JPH11290098A - Stain of nucleic acid, detection of double stranded nucleic acid by using the same, and reagent for detecting target nucleic acid - Google Patents
Stain of nucleic acid, detection of double stranded nucleic acid by using the same, and reagent for detecting target nucleic acidInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明はウイルス、微生物、
動植物、ヒト等の核酸の特定の塩基配列を光学的手段を
用いて検出、同定、もしくは各種塩基配列における変異
の有無の検出に有用な核酸染色剤及びそれを用いた遺伝
子診断、有用遺伝子のクローニング、未知遺伝子の探索
等における二本鎖核酸の検出方法及び検出試薬に関する
ものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to viruses, microorganisms,
Nucleic acid stains useful for detecting and identifying specific nucleotide sequences of nucleic acids of animals, plants, humans, etc. using optical means, or detecting the presence or absence of mutations in various nucleotide sequences, gene diagnosis using the same, and cloning of useful genes The present invention relates to a double-stranded nucleic acid detection method and a detection reagent for searching for unknown genes and the like.
【０００２】[0002]
【従来の技術】核酸の分析技術の発達により種々の変異
遺伝子が多く見いだされ、遺伝子の変異はタンパク質の
変異を起こし、それによってさまざまな疾病が引き起こ
されていることが明らかになってきた。現在これらの疾
病は酵素によるアッセイや抗体による免疫的な方法によ
って診断、発見されることが主流であるが、早期発見及
び早期治療という観点から、遺伝子上での変異を早期に
発見することのできる遺伝子診断の重要性が指摘されて
いる。また、遺伝子診断は、感染した細菌の同定にも多
く利用されている。2. Description of the Related Art With the development of nucleic acid analysis technology, many mutant genes have been found, and it has become clear that gene mutations cause protein mutations, thereby causing various diseases. At present, these diseases are mainly diagnosed and discovered by enzyme-based assays and immunological methods using antibodies, but from the viewpoint of early detection and early treatment, mutations in genes can be detected early. The importance of genetic diagnosis has been pointed out. Genetic diagnosis is also often used to identify infected bacteria.
【０００３】細菌感染症における原因細菌の遺伝子の検
出又は同定の分野においては、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリ
ダイゼーション法又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼー
ション法を用いる試みがなされている。この方法は、細
菌の核酸の特定部分に着目して、その部分の塩基配列が
対象とする被検核酸サンプル中に存在するか否かをハイ
ブリダイゼーション法によって測定することでサンプル
中に問題となる細菌が存在するか否かを判定する方法で
ある。[0003] In the field of detection or identification of the gene of the causative bacterium in bacterial infections, attempts have been made to use a DNA-DNA hybridization method or a DNA-RNA hybridization method. This method is problematic in a sample by focusing on a specific portion of a bacterial nucleic acid and measuring whether or not the base sequence of that portion is present in a test nucleic acid sample of interest by a hybridization method. This is a method for determining whether or not bacteria exist.
【０００４】ハイブリダイゼーション法の典型的な手順
としては、被検核酸を変性して不溶性担体に結合し、こ
れを酵素やラジオアイソトープで標識された標的核酸と
相補的な塩基配列を有するプローブとインキュベートし
てハイブリッド体を形成させ、その後、不溶性担体を洗
浄して標的配列と結合していないプローブを洗い流し、
酵素反応やラジオアイソトープ等により標的核酸量を定
量する操作である。As a typical procedure of the hybridization method, a test nucleic acid is denatured and bound to an insoluble carrier, which is then incubated with a probe having a base sequence complementary to a target nucleic acid labeled with an enzyme or radioisotope. To form a hybrid, then wash the insoluble carrier to wash away the probe not bound to the target sequence,
This is an operation for quantifying the amount of a target nucleic acid by an enzyme reaction, radioisotope, or the like.
【０００５】しかし、上記のような不溶性担体を用いた
ハイブリダイゼーション法では、未反応プローブの除去
（Ｂ／Ｆ分離）が必要であり、その操作は極めて煩雑で
ある。さらに、プローブがこの不溶性担体に吸着してし
まうため、不溶性担体上のハイブリッド体の標識物質を
測定する段階でこの不溶性担体に吸着したプローブに由
来する信号が測定結果に紛れ込み、試料中の標的核酸の
有無及びその量の測定結果に誤差が生じ、正しい判定が
困難であるという問題がある。However, in the hybridization method using the insoluble carrier as described above, it is necessary to remove the unreacted probe (B / F separation), and the operation is extremely complicated. Further, since the probe is adsorbed on the insoluble carrier, a signal derived from the probe adsorbed on the insoluble carrier is mixed into the measurement result at the stage of measuring the labeling substance of the hybrid on the insoluble carrier, and the target in the sample is removed. There is a problem that an error occurs in the measurement result of the presence or absence of the nucleic acid and the amount thereof, and it is difficult to make a correct determination.
【０００６】そこで、これらの問題を回避する方法とし
て、溶液中でのハイブリダイゼーション法、いわゆる、
均一系での方法の開発が望まれている。この均一系での
最大の課題は、標的核酸に結合しているプローブと結合
していないプローブを識別する必要があることである。Therefore, as a method of avoiding these problems, a hybridization method in a solution, so-called,
The development of a homogeneous method is desired. The biggest challenge with this homogeneous system is that it is necessary to distinguish between probes that bind to the target nucleic acid and those that do not.
【０００７】Ｂ／Ｆ分離を行わずにハイブリッド体を検
出する方法としては、蛍光偏光解消法を利用した方法が
提案されている（特開平２−７５９５８号公報、特開平
２−２９５４９６号公報）。この方法は、蛍光色素標識
されたプローブを用い、一本鎖核酸の蛍光偏光とハイブ
リッド体の蛍光偏光の違いにより標的核酸の有無を判定
する方法であり、その原理は、プローブに結合した蛍光
色素が二本鎖になったことにより運動しにくくなり、蛍
光異方性が増大することを利用している。しかし、この
方法では検体中にタンパク質等の夾雑物が含まれている
と、プローブがそれらに非特異的に吸着し、ハイブリッ
ド体検出のバックグランドを上昇させる原因となるた
め、あらかじめこれらの夾雑物を完全に除去するという
煩雑な操作が必要となる。As a method for detecting a hybrid without performing B / F separation, a method utilizing a fluorescence depolarization method has been proposed (JP-A-2-75958, JP-A-2-295496). . This method uses a fluorescent dye-labeled probe to determine the presence or absence of a target nucleic acid based on the difference between the fluorescence polarization of a single-stranded nucleic acid and the fluorescence polarization of a hybrid. Is made to be difficult to move due to the double-stranded structure, and the fact that the fluorescence anisotropy is increased is used. However, in this method, if impurities such as proteins are contained in the sample, the probe is non-specifically adsorbed to them and causes an increase in the background of hybrid detection. Requires a complicated operation of completely removing the.
【０００８】また、光励起エネルギーの移動を利用した
ハイブリッド体の検出法が提案されている（Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794 ）。この方法は、
エネルギー供与体化合物とエネルギー受容体化合物とか
ら構成されており、プローブが標的核酸にハイブリッド
した時、両化合物が近接に存在するためエネルギー供与
体から励起エネルギーが受容体に移動することで、エネ
ルギー供与体の励起寿命及び蛍光強度の減少又は受容体
の蛍光強度の増加が観測される。これらの現象を利用す
ることによりハイブリダイゼーションの有無を溶液のま
ま測定でき、一連の煩雑な操作を省くことができる画期
的な方法であるが、感度が既存の方法に比べて数オーダ
ー低く、実用化には到っていないのが現状である。A method for detecting a hybrid using the transfer of photoexcitation energy has been proposed (Proc. Nat.
l. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794). This method
It consists of an energy donor compound and an energy acceptor compound. When the probe hybridizes to the target nucleic acid, the excitation energy is transferred from the energy donor to the acceptor due to the presence of both compounds in close proximity, resulting in energy donation. A decrease in the excitation lifetime and fluorescence intensity of the body or an increase in the fluorescence intensity of the receptor is observed. By utilizing these phenomena, the presence or absence of hybridization can be measured as a solution, and it is an epoch-making method that can eliminate a series of complicated operations, but the sensitivity is several orders of magnitude lower than existing methods, At present, it has not been put to practical use.
【０００９】さらに、インターカレーター性蛍光色素を
用いたハイブリッド体の検出方法が提案されている（特
開平８−２１１０５０号公報）。この方法は、色素がハ
イブリッド体にインターカレーションしたときの蛍光特
性の変化を測定することによりハイブリッド体を検出す
る方法である。また、特開平９−４０６６１号公報に
は、ピリリウム塩又はその類似塩をインターカレーター
性色素として利用することができることが開示されてい
る。Further, a method for detecting a hybrid using an intercalating fluorescent dye has been proposed (JP-A-8-21110). This method is a method of detecting a hybrid by measuring a change in fluorescence characteristics when a dye is intercalated into the hybrid. JP-A-9-40661 discloses that a pyrylium salt or a salt thereof can be used as an intercalating dye.
【００１０】[0010]
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの色素
は、二本鎖核酸の有無に対する蛍光強度の変化が小さい
という問題点があった。本発明は、二本鎖核酸の有無に
対する蛍光特性の変化、特に蛍光強度の変化が大きい核
酸染色剤、それを用いた二本鎖核酸の検出方法及び検出
試薬を提供することを目的とするものである。However, these dyes have a problem that the change in fluorescence intensity with respect to the presence or absence of double-stranded nucleic acid is small. An object of the present invention is to provide a nucleic acid stain having a large change in fluorescence characteristics with respect to the presence or absence of a double-stranded nucleic acid, particularly a large change in fluorescence intensity, a method for detecting a double-stranded nucleic acid using the same, and a detection reagent. It is.
【００１１】[0011]
【課題を解決するための手段】本発明者は、このような
核酸染色剤を提供するために鋭意検討の結果、９−フェ
ニルアゾアクリジン誘導体は核酸と相互作用することに
よりその蛍光強度及び蛍光波長が変化するということを
見い出し、本発明に到達した。The present inventors have made intensive studies to provide such a nucleic acid stain, and as a result, the 9-phenylazoacridine derivative interacts with the nucleic acid to obtain its fluorescence intensity and fluorescence wavelength. Change, and arrived at the present invention.
【００１２】すなわち、第１の発明は、下記一般式
（１）で示される９−アゾアクリジン誘導体（以下、ア
ゾアクリジン誘導体と記載する）を含有してなることを
特徴とする核酸染色剤を要旨とするものである。That is, a first aspect of the present invention provides a nucleic acid stain comprising a 9-azoacridine derivative represented by the following general formula (1) (hereinafter, referred to as an azoacridine derivative). It is assumed that.
【００１３】[0013]
【化２】 Embedded image
【００１４】（なお、式中のＲ1 はアルキル基を表し、
Ｒ2 はハロゲンイオンを表し、Ｒ3 はフェニル基、アニ
リノ基、ヒドロキシフェニル基、アルキルアニリノ基、
ジアルキルアニリノ基、ジヒドロキシアルキルアニリノ
基、２−（Ｎ−アルキルアニリノ）エタノール基、ナフ
チル基、ナフトール基を表す。）(Wherein R 1 represents an alkyl group;
R 2 represents a halogen ion, R 3 represents a phenyl group, an anilino group, a hydroxyphenyl group, an alkylanilino group,
It represents a dialkylanilino group, a dihydroxyalkylanilino group, a 2- (N-alkylanilino) ethanol group, a naphthyl group, or a naphthol group. )
【００１５】また、第２の発明は、前記一般式（１）で
示されるアゾアクリジン誘導体が二本鎖核酸と相互作用
することによって生じる蛍光特性の変化を測定すること
を特徴とする二本鎖核酸の検出方法を要旨とするもので
ある。さらに、第３の発明は、標的核酸に相補的な核酸
配列を有する一本鎖ヌクレオチドからなるプローブと、
前記一般式（１）で示されるアゾアクリジン誘導体を含
有してなることを特徴とする標的核酸の検出試薬を要旨
とするものである。A second aspect of the present invention is to measure a change in fluorescence characteristics caused by the interaction of the azoacridine derivative represented by the general formula (1) with a double-stranded nucleic acid. The gist is a method for detecting a nucleic acid. Further, a third invention provides a probe comprising a single-stranded nucleotide having a nucleic acid sequence complementary to a target nucleic acid,
A gist of the present invention is a reagent for detecting a target nucleic acid, which comprises the azoacridine derivative represented by the general formula (1).
【００１６】[0016]
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるアゾアクリジン誘導体は上記一般式
（１）で示されるものである。上記一般式中のＲ1 とし
ては、メチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル基
が挙げられ、Ｒ2 としては、臭素、塩素等のハロゲンイ
オンが挙げられ、Ｒ3 としては、電子供与基であるフェ
ニル基、アニリノ基、ヒドロキシフェニル基、メチルア
ニリノ基、エチルアニリノ基等のアルキルアニリノ基、
ジメチルアニリノ基、ジエチルアニリノ基等のジアルキ
ルアニリノ基、ジメタノールアニリノ、ジエタノールア
ニリノ基等のジヒドロキシアルキルアニリノ基、２−
（Ｎ−エチルアニリノ）エタノール基等の２−（Ｎ−ア
ルキルアニリノ）エタノール基、ナフチル基、ナフトー
ル基が挙げられる。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described below in detail.
The azoacridine derivative used in the present invention is represented by the above general formula (1). R 1 in the above general formula includes an alkyl group such as a methyl group, an ethyl group and a propyl group; R 2 includes a halogen ion such as bromine and chlorine; and R 3 as an electron donating group Phenyl group, anilino group, hydroxyphenyl group, methylanilino group, alkylanilino group such as ethylanilino group,
Dialkylanilino groups such as dimethylanilino group and diethylanilino group; dihydroxyalkylanilino groups such as dimethanolanilino and diethanolanilino groups;
Examples include a 2- (N-alkylanilino) ethanol group such as an (N-ethylanilino) ethanol group, a naphthyl group, and a naphthol group.
【００１７】本発明の核酸染色剤は、上記のアゾアクリ
ジン誘導体をそのまま用いてもよく、また、適当な溶媒
や分散剤に溶解又は分散させてもよい。このような溶媒
及び分散剤としては、水、アセトニトリル、ジメチルス
ルホキシド、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の各種緩衝液
等が挙げられる。このときのアゾアクリジン誘導体の濃
度としては、１×１０-8〜１×１０-5Ｍが好ましい。As the nucleic acid stain of the present invention, the above-mentioned azoacridine derivative may be used as it is, or may be dissolved or dispersed in an appropriate solvent or dispersant. Examples of such a solvent and a dispersant include various buffers such as water, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, a phosphate buffer, and an acetate buffer. The concentration of the azoacridine derivative at this time is preferably 1 × 10 −8 to 1 × 10 −5 M.
【００１８】また、本発明の核酸染色剤は、上記のアゾ
アクリジン誘導体が標的核酸を検出するためのプローブ
に結合した形であってもよい。プローブとしては、標的
核酸中の特定の塩基配列に対して完全に相補的な核酸配
列を有することが好ましいが、一部の塩基が相補的配列
でなくても標的核酸との結合に支障がなければ問題はな
い。特定の塩基配列は、標的核酸中の１０〜３０塩基か
らなる核酸配列であり、この配列が他の核酸と識別可能
な配列であることが好ましい。The nucleic acid staining agent of the present invention may be in a form in which the azoacridine derivative is bound to a probe for detecting a target nucleic acid. The probe preferably has a nucleic acid sequence that is completely complementary to a specific base sequence in the target nucleic acid. However, even if some of the bases are not complementary, the binding to the target nucleic acid should not be hindered. If there is no problem. The specific base sequence is a nucleic acid sequence consisting of 10 to 30 bases in the target nucleic acid, and this sequence is preferably a sequence that can be distinguished from other nucleic acids.
【００１９】アゾアクリジン誘導体とプローブとの結合
は、プローブにアゾアクリジン誘導体を直接結合させて
もよく、適当な分子長のリンカーを介して結合させても
よい。リンカーとしては、ハイブリッド体形成及びアゾ
アクリジン誘導体と二本鎖核酸との相互作用を妨げない
分子であれば特に限定されるものではないが、結合操作
の容易性等の観点から、両末端に官能基を有する二官能
性炭化水素を用いることが好適である。The bond between the azoacridine derivative and the probe may be such that the azoacridine derivative may be directly bound to the probe, or may be bound via a linker having an appropriate molecular length. The linker is not particularly limited as long as it does not hinder the formation of the hybrid and the interaction between the azoacridine derivative and the double-stranded nucleic acid. It is preferred to use a difunctional hydrocarbon having groups.
【００２０】アゾアクリジン誘導体とプローブとの結合
部位としては、同じくハイブリッド体形成及びアゾアク
リジン誘導体と二本鎖核酸との相互作用を妨げない部位
であれば特に限定されるものではなく、プローブの５’
末端、３’末端又は中央部分のいずれであってもよい。
ただし、プローブを共存させた状態でＰＣＲ法等の遺伝
子増幅を実施する場合には、ＤＮＡ合成酵素による核酸
の伸長反応を阻害しないようにアゾアクリジン誘導体を
プローブの５’末端に結合させることが好ましい。The binding site between the azoacridine derivative and the probe is not particularly limited as long as it does not interfere with the formation of the hybrid and the interaction between the azoacridine derivative and the double-stranded nucleic acid. '
It may be any of the terminal, 3 ′ terminal or central part.
However, when performing gene amplification such as PCR in the presence of the probe, it is preferable to bind the azoacridine derivative to the 5 ′ end of the probe so as not to inhibit the elongation reaction of the nucleic acid by the DNA synthase. .
【００２１】次に、本発明の二本鎖核酸の検出方法につ
いて説明する。本発明の二本鎖核酸の検出方法は、上記
のアゾアクリジン誘導体を核酸染色剤として用い、アゾ
アクリジン誘導体が二本鎖核酸と相互作用することによ
り生じる蛍光特性の変化を測定することによって行う。
なお、アゾアクリジン誘導体と二本鎖核酸との相互作用
とは、アゾアクリジン誘導体が二本鎖核酸にインターカ
レートしている状態であると思われるが、特に本発明で
いう相互作用は、インターカレーションに限定されるも
のではない。Next, the method for detecting a double-stranded nucleic acid of the present invention will be described. The method for detecting a double-stranded nucleic acid of the present invention is carried out by using the azoacridine derivative described above as a nucleic acid stain, and measuring a change in fluorescence characteristics caused by the interaction of the azoacridine derivative with the double-stranded nucleic acid.
The interaction between the azoacridine derivative and the double-stranded nucleic acid is considered to be a state in which the azoacridine derivative is intercalated into the double-stranded nucleic acid. It is not limited to curation.
【００２２】本発明においては、二本鎖核酸と相互作用
する前のアゾアクリジン誘導体は親水性の高い水分子に
囲まれた状況にあるが、二本鎖核酸と相互作用すると、
その化合物は疎水性の高い核酸塩基に囲まれた状況とな
るため、蛍光特性が変化する。このため、この蛍光特性
の変化を例えば、特定波長における蛍光強度の変化や極
大最大波長の変化等によって測定することにより、二本
鎖核酸を検出、定量することができるのである。In the present invention, the azoacridine derivative before interacting with the double-stranded nucleic acid is surrounded by water molecules having high hydrophilicity.
Since the compound is surrounded by nucleobases having high hydrophobicity, the fluorescence characteristics are changed. Therefore, the double-stranded nucleic acid can be detected and quantified by measuring the change in the fluorescence characteristics based on, for example, a change in the fluorescence intensity at a specific wavelength or a change in the maximum wavelength.
【００２３】本発明の検出方法は、プローブを用いたハ
イブリダイゼーション法において、プローブと標的核酸
のハイブリッド体を検出するのに利用することができ
る。この場合、予めアゾアクリジン誘導体をプローブに
結合させておいてこれを標的核酸とハイブリダイズさせ
て検出することもできるし、アゾアクリジン誘導体の結
合していないプローブをまず標的核酸とハイブリダイズ
させ、これにアゾアクリジン誘導体を添加して検出する
こともできる。また、本発明の検出方法は、プローブあ
るいは試料を固定した状態及び溶液中でのハイブリダイ
ゼーションに適応することができる。The detection method of the present invention can be used to detect a hybrid of a probe and a target nucleic acid in a hybridization method using a probe. In this case, the azoacridine derivative may be bound to the probe in advance and hybridized with the target nucleic acid for detection, or the probe not bound to the azoacridine derivative may be first hybridized to the target nucleic acid, The azoacridine derivative can be added to the mixture for detection. Further, the detection method of the present invention can be applied to hybridization in a state where a probe or a sample is fixed and in a solution.
【００２４】二本鎖核酸に添加するアゾアクリジン誘導
体の量としては、二本鎖核酸に対してアゾアクリジン誘
導体が過剰となることが好ましく、１×１０-8〜１×１
０-5Ｍとなるように添加することが好ましい。The amount of the azoacridine derivative to be added to the double-stranded nucleic acid is preferably an excess of the azoacridine derivative with respect to the double-stranded nucleic acid, from 1 × 10 −8 to 1 × 1.
It is preferable to add so that it may be 0 -5 M.
【００２５】蛍光特性の変化の測定方法としては、二本
鎖核酸と共存させない状態で測定したアゾアクリジン誘
導体の蛍光スペクトルと二本鎖核酸と共存させた状態で
測定した蛍光性物質の蛍光スペクトルから蛍光極大波長
を比較することにより、又は両スペクトルの蛍光極大波
長における両スペクトルの蛍光強度を比較することによ
って蛍光特性の変化を測定すればよい。The method for measuring the change in the fluorescence characteristics is based on the fluorescence spectrum of the azoacridine derivative measured in the absence of the double-stranded nucleic acid and the fluorescence spectrum of the fluorescent substance measured in the presence of the double-stranded nucleic acid. The change in the fluorescence characteristic may be measured by comparing the fluorescence maximum wavelengths or by comparing the fluorescence intensities of both spectra at the fluorescence maximum wavelengths of both spectra.
【００２６】また、本発明の標的核酸の検出試薬は、プ
ローブとアゾアクリジン誘導体を含有してなるものであ
り、アゾアクリジン誘導体はプローブに結合した形でも
よく、結合していない形でもよい。The reagent for detecting a target nucleic acid of the present invention comprises a probe and an azoacridine derivative, and the azoacridine derivative may or may not be bound to the probe.
【００２７】[0027]
【実施例】以下、本発明を実施例によって具体的に説明
する。 実施例１ 下記構造式（２）で示される９−アミノアクリジン１．
０ｇ（５．１mmol）を５０ｍｌのアセトンに溶解し、そ
こへ５．６ｍｌの６Ｍの塩酸（３０mmol）、１０ｍｌの
水及び１．０ｇ（１５mmol）の亜硝酸ナトリウムを加
え、０℃で２時間攪拌した。その後、２．５ｇ（１５mm
ol）の２−（Ｎ−エチルアニリノ）エタノールを添加
し、０℃で２０時間攪拌した。炭酸水素ナトリウムを添
加して溶液を中性にした後、沈殿物をろ取し、水で洗浄
した。得られた沈殿物を１０ｍｌのアセトニトリルに溶
解し、そこへ０．５６ｇ（５．１mmol）の臭化エチルを
加え、８０℃で２４時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、
目的物である下記構造式（３）で示されるアクリジン誘
導体（以下、Ａｃ−ＮＥＥと記載する）を得た（収量
０．８３ｇ）。The present invention will be specifically described below with reference to examples. Example 1 9-aminoacridine represented by the following structural formula (2)
0 g (5.1 mmol) was dissolved in 50 ml of acetone, and 5.6 ml of 6M hydrochloric acid (30 mmol), 10 ml of water and 1.0 g (15 mmol) of sodium nitrite were added thereto, followed by stirring at 0 ° C. for 2 hours. did. Then, 2.5g (15mm
ol) of 2- (N-ethylanilino) ethanol and stirred at 0 ° C. for 20 hours. After adding sodium hydrogen carbonate to make the solution neutral, the precipitate was collected by filtration and washed with water. The obtained precipitate was dissolved in 10 ml of acetonitrile, 0.56 g (5.1 mmol) of ethyl bromide was added thereto, and the mixture was stirred at 80 ° C. for 24 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure,
An acridine derivative (hereinafter, referred to as Ac-NEE) represented by the following structural formula (3), which was the target product, was obtained (yield 0.83 g).
【００２８】[0028]
【化３】 Embedded image
【００２９】[0029]
【化４】 Embedded image
【００３０】このＡｃ−ＮＥＥを核酸染色剤として用
い、溶液中の二本鎖核酸の測定を行った。なお、二本鎖
核酸としては、市販のもの（Calf thymus DNA,ベーリン
ガー社製）を用いた。まず、ジメチルスルホキシドに１
００ｍＭの濃度となるようにＡｃ−ＮＥＥを溶解した
後、５０ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭのTrisHCl 緩衝液
（ｐＨ７．５）で１００倍に希釈し、励起波長３００ｎ
ｍにおける蛍光スペクトルを蛍光分光計ＦＰ−７７７
（日本分光社製）を用いて測定した。次に、二本鎖核酸
の塩基対濃度がＡｃ−ＮＥＥ濃度の２５倍となるよう
に、二本鎖核酸を添加し、その蛍光スペクトルを同様の
励起波長で測定した。その結果を図１に示す。図１は、
二本鎖核酸の存在下及び非存在下でのＡｃ−ＮＥＥの蛍
光スペクトルを示す図であり、縦軸に蛍光強度を、横軸
に蛍光波長を示している。図１からわかるように二本鎖
核酸の非存在下でのＡｃ−ＮＥＥの蛍光極大波長は４３
３ｎｍと４５７ｎｍであるが、二本鎖核酸が存在する時
の蛍光極大波長は４０２ｎｍと４２８ｎｍであり、Ａｃ
−ＮＥＥが二本鎖核酸と相互作用することにより、蛍光
波長が約３０ｎｍ移動した。また、二本鎖核酸が存在す
る時の蛍光強度は、存在しない時のそれの約４０倍であ
った。このことから、蛍光波長４０２ｎｍ又は４２８ｎ
ｍの蛍光強度を測定することによって二本鎖核酸を検出
することが可能であることがわかる。Using this Ac-NEE as a nucleic acid stain, double-stranded nucleic acids in the solution were measured. As the double-stranded nucleic acid, a commercially available double-stranded nucleic acid (Calf thymus DNA, manufactured by Boehringer) was used. First, add 1 to dimethyl sulfoxide
After dissolving Ac-NEE to a concentration of 00 mM, the solution was diluted 100-fold with 5 mM TrisHCl buffer (pH 7.5) containing 50 mM NaCl, and the excitation wavelength was 300 n.
m was measured using a fluorescence spectrometer FP-777.
(Manufactured by JASCO Corporation). Next, the double-stranded nucleic acid was added such that the base pair concentration of the double-stranded nucleic acid was 25 times the Ac-NEE concentration, and the fluorescence spectrum was measured at the same excitation wavelength. The result is shown in FIG. FIG.
It is a figure which shows the fluorescence spectrum of Ac-NEE in the presence and absence of a double-stranded nucleic acid, in which the vertical axis indicates the fluorescence intensity and the horizontal axis indicates the fluorescence wavelength. As can be seen from FIG. 1, the fluorescence maximum wavelength of Ac-NEE in the absence of double-stranded nucleic acid is 43
3 nm and 457 nm, but the maximum fluorescence wavelengths when double-stranded nucleic acid is present are 402 nm and 428 nm, and Ac
The fluorescence wavelength shifted by about 30 nm due to the interaction of -NEE with the double-stranded nucleic acid. Further, the fluorescence intensity when the double-stranded nucleic acid was present was about 40 times that when the double-stranded nucleic acid was not present. From this, the fluorescence wavelength of 402 nm or 428 n
It can be seen that double-stranded nucleic acid can be detected by measuring the fluorescence intensity of m.
【００３１】実施例２ １本鎖Ｍ１３ｍｐ１８DNA （宝酒造社製）と部分的に相
補的な塩基配列を有する配列番号１に示す２０量体オリ
ゴヌクレオチドをアプライドバイオシステムズ社製３９
１ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。ＣＰＧ担体から
の切り出し、脱保護、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）による精製はアプライドバイオシステムズ社指
定の方法により行った。このオリゴヌクレオチドの５’
末端に、グレンリサーチ社製の試薬５’チオールモディ
ファイアーＣ６を用いてチオールリンカーを結合させ
た。Example 2 A 20-mer oligonucleotide having a base sequence partially complementary to a single-stranded M13mp18 DNA (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) represented by SEQ ID NO: 1 was synthesized by Applied Biosystems Inc. 39
The DNA was synthesized using an automatic DNA synthesizer. Excision from CPG carrier, deprotection, high performance liquid chromatography (H
Purification by PLC) was performed according to a method specified by Applied Biosystems. 5 'of this oligonucleotide
A thiol linker was bound to the terminal using a reagent 5 ′ thiol modifier C6 manufactured by Glen Research.
【００３２】得られたオリゴヌクレオチド（２６０ｎｍ
における吸光度が５）を１００ｍＭのTrisHCl 緩衝液
（ＰＨ７．５）５０ｍｌに溶解し、これに１Ｍの硝酸銀
溶液を７．５ｍｌ加え、攪拌後、室温で４０分放置し
た。１Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液を１０ｍ
ｌ加えて攪拌後、室温で３０分放置した。遠心分離によ
り沈殿物を除き、高速液体クロマトグラフィーでプロー
ブを精製した。これに０．０１ＭのＤＴＴを２０ｍｌ加
え、攪拌後、アルゴン置換を行った。（溶液１）The resulting oligonucleotide (260 nm
Was dissolved in 50 ml of 100 mM TrisHCl buffer (PH7.5), and 7.5 ml of a 1 M silver nitrate solution was added thereto. After stirring, the mixture was allowed to stand at room temperature for 40 minutes. 10m of 1M dithiothreitol (DTT) solution
After adding and stirring, the mixture was left at room temperature for 30 minutes. The precipitate was removed by centrifugation, and the probe was purified by high performance liquid chromatography. 20 ml of 0.01 M DTT was added thereto, and the mixture was stirred and replaced with argon. (Solution 1)
【００３３】１．０ｇ（２．１mmol）のＡｃ−ＮＥＥと
０．１３ｇ（２．３mmol）の水酸化カリウムを１０ｍｌ
のグリコールモノメチルエーテルに溶解し、そこに０．
３８ｇ（２．３mmol）の１，３−ジヨードプロパンを加
え、５時間加熱還流した。これに１０ｍｌの水を加え、
よく振り混ぜた後、水層を除去した。これにヘキサンを
加えて析出した固体を濾過して集めた（収量０．６４
ｇ）。この析出した固体の１５ｍｇにジメチルホルムア
ミド２００ｍｌ、１Ｍリン酸緩衝液（pH１０．０）３０
０ｍｌ及び水５００ｍｌを加え、その後アルゴン置換し
た。（溶液２）1.0 g (2.1 mmol) of Ac-NEE and 0.13 g (2.3 mmol) of potassium hydroxide in 10 ml
Dissolved in glycol monomethyl ether of
38 g (2.3 mmol) of 1,3-diiodopropane was added, and the mixture was heated under reflux for 5 hours. Add 10 ml of water to this,
After shaking well, the aqueous layer was removed. Hexane was added thereto, and the precipitated solid was collected by filtration (yield 0.64).
g). 15 mg of the precipitated solid was added to 200 ml of dimethylformamide, 1 M phosphate buffer (pH 10.0) 30
0 ml and 500 ml of water were added, followed by purging with argon. (Solution 2)
【００３４】この溶液２に溶液１を容量が２：１になる
ように混合し、室温で２時間放置した後、セファデック
スＧ−２５（ファルマシア社製）を用いたゲル濾過に供
し、取得物を乾燥後、高速液体クロマトグラフィーで精
製することにより下記構造式（４）で示されるＡｃ−Ｎ
ＥＥの結合したプローブを得た。なお、高速液体クロマ
トグラフィー操作において使用した緩衝液は、０．１Ｍ
のTrisHCl （pH７．５）／５０重量％アセトニトリルで
あり、セファデックスＧ−２５のゲル濾過操作に用いた
緩衝液は、０．１ＭのTrisHCl （pH７．５）／５重量％
アセトニトリルである。The solution 1 was mixed with the solution 2 so that the volume became 2: 1 and left at room temperature for 2 hours, and then subjected to gel filtration using Sephadex G-25 (manufactured by Pharmacia) to obtain the obtained product. Is dried and purified by high performance liquid chromatography to obtain Ac-N represented by the following structural formula (4).
An EE-bound probe was obtained. The buffer used in the high performance liquid chromatography operation was 0.1 M
Of TrisHCl (pH 7.5) / 50% by weight acetonitrile. The buffer used for the gel filtration operation of Sephadex G-25 was 0.1 M TrisHCl (pH 7.5) / 5% by weight.
Acetonitrile.
【００３５】[0035]
【化５】 Embedded image
【００３６】実施例３ 実施例２で作製したＡｃ−ＮＥＥ結合プローブを用いて
Ｍ１３ｍｐ１８DNA の検出を行った。Ｍ１３ｍｐ１８DN
A （宝酒造社製）２００pmolとＡｃ−ＮＥＥ結合プロー
ブ２００pmolを５０ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭのTris
HCl 緩衝液（pH７．５）１ｍｌに溶解し、９０℃まで加
熱後、放冷して徐々に室温（約２０℃）までもどしてＭ
１３ｍｐ１８DNA にプローブをハイブリダイズさせた。
このハイブリッド体の励起波長３００ｎｍにおける蛍光
スペクトルを測定した。また、Ｍ１３ｍｐ１８DNA を添
加しない以外は同様にして蛍光スペクトルを測定した。
この結果、プローブだけの溶液では蛍光極大波長が４３
３ｎｍと４５７ｎｍであったのに対し、ハイブリッド体
の場合では、蛍光極大波長が４０２ｎｍと４２８ｎｍで
あり、また、ハイブリッド体の場合の蛍光強度はプロー
ブだけの場合の蛍光強度の約４倍であった。これらの結
果から、試料中にＡｃ−ＮＥＥ結合プローブを添加する
ことにより特定核酸の検出を行うことが可能であること
がわかる。Example 3 M13mp18 DNA was detected using the Ac-NEE binding probe prepared in Example 2. M13mp18DN
A 200 pmol (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and 200 pmol of the Ac-NEE binding probe were added to 5 mM Tris containing 50 mM NaCl.
Dissolved in 1 ml of HCl buffer (pH 7.5), heated to 90 ° C, allowed to cool, and gradually returned to room temperature (about 20 ° C).
The probe was hybridized to 13mp18 DNA.
The fluorescence spectrum of the hybrid at an excitation wavelength of 300 nm was measured. Also, the fluorescence spectrum was measured in the same manner except that M13mp18 DNA was not added.
As a result, in the solution containing only the probe, the maximum fluorescence wavelength was 43
Whereas the fluorescence maximum wavelengths were 402 nm and 428 nm in the hybrid in the case of 3 nm and 457 nm, and the fluorescence intensity in the hybrid was about four times that of the probe alone. . These results indicate that it is possible to detect a specific nucleic acid by adding an Ac-NEE binding probe to a sample.
【００３７】実施例４ 実施例２で作製したＡｃ−ＮＥＥ結合プローブ２００pm
olに、Ｍ１３ｍｐ１８DNA （宝酒造社製）を０．１、
０．２、０．５、１．０、２．０、３．０、５．０、
７．５、１０．０、１５．０又は２０．０当量添加し、
実施例１と同様にして励起波長３００ｎｍ、蛍光波長４
０２ｎｍの蛍光強度を測定した。その結果を図２に示
す。図２は、Ａｃ−ＮＥＥ結合プローブを用いてＭ１３
ｍｐ１８DNA を定量したときの結果を示す図であり、縦
軸に蛍光強度を、横軸にプローブ量を示している。図２
より、試料中の標的核酸の量に比例して蛍光強度が増加
していることがわかる。従って、試料にＡｃ−ＮＥＥ結
合プローブを添加し、その蛍光強度を測定することによ
り試料中の特定核酸の定量を行うことができることがわ
かる。Example 4 Ac-NEE binding probe 200 pm produced in Example 2
ol, M13mp18 DNA (Takara Shuzo) 0.1,
0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0,
7.5, 10.0, 15.0 or 20.0 equivalents are added,
Excitation wavelength 300 nm, fluorescence wavelength 4
The fluorescence intensity at 02 nm was measured. The result is shown in FIG. FIG. 2 shows M13 using Ac-NEE binding probe.
It is a figure which shows the result at the time of quantifying mp18 DNA, and a vertical axis | shaft shows fluorescence intensity and a horizontal axis shows probe quantity. FIG.
This indicates that the fluorescence intensity increases in proportion to the amount of the target nucleic acid in the sample. Therefore, it is understood that the specific nucleic acid in the sample can be quantified by adding the Ac-NEE binding probe to the sample and measuring the fluorescence intensity.
【００３８】[0038]
【発明の効果】本発明の核酸染色剤は、二本鎖核酸と相
互作用することにより、蛍光強度及び蛍光波長が変化す
るため、均一系での標的核酸の検出及び定量に利用する
ことができる。また、本発明の二本鎖核酸の検出方法及
び検出試薬によれば、標識プローブの除去操作を行うこ
となしに、標的核酸の存在の有無及び量を決定すること
が可能となる。The nucleic acid stain of the present invention interacts with a double-stranded nucleic acid to change its fluorescence intensity and fluorescence wavelength, so that it can be used for detection and quantification of a target nucleic acid in a homogeneous system. . Further, according to the method and reagent for detecting a double-stranded nucleic acid of the present invention, the presence / absence and amount of a target nucleic acid can be determined without performing an operation of removing a labeled probe.
【図１】二本鎖核酸の存在下及び非存在下でのＡｃ−Ｎ
ＥＥの蛍光スペクトルを示す図である。FIG. 1. Ac-N in the presence and absence of double-stranded nucleic acid
It is a figure which shows the fluorescence spectrum of EE.
【図２】Ａｃ−ＮＥＥ誘導体で標識されたプローブを用
いて標的核酸を定量したときの結果を示す図である。FIG. 2 is a view showing the results when a target nucleic acid is quantified using a probe labeled with an Ac-NEE derivative.
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧ ＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ
２０SEQ ID NO: 1 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single-stranded Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA sequence GTTTTCCCAG TCCACGCGTT
20
Claims (3)
クリジン誘導体を含有してなることを特徴とする核酸染
色剤。 【化１】 （なお、式中のＲ1 はアルキル基を表し、Ｒ2 はハロゲ
ンイオンを表し、Ｒ3 はフェニル基、アニリノ基、ヒド
ロキシフェニル基、アルキルアニリノ基、ジアルキルア
ニリノ基、ジヒドロキシアルキルアニリノ基、２−（Ｎ
−アルキルアニリノ）エタノール基、ナフチル基、ナフ
トール基を表す。）1. A nucleic acid staining agent comprising a 9-azoacridine derivative represented by the following general formula (1). Embedded image (In the formula, R 1 represents an alkyl group, R 2 represents a halogen ion, and R 3 represents a phenyl group, anilino group, hydroxyphenyl group, alkylanilino group, dialkylanilino group, dihydroxyalkylanilino group. , 2- (N
-Alkylanilino) represents an ethanol group, a naphthyl group or a naphthol group. )
クリジン誘導体が２本鎖核酸と相互作用することによっ
て生じる蛍光特性の変化を測定することを特徴とする２
本鎖核酸の検出方法。2. The method according to claim 2, wherein a change in fluorescence characteristics caused by the interaction of the 9-azoacridine derivative represented by the general formula (1) with a double-stranded nucleic acid is measured.
A method for detecting a single-stranded nucleic acid.
本鎖ヌクレオチドからなるプローブと、前記一般式
（１）で示される９−アゾアクリジン誘導体を含有して
なることを特徴とする標的核酸の検出試薬。3. A target nucleic acid comprising a probe consisting of a single-stranded nucleotide having a nucleic acid sequence complementary to a target nucleic acid, and a 9-azoacridine derivative represented by the general formula (1). Detection reagent.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9884898A JPH11290098A (en) | 1998-04-10 | 1998-04-10 | Stain of nucleic acid, detection of double stranded nucleic acid by using the same, and reagent for detecting target nucleic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9884898A JPH11290098A (en) | 1998-04-10 | 1998-04-10 | Stain of nucleic acid, detection of double stranded nucleic acid by using the same, and reagent for detecting target nucleic acid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11290098A true JPH11290098A (en) | 1999-10-26 |
Family
ID=14230670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9884898A Pending JPH11290098A (en) | 1998-04-10 | 1998-04-10 | Stain of nucleic acid, detection of double stranded nucleic acid by using the same, and reagent for detecting target nucleic acid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11290098A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009022512A1 (en) | 2007-08-14 | 2009-02-19 | Sony Corporation | Method for obtaining information on formation of double-stranded nucleic acid |
-
1998
- 1998-04-10 JP JP9884898A patent/JPH11290098A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009022512A1 (en) | 2007-08-14 | 2009-02-19 | Sony Corporation | Method for obtaining information on formation of double-stranded nucleic acid |
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