JPH11304707A - Fluorescence measuring apparatus - Google Patents
Fluorescence measuring apparatusInfo
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- JPH11304707A JPH11304707A JP10947798A JP10947798A JPH11304707A JP H11304707 A JPH11304707 A JP H11304707A JP 10947798 A JP10947798 A JP 10947798A JP 10947798 A JP10947798 A JP 10947798A JP H11304707 A JPH11304707 A JP H11304707A
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、一定周期で強度変
調された励起光を試料に照射し、その試料から発生した
蛍光と励起光との間の位相差を検出して、その試料中に
含まれる蛍光物質の蛍光寿命等を測定する蛍光測定装置
に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method of irradiating a sample with excitation light whose intensity is modulated at a constant period, detecting a phase difference between fluorescence generated from the sample and the excitation light, and detecting the phase difference in the sample. The present invention relates to a fluorescence measurement device that measures the fluorescence lifetime and the like of a contained fluorescent substance.
【０００２】[0002]
【従来の技術】試料に蛍光物質を含ませておき、その試
料に励起光を照射して試料中の蛍光物質から発生した蛍
光を検出し、その検出結果に基づいて試料を分析するこ
とが行われている。このような蛍光測定による試料分析
技術の１つに位相差測定法がある。この位相差測定法
は、試料に照射すべき励起光を一定周期で強度変調され
たものとし、試料中の蛍光物質から発生した蛍光と励起
光との間の位相差を検出する。そして、この位相差に基
づいて、試料中の蛍光物質の蛍光寿命、または、この蛍
光寿命と関連ある物理的もしくは化学的な特性量等を測
定する。このような位相差測定法による蛍光測定に用い
られる従来の蛍光測定装置は、例えば特開昭６２−１９
０４４５号公報に記載されている。2. Description of the Related Art A fluorescent substance is contained in a sample, the sample is irradiated with excitation light to detect fluorescence generated from the fluorescent substance in the sample, and the sample is analyzed based on the detection result. Have been done. One of the sample analysis techniques based on such fluorescence measurement is a phase difference measurement method. In this phase difference measurement method, the excitation light to be applied to the sample is intensity-modulated at a constant period, and the phase difference between the fluorescence generated from the fluorescent substance in the sample and the excitation light is detected. Then, based on the phase difference, the fluorescence lifetime of the fluorescent substance in the sample, or a physical or chemical characteristic amount related to the fluorescence lifetime is measured. A conventional fluorescence measurement apparatus used for fluorescence measurement by such a phase difference measurement method is disclosed in, for example, JP-A-62-19 / 1987.
No. 0445.
【０００３】図１０は、この従来の蛍光測定装置の構成
図である。この蛍光測定装置では、発光ダイオード２か
ら出力される励起光は高周波発生器１により強度変調さ
れ、その強度変調された励起光は、フィルタ３および光
ケーブル４を経て、試料５に照射される。試料５で発生
した蛍光および散乱された励起光は、光ケーブル６およ
びコリメータレンズ７を経て、分光器８により互いに分
離される。分光器８により分離された一方の励起光は、
フィルタ９およびレンズ１０を経て光検出器１１により
検出される。分光器８により分離された他方の蛍光は、
フィルタ１２およびレンズ１３を経て光検出器１４によ
り検出される。光検出器１１および１４それぞれから出
力された信号は、増幅器１５，１６を経て位相電圧変換
器１７に入力し、蛍光と散乱光との間の位相差が測定さ
れる。そして、この位相差に基づいて、試料５中の蛍光
物質の蛍光寿命等が求められる。FIG. 10 is a configuration diagram of this conventional fluorescence measuring apparatus. In this fluorescence measuring device, the excitation light output from the light emitting diode 2 is intensity-modulated by the high-frequency generator 1, and the intensity-modulated excitation light is applied to the sample 5 via the filter 3 and the optical cable 4. The fluorescence and the scattered excitation light generated in the sample 5 are separated from each other by the spectroscope 8 via the optical cable 6 and the collimator lens 7. One of the excitation lights separated by the spectroscope 8 is
The light is detected by a photodetector 11 through a filter 9 and a lens 10. The other fluorescence separated by the spectroscope 8 is
The light is detected by the photodetector 14 via the filter 12 and the lens 13. The signals output from the photodetectors 11 and 14 are input to the phase voltage converter 17 via the amplifiers 15 and 16, and the phase difference between the fluorescence and the scattered light is measured. Then, based on the phase difference, the fluorescence lifetime of the fluorescent substance in the sample 5 is obtained.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記従
来の蛍光測定装置では、光検出器１１および１４それぞ
れの光検出特性の変動に主に起因すると考えられる位相
差ドリフトの現象が認められる。すなわち、試料５およ
び試料５中の蛍光物質の状態が変動することなく一定で
あったとしても、光検出器１１および１４それぞれの光
検出特性が変動することから、この蛍光測定装置により
求められる位相差は時間経過とともに変動する。However, in the above-mentioned conventional fluorescence measuring device, a phenomenon of a phase difference drift which is considered to be mainly caused by the fluctuation of the light detection characteristics of the photodetectors 11 and 14 is recognized. In other words, even if the state of the sample 5 and the fluorescent substance in the sample 5 is constant without change, the light detection characteristics of the photodetectors 11 and 14 change, so that the position determined by this fluorescence measurement device is changed. The phase difference changes over time.
【０００５】このような時間経過とともに位相差が変動
する位相差ドリフトがあると、位相差を正確に測定する
ことができず、蛍光寿命等を正確に測定することができ
ない。例えば、試料５中に含まれている蛍光物質の量が
稀薄である場合、上述したような位相差ドリフトがある
と、その蛍光物質の蛍光寿命の測定の感度が悪くなる。
また、互いに異なる蛍光寿命を有する第１および第２の
蛍光物質が試料５中に含まれている場合、その試料５か
ら発生する蛍光の寿命を測定することにより第１および
第２の蛍光物質の含有比が測定されるが、上述したよう
な位相差ドリフトがあると、蛍光寿命の測定の感度が悪
くなり、第１および第２の蛍光物質の含有比の測定の感
度が悪くなる。さらに、試料５中に蛍光物質が全く含ま
れていない場合であっても位相差ドリフトが生じ、恰も
蛍光物質が含まれているかの如き測定結果が得られる。[0005] If there is a phase difference drift in which the phase difference fluctuates with the passage of time, the phase difference cannot be measured accurately, and the fluorescence lifetime and the like cannot be measured accurately. For example, in the case where the amount of the fluorescent substance contained in the sample 5 is small, if there is the phase difference drift as described above, the sensitivity of the measurement of the fluorescence lifetime of the fluorescent substance is deteriorated.
Further, when the first and second fluorescent substances having different fluorescence lifetimes are included in the sample 5, the lifetime of the fluorescence generated from the sample 5 is measured to determine the first and second fluorescent substances. Although the content ratio is measured, if the phase difference drift as described above occurs, the sensitivity of the measurement of the fluorescence lifetime becomes poor, and the sensitivity of the measurement of the content ratio of the first and second fluorescent substances deteriorates. Furthermore, even if the fluorescent substance is not contained in the sample 5 at all, a phase difference drift occurs, and a measurement result as if the fluorescent substance is contained is obtained.
【０００６】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、位相差ドリフトの問題を解消して蛍光
寿命等を正確に測定することができる蛍光測定装置を提
供することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above problems, and an object of the present invention is to provide a fluorescence measuring apparatus which can solve the problem of phase difference drift and can accurately measure the fluorescence lifetime and the like. And
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明に係る蛍光測定装
置は、(1) 一定周期で強度変調された励起光を出力する
励起光発生手段と、(2) 励起光発生手段から出力された
励起光を試料に照射する照射光学系と、(3) 照射光学系
による励起光の試料への照射に伴い試料から発生した蛍
光を入力し所定位置へ導く蛍光検出光学系と、(4) 試料
への照射前の励起光の一部または試料を透過した後の励
起光を入力し所定位置へ導く励起光検出光学系と、(5)
蛍光検出光学系および励起光検出光学系のうちの一方の
光路を交互に遮断する光路遮断手段と、(6) 蛍光検出光
学系により導かれた蛍光または励起光検出光学系により
導かれた励起光を、所定位置に配された受光部により受
光して検出する光検出器と、(7) 励起光の強度変調の周
期と同じ周期の基準信号の位相を基準として、光検出器
により検出された蛍光および励起光それぞれの位相を検
出する位相検出手段と、(8) 光路遮断手段を制御すると
ともに、位相検出手段により検出された蛍光および励起
光それぞれの位相に基づいて蛍光と励起光との間の位相
差を求める演算制御手段と、を備えることを特徴とす
る。The fluorescence measuring apparatus according to the present invention comprises: (1) excitation light generating means for outputting excitation light whose intensity is modulated at a constant period; and (2) excitation light generating means for outputting the excitation light. An irradiation optical system for irradiating the sample with the excitation light; (3) a fluorescence detection optical system for inputting fluorescence generated from the sample as the excitation light irradiates the sample with the irradiation optical system and guiding the fluorescence to a predetermined position; and (4) the sample. An excitation light detection optical system for inputting a part of the excitation light before irradiation or the excitation light after passing through the sample and guiding the excitation light to a predetermined position;
Light path blocking means for alternately blocking one of the optical paths of the fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system, and (6) the fluorescence guided by the fluorescence detection optical system or the excitation light guided by the excitation light detection optical system A photodetector that receives and detects the light by a light receiving unit disposed at a predetermined position, and (7) the photodetector is detected based on the phase of a reference signal having the same cycle as the cycle of the intensity modulation of the excitation light. Phase detection means for detecting the phases of the fluorescent light and the excitation light, and (8) controlling the optical path blocking means, and detecting the phase between the fluorescence light and the excitation light based on the respective phases of the fluorescence light and the excitation light detected by the phase detection means. And an arithmetic control means for calculating the phase difference of
【０００８】この蛍光測定装置によれば、一定周期で強
度変調された励起光は、励起光発生手段から出力され照
射光学系を経て試料に照射される。励起光の試料への照
射に伴い試料から発生した蛍光は、蛍光検出光学系が光
路遮断手段により遮断されていないとき、蛍光検出光学
系を経て光検出器の受光部に到達し検出される。一方、
励起光は、励起光検出光学系が光路遮断手段により遮断
されていないとき、励起光検出光学系を経て光検出器の
受光部に到達し検出される。光検出器により検出された
蛍光および励起光それぞれの位相は、励起光の強度変調
の周期と同じ周期の基準信号の位相を基準として位相検
出手段により検出される。そして、演算制御手段によ
り、光路遮断手段が制御されて蛍光検出光学系および励
起光検出光学系のうちの一方の光路が交互に遮断される
とともに、位相検出手段により検出された蛍光および励
起光それぞれの位相に基づいて、蛍光と励起光との間の
位相差が求められる。[0008] According to this fluorescence measuring apparatus, the excitation light whose intensity is modulated at a constant period is output from the excitation light generating means and is applied to the sample via the irradiation optical system. Fluorescence generated from the sample due to the irradiation of the sample with the excitation light reaches the light receiving section of the photodetector via the fluorescence detection optical system and is detected when the fluorescence detection optical system is not blocked by the light path blocking means. on the other hand,
The excitation light reaches the light receiving section of the photodetector via the excitation light detection optical system and is detected when the excitation light detection optical system is not blocked by the light path blocking means. The respective phases of the fluorescence and the excitation light detected by the photodetector are detected by the phase detection means based on the phase of the reference signal having the same cycle as the cycle of the intensity modulation of the excitation light. Then, the arithmetic control unit controls the optical path blocking unit to alternately block one of the optical paths of the fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system, and detects the fluorescence and excitation light detected by the phase detection unit, respectively. , The phase difference between the fluorescence and the excitation light is determined.
【０００９】また、本発明に係る蛍光測定装置では、演
算制御手段は、位相検出手段により検出された蛍光およ
び励起光それぞれの位相の双方または何れか一方を平均
化することを特徴とする。また、本発明に係る蛍光測定
装置では、演算制御手段は、蛍光と励起光との間の位相
差を平均化することを特徴とする。これら何れの場合に
も、ノイズの影響が低減され、Ｓ／Ｎ比が優れた位相差
が求められる。In the fluorescence measuring apparatus according to the present invention, the arithmetic and control means averages both or any one of the phases of the fluorescence and the excitation light detected by the phase detecting means. Further, in the fluorescence measurement device according to the present invention, the arithmetic and control unit averages a phase difference between the fluorescence and the excitation light. In any of these cases, the effect of noise is reduced and a phase difference with an excellent S / N ratio is required.
【００１０】また、本発明に係る蛍光測定装置では、光
路遮断手段は、蛍光検出光学系の光路を遮断する第１の
シャッタと、励起光検出光学系の光路を遮断する第２の
シャッタと、を備えることを特徴とする。また、本発明
に係る蛍光測定装置では、光路遮断手段は、光を通過さ
せる通過部と光を遮断する遮断部とが周方向に交互に設
けられ中心点を中心として回転するチョッパであること
を特徴とする。これら何れの場合にも、蛍光検出光学系
および励起光検出光学系のうちの一方の光路を交互に遮
断する光路遮断手段を実現するのに好適である。Further, in the fluorescence measuring device according to the present invention, the light path blocking means includes a first shutter for blocking a light path of the fluorescence detection optical system, a second shutter for blocking a light path of the excitation light detection optical system, It is characterized by having. Further, in the fluorescence measurement device according to the present invention, the light path blocking means is a chopper that is provided with a light passing part and a light blocking part that are alternately provided in a circumferential direction and that rotates around a center point. Features. In any of these cases, it is preferable to realize an optical path blocking unit that alternately blocks one of the optical paths of the fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system.
【００１１】また、本発明に係る蛍光測定装置では、励
起光の一部を分岐する励起光分岐手段と、励起光分岐手
段により分岐された励起光を検出して基準信号を発生す
る基準信号発生手段とを更に備えることを特徴とする。
また、本発明に係る蛍光測定装置では、励起光発生手段
は、一定強度の励起光を出力する励起光源と、一定周期
の変調信号を出力する変調信号発生部と、励起光源から
出力された励起光を変調信号発生部から出力された変調
信号に基づいて強度変調して出力する変調器とを備え、
基準信号は、変調信号発生部から出力された変調信号に
基づくものであることを特徴とする。また、本発明に係
る蛍光測定装置では、励起光発生手段は、一定周期の変
調信号を出力する変調信号発生部と、変調信号発生部か
ら出力された変調信号に基づいて強度変調された励起光
を出力する半導体発光素子とを備え、基準信号は、変調
信号発生部から出力された変調信号に基づくものである
ことを特徴とする。これら何れの場合にも、蛍光および
励起光それぞれの位相を検出する際の基準信号を得るの
に好適である。Further, in the fluorescence measuring apparatus according to the present invention, the excitation light branching means for branching a part of the excitation light, and the reference signal generation means for detecting the excitation light branched by the excitation light branching means and generating the reference signal. Means is further provided.
Further, in the fluorescence measurement device according to the present invention, the excitation light generating means includes: an excitation light source that outputs excitation light having a constant intensity; a modulation signal generation unit that outputs a modulation signal having a constant period; and an excitation light output from the excitation light source. A modulator that intensity-modulates the light based on the modulation signal output from the modulation signal generating unit and outputs the light,
The reference signal is based on the modulation signal output from the modulation signal generator. Further, in the fluorescence measuring device according to the present invention, the excitation light generating means includes: a modulation signal generation unit that outputs a modulation signal having a constant period; and an excitation light intensity-modulated based on the modulation signal output from the modulation signal generation unit. Wherein the reference signal is based on the modulation signal output from the modulation signal generator. Any of these cases is suitable for obtaining a reference signal when detecting the phases of the fluorescence and the excitation light.
【００１２】[0012]
【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。Embodiments of the present invention will be described below in detail with reference to the accompanying drawings. In the description of the drawings, the same elements will be denoted by the same reference symbols, without redundant description.
【００１３】（第１の実施形態）先ず、第１の実施形態
について説明する。図１は、第１の実施形態に係る蛍光
測定装置の構成図である。(First Embodiment) First, a first embodiment will be described. FIG. 1 is a configuration diagram of the fluorescence measurement device according to the first embodiment.
【００１４】一定周期で強度変調された励起光を出力す
る励起光発生手段は、励起光源２１、変調器２２および
シンセサイザ（変調信号発生部）２３を備えて構成され
る。励起光源２１は、一定強度の励起光を連続発振し出
力する。この励起光源２１が出力する励起光は、測定し
ようする蛍光物質を励起し得る波長のものである。変調
器２２は、励起光源２１から出力された励起光と、シン
セサイザ２３から出力された一定周期の変調信号とを入
力し、変調信号に基づいて励起光を強度変調し、その強
度変調された励起光を出力する。The pumping light generating means for outputting the pumping light intensity-modulated at a constant period includes a pumping light source 21, a modulator 22, and a synthesizer (modulation signal generating unit) 23. The excitation light source 21 continuously oscillates and outputs excitation light having a constant intensity. The excitation light output from the excitation light source 21 has a wavelength that can excite the fluorescent substance to be measured. The modulator 22 receives the pumping light output from the pumping light source 21 and the fixed-cycle modulation signal output from the synthesizer 23, and intensity-modulates the pumping light based on the modulation signal. Outputs light.
【００１５】その強度変調された励起光を試料セル４０
へ導く照射光学系は、ハーフミラー３１およびレンズ３
２を備えて構成される。ハーフミラー３１は、変調器２
２から出力された励起光を入力して２分岐する。レンズ
３２は、ハーフミラー３１により２分岐された励起光の
一方を入力し、その励起光を試料セル４０中の試料に集
光照射する。また、ＮＤフィルタ３３は、励起光に対し
所定の透過率を有するものであり、ハーフミラー３１に
より２分岐された励起光の他方を入力し、その励起光を
減衰させて透過させる。ＮＤフィルタ３３を透過した励
起光は、光検出器７１により検出される。The intensity-modulated excitation light is applied to the sample cell 40.
The irradiation optical system for guiding the light to the half mirror 31 and the lens 3
2 is provided. The half mirror 31 is connected to the modulator 2
The pump light output from 2 is input and split into two. The lens 32 inputs one of the excitation lights branched by the half mirror 31 and focuses and irradiates the excitation light on the sample in the sample cell 40. The ND filter 33 has a predetermined transmittance with respect to the excitation light, receives the other of the excitation light branched by the half mirror 31, and attenuates and transmits the excitation light. The excitation light transmitted through the ND filter 33 is detected by the photodetector 71.
【００１６】試料セル４０中の試料に励起光が照射され
ると、その試料中の蛍光物質が励起され、その蛍光物質
から蛍光が発生する。その蛍光は、レンズ５１、バンド
パスフィルタ５２、ダイクロイックミラー５３およびレ
ンズ５４を備えて構成される蛍光検出光学系を経て、光
検出器７２により検出される。ここで、バンドパスフィ
ルタ５２は、蛍光の波長成分を透過させ、他の波長成分
を遮断するものである。また、ダイクロイックミラー５
３は、蛍光の波長成分を透過させ、励起光の波長成分を
反射させるものである。When the sample in the sample cell 40 is irradiated with the excitation light, the fluorescent substance in the sample is excited, and the fluorescent substance generates fluorescence. The fluorescence is detected by a photodetector 72 via a fluorescence detection optical system including a lens 51, a bandpass filter 52, a dichroic mirror 53, and a lens 54. Here, the band-pass filter 52 transmits the wavelength component of the fluorescent light and blocks the other wavelength components. Dichroic mirror 5
Numeral 3 is for transmitting the wavelength component of the fluorescence and reflecting the wavelength component of the excitation light.
【００１７】試料セル４０中の試料に励起光が照射され
ると、その励起光の一部は試料セル４０を透過する。そ
の透過した励起光は、レンズ６１、ミラー６２、ＮＤフ
ィルタ６３、ミラー６４、ダイクロイックミラー５３お
よびレンズ５４を備えて構成される励起光検出光学系を
経て、光検出器７２により検出される。ここで、ＮＤフ
ィルタ６３は、励起光に対し所定の透過率を有するもの
であり、励起光を減衰させて透過させ、光検出器７２に
到達する蛍光および励起光それぞれの強度を互いに同程
度とすることで、光検出器７２による蛍光および励起光
それぞれの検出を安定にすることを目的としている。When the sample in the sample cell 40 is irradiated with the excitation light, a part of the excitation light passes through the sample cell 40. The transmitted excitation light is detected by a photodetector 72 via an excitation light detection optical system including a lens 61, a mirror 62, an ND filter 63, a mirror 64, a dichroic mirror 53, and a lens 54. Here, the ND filter 63 has a predetermined transmittance with respect to the excitation light, attenuates and transmits the excitation light, and makes the intensity of each of the fluorescence and the excitation light reaching the photodetector 72 approximately the same. By doing so, it is intended to stabilize the detection of the fluorescence and the excitation light by the photodetector 72.
【００１８】光検出器７１，７２それぞれは、シンセサ
イザ７３から出力されＲＦアンプ７４により増幅された
一定周期で強度変調されたゲイン信号を入力するととも
に、受光部に入射した光を検出し、その光の強度とゲイ
ン信号の強度とに応じた電気信号を出力する。すなわ
ち、出力される電気信号は、検出された光の強度がゲイ
ン信号に従ってゲイン変調されたものである。なお、シ
ンセサイザ２３および７３それぞれは、互いに同期して
一定周期の信号を出力する。Each of the photodetectors 71 and 72 receives a gain signal output from the synthesizer 73 and amplified by the RF amplifier 74 and intensity-modulated at a constant period, detects light incident on the light receiving section, and detects the light. And outputs an electric signal corresponding to the intensity of the gain signal. That is, the output electric signal is obtained by modulating the intensity of the detected light according to the gain signal. Note that each of the synthesizers 23 and 73 outputs a signal of a fixed period in synchronization with each other.
【００１９】アンプ７５，７６それぞれは、光検出器７
１，７２から出力された電気信号を電流電圧変換すると
ともに、その電気信号のうち高周波成分を遮断するロー
パスフィルタとしても作用する。バンドパスフィルタ７
７，７８それぞれは、アンプ７５，７６から出力された
電気信号を入力し、その電気信号のうち所定波長帯域成
分のみを出力する。位相検出器７９は、バンドパスフィ
ルタ７７，７８それぞれから出力された電気信号を入力
し、バンドパスフィルタ７７から出力された電気信号
（基準信号）の位相を基準として、バンドパスフィルタ
７８から出力された電気信号の位相を求め、その求めら
れた位相を表す位相信号を出力する。なお、光検出器７
１、アンプ７５およびバンドパスフィルタ７７は、基準
信号を発生する基準信号発生手段を構成している。Each of the amplifiers 75 and 76 includes a photodetector 7
The electric signals output from the electric signals 1 and 72 are converted into current and voltage, and also function as a low-pass filter that cuts off high frequency components of the electric signals. Bandpass filter 7
Each of the electric signals 7, 78 receives the electric signal output from the amplifiers 75, 76, and outputs only a predetermined wavelength band component of the electric signal. The phase detector 79 receives the electric signal output from each of the band-pass filters 77 and 78, and outputs the electric signal (reference signal) output from the band-pass filter 77 from the band-pass filter 78 based on the phase of the electric signal (reference signal). The phase of the obtained electric signal is obtained, and a phase signal representing the obtained phase is output. In addition, the photodetector 7
1. The amplifier 75 and the band-pass filter 77 constitute a reference signal generating means for generating a reference signal.
【００２０】演算制御部８０は、位相検出器７９から出
力された位相信号を入力するとともに、シャッタ制御部
９１を介してシャッタ９２および９３それぞれの開閉を
制御する。ここで、シャッタ９２は、試料セル４０とレ
ンズ５１との間に設けられ、シャッタ制御部９１による
指示に従って蛍光検出光学系の光路を遮断するものであ
る。一方、シャッタ９３は、ミラー６２とＮＤフィルタ
６３との間に設けられ、シャッタ制御部９１による指示
に従って励起光検出光学系の光路を遮断するものであ
る。そして、演算制御部８０は、シャッタ９２および９
３それぞれの開閉に関する情報ならびに位相検出器７９
から入力した位相信号に基づいて、蛍光と励起光との間
の位相差を検出する。The arithmetic control unit 80 receives the phase signal output from the phase detector 79 and controls the opening and closing of the shutters 92 and 93 via the shutter control unit 91. Here, the shutter 92 is provided between the sample cell 40 and the lens 51, and blocks the optical path of the fluorescence detection optical system in accordance with an instruction from the shutter control unit 91. On the other hand, the shutter 93 is provided between the mirror 62 and the ND filter 63, and cuts off the optical path of the excitation light detection optical system in accordance with an instruction from the shutter control unit 91. Then, the arithmetic control unit 80 controls the shutters 92 and 9
3 Information on opening and closing of each and phase detector 79
The phase difference between the fluorescence and the excitation light is detected on the basis of the phase signal input from.
【００２１】なお、図示していないが、光検出器７１お
よび７２それぞれに迷光が入射するのを防止する為に、
適切な箇所に遮光板を設けるのが好適である。例えば、
試料セル４０からダイクロイックミラー５３に到るまで
の間の蛍光検出光学系および励起光検出光学系それぞれ
は、両者間の光路長差の短縮化および蛍光測定装置の小
型化などを考慮すると互いに近接したものであることが
好ましいが、その場合に光検出器７２に迷光が入射する
危険があるので、特に、この間の蛍光検出光学系および
励起光検出光学系の間に遮光板を設けるのが望ましい。
また、蛍光検出光学系および励起光検出光学系それぞれ
と、ハーフミラー３１から光検出器７１に到るまでの光
学系との間でも、同様である。Although not shown, in order to prevent stray light from entering each of the photodetectors 71 and 72,
It is preferable to provide a light shielding plate at an appropriate place. For example,
The fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system from the sample cell 40 to the dichroic mirror 53 are close to each other in consideration of the reduction in the optical path length difference between the two and the miniaturization of the fluorescence measurement device. However, in this case, since there is a risk that stray light may enter the photodetector 72, it is particularly desirable to provide a light shielding plate between the fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system during this time.
The same applies to each of the fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system, and the optical system from the half mirror 31 to the photodetector 71.
【００２２】次に、本実施形態に係る蛍光測定装置の作
用を説明する。試料セル４０中の試料に含まれる蛍光物
質を励起するための励起光は、励起光源２１から一定強
度のものとして出射され、シンセサイザ２３から出力さ
れた一定周期の変調信号に基づいて変調器２２により強
度変調され、ハーフミラー３１およびレンズ３２を経
て、試料セル４０に入射する。この励起光のうち一部
は、ハーフミラー３１およびＮＤフィルタ３３を経て、
光検出器７１により検出される。また、試料セル４０中
の試料に励起光が照射されて試料中に含まれる蛍光物質
から発生した蛍光は、シャッタ９２が開いている時の
み、レンズ５１、バンドパスフィルタ５２、ダイクロイ
ックミラー５３およびレンズ５４を経て、光検出器７２
により検出される。また、試料セル４０を透過した励起
光は、シャッタ９３が開いている時のみ、レンズ６１、
ミラー６２、ＮＤフィルタ６３、ミラー６４、ダイクロ
イックミラー５３およびレンズ５４を経て、光検出器７
２により検出される。Next, the operation of the fluorescence measuring device according to this embodiment will be described. Excitation light for exciting the fluorescent substance contained in the sample in the sample cell 40 is emitted from the excitation light source 21 as one having a constant intensity, and is output from the synthesizer 23 by the modulator 22 based on a modulation signal of a constant cycle. The intensity is modulated, and enters the sample cell 40 via the half mirror 31 and the lens 32. A part of the excitation light passes through the half mirror 31 and the ND filter 33,
The light is detected by the light detector 71. Also, when the excitation light is applied to the sample in the sample cell 40 and the fluorescence generated from the fluorescent substance contained in the sample, the lens 51, the band-pass filter 52, the dichroic mirror 53 and the lens Through 54, the photodetector 72
Is detected by Also, the excitation light transmitted through the sample cell 40 is only transmitted when the shutter 61 is open and the lens 61,
After passing through a mirror 62, an ND filter 63, a mirror 64, a dichroic mirror 53 and a lens 54, the photodetector 7
2 detected.
【００２３】光検出器７１，７２それぞれから出力され
る電気信号は、シンセサイザ７３から出力されＲＦアン
プ７４により増幅された一定周期で強度変調されたゲイ
ン信号に従って、検出された光の強度が変調されたもの
である。すなわち、光検出器７１から出力されアンプ７
５およびバンドパスフィルタ７７を経て位相検出器７９
に入力する電気信号は、光検出器７２により検出された
蛍光および励起光それぞれの位相を検出する際の基準と
なる基準信号となる。一方、光検出器７２から出力され
アンプ７６およびバンドパスフィルタ７８を経て位相検
出器７９に入力する電気信号は、シャッタ９２が開かれ
シャッタ９３が閉じられている時には、蛍光の強度変化
を表す電気信号であり、シャッタ９２が閉じられシャッ
タ９３が開かれている時には、励起光の強度変化を表す
電気信号である。The electric signal output from each of the photodetectors 71 and 72 has its detected light intensity modulated in accordance with a gain signal output from a synthesizer 73 and amplified by a RF amplifier 74 and intensity-modulated at a constant period. It is a thing. That is, the output from the photodetector 71 and the amplifier 7
5 and a bandpass filter 77, and a phase detector 79
Are used as reference signals for detecting the phases of the fluorescence and the excitation light detected by the photodetector 72. On the other hand, when the shutter 92 is open and the shutter 93 is closed, the electric signal output from the photodetector 72 and input to the phase detector 79 via the amplifier 76 and the band-pass filter 78 is an electric signal indicating a change in the intensity of fluorescence. This signal is an electric signal indicating a change in the intensity of the excitation light when the shutter 92 is closed and the shutter 93 is opened.
【００２４】光検出器７２から出力されアンプ７６およ
びバンドパスフィルタ７８を経て位相検出器７９に入力
した電気信号の位相は、上記基準信号の位相を基準とし
て位相検出器７９により検出され、その位相を表す位相
信号が演算制御部８０へ出力される。そして、演算制御
部８０により、シャッタ制御部９１を介してシャッタ９
２が開かれシャッタ９３が閉じられている時に位相検出
器７９から入力した位相信号に基づいて蛍光の位相が求
められ、シャッタ制御部９１を介してシャッタ９２が閉
じられシャッタ９３が開かれている時に位相検出器７９
から入力した位相信号に基づいて励起光の位相が求めら
れ、さらに蛍光と励起光との間の位相差が求められる。The phase of the electric signal output from the photodetector 72 and input to the phase detector 79 via the amplifier 76 and the band-pass filter 78 is detected by the phase detector 79 with reference to the phase of the reference signal. Is output to the arithmetic and control unit 80. The arithmetic control unit 80 controls the shutter 9 via the shutter control unit 91.
When the shutter 2 is opened and the shutter 93 is closed, the phase of the fluorescence is obtained based on the phase signal input from the phase detector 79, and the shutter 92 is closed and the shutter 93 is opened via the shutter control unit 91. Sometimes the phase detector 79
, The phase of the excitation light is determined based on the phase signal input from, and the phase difference between the fluorescence and the excitation light is determined.
【００２５】なお、演算制御部８０は、蛍光および励起
光それぞれの位相の双方または何れか一方を平均化する
のが好適であり、また、蛍光と励起光との間の位相差を
平均化するのも好適である。これら何れの場合にも、ノ
イズの影響が低減され、Ｓ／Ｎ比が優れた位相差が求め
られる。It is preferable that the arithmetic and control unit 80 averages both or one of the phases of the fluorescent light and the excitation light, and also averages the phase difference between the fluorescence and the excitation light. Is also suitable. In any of these cases, the effect of noise is reduced and a phase difference with an excellent S / N ratio is required.
【００２６】図２は、従来の蛍光測定装置および本実施
形態に係る蛍光測定装置それぞれにより求められる位相
差について説明する図である。図２（ａ）は従来の蛍光
測定装置の場合を示し、図２（ｂ）は本実施形態に係る
蛍光測定装置の場合を示す。なお、ここでは試料セル４
０中の試料および蛍光物質それぞれの状態は変動せず一
定であるとする。FIG. 2 is a diagram for explaining the phase difference obtained by each of the conventional fluorescence measurement device and the fluorescence measurement device according to the present embodiment. FIG. 2A shows a case of a conventional fluorescence measurement device, and FIG. 2B shows a case of a fluorescence measurement device according to the present embodiment. Here, the sample cell 4
It is assumed that the state of each of the sample and the fluorescent substance in 0 is constant without fluctuating.
【００２７】従来の蛍光測定装置の場合には、一方の光
検出器で蛍光を検出し、他方の光検出器で励起光を検出
することから、光検出器の光検出特性の変動に起因し
て、これら２つの光検出器による検出結果に基づいて得
られる蛍光と励起光との間の位相差は、図２（ａ）に示
すように時間の経過とともに変動する。In the case of the conventional fluorescence measuring device, one of the photodetectors detects the fluorescence and the other photodetector detects the excitation light. The phase difference between the fluorescence and the excitation light obtained based on the detection results of these two photodetectors fluctuates with time as shown in FIG.
【００２８】これに対して、本実施形態に係る蛍光測定
装置の場合には、図２（ｂ）に示すように、時刻ｔ0 〜
ｔ1 、時刻ｔ2 〜ｔ3 および時刻ｔ4 〜ｔ5 それぞれの
期間では、シャッタ９２が開かれシャッタ９３が閉じら
れて、光検出器７１により検出された励起光の位相を基
準として、光検出器７２により検出された蛍光の位相が
位相検出器７９により求められる。このようにして求め
られた蛍光の位相は、光検出器７１および７２それぞれ
の光検出特性の変動に因り、時間の経過とともに変動す
る。また、時刻ｔ1 〜ｔ2 、時刻ｔ3 〜ｔ4 および時刻
ｔ5 〜ｔ6 それぞれの期間では、シャッタ９２が閉じら
れシャッタ９３が開かれて、光検出器７１により検出さ
れた励起光の位相を基準として、光検出器７２により検
出された励起光の位相が位相検出器７９により求められ
る。このようにして求められた励起光の位相も、光検出
器７１および７２それぞれの光検出特性の変動に因り、
時間の経過とともに変動する。On the other hand, in the case of the fluorescence measuring device according to the present embodiment, as shown in FIG.
In each of t1, time t2 to t3 and time t4 to t5, the shutter 92 is opened and the shutter 93 is closed, and the light detector 72 detects the phase of the excitation light detected by the light detector 71 as a reference. The phase of the fluorescence thus obtained is obtained by the phase detector 79. The phase of the fluorescent light obtained in this way fluctuates with time due to fluctuations in the light detection characteristics of the photodetectors 71 and 72. Further, in each of the time periods t1 to t2, the time periods t3 to t4, and the time periods t5 to t6, the shutter 92 is closed and the shutter 93 is opened, and the light is detected with reference to the phase of the excitation light detected by the photodetector 71. The phase of the excitation light detected by the detector 72 is obtained by the phase detector 79. The phase of the excitation light obtained in this manner also depends on the fluctuation of the light detection characteristics of the photodetectors 71 and 72,
It fluctuates over time.
【００２９】そして、演算制御部８０により、時刻ｔ0
〜ｔ1 の期間に求められた蛍光の位相の平均値と、時刻
ｔ1 〜ｔ2 の期間に求められた励起光の位相の平均値と
に基づいて、蛍光と励起光との間の位相差が求められ
る。時刻ｔ2 〜ｔ3 の期間に求められた蛍光の位相の平
均値と、時刻ｔ3 〜ｔ4 の期間に求められた励起光の位
相の平均値とに基づいて、蛍光と励起光との間の位相差
が求められる。また、時刻ｔ4 〜ｔ5 の期間に求められ
た蛍光の位相の平均値と、時刻ｔ5 〜ｔ6 の期間に求め
られた励起光の位相の平均値とに基づいて、蛍光と励起
光との間の位相差が求められる。このようにして蛍光と
励起光との間の位相差を求める際に、光検出器７１およ
び７２それぞれの光検出特性の変動が相殺されるので、
蛍光と励起光との間の位相差が正確に測定される。Then, the arithmetic control unit 80 controls the time t0.
The phase difference between the fluorescence and the excitation light is determined based on the average value of the phase of the fluorescence determined during the period from t1 to t1 and the average value of the phase of the excitation light determined during the period from the time t1 to t2. Can be The phase difference between the fluorescence and the excitation light based on the average value of the phase of the fluorescence obtained during the period of time t2 to t3 and the average value of the phase of the excitation light obtained during the period of time t3 to t4. Is required. Further, based on the average value of the phase of the fluorescence obtained during the period from time t4 to t5 and the average value of the phase of the excitation light obtained during the period from time t5 to t6, the difference between the fluorescence and the excitation light is obtained. A phase difference is determined. When the phase difference between the fluorescence and the excitation light is obtained in this manner, the fluctuations in the photodetection characteristics of the photodetectors 71 and 72 are canceled out.
The phase difference between the fluorescence and the excitation light is accurately measured.
【００３０】次に、従来の蛍光測定装置および本実施形
態に係る蛍光測定装置それぞれによる位相差測定の結果
について説明する。図３および図４それぞれは、従来の
蛍光測定装置および本実施形態に係る蛍光測定装置それ
ぞれによる位相差測定の結果を示すグラフである。図３
は、一方のシャッタが開かれ他方のシャッタが閉じられ
ている各期間において１００個の位相データを求めて平
均化する場合のグラフであり、図４は、一方のシャッタ
が開かれ他方のシャッタが閉じられている各期間におい
て５０個の位相データを求めて平均化する場合のグラフ
である。Next, the results of phase difference measurement by the conventional fluorescence measurement device and the fluorescence measurement device according to the present embodiment will be described. 3 and 4 are graphs showing the results of phase difference measurement by the conventional fluorescence measurement device and the fluorescence measurement device according to the present embodiment, respectively. FIG.
FIG. 4 is a graph in a case where 100 phase data are obtained and averaged in each period when one shutter is opened and the other shutter is closed. FIG. 4 is a graph in which one shutter is opened and the other shutter is closed. It is a graph at the time of calculating | requiring and averaging 50 phase data in each closed period.
【００３１】ここで、励起光源２１は、Ｈｅ−Ｎｅレー
ザ光源であり、これから出射される波長５４３．５ｎｍ
のレーザ光を励起光とした。シンセサイザ２３から変調
器２２へ出力される変調信号は、周波数が２０ＭＨｚで
あり、ビート周波数が１０Ｈｚであった。試料セル４０
中の試料は、蛍光物質としてローダミンＢを１０-6Ｍ含
む水溶液であり、測定の期間中で一定とした。これらの
図から判るように、蛍光と励起光との間の位相差は、従
来の蛍光測定装置では時間の経過とともに大きくなって
いくが、本実施形態に係る蛍光測定装置では変動が小さ
い。Here, the excitation light source 21 is a He—Ne laser light source, and a wavelength of 543.5 nm emitted therefrom.
Was used as excitation light. The modulation signal output from the synthesizer 23 to the modulator 22 had a frequency of 20 MHz and a beat frequency of 10 Hz. Sample cell 40
The sample therein was an aqueous solution containing 10 -6 M of rhodamine B as a fluorescent substance, and was kept constant during the measurement. As can be seen from these figures, the phase difference between the fluorescence and the excitation light increases with time in the conventional fluorescence measurement device, but the fluctuation is small in the fluorescence measurement device according to the present embodiment.
【００３２】以上のように、本実施形態に係る蛍光測定
装置では、光検出器７１等により得られる基準信号の位
相を基準として、光検出器７２により検出された蛍光お
よび励起光それぞれの位相が検出され、蛍光と励起光と
の間の位相差が求められるので、光検出器７１および７
２それぞれの光検出特性が変動したとしても、それらの
光検出特性の変動は、蛍光と励起光との間の位相差が求
められる際に相殺される。したがって、位相差ドリフト
の問題が解消され、位相差が正確に測定されて、蛍光寿
命または蛍光寿命と関連ある物理的もしくは化学的な特
性量等が正確に測定される。As described above, in the fluorescence measuring apparatus according to the present embodiment, the phases of the fluorescence and the excitation light detected by the photodetector 72 are determined based on the phase of the reference signal obtained by the photodetector 71 and the like. Since the detected light and the phase difference between the fluorescence and the excitation light are obtained, the photodetectors 71 and 7 are detected.
2 Even if the respective light detection characteristics fluctuate, the fluctuations in the light detection characteristics are canceled when the phase difference between the fluorescence and the excitation light is obtained. Therefore, the problem of the phase difference drift is solved, the phase difference is accurately measured, and the fluorescence lifetime or a physical or chemical characteristic amount related to the fluorescence lifetime is accurately measured.
【００３３】（第２の実施形態）次に、第２の実施形態
について説明する。図５は、第２の実施形態に係る蛍光
測定装置の構成図である。本実施形態に係る蛍光測定装
置は、第１の実施形態の場合と比較して、シャッタ制御
部９１ならびにシャッタ９２および９３に替えて、チョ
ッパ制御部９４およびチョッパ９５が設けられている点
が異なる。(Second Embodiment) Next, a second embodiment will be described. FIG. 5 is a configuration diagram of the fluorescence measurement device according to the second embodiment. The fluorescence measurement device according to the present embodiment is different from the first embodiment in that a chopper control unit 94 and a chopper 95 are provided instead of the shutter control unit 91 and the shutters 92 and 93. .
【００３４】本実施形態では、演算制御部８０は、位相
検出器７９から出力された位相信号を入力するととも
に、チョッパ制御部９４を介してチョッパ９５の回転を
制御する。チョッパ９５は、光を通過させる通過部と光
を遮断する遮断部とが周方向に交互に設けられ中心点を
中心として回転するものであって、試料セル４０とレン
ズ５１との間およびミラー６２とＮＤフィルタ６３との
間に設けられ、チョッパ制御部９４による指示に従って
蛍光検出光学系および励起光検出光学系それぞれの光路
のうちの一方の光路を交互に遮断するものである。そし
て、演算制御部８０は、チョッパ９５の回転位置に関す
る情報および位相検出器７９から入力した位相信号に基
づいて、蛍光と励起光との間の位相差を検出する。In the present embodiment, the arithmetic control unit 80 inputs the phase signal output from the phase detector 79 and controls the rotation of the chopper 95 via the chopper control unit 94. The chopper 95 is configured such that passing portions for passing light and blocking portions for blocking light are alternately provided in the circumferential direction and rotate about a center point. The chopper 95 is provided between the sample cell 40 and the lens 51 and the mirror 62. And an ND filter 63 for alternately blocking one of the optical paths of the fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system in accordance with an instruction from the chopper control unit 94. Then, the arithmetic and control unit 80 detects a phase difference between the fluorescence and the excitation light based on the information regarding the rotational position of the chopper 95 and the phase signal input from the phase detector 79.
【００３５】図６は、本実施形態に係る蛍光測定装置に
おけるチョッパ９５の例を示す図である。このチョッパ
９５は、中心点９５Ａを中心として回転する円形状の板
に設けられた２つの開口部それぞれが通過部９５Ｂおよ
び９５Ｄとされ、周方向に関し通過部９５Ｂと通過部９
５Ｄとに挟まれた部分が遮断部９５Ｃおよび９５Ｅとさ
れている。通過部９５Ｂ、遮断部９５Ｃ、通過部９５Ｄ
および遮断部９５Ｅそれぞれの間の境界線は、中心点９
５Ａで互いに直交する２つの直線のうちの何れかの直線
上にある。FIG. 6 is a diagram showing an example of the chopper 95 in the fluorescence measuring device according to the present embodiment. In the chopper 95, two openings provided in a circular plate rotating about a center point 95A are respectively defined as passing portions 95B and 95D, and the passing portions 95B and 95D are formed in the circumferential direction.
The portions sandwiched between 5D are cutoff portions 95C and 95E. Passing section 95B, blocking section 95C, passing section 95D
A boundary line between each of the cut-off portions 95E is a center point 9
5A is on one of two straight lines orthogonal to each other.
【００３６】本実施形態に係る蛍光測定装置の作用は、
第１の実施形態に係る蛍光測定装置の作用と略同様であ
るが、蛍光検出光学系および励起光検出光学系それぞれ
の光路のうちの一方の光路がチョッパ制御部９４および
チョッパ９５により交互に遮断される点で異なる。以下
では、主に本実施形態に係る蛍光測定装置におけるチョ
ッパ９５の作用について図７および図８を用いて説明す
る。The operation of the fluorescence measuring device according to this embodiment is as follows.
The operation of the fluorescence measurement apparatus according to the first embodiment is substantially the same as that of the first embodiment, except that one of the optical paths of the fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system is alternately cut off by the chopper control unit 94 and the chopper 95. Is different. Hereinafter, the operation of the chopper 95 in the fluorescence measurement device according to the present embodiment will be mainly described with reference to FIGS. 7 and 8.
【００３７】図７は、本実施形態に係る蛍光測定装置に
おけるチョッパ９５の各回転位置それぞれについて、蛍
光検出光学系および励起光検出光学系それぞれの光路と
チョッパ９５の通過部および遮断部との関係を説明する
図である。この図において、蛍光検出光学系の光路がチ
ョッパ９５の面と交わる部分を符号Ａで示し、励起光光
検出光学系の光路がチョッパ９５の面と交わる部分を符
号Ｂで示している。この図に示すように、チョッパ９５
の中心点９５Ａから蛍光検出光学系の光路Ａおよび励起
光検出光学系の光路Ｂそれぞれへ下した直線が互いにな
す角度が９０度となるように、蛍光検出光学系の光路
Ａ、励起光検出光学系の光路Ｂおよびチョッパ９５それ
ぞれが配置される。また、図８は、本実施形態に係る蛍
光測定装置により求められる位相差について説明する図
である。FIG. 7 shows the relationship between the optical path of each of the fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system and the passage section and the cutoff section of the chopper 95 for each rotational position of the chopper 95 in the fluorescence measurement apparatus according to this embodiment. FIG. In this figure, the portion where the optical path of the fluorescence detection optical system intersects the surface of the chopper 95 is denoted by reference numeral A, and the portion where the optical path of the excitation light detection optical system crosses the surface of the chopper 95 is denoted by reference character B. As shown in FIG.
The optical path A of the fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system are arranged such that the angle formed by the straight line extending from the center point 95A to the optical path A of the fluorescence detection optical system and the optical path B of the excitation light detection optical system is 90 degrees. The optical path B of the system and the chopper 95 are arranged. FIG. 8 is a diagram for explaining a phase difference obtained by the fluorescence measurement device according to the present embodiment.
【００３８】図７（ａ）に示すように蛍光検出光学系の
光路Ａが通過部９５Ｄを通過し且つ励起光検出光学系の
光路Ｂが遮断部９５Ｃにより遮断される回転位置にチョ
ッパ９５があるとき（図８の時刻ｔ0 〜ｔ1 の期間）に
は、光検出器７１により検出された励起光の位相を基準
として、光検出器７２により検出された蛍光の位相が位
相検出器７９により求められる。その後、チョッパ９５
が中心点９５Ａを中心にして回転するに従い、蛍光検出
光学系の光路Ａが通過部９５Ｄと遮断部９５Ｃとの境界
線上にあり且つ励起光検出光学系の光路Ｂが遮断部９５
Ｃと通過部９５Ｂとの境界線上にある状態（図７
（ｂ））を経て、図７（ｃ）に示すような状態となる。As shown in FIG. 7A, the chopper 95 is located at a rotational position where the optical path A of the fluorescence detecting optical system passes through the passing portion 95D and the optical path B of the excitation light detecting optical system is blocked by the blocking portion 95C. At this time (period between times t0 and t1 in FIG. 8), the phase of the fluorescence detected by the photodetector 72 is obtained by the phase detector 79 with reference to the phase of the excitation light detected by the photodetector 71. . Then, chopper 95
Is rotated around the center point 95A, the optical path A of the fluorescence detection optical system is on the boundary between the passing portion 95D and the blocking portion 95C, and the optical path B of the excitation light detecting optical system is placed in the blocking portion 95.
C on the boundary between the passing portion 95B (FIG. 7
After (b)), the state becomes as shown in FIG. 7 (c).
【００３９】図７（ｃ）に示すように蛍光検出光学系の
光路Ａが遮断部９５Ｃにより遮断され且つ励起光検出光
学系の光路Ｂが通過部９５Ｂを通過する回転位置にチョ
ッパ９５があるとき（図８の時刻ｔ1 〜ｔ2 の期間）に
は、光検出器７１により検出された励起光の位相を基準
として、光検出器７２により検出された励起光の位相が
位相検出器７９により求められる。その後、チョッパ９
５が中心点９５Ａを中心にして回転するに従い、蛍光検
出光学系の光路Ａが遮断部９５Ｃと通過部９５Ｂとの境
界線上にあり且つ励起光検出光学系の光路Ｂが通過部９
５Ｂと遮断部９５Ｅとの境界線上にある状態（図７
（ｄ））を経て、図７（ｅ）に示すような状態となる。As shown in FIG. 7 (c), when the optical path A of the fluorescence detecting optical system is blocked by the blocking section 95C and the chopper 95 is at the rotational position where the optical path B of the excitation light detecting optical system passes through the passing section 95B. During the period from time t1 to t2 in FIG. 8, the phase of the excitation light detected by the photodetector 72 is obtained by the phase detector 79 with reference to the phase of the excitation light detected by the photodetector 71. . Then, chopper 9
As 5 rotates about the center point 95A, the optical path A of the fluorescence detection optical system is on the boundary between the blocking section 95C and the passing section 95B, and the optical path B of the excitation light detecting optical system is located on the passing section 9
7B on the boundary between the cut-off portion 95E (FIG. 7)
After (d)), the state is as shown in FIG.
【００４０】図７（ｅ）に示すように蛍光検出光学系の
光路Ａが通過部９５Ｂを通過し且つ励起光検出光学系の
光路Ｂが遮断部９５Ｅにより遮断される回転位置にチョ
ッパ９５があるとき（図８の時刻ｔ2 〜ｔ3 の期間）に
は、光検出器７１により検出された励起光の位相を基準
として、光検出器７２により検出された蛍光の位相が位
相検出器７９により求められる。As shown in FIG. 7E, the chopper 95 is located at a rotational position where the optical path A of the fluorescence detection optical system passes through the passing portion 95B and the optical path B of the excitation light detection optical system is blocked by the blocking portion 95E. At this time (period from time t2 to t3 in FIG. 8), the phase of the fluorescence detected by the photodetector 72 is obtained by the phase detector 79 with reference to the phase of the excitation light detected by the photodetector 71. .
【００４１】以降、同様にして、蛍光および励起光のう
ちの一方が交互に位相検出される。すなわち、図８に示
すように、時刻ｔ0 〜ｔ1 、時刻ｔ2 〜ｔ3 および時刻
ｔ4〜ｔ5 それぞれの期間では、光検出器７１により検
出された励起光の位相を基準として、光検出器７２によ
り検出された蛍光の位相が位相検出器７９により求めら
れる。また、時刻ｔ1 〜ｔ2 、時刻ｔ3 〜ｔ4 および時
刻ｔ5 〜ｔ6 それぞれの期間では、光検出器７１により
検出された励起光の位相を基準として、光検出器７２に
より検出された励起光の位相が位相検出器７９により求
められる。このようにして求められた蛍光および励起光
それぞれの位相は、光検出器７１および７２それぞれの
光検出特性の変動に因り、時間の経過とともに変動す
る。Thereafter, similarly, one of the fluorescence and the excitation light is alternately detected in phase. That is, as shown in FIG. 8, in each of the periods of time t0 to t1, time t2 to t3, and time t4 to t5, the phase of the excitation light detected by the photodetector 71 is used as a reference to detect by the photodetector 72. The phase of the fluorescence thus obtained is obtained by the phase detector 79. In each of the time periods t1 to t2, the time periods t3 to t4 and the time periods t5 to t6, the phase of the excitation light detected by the photodetector 72 is determined based on the phase of the excitation light detected by the photodetector 71. It is determined by the phase detector 79. The phases of the fluorescent light and the excitation light obtained in this way fluctuate with time due to fluctuations in the light detection characteristics of the photodetectors 71 and 72, respectively.
【００４２】そして、演算制御部８０により、時刻ｔ0
〜ｔ1 の期間に求められた蛍光の位相の平均値と、時刻
ｔ1 〜ｔ2 の期間に求められた励起光の位相の平均値と
に基づいて、蛍光と励起光との間の位相差が求められ
る。時刻ｔ2 〜ｔ3 の期間に求められた蛍光の位相の平
均値と、時刻ｔ3 〜ｔ4 の期間に求められた励起光の位
相の平均値とに基づいて、蛍光と励起光との間の位相差
が求められる。また、時刻ｔ4 〜ｔ5 の期間に求められ
た蛍光の位相の平均値と、時刻ｔ5 〜ｔ6 の期間に求め
られた励起光の位相の平均値とに基づいて、蛍光と励起
光との間の位相差が求められる。このようにして蛍光と
励起光との間の位相差を求める際に、光検出器７１およ
び７２それぞれの光検出特性の変動が相殺されるので、
蛍光と励起光との間の位相差が正確に測定される。Then, the arithmetic control unit 80 sets the time t0.
The phase difference between the fluorescence and the excitation light is determined based on the average value of the phase of the fluorescence determined during the period from t1 to t1 and the average value of the phase of the excitation light determined during the period from the time t1 to t2. Can be The phase difference between the fluorescence and the excitation light based on the average value of the phase of the fluorescence obtained during the period of time t2 to t3 and the average value of the phase of the excitation light obtained during the period of time t3 to t4. Is required. Further, based on the average value of the phase of the fluorescence obtained during the period from time t4 to t5 and the average value of the phase of the excitation light obtained during the period from time t5 to t6, the difference between the fluorescence and the excitation light is obtained. A phase difference is determined. When the phase difference between the fluorescence and the excitation light is obtained in this manner, the fluctuations in the photodetection characteristics of the photodetectors 71 and 72 are canceled out.
The phase difference between the fluorescence and the excitation light is accurately measured.
【００４３】以上のように、本実施形態に係る蛍光測定
装置でも、光検出器７１等により得られる基準信号の位
相を基準として、光検出器７２により検出された蛍光お
よび励起光それぞれの位相が検出され、蛍光と励起光と
の間の位相差が求められるので、光検出器７１および７
２それぞれの光検出特性が変動したとしても、それらの
光検出特性の変動は、蛍光と励起光との間の位相差が求
められる際に相殺される。したがって、位相差ドリフト
の問題が解消され、位相差が正確に測定されて、蛍光寿
命または蛍光寿命と関連ある物理的もしくは化学的な特
性量等が正確に測定される。As described above, also in the fluorescence measuring apparatus according to the present embodiment, the phases of the fluorescence and the excitation light detected by the photodetector 72 are based on the phase of the reference signal obtained by the photodetector 71 and the like. Since the detected light and the phase difference between the fluorescence and the excitation light are obtained, the photodetectors 71 and 7 are detected.
2 Even if the respective light detection characteristics fluctuate, the fluctuations in the light detection characteristics are canceled when the phase difference between the fluorescence and the excitation light is obtained. Therefore, the problem of the phase difference drift is solved, the phase difference is accurately measured, and the fluorescence lifetime or a physical or chemical characteristic amount related to the fluorescence lifetime is accurately measured.
【００４４】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。位相検出器７９に入
力する一方の信号である基準信号は、励起光の一部を分
岐して光検出器７１により検出しアンプ７５およびバン
ドパスフィルタ７７を経て生成されるものに限られるも
のではない。例えば、シンセサイザ２３および７３それ
ぞれから出力される一定周期の信号を互いに混波しロー
パスフィルタを経て生成されるものでもよい。また、励
起光発生手段は、一定周期の変調信号を出力する変調信
号発生部と、変調信号発生部から出力された変調信号に
基づいて強度変調された励起光を出力する半導体発光素
子（例えば、ＬＥＤ）とを備えたものとするとともに、
基準信号は、変調信号発生部から出力された変調信号に
基づいて生成されるものでもよい。The present invention is not limited to the above embodiment, but can be variously modified. The reference signal, which is one of the signals input to the phase detector 79, is not limited to a signal generated by branching a part of the excitation light, detecting the light by the light detector 71, and passing through the amplifier 75 and the band-pass filter 77. Absent. For example, the signals may be generated by mixing signals of a fixed period outputted from the synthesizers 23 and 73 with each other and passing through a low-pass filter. Further, the excitation light generating means includes a modulation signal generation unit that outputs a modulation signal having a constant period, and a semiconductor light emitting element that outputs excitation light that is intensity-modulated based on the modulation signal output from the modulation signal generation unit (for example, LED) and
The reference signal may be generated based on the modulation signal output from the modulation signal generator.
【００４５】また、第２の実施形態に係る蛍光測定装置
におけるチョッパ９５は、図６に示したような２対の通
過部および遮断部を有するものに限られるものではな
く、１対または３対以上の通過部および遮断部を有する
ものでもよい。例えば、図９に示すような３対の通過部
および遮断部を有するものである場合には、通過部９５
Ｂ、遮断部９５Ｃ、通過部９５Ｄ、遮断部９５Ｅ、通過
部９５Ｆおよび遮断部９５Ｇそれぞれの間の境界線は、
中心点９５Ａで互いに６０度で交わる３つの直線のうち
の何れかの直線上にある。また、この場合、チョッパ９
５の中心点９５Ａから蛍光検出光学系の光路および励起
光検出光学系の光路それぞれへ下した直線が互いになす
角度が６０度または１８０度となるように、蛍光検出光
学系の光路、励起光検出光学系の光路およびチョッパ９
５それぞれが配置される。このような構成および配置と
して、チョッパ９５が中心点９５Ａを中心にして回転す
ることにより、蛍光検出光学系および励起光検出光学系
のうちの一方の光路が交互に遮断される。Further, the chopper 95 in the fluorescence measuring device according to the second embodiment is not limited to the one having two pairs of passing portions and blocking portions as shown in FIG. 6, but one pair or three pairs. It may have the above-mentioned passing part and blocking part. For example, in the case of having three pairs of passing portions and blocking portions as shown in FIG.
B, a boundary line between each of the blocking unit 95C, the passing unit 95D, the blocking unit 95E, the passing unit 95F, and the blocking unit 95G,
It is on any one of three straight lines that intersect at 60 degrees with each other at the center point 95A. In this case, the chopper 9
5, the optical path of the fluorescence detection optical system and the excitation light detection so that the angle formed by the straight lines drawn from the center point 95A to the optical path of the fluorescence detection optical system and the optical path of the excitation light detection optical system is 60 degrees or 180 degrees, respectively. Optical path of optical system and chopper 9
5 are arranged. With such a configuration and arrangement, when the chopper 95 rotates about the center point 95A, one of the optical paths of the fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system is alternately cut off.
【００４６】[0046]
【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり、本発明に
よれば、一定周期で強度変調された励起光は、励起光発
生手段から出力され照射光学系を経て試料に照射され
る。励起光の試料への照射に伴い試料から発生した蛍光
は、蛍光検出光学系が光路遮断手段により遮断されてい
ないとき、蛍光検出光学系を経て光検出器の受光部に到
達し検出される。一方、励起光は、励起光検出光学系が
光路遮断手段により遮断されていないとき、励起光検出
光学系を経て光検出器の受光部に到達し検出される。光
検出器により検出された蛍光および励起光それぞれの位
相は、励起光の強度変調の周期と同じ周期の基準信号の
位相を基準として位相検出手段により検出される。そし
て、演算制御手段により、光路遮断手段が制御されて蛍
光検出光学系および励起光検出光学系のうちの一方の光
路が交互に遮断されるとともに、位相検出手段により検
出された蛍光および励起光それぞれの位相に基づいて、
蛍光と励起光との間の位相差が求められる。As described above in detail, according to the present invention, the excitation light whose intensity is modulated at a constant period is output from the excitation light generating means and is irradiated on the sample through the irradiation optical system. Fluorescence generated from the sample due to the irradiation of the sample with the excitation light reaches the light receiving section of the photodetector via the fluorescence detection optical system and is detected when the fluorescence detection optical system is not blocked by the light path blocking means. On the other hand, when the excitation light detection optical system is not blocked by the optical path blocking means, the excitation light reaches the light receiving unit of the photodetector via the excitation light detection optical system and is detected. The respective phases of the fluorescence and the excitation light detected by the photodetector are detected by the phase detection means based on the phase of the reference signal having the same cycle as the cycle of the intensity modulation of the excitation light. Then, the arithmetic control unit controls the optical path blocking unit to alternately block one of the optical paths of the fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system, and detects the fluorescence and excitation light detected by the phase detection unit, respectively. Based on the phase of
The phase difference between the fluorescence and the excitation light is determined.
【００４７】このような構成としたことにより、基準信
号の位相を基準として、光検出器により検出された蛍光
および励起光それぞれの位相が検出され、蛍光と励起光
との間の位相差が求められるので、光検出器の光検出特
性が変動したとしても、その光検出特性の変動は、蛍光
と励起光との間の位相差が求められる際に相殺される。
したがって、位相差ドリフトの問題が解消され、位相差
が正確に測定されて、蛍光寿命または蛍光寿命と関連あ
る物理的もしくは化学的な特性量等が正確に測定され
る。With this configuration, the phases of the fluorescence and the excitation light detected by the photodetector are detected with reference to the phase of the reference signal, and the phase difference between the fluorescence and the excitation light is obtained. Therefore, even if the light detection characteristic of the photodetector changes, the change in the light detection characteristic is canceled when the phase difference between the fluorescence and the excitation light is obtained.
Therefore, the problem of the phase difference drift is solved, the phase difference is accurately measured, and the fluorescence lifetime or a physical or chemical characteristic amount related to the fluorescence lifetime is accurately measured.
【００４８】また、演算制御手段が位相検出手段により
検出された蛍光および励起光それぞれの位相の双方また
は何れか一方を平均化する場合や、演算制御手段が蛍光
と励起光との間の位相差を平均化する場合には、ノイズ
の影響が低減され、Ｓ／Ｎ比が優れた位相差が求められ
る。In the case where the arithmetic and control means averages both or any one of the phases of the fluorescence and the excitation light detected by the phase detection means, or the arithmetic and control means determines the phase difference between the fluorescence and the excitation light. Are averaged, the influence of noise is reduced, and a phase difference with an excellent S / N ratio is required.
【図１】第１の実施形態に係る蛍光測定装置の構成図で
ある。FIG. 1 is a configuration diagram of a fluorescence measurement device according to a first embodiment.
【図２】従来の蛍光測定装置および第１の実施形態に係
る蛍光測定装置それぞれにより求められる位相差につい
て説明する図である。FIG. 2 is a diagram illustrating a phase difference obtained by each of a conventional fluorescence measurement device and the fluorescence measurement device according to the first embodiment.
【図３】従来の蛍光測定装置および第１の実施形態に係
る蛍光測定装置それぞれによる位相差測定の結果を示す
グラフである。FIG. 3 is a graph showing results of phase difference measurement by a conventional fluorescence measurement device and a fluorescence measurement device according to the first embodiment.
【図４】従来の蛍光測定装置および第１の実施形態に係
る蛍光測定装置それぞれによる位相差測定の結果を示す
グラフである。FIG. 4 is a graph showing the results of phase difference measurement by the conventional fluorescence measurement device and the fluorescence measurement device according to the first embodiment.
【図５】第２の実施形態に係る蛍光測定装置の構成図で
ある。FIG. 5 is a configuration diagram of a fluorescence measurement device according to a second embodiment.
【図６】第２の実施形態に係る蛍光測定装置におけるチ
ョッパの例を示す図である。FIG. 6 is a diagram illustrating an example of a chopper in a fluorescence measurement device according to a second embodiment.
【図７】第２の実施形態に係る蛍光測定装置におけるチ
ョッパ９５の各回転位置それぞれについて、蛍光検出光
学系および励起光検出光学系それぞれの光路と、チョッ
パ９５の通過部および遮断部との関係を説明する図であ
る。FIG. 7 shows the relationship between the optical path of each of the fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system, and the passage section and the cutoff section of the chopper 95 for each rotational position of the chopper 95 in the fluorescence measurement device according to the second embodiment. FIG.
【図８】第２の実施形態に係る蛍光測定装置により求め
られる位相差について説明する図である。FIG. 8 is a diagram illustrating a phase difference obtained by a fluorescence measurement device according to a second embodiment.
【図９】第２の実施形態に係る蛍光測定装置におけるチ
ョッパの他の例を示す図である。FIG. 9 is a diagram illustrating another example of the chopper in the fluorescence measurement device according to the second embodiment.
【図１０】従来の蛍光測定装置の構成図である。FIG. 10 is a configuration diagram of a conventional fluorescence measurement device.
２１…励起光源、２２…変調器、２３…シンセサイザ、
３１…ハーフミラー、３２…レンズ、３３…ＮＤフィル
タ、４０…試料セル、５１…レンズ、５２…バンドパス
フィルタ、５３…ダイクロイックミラー、５４…レン
ズ、６１…レンズ、６２…ミラー、６３…ＮＤフィル
タ、６４…ミラー、７１，７２…光検出器、７３…シン
セサイザ、７４…ＲＦアンプ、７５，７６…アンプ、７
７，７８…バンドパスフィルタ、７９…位相検出器、８
０…演算制御部、９１…シャッタ制御部、９２，９３…
シャッタ、９４…チョッパ制御部、９５…チョッパ。21 ... excitation light source, 22 ... modulator, 23 ... synthesizer,
31 half mirror, 32 lens, 33 ND filter, 40 sample cell, 51 lens, 52 bandpass filter, 53 dichroic mirror, 54 lens, 61 lens, 62 mirror, 63 ND filter , 64: mirror, 71, 72: photodetector, 73: synthesizer, 74: RF amplifier, 75, 76: amplifier, 7
7, 78: bandpass filter, 79: phase detector, 8
0: arithmetic control unit, 91: shutter control unit, 92, 93 ...
Shutter, 94: chopper control unit, 95: chopper.
Claims (8)
する励起光発生手段と、 前記励起光発生手段から出力された前記励起光を試料に
照射する照射光学系と、 前記照射光学系による前記励起光の前記試料への照射に
伴い前記試料から発生した蛍光を入力し所定位置へ導く
蛍光検出光学系と、 前記試料への照射前の前記励起光の一部または前記試料
を透過した後の前記励起光を入力し前記所定位置へ導く
励起光検出光学系と、 前記蛍光検出光学系および前記励起光検出光学系のうち
の一方の光路を交互に遮断する光路遮断手段と、 前記蛍光検出光学系により導かれた前記蛍光または前記
励起光検出光学系により導かれた前記励起光を、前記所
定位置に配された受光部により受光して検出する光検出
器と、 前記励起光の強度変調の周期と同じ周期の基準信号の位
相を基準として、前記光検出器により検出された前記蛍
光および前記励起光それぞれの位相を検出する位相検出
手段と、 前記光路遮断手段を制御するとともに、前記位相検出手
段により検出された前記蛍光および前記励起光それぞれ
の位相に基づいて前記蛍光と前記励起光との間の位相差
を求める演算制御手段と、 を備えることを特徴とする蛍光測定装置。1. An excitation light generating means for outputting excitation light whose intensity is modulated at a constant period, an irradiation optical system for irradiating a sample with the excitation light output from the excitation light generating means, and an irradiation optical system. A fluorescence detection optical system for inputting fluorescence generated from the sample with irradiation of the sample with the excitation light and guiding the fluorescence to a predetermined position; and a portion of the excitation light before the sample is irradiated or after transmitting the sample. An excitation light detection optical system that inputs the excitation light and guides it to the predetermined position; an optical path blocking unit that alternately blocks one of the optical paths of the fluorescence detection optical system and the excitation light detection optical system; A photodetector that receives and detects the fluorescence guided by an optical system or the excitation light guided by the excitation light detection optical system by a light receiving unit disposed at the predetermined position; and intensity modulation of the excitation light. The same as the cycle of A phase detection unit that detects a phase of each of the fluorescence and the excitation light detected by the photodetector with reference to a phase of a period reference signal, and controls the optical path blocking unit and detects the phase by the phase detection unit. A control unit for calculating a phase difference between the fluorescence and the excitation light based on the phases of the fluorescence and the excitation light, respectively.
により検出された前記蛍光および前記励起光それぞれの
位相の双方または何れか一方を平均化することを特徴と
する請求項１記載の蛍光測定装置。2. The fluorescence measurement according to claim 1, wherein the arithmetic control means averages both or one of the phases of the fluorescence and the excitation light detected by the phase detection means. apparatus.
起光との間の位相差を平均化することを特徴とする請求
項１記載の蛍光測定装置。3. The fluorescence measurement apparatus according to claim 1, wherein the arithmetic control unit averages a phase difference between the fluorescence and the excitation light.
と、 前記励起光検出光学系の光路を遮断する第２のシャッタ
と、 を備えることを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装
置。4. The optical path blocking means includes: a first shutter that blocks an optical path of the fluorescence detection optical system; and a second shutter that blocks an optical path of the excitation light detection optical system. The fluorescence measurement device according to claim 1.
過部と光を遮断する遮断部とが周方向に交互に設けられ
中心点を中心として回転するチョッパであることを特徴
とする請求項１記載の蛍光測定装置。5. The light path blocking means is a chopper which is provided with a light passing part and a light blocking part alternately in a circumferential direction and rotates about a center point. 2. The fluorescence measuring device according to 1.
手段と、 前記励起光分岐手段により分岐された前記励起光を検出
して前記基準信号を発生する基準信号発生手段と、 を更に備えることを特徴とする請求項１記載の蛍光測定
装置。6. A pumping light splitting means for splitting a part of the pumping light, and a reference signal generating means for detecting the pumping light split by the pumping light splitting means and generating the reference signal. The fluorescence measuring device according to claim 1, further comprising:
部から出力された変調信号に基づいて強度変調して出力
する変調器と、 を備え、 前記基準信号は、前記変調信号発生部から出力された変
調信号に基づくものであることを特徴とする請求項１記
載の蛍光測定装置。7. The pumping light generating means includes: a pumping light source that outputs a pumping light having a constant intensity; a modulation signal generating unit that outputs a modulation signal having a constant period; and a pumping light output from the pumping light source. A modulator that performs intensity modulation based on the modulation signal output from the modulation signal generation unit and outputs the modulated signal, wherein the reference signal is based on the modulation signal output from the modulation signal generation unit. The fluorescence measuring device according to claim 1, wherein
強度変調された励起光を出力する半導体発光素子と、 を備え、 前記基準信号は、前記変調信号発生部から出力された変
調信号に基づくものであることを特徴とする請求項１記
載の蛍光測定装置。8. The pumping light generator, wherein the pumping light generator outputs a modulation signal having a constant period, and outputs a pumping light intensity-modulated based on the modulation signal output from the modulation signal generator. The fluorescence measurement device according to claim 1, further comprising: a semiconductor light emitting element, wherein the reference signal is based on a modulation signal output from the modulation signal generator.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10947798A JPH11304707A (en) | 1998-04-20 | 1998-04-20 | Fluorescence measuring apparatus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10947798A JPH11304707A (en) | 1998-04-20 | 1998-04-20 | Fluorescence measuring apparatus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11304707A true JPH11304707A (en) | 1999-11-05 |
Family
ID=14511242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10947798A Pending JPH11304707A (en) | 1998-04-20 | 1998-04-20 | Fluorescence measuring apparatus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11304707A (en) |
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- 1998-04-20 JP JP10947798A patent/JPH11304707A/en active Pending
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