JPH11332560A - Recombinant adenovirus, cosmid vector containing the recombinant virus genom and animal cell infected with the recombinant virus - Google Patents
Recombinant adenovirus, cosmid vector containing the recombinant virus genom and animal cell infected with the recombinant virusInfo
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- JPH11332560A JPH11332560A JP10148789A JP14878998A JPH11332560A JP H11332560 A JPH11332560 A JP H11332560A JP 10148789 A JP10148789 A JP 10148789A JP 14878998 A JP14878998 A JP 14878998A JP H11332560 A JPH11332560 A JP H11332560A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は組換えアデノウイル
ス、該組換えウイルス遺伝子を有しているコスミドベク
ター及び該組換えウイルスにより感染された動物細胞に
係り、本発明による組換えアデノウイルスは例えば遺伝
子病の治療に応用することができる。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a recombinant adenovirus, a cosmid vector having the recombinant virus gene, and an animal cell infected with the recombinant virus. It can be applied to the treatment of genetic diseases.
【0002】[0002]
【従来の技術及びその課題】従来、組換えアデノウイル
スを調製するには基本となるアデノウイルス (通常は野
性型) を培養細胞で大量に増殖させた後、そのウイルス
の精製を行い、更に精製ウイルスから DNA を抽出する
工程を必要としている。又、精製ウイルスDNA と大腸菌
内で増殖させたプラスミド DNA との間での相同組換え
を培養細胞の内部で生じさせる工程を必要としている。
従って、組換えアデノウイルスゲノムの複数箇所に外来
遺伝子を導入したり或いは変更を加える必要がある場合
には、中間体ウイルス (目的とする構造を有するウイル
スの前段階のウイルス) の調製を行った後に、そのウイ
ルスの DNA を精製する工程を経なければならず、多大
の時間や労力を必要としている。2. Description of the Related Art Conventionally, in order to prepare a recombinant adenovirus, a basic adenovirus (usually a wild type) is grown in large amounts in cultured cells, and then the virus is purified. It requires a process to extract DNA from the virus. It also requires a step of causing homologous recombination between the purified viral DNA and the plasmid DNA grown in E. coli inside the cultured cells.
Therefore, when it was necessary to introduce or modify a foreign gene in multiple places of the recombinant adenovirus genome, an intermediate virus (a virus at the stage before the virus having the desired structure) was prepared. Later, the virus DNA must be purified, requiring a lot of time and effort.
【0003】[0003]
【発明が解決しようとする課題乃至発明の目的】従っ
て、本発明の課題乃至目的は、従来の組換えアデノウイ
ルス調製技術においては不可欠とされる野生型又は中間
体アデノウイルスの増殖、精製及びウイルス DNA の抽
出過程を必要とせず、更に精製ウイルスゲノム DNA と
大腸菌内で増殖させたプラスミド DNA との間の相同組
換え操作を不要にすることにある。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for growing and purifying a wild-type or intermediate adenovirus, which is indispensable in conventional techniques for preparing recombinant adenovirus. The object of the present invention is to eliminate the need for a DNA extraction step and to eliminate the need for a homologous recombination operation between purified virus genomic DNA and plasmid DNA grown in E. coli.
【0004】[0004]
【課題を解決し目的を達成するための手段】本発明によ
れば、既述の課題は、両端の逆方向末端繰り返し配列
(ITR :inverted terminal repeat) までを完全に含み且
つ E1 及び E3 領域に欠損を有するアデノウイルス様ゲ
ノムを内部に有していることを特徴とするコスミドベク
ターにより基本的には解決されると共に、上述の目的が
達成される。SUMMARY OF THE INVENTION According to the present invention, the above-mentioned object is achieved by reversing the terminal repeat sequence at both ends.
(ITR: inverted terminal repeat), and the cosmid vector is characterized in that it has an adenovirus-like genome internally deficient in the E1 and E3 regions. Is achieved.
【0005】本発明によるコスミドベクターは、アデノ
ウイルス様ゲノム部分の両脇に、該アデノウイルス様ゲ
ノム部分のみをコスミドベクターから遊離させる制限酵
素認識部位を有している。本発明によるコスミドベクタ
ーにおいて、該ベクターを切断する他の制限酵素認識部
位がアデノウイルス様ゲノムの E1 及び E3 欠損領域
に、それぞれ存在しており、これによって外来遺伝子の
導入が可能になされているのが有利である。本発明によ
るコスミドベクターは、アデノウイルス様ゲノム左逆方
向末端繰り返し配列よりも右側の部分又は右逆方向末端
繰り返し配列よりも左側の部分に更に他の制限酵素認識
部位を有しており、これによりアデノウイルス様ゲノム
の修飾又は変更操作が可能になされているのが有利であ
る。[0005] The cosmid vector according to the present invention has, on both sides of the adenovirus-like genome portion, restriction enzyme recognition sites for releasing only the adenovirus-like genome portion from the cosmid vector. In the cosmid vector according to the present invention, another restriction enzyme recognition site that cleaves the vector is present in each of the E1 and E3 deficient regions of the adenovirus-like genome, thereby enabling introduction of a foreign gene. Is advantageous. The cosmid vector according to the present invention further has another restriction enzyme recognition site in a portion on the right side of the adenovirus-like genome left inverted terminal repeat sequence or on a portion on the left side of the right inverted terminal repeat sequence, Advantageously, manipulations of modifying or altering the adenovirus-like genome have been made possible.
【0006】本発明によるコスミドベクターにおいて、
例えば E1 及び E3 欠損領域にはテトラサイクリン・ト
ランスアクチベーターの発現単位及びテトラサイクリン
・プロモーターに支配された遺伝子の発現単位を導入す
ることができる。このコスミドベクターを制限酵素によ
り切断し、両端が共に逆方向末端繰り返し配列となって
いる構造になせば、該構造を有する DNA を組換えアデ
ノウイルスが増殖可能な動物細胞に導入することで本発
明による組換えアデノウイルスが得られ、この組換えア
デノウイルスは動物細胞を感染させるために使用するこ
とができる。[0006] In the cosmid vector according to the present invention,
For example, an expression unit of a tetracycline transactivator and an expression unit of a gene controlled by a tetracycline promoter can be introduced into the E1- and E3-deficient regions. If this cosmid vector is cleaved with a restriction enzyme to give a structure in which both ends are inverted terminal repeat sequences, the DNA having this structure is introduced into an animal cell in which a recombinant adenovirus can proliferate. And the recombinant adenovirus can be used to infect animal cells.
【0007】[0007]
【発明の実施の形態】アデノウイルスは野生型の場合に
約 36000 塩基対のサイズを有し、組換えアデノウイル
スベクターもほぼそれに匹敵するサイズを有しているた
めにコスミドベクターを本発明は利用するものである。
コスミドベクターを用いてアデノウイルス様ゲノムを大
腸菌内部で安定に保持すると共に、増殖させるための使
用技術は特開平 7 - 298877 号公報に開示されており、
該組換えアデノウイルスの調製法も該公開公報に開示さ
れている。そこで、本発明者等は両端の ITR をも完全
に含んだアデノウイルス様遺伝子を別異のコスミドベク
ターで安定に保持すると同時に、該コスミドベクターを
制限酵素処理を行うことにより、コスミドベクターから
アデノウイルス様ゲノムのみを遊離させることを可能に
した。この遊離された両端をも完全に含むアデノウイル
ス様ゲノムを組換えアデノウイルスが増殖可能な動物細
胞、例えば 293 細胞に遺伝子導入することにより容易
に組換えアデノウイルスを得ることができる。更に、本
発明によるコスミドベクターは外来遺伝子を導入した
り、組換えアデノウイルスの基本的骨格に改変を加える
のを容易にするために、複数の制限酵素認識部位を有す
るように構築されている。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention utilizes a cosmid vector because an adenovirus has a size of about 36000 base pairs in the case of a wild type, and a recombinant adenovirus vector has a size almost equivalent thereto. Is what you do.
The technique used to stably maintain and propagate the adenovirus-like genome inside E. coli using a cosmid vector is disclosed in JP-A-7-298877.
A method for preparing the recombinant adenovirus is also disclosed in the publication. Therefore, the present inventors stably maintain the adenovirus-like gene completely containing the ITRs at both ends with a different cosmid vector, and simultaneously treat the cosmid vector with a restriction enzyme to remove the adenovirus from the cosmid vector. It was possible to release only the genome. The recombinant adenovirus can be easily obtained by introducing the adenovirus-like genome completely containing both released ends into animal cells capable of growing the recombinant adenovirus, for example, 293 cells. Further, the cosmid vector according to the present invention is constructed to have a plurality of restriction enzyme recognition sites in order to facilitate introduction of a foreign gene or modification of the basic skeleton of the recombinant adenovirus.
【0008】次に、本発明によるコスミドベクターの構
造に関連して説明する。アデノウイルス様ゲノム部分の構造 本発明によるコスミドベクターは後記のように幾つかの
断片から構成されており、特開平 7 - 298877 号公報に
開示されている Ax1c (又は Ax1w) から派生した Ax1cw
に由来するものである (Ax1cw は理研ジーンバンクか
ら入手することができる)。この新たに作成したコスミ
ドベクターを、以下、「pacad1A」と称する。このコス
ミドベクターである pacad1A の概要は図 1 に示されて
いる。pacad1A は 6 つの断片から構成されており、断
片 1 を基本骨格とし、それに断片 2 - 6 が結合して 1
つのプラスミドを形成している形態のものである。こ
のpacad1A は、それを組換えアデノウイルス作成に使用
する際の遺伝子操作上、4つの部分に分けて使用され
る。即ち、第 1 部分はアデノウイルス様ゲノムの左側
部分 (図 1 において Bs - Bs により挟まれた領域) で
あって、完全な左 ITRを包含し、パッケージング配列及
び E1 遺伝子領域 (1.3% から 9.3% 欠失させ、その部
位に外来遺伝子の導入目的で ClaI による認識切断部位
が作成されている) を主として含むものである。第 2
部分はアデノウイルス様ゲノムの右側部分 (図1におい
て E - E により挟まれた領域) であって、完全な右 IT
R を包含し、E3 遺伝子領域 (79.6% から 84.8% 欠失さ
せ、その部位に外来遺伝子の導入目的で SwaI による認
識切断部位が作成されている)及び E4 遺伝子領域を主
として含むものである。第 3 部分はアデノウイルス様
ゲノムの中間部分であって、上記の左及び右側部分以外
のウイルス遺伝子部分である。最後の第 4 部分はアデ
ノウイルス様ゲノム以外の部分であって、本例の場合は
コスミドベクターの 1 つである charomid の部分であ
る。これらの各部分は幾つかの断片或いは断片の一部分
から構成される。下記の表 1 に各断片の由来が明らか
にされ ているが、pacad1A は直接的に Ax1cwに由来す
る部分と、AxRSV-LacZ ウイルス[H.Kojima 等 "Bioche
m. Biophys. Res. Commun. Vol. 207, pages 8 - 12,(1
995年)] のゲノム DNA を鋳型として合成 DNA であるプ
ライマーを用いて PCR[polymerase chain reaction (ポ
リメラーゼ連鎖反応)] により増幅合成した断片から構
成されている。Next, the structure of the cosmid vector according to the present invention will be described. Structure of Adenovirus-Like Genomic Portion The cosmid vector according to the present invention is composed of several fragments as described below, and Ax1cw derived from Ax1c (or Ax1w) disclosed in JP-A-7-298877.
(Ax1cw is available from RIKEN Genebank). This newly created cosmid vector is hereinafter referred to as “pacad1A”. An overview of this cosmid vector, pacad1A, is shown in FIG. pacad1A is composed of six fragments, with fragment 1 as the basic backbone, and fragments 2-6 linked to 1
In the form of two plasmids. This pacad1A is divided into four parts for genetic manipulation when it is used for producing a recombinant adenovirus. That is, the first part is the left part of the adenovirus-like genome (the region flanked by Bs-Bs in FIG. 1), which includes the complete left ITR, the packaging sequence and the E1 gene region (from 1.3% to 9.3%). % Deletion, and a recognition cleavage site by ClaI has been created at that site for the purpose of introducing a foreign gene). No. 2
The right part of the adenovirus-like genome (the region between E and E in FIG. 1) is the complete right IT
It contains R, and mainly contains the E3 gene region (removed from 79.6% to 84.8%, and a recognition cleavage site by SwaI has been created at that site for the purpose of introducing a foreign gene) and the E4 gene region. The third part is the middle part of the adenovirus-like genome, and is a part of the viral gene other than the above left and right parts. The final fourth part is a part other than the adenovirus-like genome, and in this case, is a part of one of the cosmid vectors, charomid. Each of these parts is composed of several fragments or parts of fragments. The origin of each fragment is clarified in Table 1 below, and pacad1A is directly derived from Ax1cw and the AxRSV-LacZ virus [H. Kojima et al.
m. Biophys. Res. Commun. Vol. 207, pages 8-12, (1
995)] as a template and a fragment amplified and synthesized by PCR [polymerase chain reaction] using primers, which are synthetic DNAs.
【0009】[0009]
【表1】 [Table 1]
【0010】charomid 部分 コスミドベクターとして大腸菌内で増殖させたり、λフ
ァージにパッケージさせたりするために必要な骨格部分
の構造に関する課題を解決するために、本発明者等は p
acad1A には斉藤等により開示されている charomid 9-1
1 [I. Saito 等"Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A", Vol.
83, pages 8664 - 8668, (1986年)]のポリリンカ−部
分 (制限酵素の EcoRI 及び HindIII による認識切断部
分) を取り除いたものを使用した。[0010] In order to solve the problem concerning the structure of the skeletal portion required for propagation in Escherichia coli as a charomid partial cosmid vector or packaging in λ phage, the present inventors have proposed p
acad1A has charomid 9-1 disclosed by Saito et al.
1 [I. Saito et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", Vol.
83, pages 8664-8668, (1986)] from which the polylinker portion (recognition and cleavage portion with EcoRI and HindIII of restriction enzymes) was removed.
【0011】各断片の境界部分の構造 図 1 に示されている pacad1A を構成する各断片の境界
部分における塩基構造は図 2 - 図 7 に示されている。
ポリリンカ−部分を取り除いた charomid 9-11とアデノ
ウイルス様ゲノムとの境界部分は、図 2 に示されてい
るように、左側部分は charomid 側から HindIII-Bst11
07I-PacI の順番に制限酵素認識部位が並び、次いでア
デノウイルス様ゲノムの左 ITR 部分に至っており、一
方右側部分は、図 7 に示されているように、アデノウ
イルス様ゲノムの右 ITR部分に引き続いて PacI-EcoRI
の順番で制限酵素認識部位が並び、次いで charomid 部
分に至る構造を有している。本発明において使用される
pacad1A には、このような制限酵素認識部位が配置さ
れているので、制限酵素である PacI にて処理すること
によりアデノウイルス様ゲノム部分のみを一体として c
haromid 部分から遊離させることが可能である。尚、Bs
t1107I や EcoRI を利 用すると、アデノウイルス様ゲ
ノムにおける左端部や右端部を選択的に遊離させること
が可能であり、従ってアデノウイルスの該部位の修飾や
変更の場合における処理操作が容易である。 Structure of Boundary Portion of Each Fragment The base structure at the boundary portion of each fragment constituting pacad1A shown in FIG. 1 is shown in FIG. 2 to FIG.
As shown in Fig. 2, the boundary between charomid 9-11 from which the polylinker portion was removed and the adenovirus-like genome was HindIII-Bst11 from the charomid side on the left side.
Restriction enzyme recognition sites are arranged in the order of 07I-PacI, followed by the left ITR of the adenovirus-like genome.
As shown in Figure 7, the right ITR portion of the adenovirus-like genome followed by the PacI-EcoRI
The restriction enzyme recognition sites are arranged in this order, and then reach the charomid portion. Used in the present invention
Since such a restriction enzyme recognition site is located in pacad1A, by treating with the restriction enzyme PacI, only the adenovirus-like genome
It is possible to release from the haromid part. In addition, Bs
By using t1107I or EcoRI, it is possible to selectively release the left end and the right end of the adenovirus-like genome, and therefore, it is easy to perform a processing operation when modifying or changing the adenovirus-like site.
【0012】コスミドベクターの組換え pacad1A に外来 DNA 断片を挿入又は pacad1A の 1 部
分を 外来 DNA で置換する目的で、予め制限酵素にて p
acad1A を処理した (目的によっては Klenowfragment
等による処理を追加した) 後、挿入又は置換用の DNA
断片と共にライゲーション反応を行う。引き続き、Giga
pack in vitro packaging kit(Stratagene 社) を使用
して、λファージにコスミド DNA をパッケージするこ
とによって組換えファージを作成する。この組換えファ
ージで適当な大腸菌 (例えば DH5α) を感染させ、アン
ピシリン含有 LB 寒天培地にて一晩 37℃ にてインキュ
ベーションする。出現したコロニーを各々別個に採取
し、1.5mlのアン ピシリン含有 LB 培地にて一晩 37℃
にて振盪培養する。この LB 培地に含まれる大腸菌から
コスミドベクタ−由来の DNA を抽出し (ミニプレップ
操作)、抽出した DNA を適当な制限酵素にて処理するこ
とにより目的の構造を有するクローンを単離する。For the purpose of inserting a foreign DNA fragment into the recombinant cosmid vector pacad1A or replacing a part of pacad1A with foreign DNA, p
processed acad1A (for some purposes, Klenowfragment
After addition of DNA for insertion or substitution)
A ligation reaction is performed with the fragments. Continue to Giga
Using a pack in vitro packaging kit (Stratagene), recombinant phages are prepared by packaging cosmid DNA into λ phage. The recombinant phage is used to infect a suitable E. coli (for example, DH5α) and incubated at 37 ° C. overnight on LB agar medium containing ampicillin. The colonies that appeared were individually collected and placed in 1.5 ml of LB medium containing ampicillin at 37 ° C overnight.
And shake culture. A cosmid vector-derived DNA is extracted from E. coli contained in the LB medium (miniprep operation), and the extracted DNA is treated with an appropriate restriction enzyme to isolate a clone having a desired structure.
【0013】アデノウイルス様遺伝子の遊離及び精製 目的の構造を有する pacad1A 誘導体クローンの DNA を
大量に精製するためには、先ず 1.5mlの LB 培地から抽
出して得られた DNA を再び Gigapack invitro packagi
ng kit を使用して、λ-ファージ内にパッケージするこ
とにより組換えファージを作成する。この組換えファー
ジで適当な大腸菌 (DH5α) を感染させ、アンピシリン
を含有する適当な量 (50 - 200ml) の LB 培地内で一晩
37℃ にて振盪培養を行う。この LB 培地から、QIAGEN
カラム(QIAGEN 社)を利用し又は CsCl による濃度密
度勾配超遠心法を利用して DNAを抽出し、精製する。得
られた DNA の内の適当量を採取して PacI (New Englan
d BioLabs 社) にて制限酵素処理を行う。PacI による
処理を行った後に、除蛋白の目的でフェノール/クロロ
ホルム処理と遠心処理を行う。得られた上清に含まれて
いる DNA を更に精製する目的でエタノールによる沈澱
処理を行った後、更にその沈澱 (DNA)を 70% エタノー
ルを用いて一度リンスする。リンスした DNA について
は滅菌蒸留水に溶解してDNA 濃度を測定し、その後は動
物細胞である 293 細胞への遺伝子導入操作を行うまで
凍結保存する。 Release and purification of adenovirus-like gene In order to purify a large amount of DNA of a pacad1A derivative clone having the desired structure, first, DNA obtained by extracting from 1.5 ml of LB medium is again used as a Gigapack invitro packagi.
Recombinant phage is made by packaging into λ-phage using ng kit. Infect the appropriate E. coli (DH5α) with the recombinant phage and overnight in an appropriate volume (50-200 ml) of LB medium containing ampicillin.
Perform shaking culture at 37 ℃. From this LB medium, use QIAGEN
DNA is extracted and purified using a column (QIAGEN) or a concentration density gradient ultracentrifugation method using CsCl. An appropriate amount of the obtained DNA was collected, and PacI (New Englan
d BioLabs). After the treatment with PacI, phenol / chloroform treatment and centrifugation are performed for the purpose of deproteinization. After a precipitation treatment with ethanol for the purpose of further purifying the DNA contained in the obtained supernatant, the precipitate (DNA) is further rinsed once with 70% ethanol. The rinsed DNA is dissolved in sterile distilled water, the DNA concentration is measured, and then frozen and stored until gene transfer to 293 animal cells is performed.
【0014】アデノウイルス様ゲノム DNA の 293細胞
への導入 上記の工程で得られたアデノウイルス様ゲノム DNA を
10μg 含有する 600μl の Opti-MEM 液 (Gibco 社) と
80μl の Lipofectamine reagent (Gibco社) を含有す
る 600μl の Opti-MEM 液とを混和させ、次いで室温に
て 30 分間静置する。その後、この混和液に更に 7ml
の Opti-MEM 液を添加する。この溶液を、予め用意した
293 細胞 [ATCC より入手 (コラーゲンにてコートされ
た面積 75cm2 のフラスコ 1 個分)] の培養液と置換
し、37℃、5% CO2 の環境下(CO2 インキュベーター内)
にてインキュベーションを行う。次いで、DNA 含有混和
液を新鮮な細胞培養液と完全に置換し、更に終夜 37
℃、5% CO2 の環境下(CO2 インキュベーター内) にてイ
ンキュベーションする。上記の遺伝子導入操作を行った
日の翌日、293 細胞をフラスコから遊離させて浮遊液と
し、コラーゲンにてコートされた 96 穴プレート 1 枚
に播き、組換えウイルスの出現・増殖を待つ。 293 cells of adenovirus-like genomic DNA
The adenovirus virus-like genomic DNA obtained in the introduction above process to
600 μl Opti-MEM solution (Gibco) containing 10 μg
Mix with 80 µl of Lipofectamine reagent (Gibco) and 600 µl of Opti-MEM solution, and then stand at room temperature for 30 minutes. Then add another 7ml to this mixture.
Add Opti-MEM solution. This solution was prepared in advance
Replace with the culture solution of 293 cells [obtained from the ATCC (one flask with an area of 75 cm 2 coated with collagen)] at 37 ° C, 5% CO 2 (in a CO 2 incubator)
Incubate at The DNA-containing mixture was then completely replaced with fresh cell culture and incubated overnight.
Incubate at ℃, 5% CO 2 environment (in a CO 2 incubator). On the day following the day of the above-described gene transfer procedure, 293 cells are released from the flask to form a suspension, and seeded on a 96-well plate coated with collagen, and the appearance and growth of the recombinant virus are awaited.
【0015】組換えアデノウイルスの単離 通常、遺伝子導入操作から 14 日間にわたり 293 細胞
を維持すれば、新しく生成した組換えアデノウイルスが
293 細胞内で増殖して、293 細胞を死滅させる細胞障
害効果 (cytopathic effect) が観察されるので、ウイ
ルスの生成したwell の判別を行うことができる。その
well からウイルスを含有している死滅細胞と培養液の
凍結保存を行う。この保存液の一部分で新鮮な 293 細
胞を感染させ、死滅細胞からゲノム DNA の抽出を行
う。得られた DNA を幾つかの制限酵素で処理した後、
アガロースゲルによる電気泳動で、その切断パターンを
確認する。叙上の操作により目的の構造を有するウイル
スクローンを大量に増殖させた後に精製処理する。 Isolation of recombinant adenovirus Normally, if 293 cells are maintained for 14 days after the gene transfer operation, newly generated recombinant adenovirus will
Since a cytopathic effect that proliferates in 293 cells and kills 293 cells is observed, it is possible to discriminate wells that have produced virus. That
Cryopreserve the dead cells containing the virus and culture medium from the wells. A portion of this stock solution infects fresh 293 cells and extracts genomic DNA from dead cells. After treating the obtained DNA with several restriction enzymes,
The cleavage pattern is confirmed by electrophoresis on an agarose gel. After a large amount of virus clones having the desired structure are propagated by the above-described operation, purification is performed.
【0016】本発明の特徴 本発明を従来の方法と対比して、その特徴を明確化する
と (1) 通常、組換えアデノウイルスの生成は 293 細胞
内での 2 種類の異なった DNA 分子間での相同組換えに
依存するが、本発明ではこの工程が不要であり、従って
(2) 生成され出現してくる組換えアデノウイルスは目
的以外の構造を有している可能性が極めて低く、又 (3)
従来法では 2 種類の異なった DNA 分子のうち片方の
DNA が大量増殖及び精製したウイルス粒子から抽出され
たものであるために、その調製には比較的多大な時間及
び労力並びに特定の施設や機器が必要とされるが、本発
明においては pacad1A 及びその誘導体はコスミドベク
ターであるために、大腸菌内部で増殖させる工程のみで
あり、従って簡便且つ容易に組換えアデノウイルスの大
量調製を行うことができ、(4) pacad1A はコスミドベク
ターの形態を有しているために、λファージ及び大腸菌
によるアデノウイルス様ゲノムの安定保持が可能であ
り、更に (5) pacad1A 内部のアデノウイルス様ゲノム
部分には、該ゲノムを修飾する際に要求される複雑な操
作を簡素化するために種々の制限酵素(ClaI, Bst1107I,
XbaI, BamHI, EcoRI, SwaI 及び KpnI - 図 1 参照)
の認識部位が用意されており、従って新しい世代の組換
えアデノウイルスベクターの作成や複雑な機能を有する
組換えアデノウイルスベクターの作成に利用することが
できる。 Characteristics of the present invention Compared with the conventional method, the characteristics of the present invention are clarified. (1) Normally, the production of recombinant adenovirus is performed between two different DNA molecules in 293 cells. Although this step is unnecessary in the present invention,
(2) The recombinant adenovirus produced and emerging is extremely unlikely to have a structure other than the intended one, and (3)
In the conventional method, one of two different DNA molecules
Since DNA is extracted from virus particles grown and purified in large quantities, its preparation requires a relatively large amount of time and labor and specific facilities and equipment.In the present invention, pacad1A and its Since the derivative is a cosmid vector, it is only a step of growing in Escherichia coli.Therefore, large-scale preparation of a recombinant adenovirus can be performed easily and easily. (4) pacad1A has the form of a cosmid vector. As a result, the adenovirus-like genome can be stably maintained by λ phage and E. coli, and (5) complex operations required for modifying the genome are required for the adenovirus-like genome inside pacad1A. Various restriction enzymes (ClaI, Bst1107I,
XbaI, BamHI, EcoRI, SwaI and KpnI-see Figure 1)
Thus, it can be used to construct a new generation of recombinant adenovirus vector or a recombinant adenovirus vector having a complicated function.
【0017】[0017]
【実施例等】次に、実施例及び試験例により本発明を更
に詳細に且つ具体的に説明するが、この実施例は本発明
適用の単なる 1 例に過ぎないことに留意され度い。実施例 (テトラサイクリンによる遺伝子発現の調節が単
一のベクターで可能な組換えアデノウイルスの作成) このタイプの組換えアデノウイルスの作成は、大別して
4 つの段階に分けて実施することができ、その概要が
図 8 に示されている。これらの内で段階 1 及び 2 は
コスミドベクターへの発現単位の挿入のための組換え操
作に関するものであり、段階 3 は両端における ITR 部
分 (図 1 参照) を完全に包含するアデノウイルス様ゲ
ノム DNA の遊離および精製操作に関するものであり、
段階 4 は該 DNA の 293 細胞への導入操作と出現ウイ
ルスの単離操作に関するものである。EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail and concretely with reference to examples and test examples, but it should be noted that this example is merely an example of application of the present invention. Example (Construction of recombinant adenovirus capable of regulating gene expression by tetracycline with a single vector) The construction of this type of recombinant adenovirus can be roughly divided into four steps, An overview is shown in Figure 8. Of these, steps 1 and 2 involve the recombination procedure for insertion of the expression unit into the cosmid vector, and step 3 involves adenovirus-like genomic DNA that completely contains the ITR portions at both ends (see Figure 1). For the release and purification of
Step 4 involves the operation of introducing the DNA into 293 cells and the operation of isolating emerging viruses.
【0018】上記の段階の内で、段階 1 及び 2 はそれ
ぞれ下記の諸工程を包含している。 (a) 制限酵素によるコスミドベクターの処理及び得られ
た DNA 断片の精製工程、(b) 導入又は置換する DNA 断
片の精製工程、(c) 両 DNA 断片のライゲ−ション反応
工程、(d) in vitro packaging 反応及び得られた組換
えλファージにより大腸菌(DH5α) を感染させる工程、
(e) アンピシリン耐性大腸菌からのコスミド DNA の抽
出と該 DNA の構造を確認する工程、及び(f) 目的の構
造を有するクローン由来のアデノウイルス様ゲノム DNA
を大量に調製する工程。[0018] Of the above steps, steps 1 and 2 each include the following steps. (a) treatment of a cosmid vector with a restriction enzyme and purification of the obtained DNA fragment, (b) purification of the DNA fragment to be introduced or replaced, (c) ligation reaction of both DNA fragments, (d) in In vitro packaging reaction and a step of infecting Escherichia coli (DH5α) with the obtained recombinant λ phage,
(e) extracting cosmid DNA from ampicillin-resistant Escherichia coli and confirming the structure of the DNA, and (f) adenovirus-like genomic DNA derived from a clone having the desired structure
A large amount of is prepared.
【0019】段階 1 及び 2 (pacad1A への発現単位の
挿入工程) :先ず、SV40 ウイルスのラージ T 蛋白質由
来の核移行シグナルを含むテトラサイクリン・トランス
アクチベーター遺伝子 (特開平 10 - 80274 号公報に開
示されている NtTA 遺伝子) を CAG プロモーター(特
開平 3 - 168087 号公報に開示されている)の下流に配
置されたテトラサイクリン・トランスアクチベーター発
現単位 (特開平 10 - 80274 号公報に開示されている p
CANtTA プラスミド由来のもの) を ClaI (宝酒造株式会
社) にて切り出し精製した。次に、pacad1Aを ClaI に
て処理した後、その NtTA 遺伝子発現単位と共にライゲ
−ション反応を行い、GigapackIII Gold kit (Stratage
ne 社) を用いてλファージに invitro packaging し
た。このλファージで大腸菌 (DH5α) を感染させ、ア
ンピシリン含有 LB 寒天培地に播き、37℃ にて一晩イ
ンキュベーションした。翌日、新たに出現したコロニー
から DNA を抽出し、Bst1107I と SpeI による制限処理
を通じて構造の確認を行い、目的の構造を有するクロー
ン(pacadCANT)を得た (上記の諸操作が段階 1 であ
り、得られた pacadCANT には NtTA 発現単位が右向き
に導入されている)。Steps 1 and 2 (Step of inserting expression unit into pacad1A): First, a tetracycline transactivator gene containing a nuclear translocation signal derived from the large T protein of SV40 virus (disclosed in JP-A-10-80274) NtTA gene) is placed downstream of a CAG promoter (disclosed in JP-A-3-168087) and a tetracycline transactivator expression unit (p disclosed in JP-A-10-80274).
(Derived from the CANtTA plasmid) was cut out with ClaI (Takara Shuzo Co., Ltd.) and purified. Next, after treating pacad1A with ClaI, a ligation reaction was performed with the NtTA gene expression unit, and GigapackIII Gold kit (Stratage
ne company) and in vitro packaging to λ phage. Escherichia coli (DH5α) was infected with this λ phage, seeded on LB agar medium containing ampicillin, and incubated at 37 ° C overnight. The next day, DNA was extracted from the newly emerged colonies, and the structure was confirmed through restriction treatment with Bst1107I and SpeI to obtain a clone (pacadCANT) having the desired structure. In the obtained pacadCANT, the NtTA expression unit is introduced rightward).
【0020】次に、GigapackIII Gold kit を使用して
in vitro packaging により上記のpacadCANT で大腸菌
(DH5α) を感染させた。このλファージ感染大腸菌をア
ンピシリン含有 LB 培地にて終夜培養して増殖させた。
この培養液から pacadCANTDNA の大量精製を QIAGEN カ
ラムを利用して行った。得られた DNA の一部を採取し
て SwaI (べ−リンガ−・マンハイム社)にて制限処理
を行い、これにより生成した DNA 断片を精製した。こ
れに、テトラサイクリン・プロモーター [M.Gossen 等
" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.", Vol. 89, pages
5547 - 5551 (1992 年)] の下流にピッカジーンプロモ
ーターベクター 2 プラスミド(東洋インキ株式会社)
由来のホタルルシフェラーゼ遺伝子および SV40 由来の
後期ポリアデニレ−ションシグナル配列を配置させたル
シフェラーゼ発現単位を含む DNA断片を添加してライゲ
−ション反応を行った。このライゲーション液について
GigapackIII Gold kit (Stratagene 社) を用いてλフ
ァージに in vitropackaging した。このλファージで
大腸菌 (DH5α) を感染させ、アンピシリン含有 LB 寒
天培地に播き、37℃ にて一晩インキュベーションし
た。翌日、新たに出現したコロニーから DNA を抽出し
て構造を確認した。目的の構造 (テトラサイクリン・プ
ロモーターにて支配されるルシフェラ−ゼ発現単位を S
waI による pacadCANT の切断部位に左向きに有してい
る) を有するクローンを得、このクローンを「pacadCAN
TT-luc」と命名すると共に、その DNA の大量調製及び
精製を QIAGEN カラムを利用して行った。この DNA を
TE 液 [10 mM Tris HCl(pH 8.0) + 1 mM EDTA 液] に溶
解し、DNA 濃度を測定した後に凍結保存した(上記 の諸
操作が段階 2 である)。Next, using the Gigapack III Gold kit
E. coli with pacadCANT described above by in vitro packaging
(DH5α). The λ phage-infected Escherichia coli was cultured overnight in an LB medium containing ampicillin and grown.
Mass purification of pacadCANTDNA from this culture was performed using a QIAGEN column. A part of the obtained DNA was collected, subjected to restriction treatment with SwaI (Behringer-Mannheim), and the DNA fragment generated thereby was purified. This includes the tetracycline promoter [M. Gossen et al.
"Proc. Natl. Acad. Sci. USA", Vol. 89, pages
5547-5551 (1992)] downstream of the Picker Gene Promoter Vector 2 plasmid (Toyo Ink Co., Ltd.)
A ligation reaction was carried out by adding a DNA fragment containing a luciferase expression unit in which a firefly luciferase gene derived from the yeast and a late polyadenylation signal sequence derived from SV40 were arranged. About this ligation solution
Lambda phage was in vitro packaged using GigapackIII Gold kit (Stratagene). Escherichia coli (DH5α) was infected with this λ phage, seeded on LB agar medium containing ampicillin, and incubated at 37 ° C overnight. The next day, DNA was extracted from newly emerging colonies to confirm the structure. Desired structure (Luciferase expression unit controlled by tetracycline promoter
(leftward at the site of cleavage of pacadCANT by waI).
The DNA was named "TT-luc", and its DNA was prepared and purified in large quantities using a QIAGEN column. This DNA
It was dissolved in a TE solution [10 mM Tris HCl (pH 8.0) + 1 mM EDTA solution], and the DNA concentration was measured and then stored frozen (the above operations are Step 2).
【0021】段階 3 (アデノウイルス様ゲノム DNA の
遊離および精製) :100μg の pacadCANTT-luc DNA を 4
0μl の PacI [4000U/ml (New EnglandBioLabs 社) に
て 2 時間処理した。その後、フェノール/クロロホル
ム処理を1 回及びクロロホルム処理を 2 回行い、次い
でエタノ−ルによる沈澱処理を行った。沈澱した DNA
を 70% エタノールにてリンスし、210μl の滅菌蒸留水
に溶解した。この DNA 溶液の内で 10μl を採取して D
NA 濃度の測定を行い、残余を凍結保存した。Step 3 (Release and purification of adenovirus-like genomic DNA): 100 μg of pacadCANTT-luc DNA was added to 4
The cells were treated with 0 μl of PacI [4000 U / ml (New England BioLabs)] for 2 hours. Thereafter, phenol / chloroform treatment was performed once and chloroform treatment was performed twice, followed by precipitation treatment with ethanol. Precipitated DNA
Was rinsed with 70% ethanol and dissolved in 210 μl of sterile distilled water. Take 10 μl of this DNA solution and add D
The NA concentration was measured, and the remainder was stored frozen.
【0022】段階 4 の前段 (293 細胞へのアデノウイ
ルス様ゲノム DNA 導入) :段階 3 において得られ且つ
濃度が判明した DNA であって 10μg の DNA を含有す
る量の DNA を凍結保存分から採取して 600μl の Opti
-MEM 液に溶解し、80μl の Lipofectamine を含有する
600μl の Opti-MEM 液と混和した。次いで、室温にお
いて 30 分間静置した後に更に 7ml の Opti-MEM 液を
添加してアデノウイルス様ゲノム導入用の DNA-Lipofec
tamine 混和液とした。コラーゲンにてコートされた面
積 75cm2 のフラスコに予め用意した 293 細胞培養液
(細胞集密度 : 80%) から培養液 (10% FBS 含有 DMEM
培養液) を除去し、5mlのOpti-MEM 液により細胞を軽く
リンスした。その後、Opti-MEM リンス液を除去し、こ
れを上記のゲノム導入用混和液と置換し、37℃、5% CO2
の条件下にてCO2 インキュベーター内で細胞を 4 時間
インキュベーションした。次いで、ゲノム導入用の DNA
-Lipofectamine 混和液を新鮮な培養液(10% FBS 含有
DMEM液) に置換し、更に上記と同様の条件で終夜インキ
ュベーションした。翌日、遺伝子導入処理を施した 293
細胞をフラスコから遊離させ、10% FBS 含有 DMEM液を
用いて細胞浮游液となした。この細胞浮游液をコラーゲ
ンにてコートされた96 穴プレートに播き、37℃、5% CO
2 の条件下に維持した。Step 4 (Transfection of adenovirus-like genomic DNA into 293 cells): The DNA obtained in Step 3 and having a known concentration and containing 10 μg of DNA was collected from the frozen stock. 600 μl of Opti
Dissolve in -MEM solution and contain 80μl Lipofectamine
It was mixed with 600 μl of Opti-MEM solution. Then, after leaving still at room temperature for 30 minutes, 7 ml of Opti-MEM solution was added and DNA-Lipofec for introduction of adenovirus-like genome was added.
A tamine mixture was used. 293 cell culture solution previously prepared in a 75 cm 2 flask coated with collagen
(Cell confluence: 80%) from culture solution (DMEM containing 10% FBS)
The culture was removed, and the cells were lightly rinsed with 5 ml of Opti-MEM solution. Then, remove the Opti-MEM rinse solution and replace it with the above-mentioned mixture for genome introduction, at 37 ° C, 5% CO 2
The cells were incubated for 4 hours in a CO 2 incubator under the following conditions. Next, DNA for genome introduction
-Lipofectamine mixed solution with fresh culture solution (containing 10% FBS)
(DMEM solution) and further incubated overnight under the same conditions as above. The next day, the transfected 293
The cells were released from the flask, and used as a cell suspension using DMEM containing 10% FBS. This cell suspension was seeded on a 96-well plate coated with collagen and incubated at 37 ° C and 5% CO2.
The condition of 2 was maintained.
【0023】段階 4 の後段 (組換えアデノウイルスの
単離及び構造確認) :独立して 2 回行った遺伝子導入操
作の結果、遺伝子導入処理から 7 - 14 日後に 16 乃至
21 個の well においてウイルスによる細胞障害効果が
観察された(後記の表 2 における遺伝子導入例 A 及び
B 参照)。ウイルスによる細胞障害効果が観察された we
ll の細胞と培養液の両者を、各々別個に滅菌チューブ
に採取して凍結保存した。遺伝子導入処理後 14 日間に
わたり細胞を維持した段階で、細胞障害効果の認められ
た全ての well 由来のもの (死滅細胞 + 培養液)につい
て、ドライアイス・エタノールと 37℃ のウオーターバ
スとを用いて 5回の急速凍結と融解とを繰返した後に遠
心処理を行って、ウイルスを含有する上清を回収した。
この上清の一部で新鮮な 293 細胞(24 穴プレートに播
種)を感染させ、完全に細胞障害効果が出現した時点で
死滅細胞を回収し、該細胞からDNA を抽出した。この D
NA を幾つかの制限酵素で処理することにより構造の確
認を行った。図 9 には遺伝子導入例 A の場合に得られ
たウイルス由来の DNAを SphI で処理した例 (16 例)
が示されている。得られたすべてのウイルスは制限酵素
SphI を用いて処理する場合に図 10 に示されているよ
うなサイズのDNA 断片を 遊離することが予想される
が、遺伝子導入例 A の場合には得られた16 wells のウ
イルスすべてが同一の且つ予想された構造を有している
ことが判明した (この新たに得られた組換えアデノウイ
ルスを「AcNTT-luc」と命名した)。これにより、本発明
による組換えアデノウイルスの調製過程においては、従
来の方法と比較する場合に、E1 陽性ウイルス等の望ま
しからぬウイルスが出現する確率の極めて低いことが証
明された。尚、PacI にて処理していないpacadCANTT-lu
c についても PacI 処理を行った pacadCANTT-luc と同
様の条件で遺伝子導入を行ったが (後記の表 2 におけ
る遺伝子導入例 C, D, E 及びF)、293 細胞に対する 障
害効果は認められず、従ってウイルスの生成にはpacadC
ANTT-luc を PacI により処理して両端に ITR を完全に
含むアデノウイルス様ゲノム DNA の遊離が必要である
ことが判明した。After step 4 (Isolation and structure confirmation of recombinant adenovirus): As a result of the gene transfer operation performed twice independently, 16 to 14 days after the gene transfer treatment,
The cytotoxic effect of the virus was observed in 21 wells (gene transfer examples A and
B). We observed cytotoxic effect by virus
Both cells and culture medium were separately collected in sterile tubes and cryopreserved. After maintaining the cells for 14 days after the gene transfer treatment, the cells (dead cells + culture medium) from all wells with cytotoxic effects were observed using dry ice / ethanol and a 37 ° C water bath. After five times of rapid freezing and thawing, centrifugation was performed to collect the virus-containing supernatant.
A part of the supernatant was used to infect fresh 293 cells (inoculated on a 24-well plate), and when the cytotoxic effect was completely developed, dead cells were collected and DNA was extracted from the cells. This D
The structure was confirmed by treating NA with some restriction enzymes. Fig. 9 shows an example in which DNA derived from the virus obtained in the case of transfection example A was treated with SphI (16 cases).
It is shown. All viruses obtained are restriction enzymes
When treated with SphI, it is expected that DNA fragments of the size shown in Fig. 10 will be released, but in the case of transfection example A, all of the obtained 16-well viruses are identical. And it was found to have the expected structure (the newly obtained recombinant adenovirus was named "AcNTT-luc"). This proved that in the process of preparing the recombinant adenovirus according to the present invention, the probability of occurrence of unwanted viruses such as E1 positive virus was extremely low as compared with the conventional method. PacadCANTT-lu not treated with PacI
For c, transfection was performed under the same conditions as for pacadCANTT-luc treated with PacI (transfection examples C, D, E and F in Table 2 below), but no inhibitory effect on 293 cells was observed. Therefore, pacadC
Treatment of ANTT-luc with PacI revealed that it was necessary to release adenovirus-like genomic DNA completely containing ITRs at both ends.
【0024】[0024]
【表2】 表 2 中において「陽性 well の数」とは、293 細胞に
対してウイルスによる細胞傷害効果が観察された well
の数の総計である。[Table 2] In Table 2, "Number of positive wells" refers to the number of wells in which the cytotoxic effect of the virus was observed on 293 cells.
Is the sum of the numbers.
【0025】試験例 (AcNTT-luc 組換えアデノウイルス
ベクターの機能に関する評価) 本発明による AcNTT-luc ウイルスベクターはそのゲノ
ム上の別々の箇所(E1欠損部位及び E3 欠損部位) に異
なる遺伝子発現単位を有している。E3 欠損部位に導入
されたテトラサイクリン・プロモーターの支配下のルシ
フェラ−ゼ遺伝子が発現するためには、E1 欠損部位に
導入された NtTA 遺伝子の発現が必要であり、更にその
発現はテトラサイクリンを培養系に加えることにより阻
害できるようにデザインされている。従って、別々の箇
所に導入された遺伝子が両者共に機能するか否かを調べ
る目的で、CHO-K1 細胞 (ATCC より供与を受けた) にAc
NTT-luc ウイルスを感染させ [感染重複度 (multiplici
ty of infection) :1)]、培養液中のテトラサイクリン
の濃度を変化させて、ルシフェラ−ゼ遺伝子の発現を調
べた。結果は下記の表 3 に示されている通りであり、
テトラサイクリン不在の場合には高いルシフェラ−ゼ活
性が認められる一方、テトラサイクリンが存在する場合
にはその濃度上昇に従って活性が減少し、1μg/ml のテ
トラサイクリンが存在する場合には不在の場合の 1000
分の 1 にまで活性が低下した。これらの結果から、本
発明による組換えアデノウイルスは動物細胞に感染し、
細胞内部に侵入した該ウイルスから、即ち、そのゲノム
上の別々の箇所に存在する異なる遺伝子発現単位から目
的の遺伝子産物(蛋白質)が発現する機能を有すること
が確認された。このことは、AcNTT-luc の場合に、 E3
欠損部位に導入されたテトラサイクリン・プロモーター
の支配下にある外来遺伝子の発現が E1 欠損部位に導入
された NtTA 遺伝子の発現により誘導され、更に該誘導
はテトラサイクリンを培養系に加えることにより阻害で
きるという発現調節機能を有していることの証左に他な
らないのである。 Test Example (Evaluation on Function of AcNTT-luc Recombinant Adenovirus Vector) The AcNTT-luc virus vector according to the present invention has different gene expression units at different positions (E1-deficient site and E3-deficient site) on its genome. Have. In order for the luciferase gene under the control of the tetracycline promoter introduced into the E3 deficient site to be expressed, the expression of the NtTA gene introduced into the E1 deficient site is necessary. It is designed so that it can be inhibited by adding. Therefore, CHO-K1 cells (provided by the ATCC) were used to determine whether the genes introduced at different sites
Infect the NTT-luc virus and select [Multiplici
ty of infection): 1)], the expression of luciferase gene was examined by changing the concentration of tetracycline in the culture solution. The results are as shown in Table 3 below,
In the absence of tetracycline, high luciferase activity is observed, whereas in the presence of tetracycline, the activity decreases as the concentration increases, and in the absence of 1 μg / ml tetracycline, the activity decreases by 1000 μm.
Activity was reduced by a factor of one. From these results, the recombinant adenovirus according to the present invention infects animal cells,
It was confirmed that the virus had a function of expressing a target gene product (protein) from the virus invading the inside of the cell, that is, from different gene expression units present at different places on the genome. This means that in the case of AcNTT-luc, E3
Expression of a foreign gene under the control of the tetracycline promoter introduced into the deletion site is induced by expression of the NtTA gene introduced into the E1 deletion site, and the induction can be inhibited by adding tetracycline to the culture system. There is no other evidence that it has an adjustment function.
【0026】[0026]
【表3】 表 3 中において、* : 平均値 ± 標準偏差[Table 3] In Table 3, * : average ± standard deviation
【0027】本発明による組換えアデノウイルスベクタ
ーと従来の組換えアデノウイルスとの比較 本発明による組換えアデノウイルスの特徴、即ちアデノ
ウイルス様ゲノム内に導入された (テトラサイクリン・
プロモーターの支配下にある) 外来遺伝子の発現が、単
一のアデノウイルス様ゲノムの別部位に導入された NtT
A 遺伝子の発現により誘導され、該誘導がテトラサイク
リンを培養系に加えることにより阻害できるという発現
調節機能を有するタイプの組換えアデノウイルスの特徴
を、従来の組換えアデノウイルスと比較して明確にする
と次の通りである。従来の組換えアデノウイルスを用い
て外来遺伝子を動物細胞に導入した場合には、該外来遺
伝子の発現は通常恒常的で、外部からのコントロールは
不可能な場合が多く、又発現の調節が可能な場合におい
ても、目的とする導入遺伝子の発現量自体が乏しかった
り或いはその誘導又は抑制の度合いが乏しかったりして
有用性が低かったのが実状である。これに対して、Goss
en 等が開発し [" Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.", Vo
l. 89, pages 5547 - 5551 頁 (1992 年)]、濱田等が改
良を加えた (特開平 10 - 80274 号公報)、テトラサイ
クリンにて導入遺伝子の発現量をコントロールできるシ
ステムは極めて有用な系である。この系の組換えアデノ
ウイルスベクターへの応用は既になされているが、単一
のアデノウイルスベクターにおける別々の部位 (E1 及
び E3 欠損部位) にテトラサイクリン・トランスアクチ
ベーターの発現単位及びテトラサイクリン・プロモー
ターの支配下におかれた外来導入遺伝子の発現単位をそ
れぞれ有する組換えアデノウイルスは本発明が初めてで
ある。単一のアデノウイルスにテトラサイクリン・トラ
ンスアクチベーターの発現単位およびテトラサイクリン
・プロモーターの支配下におかれた外来導入遺伝子の発
現単位の両者を導入することにより、本発明においては
複数のウイルスを調製し、取り扱うと云う手間が省ける
以外に、1 個のウイルスが動物細胞内に侵入すれば、目
的とする外来導入遺伝子の発現調節が可能になると云う
利点を有している。更に、試験例の表 3 において示さ
れているように、このタイプの 組換えアデノウイルス
を用いれば、少なくとも 1000 倍の遺伝子発現誘導 (又
は発現抑制) が可能である。このような発現調節機能を
有する本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子治療の
目的に使用する場合や、細胞や生体が有している生理活
性物質の機能に関する解析に応用する場合に極めて有用
な手段となる。The recombinant adenovirus vector according to the present invention
Comparison of a recombinant adenovirus with a conventional recombinant adenovirus. The characteristics of the recombinant adenovirus according to the present invention, i.e.
The expression of a foreign gene (under the control of a promoter) is transferred to another site in a single adenovirus-like genome.
The characteristics of a type of recombinant adenovirus that is induced by the expression of the A gene and has an expression regulating function that the induction can be inhibited by adding tetracycline to the culture system are clarified in comparison with the conventional recombinant adenovirus. It is as follows. When a foreign gene is introduced into animal cells using a conventional recombinant adenovirus, the expression of the foreign gene is usually constitutive, and external control is often impossible, and the expression can be regulated. In such cases, the usefulness is low because the expression level of the target transgene itself is poor or the degree of induction or suppression thereof is poor. In contrast, Goss
en etc. ["Proc. Natl. Acad. Sci. USA", Vo
l. 89, pages 5547-5551 (1992)], improved by Hamada et al. (JP-A-10-80274), a system that can control the expression level of a transgene with tetracycline is an extremely useful system. is there. Although this system has already been applied to recombinant adenovirus vectors, the expression sites of the tetracycline transactivator and the tetracycline promoter are controlled at separate sites (E1 and E3 deletion sites) in a single adenovirus vector. This is the first time that the present invention is a recombinant adenovirus having an expression unit for a foreign transgene placed below. By introducing both the expression unit of the tetracycline transactivator and the expression unit of the foreign transgene under the control of the tetracycline promoter into a single adenovirus, a plurality of viruses are prepared in the present invention, In addition to saving the trouble of handling, if one virus invades animal cells, it has the advantage that the expression of the desired foreign transgene can be regulated. Furthermore, as shown in Table 3 of the test examples, the use of this type of recombinant adenovirus can induce (or suppress) gene expression at least 1000-fold. The recombinant adenovirus of the present invention having such an expression regulating function is extremely useful when used for the purpose of gene therapy or when applied to analysis on the function of a physiologically active substance possessed by cells or living bodies. Means.
【0028】[0028]
【発明の効果】アデノウイルス様ゲノムを有する本発明
によるコスミドベクターを用いれば、従来複数の部位に
対する複雑な操作過程を必要とされてきたアデノウイル
スの遺伝子の修飾、変更、外来遺伝子の導入等の操作を
簡便に行うことができる。又、その際にアデノウイルス
の大量調製や、そのゲノム DNA の大量調製を必要とし
ないので、時間や労力を大幅に節減することができる。According to the present invention, the use of the cosmid vector having an adenovirus-like genome according to the present invention makes it possible to modify or change an adenovirus gene, introduce a foreign gene, etc., which have conventionally required complicated operation processes at a plurality of sites. The operation can be performed easily. In this case, it is not necessary to prepare a large amount of adenovirus or its genomic DNA, so that time and labor can be greatly reduced.
【図1】本発明において使用された組換えコスミドベク
ターである pacad1A の構造の概要を示す図であり、本
図中において E1 欠損部位 : アデノウイルスの初期発現領域 (early
region) 1 の欠損部位、 E3 欠損部位 : アデノウイルスの初期発現領域 3 の欠
損部位、 COS : 本コスミドベクターをλファージにパ−ッケ−ジ
する際に必須の部分、 Ori : 大腸菌内でのプラスミドの複製起点であって、大
腸菌内で本コスミドベクターが増幅される機能を果たす
部分、 Ampr : 本コスミドベクターにより形質転換された大腸
菌に抗生物質であるアンピシリンに対する耐性を付与す
るための遺伝子部分、 ITR : アデノウイルスゲノムの両端に存在する逆方向末
端繰り返し配列部分、 Bs : 制限酵素である Bst1107I による認識切断部位、 P : 制限酵素である PacI による認識切断部位、 C : 制限酵素である ClaI による認識切断部位、 X : 制限酵素である XbaI による認識切断部位、 B : 制限酵素である BamHI による認識切断部位、 E : 制限酵素である EcoRI による認識切断部位、 S : 制限酵素である SwaI による認識切断部位、 K : 制限酵素である KpnI による認識切断部位を意味
し、イタリック体で略記された制限酵素 (C, X, B 及び
S) は、これらの制限酵素が認識して本コスミドベクタ
ー切断する箇所が 1 箇所のみであることを意味してい
る。FIG. 1 is a diagram showing an outline of the structure of pacad1A, which is a recombinant cosmid vector used in the present invention. In the figure, E1 deletion site: early expression region of adenovirus (early
region) 1 deletion site, E3 deletion site: adenovirus early expression region 3 deletion site, COS: an essential part for packaging this cosmid vector into λ phage, Ori: in E. coli a plasmid origin of replication, parts performing a function of the cosmid vector is amplified in E. coli, Amp r: gene portion to confer resistance to ampicillin, an antibiotic in E. coli transformed with the cosmid vector , ITR: Inverted terminal repeats located at both ends of the adenovirus genome, Bs: Recognition and cleavage site by restriction enzyme Bst1107I, P: Recognition and cleavage site by restriction enzyme PacI, C: by restriction enzyme ClaI Recognition cleavage site, X: Recognition and cleavage site by restriction enzyme XbaI, B: Recognition and cleavage site by restriction enzyme BamHI, E: Restriction enzyme EcoRI Recognition cleavage site by, S: recognition cleavage site by a restriction enzyme SwaI, K: restriction enzyme KpnI by means recognized cleavage site is a restriction enzyme (C which is abbreviated in italics, X, B and
S) means that these restriction enzymes recognize and cut this cosmid vector at only one site.
【図2】図 1 に示されたコスミドベクターである paca
d1A を構成する断片 1 と 2 との境界 A 部分の塩基配
列と、該境界部分における塩基配列を認識してベクター
を切断可能な制限酵素とを示す図。FIG. 2 paca, a cosmid vector shown in FIG.
The figure which shows the base sequence of the boundary A part of the fragment 1 and 2 which comprise d1A, and the restriction enzyme which recognizes the base sequence in this boundary part and can cut | disconnect a vector.
【図3】図 1 に示されたコスミドベクターである paca
d1A を構成する断片 2 と 3 との境界 B 部分の塩基配
列と、該境界部分における塩基配列を認識してベクター
を切断可能な制限酵素とを示す図。FIG. 3 pcosm, a cosmid vector shown in FIG.
The figure which shows the base sequence of the boundary B part of the fragment 2 and 3 which comprise d1A, and the restriction enzyme which recognizes the base sequence in this boundary part and can cut | disconnect a vector.
【図4】図 1 に示されたコスミドベクターである paca
d1A を構成する断片 3 と 4 との境界 C 部分の塩基配
列と、該境界部分における塩基配列を認識してベクター
を切断可能な制限酵素とを示す図。FIG. 4 shows the cosmid vector paca shown in FIG.
The figure which shows the base sequence of the boundary C part of the fragment 3 and 4 which comprise d1A, and the restriction enzyme which recognizes the base sequence in the said boundary part and can cut | disconnect a vector.
【図5】図 1 に示されたコスミドベクターである paca
d1A を構成する断片 4 と 5 との境界 D 部分の塩基配
列と、該境界部分における塩基配列を認識してベクター
を切断可能な制限酵素とを示す図。FIG. 5: paca, a cosmid vector shown in FIG.
The figure which shows the base sequence of the boundary D part of the fragment 4 and 5 which comprise d1A, and the restriction enzyme which recognizes the base sequence in this boundary part and can cut | disconnect a vector.
【図6】図 1 に示されたコスミドベクターである paca
d1A を構成する断片 5 と 6 との境界 E 部分の塩基配
列と、該境界部分における塩基配列を認識してベクター
を切断可能な制限酵素とを示す図。FIG. 6 shows the cosmid vector paca shown in FIG.
The figure which shows the base sequence of the boundary E part of the fragment 5 and 6 which comprise d1A, and the restriction enzyme which recognizes the base sequence in this boundary part and can cut | disconnect a vector.
【図7】図 1 に示されたコスミドベクターである paca
d1A を構成する断片 6 と 7 との境界 F 部分の塩基配
列と、該境界部分における塩基配列を認識してベクター
を切断可能な制限酵素とを示す図。FIG. 7: paca, a cosmid vector shown in FIG.
The figure which shows the base sequence of the boundary F part of the fragment 6 and 7 which comprise d1A, and the restriction enzyme which recognizes the base sequence in this boundary part and can cut | disconnect a vector.
【図8】テトラサイクリンによる遺伝子発現の調節が単
一のベクターで可能な組換えアデノウイルス、該ウイル
スによる動物細胞の感染及び該動物細胞の培養によるウ
イルスの発現を示す図。FIG. 8 is a diagram showing a recombinant adenovirus capable of regulating gene expression by tetracycline with a single vector, infection of animal cells with the virus, and expression of the virus by culturing the animal cells.
【図9】実施例における遺伝子導入例 A において得た
16 wells の組換えアデノウイルス由来 DNA を制限酵素
の SphI で処理し、アガロースゲルによる電気泳動を行
って調べた切断パターンを示すものであり、M はマーカ
ーのレーンを示し、図の左側に、マーカーによって指示
される DNA のサイズ (塩基対の数) が数字で示されて
いる。FIG. 9 shows the results obtained in Example A for gene transfer in Examples.
16 wells of recombinant adenovirus-derived DNA was treated with the restriction enzyme SphI and subjected to electrophoresis on an agarose gel to show the cleavage pattern.M indicates the marker lane, and the left side of the figure shows the marker The size (number of base pairs) of the DNA indicated by is indicated by a number.
【図10】目的とされる AcNTT-luc が示すものと想定
される SphI による組換えアデノウイルス遺伝子 DNA
の切断パターンを示すものであり、各数字は SphI によ
る消化にて遊離してくる DNA 断片のサイズ (塩基対の
数) を示している。[FIG. 10] Recombinant adenovirus gene DNA by SphI assumed to be represented by the target AcNTT-luc
The numbers indicate the size (number of base pairs) of DNA fragments released by digestion with SphI.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI (C12N 15/09 ZNA C12R 1:92) ──────────────────────────────────────────────────の Continued on front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI (C12N 15/09 ZNA C12R 1:92)
Claims (8)
全に含み且つ E1 及び E3 領域に欠損を有するアデノウ
イルス様ゲノムを内部に有していることを特徴とする、
コスミドベクター。1. An adenovirus-like genome completely containing up to the inverted terminal repeats at both ends and having deletions in the E1 and E3 regions.
Cosmid vector.
該アデノウイルス様ゲノム部分のみをコスミドベクター
から遊離させる制限酵素認識部位を有していることを特
徴とする、請求項 1 に記載のコスミドベクター。2. On both sides of the adenovirus-like genome portion,
The cosmid vector according to claim 1, wherein the cosmid vector has a restriction enzyme recognition site that releases only the adenovirus-like genome portion from the cosmid vector.
素認識部位がアデノウイルス様ゲノムの E1 及び E3 欠
損領域に、それぞれ存在していることを特徴とする、請
求項 1 又は 2 に記載のコスミドベクター。3. The cosmid vector according to claim 1, wherein another restriction enzyme recognition site that cleaves the cosmid vector is present in the E1- and E3-deficient regions of the adenovirus-like genome, respectively. .
繰り返し配列よりも右側の部分又は右逆方向末端繰り返
し配列よりも左側の部分に更に他の制限酵素認識部位を
有しており、これによりアデノウイルス様ゲノムの修飾
又は変更操作が容易になされていることを特徴とする、
請求項 1 - 3 の何れか 1 つに記載のコスミドベクタ
ー。4. The adenovirus-like genome further has another restriction enzyme recognition site in a portion on the right side of the left inverted terminal repeat sequence or on a portion on the left side of the right inverted terminal repeat sequence. The modification or alteration operation of the virus-like genome is easily performed,
The cosmid vector according to any one of claims 1 to 3.
ン・トランスアクチベーターの発現単位及びテトラサイ
クリン・プロモーターに支配された外来遺伝子の発現単
位をそれぞれ有していることを特徴とする、請求項 3
に記載のコスミドベクター。5. The method according to claim 3, wherein the E1 and E3 deficient regions have an expression unit of a tetracycline transactivator and an expression unit of a foreign gene controlled by a tetracycline promoter, respectively.
The cosmid vector according to 1.
スミドベクターが制限酵素により切断されて調製された
ものであることを特徴とする、組換えアデノウイルス。6. A recombinant adenovirus, which is prepared by cutting the cosmid vector according to claim 1 with a restriction enzyme.
下にある遺伝子の発現がテトラサイクリンにより調節可
能なことを特徴とする、請求項 5 に記載のコスミドベ
クターから調製された組換えアデノウイルス。7. The recombinant adenovirus prepared from the cosmid vector according to claim 5, wherein the expression of a gene under the control of the tetracycline promoter can be regulated by tetracycline.
ウイルスにより感染されていることを特徴とする、動物
細胞。8. An animal cell which is infected with the recombinant adenovirus according to claim 6 or 7.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10148789A JPH11332560A (en) | 1998-05-29 | 1998-05-29 | Recombinant adenovirus, cosmid vector containing the recombinant virus genom and animal cell infected with the recombinant virus |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10148789A JPH11332560A (en) | 1998-05-29 | 1998-05-29 | Recombinant adenovirus, cosmid vector containing the recombinant virus genom and animal cell infected with the recombinant virus |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11332560A true JPH11332560A (en) | 1999-12-07 |
Family
ID=15460734
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP10148789A Withdrawn JPH11332560A (en) | 1998-05-29 | 1998-05-29 | Recombinant adenovirus, cosmid vector containing the recombinant virus genom and animal cell infected with the recombinant virus |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH11332560A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004094643A1 (en) * | 2003-04-18 | 2004-11-04 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Novel cosmid vector |
-
1998
- 1998-05-29 JP JP10148789A patent/JPH11332560A/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004094643A1 (en) * | 2003-04-18 | 2004-11-04 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Novel cosmid vector |
US8216833B2 (en) | 2003-04-18 | 2012-07-10 | Izumu Saito | Cosmid vector |
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