JPH11299486A - 改変型酵素及びそれを用いた製造法 - Google Patents
改変型酵素及びそれを用いた製造法Info
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- JPH11299486A JPH11299486A JP10114907A JP11490798A JPH11299486A JP H11299486 A JPH11299486 A JP H11299486A JP 10114907 A JP10114907 A JP 10114907A JP 11490798 A JP11490798 A JP 11490798A JP H11299486 A JPH11299486 A JP H11299486A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】アリールマロン酸脱炭酸酵素の触媒活性・耐熱
性の向上等の諸性質の改良が求められていた。 【解決手段】野生型アリールマロン酸脱炭酸酵素のアミ
ノ酸配列45番目のプロリン残基がロイシン残基に置換
されている改変型アリールマロン酸脱炭酸酵素。また改
変型アリールマロン酸脱炭酸酵素を用いて、α−フェニ
ル−α−メチルマロン酸から光学活性なα−フェニルプ
ロピオン酸を製造する。
性の向上等の諸性質の改良が求められていた。 【解決手段】野生型アリールマロン酸脱炭酸酵素のアミ
ノ酸配列45番目のプロリン残基がロイシン残基に置換
されている改変型アリールマロン酸脱炭酸酵素。また改
変型アリールマロン酸脱炭酸酵素を用いて、α−フェニ
ル−α−メチルマロン酸から光学活性なα−フェニルプ
ロピオン酸を製造する。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なアリールマロ
ン酸脱炭酸酵素及びそれを用いた製造法に関するもので
ある。
ン酸脱炭酸酵素及びそれを用いた製造法に関するもので
ある。
【0002】
【従来の技術】光学活性アリールアルカン酸は強電磁液
晶や医農薬の合成中間体として有用な化合物である。従
来、二置換マロン酸誘導体を原料に不斉脱炭酸反応を行
い、光学活性アリールアルカン酸を高い収率で得る方法
は知られていなかったが、アリールマロン酸脱炭酸酵素
(以下、AMDaseと略記する)の発見により容易に
得られるようになった(特開平5−1766778号公
報)。その後、この酵素は性質が詳細に解析され(特開
平5−227963号公報、特開平5−284981号
公報)、また本酵素を用いるフッ素含有α- アリールア
ルカン酸化合物の合成方法も開示される様になった(特
開平5- 260983号公報)。さらには本酵素の大量
生産のために大腸菌への遺伝子のクローニングも成さ
れ、また、この酵素のアミノ酸配列も明らかにされた
(特開平5−328976号公報)。AMDaseのア
ミノ酸配列は、特開平5−328976及び9−224
675に記載された通りである。
晶や医農薬の合成中間体として有用な化合物である。従
来、二置換マロン酸誘導体を原料に不斉脱炭酸反応を行
い、光学活性アリールアルカン酸を高い収率で得る方法
は知られていなかったが、アリールマロン酸脱炭酸酵素
(以下、AMDaseと略記する)の発見により容易に
得られるようになった(特開平5−1766778号公
報)。その後、この酵素は性質が詳細に解析され(特開
平5−227963号公報、特開平5−284981号
公報)、また本酵素を用いるフッ素含有α- アリールア
ルカン酸化合物の合成方法も開示される様になった(特
開平5- 260983号公報)。さらには本酵素の大量
生産のために大腸菌への遺伝子のクローニングも成さ
れ、また、この酵素のアミノ酸配列も明らかにされた
(特開平5−328976号公報)。AMDaseのア
ミノ酸配列は、特開平5−328976及び9−224
675に記載された通りである。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】ところで、近年の遺伝
子工学技術の進歩により、タンパク質アミノ酸配列を人
為的に改変することによって、蛋白質の持つ諸性質を、
より工業的に使用しやすく改変することが可能になって
きた。例えばアスパルテーム前駆体合成に利用される酵
素であるサーモリシンのアミノ酸配列を人為的に改変す
ることにより触媒活性を向上させるような発明が成され
ている(特開平6−181761号公報)。AMDas
eにおいても、よりアリールアルカン酸の生産性を向上
させるため、触媒活性の向上等の諸性質の改良が求めら
れていた。そのために、AMDaseの101番目のシ
ステイン残基を他のアミノ酸に置換することにより、フ
ェニルマロン酸の脱炭酸に対する触媒活性が向上された
変異体が作製されている(特開平9−224675)。
当該出願の変異型AMDaseにおいてはフェニルマロ
ン酸などに対する活性について開示されているが、さら
に触媒活性の向上や耐熱性の向上が求められていた。
子工学技術の進歩により、タンパク質アミノ酸配列を人
為的に改変することによって、蛋白質の持つ諸性質を、
より工業的に使用しやすく改変することが可能になって
きた。例えばアスパルテーム前駆体合成に利用される酵
素であるサーモリシンのアミノ酸配列を人為的に改変す
ることにより触媒活性を向上させるような発明が成され
ている(特開平6−181761号公報)。AMDas
eにおいても、よりアリールアルカン酸の生産性を向上
させるため、触媒活性の向上等の諸性質の改良が求めら
れていた。そのために、AMDaseの101番目のシ
ステイン残基を他のアミノ酸に置換することにより、フ
ェニルマロン酸の脱炭酸に対する触媒活性が向上された
変異体が作製されている(特開平9−224675)。
当該出願の変異型AMDaseにおいてはフェニルマロ
ン酸などに対する活性について開示されているが、さら
に触媒活性の向上や耐熱性の向上が求められていた。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは特開平5−
328976号公報に開示されているAMDaseのア
ミノ酸配列およびDNA塩基配列を元に、種々の変異体
を作製し、その諸性質を詳細に解析した結果、本発明を
完成するに至った。
328976号公報に開示されているAMDaseのア
ミノ酸配列およびDNA塩基配列を元に、種々の変異体
を作製し、その諸性質を詳細に解析した結果、本発明を
完成するに至った。
【0005】即ち本発明は、野生型アリールマロン酸脱
炭酸酵素のアミノ酸配列45番目のプロリン残基が他の
アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変
型アリールマロン酸脱炭酸酵素である。また本発明は、
一般式[I]
炭酸酵素のアミノ酸配列45番目のプロリン残基が他の
アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変
型アリールマロン酸脱炭酸酵素である。また本発明は、
一般式[I]
【0006】
【化3】
【0007】(式中、Arはアリール基を示し、Rは水
素原子またはメチル基を示す)で表される化合物を、前
述の改変型アリールマロン酸脱炭酸酵素と接触させるこ
とを特徴とする、一般式[II]
素原子またはメチル基を示す)で表される化合物を、前
述の改変型アリールマロン酸脱炭酸酵素と接触させるこ
とを特徴とする、一般式[II]
【0008】
【化4】
【0009】(式中、Ar及びRは前述と同様のものを
示す)で表される化合物の製造法である。以下、本発明
をさらに詳細に説明する。
示す)で表される化合物の製造法である。以下、本発明
をさらに詳細に説明する。
【0010】本発明の変異型AMDaseは、野生型A
MDaseのアミノ酸配列45番目のプロリン残基が他
のアミノ酸残基に置換されている。45番目のプロリン
残基を置換するアミノ酸としては特に限定は無いが、疎
水性アミノ酸が好ましく、特にロイシンが好ましい。4
5番目のプロリンがロイシンに置換された場合は、野生
型AMDaseと比較して、α−フェニル−α−メチル
マロン酸の脱炭酸反応に対する活性が3割以上向上し、
またT1/2が3℃程度向上される。なおT1/2とは、AM
DaseをpH8.5で30分間保温した場合に50%
の酵素が失活する温度である。
MDaseのアミノ酸配列45番目のプロリン残基が他
のアミノ酸残基に置換されている。45番目のプロリン
残基を置換するアミノ酸としては特に限定は無いが、疎
水性アミノ酸が好ましく、特にロイシンが好ましい。4
5番目のプロリンがロイシンに置換された場合は、野生
型AMDaseと比較して、α−フェニル−α−メチル
マロン酸の脱炭酸反応に対する活性が3割以上向上し、
またT1/2が3℃程度向上される。なおT1/2とは、AM
DaseをpH8.5で30分間保温した場合に50%
の酵素が失活する温度である。
【0011】本発明の変異型AMDaseの製造法には
特に限定はなく、任意の公知の方法を実施することが可
能であり、最終的に目的とする変異型AMDaseが得
られればその製造方法は問わないものである。例えば、
野生型AMDaseを化学的方法で直接改変することも
可能である。また、変異型AMDaseに相当する遺伝
子を、野生型AMDaseへの点突然変異の導入または
完全化学合成により作成し、その遺伝子で形質転換され
た任意の細胞に生産させる事も可能である。なお、本発
明の変異型AMDaseは、野生型AMDaseの45
番目に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換され
ていれば良く、その他のアミノ酸配列が一部欠損・挿入
がされていても、また他の部位にアミノ酸置換が行われ
ていても本発明の範囲内である。
特に限定はなく、任意の公知の方法を実施することが可
能であり、最終的に目的とする変異型AMDaseが得
られればその製造方法は問わないものである。例えば、
野生型AMDaseを化学的方法で直接改変することも
可能である。また、変異型AMDaseに相当する遺伝
子を、野生型AMDaseへの点突然変異の導入または
完全化学合成により作成し、その遺伝子で形質転換され
た任意の細胞に生産させる事も可能である。なお、本発
明の変異型AMDaseは、野生型AMDaseの45
番目に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換され
ていれば良く、その他のアミノ酸配列が一部欠損・挿入
がされていても、また他の部位にアミノ酸置換が行われ
ていても本発明の範囲内である。
【0012】本発明では、このような変異型AMDas
eを一般式[I]で表される化合物と接触させることに
より、一般式[II]で表される化合物を製造すること
ができる。一般式[I][II]において、Rは水素原
子またはメチル基を表し、Arはアリール基を表す。ア
リール基としては、例えばフェニル基、α−ナフチル
基、β−ナフチル基、2−フリル基、3−フリル基、2
−チエニル基、3−チエニル基などがあげられる。これ
らは置換基を有していてもよい。置換基としては、ハロ
ゲン、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン化アルキル
基、フェニル基、ベンゾイル基、ベンジル基などがあ
る。
eを一般式[I]で表される化合物と接触させることに
より、一般式[II]で表される化合物を製造すること
ができる。一般式[I][II]において、Rは水素原
子またはメチル基を表し、Arはアリール基を表す。ア
リール基としては、例えばフェニル基、α−ナフチル
基、β−ナフチル基、2−フリル基、3−フリル基、2
−チエニル基、3−チエニル基などがあげられる。これ
らは置換基を有していてもよい。置換基としては、ハロ
ゲン、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン化アルキル
基、フェニル基、ベンゾイル基、ベンジル基などがあ
る。
【0013】本発明では、一般式[I]で表される化合
物を変異型AMDaseに接触させるときの条件は特に
限定はない。しかしながら、温度は好ましくは10〜5
0℃、さらに好ましくは20〜40℃、pHは好ましく
は5.0〜9.5、さらに好ましくは6.0〜9.0、
時間は他の条件との兼ね合いによるが、好ましくは数分
〜数日である。
物を変異型AMDaseに接触させるときの条件は特に
限定はない。しかしながら、温度は好ましくは10〜5
0℃、さらに好ましくは20〜40℃、pHは好ましく
は5.0〜9.5、さらに好ましくは6.0〜9.0、
時間は他の条件との兼ね合いによるが、好ましくは数分
〜数日である。
【0014】本発明の変異型AMDaseは、一般式
[I]においてRが水素原子の場合(すなわち一般式
[I]がα−アリールマロン酸)だけでなく、Rがメチ
ル基の場合(すなわち一般式[I]がα−アリール−α
−メチルマロン酸)のように、メチル基が置換したアリ
ールマロン酸をも基質とするところに特徴がある。また
この反応において、Rがメチル基の場合、生成物のα−
アリールカルボン酸はほぼ100%eeの光学純度のR
体が得られることも特徴の1つである。
[I]においてRが水素原子の場合(すなわち一般式
[I]がα−アリールマロン酸)だけでなく、Rがメチ
ル基の場合(すなわち一般式[I]がα−アリール−α
−メチルマロン酸)のように、メチル基が置換したアリ
ールマロン酸をも基質とするところに特徴がある。また
この反応において、Rがメチル基の場合、生成物のα−
アリールカルボン酸はほぼ100%eeの光学純度のR
体が得られることも特徴の1つである。
【0015】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
【0016】実施例1<変異型AMDase遺伝子およ
びその保持菌の調製> 常法にしたがって抽出したプラスミドpAMD101
(特開平9−224675)より、HindIII及び
PstI両制限酵素によりAMDase遺伝子を切り出
し、同じくHindIII及びPstI両制限酵素で予
め処理しておいたファージベクターM13mp19にラ
イゲーションし、大腸菌MV1184に形質導入した。
形質導入された大腸菌の培養液よりファージ液を得、そ
のファージ液よりAMDase遺伝子を保持するssD
NAを得た。
びその保持菌の調製> 常法にしたがって抽出したプラスミドpAMD101
(特開平9−224675)より、HindIII及び
PstI両制限酵素によりAMDase遺伝子を切り出
し、同じくHindIII及びPstI両制限酵素で予
め処理しておいたファージベクターM13mp19にラ
イゲーションし、大腸菌MV1184に形質導入した。
形質導入された大腸菌の培養液よりファージ液を得、そ
のファージ液よりAMDase遺伝子を保持するssD
NAを得た。
【0017】このssDNAを含む水溶液10μlに1
Mの亜硝酸ナトリウムを含む1M酢酸ナトリウム水溶液
10μlを加えて21.5℃に保温し、5時間変異の導
入を行なった。変異の導入はエタノールの添加によって
DNAを沈澱させることにより停止した。このようにし
て得られた変異が導入されたDNAをHindIII及
びPstIの両制限酵素で処理してAMDase遺伝子
を回収し、さらに両制限酵素で予め処理したpUC19
にライゲーションして大腸菌JM109株に形質導入し
た。この形質導入された大腸菌をPM−Plateに接
種し、AMDaseの発現に伴うpH指示薬BTBの変
色を示すコロニーを選択した。なお、PM−Plate
の組成は表1に示した。
Mの亜硝酸ナトリウムを含む1M酢酸ナトリウム水溶液
10μlを加えて21.5℃に保温し、5時間変異の導
入を行なった。変異の導入はエタノールの添加によって
DNAを沈澱させることにより停止した。このようにし
て得られた変異が導入されたDNAをHindIII及
びPstIの両制限酵素で処理してAMDase遺伝子
を回収し、さらに両制限酵素で予め処理したpUC19
にライゲーションして大腸菌JM109株に形質導入し
た。この形質導入された大腸菌をPM−Plateに接
種し、AMDaseの発現に伴うpH指示薬BTBの変
色を示すコロニーを選択した。なお、PM−Plate
の組成は表1に示した。
【0018】
【表1】
【0019】このようにして得られた各コロニーに由来
する菌体を破砕し、その上清中のフェニルマロン酸に対
する脱炭酸活性とフェニルメチルマロン酸に対する脱炭
酸活性を測定し、後者の活性が前者の活性より高いコロ
ニーを一つを選択した。このコロニーより常法にしたが
ってAMDase遺伝子を抽出し、アプライドバイオシ
ステムズ社製373型DNAシーケンシングシステムで
全塩基配列の分析を行なった。その塩基配列解析結果よ
り、得られたAMDaseは第45番目のプロリンがロ
イシンに置換されていることが確認された。ここで得ら
れたAMDaseを変異型AMDaseとし、変異型A
MDase遺伝子をクローニングしたプラスミドを以
下、pAMD*と略記する。
する菌体を破砕し、その上清中のフェニルマロン酸に対
する脱炭酸活性とフェニルメチルマロン酸に対する脱炭
酸活性を測定し、後者の活性が前者の活性より高いコロ
ニーを一つを選択した。このコロニーより常法にしたが
ってAMDase遺伝子を抽出し、アプライドバイオシ
ステムズ社製373型DNAシーケンシングシステムで
全塩基配列の分析を行なった。その塩基配列解析結果よ
り、得られたAMDaseは第45番目のプロリンがロ
イシンに置換されていることが確認された。ここで得ら
れたAMDaseを変異型AMDaseとし、変異型A
MDase遺伝子をクローニングしたプラスミドを以
下、pAMD*と略記する。
【0020】<遺伝子保持菌の培養および改変型AMD
aseの精製>変異型AMDase遺伝子保持菌JM1
09/pAMD*を20mlのLB培地(トリプトン
1.0%、酵母エキス0.5%、NaCl 1.0%、
pH7.0)に接種し、30℃で18時間振蕩培養を行
なった。この培養液の1mlを100mlの同培地に接
種し、30℃で6時間培養を行なった後、イソプロピル
−β−チオ−ガラクトピラノシドを0.1mMになるよ
うに添加して、さらに30℃で12時間培養を行なっ
た。
aseの精製>変異型AMDase遺伝子保持菌JM1
09/pAMD*を20mlのLB培地(トリプトン
1.0%、酵母エキス0.5%、NaCl 1.0%、
pH7.0)に接種し、30℃で18時間振蕩培養を行
なった。この培養液の1mlを100mlの同培地に接
種し、30℃で6時間培養を行なった後、イソプロピル
−β−チオ−ガラクトピラノシドを0.1mMになるよ
うに添加して、さらに30℃で12時間培養を行なっ
た。
【0021】このようにして得られた培養液を3000
×gで20分間遠心分離して微生物の菌体を回収した。
この菌体を0.5mM EDTA及び5mMのβ−メル
カプトエタノールを含むリン酸緩衝液(pH7.0)に
懸濁し、超音波によって菌体の破砕を行なった。この破
砕菌体に2%の硫酸プロタミン水溶液を懸濁液の1%量
滴下し、30分間攪拌した。この操作により生じた沈澱
を8000×gで20分間遠心分離することによって除
去し、無細胞抽出液とした。
×gで20分間遠心分離して微生物の菌体を回収した。
この菌体を0.5mM EDTA及び5mMのβ−メル
カプトエタノールを含むリン酸緩衝液(pH7.0)に
懸濁し、超音波によって菌体の破砕を行なった。この破
砕菌体に2%の硫酸プロタミン水溶液を懸濁液の1%量
滴下し、30分間攪拌した。この操作により生じた沈澱
を8000×gで20分間遠心分離することによって除
去し、無細胞抽出液とした。
【0022】無細胞抽出液をを50℃で2分間加熱処理
した後、直ちに氷冷することにより、蛋白性の不純物を
変成させ、8000×g、20分間の遠心分離で除去し
た。次いで硫酸アンモニウムを60%飽和になるように
添加して1時間攪拌し、酵素を含む沈殿物を遠心分離に
よって回収した。
した後、直ちに氷冷することにより、蛋白性の不純物を
変成させ、8000×g、20分間の遠心分離で除去し
た。次いで硫酸アンモニウムを60%飽和になるように
添加して1時間攪拌し、酵素を含む沈殿物を遠心分離に
よって回収した。
【0023】この沈殿物を0.5mM EDTA及び5
mM β−メルカプトエタノールを含む10mMのトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.5、以下緩衝液Aと略記する)
に溶解し、さらに緩衝液Aに対して透析を行なった後、
緩衝液Aで予め平衡化したDEAE−トヨパールカラム
に通過させて酵素を吸着させた。このカラムを緩衝液A
で洗浄した後、10mMから50mMまでのNaClの
直線濃度勾配によって酵素の溶出をおこなった。次いで
AMDase活性を示す溶出画分を回収して、硫酸アン
モニウムを25%飽和になるように添加し、予め25%
飽和硫安を含む緩衝液Aで平衡化したブチルトヨパール
カラムに酵素を吸着させた。酵素の溶出は硫酸アンモニ
ウムの25%飽和から0%飽和の直線濃度勾配により行
なった。AMDase活性を示す画分を回収して緩衝液
Aに対して透析し、精製された変異型AMDaseを得
た。
mM β−メルカプトエタノールを含む10mMのトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.5、以下緩衝液Aと略記する)
に溶解し、さらに緩衝液Aに対して透析を行なった後、
緩衝液Aで予め平衡化したDEAE−トヨパールカラム
に通過させて酵素を吸着させた。このカラムを緩衝液A
で洗浄した後、10mMから50mMまでのNaClの
直線濃度勾配によって酵素の溶出をおこなった。次いで
AMDase活性を示す溶出画分を回収して、硫酸アン
モニウムを25%飽和になるように添加し、予め25%
飽和硫安を含む緩衝液Aで平衡化したブチルトヨパール
カラムに酵素を吸着させた。酵素の溶出は硫酸アンモニ
ウムの25%飽和から0%飽和の直線濃度勾配により行
なった。AMDase活性を示す画分を回収して緩衝液
Aに対して透析し、精製された変異型AMDaseを得
た。
【0024】実施例2<変異型AMDaseの活性評価
> 基質として3−12. 5mMのフェニルマロン酸または
5−20mMのα−フェニル−α−メチルマロン酸と、
適当量の野生型または変異型AMDaseを含む0.1
25Mのトリス塩酸緩衝液400μlを30℃で保温
し、5分間反応を行なった後に2N塩酸100μlを加
えて酵素反応を停止した。この反応中に生じたフェニル
酢酸またはα−フェニルプロピオン酸を逆相高速液体ク
ロマトグラフィーにより定量し、種々の濃度の両基質に
対する脱炭酸反応の初速度を測定した。
> 基質として3−12. 5mMのフェニルマロン酸または
5−20mMのα−フェニル−α−メチルマロン酸と、
適当量の野生型または変異型AMDaseを含む0.1
25Mのトリス塩酸緩衝液400μlを30℃で保温
し、5分間反応を行なった後に2N塩酸100μlを加
えて酵素反応を停止した。この反応中に生じたフェニル
酢酸またはα−フェニルプロピオン酸を逆相高速液体ク
ロマトグラフィーにより定量し、種々の濃度の両基質に
対する脱炭酸反応の初速度を測定した。
【0025】両逆数プロット(ラインウィーバー・バー
グプロット)で反応速度論的パラメーターを求めた。フ
ェニルマロン酸を用いた場合の結果を表2に、α−フェ
ニル−α−メチルマロン酸を用いた場合の結果を表3に
示した。変異型AMDaseは、フェニルマロン酸に対
して約24%のKm値の低下を、フェニルメチルマロン
酸に対して約63%のKm値の低下を示した。即ち両基
質に対して野生型酵素より高い親和性を示し、特に後者
の基質に対してより高い選択性を示した。また、フェニ
ルマロン酸に対する触媒効率を示すkcat/Km値は
野生型酵素の91%であり大きな変化は認められなかっ
たが、フェニルメチルマロン酸に対しては野生型酵素の
128%の値を示し、Kcat/Km値によってもフェ
ニルメチルマロン酸に対して選択性と活性が向上してい
る事が示された。
グプロット)で反応速度論的パラメーターを求めた。フ
ェニルマロン酸を用いた場合の結果を表2に、α−フェ
ニル−α−メチルマロン酸を用いた場合の結果を表3に
示した。変異型AMDaseは、フェニルマロン酸に対
して約24%のKm値の低下を、フェニルメチルマロン
酸に対して約63%のKm値の低下を示した。即ち両基
質に対して野生型酵素より高い親和性を示し、特に後者
の基質に対してより高い選択性を示した。また、フェニ
ルマロン酸に対する触媒効率を示すkcat/Km値は
野生型酵素の91%であり大きな変化は認められなかっ
たが、フェニルメチルマロン酸に対しては野生型酵素の
128%の値を示し、Kcat/Km値によってもフェ
ニルメチルマロン酸に対して選択性と活性が向上してい
る事が示された。
【0026】なお、本反応により得られたα−フェニル
プロピオン酸の光学純度を測定したところ、ほぼ100
%eeの光学純度のR体であることが示された。即ち変
異体酵素の光学選択性は野生型酵素と同じであった。
プロピオン酸の光学純度を測定したところ、ほぼ100
%eeの光学純度のR体であることが示された。即ち変
異体酵素の光学選択性は野生型酵素と同じであった。
【0027】
【表2】
【0028】
【表3】
【0029】実施例3<熱安定性の分析> 野生型及び変異型のAMDase溶液(pH8.5)
を、30から70℃の間の種々の温度で30分間加熱を
行ない、直ちに冷却した。この加熱処理前後の酵素活性
を30mMフェニルマロン酸を基質として実施例2に示
した方法で測定し、加熱処理後の酵素残存活性を求め
た。結果を図1に示す。縦軸は酵素残存活性を、横軸は
加熱温度を示す。図中、黒丸は変異型AMDase、白
丸は野生型AMDaseを示す。図1より残存酵素活性
が50%となる温度(T1/2)を求めると、野生型AM
Daseは50℃であったのに対し、改変型AMDas
eでは53℃であり、本発明の改変型AMDaseは3
℃のT1/2の向上が確認された。
を、30から70℃の間の種々の温度で30分間加熱を
行ない、直ちに冷却した。この加熱処理前後の酵素活性
を30mMフェニルマロン酸を基質として実施例2に示
した方法で測定し、加熱処理後の酵素残存活性を求め
た。結果を図1に示す。縦軸は酵素残存活性を、横軸は
加熱温度を示す。図中、黒丸は変異型AMDase、白
丸は野生型AMDaseを示す。図1より残存酵素活性
が50%となる温度(T1/2)を求めると、野生型AM
Daseは50℃であったのに対し、改変型AMDas
eでは53℃であり、本発明の改変型AMDaseは3
℃のT1/2の向上が確認された。
【0030】また野生型及び変異型のAMDase溶液
(pH8.5)を、50℃で加熱を行なった際の残存酵
素活性の経時変化を図2に示した。縦軸は酵素残存活性
を、横軸は時間を示す。図中、黒丸は変異型AMDas
e、白丸は野生型AMDaseを示す。AMDaseの
失活は野生型、変異型ともに見かけ上1次反応で進行し
たが、30分間加熱後の残存酵素活性が、野生型AMD
aseは50%であったのに対し、改変型AMDase
では60%であった。すなわち、この分析によっても改
変型AMDaseが野生型AMDaseより高い安定性
を示すことが確認された。失活の一次反応速度定数を計
算すると野生型酵素では2.3×10-2min-1であっ
たのに対し、本変異型酵素では1. 6×10-2であっ
た。すなわち変異型酵素では野生型酵素に対して失活速
度が30%程度減少していた。
(pH8.5)を、50℃で加熱を行なった際の残存酵
素活性の経時変化を図2に示した。縦軸は酵素残存活性
を、横軸は時間を示す。図中、黒丸は変異型AMDas
e、白丸は野生型AMDaseを示す。AMDaseの
失活は野生型、変異型ともに見かけ上1次反応で進行し
たが、30分間加熱後の残存酵素活性が、野生型AMD
aseは50%であったのに対し、改変型AMDase
では60%であった。すなわち、この分析によっても改
変型AMDaseが野生型AMDaseより高い安定性
を示すことが確認された。失活の一次反応速度定数を計
算すると野生型酵素では2.3×10-2min-1であっ
たのに対し、本変異型酵素では1. 6×10-2であっ
た。すなわち変異型酵素では野生型酵素に対して失活速
度が30%程度減少していた。
【0031】
【発明の効果】本発明の改変型AMDaseは、アミノ
酸配列の45番目が置換されたことにより、酵素の特性
が改善されることが期待される。特にアミノ酸配列に4
5番目をロイシンに置換した改変型AMDaseでは、
触媒活性、耐熱性及び基質特異性の向上がみられ、具体
的にはα−フェニル−α−メチルマロン酸をα−フェニ
ルプロピオン酸に変換する触媒活性が高く、その触媒活
性の高さは主として基質との親和性が増したことによ
る。また優位に熱安定性が高く、加熱処理による失活に
抵抗性を示す。従って、光学活性α−アリールプロピオ
ン酸の合成において、従来の酵素と比べて反応時間の短
縮、酵素使用量の削減などの点で優れた効果を発揮する
ことが出来る。
酸配列の45番目が置換されたことにより、酵素の特性
が改善されることが期待される。特にアミノ酸配列に4
5番目をロイシンに置換した改変型AMDaseでは、
触媒活性、耐熱性及び基質特異性の向上がみられ、具体
的にはα−フェニル−α−メチルマロン酸をα−フェニ
ルプロピオン酸に変換する触媒活性が高く、その触媒活
性の高さは主として基質との親和性が増したことによ
る。また優位に熱安定性が高く、加熱処理による失活に
抵抗性を示す。従って、光学活性α−アリールプロピオ
ン酸の合成において、従来の酵素と比べて反応時間の短
縮、酵素使用量の削減などの点で優れた効果を発揮する
ことが出来る。
【図1】実施例3で行った、AMDaseを30分間加
熱した後の残存酵素活性を示す図である。
熱した後の残存酵素活性を示す図である。
【図2】実施例3で行った、AMDaseを加熱した際
の残存酵素活性の経時変化を示す図である。
の残存酵素活性の経時変化を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12R 1:19) (C12N 9/88 C12R 1:19)
Claims (4)
- 【請求項1】野生型アリールマロン酸脱炭酸酵素のアミ
ノ酸配列45番目のプロリン残基が他のアミノ酸残基に
置換されていることを特徴とする、改変型アリールマロ
ン酸脱炭酸酵素。 - 【請求項2】請求項1において、45番目のプロリン残
基が疎水性アミノ酸残基に置換されていることを特徴と
する、改変型アリールマロン酸脱炭酸酵素。 - 【請求項3】請求項1において、45番目のプロリン残
基がロイシン残基に置換されていることを特徴とする、
改変型アリールマロン酸脱炭酸酵素。 - 【請求項4】一般式[I] 【化1】 (式中、Arはアリール基を示し、Rは水素原子または
メチル基を示す)で表される化合物を、請求項1〜3い
ずれかに記載の改変型改変型アリールマロン酸脱炭酸酵
素と接触させることを特徴とする、一般式[II] 【化2】 (式中、Ar及びRは前述と同様のものを示す)で表さ
れる化合物の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10114907A JPH11299486A (ja) | 1998-04-24 | 1998-04-24 | 改変型酵素及びそれを用いた製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10114907A JPH11299486A (ja) | 1998-04-24 | 1998-04-24 | 改変型酵素及びそれを用いた製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11299486A true JPH11299486A (ja) | 1999-11-02 |
Family
ID=14649624
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10114907A Pending JPH11299486A (ja) | 1998-04-24 | 1998-04-24 | 改変型酵素及びそれを用いた製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH11299486A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1564298A1 (de) * | 2004-02-13 | 2005-08-17 | BioSpring GmbH | Enzymatische asymmetrische Decarboxylierung von disubstituierten Malonsäuren |
-
1998
- 1998-04-24 JP JP10114907A patent/JPH11299486A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1564298A1 (de) * | 2004-02-13 | 2005-08-17 | BioSpring GmbH | Enzymatische asymmetrische Decarboxylierung von disubstituierten Malonsäuren |
WO2005078111A1 (de) * | 2004-02-13 | 2005-08-25 | Biospring Gmbh | Enzymatische asymmetrische decarboxylierung von disubstituierten malonsäuren |
US7981645B2 (en) | 2004-02-13 | 2011-07-19 | Biospring Gmbh | Enzymatic asymmetric decarboxylation of disubstituted malonic acids |
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