JPH11311625A - Simple antibody-value measuring method and reference antibody for detection of anti-parvovirus antibody - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an anti-Parvovirus antibody-value measuring method, which eliminates a deficiency of reproducibility in an anti-Parvovirus antibody detection method by a latex reagent, using an agglutination causing a time- dependent change and in which the antibody value of a precise anti-Parvovirus antibody can be detected surely and simply and to provide a reference antibody for the detection of anti-Parvovirus antibody. SOLUTION: In this method, an antibody value in a blood serum to be inspected is measured, in which an aggregation image obtained in such a way that fine particles in which an antibody is fixed are mixed with a mixture of a reference antibody and a reference antigen is compared with an aggregation image obtained so that the fine particles in which the antibody is fixed are mixed with a mixture of the blood serum, to be inspected and the reference antigen, and the antibody value of the blood serum to be inspected is evaluated. The reference antibody is used to detect the anti-Parvovirus antibody and indicates a prescribed antibody value.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、特にワクチン接種
のための診断において重要な抗犬パルボウイルス抗体、
抗猫汎白血球減少症ウイルス抗体、及び抗豚パルボウイ
ルス抗体等の抗体価を簡便にかつ正確に測定する方法に
関する。また、本発明は、所定の抗体価を示す抗犬パル
ボウイルス抗体、抗猫汎白血球減少症ウイルス抗体、及
び抗豚パルボウイルス抗体等の検出用参照抗体に関す
る。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to anti-canine parvovirus antibodies, which are of particular importance in diagnosis for vaccination,
The present invention relates to a method for simply and accurately measuring antibody titers of anti-feline panleukopenia virus antibody and anti-porcine parvovirus antibody. The present invention also relates to a reference antibody for detection, such as an anti-dog parvovirus antibody, an anti-feline panleukopenia virus antibody, and an anti-porcine parvovirus antibody, which exhibit a predetermined antibody titer.

【０００２】[0002]

【従来の技術】パルボウイルスは、動物疾病の通常の病
因である。パルボウイルスの例としては、犬パルボウイ
ルス、猫パルボウイルスの亜種である猫汎白血球減少症
ウイルス、及び豚パルボウイルス等が挙げられる。BACKGROUND OF THE INVENTION Parvovirus is a common etiology of animal disease. Examples of parvoviruses include canine parvovirus, feline panleukopenia virus, a subspecies of feline parvovirus, and swine parvovirus.

【０００３】犬パルボウイルスは、大変強いウイルス
で、６０℃で１時間処理しても死滅しない。また、犬パ
ルボウイルスはアルコール、クレゾール、逆性石鹸など
にも耐性がある。従って、環境中に***された犬パルボ
ウイルスは数ヶ月以上生存可能であり、その間飼育環境
を汚染しつづける。[0003] Dog parvovirus is a very strong virus and does not die even after treatment at 60 ° C for 1 hour. Dog parvovirus is also resistant to alcohol, cresol, inverse soap and the like. Therefore, canine parvovirus excreted in the environment can survive for more than a few months, during which time it continues to contaminate the rearing environment.

【０００４】犬パルボウイルスは、犬の品種や年齢に関
係なく感染し、急性腸炎や心筋炎を引き起こす。幼犬に
多い過急性感染では、発症後１日程度で死亡するものも
ある。また、８週齢未満で感染したものは、心臓にウイ
ルスが感染し、心筋炎で死亡するものもいる。[0004] Canine parvovirus is transmitted regardless of the breed and age of the dog, causing acute enteritis and myocarditis. Some hyperacute infections among puppies die about 1 day after onset. In addition, those infected before the age of 8 weeks are infected with the virus in the heart and some die of myocarditis.

【０００５】このように、犬パルボウイルスは、特に幼
弱犬では死亡率が高い。また、感染性も強いため、犬の
伝染性ウイルスの中でも特に重要視されている。現在、
犬パルボウイルスの感染予防としてワクチン接種が行わ
れている。しかし、このワクチンは、母犬からの移行抗
体（抗犬パルボウイルス抗体）が豚赤血球凝集抑制価の
単位ＨＩで８ＨＩ以上あると効果がない。従って、ワク
チン接種前に、血清中の抗犬パルボウイルス抗体を測定
し、抗体価が８ＨＩ以下であることを確認することが必
要である。[0005] As described above, canine parvovirus has a high mortality, especially in young dogs. It is also highly infectious and is therefore regarded as particularly important among infectious viruses in dogs. Current,
Vaccination has been performed to prevent transmission of canine parvovirus. However, this vaccine has no effect if the transfer antibody (anti-dog parvovirus antibody) from the mother dog is 8 HI or more, which is the unit of porcine hemagglutination inhibition titer HI. Therefore, before vaccination, it is necessary to measure the anti-dog parvovirus antibody in the serum and confirm that the antibody titer is 8 HI or less.

【０００６】また、ワクチンを接種しても抗体価の上が
らない個体や、抗体ができても抗体価が低い（８〜２５
６ＨＩ）個体は感染を防ぐことはできない。確実に感染
及び発症の防御をするためには５１２ＨＩ以上の抗体価
が必要である。そのため、ワクチン接種後も抗体価を測
定する必要がある。[0006] In addition, an individual whose antibody titer does not increase even after inoculation with the vaccine, or an antibody that has an antibody titer is low (8 to 25)
6HI) Individuals cannot prevent infection. An antibody titer of 512 HI or more is required to reliably protect against infection and onset. Therefore, it is necessary to measure the antibody titer even after vaccination.

【０００７】更に研究の分野においては、８ＨＩ以下の
抗体を計ることは、ワクチン接種の最適時期を研究する
上で重要と考えられる。また、ワクチン接種では抗体価
が数千ＨＩ程度とあまり上がらないが、野外株に感染す
ると抗体価が万単位ＨＩを示すとの情報もある。従っ
て、５１２ＨＩ以上の抗体を測ることは、野外株に感染
したのかワクチンにより抗体価が上がったのかを区別す
る一つの手段を提供するとも考えられる。[0007] Further, in the field of research, measuring antibodies below 8HI is considered important in studying the optimal time of vaccination. In addition, there is information that the antibody titer does not rise so much as several thousands HI in vaccination, but the antibody titer shows 10,000 units HI when infected with a field strain. Therefore, measuring antibodies of 512 HI or more may provide one means of distinguishing between infection with a field strain and an increase in antibody titer by a vaccine.

【０００８】猫汎白血球減少症は、猫パルボウイルスの
亜種である猫汎白血球減少症ウイルスの感染症である。
この猫汎白血球減少症ウイルスには全ての年齢の猫が感
染する。症状としては、著明な白血球減少、発熱、嘔吐
や下痢を主徴とする症状を呈する。特に、弱齢猫ほど典
型的な症状を呈し、斃死率も高い。[0008] Feline panleukopenia is an infection of feline panleukopenia virus, a subspecies of feline parvovirus.
The feline panleukopenia virus infects cats of all ages. Symptoms include marked leukopenia, fever, vomiting and diarrhea. In particular, younger cats have more typical symptoms and higher mortality.

【０００９】猫汎白血球減少症ウイルスによる感染の予
防には、ワクチンが有効である。犬と同様に、効果的な
ワクチン接種の判断とワクチンによる効果の把握のため
にワクチン接種前後の抗体価を知ることは重要である。[0009] Vaccines are effective in preventing infection by feline panleukopenia virus. As with dogs, it is important to know the antibody titers before and after vaccination in order to determine effective vaccination and understand the effects of the vaccine.

【００１０】豚パルボウイルスは、畜産産業上重要な家
畜である豚を宿主とするパルボウイルスである。豚パル
ボウイルスが妊娠している豚に感染すると死流産をおこ
す。そのため、効果的なワクチン接種とワクチンの効果
の把握が必要であり、ワクチン接種前後の抗体価を知る
ことは重要である。[0010] Porcine parvovirus is a parvovirus that uses pigs, which are important livestock in the livestock industry, as hosts. Swine parvovirus infects pregnant pigs and causes abortion. Therefore, effective vaccination and understanding of the effects of the vaccine are necessary, and it is important to know the antibody titers before and after vaccination.

【００１１】従来、これらのワクチン接種のための抗パ
ルボウイルス抗体検出法としては、赤血球凝集抑制反応
法が用いられてきた。しかし、この方法は測定に１昼夜
かかる。このため赤血球凝集抑制反応法を臨床の場で利
用することは困難であった。Heretofore, as a method for detecting anti-parvovirus antibodies for vaccination, hemagglutination inhibition reaction has been used. However, this method takes one day and night to measure. Therefore, it has been difficult to use the hemagglutination inhibition reaction method in a clinical setting.

【００１２】従って、臨床の場で簡便にかつ短時間で犬
パルボウイルス、猫汎白血球減少症ウイルス、及び豚パ
ルボウイルス等に対する抗体の抗体価を測定する方法及
び診断薬の開発が望まれていた。[0012] Accordingly, there has been a demand for a method for measuring the antibody titer of an antibody against canine parvovirus, feline panleukopenia virus, swine parvovirus, etc., conveniently and in a short time in a clinical setting, and development of a diagnostic agent. .

【００１３】そこで、ラテックス試薬を用いた検出方法
（特開平８−１３６５４５号公報）が開発された。この
方法は抗原抗体反応の凝集反応に着目し、臨床の場で簡
便かつ短時間で抗体価の測定を行うことを可能にした。
しかし、凝集反応は、経時的変化を伴うものであり、抗
原と被検血清を反応させる時間によっても得られる抗体
価は変化するため、反応時間を厳密に管理する必要があ
った。それだけでなく、陽性対照として用いる抗原の濃
度設定により、結果として得られる抗体価が変化すると
いう欠点があった。また、抗原と被検血清の反応の後、
得られた混合物とラテックス試薬との反応においても反
応時間を厳密に管理する必要があった。従って、ラテッ
クス試薬を用いた従来法は、実用上高い再現性を得にく
く、正確かつ確実な抗体価を簡便に測定することは容易
ではなく、改善の余地があった。Accordingly, a detection method using a latex reagent (JP-A-8-136545) has been developed. This method focuses on the agglutination reaction of the antigen-antibody reaction, and makes it possible to measure the antibody titer easily and in a short time in a clinical setting.
However, the agglutination reaction involves a change over time, and the antibody titer obtained also changes depending on the time for reacting the antigen with the test serum. Therefore, it is necessary to strictly control the reaction time. In addition, there is a disadvantage that the resulting antibody titer changes depending on the concentration of the antigen used as a positive control. After the reaction between the antigen and the test serum,
In the reaction between the obtained mixture and the latex reagent, it was necessary to strictly control the reaction time. Therefore, in the conventional method using a latex reagent, it is difficult to obtain practically high reproducibility, and it is not easy to measure an accurate and reliable antibody titer easily, and there is room for improvement.

【００１４】[0014]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、経時
的変化を伴う凝集反応を用いたラテックス試薬による抗
パルボウイルス抗体検出法における再現性の乏しさを解
決し、正確な抗パルボウイルス抗体の抗体価を確実に及
び簡便に検出することができる抗パルボウイルス抗体検
出用試薬及び抗パルボウイルス抗体価測定方法を提供す
ることにある。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to solve the problem of poor reproducibility in a method for detecting an anti-parvovirus antibody using a latex reagent using an agglutination reaction which changes with time, and to provide an accurate anti-parvovirus antibody. It is an object of the present invention to provide a reagent for detecting an anti-parvovirus antibody and a method for measuring an anti-parvovirus antibody titer, which can surely and easily detect the antibody titer.

【００１５】[0015]

【課題を解決するための手段】抗体価測定方法 被検血清中の抗体価を測定する本発明の方法は、以下の
工程により行われる。参照抗体と参照抗原との混合物に
抗体を固定化した微粒子（以下、抗体固定微粒子とい
う）を混合することにより得られる凝集像と、被検血清
と上記参照抗原との混合物に上記抗体固定微粒子を混合
することにより得られる凝集像を比較し、被検血清の抗
体価を評価することにより被検血清中の抗体価を測定す
る。Means for Measuring Antibody Titer The method of the present invention for measuring an antibody titer in a test serum is carried out by the following steps. An agglutination image obtained by mixing antibody-immobilized microparticles (hereinafter, referred to as antibody-immobilized microparticles) with a mixture of a reference antibody and a reference antigen, and the antibody-immobilized microparticles in a mixture of a test serum and the reference antigen Aggregation images obtained by mixing are compared, and the antibody titer of the test serum is measured by evaluating the antibody titer of the test serum.

【００１６】＜材料とその調製＞参照抗体は、例えば、
検出する抗体と同じ種類の抗体を所定の抗体価を示すよ
うに緩衝液で希釈することにより作製したものであるこ
とができる。<Material and its preparation> The reference antibody is, for example,
It can be prepared by diluting an antibody of the same type as the antibody to be detected with a buffer so as to exhibit a predetermined antibody titer.

【００１７】抗体としては、抗原と結合し凝集を生成す
るものであればどの種類の抗体も用いることができ、例
えば、抗原がパルボウイルスの場合は、パルボウイルス
と凝集反応を示す抗パルボウイルス抗体を用いることが
できる。具体的には、例えば、抗犬パルボウイルス抗
体、猫汎白血球減少症ウイルス抗体、及び豚パルボウイ
ルス抗体等を使用することができる。As the antibody, any type of antibody can be used as long as it binds to the antigen and forms aggregation. For example, when the antigen is a parvovirus, an anti-parvovirus antibody showing an agglutination reaction with the parvovirus Can be used. Specifically, for example, anti-dog parvovirus antibody, feline panleukopenia virus antibody, and swine parvovirus antibody can be used.

【００１８】抗体は、マウスやラットのモノクローナル
抗体として得たもの、抗原に感染した動物の血清から精
製したもの、又は抗原を動物、例えば、ウサギ、羊、山
羊、馬、ニワトリ、モルモット等の体内に投与すること
により、その動物を免疫化して得られるポリクローナル
抗体を用いることができる。検出する抗体が抗パルボウ
イルス抗体の場合、抗体としては、例えば、犬パルボウ
イルス感染犬から採取した抗犬パルボウイルス抗体を含
む血清、ウサギ又は羊等の動物に犬パルボウイルスを投
与して免疫化して得られた抗犬パルボウイルス抗体を含
む血清、又は犬パルボウイルスモノクローナル抗体（マ
ウス）等を挙げることができる。The antibody may be obtained as a mouse or rat monoclonal antibody, purified from the serum of an animal infected with the antigen, or the antigen may be obtained from an animal such as a rabbit, sheep, goat, horse, chicken, guinea pig or the like. , A polyclonal antibody obtained by immunizing the animal can be used. When the antibody to be detected is an anti-parvovirus antibody, the antibody may be, for example, a serum containing an anti-dog parvovirus antibody collected from a dog infected with dog parvovirus, or immunization by administering dog parvovirus to an animal such as a rabbit or sheep. And a serum containing an anti-dog parvovirus antibody obtained in this manner, or a dog parvovirus monoclonal antibody (mouse).

【００１９】抗体を希釈するために使用する緩衝液とし
ては、抗原抗体反応を阻害しない緩衝液であればいずれ
も使用することができる。更には安定剤として牛血清ア
ルブミンやゼラチン等を含むpH6.0〜8.0の緩衝液等を使
用することができる。具体的には、例えば、0.15M NaC
l、0.2％ BSA、０．１％ NaN₃を含む0.01Mリン酸緩衝食
塩液（pH7.4）の緩衝液を用いることができる。As the buffer used for diluting the antibody, any buffer can be used as long as it does not inhibit the antigen-antibody reaction. Further, a buffer having a pH of 6.0 to 8.0 containing bovine serum albumin, gelatin or the like can be used as a stabilizer. Specifically, for example, 0.15M NaC
l, a buffer of 0.01 M phosphate buffered saline (pH 7.4) containing 0.2% BSA and 0.1% NaN ₃ can be used.

【００２０】参照抗体の抗体価は被検血清の抗体価を考
慮して適宜設定することができる。本発明において抗体
価は種々の表記法で表わすことができる。抗体価表記法
については特に限定はなく、公知の方法、例えば、赤血
球凝集抑制試験（M. Senda、NIIirayama、 II. Yamamot
o and K. Kurata.、1986. An Improved hemagglutinati
on test for study of canine parrovirus、 Vet. micr
obiol、 12:1-6）により得られる結果を用いる表記法
(単位ＨＩ)等を使用することができる。The antibody titer of the reference antibody can be appropriately set in consideration of the antibody titer of the test serum. In the present invention, the antibody titer can be represented by various notations. There is no particular limitation on the antibody titer notation, and known methods such as a hemagglutination inhibition test (M. Senda, NIIirayama, II. Yamamot
o and K. Kurata., 1986.An Improved hemagglutinati
on test for study of canine parrovirus, Vet.micr
obiol, 12: 1-6)
(Unit HI) can be used.

【００２１】赤血球凝集抑制試験を用いる場合、赤血球
の凝集が認められた最大希釈倍数の逆数である赤血球凝
集抑制価（ＨＩ）により抗体価を表記することができ
る。参照抗体が有すべき所定の抗体価としては、例え
ば、臨床の場における感染及び発症の診断のための８、
３２、１２８及び５１２ＨＩを挙げることができる。８
ＨＩの抗体価を持つ参照抗体は、抗犬パルボウイルスの
ワクチンの効果を得るための基準となるため、抗犬パル
ボウイルスのワクチン接種の可否判断に用いることがで
きる。また、そのワクチン接種後、その効果を判断する
ために、５１２ＨＩの抗体価を持つ参照抗体を用いるこ
とができる。When the hemagglutination inhibition test is used, the antibody titer can be expressed by the hemagglutination inhibition titer (HI), which is the reciprocal of the maximum dilution at which red blood cell agglutination was observed. The predetermined antibody titer that the reference antibody should have is, for example, 8, for diagnosis of infection and onset in a clinical setting.
32, 128 and 512 HI. 8
Since a reference antibody having an HI antibody titer serves as a standard for obtaining the effect of the anti-dog parvovirus vaccine, it can be used to determine whether or not vaccination with the anti-dog parvovirus is possible. After the vaccination, a reference antibody having an antibody titer of 512 HI can be used to determine its effect.

【００２２】参照抗原は、参照抗体に対応する抗原の溶
液である。含有される抗原量は、参照抗体を用いて本発
明に記載の抗体価測定法を行った場合、中程度の凝集像
を生成する程度であることが適当である。The reference antigen is a solution of the antigen corresponding to the reference antibody. It is appropriate that the amount of the contained antigen is such that a medium aggregation image is generated when the antibody titer described in the present invention is performed using the reference antibody.

【００２３】参照抗原は、検出する抗体に対応する抗原
を緩衝液で希釈することにより作製することができる。
まず、緩衝液で希釈した抗原と参照抗体との混合物を抗
体固定微粒子と混合することにより凝集像を得る。得ら
れた凝集像が中程度になるように抗原の希釈溶液の濃度
を調製し、参照抗原を得る。ここで中程度の凝集とは、
比較的観察し易い程度の凝集を言う。更に凝集は短時間
で得られることが好ましく、例えば、抗体固定微粒子を
混合してから1分位で徐々に凝集が認められ、2分位で比
較的観察し易い凝集が得られることが適当である。The reference antigen can be prepared by diluting the antigen corresponding to the antibody to be detected with a buffer.
First, an agglutination image is obtained by mixing a mixture of an antigen and a reference antibody diluted with a buffer solution with antibody-immobilized fine particles. The concentration of the diluted antigen solution is adjusted so that the obtained agglutination image becomes medium, to obtain a reference antigen. Here, medium aggregation means
It refers to aggregation that is relatively easy to observe. Further, aggregation is preferably obtained in a short time.For example, after mixing antibody-immobilized fine particles, aggregation is gradually observed in about one minute, and aggregation that is relatively easily observed in two minutes is appropriate. is there.

【００２４】参照抗原として用いる抗原は、測定する抗
体に対応する抗原である。具体的には、抗犬パルボウイ
ルス抗体に対応する犬パルボウイルス、抗猫汎白血球減
少症ウイルス抗体に対応する猫汎白血球減少症ウイル
ス、及び抗豚パルボウイルス抗体に対応する豚パルボウ
イルス等を用いることができる。The antigen used as the reference antigen is an antigen corresponding to the antibody to be measured. Specifically, a dog parvovirus corresponding to an anti-dog parvovirus antibody, a feline panleukopenia virus corresponding to an anti-feline panleukopenia virus antibody, and a swine parvovirus corresponding to an anti-porcine parvovirus antibody are used. be able to.

【００２５】抗原の作製方法は、特に限定されず、従来
使用されている方法を用いることができる。具体的に
は、ウイルスを培養する方法や直接感染した個体の糞便
から調製する方法等を挙げることができる。The method for producing the antigen is not particularly limited, and a conventionally used method can be used. Specific examples include a method of culturing the virus and a method of preparing the virus from feces of an individual directly infected.

【００２６】例えば、犬パルボウイルスを調製する場合
には以下の方法を使用することができる。パルボウイル
ス感染犬から採取した糞便をPBSで希釈溶解し、その希
釈溶液を遠心する。遠心後、上清を分離し38％の硫安に
より塩析し遠心する。得られた沈査をPBSで溶解する。
得られた溶解液を透析にかけ、その後βプロピオラクト
ン又はホルマリン等でウイルスを不活性化する。得られ
たウイルスの濃度を調節し、抗原を得る。For example, when preparing a dog parvovirus, the following method can be used. Feces collected from a parvovirus-infected dog are diluted and dissolved in PBS, and the diluted solution is centrifuged. After centrifugation, the supernatant is separated, salted out with 38% ammonium sulfate, and centrifuged. The obtained precipitate is dissolved in PBS.
The obtained lysate is dialyzed, and then the virus is inactivated with β-propiolactone or formalin. The concentration of the obtained virus is adjusted to obtain an antigen.

【００２７】緩衝液は、抗原抗体反応を阻害しない緩衝
液であればいずれも使用することができる。更には安定
剤として牛血清アルブミンやゼラチン等を含むpH6.0〜
8.0の緩衝液等を使用することができる。具体的には、
例えば、上記参照抗体作製に用いた緩衝液を使用するこ
とができる。Any buffer can be used as long as it does not inhibit the antigen-antibody reaction. Furthermore, pH 6.0- containing bovine serum albumin and gelatin as stabilizers
8.0 buffer or the like can be used. In particular,
For example, the buffer used for preparing the above-mentioned reference antibody can be used.

【００２８】抗体を固定化した微粒子（抗体固定微粒
子）とは、測定する抗体を微粒子の表面に固定化したも
のをいう。The fine particles on which the antibody is immobilized (antibody-immobilized fine particles) refer to those in which the antibody to be measured is immobilized on the surface of the fine particles.

【００２９】固定化する方法は特に限定はなく、公知の
方法等を使用することができる。固定化の方法の一例と
しては、物理的吸着、グルタールアルデヒドによる強制
固定、又はカルボキシル基若しくはスペーサーを介する
固定等を挙げることができる。The method of immobilization is not particularly limited, and a known method or the like can be used. Examples of the immobilization method include physical adsorption, forced immobilization with glutaraldehyde, and immobilization via a carboxyl group or a spacer.

【００３０】物理的吸着は、微粒子をタンパク質と接触
させることにより行うことができる。接触の方法は特に
問わないが、例えば、混合又は攪拌等を用いることがで
きる。The physical adsorption can be performed by bringing the fine particles into contact with a protein. The method of contact is not particularly limited, and for example, mixing or stirring can be used.

【００３１】抗体固定微粒子の作製に用いる抗体は、検
出しようとしている抗体であって、参照抗体と競合する
ものを使用する。The antibody used for preparing the antibody-immobilized fine particles is the antibody to be detected, which competes with the reference antibody.

【００３２】使用できる微粒子としては、抗原抗体反応
が起る前は均一で、抗原抗体反応の後は視覚的に判定で
きるものであればいずれも使用することができる。微粒
子の大きさは、特に限定はないが、好ましくは、0.2ミ
クロン〜2ミクロン位のものを使用することができる。
微粒子の一例としては、ラテックス、不溶性染色ポリマ
ー、及び赤血球等を挙げることができる。Any fine particles can be used as long as they are uniform before the antigen-antibody reaction occurs and can be visually determined after the antigen-antibody reaction. The size of the fine particles is not particularly limited, but preferably those having a size of about 0.2 μm to 2 μm can be used.
Examples of the fine particles include a latex, an insoluble dyed polymer, and red blood cells.

【００３３】ラテックスとしては、高比重ポリスチレ
ン、カルボキシ化ポリスチレン、ポリビニルトルエン、
スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−ジビニルベ
ンゼン共重合体、ビニルトルエン−第三ブチルスチレン
共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタク
リル酸、ポリアクリルニトリル、アクリロニトリル−ブ
タジエン−スチレン共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレ
ート、塩化ビニル−アクリレート共重合体等の有機高分
子を挙げることができる。As latex, high specific gravity polystyrene, carboxylated polystyrene, polyvinyl toluene,
Styrene-butadiene copolymer, styrene-divinylbenzene copolymer, vinyltoluene-tert-butylstyrene copolymer, polyester, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyacrylonitrile, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, poly Organic polymers such as vinyl acetate acrylate and vinyl chloride-acrylate copolymer can be mentioned.

【００３４】赤血球としては、羊、山羊、牛、及びニワ
トリ等の動物の赤血球を挙げることができる。これらの
赤血球は、生、又は、グルタールアルデヒド若しくはホ
ルマリン等で固定したものを用いることができる。Examples of the red blood cells include red blood cells of animals such as sheep, goats, cows, and chickens. These erythrocytes can be used raw or fixed with glutaraldehyde or formalin.

【００３５】被検血清とは、抗体価を測定する個体から
採取した血清をいう。The test serum is a serum collected from an individual whose antibody titer is to be measured.

【００３６】＜操作方法＞本発明の抗体価測定法におい
て使用する器具には特に限定はない。本発明では参照抗
体を用いた凝集像と被検血清を用いた凝集像を比較す
る。比較による判断を正確にするため、２つの凝集反応
は同条件下で行われることが好ましい。従って、好まし
くは、凝集判定プレートを使用することができる。凝集
判定プレートを使用する場合、測定に使用する試薬の量
も少量ですみ、混合も同条件の下行うことができる利点
がある。以下、その凝集判定プレートを使用した場合の
操作方法を例として挙げる。<Operation method> The instrument used in the antibody titer measuring method of the present invention is not particularly limited. In the present invention, an agglutination image using a reference antibody and an agglutination image using a test serum are compared. Preferably, the two agglutination reactions are performed under the same conditions to make the judgment by comparison accurate. Therefore, preferably, an aggregation determination plate can be used. When the aggregation determination plate is used, there is an advantage that the amount of the reagent used for the measurement is small and the mixing can be performed under the same conditions. Hereinafter, an operation method using the aggregation determination plate will be described as an example.

【００３７】10〜100μｌ程度の、好ましくは50μｌの
被検血清及び参照抗体を，プレ−ト上の所定の位置に滴
下する。参照抗体を滴下した同じ位置に10〜100μｌ程
度の、好ましくは、50μｌの参照抗原を滴下する。混合
時間を正確にするため、被検血清及び参照抗体に接しな
いように滴下することもできる。以上の準備完了後、プ
レ−ト上の滴下された溶液を混合する。混合時間は1分
以上、好ましくは、１分程度である。本発明の課題とし
て検出時間の短縮が挙げられているため、短いほうが好
ましい。About 10 to 100 μl, preferably 50 μl, of the test serum and the reference antibody are dropped at predetermined positions on the plate. About 10 to 100 μl, preferably 50 μl, of the reference antigen is dropped at the same position where the reference antibody was dropped. In order to make the mixing time accurate, it may be dropped so as not to come into contact with the test serum and the reference antibody. After the above preparation is completed, the dropped solution on the plate is mixed. The mixing time is 1 minute or more, preferably about 1 minute. Since the object of the present invention is to shorten the detection time, a shorter one is preferable.

【００３８】混合を同時に終了し、プレ−ト上の同じ位
置に抗体固定微粒子を得られた混合物に接しないように
添加する。プレ−ト上の抗体固定微粒子と得られた混合
物を同時に混合する。混合時間は、特に制限は無く、凝
集像が観察されるまで混合することができ、例えば、１
〜２分間混合することができる。The mixing is completed at the same time, and antibody-immobilized fine particles are added at the same position on the plate so as not to come into contact with the obtained mixture. The antibody-fixed microparticles on the plate and the resulting mixture are mixed simultaneously. The mixing time is not particularly limited, and mixing can be performed until an aggregation image is observed.
Mix for ~ 2 minutes.

【００３９】プレ−ト上に生成した凝集像を比較する。
参照抗体を用いた凝集像と比較して、被検血清を用いた
凝集像が大きいか、同程度か、又は小さいかを判断す
る。また、抗体と抗原の混合物と抗体固定微粒子とを混
合する過程において、凝集が早いか又は遅いかも合わせ
て判定する。その判定結果と対応表を照らし合わせて抗
体価を判断する。The aggregation images formed on the plates are compared.
It is determined whether the agglutination image using the test serum is larger, similar, or smaller than the agglutination image using the reference antibody. In the process of mixing the antibody-antigen mixture with the antibody-immobilized fine particles, it is also determined whether aggregation is early or late. The antibody titer is determined by comparing the result of the determination with the correspondence table.

【００４０】測定可能な抗体価の範囲は限定されず、参
照抗体及び／又は被検血清の希釈を組み合わせることに
よって制限なく測定することができる。よって、抗体価
が８又は５１２ＨＩの参照抗体を用いて８ＨＩ以下又は
５１２ＨＩ以上の抗体価の測定も可能である。研究のた
めの使用においては、ワクチン接種の最適時期の研究に
おいて重要と思われる８ＨＩ以下の抗体価の測定が必要
となる場合もある。また、野外株による感染抗体価の上
昇とワクチンによる抗体価の上昇を区別のするための手
段として５１２ＨＩ以上の抗体価の測定が必要となる場
合もある。このような場合においても本発明は有効であ
る。The range of measurable antibody titers is not limited, and can be measured without limitation by combining dilutions of a reference antibody and / or a test serum. Therefore, it is also possible to measure an antibody titer of 8 HI or less or 512 HI or more using a reference antibody having an antibody titer of 8 or 512 HI. For research use, it may be necessary to measure antibody titers below 8HI which may be important in studies at the optimal time of vaccination. In some cases, measurement of an antibody titer of 512 HI or more is necessary as a means for distinguishing between an increase in an infectious antibody titer due to a field strain and an increase in an antibody titer due to a vaccine. The present invention is also effective in such a case.

【００４１】抗パルボウイルス抗体検出用参照抗体 抗パルボウイルス抗体検出用であって所定の抗体価を示
す本発明の参照抗体は、例えば、抗パルボウイルス抗体
を緩衝液で希釈することにより作製したものであること
ができる。 Reference Antibody for Anti-Parvovirus Antibody Detection The reference antibody of the present invention for detecting anti-parvovirus antibody and exhibiting a predetermined antibody titer is prepared, for example, by diluting an anti-parvovirus antibody with a buffer. Can be

【００４２】抗パルボウイルス抗体としては、例えば、
抗犬パルボウイルス抗体、猫汎白血球減少症ウイルス抗
体、又は豚パルボウイルス抗体等を用いることができ
る。Examples of anti-parvovirus antibodies include:
Anti-dog parvovirus antibody, feline panleukopenia virus antibody, or swine parvovirus antibody can be used.

【００４３】抗パルボウイルス抗体の作製方法は、特に
限定はなく公知の方法を用いて作製することができる。
使用する抗パルボウイルス抗体としては、例えば、マウ
スやラットのモノクローナル抗体として得たもの、パル
ボウイルスに感染した動物の血清から精製したもの、又
はパルボウイルスを動物、例えば、ウサギ、羊、山羊、
馬、ニワトリ、モルモット等の体内に投与して動物を免
疫化して得られるポリクローナル抗体等を挙げることが
できる。The method for preparing the anti-parvovirus antibody is not particularly limited, and it can be prepared using a known method.
The anti-parvovirus antibodies used include, for example, those obtained as mouse or rat monoclonal antibodies, those purified from the sera of animals infected with parvovirus, or parvovirus in animals, for example, rabbits, sheep, goats,
Examples thereof include polyclonal antibodies obtained by immunizing animals by administering them to the body of horses, chickens, guinea pigs and the like.

【００４４】緩衝液としては、抗原抗体反応を阻害しな
い緩衝液であればいずれも使用することができる。更に
は安定剤として牛血清アルブミンやゼラチン等を含むpH
6.0〜8.0の緩衝液等を使用することができる。具体的に
は、例えば、0.15M NaCl、0.2％ BSA、０．１％ NaN₃を
含む0.01Mリン酸緩衝食塩液（ｐH7.4）を用いることが
できる。As the buffer, any buffer can be used as long as it does not inhibit the antigen-antibody reaction. Furthermore, it contains bovine serum albumin and gelatin as stabilizers.
A buffer of 6.0 to 8.0 or the like can be used. Specifically, for example, a 0.01 M phosphate buffered saline (pH 7.4) containing 0.15 M NaCl, 0.2% BSA, and 0.1% NaN ₃ can be used.

【００４５】参照抗体の抗パルボウイルス抗体の抗体価
は被検血清の抗体価を考慮して適宜設定することができ
る。抗体価は種々の表記法で表わすことができる。抗体
価表記法については特に限定はなく、公知の方法、例え
ば、上記赤血球凝集抑制試験により得られる結果を用い
る表記法(単位ＨＩ)等を使用することができる。The antibody titer of the anti-parvovirus antibody of the reference antibody can be appropriately set in consideration of the antibody titer of the test serum. Antibody titers can be represented in various notations. There is no particular limitation on the antibody titer notation, and a known method, for example, a notation (unit HI) using the results obtained by the above-described hemagglutination inhibition test can be used.

【００４６】赤血球凝集抑制試験を用いる場合、赤血球
の凝集が認められた最大希釈倍数の逆数である赤血球凝
集抑制価（ＨＩ）により抗体価を表記することができ
る。参照抗体が有すべき所定の抗体価としては、例え
ば、臨床上感染及び診断のための８、３２、１２８、及
び５１２ＨＩを挙げることができる。８ＨＩの抗体価を
持つ参照抗体は、抗犬パルボウイルスのワクチンの効果
を得るための基準となるため、抗犬パルボウイルスのワ
クチン接種の可否判断に用いることができる。また、そ
のワクチン接種後、その効果を判断するために５１２Ｈ
Ｉの抗体価を持つ参照抗体を用いることができる。When the hemagglutination inhibition test is used, the antibody titer can be represented by the hemagglutination inhibition titer (HI), which is the reciprocal of the maximum dilution at which red blood cell agglutination was observed. Predetermined antibody titers that the reference antibody should have include, for example, 8, 32, 128, and 512 HI for clinical infection and diagnosis. The reference antibody having an antibody titer of 8HI serves as a criterion for obtaining the effect of the anti-dog parvovirus vaccine, and thus can be used for judging whether or not vaccination with the anti-dog parvovirus is possible. Also, after the vaccination, 512H
A reference antibody with an I titer can be used.

【００４７】以下の実施例において本発明を更に詳しく
説明するが、本発明はこれらに限れるられるものではな
い。The present invention will be described in more detail in the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

【００４８】[0048]

【実施例】実施例１ （１）犬パルボウイルスの調製 犬パルボウイルス感染症の犬の下痢便をリン酸緩衝食塩
液に懸濁した。得られた懸濁液を遠心した。遠心後、そ
の上清を猫腎継代細胞（ＣＲＦＫ株）に接種して培養し
た。培養上清を遠心し上清を得た。赤血球凝集反応法、
赤血球凝集抑制反応法、及び酵素免疫測定法を用いてそ
の上清が犬パルボウイルスに富む分画であることを確認
した。EXAMPLES Example 1 (1) Preparation of Canine Parvovirus Diarrheal stool of a dog with canine parvovirus infection was suspended in phosphate buffered saline. The resulting suspension was centrifuged. After centrifugation, the supernatant was inoculated into a cat kidney passage cell (CRFK strain) and cultured. The culture supernatant was centrifuged to obtain a supernatant. Hemagglutination,
The supernatant was confirmed to be a fraction rich in canine parvovirus using the hemagglutination inhibition reaction method and enzyme immunoassay.

【００４９】（２）抗犬パルボウイルス抗体の作製 （１）で得た犬パルボウイルス培溶液の上清を２０％シ
ョ糖及びメトリザマイド密度匂配平衡遠心法（２０−６
０％）により更に精製し、精製犬パルボウイルスを得
た。(2) Preparation of anti-dog parvovirus antibody The supernatant of the dog parvovirus culture solution obtained in (1) was centrifuged with 20% sucrose and metrizamide density odor equilibrium (20-6).
0%) to obtain a purified dog parvovirus.

【００５０】この精製犬パルボウイルスを用いてモノク
ローナル抗体を以下の方法で作製した。精製犬パルボウ
イルスをリン酸緩衝食塩液に懸濁し、等量のＦｒｅｕｎ
ｄの完全アジュバントと混和した。得られた混和物をＢ
ＡＬＢ／ｃ系のマウスの腹腔内に０．１ｍｌ投与し、マ
ウスを免疫化した。３週間後にリン酸緩衝食塩液に懸濁
した精製犬パルボウイルス０．１ｍｌを尾静脈よりマウ
スに追加投与し、マウスを更に免疫化した。３日後にマ
ウスの脾臓細胞を採取した。得られた脾臓細胞とマウス
ミエローマ細胞Ｘ６３／Ａｇ８６５３株にポリエチレン
グリコール４，０００を用いて細胞融合を行った。得ら
れた融合細胞を３回以上クローニングし、抗犬パルボウ
イルスモノクローナル抗体（ＩｇＧ）産生マウスハイブ
リドーマ株を得た。Using this purified dog parvovirus, a monoclonal antibody was prepared by the following method. The purified dog parvovirus is suspended in phosphate buffered saline and an equal volume of Freun
d. Complete adjuvant. The resulting mixture is B
The mice were immunized by intraperitoneal injection of 0.1 ml of ALB / c mice. Three weeks later, 0.1 ml of purified dog parvovirus suspended in a phosphate buffered saline was additionally administered to the mouse via the tail vein, and the mouse was further immunized. Three days later, mouse spleen cells were collected. Cell fusion was performed between the obtained spleen cells and mouse myeloma cell X63 / Ag8653 using polyethylene glycol 4,000. The obtained fused cells were cloned three or more times to obtain an anti-dog parvovirus monoclonal antibody (IgG) -producing mouse hybridoma strain.

【００５１】マウス（ＢＡＬＢ／ｃ系）の腹腔内にテト
ラメチルペンタデカンを０．５ｍｌ注射した。１週間
後、抗犬パルボウイルスモノクローナル抗体産生マウス
ハイブリドーマ株の１〜５×１０⁶個の細胞を同じマウ
スの腹腔内に注射した。１〜２週間後にマウスから腹水
を採取した。得られた腹水から硫酸アンモニウム塩析法
でγグロブリン分画を得た。A mouse (BALB / c strain) was intraperitoneally injected with 0.5 ml of tetramethylpentadecane. One week later, 1-5 × 10 ⁶ cells of a mouse hybridoma strain producing an anti-dog parvovirus monoclonal antibody were injected intraperitoneally into the same mouse. One to two weeks later, ascites was collected from the mice. A gamma globulin fraction was obtained from the obtained ascites by ammonium sulfate salting out method.

【００５２】（３）抗犬パルボウイルスモノクローナル
抗体固定化ラテックス粒子の作製 抗犬パルボウイルスモノクローナル抗体（ＩｇＧ）を、
０．０５Ｍグリシン、０．１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ８．
０）の緩衝液（以下、緩衝液Ａと呼ぶ）に１ｍｇ／ｍｌ
になるように懸濁した。粒径０．４μのポリスチレン系
ラテックス粒子を緩衝液Ａに１重量％になるように懸濁
した。得られた２つの懸濁液を混和し１８時間攪拌し
た。得られた反応液を緩衝液Ａで遠心洗浄した。得られ
た沈査を０．０５Ｍグリシン、０．１５ＭＮａＣｌ、
０．２％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ₃(ｐＨ８．２)の緩衝
液（以下、緩衝液Ｂと呼ぶ）にラテックス粒子重量で
０．２５重量％になるように懸濁した。得られた懸濁液
を抗犬パルボウイルス抗体を固定化したラテックス粒子
（以下、ラテックス試薬という）として使用した。(3) Preparation of anti-dog parvovirus monoclonal antibody-immobilized latex particles An anti-dog parvovirus monoclonal antibody (IgG) was
0.05M glycine, 0.15M NaCl (pH 8.
0) buffer (hereinafter referred to as buffer A) 1 mg / ml
And suspended. Polystyrene-based latex particles having a particle size of 0.4 μ were suspended in buffer A so as to be 1% by weight. The resulting two suspensions were mixed and stirred for 18 hours. The obtained reaction solution was washed with a buffer A by centrifugation. The resulting precipitate was analyzed using 0.05M glycine, 0.15M NaCl,
It was suspended in a buffer solution of 0.2% BSA and 0.1% NaN ₃ (pH 8.2) (hereinafter referred to as buffer solution B) so that the latex particle weight was 0.25% by weight. The obtained suspension was used as latex particles on which an anti-dog parvovirus antibody was immobilized (hereinafter referred to as a latex reagent).

【００５３】（４）参照抗体の作製 （２）で得た抗犬パルボウイルス抗体の抗体価を豚赤血
球凝集抑制反応法により予め測定した。その抗犬パルボ
ウイルス抗体を緩衝液Ｂで希釈して、それぞれ８、３
２、１２８、及び５１２ＨＩの抗体価を持つ抗体溶液を
作製した。得られた希釈溶液は、それぞれ参照抗体（８
ＨＩ）、参照抗体（３２ＨＩ）、参照抗体（１２８Ｈ
Ｉ）、及び参照抗体（５１２ＨＩ）とした。(4) Preparation of Reference Antibody The antibody titer of the anti-dog parvovirus antibody obtained in (2) was measured in advance by the swine hemagglutination inhibition reaction method. The anti-dog parvovirus antibody was diluted with buffer B, and
Antibody solutions with antibody titers of 2, 128, and 512 HI were prepared. The obtained diluted solutions were each used as a reference antibody (8
HI), reference antibody (32HI), reference antibody (128H
I) and a reference antibody (512HI).

【００５４】（５）参照抗原の作製 犬パルボウイルスを、参照抗体（８ＨＩ）及びラテック
ス試薬と反応させた時、中程度の凝集像が得られる濃度
に緩衝液Ｂで希釈調製した。得られた抗原溶液を参照抗
原（８ＨＩ）とした。(5) Preparation of Reference Antigen The dog parvovirus was diluted with the buffer B to a concentration at which a medium aggregation image was obtained when reacted with the reference antibody (8HI) and a latex reagent. The obtained antigen solution was used as a reference antigen (8HI).

【００５５】同様にして、犬パルボウイルスを参照抗体
（３２ＨＩ）、参照抗体（１２８ＨＩ）、及び参照抗体
（５１２ＨＩ）と反応させた時、中程度の凝集が得られ
るように犬パルボウイルスを希釈調製した。得られた抗
原溶液をそれぞれ参照抗原（３２ＨＩ）、参照抗原（１
２８ＨＩ）、及び参照抗原（５１２ＨＩ）とした。Similarly, when the dog parvovirus is reacted with the reference antibody (32HI), the reference antibody (128HI), and the reference antibody (512HI), the dog parvovirus is diluted and prepared so that moderate aggregation is obtained. did. The obtained antigen solutions were used as a reference antigen (32HI) and a reference antigen (1
28HI) and a reference antigen (512HI).

【００５６】操作手順 次に測定操作の手順を詳細に述べる。ラテックス凝集判
定プレートの各ウエルに入れる試薬は、図１に記載され
ているとうりである。Operation Procedure Next, the procedure of the measurement operation will be described in detail. The reagent to be added to each well of the latex agglutination determination plate is as described in FIG.

【００５７】ラテックス凝集判定プレートのウエル
[１]、[２]、[３]、及び[４]に、それぞれ５０μｌの
(1)：参照抗体（８ＨＩ）、(2)：参照抗体（３２Ｈ
Ｉ）、(3)：参照抗体（１２８ＨＩ）、及び(4)：参照抗
体（５１２ＨＩ）を入れ、ウエル[５]、[６]、[７]、及
び[８]に(10)：被検血清をそれぞれ５０μｌずつ滴下す
る。Well of latex agglutination determination plate
50 μl of each of [1], [2], [3] and [4]
(1): Reference antibody (8HI), (2): Reference antibody (32H)
I), (3): Reference antibody (128 HI) and (4): Reference antibody (512 HI), and wells [5], [6], [7], and [8] (10): Test 50 μl of each serum is dropped.

【００５８】次に、前の液に重ねて、ウエル[１]及び
[５]に５０μｌの(5)：参照抗原（８ＨＩ）を、ウエル
[２]及び[６]に５０μｌの(6)：参照抗原（３２ＨＩ）
を、ウエル[３]及び[７]に５０μｌの(7)：参照抗原
（１２８ＨＩ）を、ウエル[４]及び[８]に５０μｌの
(8)：参照抗原（５１２ＨＩ）を滴下する。ラテックス
凝集判定プレートを傾けながら穏やかに回し試薬を１分
程度混和する。Next, over the previous liquid, well [1] and
50 μl of [5]: Reference antigen (8HI) was added to the well [5].
50 μl of (6) in [2] and [6]: Reference antigen (32HI)
50 μl in wells [3] and [7] (7): Reference antigen (128 HI), 50 μl in wells [4] and [8]
(8): The reference antigen (512HI) is dropped. Gently rotate the latex agglutination determination plate while tilting, and mix the reagent for about 1 minute.

【００５９】ウエル[１]〜[８]のそれぞれに(9)：ラテ
ックス試薬を５０μｌづつ滴下する。ラテックス凝集判
定プレートを傾けながら穏やかにまわし試薬を１〜２分
間混合する。参照抗体と被検血清のラテックス凝集像を
比較する。(9): 50 μl of a latex reagent is added dropwise to each of the wells [1] to [8]. The reagent is gently turned while the latex agglutination determination plate is tilted, and mixed for 1-2 minutes. The latex agglutination images of the reference antibody and the test serum are compared.

【００６０】参照抗体と比較して、被検血清の凝集像が
強い場合を（＋＋＋）、同程度な場合を（＋）、凝集像
が弱いか凝集が認められない場合を（−）とする。判定
表（表１）に従い、抗体価を求める。なお、ラテックス
試薬を用いて凝集反応を行った場合は、判定により得ら
れた抗体価をＬＩ（Latex Inhibition）の単位で表す
（以下、実施例２においても同様にＬＩで表示）。[0060] Compared to the reference antibody, the case where the agglutination image of the test serum is strong (+++), the case where it is almost the same, (+), and the case where the agglutination image is weak or no agglutination is observed (-) . The antibody titer is determined according to the judgment table (Table 1). When an agglutination reaction is performed using a latex reagent, the antibody titer obtained by the determination is expressed in units of LI (Latex Inhibition) (hereinafter, also indicated in LI in Example 2).

【００６１】[0061]

【表１】判定表 参照抗体（ウエル[１]、[２]、及び[３]）と被検血清
（ウエル[４]、[５]、及び[６]）の凝集像を比較し判定
する。 ＋＋＋：参照抗体の凝集像と比較して、被検検体の凝集
が強い ＋ ：参照抗体の凝集像と比較して、被検検体の凝集が
同程度 − ：参照抗体の凝集像と比較して、被検検体の凝集が
弱いか又は無い[Table 1] Judgment table Judgment is made by comparing the agglutination images of the reference antibody (wells [1], [2], and [3]) and the test serum (wells [4], [5], and [6]) . +++: Aggregation of the test sample is stronger than the aggregation image of the reference antibody. +: Aggregation of the test sample is comparable to the aggregation image of the reference antibody. −: Compared with the aggregation image of the reference antibody. , Weak or no aggregation of test sample

【００６２】実施例２ 実施例１に８〜５１２ＨＩを測定範囲とした例を示した
が、測定するポイントをワクチン接種時期の判定、又は
ワクチンの効果の判定に限定する場合の例を示す。ワク
チン接種時期の判定のためには抗犬パルボウイルス抗体
が８ＨＩ以下であることを判定すれば良い。また、ワク
チンの効果の判定をするためには５１２ＨＩのものを作
製すれば良い。そのためには、基準とする参照抗体をそ
れぞれ８ＨＩと５１２ＨＩ、のものを作製すれば良い。
ここでは、ワクチン接種時期の判定に有効な８ＨＩの例
を示した。 Example 2 The example in which the measurement range is set to 8 to 512 HI is shown in Example 1, but an example in which the measurement points are limited to the judgment of the vaccination timing or the judgment of the vaccine effect will be described. In order to determine the vaccination time, it may be determined that the anti-dog parvovirus antibody is 8HI or less. In addition, in order to determine the effect of the vaccine, a vaccine of 512HI may be prepared. For this purpose, reference antibodies 8HI and 512HI may be prepared, respectively.
Here, an example of 8HI effective for determining the vaccination timing is shown.

【００６３】（１）犬パルボウイルスの調製 実施例１に準じ犬パルボウイルスを調製した。(1) Preparation of Canine Parvovirus A canine parvovirus was prepared according to Example 1.

【００６４】（２）参照抗体の作製 実施例１に準じ抗犬パルボウイルス抗体を得た。緩衝液
Ｂで抗犬パルボウイルス抗体を希釈して、８ＨＩの参照
抗体を作製した（以下、参照抗体（８ＨＩ）という）。(2) Preparation of Reference Antibody An anti-dog parvovirus antibody was obtained according to Example 1. The anti-dog parvovirus antibody was diluted with buffer B to prepare an 8HI reference antibody (hereinafter referred to as reference antibody (8HI)).

【００６５】（３）参照抗原の作製 実施例１に準じて犬パルボウイルスを得た。緩衝液Ｂで
犬パルボウイルスを希釈して、参照抗体（８ＨＩ）とラ
テックス試薬を反応させた時中程度の凝集像が得られる
濃度に調製した（以下、参照抗原（８ＨＩ）という）。(3) Preparation of Reference Antigen A canine parvovirus was obtained according to Example 1. Canine parvovirus was diluted with buffer B to adjust the concentration to obtain a medium aggregation image when the reference antibody (8HI) was reacted with the latex reagent (hereinafter referred to as reference antigen (8HI)).

【００６６】操作手順 次に測定操作の手順を詳細に述べる。ラテックス凝集判
定プレートの各ウエルに入れる試薬は、図２に記載され
ているとうりである。Operation Procedure Next, the procedure of the measurement operation will be described in detail. The reagent to be added to each well of the latex agglutination determination plate is as shown in FIG.

【００６７】ラテックス凝集判定プレートのウエル
（１]に５０μｌの(1)：参照抗体（８ＨＩ）を入れ、ウ
エル（２]に５０μｌの(3)：被検血清を入れる。次に、
前の液に重ねてウエル[１]及び[２]に５０μｌの(2)：
参照抗原（８ＨＩ用）をそれぞれ滴下する。ラテックス
凝集判定プレートを傾けながら穏やかに回し、各ウエル
の試薬を約１分間混和する。ウエル[１]及び[２]に５０
μｌの(4)：ラテックス試薬を滴下する。ラテックス凝
集判定プレートを傾けながら穏やかに回し、各ウエルの
試薬を１〜２分間反応させる。反応中、参照抗体と被検
血清のラテックス凝集像を比較する。In a latex agglutination determination plate, well (1) is charged with 50 μl of (1): reference antibody (8HI), and well (2) is charged with 50 μl of (3): test serum.
50 μl of (2) in wells [1] and [2] over the previous solution:
The reference antigen (for 8HI) is added dropwise. Gently turn the latex aggregation determination plate while tilting, and mix the reagents in each well for about 1 minute. 50 for wells [1] and [2]
μl of (4): latex reagent is added dropwise. The latex agglutination determination plate is gently rotated while being tilted, and the reagent in each well is allowed to react for 1-2 minutes. During the reaction, the latex agglutination images of the reference antibody and the test serum are compared.

【００６８】判定 参照抗体と比較して被検血清の凝集像が強い場合は、抗
体価は８ＬＩ以下であり、ワクチン接種可能であると判
定できる。被検血清の凝集像が同じか弱い場合は、抗体
価は８ＬＩ以上であり、ワクチンを接種しても効果は期
待できないと判定できる。Judgment When the aggregated image of the test serum is stronger than that of the reference antibody, the antibody titer is 8 LI or less, and it can be judged that vaccination is possible. When the agglutination images of the test sera are the same or weak, the antibody titer is 8 LI or more, and it can be determined that no effect can be expected even if vaccination is performed.

【００６９】同様に、参照抗体（５１２ＨＩ）を用い
て、ワクチン接種後２週間目の被検血清を測定すれば、
参照抗体と比較して凝集像が同程度か弱い場合は、５１
２ＬＩ以上の抗体価がありワクチンは有効に働いている
と判定できる。しかし、凝集が強い場合は５１２ＬＩ以
下の抗体価しかなく、感染の危険性があると判断でき
る。Similarly, if the test serum 2 weeks after vaccination was measured using the reference antibody (512HI),
If the aggregation image is comparable or weaker than the reference antibody, 51
Since the antibody titer is 2 LI or more, it can be determined that the vaccine is working effectively. However, when the aggregation is strong, there is only an antibody titer of 512 LI or less, and it can be determined that there is a risk of infection.

【００７０】比較例１ プレインクベーションの反応時間の違いによる凝集の変
化 従来法（特開平８−１３６５４５号公報）において一番
の問題であったプレインクベーション（抗原抗体反応）
の反応時間の違いによる測定結果への影響を調べた。従
来法のプレインクベ−ションの時間を、それぞれ２分、
５分、及び１０分にして、抗体価が８、１６、及び３２
ＨＩの３つの検体にラテックス反応を行った。ラテック
ス反応の時間は、３分と一定にした。それぞれ得られた
凝集像を観察した。結果を表２に示す。 Comparative Example 1 Change in Aggregation Due to Difference in Preincubation Reaction Time Pre-incubation (antigen-antibody reaction), which was the most problematic in the conventional method (Japanese Patent Laid-Open No. 8-136545).
The effect of the reaction time on the measurement results was investigated. The pre-incubation time of the conventional method is 2 minutes each,
At 5 and 10 minutes, the antibody titers were 8, 16, and 32
A latex reaction was performed on three specimens of HI. The time of the latex reaction was kept constant at 3 minutes. The obtained aggregation images were observed. Table 2 shows the results.

【００７１】[0071]

【表２】従来法におけるプレインクベ−ションの反応時
間の違いによる凝集の変化 ２＋：大きな凝集 ＋：中程度の凝集 ＋ｗ：弱い凝集 −：凝集なしTable 2 Changes in aggregation due to differences in the reaction time of pre-incubation in the conventional method 2+: Large aggregation +: Medium aggregation + w: Weak aggregation-: No aggregation

【００７２】表２より、従来法ではプレインクベーショ
ンの反応時間の違いにより得られる凝集が異なることが
分かった。プレインクベ−ションの反応時間が長くなる
と抗体価が低くなる。よって、正確な抗体価を得るため
には、厳密な時間設定が必要である。From Table 2, it was found that in the conventional method, the aggregation obtained differs depending on the reaction time of the pre-incubation. The longer the pre-incubation reaction time, the lower the antibody titer. Therefore, strict time setting is required to obtain an accurate antibody titer.

【００７３】実施例３ 本発明におけるプレインクベ−ションの時間の違いによ
る抗体価測定結果に対する影響を調べ、比較例１と結果
を比較した。プレインクベ−ションの時間をそれぞれ２
分、５分、又は１０分にして実施例１に記載の方法（以
下、ラテックス凝集抑制試験という）を用いて、それぞ
れ抗体価８、１６、及び３２ＨＩを示す３つの検体につ
いて抗体価の測定を行った。結果を表３に示す。 Example 3 The effect of the preincubation time difference in the present invention on the antibody titer measurement results was examined, and the results were compared with Comparative Example 1. Pre-incubation time is 2
Using the method described in Example 1 (hereinafter, referred to as a latex agglutination inhibition test) after three minutes, five minutes, or ten minutes, measurement of the antibody titer was performed on three samples having antibody titers of 8, 16, and 32 HI, respectively. went. Table 3 shows the results.

【００７４】[0074]

【表３】ラテックス凝集抑制試験におけるプレインクベ
−ションの反応時間の違いによる抗体価の変化 抗体価（ＬＩ）で表示[Table 3] Changes in antibody titer due to differences in reaction time of pre-incubation in latex agglutination inhibition test Indication by antibody titer (LI)

【００７５】プレインクベ−ションの時間の違いによる
測定結果への影響は見られなかった。ラテックス凝集抑
制試験では、検体と参照抗体を用いて得られた２つ凝集
像を比較するため、反応時間が異なっても抗体価の測定
には何ら影響はないことが示された。The effect of the difference in the pre-incubation time on the measurement results was not observed. In the latex agglutination inhibition test, the two agglutination images obtained using the sample and the reference antibody were compared, and thus it was shown that the difference in the reaction time had no effect on the measurement of the antibody titer.

【００７６】実施例４ 実施例１に記載の抗体価測定法の再現性を確認するため
に、同時再現性、日差再現性、及び測定者間再現性を実
験した。 Example 4 In order to confirm the reproducibility of the antibody titration method described in Example 1, simultaneous reproducibility, daily reproducibility, and reproducibility between subjects were examined.

【００７７】（１）同時再現性 ３つの検体を用いて、それぞれ同時にラテックス凝集抑
制試験で抗体価を１０回測定した。結果を表４に示す。(1) Simultaneous Reproducibility Using three specimens, the antibody titer was simultaneously measured 10 times in a latex agglutination inhibition test. Table 4 shows the results.

【００７８】[0078]

【表４】 [Table 4]

【００７９】行う回数に関係なく一定の抗体価を得るこ
とができた。A constant antibody titer could be obtained irrespective of the number of times.

【００８０】（２）日差再現性 ３つの検体を用いてそれぞれ異なる日に１０回ラテック
ス凝集抑制試験を用いて抗体価を測定した。結果を表５
に示す。(2) Daily Difference Reproducibility The antibody titer was measured using the latex agglutination inhibition test 10 times on three different days using three samples. Table 5 shows the results
Shown in

【００８１】[0081]

【表５】 [Table 5]

【００８２】日にちが違っても本方法によって得られる
抗体価は一定であった。The antibody titer obtained by the present method was constant even on different dates.

【００８３】（３）測定者間再現性 異なる３つの検体を用いて、異なる３名の測定者らにそ
れぞれ３つの検体をラテックス凝集抑制試験で抗体価を
測定してもらった。結果を表６に示す。(3) Inter-Measurement Reproducibility Using three different specimens, three different persons were asked to measure the antibody titer of each of the three specimens in a latex agglutination inhibition test. Table 6 shows the results.

【００８４】[0084]

【表６】 [Table 6]

【００８５】測定者が違っても得られる抗体価は一定で
あった。以上の結果からラテックス凝集抑制試験は、い
ずれも高い再現性を示すことが分かった。The antibody titer obtained was constant, even if the measurer was different. From the above results, it was found that all the latex agglutination inhibition tests showed high reproducibility.

【００８６】実施例５ 豚赤血球凝集抑制反応法との相関 ラテックス凝集抑制試験によって得られた抗体価（Ｌ
Ｉ）と豚赤血球凝集抑制反応法によって得られた抗体価
（ＨＩ）とを対比することにより、本測定法による測定
が正確であることを示す。 Example 5 Correlation with Porcine Hemagglutination Inhibition Reaction Method Antibody titer (L
By comparing I) with the antibody titer (HI) obtained by the swine hemagglutination inhibition reaction method, it is shown that the measurement by the present measurement method is accurate.

【００８７】（１）豚赤血球凝集抑制反応法 牛血清アルブミン添加ほう酸緩衝食塩液（以下、ＢＢＳ
Ａと呼ぶ）と、犬血清、０．５％豚赤血球（以下、ＰＲ
ＢＣと呼ぶ）を準備した。１容の犬血清に１容のレセプ
ター破壊酵素を加えて３７℃で、１８時間処理した。更
に、得られた混合物を５６℃で、３０分間処理した。得
られた混合物に２容の２５％カオリンを加え、室温で２
０分間振盪した。得られた混合物を遠心し、上清を得
た。得られた上清に１／１０容の豚血球を加え、４℃
で、２時間振盪した。得られた溶液を遠心し、その上清
を前処理済み被検血清とした。(1) Pig Hemagglutination Inhibition Reaction Method Bovine buffered saline supplemented with bovine serum albumin (hereinafter BBS)
A), dog serum, 0.5% swine red blood cells (hereinafter referred to as PR
BC). One volume of dog serum was added with one volume of receptor-disrupting enzyme and treated at 37 ° C. for 18 hours. Further, the obtained mixture was treated at 56 ° C. for 30 minutes. To the resulting mixture was added 2 volumes of 25% kaolin and at room temperature 2%.
Shake for 0 minutes. The obtained mixture was centrifuged to obtain a supernatant. 1/10 volume of swine blood cells was added to the obtained supernatant, and 4 ° C.
For 2 hours. The obtained solution was centrifuged, and the supernatant was used as a pretreated test serum.

【００８８】Ｖ底プレートにＢＢＳＡを２５μｌずつ分
注し、一番目のウエルに前処理済み被検血清２５μｌを
加えた。以下２倍段階希釈を行った。更に、各々のウエ
ルに犬パルボウイルス（８ＨＡ）を２５μｌ加え混和し
た。BBSA (25 μl) was dispensed into the V-bottom plate, and 25 μl of the pretreated test serum was added to the first well. Hereinafter, two-fold serial dilution was performed. Further, 25 μl of dog parvovirus (8HA) was added to each well and mixed.

【００８９】得られた混和物を室温で１時間静置した。
その後、その混和物にＰＲＢＣを２５μｌ注ぎ、ミキサ
ーでプレートを２０秒間×２回振動させて混和した。全
体を４℃の恒温装置内に入れて一昼夜静置した後、ウエ
ル内の凝集像を観察した。観察結果より凝集反応の抑制
される最大希釈倍数の逆数（抗体価ＨＩ）を求めた。異
なる１７５種類の血清につき、ラテックス凝集抑制試験
で測定した抗体価ＬＩと豚赤血球凝集抑制反応法で測定
した抗体価ＨＩを対比した。その結果を図３に示す。The obtained mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
Then, 25 μl of PRBC was poured into the mixture, and the plate was shaken twice for 20 seconds with a mixer to mix. The whole was placed in a thermostat at 4 ° C. and allowed to stand for 24 hours, and then the aggregation image in the well was observed. From the observation results, the reciprocal (antibody titer HI) of the maximum dilution factor at which agglutination was suppressed was determined. For 175 different sera, the antibody titer LI measured by the latex agglutination inhibition test and the antibody titer HI measured by the swine hemagglutination inhibition reaction method were compared. The result is shown in FIG.

【００９０】赤血球凝集抑制試験とラテックス凝集抑制
試験との相関は、Ｙをラテックス凝集抑制試験、Ｘを赤
血球凝集抑制試験とした時、 Ｙ＝０．８１６Ｘ＋０．２９１ 相関係数（ｒ）＝０．８９４（ｎ＝１７５） と高い相関があった。よって、ラテックス凝集抑制試験
による抗体価の測定が使用するのに十分正確であること
が分かった。The correlation between the hemagglutination inhibition test and the latex agglutination inhibition test is as follows: when Y is the latex agglutination inhibition test and X is the hemagglutination inhibition test, Y = 0.816X + 0.291 Correlation coefficient (r) = 0. 894 (n = 175). Therefore, it was found that the measurement of the antibody titer by the latex agglutination inhibition test was sufficiently accurate to be used.

【００９１】[0091]

【発明の効果】本発明は、被検血清と参照抗体による凝
集反応を同時に行い、その凝集像を比較することによ
り、従来法の欠点を解決した。つまり、抗原の濃度の変
化により得られる測定結果が異なることもなくなった。
また、プレインクベーションの時間及び得られた混合物
に抗体固定微粒子を混合する時間を厳密に計る必要もな
くなった。According to the present invention, the drawbacks of the conventional method have been solved by simultaneously performing an agglutination reaction using a test serum and a reference antibody and comparing the agglutination images. That is, the measurement results obtained by the change in the antigen concentration no longer differ.
Further, it is no longer necessary to strictly measure the pre-incubation time and the time for mixing the antibody-immobilized fine particles with the obtained mixture.

【００９２】更に、凝集の経時的変化による測定の不正
確さや、測定回数、測定日時、及び測定者の違いによる
再現性の低さを改善することができた。従って、本方法
は臨床の場で実用化することができる、簡便で正確な抗
体価測定方法を提供することができるようになった。Further, the inaccuracy of the measurement due to the change over time of the aggregation and the low reproducibility due to the difference in the number of measurements, the date and time of the measurement, and the operator could be improved. Therefore, the present method can provide a simple and accurate method for measuring antibody titer that can be put to practical use in a clinical setting.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 実施例１においてラテックス凝集判定プレー
トの各ウエルに添加する試薬の構成を示す。FIG. 1 shows a configuration of a reagent added to each well of a latex agglutination determination plate in Example 1.

【図２】 実施例２においてラテックス凝集判定プレー
トの各ウエルに添加する試薬の構成を示す。FIG. 2 shows a configuration of a reagent added to each well of a latex agglutination determination plate in Example 2.

【図３】 赤血球凝集抑制試験とラテックス凝集抑制試
験の相関を表わすグラフである。FIG. 3 is a graph showing a correlation between a test for inhibiting hemagglutination and a test for inhibiting latex agglutination.

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 被検血清中の抗体価を測定する方法であ
って、 − 参照抗体と参照抗原との混合物に抗体を固定化した
微粒子を混合することにより得られる凝集像と、 − 被検血清と上記参照抗原との混合物に上記抗体を固
定化した微粒子を混合することにより得られる凝集像を
比較し、被検血清の抗体価を評価することを特徴とする
方法。1. A method for measuring an antibody titer in a test serum, comprising:-an agglutination image obtained by mixing fine particles having an antibody immobilized thereon with a mixture of a reference antibody and a reference antigen; A method comprising comparing an aggregated image obtained by mixing fine particles having the antibody immobilized thereon with a mixture of serum and the reference antigen, and evaluating the antibody titer of the test serum. 【請求項２】 検出する抗体が抗パルボウイルス抗体で
ある請求項１に記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the antibody to be detected is an anti-parvovirus antibody. 【請求項３】 検出する抗体が抗犬パルボウイルス抗
体、抗猫汎白血球減少症ウイルス抗体、又は抗豚パルボ
ウイルス抗体である請求項１又は２に記載の方法。3. The method according to claim 1, wherein the antibody to be detected is an anti-dog parvovirus antibody, an anti-feline panleukopenia virus antibody, or an anti-porcine parvovirus antibody. 【請求項４】 微粒子がラテックス、不溶性染料ポリマ
ー、及び赤血球からなる群から選択される少なくとも一
種である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the fine particles are at least one selected from the group consisting of latex, insoluble dye polymer, and red blood cells. 【請求項５】 抗パルボウイルス抗体検出用であって所
定の抗体価を示す参照抗体。5. A reference antibody for detecting an anti-parvovirus antibody and showing a predetermined antibody titer. 【請求項６】 抗パルボウイルス抗体が、抗犬パルボウ
イルス抗体、抗猫汎白血球減少症ウイルス抗体、又は抗
豚パルボウイルス抗体である請求項５に記載の参照抗
体。6. The reference antibody according to claim 5, wherein the anti-parvovirus antibody is an anti-dog parvovirus antibody, an anti-feline panleukopenia virus antibody, or an anti-porcine parvovirus antibody.