また、咽頭拭い液の臨床検体からは、上記
の増幅の他に、2nd ＰＣＲで約６２０ｂｐの増幅も認め
られた。これは、エンテロウイルスと同じピコルナウイ
ルス科に属するライノウイルスと考えられ、今回用いた
プライマー配列を有するが、5'非翻訳領域に一部塩基配
列の欠失を持つため、その増幅産物の長さからエンテロ
ウイルスとは容易に区別ができた。[0027] In addition to the above-mentioned amplification, about 620 bp amplification by 2nd PCR was observed from the clinical specimen of the throat swab. This is considered to be a rhinovirus belonging to the same Picornaviridae family as the enterovirus, and has the primer sequence used this time, but has a partial nucleotide sequence deletion in the 5 'untranslated region, so the length of the amplification product Could easily be distinguished from enterovirus.
【００２８】このようにして得られた、ＶＰ４全領域を
含むＰＣＲ産物の塩基配列を解析した。ＰＣＲ産物は、
QIAquick PCR purificationキット(QIAGEN)を用いて、
未反応のプライマーとｄＮＴＰｓを除去し、ＤＮＡ濃度
が５ｎｇ／μｌ以上になるように蒸留水に溶解した。塩
基配列解析用に、ＶＰ４領域上流のエンテロウイルスに
共通の塩基配列に基づいて、プライマー(SEVP1、5'TGGC
TGCTTATGGTGACAAT3'、20mer(配列番号４))を設計した。
塩基配列の解析は、ダイデオキシターミネーターサイク
ルシークエンスキット(PERKIN ELMER)を用いて、９５℃
１０秒、５０℃５秒および６０℃４分のサイクルで２５
サイクル反応を行い、373A DNAオートシーケンサー(PER
KIN ELMER)で塩基配列を決定した。The nucleotide sequence of the thus obtained PCR product containing the entire VP4 region was analyzed. The PCR product is
Using QIAquick PCR purification kit (QIAGEN),
Unreacted primers and dNTPs were removed and dissolved in distilled water so that the DNA concentration was 5 ng / μl or more. For nucleotide sequence analysis, primers (SEVP1, 5′TGGC) were used based on the nucleotide sequence common to the enterovirus upstream of the VP4 region.
TGCTTATGGTGACAAT3 ', 20mer (SEQ ID NO: 4)) was designed.
The nucleotide sequence was analyzed at 95 ° C. using a dideoxy terminator cycle sequencing kit (PERKIN ELMER).
25 cycles of 10 seconds, 50 ° C for 5 seconds and 60 ° C for 4 minutes.
Perform a cycle reaction and use the 373A DNA Autosequencer (PER
The nucleotide sequence was determined by KIN ELMER).
【００２９】塩基配列を決定した結果、エンテロウイル
スの標準株、分離ウイルス株、臨床検体のいずれの株に
ついても、塩基配列に挿入や欠失は認められず、ＶＰ４
領域は２０７ｂｐの長さで一様であった。As a result of determining the nucleotide sequence, no insertion or deletion was observed in the nucleotide sequence of any of the standard strain, the isolated virus strain, and the clinical specimen of the enterovirus.
The area was uniform with a length of 207 bp.
【００３０】CAV2-8、CAV10、CBV2、CBV6、ECV1-5、ECV
7、ECV13、ECV14、ECV17-21、ECV24、ECV25およびECV30
（２６血清型）が、今回初めてＶＰ４全領域の塩基配列
を解析したウイルス標準株であり、CAV9、CAV16、CAV2
1、CAV24、CBV1、CBV3-5、ECV6、ECV9、ECV11、ECV12、
ECV16、EV70、ECV71、PV1-3（１８血清型３５株）がGen
Bankに登録されている標準株である。これら４４血清型
のエンテロウイルス標準株のＶＰ４領域は、６６〜８４
％のホモロジーを有し、８０％のホモロジーで血清型が
区別できた。CAV2-8, CAV10, CBV2, CBV6, ECV1-5, ECV
7, ECV13, ECV14, ECV17-21, ECV24, ECV25 and ECV30
(26 serotypes) are the virus standard strains whose nucleotide sequence of the entire VP4 region was analyzed for the first time, and CAV9, CAV16, CAV2
1, CAV24, CBV1, CBV3-5, ECV6, ECV9, ECV11, ECV12,
ECV16, EV70, ECV71, PV1-3 (18 serotypes 35 strains)
It is a standard stock registered in Bank. The VP4 region of these 44 serotype enterovirus standard strains is 66-84.
% Homology, and serotypes could be distinguished by 80% homology.
【００３１】上記の条件のRT-PCRによれば、0.1TCID50
の検出感度で、咽頭拭い液、髄液などの臨床材料からウ
イルスゲノムを直接増幅することが可能である。従っ
て、分離培養することなく、エンテロウイルスの血清型
の迅速同定が可能になる。According to RT-PCR under the above conditions, 0.1 TCID 50
With the detection sensitivity of, it is possible to directly amplify the viral genome from clinical materials such as pharyngeal swabs and cerebrospinal fluid. Therefore, rapid identification of enterovirus serotypes is possible without separate culture.
【００３２】[0032]
【実施例２】 系統解析による臨床分離株の血清型同定
実施例１で新たに塩基配列を解析した標準株２６株、な
らびに、GenBankに登録されているCAV9、CAV16、CAV2
1、CAV24、CBV1、CBV3、CBV4、CBV5、ECV6、ECV9、ECV1
1、ECV12、ECV16、EV70、EV71およびPV1-3（１８血清型
３５株）のＶＰ４領域の塩基配列を選出した。系統樹
は、Higgins法(DNASIS、日立ソフトウェアエンジニアリ
ング)、ならびに、２−パラメーター法を用いたUPGMA法
およびN-J法(SINCA、富士通)の両ソフトウェアにより作
成し、作成された系統樹の確かさは、ブーツストラップ
法(SINCA)を用いて統計的評価を行った。[Example 2] Serotyping of clinical isolates by phylogenetic analysis 26 standard strains whose nucleotide sequences were newly analyzed in Example 1, and CAV9, CAV16 and CAV2 registered in GenBank
1, CAV24, CBV1, CBV3, CBV4, CBV5, ECV6, ECV9, ECV1
1. The nucleotide sequences of the VP4 region of ECV12, ECV16, EV70, EV71 and PV1-3 (18 serotype 35 strains) were selected. The phylogenetic tree was created by both the Higgins method (DNASIS, Hitachi Software Engineering) and the UPGMA method and the NJ method (SINCA, Fujitsu) using the two-parameter method. Statistical evaluation was performed using the bootstrap method (SINCA).
【００３３】臨床分離株の塩基配列を標準株と共に系統
解析を行って得られた系統樹の枝分かれとブーツストラ
ップ解析とより血清型同定を行った。先ず、標準株のＶ
Ｐ４領域の全領域の塩基配列による系統樹を作成した結
果、エンテロウイルスの遺伝子型は約６０％のホモロジ
ーで５群に分かれた。すなわち、CAV2-8、CAV10の第１
群、CAV16、EV71の第２群、CBV1-6、CAV9、エコーウイ
ルス(ECV)の第３群、ポリオウイルス(PV)、CAV21、CAV2
4の第４群およびEV70の第５群の各群である。これは、U
PGMA法およびN-J法のいずれも同様な結果となり、ピコ
ルナウイルス科内のゲノムにおける系統樹と矛盾を生じ
ず、さらにPeterMuirらが示したVP4-VP2のアミノ酸配列
の系統樹によるグループ分けとよく似ていた。Phylogenetic analysis was performed on the nucleotide sequence of the clinically isolated strain together with the standard strain, and the serotype was identified based on branching of the phylogenetic tree and bootstrap analysis. First, the standard strain V
As a result of creating a phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of the entire P4 region, the genotype of the enterovirus was divided into five groups with a homology of about 60%. That is, the first of CAV2-8 and CAV10
Group, CAV16, second group of EV71, CBV1-6, CAV9, third group of echovirus (ECV), poliovirus (PV), CAV21, CAV2
4 shows a fourth group and EV70 shows a fifth group. This is U
Both the PGMA method and the NJ method gave similar results, and did not conflict with the phylogenetic tree in the genome of the Picornaviridae family, and were very similar to the grouping of the amino acid sequence of VP4-VP2 by PeterMuir et al. I was
【００３４】次に、同様に手足口病の臨床分離株３６株
の系統解析を行ったところ、血清型の同定されたCAV16
およびEV71は、それぞれの血清型の標準株と８０％以上
のホモロジーを示し、ブーツストラップ法において１０
０％の確率で、交差することなくそれぞれCAV16およびE
V71の単一の血清型のクラスターを形成した。さらに、
血清型が未同定な株についても単一のクラスターを形成
していた。Next, phylogenetic analysis of 36 clinical isolates of hand-foot-and-mouth disease was carried out in the same manner.
And EV71 show 80% or more homology with the standard strain of each serotype, and show 10% homology in the bootstrap method.
0% probability, CAV16 and E respectively without crossing
A single serotype cluster of V71 formed. further,
Strains with unidentified serotypes also formed a single cluster.
【００３５】また、同様にECV30の分離株１４株につい
て系統解析を行うと、ECV30の標準株と８０％以上のホ
モロジーを示し、ブーツストラップ法で１００％の確率
で交差することなく単一のクラスターを形成していた。Similarly, when the phylogenetic analysis was performed on 14 ECV30 isolates, they showed a homology of 80% or more with the ECV30 standard strain, and showed a single cluster without crossover at 100% probability by the bootstrap method. Had formed.
【００３６】さらに、コクサッキーウイルスＡ２４変異
株(CAV24v)の各分離株についても、同様に系統解析を行
うと、標準株と単一のクラスター（８５％以上のホモロ
ジー）を形成したうえに、ブーツストラップ法で１００
％の確率で交差することなく単一のクラスターを形成
し、他の血清型のエンテロウイルスと容易に鑑別され
た。急性出血性結膜炎(AHC)の原因ウイルスとして、CAV
24vとEV70の二つのウイルスが知られており、従って、A
HCの原因ウイルスを分離培養することなく、迅速に同定
できることが確認された。Further, when each strain of the Coxsackievirus A24 mutant (CAV24v) was subjected to phylogenetic analysis, a single cluster (having a homology of 85% or more) with the standard strain was formed, followed by the bootstrap method. At 100
It formed a single cluster without crossover with a% probability and was easily distinguished from other serotypes of enterovirus. CAV as the causative virus of acute hemorrhagic conjunctivitis (AHC)
Two viruses, 24v and EV70, are known, and therefore A
It was confirmed that the virus responsible for HC can be quickly identified without separate culture.
【００３７】[0037]
【発明の効果】本発明によって、エンテロウイルスの血
清型を、エンテロウイルスの分離培養を要することな
く、塩基配列の分子系統解析により決定することが可能
になる。According to the present invention, it is possible to determine the serotype of an enterovirus by molecular phylogenetic analysis of the base sequence without the need for separate culture of the enterovirus.
【００３８】[0038]
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列の特徴 存在位置：18 他の情報：N=A, T, GまたはC 配列 GGTAAYTTCC ACCACCANCC 20[Sequence list] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid, Synthetic DNA Sequence characteristics Location: 18 Other Information: N = A, T, G or C sequence GGTAAYTTCC ACCACCANCC 20
【００３９】 配列番号：２ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 CCTCCGGCCC CTGAATGCGG CTAAT 25SEQ ID NO: 2 Sequence length: 25 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid, synthetic DNA sequence CCTCCGGCCC CTGAATGCGG CTAAT 25
【００４０】 配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 CTACTTTGGG TGTCCGTGTT 20SEQ ID NO: 3 Sequence length: 20 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid, synthetic DNA sequence CTACTTTGGG TGTCCGTGTT 20
【００４１】 配列番号：４ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 TGGCTGCTTA TGGTGACAAT 20SEQ ID NO: 4 Sequence length: 20 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid, synthetic DNA sequence TGGCTGCTTA TGGTGACAAT 20
Claims (3)
列に基づいて分子系統解析を行い、エンテロウイルスの
血清型を同定することを特徴とするエンテロウイルスの
血清型同定法。1. A method for identifying a serotype of an enterovirus, wherein the serotype of the enterovirus is identified by performing a molecular phylogenetic analysis on the basis of the nucleotide sequence of the VP4 region of the enterovirus.
ＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲに
よってＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅し、
増幅された産物を用いて塩基配列解析を行うことによ
り、前記ＶＰ４領域の塩基配列を得ることを特徴とする
請求項１に記載の血清型同定法。2. An RNA is prepared from a sample, and the prepared R
A cDNA is obtained from NA, and a base sequence including a base sequence of the VP4 region is amplified from the obtained cDNA by PCR,
The serotype identification method according to claim 1, wherein the nucleotide sequence of the VP4 region is obtained by performing nucleotide sequence analysis using the amplified product.
列を有するプライマーと配列番号２に示す塩基配列を有
するプライマーとを用いるものであることを特徴とする
請求項２に記載の血清型同定法。3. The serotype identification according to claim 2, wherein the PCR uses a primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. Law.
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|---|---|---|---|---|
| JP2003093057A (en) * | 2001-09-26 | 2003-04-02 | Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories Inc | Method for identifying serotype or genotype by lineage analysis of rhinovirus |
| JP2010104379A (en) * | 2010-02-01 | 2010-05-13 | Mitsubishi Chemical Medience Corp | Method for identifying strain of mycoplasma and ureaplasma |
-
1998
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