JPH1132764A

JPH1132764A - ビフィドバクテリウム・ブレーベ用モノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH1132764A
Application number: JP9202645A
Authority: JP
Inventors: Akito Mike; 明人三毛; Hisako Yasui; 久子保井; Yoko Oya; 陽子大矢; Makoto Owaki; 眞大脇
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1997-07-14
Filing date: 1997-07-14
Publication date: 1999-02-09

Abstract

(57)【要約】【課題】異なる属、種、株に属する細菌とは反応せ
ず、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium
breve)ＹＩＴ４０６５株を特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体を得て、その検出を簡便、迅速化する。【解決手段】ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifid
obacterium breve)ＹＩＴ４０６５株を特異的に認識す
るモノクローナル抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ビフィドバクテリ
ウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)ＹＩＴ４０６
５株及びその関連株に特異的なビフィドバクテリウム・
ブレーベ用モノクローナル抗体、該モノクローナル抗体
産生融合細胞及び抗体感作コロイド金に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】ビフィドバクテリウム(Bifidobacteriu
m)属細菌(所謂、ビフィズス菌)は、ヨーグルト、乳酸菌
飲料などの発酵乳製品や医薬品等様々な分野で利用され
ている有用微生物である。また、従来から、ビフィズス
菌は整腸作用、腸管内の腐敗防止作用を有することが認
識されており、近年では抗潰瘍作用、免疫賦活作用等種
々の生理活性が存在することもわかっている。

【０００３】しかしながら、ビフィズス菌の中でも、そ
の菌種、菌株によって菌体成分が与える生理活性に差が
あることも確かめられている。例えば、同じビフィドバ
クテリウム・ブレーベでもFERM BP-2824株は、ATCC 156
98株よりも免疫賦活活性が強い。これは、菌体表面のタ
ンパク質、糖鎖等の組成や酵素等の菌体成分の違いに由
来しているものと考えられている。

【０００４】一方、本出願人が保有しているビフィドバ
クテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５株はビフィズス菌
の中でも酸耐性、胆汁酸耐性等飲食品の製造用菌株とし
ての特性も優れているが、ガン予防作用、免疫賦活作
用、血中コレステロール低下作用、整腸作用等生体内に
おける種々の生理効果を特に強く有する菌株であり、食
品や医薬品、化粧品など広範囲な用途が期待されている
ものである。

【０００５】このため、この菌株に対しては、生体内で
の動向や作用の確認など多岐にわたる研究がなされてい
る。そして、その際には培地や糞便中の細菌叢から該菌
株を同種又は類似の種の他菌株と区別して、菌株レベル
で同定する必要がある。現状では、菌株の同定は、選択
培地による選別や表現形質、即ち、糖分解性状、発酵生
産物などを検査することにより行われている。また、こ
れに加えてＤＮＡ‐ＤＮＡホモロジーによる判定も行わ
れている。しかし、これらの解析は煩雑で時間がかか
り、中には試験者の熟練を要する操作もある。そこで、
より迅速且つ簡便に該菌株を検出する方法が望まれてい
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】微生物の中でも、同一
菌種で菌株の異なる細菌は、表現形質、ＤＮＡの塩基配
列等が酷似しており、これらを菌株レベルで検出するこ
とは困難である。また、菌株レベルの検出を行う場合で
も、継代培養により極わずかな性状の違いを有するに至
った近縁の菌株群(以下「関連株」と記す)は同一の菌株
として認識する必要がある。これは、関連株群に属する
菌株の生理活性が各々同等であるためである。

【０００７】このように、関連株群を全て検出し、他の
菌株は検出しないという条件を満たす検出方法として
は、モノクローナル抗体を用いた選別方法が有効である
と考えられた。そこで、本発明者は他の属、種、株に属
する細菌とは反応せず、ビフィドバクテリウム・ブレー
ベＹＩＴ４０６５株及びその関連株に特異的に結合する
モノクローナル抗体を作成することを目的として研究を
行った。

【０００８】

【課題を解決するための手段】かかる実状に鑑み本発明
者は鋭意研究を行ったところ、ビフィドバクテリウム・
ブレーベＹＩＴ４０６５株及びその関連菌株を特異的に
認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を得ることに成功し、これを培養すれば、目的とするモ
ノクローナル抗体が得られることを見いだし本発明を完
成した。

【０００９】即ち、本請求項１に記載された発明に係る
ビフィドバクテリウム・ブレーベ用モノクローナル抗体
は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium
breve)ＹＩＴ４０６５株及びその関連株を特異的に認
識するものである。

【００１０】また、本請求項２に記載された発明に係る
融合細胞(ハイブリドーマ)は、このモノクローナル抗体
を産生するものである。尚、本発明の一実施態様では、
ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium bre
ve)ＹＩＴ４０６５株及びその関連株を特異的に認識す
るモノクローナル抗体を産生し、FERM P-16296として寄
託されたものが例示される。

【００１１】また、本請求項３に記載された発明に係る
抗体感作コロイド金は、ビフィドバクテリウム・ブレー
ベＹＩＴ４０６５株及びその関連菌株を特異的に認識す
るモノクローナル抗体にコロイド金粒子を吸着させたも
のである。

【００１２】また、本請求項４に記載された発明に係る
抗原の検出方法は、請求項３のコロイド金を用意し、被
検抗原群に前記抗体感作コロイド金を反応させた後、洗
浄して抗体感作コロイド金が固着した赤色の被検抗原を
目視により検出するものである。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明のビフィドバクテリウム・
ブレーベＹＩＴ４０６５株(以下「YIT4065株」と記す)
とは、本出願人が保有している菌株であり、受託番号FE
RM P-15488株として工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されているものである。この菌株は、整腸作用、
免疫賦活作用等様々な生理活性を有し、食品、医薬品等
としても使用されている最も有用な菌株の１つである。

【００１４】一方、本発明の関連株とは、元来同系統に
属していた菌株群のことである。即ち、継代培養等に伴
う変異のために、表面形状等を極わずかに変化させた、
所謂「親子関係」の菌株群を指し、お互いに極わずかな
表現形質の差を有しているものの、人体に与える活性に
は殆ど変わりがないものを指す。具体的には、ＹＩＴ４
０６５株の親株であるＹＩＴ４０１０株を始めとして、
姉妹株であるＹＩＴ４０５２株等が挙げられる。

【００１５】YIT4065株及び関連株に特異的なモノクロ
ーナル抗体を作製するためには、まず、動物をYIT4065
株の菌体で免疫する。そして、免疫された動物を解剖
し、該菌株特異的抗体を産生する細胞(以下、抗体産生
細胞と略記する)を得る。次に、得られた抗体産生細胞
とミエローマ細胞(骨髄腫細胞)とを融合させハイブリド
ーマ(融合細胞)を得、これらのハイブリドーマを培養す
る。更に、培養物中に得られる抗体のYIT4065株に対す
る特異性を指標として抗体を産生するハイブリドーマを
クローニングし、これを培養することによりYIT4065株
及び関連株に特異的なモノクローナル抗体を作製するハ
イブリドーマを取得することができる。

【００１６】前記のハイブリドーマは、YIT4065株の菌
体を免疫された動物より得られた抗体産生細胞とミエロ
ーマ細胞とを融合させることによって形成される。使用
する抗体産生細胞としてはYIT4065株の(死)菌体を免疫
された動物の脾臓細胞が好ましい。前記の抗体産生細胞
及びミエローマ細胞としては、これらが融合可能な限り
において供給源である動物の種類を特定する必要はない
が、融合効率や抗体産生の安定性の面からみて同じ種族
の動物由来のものを使用することが望ましい。

【００１７】前記のハイブリドーマのうち、好ましいハ
イブリドーマはYIT4065株の死菌体を免疫したマウスの
脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合させて得ら
れるものであり、その例としては、予めYIT4065株の死
菌体を免疫したＢＡＬＢ／Ｃマウスの抗YIT4065株抗体
産生細胞と、ＢＡＬＢ／Ｃマウスのミエローマ細胞との
融合ハイブリドーマが挙げられる。

【００１８】細胞融合直後には、他種類の抗体を産生す
るハイブリドーマが混ざり合っている。そこで、YIT406
5株及びその関連株の抗原決定部位に対し特異性を示す
抗体を産生する細胞を選択(スクリーニング)し、目的と
する抗体産生細胞を得る必要がある。抗体の検出にはVo
llerら[Bull.WHO.,53巻,55-56頁,(1976)]が報告してい
る酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ法)が好ましく用いられ
る。

【００１９】スクリーニングについて、更に具体的に説
明すると、組織培養プレート、例えば96穴マイクロタイ
タープレートの穴壁に固定化したYIT4065株抗原にハイ
ブリドーマ培養液又はハイブリドーマを接種したマウス
の腹水を加え、次いで、これにペルオキシダーゼを標識
した抗マウス抗体を加えた後、そのペルオキシダーゼ活
性をオルトフェニレンジアミン(ＯＰＤ)の発色で検定す
る。このＯＰＤの発色は抗体の存在を意味する。ハイブ
リドーマ培養液及びその濃縮液、あるいはハイブリドー
マを接種した腹水の抗YIT4065株抗体の力価は、ＯＰＤ
の発色(吸光度492nmにおける測定値)が0.5又は1.0を与
える検体の最終希釈倍率で求められる。ＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスのミエローマ細胞の培養液並びに同細胞をＢＡＬＢ
／Ｃマウスに接種して得られる血清及び腹水は、YIT406
5株に対する抗体活性を有していない。

【００２０】YIT4065株に対するモノクローナル抗体の
製造は、前記の抗体産生クローン(ハイブリドーマ)を培
地中において、又は組織適合性動物もしくはヌードマウ
ス等の免疫不全動物の体内において維持生育させること
により行われる。又は、動物の血清もしくは腹水から回
収される[回収方法に関しては、例えば、岩崎辰夫ら、
単クローン抗体,88-94頁(1983)参照]。

【００２１】次に、こうして得たYIT4065株特異的モノ
クローナル抗体を用い、YIT4065株をより簡便に検出す
るために必要なモノクローナル抗体の担体を検討した。
吸着させる担体としては、ラテックス粒子及びコロイド
金粒子を用いることとし、感作ラテックス及び感作コロ
イド金を作成した。ラテックス粒子への抗体の感作はTs
uda,S.らの方法に従った(Tsuda,S.et al.,Plant Diseas
e,76,466-469,(1992))。また、コロイド金粒子は自作
し、後に示す方法を用いて抗体の感作を行った。

【００２２】感作ラテックス作製に使用するラテックス
粒子としては、比重が1.0〜1.5g/cc、好ましくは1.5g/c
c前後の高比重ラテックス粒子が好適なものとして用い
られ、更に、平均粒子径は約0.1〜2.0um、好ましくは1.
0um前後のラテックス粒子か好適なものとして用いられ
る。

【００２３】このようなラテックス粒子としては、例え
ば、バクトラテックス0.81(Difco社製、平均粒子径0.81
um、比重1.0g/cc)、及びH0901、H0902、H2002(日本合成
ゴム社製、平均粒径・比重は、各々、0.94um・1.5g/cc、0
・98um・1.5g/cc、2.22um・1.5g/cc)等の市販製品が例示さ
れるが、これに限らず、これらと同効のものであればそ
の種類を問わず使用することが可能である。

【００２４】また、コロイド金粒子とは、金粒子がコロ
イド状に会合した赤色の会合コロイドのことである。感
作コロイド金の作製に用いるコロイド金としては、平均
粒子径が0.01um〜0.02um程度が好適である。しかしなが
ら、この範囲外のものであっても金粒子がコロイドを形
成できる範囲内であれば使用可能である。

【００２５】前記のようにして得られたYIT4065株特異
的モノクローナル抗体及び該抗体で感作されたラテック
スもしくはコロイド金を用い、免疫学的手法によりYIT4
065株の同定を行ったところ、一長一短はあるものの、
感作コロイド金を用いた系が最も好適であると思われ
た。担体の吸着を行っていないモノクローナル抗体を用
いると、作業時間がかかりすぎてしまい、感作ラテック
スを使用した場合には自己凝集が起こりにくく、短時間
で検出を行えるなどの長所はあるが、洗浄時に担体が固
相から引き離されてしまうこともあった。これに対し、
感作コロイド金を使用すると、ラテックスよりもバック
がきれいで、抗原−抗体複合体が安定しており、操作も
簡便であった。また、コロイド金は容易に作製できるの
で、自己で作ったコロイド金を用いれば、ラテックス等
よりもコスト安である。尚、ラテックス粒子としては種
々の色彩を持つものを使用できるので、細菌叢の解析等
色の組合せを用いると便利な場合には、感作ラテックス
が好適である。

【００２６】本発明において作成したモノクローナル抗
体は、ＥＬｌＳＡ法等により菌株の同定、定量に用いる
ことができる。また、本発明の感作ラテックスを用いれ
ば、感作ラテックスと比験サンプルとをスライドグラス
上で混合し、光学顕微鏡下に凝集像の正否を判断する方
法(顕微鏡ラテックス法〉等様々な同定、定量方法を行
える。

【００２７】また、本発明で用いた、感作コロイド金を
用いた菌株検出の簡便法(コロイド金法)は以下のような
ものである。即ち、ニトロセルロース膜等にYIT4065株
及び(同菌種の)他菌株をスポットし、これに本発明の感
作コロイド金を反応させた後洗浄を行うと、YIT4065株
をスポットした部分のみが染色され、コロイド金由来の
赤い発色が認められるのである。スポットする際に、発
酵乳のような他種類の菌種や成分を含む溶液を直接用い
ても、菌株を特異的に検出できる。このような検出方法
によれば、簡便、迅速且つ安価に菌株を検出することが
可能であり、作業者の熟練もさほど必要はない。また、
感作コロイド金は前記の他にも従来感作ラテックス等で
行われていた検出方法等にも好適に使用できる。

【００２８】

【実施例】

実施例１．ハイブリドーマの作製及び腹水抗体の製造純粋培養したビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidob
acterium breve)ＹＩＴ４０６５株を生理食塩水にて洗
浄し、次いで、吸光度660nmでの値が0.5となるように生
理食塩水に懸濁した。得られた懸濁液0.2mlをＢＡＬＢ
／Ｃマウスの尾静脈に注射し、10日後にも同様に調製し
た懸濁液0.2mlを追加注射した。更に、10日毎に合計で
４〜５回懸濁液を注射した。マウスを屠殺する前に、同
様に調製した懸濁液0.2mlを注射し最終免疫とした。最
終免疫後４日目にマウスを殺して脾臓を摘出し、その脾
臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地(シグマ社製)に懸濁させ
た。脾臓細胞浮遊液を塩化アンモニウムの0.82％水溶液
で室温で10分間処理した後、無血清培地中で遠心分離(2
50×ｇ)により２回洗浄し、次いで、無血清培地中に懸
濁させた。

【００２９】一方、ミエローマ細胞を牛胎児血清が15％
含まれるＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた後、無血清
培地で遠心分離により２回洗浄し、次いで、無血清培地
に懸濁させた。懸濁状態の脾臓細胞4.0×10⁷個とミエロ
ーマ細胞1.0×10⁷個とを混合した後、遠心分離して沈査
とし、これにポリエチレングリコール6000を45％含む無
血清培地を１ml加え、６分間、37℃で細胞を融合させ
た。得られた細胞混合物を無血清培地での遠心分離によ
り洗浄した後、牛胎児血清を15％含むＲＰＭＩ１６４０
培地中に1.0×10⁵膵臓細胞／mlとなるように浮遊させ、
その0.1mlを96穴プラスティックマイクロタイタープレ
ートに分注し、７％炭酸ガス存在下のインキュベーター
中に培養した。

【００３０】培養開始１日目にＨＡＴ培地を0.1ml加
え、２日目、４日目、７日目、10日目には培養液の半分
を吸引し、その代わりにＨＡＴ培地を追加した。96穴プ
ラスティックマイクロタイターブレート60〜90％の培養
穴に１穴あたり平均１〜２個のハイブリドーマの集落が
生育した。ハイブリドーマが充分増殖した時点(培養開
始より約２週間後)で、培養上清のYIT4065株に対する抗
体力価をＥＬＩＳＡ法で検定した。総計309穴中139穴の
ハイブリドーマ培養上清にYIT4065株に対する抗体が認
められた。抗体を産生している各穴のハイブリドーマに
ついて、限界希釈法によるクローニング操作２回繰り返
し行った。かくして、抗体を安定に産生するクローン１
株を単離し４Ａと命名した。このクローンについて培養
液、腹水及び硫安沈殿画分よりYIT4065株特異的モノク
ローナル抗体を得た。尚、このクローンのアイソタイプ
はＩｇＭであった。このクローン４Ａは受託番号FERM P
-16296として工業技術院生命工学工業技術研究所に平成
９年７月１日付けで寄託されている。

【００３１】実施例２．モノクローナル抗体の特異性の
確認 (2-1)モノクローナル抗体マウスモノクローナル抗体として、ビフィドバクテリウ
ム・ブレーベＹＩＴ４０６５株及びその関連株に特異的
な４Ａを使用した。ハイブリドーマクローンの細胞培養
上清、あるいは部分精製したものをモノクローナル抗体
試料として実験に用いた。

【００３２】(2-2)菌体抗原ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium bre
ve)ＹＩＴ４０６５株(FERM P-15488)、その親株である
ＹＩＴ４０１０株及び該菌株が属する又は属さない種の
標準菌株を使用した。詳しくは、ビフィドバクテリウム
・ブレーベＹＩＴ４０１４(ATCC 15700)株、ＹＩＴ４０
１５(ATCC 15698)株、ＹＩＴ４０４９(ATCC 15701)株、
Ａａ-５０株、Ｌａ-１株、Ｎａ-２５株、ビフィドバク
テリウム・ビフィダム(B.bifidum)ＹＩＴ４００７(FERM
BP-791)株、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス
(B.adolescentis)ＹＩＴ４０１１(ATCC 15703)株、ビフ
ィドバクテリウム・インファンティス(B.infantis)ＹＩ
Ｔ４０１８(ATCC 15697)株、ビフィドバクテリウム・ロ
ンガム(B.longum)ＹＩＴ４０２１(ATCC 15707)株、ＹＩ
Ｔ４０３７(ATCC 15708)株、ビフィドバクテリウム・ビ
フィダム(B.bifidum)ＹＩＴ４０３９(IFO 14252)株、ビ
フィドバクテリウム。・アニマリス(B.animalis)ＹＩＴ
４０４４(JCM 1190)株、ラクトバシラス・カゼイ(Lacto
bacillus casei)ＹＩＴ９０２９(FERM BP-1366)株であ
る。

【００３３】(2-3)ＥＬＩＳＡ法上記の菌体抗原各々について純粋培養したものを、1.0
×10⁹/ml程度に希釈し、その0.1mlを96穴マイクロタイ
タープレートの各穴中に分注し、37℃で２時間コーティ
ングを行った。次にプレート上の各穴をＥＬＩＳＡ用洗
浄液(ＰＢＳにTriton X-100を0.05%添加したもの)にて
３回洗浄し、ブロッキング剤(ブロッキングエース、大
日本製薬社製)を添加して、抗原未吸着部分を被膜し
た。被膜処理は37℃で１時間行った。これをＥＬＩＳＡ
用洗浄液にて３回洗浄し、１次抗体として抗体４Ａを各
プレート毎に添加し、37℃で１時間半反応させた。更
に、３回洗浄を行い、２次抗体として酵素(ペルオキシ
ダーゼ)標識抗マウス免疫グロブリン抗体(Cappel)を37
℃で１時間半反応させた。３回洗浄をした後、発色(光)
基質(オルトフェニレンジアミン(ＯＰＤ))を添加して、
その発色の度合いから、各抗原と４Ａとの反応性を確認
した。

【００３４】実験に供した菌株は、基準株や当社におい
て継代培養された既知の株であり、これらがYIT4065株
の関連株又は別系統の株であることは判っている。そこ
で、この知見を元に、ＥＬＩＳＡ法の結果を検討したと
ころ、同一の結果が得られ、クローン４ＡはYIT4065株
及びその関連株に特異的であった。結果を次の表１に示
す。表１において、＋は抗体の結合があるもの、−は抗
体の結合がないものを指す。

【００３５】

【表１】

【００３６】実施例３．着色担体微粒子への抗体感作 (3-1)感作ラテックス作製図１は抗体感作着色ラテックスの調製工程及びそれを用
いた菌体検出工程を示す説明図である。着色ラテックス
としては、ピンク色に着色されたラテックス粒子(IMMUT
EX,G0304R,0.30μm,日本合成ゴム)を使用した。ラテッ
クス粒子への抗体の感作は、Tsuda,S.らの方法に従い、
図１に示す通り、0.02Mトリス緩衝食塩水(pH7.2，0.15M
NaCl、以下「ＴＢＳ」と記す)で１％に調製したラテッ
クス溶液と、ＴＢＳにて0.5mg/mlに調製したモノクロー
ナル抗体溶液とを等量ずつ混合し、時々撹拌しながら室
温で２時間静置した。牛血清アルブミン(「ＢＳＡ」と
記す)を1％添加したＴＢＳにてラテックス粒子を遠心洗
浄(３回)後、同溶液にラテックス粒子を1％となるよう
に懸濁した。これを抗体感作着色ラテックスとし、ＴＢ
Ｓにて1/20〜1/40(ラテックス濃度0.025〜0.05％)に希
釈して使用に供する。

【００３７】(3-2)感作コロイド金の作製免疫反応用コロイド金は自作した。まず純水(ミリＱ水
を0.22μmのフィルターで濾過したもの)を用意し、使用
する全ての器具をよく洗浄した。塩化金酸(添川理化学
社製)の0.01％溶液を純水にて調製し、三角フラスコに
入れてガスバーナーで加熱した。溶液が沸騰したら、1/
20容の１％クエン酸三ナトリウム溶液(純水にて調製)を
加えて５分間加熱を続けた。もう一度1/20容の１％クエ
ン酸三ナトリウム溶液を加え、更に10分間加熟して火を
止めた。こうして出来上がったコロイド金は赤銅色をし
ていた。コロイド金溶液は防腐剤等を添加せずに、密封
して使用時まで５℃に保存した。

【００３８】図２は抗体感作コロイド金の調製工程及び
それを用いた菌体検出工程を示す説明図である。図２に
示すように、コロイド金粒子への抗体の感作は、前記で
作成したコロイド金溶液と、ＰＢＳ(0.22μmのフィルタ
ーで濾過したもの)で0.1〜1mg/mlに調製したモノクロー
ナル抗体溶液を等量ずつ混合し、室温で２時間以上静置
した。10％ＢＳＡ溶液を1/20容加えた後、遠心(12,000r
pm、30分間)してコロイド金粒子を沈殿として回収し
た。0.1％ＢＳＡ、0.2％ポリエチレングリコール及び0.
1％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳにコロイド金粒子を
懸濁(0.01％:もとのコロイド金溶液の濃度)したもの
を、抗体感作コロイド金として実験に用いた。

【００３９】実施例４．感作コロイド金を使用したYIT4
065株の簡便検出 (4-1)モノクローナル抗体実施例３で作製した４Ａ感作コロイド金を使用した。

【００４０】(4-2)菌体抗原ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９(FERM BPカゼイ
ＹＩＴ０２０９(NCDO151）株、ビフィドバクテリウム・
ブレーベＹＩＴ４０６５(FERM P-15488)株、ビフィドバ
クテリウム・ブレーベＹＩＴ４０１４(ATCC 15700）
株、ビフィドバクテリム・ビフィダムＹＩＴ４００７(F
ERM BP-791)株、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹ
ＩＴ４０３９(IFO 14252）株を使用した。

【００４１】(4-3)コロイド金法による検出図３はコロイド金法による検出操作を模式的に示す説明
図であり、ａ図はニトロセルロース膜への菌株のスポッ
トを示し、ｂ図は染色後の状態を示す説明図である。図
３のａ図に示す通り、前記の６菌株をニトロセルロース
膜(40)上にスポットした。図において、点線で囲まれた
(41)はラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９株、(42)
はビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５株、
(43)はビフィドバクテリム・ビフィダムＹＩＴ４００７
株、(44)はラクトバチルス・カゼイＹＩＴ０２０９株、
(45)はビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０１４
株、(46)はビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ４
０３９のスポットを示す。

【００４２】ニトロセルロースフィルターをブロッキン
グした後、水で１回洗浄し、各スポットへ４Ａ感作コロ
イド金を反応させた。これを水で１回洗浄したところ、
図３のｂ図に示す通り、４Ａに特異的なビフィドバクテ
リム・ブレーベＹＩＴ４０６５のスポット(42)のみが染
色されていた。

【００４３】実施例５．感作コロイド金を使用した乳製
品中のYIT4065株の検出糖質、タンパク質等の菌体以外の成分の混ざった溶液中
でも４Ａ感作コロイド金を用いたYIT4065株の検出が可
能であるかを検討するため、以下の実験を行った。

【００４４】まず、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹ
ＩＴ４０６５株を10⁸/ml含有)を10倍毎に段階希釈し、
これらをニトロセルロースフィルター上へスポットす
る。これに４Ａ感作コロイド金を室温10分間反応させ、
水で１回洗浄を行った。図４は希釈率を変化させた場合
のYIT4065株の検出結果を示す説明図であり、図におい
て、(50)はニトロセルロースフィルター、(51)は10倍希
釈のスポット、(52)は100倍希釈のスポット、(53)は100
0倍希釈のスポットを示す。コロイド金による発色の有
無を検討したところ、100倍希釈(菌数として10⁶/ml)で
検出可能であった。尚、より高倍率の希釈を行っても検
出可能にするためにはアルカリによるミルク成分の可溶
比等の処理も有用であると思われた。

【００４５】実施例６．感作コロイド金を使用した糞便
中のＹＩＴ４０１０株の検出糞便中でも４Ａ感作コロイド金を用いたYIT4065株関連
株の検出が可能であるかを検討するため、以下の実験を
行った。

【００４６】超未熟児(３名)に対し、ＹＩＴ４０１０株
を５×10⁸/日の投与を行い、その糞便を採取した。更に
非投与群(３名)の糞便も採取した。各糞便をＰＢＳで希
釈した溶液及び陽性コントロールとしてのＹＩＴ４０１
０株希釈液をニトロセルロースフィルター上にスポット
した。これに４Ａ感作コロイド金を室温10分間反応さ
せ、水で１回洗浄を行った。コロイド金による発色の有
無を確認した結果を次の表２に示す。表２に示すとお
り、投与群及び陽性コントロールの糞便からＹＩＴ４０
１０株が検出された。

【００４７】

【表２】

【００４８】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体を用いれ
ば、YIT4065株及びその関連株を簡便且つ迅速に検出す
ることが可能となる。YIT4065株及びその関連株は食
品、医薬品等に供されている有用微生物であるので、そ
の検出が簡便、迅速に行われれば、生体への作用の確認
等様々な研究を補助できる。

【００４９】また、本発明のモノクローナル抗体産生融
合細胞を用いれば、前記モノクローナル抗体が容易に作
出できる。更に、モノクローナル抗体等で感作した感作
コロイド金を使用すれば、従来の免疫学的手法よりも簡
便、迅速且つ安価に微生物を検出することができる。前
記のYIT4065株特異的モノクローナル抗体を用いれば、Y
IT4065株及びその関連株のみを検出できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】抗体感作着色ラテックスの調製工程及びそれを
用いた菌体検出工程を示す説明図である。

【図２】抗体感作コロイド菌の調製工程及びそれを用い
た菌体検出工程を示す説明図である。

【図３】コロイド金法による検出操作を模式的に示す説
明図であり、ａ図はニトロセルロース膜への菌株のスポ
ットを示し、ｂ図は染色後の状態を示す説明図である。

【図４】希釈率を変化させた場合のYIT4065株の検出結
果を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/553 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者大脇眞東京都港区東新橋１丁目１番19号株式会社ヤクルト本社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifid
obacterium breve)ＹＩＴ４０６５株及びその関連株を
特異的に認識するビフィドバクテリウム・ブレーベ用モ
ノクローナル抗体。
【請求項２】請求項１記載のビフィドバクテリウム・
ブレーベ用モノクローナル抗体を産生することを特徴と
する融合細胞(ハイブリドーマ)。
【請求項３】請求項１記載のビフィドバクテリウム・
ブレーベ用モノクローナル抗体にコロイド金粒子を吸着
させたことを特徴とする抗体感作コロイド金。
【請求項４】請求項３のコロイド金を用意し、被検抗
原群に前記抗体感作コロイド金を反応させた後、洗浄し
て抗体感作コロイド金が固着した赤色の被検抗原を目視
により検出することを特徴とする抗原の検出方法。