JPH11332567A - アトピー体質の判定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子工学の手法を用いて、個体の特定の遺
伝子配列からアトピー性アレルギー疾患の発症危険性を
正確に判定する方法を提供する。 【解決手段】 アトピー体質を判定する方法であって、
インターロイキン４受容体α鎖をコードする遺伝子の核
酸部分塩基配列又は全長を含むフラグメントをＰＣＲ法
により増幅する工程などにより、Ｎ末端から50番目のア
ミノ酸がイソロイシンであるインターロイキン４受容体
α鎖を有する個体をアトピー性アレルギー疾患の発症危
険性ありと判定する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、アトピー性アレルギー疾患の発
症の危険性を判定する方法に関する。より具体的には、
個体の特定の遺伝子配列から遺伝子工学の手法を用いて
アトピー性アレルギー疾患の発症危険性を正確に判定す
る方法に関するものである。

【０００２】喘息は日常生活に支障をもたらす疾病であ
り、小児や若年成人におけるその主因はアトピーであ
る。アトピーにはヘルパーＴ細胞タイプ２サブタイプが
関与しており、特にインターロイキン(ＩＬ−４)が過剰
でダニや花粉などの環境に存在する抗原に対するＩｇＥ
が産生されている免疫不全である(Shirakawa, T. et a
l., Science, 275, pp.77-79, 1997)。気道の肥満細胞
に結合したＩｇＥと抗原との反応は粘膜の炎症を誘起
し、これが喘息症状を引き起こす。アトピーの発症に遺
伝的要因が関与する可能性は、臨床の場において経験的
に認められている。しかしながら、アトピーは遺伝的要
因に環境的要因が加わって発症する多因子遺伝疾患であ
るため、その原因遺伝子の同定は非常に困難であった。

【０００３】遺伝学的なアプローチである染色体を対象
とした連鎖解析により、血清IgE値と第5、6、7、11、お
よび16染色体との関連が示されている。これらの染色体
には、ＩＬ−４などの種々のサイトカイン、HLA、T細胞
受容体、高親和性IgE受容体、およびＩＬ−４受容体な
ど多様な遺伝子が存在しており、これらの遺伝子がアレ
ルギー、特にアトピー関連遺伝子の候補として考えられ
ている。広範な一連の研究の結果、遺伝学的には２種以
上の遺伝子がアトピーに関与していることが判明したが
(Daniels, S.E., et al., Nature, 383, pp.247-250, 1
996; NatureGenel., 15, pp.389-392, 1997)、これらの
遺伝子がどのような機構でアトピーの遺伝的体質に関与
するのかなどの機能面での証明は皆無であり、あくまで
原因遺伝子としての候補の域を脱していなかった。

【０００４】ＩＬ−４やインターロイキン１３(ＩＬ‐1
3)は、B細胞におけるIgE産生やヘルパーT細胞のTh2サブ
タイプへの分化に必須のサイトカインであり、IgE依存
性であるアレルギー疾患の病態進展に深く関連してい
る。特に、ＩＬ−４は多機能造血性サイトカインであ
り、Ｂ細胞がＩｇＥ抗体を産生するのに必須であると共
に、ヘルパーＴ細胞がＴｈ２（ヘルパーＴ細胞タイプサ
ブタイプ２）へと成熟化するのにも不可欠であるところ
から(Zuwarski, G. et al., Immunology Today, 15,pp.
19-26, 1994)、ＩｇＥ−依存性アトピー障害において決
定的な役割を果たしていると考えられる。

【０００５】ＩＬ−４やＩＬ−１３がIgE産生やヘルパ
ーT細胞のTh2サブタイプへの分化誘導を惹起するには、
Signal Transducer and Transcription factor-6 (STAT
6; 以下、「スタット６」と略す場合がある)と呼ばれ
る転写因子が細胞内情報伝達系において重要な役割を果
たしている。ＩＬ−４は、ＩＬ−４受容体α鎖とインタ
ーロイキン２受容体γ鎖（共通γ鎖：Russel, S.M. et
al., Science, 262, pp.1880-1882, 1993)とからなる特
異的な受容体複合体を介して作用する。ＩＬ−４受容体
α鎖にはヤヌスカイネ−ス(Janus kinase)であるJAK1が
会合し、共通γ鎖にはJAK3が会合して、これらのチロシ
ンりん酸化酵素がスタット６を活性化する。

【０００６】最近、ＩＬ−４受容体α鎖のバリアントで
あるＡｒｇ５７６Ｇｌｎ（アミノ酸番号は１番目のＡＴ
Ｇコドンからの番号を示し、数字の右側に示した天然型
アミノ酸が数字左側に示したアミノ酸に変異したことを
示す）が他のアトピー関連障害［過ＩｇＥ症候群及び重
症湿疹］と関連付けられて、負の調節分子であるＳＨＰ
−１が受容体に結合するのを妨げることが示された(Khu
rana, G.K., et al., New. Engl. J. M., 337, pp.1720
-1725, 1997)。

【０００７】一方、ヒトＩＬ−４受容体α鎖のＩｌｅ５
０Ｖａｌ変異も同定されている（50は2番目のＡＴＧコ
ドンからの番号である）(Idzerda, R.L., J. Exp. Me
d., 171, pp.861-873, 1990; Garizzi, J.-P. et al.,
Int. Immunol., 2, pp.669-675,1990)。これは、ヒトＩ
Ｌ−４受容体αの細胞外変異で今日までに知られている
唯一のものである(Deichmann, K. et al., Biochem. Bi
ophys. Res. Comm., 231, pp.696-697, 1997)。しかし
ながら、このヒトＩＬ−４受容体α鎖のアミノ酸変異と
アトピーとの関連については従来報告がない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、アト
ピー性アレルギー疾患の発症の危険性を正確に判定する
方法を提供することにある。より具体的には、遺伝子工
学の手法を用いて、個体の特定の遺伝子配列からアトピ
ー性アレルギー疾患の発症危険性を正確に判定する方法
を提供することが本発明の課題である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らはヒトＩＬ−
４受容体α鎖の遺伝子変異とアトピー性アレルギー疾患
発症との相関を解明すべく、アトピー性及び非アトピー
性の喘息について大規模な遺伝子連鎖解析を行い、見出
された変異型ＩＬ−４受容体α鎖遺伝子をマウス及びヒ
トのＢ細胞系にトランスフェクションを行った後、機能
検定を行った。その結果、ＩＬ−４受容体α鎖のＩｌｅ
５０Ｖａｌ変異が喘息の発症に強く関与していることを
見出した。本発明は上記の知見を元にして完成されたも
のである。

【００１０】すなわち本発明は、アトピー性アレルギー
疾患発症の危険性を判定する方法であって、Ｎ末端から
50番目のアミノ酸がイソロイシンであるＩＬ−４受容体
α鎖を有するヒト個体をアトピー性アレルギー疾患の発
症危険性ありと判定する方法を提供するものである。こ
の発明の好ましい態様によれば、ＩＬ−４受容体α鎖を
コードする遺伝子の核酸配列を決定することにより判定
を行う上記方法；及び、ＩＬ−４受容体α鎖をコードす
る遺伝子の部分塩基配列又は全長を含むフラグメントを
ＰＣＲ法により増幅する工程を含む上記方法が提供され
る。

【００１１】別の好ましい態様によれば、ＩＬ−４受容
体α鎖をコードする遺伝子においてＩＬ−４受容体α鎖
のＮ末端から50番目のアミノ酸をコードする核酸配列が
イソロイシンをコードする核酸配列である場合に、その
個体をアトピー性アレルギー疾患の発症危険性ありと判
定する上記方法；インターロイキン４受容体遺伝子の両
方の対立遺伝子のうち少なくとも一方の遺伝子において
ＩＬ−４受容体α鎖のＮ末端から50番目のアミノ酸をコ
ードする核酸配列がイソロイシンをコードする核酸配列
である場合に、その個体をアトピー性アレルギー疾患の
発症危険性が高いと判定する上記方法；及び、インター
ロイキン４受容体遺伝子の両方の対立遺伝子においてＩ
Ｌ−４受容体α鎖のＮ末端から50番目のアミノ酸をコー
ドする核酸配列がイソロイシンをコードする核酸配列で
ある場合に、その個体をアトピー性アレルギー疾患の発
症危険性が高いと判定する上記方法が提供される。

【００１２】別の観点からは、アトピー性アレルギー疾
患発症の危険性を判定する方法であって、下記の工程：
(a) ヒト個体より分離した生体試料を用いてＩＬ−４受
容体α鎖をコードする遺伝子の核酸番号150 から152 を
含む部分塩基配列又は全長を含むフラグメントをＰＣＲ
法により増幅する工程；及び(b) Ｉｌｅ５０Ｖａｌ変異
を含むフラグメントが得られた場合にはその個体をアト
ピー性アレルギー疾患の発症危険性ありと判定する工程
を含む方法；下記のプライマー・セット：Ａプライマ
ー：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＧＣＣＣＡＣＡＣ
ＧＴＴＧＴ、及びＢプライマー：５’−ＣＧＣＴＧＧＧ
ＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧを用いる上記方法；及びＮ末端か
ら50番目のアミノ酸がイソロイシンであるＩＬ−４受容
体α鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて
判定を行う上記方法が提供される。

【００１３】さらに別の観点からは、Ｎ末端から50番目
のアミノ酸がイソロイシンであるＩＬ−４受容体α鎖を
含むインターロイキン受容体（好ましくはＩＬ−４受容
体又はＩＬ−１３受容体、より好ましくはＩＬ−４受容
体）にアンタゴニストとして結合するリガンドを含むア
トピー性アレルギー疾患の治療及び／又は予防剤；Ｎ末
端から50番目のアミノ酸がイソロイシンであるＩＬ−４
受容体α鎖を含むインターロイキン受容体（好ましくは
ＩＬ−４受容体又はＩＬ−１３受容体、より好ましくは
ＩＬ−４受容体）にアンタゴニストとして結合するリガ
ンドを評価する工程を含む、アトピー性アレルギー疾患
の治療及び／又は予防剤の評価方法が提供される。

【００１４】また、別の観点からは、Ｎ末端から50番目
のアミノ酸がイソロイシンであるＩＬ−４受容体α鎖を
含むインターロイキン受容体（好ましくはＩＬ−４受容
体又はＩＬ−１３受容体、より好ましくはＩＬ−４受容
体）を不活性化又は阻害する物質、好ましくはモノクロ
ーナル抗体を有効成分として含む、アトピー性アレルギ
ー疾患の治療及び／又は予防剤が提供される。

【００１５】さらに、別の観点からは、Ｎ末端から50番
目のアミノ酸がイソロイシンであるインターロイキン４
受容体のα鎖を有するインターロイキン受容体から引き
起こされるＩｇＥの生産増加の阻害剤又は抑制剤；Ｎ末
端から50番目のアミノ酸がイソロイシンであるインター
ロイキン４受容体のα鎖を有するインターロイキン受容
体から引き起こされるスタット６のリン酸化の阻害剤又
は抑制剤が提供される。これらの発明において、アトピ
ー性アレルギー疾患の好ましい例としては、アトピー性
皮膚炎、アトピー性喘息、又は花粉症を挙げることがで
きる。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明の方法は、アトピー性アレ
ルギー疾患発症の危険性を判定するにあたり、Ｎ末端か
ら50番目のアミノ酸がイソロイシンであるＩＬ−４受容
体α鎖を有する個体をアトピー性アレルギー疾患の発症
危険性ありと判定することを特徴としている。ヒトＩＬ
−４受容体α鎖のアミノ酸配列及びＩｌｅ５０Ｖａｌ変
異については公知文献に記載されている(Idzerda, R.
L., J. Exp. Med., 171, pp.861-873, 1990; Garizzi,
J.-P. et al., Int. Immunol., 2, pp.669-675, 199
0)。

【００１７】本発明の方法では、判定を行うにあたり、
個体から分離・採取された生体試料を用いて、その個体
が有するＩＬ−４受容体のＩＬ−４受容体α鎖にＩｌｅ
５０Ｖａｌ変異が含まれるか否かを確認する。この確認
のための手段は特に限定されず、ＩＬ−４受容体α鎖を
構成するポリペプチド鎖のアミノ酸配列を直接分析する
方法のほか、遺伝子工学的な手法に従って、インターロ
イキン４受容体α鎖をコードする遺伝子の核酸配列を決
定する方法などを採用することができる。生体試料の種
類は特に限定されないが、例えば、血液、組織片などを
用いることが好ましい。

【００１８】ＩＬ−４受容体α鎖をコードする遺伝子の
核酸配列を決定する方法としては、ＰＣＲ（ポリメラー
ゼ・チェーン・リアクション）法を採用することが好ま
しい。この方法は遺伝子工学の分野で周知かつ汎用され
ており、適宜のプライマー配列を用いることにより、目
的の遺伝子フラグメントを短時間に簡便に増幅すること
ができる。ＰＣＲ法により、ＩＬ−４受容体α鎖をコー
ドする遺伝子の部分塩基配列であって、該遺伝子の核酸
番号150 から152 を含む部分塩基配列（ＩＬ−４受容体
α鎖のＮ末端アミノ酸をコードする核酸を核酸番号１か
ら３とする）、又はＩＬ−４受容体α鎖をコードする遺
伝子の全長を含むフラグメントを増幅することができ
る。

【００１９】ＰＣＲ法の反応条件、試薬などは当業者に
適宜選択可能であり、プライマー配列も所望のフラグメ
ントを効率的に増幅できるように適宜設計して用いるこ
とができる。例えば、下記のプライマー・セット：Ａプ
ライマー：5'-ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＧＣＣＣＡＣ
ＡＣＧＴＴＧＴ、及びＢプライマー：５’−ＣＧＣＴＧ
ＧＧＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧを用いると、効率的に所望の
フラグメントを調整することが可能である。増幅された
フラグメントの核酸配列を決定する方法も特に限定され
ず、当業者に利用可能な種々の方法のうちいかなるもの
を採用してもよい。

【００２０】本発明の判定方法に従えば、ＩＬ−４受容
体α鎖をコードする遺伝子においてＩＬ−４受容体α鎖
のＮ末端から50番目のアミノ酸をコードする核酸配列が
イソロイシンをコードする核酸配列である場合に、その
ヒト個体、好ましくはヒト小児個体はアトピー性アレル
ギー疾患の発症危険性ありと判定される。このような個
体には、Ｉｌｅ５０ホモ及びヘテロが含まれる。これら
のうち、少なくとも一方の対立遺伝子においてＩＬ−４
受容体α鎖のＮ末端から50番目のアミノ酸をコードする
核酸配列がイソロイシンをコードする核酸配列である場
合（Ｉｌｅ５０ヘテロ）には、その個体はＩｌｅ５０を
含まない個体に比べてアトピー性アレルギー疾患の発症
危険性が高いと判定できる。また、両方の対立遺伝子に
おいてＩＬ−４受容体α鎖のＮ末端から50番目のアミノ
酸をコードする核酸配列がイソロイシンをコードする核
酸配列である場合（Ｉｌｅ５０ホモ）には、その個体は
Ｉｌｅ５０ヘテロの個体よりもアトピー性アレルギー疾
患の発症危険性がさらに高いと判定される。

【００２１】本発明の方法は、一般的には、下記の２工
程：(a) ヒト個体より分離した生体試料を用いてＩＬ−
４受容体α鎖をコードする遺伝子の核酸番号150 から15
2 を含む部分塩基配列又は全長を含むフラグメントをＰ
ＣＲ法により増幅する工程；及び(b) Ｉｌｅ５０Ｖａｌ
変異を含むフラグメントが得られた場合にはその個体を
アトピー性アレルギー疾患の発症危険性ありと判定する
工程を含む方法により実施されることが好ましい。

【００２２】別の観点からは、Ｎ末端から50番目のアミ
ノ酸がイソロイシンであるＩＬ−４受容体α鎖を含むＩ
Ｌ−４受容体又はＩＬ−１３受容体にアンタゴニストと
して結合するリガンドを有効成分として含むアトピー性
アレルギー疾患の治療及び／又は予防剤が提供される。
ある物質がアンタゴニストとしてＩＬ−４受容体α鎖を
含むＩＬ−４受容体に結合可能か否かは、結合定数（受
容体親和性）やインターロイキン４の生理活性発現阻害
濃度などを調べることにより容易に判定できる。本発明
のアトピー性アレルギー疾患の治療及び／又は予防剤の
評価方法は、種々の化合物のなかから、上記の特徴を有
するリガンドを評価により選択することを特徴としてい
る。候補物質を選別するための指標としては、例えば、
上記に説明した結合定数やＩＬ−４阻害濃度などを用い
ることができる。

【００２３】また、Ｎ末端から50番目のアミノ酸がイソ
ロイシンであるＩＬ−４受容体α鎖を含むＩＬ−４受容
体を不活化する物質、例えば、Ｎ末端から50番目のアミ
ノ酸がイソロイシンであるＩＬ−４受容体α鎖を特異的
に認識するモノクローナル抗体を有効成分として含む医
薬もアトピー性アレルギー疾患の治療及び／又は予防剤
として有用である。モノクローナル抗体の製造方法は当
業者に周知かつ慣用であり、Ｎ末端から50番目のアミノ
酸がイソロイシンであるＩＬ−４受容体α鎖を抗原とし
て用いることにより、上記の特徴を有するモノクローナ
ル抗体を製造することができる。なお、ＩＬ−４受容体
α鎖のＩｌｅ５０Ｖａｌ変異を特異的に認識できるモノ
クローナル抗体は、本発明の判定方法にも好適に用いる
ことができる。

【００２４】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。 例１ 母集団の推計学的解析において、Ｉｌｅ５０Ｖａｌ変異
の試験は、ＰＣＲに基づいたＭｓｌ１制限アッセイを用
いて行った。コントロール被験者におけるＩＬ−４受容
体α Ｉｌｅ５０及びＶａｌ５０に対するゲノタイプ頻
度はハーディ−ワインバーグ平衡と合致しており、ｐ
（Ｉｌｅ５０）−０．４、ｑ（Ｖａｌ５０）−０．６で
あった。コントロール群とアトピー患者群の間でＩｌｅ
５０及びＶａｌ５０のゲノタイプ頻度は顕著に異ってい
た（表１）。

【００２５】

【表１】

【００２６】Ｉｌｅ５０はアトピー性喘息に関連してい
たが、内因性喘息や非アトピー性喘息には関連がなかっ
た。Ｉｌｅ５０は、総血清ＩｇＥレベルの上昇（予測比
＝３．９４、９５％ＣＩ １．９０−５．８８、ｐ＜
０．０１）とダニ特異性ＩｇＥの上昇（予測比＝３．１
８、９５％ＣＩ １．７２−２．２８、ｐ＜０．０１）
にも関連していた。アトピー性喘息との関連は、特に小
児において強かった（予測比＝６．３０、９５％ＣＩ
３．６６−８．９５、ｐ＜０．００１）；成人（予測比
＝３．６７、９５％ＣＩ １．５７−６．６９、ｐ＜
０．０１）。これらの結果は、若年の一卵性双生児が喘
息症状と総血清ＩｇＥレベルとの間に最も高い対応率を
示したことと一致しており、かつアトピーや喘息に対す
る相対的な遺伝的インプットまたは遺伝性が小児におい
て最大であるという結論とも一致する(Shirakawa, T.,
et al., J. Clin. Epidemiol., 49, pp.1059-1065, 199
6)。

【００２７】小児喘息群におけるＩｌｅ５０ホモ接合体
の高い頻度［〜６０％］は、アトピーに関するＩｌｅ５
０の主として劣性の遺伝的効果を示唆しており、一方、
Ａｒｇ５７６Ｇｌｎの効果は主として優性であるように
見受けられた(Khurama, G.K., New Engl. J.M., 337, p
p.1720-1725, 1997)。この結果は、異質性が一つの座の
中だけでなく異なった座の間でも見られるというアトピ
ーの遺伝学の複雑さを示している。

【００２８】ＩＬ−４受容体αのＩｌｅ５０変異とＶａ
ｌ５０変異の機能を調べるために、これらの変異を示す
ｃＤＮＡを用いて、ルシフェラーゼまたはヒト成長ホル
モン遺伝子のいずれかに結合させたヒトＩε遺伝子のプ
ロモーター領域を含むプラスミドを構築し、マウスＢリ
ンパ球又はヒトＢリンパ球にトランスフェクトした。こ
のＩε−ルシフェラーゼ構築物をマウスのｐｒｏ−Ｂ細
胞系であるＢａ／Ｆ３［ＢＦ−ＧＥＴＰ］にトランスフ
ェクトし、Ｉε−ヒト成長ホルモン構築物をヒトＢ細胞
系であるＪｉｊｏｙｅ［Ｊ−ＧＥＴＰ］にトランスフェ
クトした。次いで、これらの系のクローンに発現ベクタ
ー（Ｉｌｅ５０またはＶａｌ５０ ＩＬ−４受容体αｃ
ＤＮＡ（図１(b)）のいずれかを担持）をトランスフェ
クトした。

【００２９】マウスＢＦ−ＧＥＴＰ系をスクリーニング
に付すと、１０種のＩｌｅ５０の内４種、１０種のＶａ
ｌ５０のうち２種のトランスフェクトされたクローンが
ヒトＩＬ−４の刺激を受けて良く生育した。Ｉｌｅ５０
ＢＦ−ＧＥＴＰは、ヒトＩＬ−４の刺激を受けて生育
したＶａｌ５０ ＢＦ−ＧＥＴＰに比べてほぼ３倍量の
生育を示した（図２）。それらのルシフェラーゼ活性
は、マウスＩＬ−４の刺激に対しては互いに異ならず、
また親ＢＦ−ＧＥＴＰクローンとも異ならなかったが、
これは、ジャームラインイプシロン転写物の転写に対す
る細胞内機構がＩｌｅ５０ＢＦ−ＧＥＴＰ及びＶａｌ５
０ＢＦ−ＧＥＴＰの両者において正常であることを示し
ている。Ｉｌｅ５０ＢＦ−ＧＥＴＰは、Ｖａｌ５０クロ
ーンと比較した場合、ヒトＩＬ−４に呼応したＩε転写
物の誘導が約３倍大きかった（それぞれ５．４倍増およ
び１５．５倍増）（図３）。

【００３０】Ｖａｌ５０トランスフェクト物よりもＩｌ
ｅ５０の発現が高いためにヒトＩＬ−４の刺激に対して
Ｉｌｅ５０ＢＦ−ＧＥＴＰの応答が増強されている可能
性を評価するために、結合アッセイを行った。その結
果、平均Ｋｄ｛５２（３９−６３）ｐＭ対５６（４０、
７１）ｐＭ−図４｝におけるＩｌｅ５０ＢＦ−ＧＥＴＰ
とＶａｌ５０ＢＦ−ＧＥＴＰの間には差異がなかった。
細胞上のＩｌｅ５０ＩＬ−４受容体αの平均数（２３０
０部位／細胞）はＶａｌ５０ＩＬ−４受容体αの平均数
（２３００部位／細胞）と同じであった。この結果は、
Ｉｌｅ５０がヒトＩＬ−４受容体αの機能をアップレギ
ュレートし、その結果としてヒトＩＬ−４に呼応した細
胞増殖の増加とジャームラインイプシロン転写物（Ｉε
により支配されている領域のこと）の増加の両方をもた
らすことを強く示唆している。

【００３１】トランスフェクトされたヒトＪ−ＧＥＴＰ
クローンにおいても同じ結果が得られた。スクリーニン
グの際、１０個の薬剤耐性クローンを得たが、これらは
それぞれＩｌｅ５０ＩＬ−４受容体αまたはＶａｌ５０
ＩＬ−４受容体αを有していた。これらのなかから応答
性の高いクローンを３個選んで以下の試験に使用した。
Ｉｌｅ５０ Ｊ−ＧＥＴＰは、ＩＬ−４に応答してＶａ
ｌ５０ Ｊ−ＧＥＴＰが産生したよりも約３倍多い成長
ホルモンを産生した（図５）。平均Ｋｄ｛６３−１４３
対１００−１４３ｐＭ｝については、Ｉｌｅ５０Ｊ−Ｇ
ＥＴＰとＶａｌ５０Ｊ−ＧＥＴＰの間には差異がなく
（図６）、またＪ−ＧＥＴＰ上のＩＬ−４受容体αの数
においても差はなかった｛Ｉｌｅ５０では１０００−１
００００／細胞に対しＶａｌ５０では３６００−４２０
０／細胞｝。

【００３２】Ｓｔａｔ６欠損マウスではＩｇＥが産生さ
れないことから(Takeda, K. et al., Nature, 380, pp.
627-630, 1996; Shimoda, K., et al., Nature, 380, p
p.630-633, 1996)、上記の知見を明確にし、さらに発展
させるために、転写因子Ｓｔａｔ６の相対的活性化を検
討した。Ｉｌｅ５０及びＶａｌ５０Ｊ−ＧＥＴＰにおけ
るＳｔａｔ６の活性化の動的パターンはほぼ同等であっ
たが、マウスＢＦ−ＧＥＴＰ及びヒトＪ−ＧＥＴＰクロ
ーンの両者において、Ｖａｌ５０と比較してＩｌｅ５０
変異体はＳｔａｔ６の活性化を約２倍増強していた（図
７：細胞は各ヒトＩＬ−４濃度で１５分間インキュベー
トした）。

【００３３】マウスとヒトの両細胞系から得られたデー
タは、ＩＬ−４受容体αのＩｌｅ５０がＩＬ−４に対す
る受容体の応答を顕著に増加させ、その結果、Ｓｔａｔ
６の活性を増加させて、増殖とジャームラインε産生を
もたらすという結論を強く示唆している。これらの知見
は、Ｉｌｅ５０とＩｇＥの高い血清レベルとの間に見い
だした強い関連性（両方ともトータル且つアレルゲン特
異性）と完全に一致しており、また統計解析におけるア
トピー性喘息とも完全に一致している。なお、ＩＬ−４
受容体αはＩＬ−４受容体及びＩＬ−１３受容体の両者
に共通の成分であるところから(Callard, R.E., Immuno
l. Today, 17, pp.108-110, 1996)、ＩＬ−１３はＩＬ
−４の多様な機能の一部を共有している。従って、ＩＬ
−４受容体α鎖の変異は、ＩＬ−１３の機能を増強する
可能性がある。

【００３４】［実験方法］被験者の選定 医学検査会社における患者の中からコントロールとして
１２０名の被験者を選定した。選定した被験者の性別と
年齢による罹病率はこの地域でのものに合致させた。医
師によってアレルギー、内因性小児アレルギー性喘息と
診断された１２０症例を２病院からそれぞれ集めた。被
験者は以下の呼吸器症状のうちの2以上を呈した場合に
喘息と判定した。（ｉ）咳、（ｉｉ）痰、（ｉｉｉ）呼
吸困難、（ｉｖ）一日中あるいは夜間のぜい鳴、または
（ｖ）２年以上にわたるぜい鳴を伴った欠乏呼吸の発
作。成人被験者にはヘビースモーカー（紙巻きタバコ２
０本超／日）はいなかった。

【００３５】血清学的試験 ＭＡＳＴ（日立製作所）を用いて特異的ＩｇＥを検出
し、文献記載の方法と同様にして陽性タイターに対する
カットオフ値を用いた(Mao, X.-Q. et al., Lancet, 34
8, pp.581-583, 1996)。文献記載の小児に対する正常値
より大きいかあるいは成人では４００ｋＵ／Ｌ（平均＋
／−２ＳＤ）より大きいものを、高い総ＩｇＥ値（ＣＡ
Ｐ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）とした。アトピー
はＩｇＥ応答性で定義し、総血清ＩｇＥの高濃度値とし
て、あるいは１５種の高度に精製した空媒アレルゲンの
一種以上に対する陽性特異性ＩｇＥタイターか、これら
２つの組合せで診断を下した。

【００３６】ＤＮＡ法 ＤＮＡサンプルは市販キット（ＩｓｏＱｕｉｃｋ、Ｍｉ
ｃｒｏｐｒｏｂｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ガー
デングローブ）を用いて抽出した。ヒトＩＬ−４受容体
αに対してはゲノミックＤＮＡでなくｃＤＮＡ配列のみ
しか入手できなかったため、マウスＩＬ−４受容体α遺
伝子のエクソン−イントロン構造に基づいて次のプライ
マーを用いた(Wrighton, N. et al., Growth Factor,
6, pp.103-118, 1992)。最初９４℃で５分間変性させた
後、１００ｎｇのゲノミックＤＮＡをテンプレートとし
て全３０μｌの反応液中でＰＣＲ反応を行い、９４℃で
３０秒、６０℃で３０秒、さらに７２℃で３０秒のサイ
クルを３７サイクル実施した。プライマーとして、５’
−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＧＣＣＣＡＣＡＣＧＴＴＧ
Ｔ及び５’−ＣＧＣＴＧＧＧＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧを用
いた。アンダーラインを付した配列は、ＰＣＲ産物の延
長のために加えた。２ユニットのＭｓｌ１（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、英国）で一夜消化した
後、５％アガロースゲルでＤＮＡを分離した（２：３Ｎ
ｕｓｉｅｖｅ ＧＴＧ：アガロース）。

【００３７】機能アッセイ 文献記載の方法に従って部位特異的突然変異誘発を実施
した(Kunkel. T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
82, pp.488-492, 1985)。５’ＣＴＣＡＧＧＧＡＴＡＣ
ＡＣＣＣＧで表されるオリゴヌクレオチドを突然変異誘
発に用いた。バリンまたはイソロイシンを担持するヒト
ＩＬ−４受容体αのプラスミドＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．
１／Ｚｅｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カナダ国
カールスバッド）に挿入し、これらをそれぞれＶａｌ５
０及びＩｌｅ５０と命名した。

【００３８】トランスフェクトＢ細胞系の構築 ｐＧＬ３エンハンサーベクター（プロメガ社、ウィスコ
ンシン州マジソン）に挿入したヒトＩεの−１８７〜＋
６のプロモーター領域を含むプラスミドとｐＳＶ２ネオ
マイシン耐性遺伝子とをマウスｐｒｏ−Ｂ細胞系である
Ｂａ／Ｆ３に共トランスフェクトし、得られた形質転換
細胞をＢＦ−ＧＥＴＰと命名した。Ｖａｌ５０ＩＬ−４
受容体αまたはＩｌｅ５０ＩＬ−４受容体αのいずれか
を電気穿孔法によってＢＦ−ＧＥＴＰにトランスフェク
トした。

【００３９】ヒト成長ホルモンｃＤＮＡ及びヒトＩεの
−５８３〜−３のプロモーター領域を挿入したｐＳ７２
ベクターのプラスミドでヒトバーキットリンパ腫瘍細胞
系であるＪｉｊｏｙｃをトランスフェクトした。この形
質転換細胞はＪａｎＥ．ｄｅＶｒｉｅｓ博士（ＤＮＡＸ
リサーチ・インスチチュート、カリフォルニア州パロア
ルト）から寄贈されたものであり、Ｊ−ＧＥＴＰと称す
る。Ｖａｌ５０またはＩｌｅ５０ＩＬ−４受容体αのい
ずれかを電気穿孔法によってＪ−ＧＥＴＰにトランスフ
ェクトした。

【００４０】ＢＴ−ＧＥＴＰを用いたＭＴＴアッセイ 各種濃度のヒトＩＬ−４で２４時間インキュベートした
細胞の増殖応答を従前記載のＭＴＴ法によって検定した
(Yokota, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.,
81, pp.1070-1074, 1984)。ＢＴ−ＧＥＴＰを用いたルシフェラーゼ活性アッセイ ２ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４またはマウスＩＬ−４の存
在下あるいは不存在下で１×１０^６個の細胞(ＢＴ‐Ｇ
ＥＴＰ)を２４時間培養後、細胞をリポーター溶解バッ
ファー（プロメガ社）で溶解させ、清澄な細胞溶解液を
ルシフェラーゼアッセイ試薬（東洋インキ）と混合し
た。

【００４１】成長ホルモンアッセイ 各種濃度のヒトＩＬ−４で１×１０^４個の細胞を４８時
間培養後、ＥＬＩＳＡアッセイによって成長ホルモンの
産生を調べた。結合アッセイ ^１２５ Ｉ−標識ヒトＩＬ−４（ＮＥＮ、マサチューセッ
ツ州ボストン）の細胞に対する結合アッセイを文献記載
の方法に従って行った(Izuhara, K. et al., Biochem.
Biophys. Res. Comm. 190, pp.992-1000, 1993)。

【００４２】電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳ
Ａ） 文献記載の方法に従ってＥＭＳＡの操作を実施した(Izu
hara, K. et al., J.Biol. Chem., 271, pp.619-622, 1
996)。ヒトＩＬ−４によって刺激された細胞を溶解し、
核タンパクを抽出した。用いた核抽出物の量は混合前に
標準化した。核抽出物を結合バッファーであるｐｏｌｙ
（ｄｌ−ｄＣ）及びＩεの^３２Ｐ標識オリゴヌクレオチ
ドプローブ（５’ＧＴＣＡＡＣＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＣ
ＡＧＡＡ）と混合した後、混合物をポリアクリルアミド
ゲルで電気泳動により分離した。ＤＮＡ−タンパク複合
体をオートラジオグラフィーで視覚化した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 インターロイキン４受容体α鎖の構造を示す
図である。図中、（ａ）ヒトＩＬ−４受容体α鎖の構造
の模式図であり、斜線部分はシグナルぺプチド、黒く塗
った部分はトランスメンブレンドメインを示す。（ｂ）
はＩｌｅ５０またはＶａｌ５０をコードするｃＤＮＡ配
列を示す。

【図２】 Ｂａ／Ｆ３トランスフェクタントアッセイ
（ＭＴＴアッセイ）の結果を示す図である。

【図３】 Ｂａ／Ｆ３トランスフェクタントアッセイ
（ルシフェラーゼ活性アッセイ）の結果を示す図であ
る。図中、ヒトＩＬ−４の刺激が無い場合の各クローン
のルシフェラーゼ活性を１倍として結果を示した。

【図４】 Ｂａ／Ｆ３トランスフェクタントアッセイ
（結合アッセイ）の結果を示す図である。

【図５】 Ｊｉｊｏｙｅトランスフェクタントアッセイ
（成長ホルモン活性アッセイ）の結果を示す図である。
誤差を示す縦棒はそれぞれ３クローンでの偏差を示す。

【図６】 Ｊｉｊｏｙｅトランスフェクタントアッセイ
（結合アッセイ）の結果を示す図である。

【図７】 ＩＬ−４受容体及びＢＦ−ＧＥＴＰ又はＪ−
ＧＥＴＰによって誘発されたＳｔａｔ６活性を示した図
である。図中、矢印はＳｔａｔ６含有ＤＮＡ複合体の位
置を示す。また、図中、ＡはＢＦ−ＧＥＴＰの結果を示
し、ＢはＪ−ＧＥＴＰの結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アトピー体質を判定する方法であって、
   Ｎ末端から50番目のアミノ酸がイソロイシンであるイン
   ターロイキン４受容体α鎖を有する個体をアトピー性ア
   レルギー疾患の発症危険性ありと判定する方法。
2. 【請求項２】 インターロイキン４受容体α鎖をコード
   する遺伝子の核酸配列を決定することにより判定を行う
   請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 インターロイキン４受容体α鎖をコード
   する遺伝子の核酸部分塩基配列又は全長を含むフラグメ
   ントをＰＣＲ法により増幅する工程を含む請求項１記載
   の方法。
4. 【請求項４】 インターロイキン４受容体α鎖をコード
   する遺伝子においてインターロイキン４受容体α鎖のＮ
   末端から50番目のアミノ酸をコードする核酸配列がイソ
   ロイシンをコードする核酸配列である場合に、その個体
   をアトピー性アレルギー疾患の発症危険性ありと判定す
   る請求項２又は３記載の方法。
5. 【請求項５】 インターロイキン４受容体遺伝子の両方
   の対立遺伝子においてインターロイキン４受容体α鎖の
   Ｎ末端から50番目のアミノ酸をコードする核酸配列がイ
   ソロイシンをコードする核酸配列である場合に、その個
   体をアトピー性アレルギー疾患の発症危険性が高いと判
   定する請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 アトピー性アレルギー疾患の発症危険性
   を判定する方法であって、下記の工程： (a) 個体より分離した生体試料を用いてインターロイキ
   ン４受容体α鎖をコードする遺伝子の核酸番号150 から
   152 を含む部分塩基配列又は全長を含むフラグメントを
   ＰＣＲ法により増幅する工程； (b) Ｉｌｅ５０Ｖａｌ変異を含むフラグメントが得られ
   た場合には、その個体をアトピー性アレルギー疾患の発
   症危険性ありと判定する工程、を含む方法。
7. 【請求項７】 下記のプライマー・セット： Ａプライマー：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＧＣＣ
   ＣＡＣＡＣＧＴＴＧＴ Ｂプライマー：５’−ＣＧＣＴＧＧＧＣＴＴＧＡＡＧＧ
   ＡＧを用いる請求項３ないし６のいずれか１項に記載の
   方法。
8. 【請求項８】 アトピー性アレルギー疾患の発症危険性
   を判定するために用いるプライマー・セットであって、
   請求項７に記載のＡプライマー及びＢプライマーを含む
   セット。
9. 【請求項９】 Ｎ末端から50番目のアミノ酸がイソロイ
   シンであるインターロイキン４受容体α鎖を特異的に認
   識するモノクローナル抗体を用いて判定を行う請求項１
   記載の方法。
10. 【請求項１０】 Ｎ末端から50番目のアミノ酸がイソロ
    イシンであるインターロイキン４受容体α鎖を含むイン
    ターロイキン受容体にアンタゴニストとして結合するリ
    ガンドを含むアトピー性アレルギー疾患の治療及び／又
    は予防剤。
11. 【請求項１１】 インターロイキン受容体がインターロ
    イキン４受容体である請求項10記載の治療及び／又は予
    防剤。
12. 【請求項１２】 Ｎ末端から50番目のアミノ酸がイソロ
    イシンであるインターロイキン４受容体α鎖を含むイン
    ターロイキン受容体にアンタゴニストとして結合するリ
    ガンドを評価する工程を含む、アトピー性アレルギー疾
    患の治療及び／又は予防剤の評価方法。
13. 【請求項１３】 インターロイキン受容体がインターロ
    イキン４受容体である請求項１２記載の治療及び／又は
    予防剤の評価方法。
14. 【請求項１４】 Ｎ末端から50番目のアミノ酸がイソロ
    イシンであるインターロイキン４受容体α鎖を含むイン
    ターロイキン受容体を不活性化する物質を有効成分とし
    て含む、アトピー性アレルギー疾患の治療及び／又は予
    防剤。
15. 【請求項１５】 インターロイキン受容体がインターロ
    イキン４受容体である請求項1４記載の治療及び／又は
    予防剤。
16. 【請求項１６】 インターロイキン受容体を不活性化又
    は阻害する物質が、モノクローナル抗体又はそのモノク
    ローナル抗体の抗原認識部位を有する物質である、請求
    項１４又は１５記載の治療及び／又は予防剤。
17. 【請求項１７】 Ｎ末端から50番目のアミノ酸がイソロ
    イシンであるインターロイキン４受容体のα鎖を含むイ
    ンターロイキン受容体から引き起こされるＩｇＥの生産
    増加の阻害剤又は抑制剤。
18. 【請求項１８】 Ｎ末端から50番目のアミノ酸がイソロ
    イシンであるインターロイキン４受容体のα鎖を含むイ
    ンターロイキン受容体から引き起こされるスタット６の
    リン酸化の阻害剤又は抑制剤。
19. 【請求項１９】 アトピー性アレルギー疾患がアトピー
    性皮膚炎、アトピー性喘息又は花粉症である請求項１な
    いし６のいずれか１項に記載の方法。
20. 【請求項２０】 アトピー性アレルギー疾患がアトピー
    性皮膚炎、アトピー性喘息又は花粉症である請求項10、
    請求項11、請求項14ないし16のいずれか１項に記載の方
    法。
21. 【請求項２１】 アトピー性アレルギー疾患がアトピー
    性皮膚炎、アトピー性喘息又は花粉症である請求項12又
    は13記載の方法。