JPH11346759A

JPH11346759A - 火落菌数の測定法

Info

Publication number: JPH11346759A
Application number: JP10161188A
Authority: JP
Inventors: Hideomi Takahashi; 秀臣高橋
Original assignee: Nihon Millipore KK
Current assignee: Nihon Millipore KK
Priority date: 1998-06-09
Filing date: 1998-06-09
Publication date: 1999-12-21

Abstract

(57)【要約】【課題】通常微生物を取り扱う実験室に備えた汎用設
備を用い検体中の火落菌数を簡便、迅速且つ正確に測定
するようにしている。【解決手段】検体中の火落菌数を多孔質濾過膜上に捕
集し、嫌気性雰囲気下に寒天培地上で短時間培養して形
成された火落菌由来のコロニ−を塩基性染料の有機溶媒
溶液で染色した後、有機溶媒を揮散して目視、拡大鏡も
しくは顕微鏡下に染色微小コロニ−を計数可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は日本酒の腐敗の原因
として知られている火落菌の生菌数を簡便かつ迅速に測
定する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から日本酒などの検体中の火落菌の
数を求める方法は知られており、コロニー数を計数する
ための培地としてS I培地（日本醸造協会）が既に知ら
れている。すなわち、ＳＩ培地は、酵母エキス１０ｇ、
ポリペプトン５ｇ、ブドウ糖２５ｇ、酢酸ナトリウム１
０ｇ、７水和硫酸マグネシウム０．１ｇ、硫酸マンガン
０．００２５ｇ、硫酸第一鉄０．００２５ｍｌ、窒化ナ
トリウム０．０５ｇ、メバロン酸０．０５ｇ、寒天０．
６ｇ、エタノール１００（または１５０）ｍｌ、蒸留水
９００（または８５０）ｍｌから成り、ｐH５．１〜
５．２を示すものとして知られている。さらに、食品中
の微生物検査法解説書（株式会社講談社発行）２７７
頁によれば、ＳＩ培地に対し、寒天１０ｇを補填し、エ
タノールを６〜８％濃度として培地を改善することが示
されている。これによれば培養と火落菌の数判定は検体
をメンブレンフィルタ（直径４７ｍｍ、孔径０．４５μ
ｍ）で濾過し、ＳＩ培地上にメンブレンフィルタを置
き、その上に液体状の温かい培地を注いでから固化さ
せ、既存の寒天培地と共に層を成し（１０ｍｌ、４０〜
４２℃）、３０℃、約１週間ビニ−ル袋に包んで培養
し、通常３〜４日間培養後コロニーがなければ除菌され
ていると判断する。このときに顕微鏡観察は有効である
とされており、真性火落菌の中には誘導期間の長いもの
があるので都合１週間の培養後の観察も欠かせないとし
ている。

【０００３】しかしながら、観察結果が得られるまで３
〜４日乃至は１週間を要することが避けられず、例えば
検体が製品である場合は大量の在庫を抱えることとなり
改善が望まれていた。そこで、特開平７−１９５号にお
いて極めて迅速な火落菌の測定方法が提案された。すな
わち、親水性ポリカ−ボネ−トメンブレンフィルタで日
本酒中の火落菌を濾過捕集し、より好ましいTM培地（同
特許出願中に開示されている組成の培地で、発明者の頭
文字をとつて命名されている。）上で嫌気下に培養し、
アデノシン５’−三リン酸（以下ATPとも記する。）
の抽出試薬により該フィルタ上に増殖した火落菌由来の
ATPを取り出し、ルシフェラ−ゼ、マグネシウム、酸素
の存在下ルシフェリンと反応せしめ生起する発光反応を
発光画像解析システムで処理して生菌数を測定するとし
ている。嫌気培養時間は３０℃において僅かに１６時間
と示されている。

【０００４】かかる発明は迅速さの観点からはかなり満
足のいくものであるが、経済的理由あるいはその他の理
由から、より簡易な迅速測定は相変わらず求められつづ
け、例えば特開平５−１０３６９５号には火落菌の培養
条件の重要項目である嫌気条件を一層緻密に追求し、エ
タノール処理、培養雰囲気としての酸素濃度範囲の設
定、およびその維持のための通気度の限定された多層フ
ィルムからなるパウチ（雰囲気を制御するための系を隔
離、構成する袋体）の使用を開示している。

【０００５】この結果、高価な設備を要しなくとも培養
日数を７日以内に短縮し得、更なる短縮をも示唆してい
るが明らかにはされていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の方法においては、やはり検出までの日数が長過ぎた
り、短縮し得たとしても発光を検出する方法においては
必要な装置が高額な上、その維持管理は必ずしも容易で
はないことは否めず、通常微生物を取り扱うために実験
室に備えた汎用設備において低廉で、簡単に、かつ迅速
に火落菌数を測定することができない問題を有してい
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記のような背景に鑑
み、本発明者は高価な機器を用いることなく、火落菌の
迅速な数の測定方法を提供することを種々検討した。そ
の結果、メンブレンフィルタを適用して濾過、捕集、培
養し、形成されたコロニーを計数して検体中の菌数を測
定する方法において、該培養が嫌気性条件下、所定時
間、寒天、ゼラン、カラ−ゲンの少なくとも１種を含有
する火落菌培養固体培地で行った後、該メンブレンフィ
ルタ上を塩基性染料の有機溶媒溶液で処理、風乾して染
色されたコロニーを計数することを特徴とする火落菌の
迅速測定法を見出し本願発明を想到するに至った。

【０００８】ここに、検体を濾過して火落菌を捕集する
ために適用するメンブレンフィルタは各種ポリオレフィ
ン、特に塩素やフッ素などのハロゲン置換ポリオレフィ
ン、各種ポリアミド、ポリサルホン、ポリエ−テル、ポ
リカ−ボネ−ト製の孔径０．２２〜０．６５μｍが好適
である。さらにはそれらの表面を物理的もしくは化学的
に修飾して水酸基、アミノ基、陰イオン交換基、陽イオ
ン交換基などの親水性基を付与した機能性濾過膜なども
適用して構わない。特に、濾過膜上には計数を容易なら
しめるように種々の規格の格子を設ける、例えば約２〜
３ｍｍの正方格子などがプリントされた濾過膜を使用す
ることが好ましい。

【０００９】本願発明におけるメンブレンフィルタを適
用して濾過により捕集される火落菌とは例えばLactbaci
llus homohiochii，Lactbacillus fructivoransのごと
き真性火落菌やLactbacillus fermentum, Lactbacillus
plantalumのごとき火落性乳酸菌を対象とするものであ
る。

【００１０】培養に使用する培地には寒天、ゼラン、カ
ラゲーナンの少なくとも１種が含有され、含有程度に関
して詳述するなら培地が確実に固形化する程度に含有さ
れることが要される。即ち、０．２〜２ｗｔ％前後で、
培養に支障が無い程度までの含有率とされる事が好まし
い。培地の栄養成分としては火落菌を増殖させるものな
ら特に限定されることなく使用し得、例えば上述した先
行技術に開示されたＳＩ培地、ＴＭ培地、ＮＳ培地など
に上述した寒天、ゼラン、カラゲーナン等を添加した固
体培地は好適である。特にエタノール成分は欠かせず、
真性火落菌数の測定の場合は培地中のエタノール含有率
を５〜１５％とする事が好ましい。

【００１１】また、培養に関して重要なことにはすでに
開示されているとおり、培地上に設置された火落菌を付
着したメンブレンフィルタ周辺を嫌気性雰囲気に保持す
ることが肝要である。ここに嫌気性の雰囲気は、捕集し
た火落菌を付着したメンブレンフィルタを固体培地の上
に設置した後、市販の酸素吸収・炭酸ガス発生剤例えば
商品名アネロパック（三菱ガス化学（株）製）のような
気体調整剤の他、炭酸ガス培養器も使用できる。

【００１２】培養における所定時間とは、染色されたコ
ロニー計数が容易に為し得る程度の時間であり、火落菌
の種類、培地の構成、組成、培養温度などにより画一的
には決められないがおおむね1．５から２日であり、発
光反応を利用しない方法としては従来法より格段に短縮
し得ることに変わりはない。

【００１３】上述したように本願発明においてはコロニ
ー計数を容易にするため、換言するなら短時日でもコロ
ニー計数が為し得るようにするために、培養された火落
菌を塩基性染料の有機溶媒溶液で染色することは不可欠
の要件である。すでに特開平９−３７７９４に開示の通
り塩基性染料としては、メチレンブルー、サフラニン、
フクシン、ゲンチアンバイオレットが好適であるが、こ
れらに限定されるものではない。

【００１４】これら染料を溶解する溶媒は各種の有機溶
媒、特に極性有機溶媒が好適であるが、染料を溶解し得
て染色が速やかになされ、溶媒揮散に支障がなく、濾過
膜の平面性を失わない限り、水を溶媒の一部として加え
た有機溶媒も使用し得る。その中でも、揮発度が高い有
機溶媒やそれら溶媒の混合物が好ましいが、加熱乾燥を
適用できる場合には必ずしも揮発度の高いことを考慮し
なくても構わない。特に、エタノールは好ましく培養中
の火落菌の周辺環境はエタノールを含有しており染料の
浸透がすばやくなされ極めて容易に染色される特徴を発
揮する。

【００１５】コロニー計数について詳述すると、目視も
しくは顕微鏡を用いてなされるが火落菌の濾過、捕集、
培養から計数までの時間を少しでも短縮するためには顕
微鏡を使用することが好ましい。顕微鏡の倍率とコロニ
ーの大きさについて言及すると、１０〜３０倍程度の顕
微鏡倍率が実用面より好ましい。顕微鏡の倍率が高くな
り過ぎると走査が煩わしくなり、場合によってはコロニ
ーとは異なる異物をも計数する虜があり好ましくないの
で、コロニーの大きさとしては３０μｍ前後もしくはそ
れ以上が望ましい。検体由来の微生物コロニー以外の異
物が多い場合は、培養時間を数時間程度延長すると、よ
り低倍率または目視での計数が容易になる。しかし、い
たずらに大きくなるまで培養時間を延長することは迅速
測定の目的に照らして避けるべきである。

【００１６】濾過膜の乾燥については、揮発度の高い溶
媒や低沸点の溶媒は、単に風乾することで除去し得るの
で特に好都合でありエタノールはこの点でも好適であ
る。かくして、高価な測定設備を設けることなく本発明
の目標である火落菌培養時間を短縮すること、換言する
と簡易かつ迅速な微生物検出方法が提供された。すなわ
ち、短時間の培養では顕微鏡下にも難しい微小コロニー
検出を染色操作を加味することで容易にし、その結果培
養時間だけでなく計数のために要する時間も短縮するこ
とができ、目的の菌数を計測すると言う目標、換言する
と微小コロニーを計数し得ると言う目標が達成された。

【００１７】本発明における火落菌検出時間は微生物の
種類に応じて異なり一概には表現し得ないが、従来法に
おいて3日以上通常1週間以上要したコロニー測定が概ね
数分の１とすることを可能にした。要するに簡単な嫌気
条件の構成下、塩基性染料と有機溶媒を用いた染色と溶
媒の揮散によりその存在が際立たせて目視あるいは顕微
鏡下で検出し得るので、著しく培養時間及びこれに続く
各種の所要時間を短縮し得るところとなった。

【００１８】従って、本発明の火落菌数測定方法は火落
菌を合成分子製濾過膜上に捕集し、コロニーが染色され
て目視もしくは低倍率下の顕微鏡で計数し得るまで培養
し、続いて、塩基性染料の有機溶媒溶液でコロニーを染
色し、該有機溶媒を風乾、揮散後、染色されたコロニー
数を目視もしくは低倍率下の顕微鏡で計数測定すること
により、元の微生物含有試料中の微生物数を計測するも
のであると言える。

【００１９】

【発明の実施の形態】以下には本願発明方法を実施例に
より説明するが、本願発明を限定するものではない。

【００２０】

【実施例】（実施例１）Lactbacillus fructivorans Ｉ
ＦＯ１３９５４とLactbacillus homohiochiiＩＦＯ１５
８８７を夫々、市販ＳＩ液体培地に接種して３０℃で４
日間静置培養し前者の菌数が約４×１０⁷／ｍｌ、後者
の菌数が約４×１０⁸／ｍｌの増殖液を得た。

【００２１】次いで、１０％エタノール溶液で前者を３
×１０⁵倍に後者を３×１０⁶倍に希釈し、夫々１００
ＣＦＵ（ＣｏｌｏｎｙＦｏｒｍｉｎｇＵｎｉｔ）／１
００μｌの希釈菌液とした。

【００２２】これら希釈菌液各々１００μｌを供試し、
商品名アネロパウチＣＯ₂（三菱化学製ＣＯ₂発生剤）
１袋で、ほぼ閉鎖系とされた培養雰囲気を嫌気性に制御
し（酸素分圧を低くする）、３０℃で時間を変えて３種
類の培養・計数法で培養し生成コロニー検出の簡易さを
観察し結果を表１に示した。

【００２３】＜第一の培養・計数法（以下、寒天平板法
もしくは寒天法とも略記）＞ＳＩ寒天培地（市販のＳＩ
培地に寒天を１％添加して調製した培地）の表面にコン
ラージ棒で前記希釈菌液１００μｌを均一に広げ、所定
時間培養し、生成コロニー数を目視、計数する。

【００２４】＜第二の培養・計数法（以下、メンブレン
フィルター法もしくはＭＦ法とも略記）＞滅菌済みの孔
径０．４５μｍのセルロ−ス製メンブレンフィルター
（日本ミリポア社製ＨＡＷＧ、直径４７ｍｍ）をフィル
ターホルダーにセットし、前記希釈菌液１００μｌを１
０％エタノール溶液を用いて濾過し、洗浄する。次いで
このメンブレンをＳＩ寒天培地の表面に静置し、所定時
間培養し、生成コロニー数を目視、計数する。

【００２５】＜第三の培養・計数法（以下、マイクロス
テイン法もしくはＭＳ法とも略記）＞滅菌済みの孔径
０．４５μｍのＭＳ法用メンブレンフィルター（日本ミ
リポア社製ＭＳＨＳ、直径４７ｍｍ）をフィルターホル
ダーにセットし、前記希釈菌液１００μｌを１０％エタ
ノール溶液を用いて濾過し、洗浄する。次いでこのメン
ブレンフィルターをＳＩ寒天培地の表面に静置し、所定
時間培養する。別途、染色液として孔径０．２２μｍの
ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）製のメンブレンフィ
ルタで濾過した０．１ｗｔ％のメチレンブルーのエタノ
ール溶液を調整しておく（詳細は特開平９−３７７９４
号に開示済み）。上記培養終了後のメンブレンフィルタ
ーの中央部にこのメチレンブルーのエタノール溶液（以
下ＭＳ染色液と呼称する）２００μｌを供し、メンブレ
ンフィルターを取り出し、シャーレの蓋に移し乾燥後約
１０〜２０倍の拡大鏡、もしくは顕微鏡で染色されたコ
ロニー数を計数する。

【００２６】

【表１】

【００２７】表１から明らかなように、ＭＳ法では寒天
法に比較してほぼ半分の培養時間でコロニー計数が可能
となり、ＭＦ法に比較すると約１／３の培養時間でコロ
ニー計数が可能となった。コロニー数計数まで長時間を
要したＭＦ法はコロニーの色とメンブレンフィルターの
色が同色系であったためコントラストが不良であったこ
とにも原因があり、黒色系のメンブレンフィルターを採
用することにより培養時間短縮がはかれるとは考えられ
る。

【００２８】（実施例２）Lactbacillus fructivorans
ＩＦＯ１３９５４を市販ＳＩ液体培地に接種して３０℃
で４日間静置培養し、１０％エタノール溶液で３×１０
⁵倍に希釈した希釈菌液を得た。一方、滅菌済みの孔径
０．４５μｍのＭＳ用メンブレンフィルター（日本ミリ
ポア社製ＨＳＨＳ、直径４７ｍｍ）を滅菌済みフィルタ
ーホルダーにセットし、上記希釈菌液１００μｌを１０
％エタノール溶液を用いて濾過し、洗浄する。次いでこ
のメンブレンフィルターを直径９０ｍｍのシャーレに充
填されたＳＩ寒天培地の表面に静置し、その状態のまま
アネロパック（三菱化学製酸素吸収・炭酸ガス発生剤）
内にアネロパウチケンキ（三菱化学製）と共に収納し、
密閉系を維持したまま３０℃で４５時間、培養した。続
いて実施例１に記載したＭＳ染色液２００μｌをメンブ
レンフィルターの中央部に静かに供し、染色液が全面に
拡散した後、メンブレンフィルターをシャーレの蓋に移
し替え、通風下で乾燥し倍率１０倍の拡大鏡で青く染色
されたコロニー数を計数した。結果を表２に示した。

【００２９】対照としてＭＳ用メンブレンフィルターに
代えて同一孔径を有するセルロ−スメンブレンフィルタ
ー（日本ミリポア社製ＨＡＷＧ、直径４７ｍｍ）を用い
た前記ＭＦ法により、培養１２０時間後にコロニー数を
計数した。Lactbacillus fructivoransのコロニー計数
結果を表２に示した。

【００３０】

【表２】

【００３１】（実施例３）Lactbacillus homohiochiiＩ
ＦＯ１５８８７を市販ＳＩ液体培地に接種して３０℃で
４日間静置培養し、１０％エタノール溶液で３×１０⁶
倍に希釈した希釈菌液を得た。一方、滅菌済みの孔径
０．４５μｍのＭＳ用メンブレンフィルター（日本ミリ
ポア社製ＨＳＨＳ、直径４７ｍｍ）を滅菌済みフィルタ
ーホルダーにセットし、上記希釈菌液１００μｌを清酒
をミリＱ水で２倍に希釈後、ステリベクスＧＶ（孔径
０．２２μmのデュラポアメンブレンタイプ、ミリポア
製）でろ過した溶液を用いて濾過し、洗浄する。次いで
このメンブレンフィルターを直径６０ｍｍのシャーレに
充填されたＳＩ寒天培地の表面に静置し、その状態のま
まアネロパック（三菱化学製）内にアネロパウチケンキ
（三菱化学製）と共に収納し、密閉系を維持したまま３
０℃で６０時間、培養した。続いて実施例２と同様ＭＳ
染色液２００μｌをメンブレンフィルターの中央部に静
かに供し、染色液が全面に拡散した後、メンブレンフィ
ルターをシャーレの蓋に移し替え、通風下で乾燥し倍率
１５倍の拡大鏡で染色されたコロニー数を計数した。結
果を表３に示した。

【００３２】対照として上記希釈液１００μｌを直径９
０ｍｍのシャーレに充填されたＳＩ寒天培地の表面にコ
ンラージ棒で均一に広げ、所定時間培養し、生成コロニ
ー数を目視、計数した。Lactbacillus homohiochiiのコ
ロニー計数結果を表３に示した。

【００３３】

【表３】

【００３４】（実施例４）火落菌に汚染され白濁した清
酒より分離した菌（Ｎ菌と呼ぶ）を市販ＳＩ液体培地に
接種して３０℃で４日間静置培養し、１０％エタノール
溶液で1×１０⁵倍に希釈した希釈菌液を得た。一方、滅
菌済みの孔径０．４５μｍのＭＳ用メンブレンフィルタ
ー（日本ミリポア社製ＨＳＨＳ、直径４７ｍｍ）を滅菌
済みフィルターホルダーにセットし、上記希釈菌液１０
０μｌを１０％エタノール溶液を用いて濾過し、洗浄す
る。次いでこのメンブレンフィルターを直径６０ｍｍの
シャーレに充填されたゼランを０．５％含有するＳＩ培
地の表面に静置し、その状態のままアネロパック（三菱
化学製）内にアネロパウチCO₂（三菱化学製）と共に収
納し、密閉系を維持したまま３０℃で４０時間、培養し
た。続いて実施例２と同様ＭＳ染色液２００μｌをメン
ブレンフィルターの中央部に静かに供し、染色液が全面
に拡散した後、メンブレンフィルターをシャーレの蓋に
移し替え、通風下で乾燥し倍率２０倍の拡大鏡で染色さ
れたコロニー数を計数した。結果を表４に示した。

【００３５】対照として上記希釈液１００μｌを直径９
０ｍｍのシャーレに充填されたゼランを０．５％含有す
るＳＩ培地の表面にコンラージ棒で均一に広げ、４日間
培養し、生成コロニー数を目視、計数した。Ｎ菌のコロ
ニー計数結果を表４に示した。

【００３６】

【表４】

【００３７】（実施例５）火落菌に汚染さた白濁した清
酒を、１０％エタノール溶液で1×１０⁴倍に希釈した
希釈菌液を得た。一方、滅菌済みの孔径０．４５μｍの
ＭＳ用メンブレンフィルター（日本ミリポア社製ＨＳＨ
Ｓ、直径４７ｍｍ）を滅菌済みフィルターホルダーにセ
ットし、上記希釈菌液１００μｌを１０％エタノール溶
液を用いて濾過し、洗浄する。次いでこのメンブレンフ
ィルターを直径６０ｍｍのシャーレに充填されたＳＩ寒
天培地の表面に静置し、その状態のままアネロパック
（三菱化学製）内にアネロパウチCO₂（三菱化学製）と
共に収納し、密閉系を維持したまま３０℃で４８時間、
培養した。続いて実施例２と同様ＭＳ染色液２００μｌ
をメンブレンフィルターの中央部に静かに供し、染色液
が全面に拡散した後、メンブレンフィルターをシャーレ
の蓋に移し替え、通風下で乾燥し倍率２０倍の拡大鏡で
染色されたコロニー数を計数した。結果を表５に示し
た。

【００３８】対照として上記希釈液１００μｌを直径９
０ｍｍのシャーレに充填されたＳＩ寒天培地の表面にコ
ンラージ棒で均一に広げ、９６時間培養し、生成コロニ
ー数を目視、計数した。Ｎ菌のコロニー計数結果を表５
に示した。両方法の間に差は認められなかった。

【００３９】

【表５】

【００４０】

【発明の効果】以上の説明より明らかなように、請求項
１記載の発明は、検体中の火落菌を濾過膜上に捕集し、
培養して形成されたコロニー数を計数する方法に於て、
培養を嫌気性条件下、固形寒天培地上で行い、形成され
たコロニーを染料の有機溶媒溶液で染色し次いで溶媒を
揮散し得られた染色微小コロニー数を計数するようにし
ているので、通常微生物を取り扱う実験室に備えた汎用
設備で簡単に、迅速に且つ正確に火落菌数を計数するこ
とが可能である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】メンブレンフィルタを適用して濾過、捕
集、培養し、形成されたコロニーを計数して検体中の菌
数を測定する方法において、該培養を嫌気性条件下、所
定時間、寒天、ゼラン、カラゲーナンの少なくとも１種
を含有する火落菌培養固体培地で行った後、前記メンブ
レンフィルタ上を塩基性染料の有機溶液で処理、風乾し
て染色されたコロニーを計数することを特徴とする火落
菌数の測定法。
【請求項２】コロニー計数が顕微鏡もしくは拡大鏡で
なされることを特徴とする請求項１記載の火落菌数の測
定法。