JPH11276198A - Chemiluminescent enzyme immunoassay - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To raise the sensitivity of a method for a chemiluminescent enzyme immunoassay using a peroxidase enzyme as a labeling substance and measure the content of an antigen or an antibody in a low-concentration region with good quantitativeness by adding a specific chemiluminescent reagent to an immune complex and producing the chemiluminescence in the presence of a hydrogen acceptor. SOLUTION: A peroxidase enzyme-labeled antibody or antigen is mixed with an antigen or an antibody to be measured or an aggregate thereof to produce an immune complex which is a peroxidase enzyme-labeled-antigen- antibody complex according to an antigen-antibody reaction. A chemilumiscent reagent obtained by bringing N,N'-clisubstituted-9,9'-bisacridinium salts (preferably N,N'-dimethyl-9,9'-bisacriclinium dinitrate) into contact with a reducing agent in the presence of an N,N-disubstituted carboxamide compound under irradiation of ultraviolet rays is added to the immune complex to produce the chemiluminescence in the presence of a hydrogen acceptor. The luminous quantity thereof is then measured to determine the content of the antigen or antibody.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、化学発光方法を利
用する酵素免疫測定方法に関するものであり、更に詳し
くは、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、特
定のビスアクリジニウム塩類の還元生成物を化学発光物
質として用いる抗原又は抗体の免疫学的測定方法に関す
るものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an enzyme immunoassay method using a chemiluminescence method, and more particularly, to a method of using a peroxidase enzyme as a labeling substance and reducing a reduction product of a specific bisacridinium salt. The present invention relates to a method for immunologically measuring an antigen or an antibody used as a chemiluminescent substance.

【０００２】[0002]

【従来の技術】酵素免疫測定方法は、標識物質に放射性
同位元素を使用しないので良好な測定環境を保持するこ
とが可能であり、人体に対して危険性の少ない免疫測定
方法として開発され、種々の物質の測定系に利用されて
いる。この酵素免疫測定方法において使用される酵素と
しては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
β−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ等の
種々の酵素が使用されている。これらの酵素を用いた酵
素標識抗体又は抗原の酵素活性を検出する方法として
は、過酸化水素／ｏ−フェニレンジアミン、４−ニトロ
フェニル−ホスフェート、２−ニトロフェニル−β−ガ
ラクトシド等の酵素基質の酵素による分解反応に伴い生
成する発色性物質の発色量を測定して酵素活性を定量
し、この酵素活性と相関性を有する抗体又は抗原の量を
定量する比色法が一般的である。しかしながら、臨床化
学分析においてはその測定対象が生体試料（主として血
清、尿等）であり、その測定値は病態の診断又はその経
過観察等に用いられることが多く、そのために、より高
感度及び高精度な測定が求められているが、比色法によ
りこの要求を完全に満足させるのは難しい。そこで、こ
の要求を満たすことを目的として蛍光法が提案されてい
る。蛍光法とは、標識に用いた酵素の触媒活性により、
４−ヒドロキシフェニル酢酸、４−メチルウムベリフェ
リル−β−ガラクトシド、４−メチルウムベリフェリル
−ホスフェート等の蛍光基質を分解して蛍光を発生させ
た後、この蛍光強度を測定して酵素活性を定量し、この
酵素活性と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する
方法である。しかし、蛍光法では、励起光の散乱が存在
するため前記の要求を満たすには充分とは云い難い。ま
た、比色法及び蛍光法では、キセノンランプ等の光源が
必要であり、光源からの光に由来する迷走現象や溶媒に
由来するラマン光が原因となり、バックグラウンドのレ
ベルを上昇させてしまうので、比色法及び蛍光法による
測定の高感度化は原理的に困難である。近年、比色法及
び蛍光法を上回る高感度な酵素免疫測定方法として、化
学発光酵素免疫測定方法（ＣＬＥＩＡ）が開発され、注
目されている。2. Description of the Related Art Enzyme-linked immunosorbent assays have been developed as immunoassays that do not use radioactive isotopes as labeling substances and thus can maintain a favorable assay environment and are less dangerous to the human body. It is used in the measurement system for substances. Enzymes used in this enzyme immunoassay include peroxidase, alkaline phosphatase,
Various enzymes such as β-galactosidase and glucose oxidase have been used. As a method for detecting the enzyme activity of an enzyme-labeled antibody or an antigen using these enzymes, a method for detecting an enzyme substrate such as hydrogen peroxide / o-phenylenediamine, 4-nitrophenyl-phosphate, 2-nitrophenyl-β-galactoside, etc. A colorimetric method is generally used, in which the amount of a color-forming substance produced by a decomposition reaction by an enzyme is measured to determine the enzyme activity, and the amount of an antibody or antigen having a correlation with the enzyme activity is determined. However, in clinical chemistry analysis, the measurement target is a biological sample (mainly, serum, urine, etc.), and the measured value is often used for diagnosing a disease state or observing its follow-up. Accurate measurement is required, but it is difficult to completely satisfy this requirement by a colorimetric method. Therefore, a fluorescence method has been proposed for the purpose of satisfying this requirement. The fluorescence method is based on the catalytic activity of the enzyme used for labeling.
After decomposing a fluorescent substrate such as 4-hydroxyphenylacetic acid, 4-methylumbelliferyl-β-galactoside, or 4-methylumbelliferyl-phosphate to generate fluorescence, the fluorescence intensity is measured to determine the enzyme activity. This is a method of quantifying and quantifying the amount of an antibody or antigen having a correlation with this enzyme activity. However, it is difficult to say that the fluorescence method is sufficient to satisfy the above requirements because of the scattering of excitation light. In addition, the colorimetric method and the fluorescent method require a light source such as a xenon lamp. In principle, it is difficult to increase the sensitivity of the measurement by the colorimetric method and the fluorescent method. In recent years, a chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) has been developed and attracted attention as a more sensitive enzyme immunoassay than colorimetry and fluorescence.

【０００３】化学発光酵素免疫測定方法（ＣＬＥＩＡ）
は、酵素の触媒活性によって化学発光物質が中間体を経
て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放
出される発光量を測定して酵素活性を定量し、この酵素
活性と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する方法
であり、化学反応により化学発光物質を発光させるため
光源が不要であり、光源に起因するバックグラウンドの
上昇等がないため測定の高感度化が可能である。[0003] Chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA)
Is to determine the enzyme activity by measuring the amount of luminescence emitted when the chemiluminescent substance is excited via an intermediate due to the catalytic activity of the enzyme and returning from this state to the ground state, and correlate with this enzyme activity. This is a method for quantifying the amount of an antibody or an antigen having a light source, which does not require a light source to emit a chemiluminescent substance by a chemical reaction, and can increase measurement sensitivity because there is no increase in background caused by the light source. .

【０００４】化学発光酵素免疫測定方法（ＣＬＥＩＡ）
に用いられる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース
オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ等が挙げられるが、取
り扱い易さ、入手し易さ等の点でペルオキシダーゼが好
適に用いられ、化学発光物質としてルミノールを用い、
発光増強剤としてｐ−ヨードフェノールを用いる化学発
光系が開発され、種々の物質が化学発光方法により免疫
学的に高感度で定量することが可能になっている。[0004] Chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA)
Examples of the enzyme used include peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucose oxidase, dehydrogenase, and the like. Using
A chemiluminescence system using p-iodophenol as a luminescence enhancer has been developed, and it has become possible to quantify various substances with high sensitivity immunologically by a chemiluminescence method.

【０００５】しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素を標
識物質とする化学発光酵素免疫測定方法（ＣＬＥＩＡ）
においては、測定対象物質の低濃度領域での定量性を、
更に、高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシ
ダーゼ酵素を標識物質とする化学発光酵素免疫測定方法
（ＣＬＥＩＡ）の更なる高感度化が望まれていた。However, a chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) using a peroxidase enzyme as a labeling substance.
In, the quantification of the analyte in the low concentration region,
Further, in many cases, it is necessary to increase the sensitivity, and there has been a demand for further increasing the sensitivity of a chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) using a peroxidase enzyme as a labeling substance.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、前
記事情に鑑み、測定対象物質をより高感度で測定可能な
化学発光方法による新規な免疫測定系を利用した酵素免
疫測定方法を提供することを課題とする。Accordingly, the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides an enzyme immunoassay method using a novel immunoassay system based on a chemiluminescence method capable of measuring a substance to be measured with higher sensitivity. That is the task.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
前記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、化
学発光物質としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
化合物、更に、蟻酸の存在下において還元剤と紫外線照
射下で接触させて調製した化学発光試薬を用い、更に、
発光増強剤として特定のフェノール系化合物を用いる化
学発光系が、化学発光物質としてルミノールを用いる系
より高感度に測定対象物質を免疫学的に定量することが
可能なことを見い出し、これらの知見に基づいて本発明
の完成に到達した。Means for Solving the Problems Accordingly, the present inventors have:
As a result of intensive studies to solve the above problems, N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salts were used as chemiluminescent substances, N, N-disubstituted carboxylic acid amide compounds, Using a chemiluminescent reagent prepared by contacting with a reducing agent under ultraviolet irradiation in the presence of formic acid,
We have found that a chemiluminescence system using a specific phenolic compound as a luminescence enhancer is capable of immunologically quantifying a substance to be measured with higher sensitivity than a system using luminol as a chemiluminescence substance. Based on this, the present invention has been completed.

【０００８】すなわち、本発明は、ペルオキシダーゼ酵
素標識した抗体若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原
若しくは抗体又はそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反
応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体から
なる免疫複合体を生成させた後、化学発光物質として
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下に
おいて還元剤と紫外線照射下で接触させて調製した化学
発光試薬を添加し、水素受容体の存在下に化学発光さ
せ、その発光量を測定することにより試料中の抗原又は
抗体の量を定量することを特徴とする化学発光酵素免疫
測定方法に関するものである。That is, the present invention relates to an immunocomplex comprising a peroxidase enzyme-labeled-antigen-antibody complex by mixing an antibody or an antigen labeled with a peroxidase enzyme with an antigen or an antibody to be measured in a sample or an aggregate thereof. After the formation of the compound, N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts are irradiated with a reducing agent and ultraviolet light in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound as a chemiluminescent substance. Adding a chemiluminescent reagent prepared by contacting the sample under the conditions described above, causing chemiluminescence in the presence of a hydrogen receptor, and quantifying the amount of antigen or antibody in the sample by measuring the amount of luminescence. The present invention relates to a luminescent enzyme immunoassay method.

【０００９】[0009]

【発明の実施の形態】以下、本発明につき更に詳しく説
明する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

【００１０】本発明の化学発光酵素免疫測定方法は、抗
原抗体反応により測定すべき抗原又は抗体をペルオキシ
ダーゼ酵素標識した免疫複合体として捕捉する免疫反応
段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する
標識酵素を用いる化学発光方法により測定する化学発光
反応段階とからなる。免疫反応段階を構成する抗原抗体
反応の方法は任意であり、いずれの方法をも採用するこ
とができる。The chemiluminescent enzyme immunoassay of the present invention comprises an immunoreaction step in which an antigen or antibody to be measured by an antigen-antibody reaction is captured as an immune complex labeled with a peroxidase enzyme, and the produced immunocomplex is incorporated into the molecule. And a chemiluminescence reaction step which is measured by a chemiluminescence method using a labeling enzyme present in the above. The method of the antigen-antibody reaction constituting the immune reaction step is arbitrary, and any method can be adopted.

【００１１】例えば、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
を捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗体を反応
させるサンドイッチ法、 サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体
と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンド
イッチ錯体に対して、更に、この抗体に対する標識した
第二抗体を反応させる二抗体法。 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる
競合法、 測定すべき抗原又は抗体を含有する試料にこれらと特
異的に反応する標識した抗体又は抗原を作用させて凝集
沈殿させた後、遠心分離して分離した免疫複合体中の標
識物質を検出する凝集沈殿法、 不溶性担体に結合した抗原に試料中の測定すべき抗体
をペルオキシダーゼ酵素標識抗ヒトガンマグロブリン抗
体を作用させる抗体検出法、更に、 ビチオン標識抗体にペルオキシダーゼ酵素標識アビジ
ンを反応させるビチオン−アビジン法等を非限定的に用
いることができる。[0011] For example, a sandwich method in which an antigen to be measured in a sample is captured by an antibody bound to an insoluble carrier, and then a peroxidase enzyme-labeled antibody is reacted. A two-antibody method in which a sandwich complex produced is further reacted with a labeled second antibody against this antibody using an antibody to be produced. A competition method in which an antigen to be measured in a sample is reacted with an antibody bound to an insoluble carrier in the presence of a peroxidase enzyme-labeled antigen, a labeled antibody which specifically reacts with a sample containing the antigen or antibody to be measured or An agglutination sedimentation method is used to detect the labeling substance in the immune complex separated by centrifugation after the antigen is allowed to act for coagulation and sedimentation. An antibody detection method in which a human gamma globulin antibody is allowed to act, and a bition-avidin method in which a peroxidase enzyme-labeled avidin is reacted with a bition-labeled antibody can be used without limitation.

【００１２】特に、本発明においては、ペルオキシダー
ゼ酵素標識した抗体又は抗原を試料中の測定すべき抗原
又は抗体と混合し、抗原抗体反応によりペルオキシダー
ゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体を生成さ
せ、免疫複合体を不溶性担体に固定化した抗体又は抗原
と反応させて不溶性固体上に捕捉する方法が好ましい。In particular, in the present invention, an antibody or an antigen labeled with a peroxidase enzyme is mixed with an antigen or an antibody to be measured in a sample to form an immune complex comprising a peroxidase enzyme-labeled-antigen-antibody complex by an antigen-antibody reaction. Preferably, the immune complex is reacted with an antibody or antigen immobilized on an insoluble carrier and captured on an insoluble solid.

【００１３】本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用い
られる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアク
リロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサ
ッカライド等の高分子化合物、ガラス、金属、磁性粒子
及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性
担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維
状、棒状、盤状、容器状のほか、セル、マイクロプレー
ト、試験管等の種々の形状で用いることができる。更
に、これらの不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法
は任意であり、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合
法等のいずれも用いることができる。The insoluble carrier used in the chemiluminescent enzyme immunoassay of the present invention includes, for example, polymer compounds such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, cross-linked dextran, polysaccharide, glass, and metal. , Magnetic particles and combinations thereof. As the shape of the insoluble carrier, for example, various shapes such as a tray, a sphere, a fiber, a bar, a disk, a container, a cell, a microplate, and a test tube can be used. Further, the method of immobilizing the antigen or antibody on these insoluble carriers is arbitrary, and any of a physical adsorption method, a covalent bonding method, and an ionic bonding method can be used.

【００１４】尚、本発明の酵素免疫測定方法において用
いられる抗体類はモノクローナル抗体及びポリクローナ
ル抗体のいずれを使用することも可能であり、形態は全
抗体又はＦ（ａｂ’）₂ 、Ｆａｂ等の断片を用いること
ができる。また、抗体の起源は任意であるが、マウス、
ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来するものが好適に用
いられる。The antibodies used in the enzyme immunoassay of the present invention may be either monoclonal antibodies or polyclonal antibodies, and may be in the form of whole antibodies or fragments of F (ab ') ₂ , Fab, etc. Can be used. In addition, the origin of the antibody is arbitrary,
Those derived from rats, rabbits, sheep, goats, chickens and the like are preferably used.

【００１５】更に、本発明の化学発光酵素免疫測定方法
の後段の化学発光反応段階を構成する化学発光方法は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下に
おいて還元剤と紫外線照射下で接触させることにより得
られる化学発光試薬を用いることができる方法であれ
ば、特に限定されるものではない。Further, the chemiluminescence method constituting the subsequent chemiluminescence reaction step of the chemiluminescence enzyme immunoassay method of the present invention comprises:
A chemiluminescent reagent obtained by bringing an N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salt into contact with a reducing agent under ultraviolet irradiation in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound. The method is not particularly limited as long as the method can be used.

【００１６】本発明において、学発光試薬として、Ｎ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下におい
て紫外線の照射下で還元剤と接触させることにより得ら
れる還元生成物を含有する化学発光試薬を用い、更に、
発光増強剤の存在下において水素受容体を作用させて不
溶性担体上に捕捉された標識物質であるペルオキシダー
ゼ酵素の活性を測定するものであり、その測定方法は任
意であるが、一般に、化学発光物質及び発光増強剤を含
有する測定試薬を、ペルオキシダーゼ酵素標識抗体又は
抗原を免疫学的に捕捉した不溶性担体に添加し、特定塩
基性ｐＨ領域において水素受容体（過酸化水素水溶液）
を添加して化学発光反応させ、その発光量を発光測定装
置で測定する方法等が行なわれる。In the present invention, N,
N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts are
A chemiluminescent reagent containing a reduction product obtained by contacting with a reducing agent under ultraviolet irradiation in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound;
The activity of a peroxidase enzyme, which is a labeling substance captured on an insoluble carrier by allowing a hydrogen receptor to act in the presence of a luminescence enhancer, is measured.The measuring method is optional, but generally, a chemiluminescent substance is used. And a measurement reagent containing a luminescence enhancer are added to an insoluble carrier having immunologically captured a peroxidase enzyme-labeled antibody or antigen, and a hydrogen acceptor (aqueous hydrogen peroxide solution) in a specific basic pH region
Is added to cause a chemiluminescence reaction, and the amount of the emitted light is measured by a luminescence measuring device.

【００１７】本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用い
られる化学発光試薬は、下記の一般式（１）The chemiluminescent reagent used in the chemiluminescent enzyme immunoassay of the present invention has the following general formula (1):

【００１８】[0018]

【化２】 で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物
の存在下において還元剤と紫外線照射下で接触させるこ
とにより得られる反応生成物であり、単一化合物又は混
合物である。Embedded image By contacting the N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salt represented by with a reducing agent under ultraviolet irradiation in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound. The reaction product is a single compound or a mixture.

【００１９】上記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ²
は、各々、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリ
ール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異
なるものでもよい。アルキル基としては、炭素数１〜２
０、好ましくは、１〜１４の直鎖状又は分岐状のいずれ
でも用いることができ、アリール基及びハロゲン化アリ
ール基は、各々、炭素数６〜２０のものであり、炭素数
１〜１４のアルキル基で置換されたものでもよいが、特
にフェニル基及びハロゲン化フェニル基が好ましい。ま
た、式中、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、各々、水素原
子、アルキル基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハ
ロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも異
なるものでもよい。アルキル基、アルコキシ基は炭素数
１〜２０、好ましくは、１〜１４の直鎖状又は分岐状の
ものでもよく、アリール基、アリーロキシ基は炭素数６
〜２０のものであり、アルキル基で置換されたものでも
よい。In the above general formula (1), R ¹ and R ²
Are each selected from the group consisting of an alkyl group, an aryl group and an aryl halide group, and may be the same or different from each other. As the alkyl group, one having 1 to 2 carbon atoms
0, preferably any of 1 to 14 linear or branched, and the aryl group and the halogenated aryl group each have 6 to 20 carbon atoms and 1 to 14 carbon atoms. Although it may be substituted with an alkyl group, a phenyl group and a halogenated phenyl group are particularly preferred. In the formula, R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are each selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group, an alkoxy group, an aryloxy group and a halogen atom, and may be the same or different. The alkyl group and the alkoxy group may be linear or branched having 1 to 20, preferably 1 to 14 carbon atoms, and the aryl group and the aryloxy group may have 6 carbon atoms.
To 20 and may be substituted with an alkyl group.

【００２０】上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の具体例を例示すると、Ｎ，Ｎ’−ジ
メチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩が好適に用い
られるが、その他に、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−
ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，
９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−
９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジペンチ
ル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフ
ェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−
ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウ
ム塩等を非限定的に挙げることができる。これらのなか
で、特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリ
ジニウムジナイトレートが好適である。As specific examples of the N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salts, N, N'-dimethyl-9,9'-bisacridinium salts are preferably used. But N, N'-diethyl-9,9'-
Bisacridinium salt, N, N'-dipropyl-9,
9'-bisacridinium salt, N, N'-dibutyl-
9,9′-bisacridinium salt, N, N′-dipentyl-9,9′-bisacridinium salt, N, N′-diphenyl-9,9′-bisacridinium salt, N, N '-
Non-limiting examples include di-m-chlorophenyl-9,9'-bisacridinium salt. Among these, N, N'-dimethyl-9,9'-bisacridinium dinitrate is particularly preferred.

【００２１】上記一般式（１）において、Ｘ^n-はｎ価の
陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとして
は、特に限定されるものではないが、硝酸イオン（ＮＯ
₃ ^-）、ハロゲン化物イオン（例えば、塩化物イオン、フ
ッ化物イオン等）、（メタ）リン酸イオン（ＰＯ₃ ^-）等
を挙げることができる。これらの陰イオンのなかでは、
特に硝酸イオンが好ましい。In the general formula (1), X ^n- is an n-valent anion, and n is 1 or 2. The anion is not particularly limited, but may be a nitrate ion (NO
₃ ^-), halide ions (e.g., chloride ion, fluoride ion, etc.), (meth) phosphate ion (PO ₃ ^- can be mentioned) and the like. Among these anions,
Particularly, nitrate ion is preferable.

【００２２】本発明の化学発光免疫測定方法において用
いられる化学発光試薬の製造に供されるＮ，Ｎ−ジ置換
カルボン酸アミド化合物は、例えば、次の一般式（２）The N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound used for the production of the chemiluminescent reagent used in the chemiluminescence immunoassay of the present invention is, for example, the following general formula (2)

【００２３】[0023]

【化３】 で表すことができる。一般式（２）において、Ｒ₁ は、
水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１
０のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基であ
り、アリール基はアルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基等で置換されていてもよい。Ｒ₂ は、
メチル基又はエチル基であり、Ｒ₃ は、炭素数１〜１０
のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数
６〜２０のアリール基であり、アリール基はアルキル
基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基、アミノ基等で置換
されていてもよい。また、Ｒ₁ 及びＲ₃ は互いに結合し
て、各々が結合しているカルボニル基の炭素原子及びア
ミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。Ｎ，
Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体例を例示する
と、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，
Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベン
ズアミド等を挙げることができ、また、ピロリドン類と
して、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げ
られる。このＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物
は、本発明の化学発光試薬の製造には必須であり、Ｎ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類と複
合体を形成した後、アクリジニウム塩構造の還元反応に
伴い、より発光収率の高い化合物へと変化するものであ
り、本発明の化学発光試薬の製造反応に反応成分として
関与し、反応生成物の水溶性の付与等に寄与しているも
のと推定される。従って、その使用量はＮ，Ｎ’−ジ置
換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対して１〜１
０００当量、好ましくは１．５〜５００当量、特に好ま
しくは２〜３００当量の割合で採用される。Embedded image Can be represented by In the general formula (2), R ₁ is
Hydrogen atom, alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, 2 to 1 carbon atoms
0 is an alkenyl group, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, and the aryl group is an alkyl group, a halogen group, a nitro group,
It may be substituted with a hydroxyl group, an amino group or the like. R ₂ is
A methyl group or an ethyl group, and R ₃ has 1 to 10 carbon atoms.
An alkyl group, an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms, and an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, and the aryl group may be substituted with an alkyl group, a halogen group, a nitro group, a hydroxyl group, an amino group, or the like. R ₁ and R ₃ may be bonded to each other to form a ring together with the carbon atom of the carbonyl group and the nitrogen atom of the amide group to which each is bonded. N,
Specific examples of the N-disubstituted carboxylic acid amide compound include N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N, N-dimethylacrylamide,
Examples thereof include N-dimethylpropionamide and N, N-dimethylbenzamide, and examples of pyrrolidones include, but are not limited to, N-methyl-2-pyrrolidone. This N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound is essential for the production of the chemiluminescent reagent of the present invention.
After forming a complex with the N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salt, the compound changes to a compound having a higher luminescence yield with the reduction reaction of the acridinium salt structure. It is presumed that it participates in the production reaction of the chemiluminescent reagent as a reaction component and contributes to imparting water solubility of the reaction product. Therefore, the amount used is 1 to 1 with respect to N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salts.
It is employed in a proportion of 000 equivalents, preferably 1.5 to 500 equivalents, particularly preferably 2 to 300 equivalents.

【００２４】また、化学発光試薬の製造において、Ｎ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を
Ｎ，Ｎ’−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下にお
いて還元剤と接触させる際に、更に、蟻酸を添加するこ
とが好ましく、また、還元処理には有機溶媒を用いるこ
とが好ましい。蟻酸は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類に対して０〜５０００当量、好
ましくは、０．５〜１０００当量、特に好ましくは、１
〜５００当量の割合で用いられ、還元反応を促進し、化
学発光試薬の反応収率を著しく高める作用を有するもの
である。In the production of a chemiluminescent reagent, N,
When the N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt is brought into contact with a reducing agent in the presence of an N, N′-disubstituted carboxylic acid amide compound, it is preferable to further add formic acid, It is preferable to use an organic solvent for the reduction treatment. Formic acid is N, N'-disubstituted-9,9'-
0 to 5000 equivalents, preferably 0.5 to 1000 equivalents, particularly preferably 1 to 1 equivalent to the bisacridinium salt.
It is used at a ratio of up to 500 equivalents and has the effect of promoting the reduction reaction and significantly increasing the reaction yield of the chemiluminescent reagent.

【００２５】化学発光試薬の製造において、Ｎ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理
に用いられる還元剤としては、水素化リチウムアルミニ
ウム、水素化リチウムボロン、水素化ナトリウムボロン
等が挙げられるが、水素化リチウムアルミニウムが特に
好ましい。In the production of a chemiluminescent reagent, N, N'-
Examples of the reducing agent used for the reduction treatment of disubstituted-9,9'-bisacridinium salts include lithium aluminum hydride, lithium boron hydride, sodium boron hydride, and the like. preferable.

【００２６】還元処理を行なう際には、反応溶媒を使用
することが好ましく、反応試薬に対して不活性であり、
反応試薬に対する溶解性を有するものであれば、特に限
定されるものではないが、テトラヒドロフラン、ジオキ
サン類等の環状エーテル類等の有機溶媒が特に好まし
い。When performing the reduction treatment, it is preferable to use a reaction solvent, which is inert to the reaction reagent,
Although it is not particularly limited as long as it has solubility in the reaction reagent, organic solvents such as cyclic ethers such as tetrahydrofuran and dioxane are particularly preferable.

【００２７】また、化学発光試薬の製造に用いられる紫
外線の光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯
等を非限定的に用いることができるが、高圧水銀灯が好
ましく用いられる。この紫外線照射により得られる化学
発光試薬は、紫外線を照射せずに製造した化学発光試薬
に較べて同濃度で使用した場合に、非常に高い発光強度
を示すことが認められることから、化学発光性化合物の
生成反応を促進する作用を有するものと推定される。A high-pressure mercury lamp, a low-pressure mercury lamp, a germicidal lamp and the like can be used without limitation as an ultraviolet light source used for the production of a chemiluminescent reagent, but a high-pressure mercury lamp is preferably used. The chemiluminescent reagent obtained by this ultraviolet irradiation shows extremely high luminescence intensity when used at the same concentration as compared to a chemiluminescent reagent manufactured without irradiation with ultraviolet light. It is presumed that the compound has an action to promote the reaction for producing a compound.

【００２８】反応温度は用いられる還元剤及び反応溶媒
の種類によって異なるが、一般的に、−１０〜＋１５０
℃、好ましくは、０〜１２０℃、特に好ましくは、２０
〜９０℃の範囲の温度を採用することができる。また、
反応時間は、１分〜一昼夜、好ましくは、１０分〜１２
時間、特に好ましくは、３０分〜５時間の範囲の時間で
よい。The reaction temperature depends on the type of the reducing agent and the reaction solvent used, but is generally -10 to +150.
° C, preferably 0 to 120 ° C, particularly preferably 20 ° C.
Temperatures in the range of ９０90 ° C. can be employed. Also,
Reaction time is 1 minute to 24 hours, preferably 10 minutes to 12 minutes.
Time, particularly preferably 30 minutes to 5 hours.

【００２９】本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用い
られる化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件
下、過剰の水素受容体の存在下において、ペルオキシダ
ーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光はフェノ
ール性化合物等の発光増強剤によって増強されることが
認められる。このようなフェノール性化合物としては、
ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−
（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−プロモ
フェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フ
ェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノー
ル、ｐ−クロロフェノール、６−ヒドロキシベンゾチア
ゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が非限
定的に挙げられる。The chemiluminescent reagent used in the chemiluminescent enzyme immunoassay of the present invention emits luminescence in an amount depending on the concentration of peroxidase under basic conditions of pH 7.5 to 13 in the presence of an excess of hydrogen acceptor. I do. It is recognized that this luminescence is enhanced by a luminescence enhancer such as a phenolic compound. Such phenolic compounds include:
p-hydroxycinnamic acid, p-phenylphenol, p-
(4-chlorophenyl) phenol, p- (4-bromophenyl) phenol, p- (4-iodophenyl) phenol, p-iodophenol, p-bromophenol, p-chlorophenol, 6-hydroxybenzothiazole, 2- Non-limiting examples include naphthol, firefly luciferin and the like.

【００３０】本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用い
られる化学発光試薬の濃度は、１０^-8〜１Ｍ、好ましく
は、１０^-6〜１０^-2Ｍの範囲であり、その使用量は１０
〜５００μｌ、特に、５０〜３００μｌの範囲が好まし
い。また、発光増強剤の使用量は、化学発光試薬の０．
０１〜１００倍モル、好ましくは、０．１〜１０倍モル
の範囲であり、その濃度は１０^-6〜１Ｍ、特に、１０^-4
〜１０^-2Ｍの範囲が好ましい。The concentration of the chemiluminescent reagent used in the chemiluminescent enzyme immunoassay of the present invention is in the range of 10 ^{−8 to 1} M, preferably 10 ⁻⁶ to 10 ⁻² M, and the amount used is 10
The range is preferably from 500 to 500 µl, particularly preferably from 50 to 300 µl. In addition, the amount of the luminescence enhancer used is 0.1% of the chemiluminescence reagent.
It is in the range of from 0.1 to 100-fold molar, preferably from 0.1 to 10-fold molar, and its concentration is from 10 ^{-6 to 1} M, especially 10 ^-4.
A range from 10 to ^10-2M is preferred.

【００３１】ペルオキシダーゼを標識物質として利用
し、抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合
には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダー
ゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用
いることが好ましい。When peroxidase is used as a labeling substance to label antibodies, nucleic acids and the like to quantify various substances, there is no particular limitation, but horseradish peroxidase (HRP) may be used as the peroxidase. Is preferred.

【００３２】また、化学発光反応に用いられる水素受容
体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るも
のであれば、特に限定されるものではなく、有機過酸化
物、無機過酸化物等が任意に用いられるが、過酸化水素
が好ましくい。この水素受容体の使用量は化学発光性物
質に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、
その使用量は、化学発光物質に対して３〜１万倍モル、
特に、１０〜１０００倍モルの範囲が好ましい。The hydrogen acceptor used in the chemiluminescence reaction is not particularly limited as long as it can serve as a substrate for a peroxidase enzyme, and organic peroxides, inorganic peroxides and the like are optionally used. However, hydrogen peroxide is preferred. It is necessary to use the hydrogen acceptor in a sufficient excess amount with respect to the chemiluminescent substance,
The amount used is 30,000 to 10,000 times the mole of the chemiluminescent substance,
In particular, the range of 10 to 1000 times mol is preferable.

【００３３】化学発光反応に用いられる塩基性緩衝液と
しては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、
炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を挙
げることができる。これらの緩衝液は１ｍＭ〜１Ｍの濃
度範囲で用いることが好ましい。また、反応時に界面活
性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることもでき
る。The basic buffers used in the chemiluminescence reaction include Tris buffer, phosphate buffer, borate buffer,
Examples thereof include a carbonate buffer and a glycine-sodium hydroxide buffer. These buffers are preferably used in a concentration range of 1 mM to 1M. In addition, additives such as a surfactant and a chelating agent can be optionally used during the reaction.

【００３４】本発明の化学発光酵素免疫測定方法におけ
る化学発光反応の発光量の測定は、発光光度計を用いて
測定することができる。その際に、発光量測定の開始点
及び積算時間は任意であるが、発光量が安定し且つ発光
量の濃度依存性の高い時間を選択するのが望ましい。例
えば、測定開始点は試薬混合後０〜１時間、好ましく
は、０〜３０分、特に好ましくは、０〜１５分であり、
測定の積算時間は１秒〜１分、好ましくは、１〜３０
秒、特に好ましくは、１〜１０秒である。The amount of luminescence of the chemiluminescence reaction in the method of the present invention can be measured using a luminescence photometer. At this time, the start point and the integration time of the light emission amount measurement are arbitrary, but it is desirable to select a time in which the light emission amount is stable and the light emission amount has high concentration dependency. For example, the measurement starting point is 0 to 1 hour after mixing the reagents, preferably 0 to 30 minutes, particularly preferably 0 to 15 minutes,
The integration time of measurement is 1 second to 1 minute, preferably 1 to 30 minutes.
Seconds, particularly preferably 1 to 10 seconds.

【００３５】本発明の好ましい実施の形態としては、ペ
ルオキシダーゼ酵素標識した抗体又は抗原を試料中の抗
原又は抗体と混合し、抗原抗体反応によりペルオキシダ
ーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体を生成
させた後、化学発光試薬として、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存在下において紫外線
照射下で還元剤と接触させることにより得られる化学発
光試薬を添加し、水素受容体の存在下において、化学発
光させ、その発光量を測定することにより、試料中の抗
原量又は抗体量を測定することからなる化学発光酵素免
疫測定方法を提供することができる。In a preferred embodiment of the present invention, an antibody or an antigen labeled with a peroxidase enzyme is mixed with an antigen or an antibody in a sample, and an immunoconjugate comprising a peroxidase enzyme-labeled-antigen-antibody complex is formed by an antigen-antibody reaction. After that, N, N'-disubstituted-
A chemiluminescent reagent obtained by contacting a 9,9′-bisacridinium salt with a reducing agent under ultraviolet irradiation in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound and formic acid is added, and a hydrogen acceptor is added. By performing chemiluminescence in the presence of and measuring the amount of luminescence, a chemiluminescent enzyme immunoassay method comprising measuring the amount of antigen or antibody in a sample can be provided.

【００３６】[0036]

【実施例】以下、参考例と共に実施例を示し、本発明を
具体的に説明するが、本発明は実施例等により限定され
るものではない。尚、参考例及び実施例等の％は重量％
を意味する。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples along with Reference Examples, but the present invention is not limited to Examples and the like. The percentages in Reference Examples and Examples are% by weight.
Means

【００３７】［参考例１］化学発光試薬の製造 ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメ
チルアセトアミド１５０μｌを加えて溶解させた後、攪
拌下に１，４−ジオキサン１ｍｌ中へ加えてルシゲニン
を１，４−ジオキサン中に微分散させた。次に、これに
蟻酸２０μｌを加えてよく攪拌してから、水素化リチウ
ムアルミニウム粉末５ｍｇを添加して、１ＫＷの高圧水
銀灯の照射下に、２５℃で３０分間攪拌して還元反応さ
せた後、反応混合液を氷冷下に脱イオン水１ｍｌ中へ少
量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを
分解させた。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈
殿を濾別してから、濾液のｐＨを１Ｎ塩酸で７．０に調
整することにより新規化学発光試薬を得た。Reference Example 1 Preparation of Chemiluminescent Reagent [0086] 1 mg of lucigenin was placed in a test tube, and 150 μl of N, N-dimethylacetamide was added thereto and dissolved, and then added to 1 ml of 1,4-dioxane with stirring. Lucigenin was finely dispersed in 1,4-dioxane. Next, formic acid (20 μl) was added thereto, and the mixture was stirred well. Then, lithium aluminum hydride powder (5 mg) was added, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 30 minutes under irradiation with a 1 kW high-pressure mercury lamp to cause a reduction reaction. The reaction mixture was poured into 1 ml of deionized water little by little under ice cooling to decompose excess lithium aluminum hydride. Next, the resulting precipitate of aluminum hydroxide and the like was separated by filtration, and the pH of the filtrate was adjusted to 7.0 with 1N hydrochloric acid to obtain a novel chemiluminescent reagent.

【００３８】［参考例２］不溶性担体固定化ポリクローナル抗体の製造 抗原に対し特異的反応性を有する兎等の動物由来のポリ
クローナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
7.4 ）（ＰＢＳ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶
液を、白色マイクロプレート（ラボシステム社）の各ウ
ェルに０．１ｍｌずつ加え、３７℃の温度で１時間放置
した後、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）水溶液を０．３ｍｌずつ加えて３７℃の温
度で１時間放置してポストコーティング処理を実施して
ポリクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得
た。Reference Example 2 Production of Polyclonal Antibody Immobilized on Insoluble Carrier A polyclonal antibody derived from an animal such as a rabbit having specific reactivity to an antigen was prepared by adding 10 mM phosphate buffered saline (pH
7.4) 0.1 ml of a solution dissolved in (PBS) at a concentration of 10 mg / ml was added to each well of a white microplate (Lab System), left at 37 ° C. for 1 hour, and washed with PBS. Thereafter, 0.3 ml of a 1% bovine serum albumin (BSA) aqueous solution was added thereto, and the mixture was allowed to stand at a temperature of 37 ° C. for 1 hour to perform a post-coating treatment to obtain a polyclonal antibody-immobilized white microplate.

【００３９】［参考例３］ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体の製造 抗原に特異的反応性を有するマウス由来等のモノクロー
ナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
（ｐＨ7.4 ）に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液
１ｍｌに、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サク
シンイミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度
のジメチルホルムアミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５
℃の温度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合
液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ6.0 ）でゲル濾過を行な
い、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳと
を分離した。[Reference Example 3] Production of Peroxidase Enzyme-Labeled Monoclonal Antibody Monoclonal antibody derived from a mouse or the like having specific reactivity to an antigen was prepared from 10 mM phosphate buffered saline (PBS).
A solution of N- (m-maleimidobenzoic acid) -N-succinimide ester (MBS) in dimethylformamide having a concentration of 10 mg / ml was dissolved in 1 ml of a solution of 1.0 mg / ml in 1.0 (pH 7.4). Add 1 ml and add 25
The reaction was carried out at a temperature of ° C for 30 minutes. Then, using a column packed with Sephadex G-25,
Gel filtration was performed with a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) to separate the maleimidated monoclonal antibody from unreacted MBS.

【００４０】一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホース
ラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍ
ｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−
（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１
０ｍｇ／ｍｌの濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃
の温度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液
をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、１
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ4.5 ）でゲル濾過して精製、ピ
リジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、
これをコロジオンバック中において氷冷下に約１０倍に
濃縮した。次に、これに０．１Ｍジチオスレイトールを
含有する０．１Ｍ酢酸緩衝生理食塩水（ｐＨ4.5 ）１ｍ
ｌを添加して、２５℃の温度で３０分間攪拌してＨＲＰ
分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した
後、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填し
たカラムを用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有
する画分を得た。On the other hand, horseradish peroxidase (HRP) was used as a peroxidase enzyme.
g / ml of PBS solution in N-succinimidyl-3-
(2-pyridylthio) propionate (SPDP) 1
0 mg / ml ethanol solution was added,
At 30 ° C. for 30 minutes. Then, the reaction mixture was applied to a column packed with Sephadex G-25 using 1
Purification by gel filtration with 0 mM acetate buffer (pH 4.5), collection of a fraction containing pyridyl disulfide-modified HRP,
This was concentrated about 10 times under ice cooling in a collodion bag. Next, 1 m of 0.1 M acetate buffered saline (pH 4.5) containing 0.1 M dithiothreitol was added thereto.
and stirred at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes to add HRP
After reducing the pyridyl disulfide group introduced into the molecule, the reaction mixture was subjected to gel filtration using a column packed with Sephadex G-25 to obtain a fraction containing thiolated HRP.

【００４１】次に、マレイミド化モノクローナル抗体と
チオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用い
て氷冷下に４ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃
で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰ
ＲＡＣＯＲ社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、
ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体を得る。Next, the maleimidated monoclonal antibody and the thiolated HRP were mixed, concentrated using a collodion bag under ice cooling to a protein concentration of 4 mg / ml.
And left overnight for Ultrogel AcA44 (SEP
Gel filtration using a column packed with (RACOR),
A peroxidase enzyme-labeled monoclonal antibody is obtained.

【００４２】［実施例１］同時サンドイッチ法ＣＬＥＩ
Ａによるα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定兎抗ヒ
トＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロ
プレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を０〜８
００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
溶液（ｐＨ7.4 ）５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.
4 ）１００μｌとを加え、３７℃の濃度で１時間インキ
ュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した
後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにｐ−ヨード
フェノールを１０^-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）１００μｌを加え、これに参
考例１で製造した化学発光試薬の１０００倍希釈液１０
０μｌ及び０．００３４％過酸化水素を含む０．１Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）５０μｌを注入して発光さ
せ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製
ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定
し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることに
より、図１に示される濃度依存性の良い検量線を得た。
この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを０．０５
ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。Example 1 Simultaneous sandwich method CLEI
A. Measurement of α-fetoprotein (AFP) A purified human AFP (standard substance) was placed on a white microplate on which a rabbit anti-human AFP polyclonal antibody was immobilized, in the range of 0 to 8 μm.
PBS containing 2% BSA in the range of 00 ng / ml
50 μl of a solution (pH 7.4) and about 3 μg / m 2 of a mouse anti-human AFP monoclonal antibody labeled with a peroxidase enzyme.
1% PBS solution containing 2% BSA (pH 7.
4) 100 μl was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Next, the solution in the wells is removed by suction, and the wells are washed with physiological saline. Then, each well contains 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing p-iodophenol at a concentration of 10 ^-3 M. ) 100 μl was added thereto, and a 1000-fold diluted solution of the chemiluminescent reagent prepared in Reference Example 1 was added.
50 μl of 0 μl and 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing 0.0034% hydrogen peroxide was injected to emit light, and the amount of this light was measured using a luminometer (Diatron, Luminous CT-9000D). The measurement was performed by integrating for 5 seconds, and this value was plotted against the concentration of the standard substance to obtain a calibration curve having good concentration dependency shown in FIG.
Using this calibration curve, human AFP in serum sample was
It was possible to measure up to a concentration of ng / ml.

【００４３】［実施例２」同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるプロラクチン（Ｐ
ＲＬ）の測定 兎抗ヒトＰＲＬポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＰＲＬ（標準物質）を
０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）５０μｌとペルオキシダーゼ酵
素標識マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約２μ
ｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液
（ｐＨ7.4 ）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時
間インキュベートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引
除去し、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにｐ−ヨ
ードフェノールを１０^-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）１００μｌを加え、これ
に参考例１で製造した化学発光試薬の１０００倍希釈液
１００μｌ及び０．００３４％過酸化水素を含む０．１
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）５０μｌを注入して発
光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン
社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して
測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットするこ
とにより、図２に示される濃度依存性の良好な検量線を
得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトプロラクチ
ンを０．１ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能で
あった。[Example 2] Prolactin (P) by simultaneous sandwich method CLEIA
(RL) Measurement 50 μl of a 2% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) containing purified human PRL (standard substance) in the range of 0 to 200 ng / ml was placed on a white microplate on which a rabbit anti-human PRL polyclonal antibody was immobilized. And peroxidase enzyme-labeled mouse anti-human PRL monoclonal antibody
100 μl of a PBS solution (pH 7.4) containing 2% BSA containing a concentration of g / ml was added, and the mixture was incubated at a temperature of 37 ° C. for 1 hour. Next, the solution in the wells is removed by suction, and the wells are washed with physiological saline. Then, 100 μl of a 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing p-iodophenol at a concentration of 10 ⁻³ M is added to each well. And 100 μl of a 1000-fold diluted solution of the chemiluminescent reagent prepared in Reference Example 1 and 0.1% containing 0.0034% hydrogen peroxide.
50 μl of M Tris-HCl buffer (pH 8.4) was injected to cause luminescence, and the luminescence was integrated and measured for 0 to 5 seconds with a luminometer (Diatron, Luminous CT-9000D). By plotting against the concentration, a good concentration-dependent calibration curve shown in FIG. 2 was obtained. Using this calibration curve, it was possible to measure human prolactin in serum samples to a concentration of 0.1 ng / ml.

【００４４】［実施例３］同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるヒト絨毛性ゴナド
トロピンβ鎖（βｈＣＧ）の測定 兎抗ヒトｈＣＧポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したβｈＣＧ（標準物質）を０
〜２００ｍＩＵ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）５０μｌとペルオキシダーゼ酵
素標識マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ
／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐ
Ｈ7.4 ）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間イ
ンキュベートした。Example 3 Human chorionic gonado by simultaneous sandwich method CLEIA
Measurement of tropin β chain (βhCG) Purified βhCG (standard substance) was added to a white microplate on which a rabbit anti-human hCG polyclonal antibody was immobilized.
50 μl of a 2% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) containing about 200 μIU / ml and about 2 μg of a peroxidase enzyme-labeled mouse anti-βhCG monoclonal antibody
2% BSA-containing PBS solution (p / p
H7.4) and incubated at 37 ° C. for 1 hour.

【００４５】次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、
生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにｐ−ヨードフェ
ノールを１０^-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．４）１００μｌを加え、これに参考例
１で製造した化学発光試薬の１０００倍希釈液１００μ
ｌ及び０．００３４％過酸化水素を含む０．１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）５０μｌを注入して発光させ、
この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミ
ナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、
この値を標準物質濃度に対してプロットすることによ
り、図３に示される濃度依存性の良い検量線を得た。こ
の検量線を用いて血清検体中のβｈＣＧを０．１ｍＩＵ
／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。Next, after the solution in the well is removed by suction,
After washing with physiological saline, 100 μl of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing p-iodophenol at a concentration of 10 ⁻³ M was added to each well, and this was prepared in Reference Example 1. 100-fold dilution of chemiluminescent reagent at 100 μ
and 50 μl of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing 0.001% and 0.0034% hydrogen peroxide.
This luminescence amount was measured by integrating for 0 to 5 seconds with a luminometer (Luminous CT-9000D manufactured by Diatron),
By plotting this value against the concentration of the standard substance, a calibration curve with good concentration dependency shown in FIG. 3 was obtained. Using this calibration curve, βhCG in the serum sample was determined to be 0.1 mIU.
/ Ml could be measured.

【００４６】［比較例１］ルミノールを用いる同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによ
るα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定 兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を
０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）５０μｌとペルオキシダーゼ酵
素標識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μ
ｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液
（ｐＨ7.4 ）１００μｌとを加え、３７℃の濃度で１時
間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除
去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにｐ−
ヨードフェノールを１０^-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）１００μｌを加え、こ
れにルミノールを５．６×１０^-5Ｍの濃度で含有する
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）５０μｌを注入
して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤ
トロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積
算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロット
することにより、図４に示される濃度依存性を有する検
量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦ
Ｐを２．０ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能で
あったにすぎなかった。Comparative Example 1 The simultaneous sandwich method CLEIA using luminol
Measurement of α-fetoprotein (AFP) 2% BSA-containing PBS solution containing purified human AFP (standard substance) in a range of 0 to 800 ng / ml on a white microplate on which a rabbit anti-human AFP polyclonal antibody is immobilized. (PH 7.4) 50 μl and peroxidase enzyme-labeled mouse anti-human AFP monoclonal antibody
100 μl of a PBS solution (pH 7.4) containing 2% BSA containing a concentration of g / ml was added, and the mixture was incubated at a concentration of 37 ° C. for 1 hour. Next, the solution in the wells is removed by suction, washed with physiological saline, and p-well is added to each well.
0.1 M containing iodophenol at a concentration of 10 ^-3 M
100 μl of Tris-HCl buffer (pH 8.4) was added, and 50 μl of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing luminol at a concentration of 5.6 × 10 ⁻⁵ M was injected to emit light. This luminescence amount was measured by integrating for 0 to 5 seconds with a luminometer (Luminous CT-9000D manufactured by Diatron Co., Ltd.), and this value was plotted against the concentration of the standard substance to obtain the concentration dependency shown in FIG. A calibration curve was obtained. Using this calibration curve, human AF in serum samples
It was only possible to measure P to a concentration of 2.0 ng / ml.

【００４７】[0047]

【発明の効果】本発明の化学発光酵素免疫測定方法によ
れば、入手が容易であり、取り扱いも比較的に容易なペ
ルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、安価で入手
が容易であるルシゲニン等を出発原料とし、且つ容易に
製造できる新規化学発光試薬を用いる化学発光法により
測定対象物質である種々の抗原又は抗体類を免疫学的に
高感度に測定することができる。According to the chemiluminescent enzyme immunoassay of the present invention, a peroxidase enzyme which is easily available and relatively easy to handle is used as a labeling substance, and lucigenin and the like which are inexpensive and easily available are used as starting materials. Various antigens or antibodies to be measured can be measured with high sensitivity immunologically by a chemiluminescence method using a novel chemiluminescent reagent which can be easily produced as a raw material.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 実施例１記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。FIG. 1 is a calibration curve for measuring human αAFP prepared by plotting the amount of chemiluminescence chemiluminescent using the reaction system described in Example 1 as a function of the concentration of human αAFP (standard substance).

【図２】 実施例２記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトプロラクチン（標準物質）の濃度の
関数としてプロットして作成したヒトプロラクチン測定
用の検量線である。FIG. 2 is a calibration curve for measuring human prolactin prepared by plotting the amount of chemiluminescence chemiluminescent using the reaction system described in Example 2 as a function of the concentration of human prolactin (standard substance).

【図３】 実施例３記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をβｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数とし
てプロットして作成したβｈＣＧ測定用の検量線であ
る。FIG. 3 is a calibration curve for βhCG measurement prepared by plotting the amount of chemiluminescence chemiluminescent using the reaction system described in Example 3 as a function of the concentration of βhCG (standard substance).

【図４】 比較例１記載の反応系（ルミノールを使
用。）を用いて化学発光させた化学発光量をヒトαＡＦ
Ｐ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成し
たヒトαＡＦＰ測定用の検量線である。 −FIG. 4 shows the amount of chemiluminescence obtained by chemiluminescence using the reaction system (using luminol) described in Comparative Example 1 and human αAF.
It is a calibration curve for human αAFP measurement prepared by plotting as a function of the concentration of P (standard substance). −

【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成１０年７月１３日[Submission date] July 13, 1998

【手続補正１】[Procedure amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００２３[Correction target item name] 0023

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【００２３】[0023]

【化３】 で表すことができる。一般式（２）において、Ｒ_１は、
水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１
０のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基であ
り、アリール基はアルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基等で置換されていてもよい。Ｒ_２は、
メチル基又はエチル基てあり、Ｒ_３は、炭素数１〜１０
のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数
６〜２０のアリール基であり、アリール基はアルキル
基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基、アミノ基等で置換
されていてもよい。また、Ｒ_１及びＲ_３は互いに結合し
て、各々が結合しているカルボニル基の炭素原子及びア
ミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。Ｎ，
Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体例を例示する
と、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，
Ｎ−ジメチルプロピオンァミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベン
ズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン及びＮ−エチル
−２−ピロリドン等を挙げることができる。このＮ，Ｎ
−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、本発明の化学発光
試薬の製造には必須であり、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，
９’−ビスアクリジニウム塩類と複合体を形成した後、
アクリジニウム塩構造の還元反応に伴い、より発光収率
の高い化合物へと変化するものであり、本発明の化学発
光試薬の製造反応に反応成分として関与し、反応生成物
の水溶性の付与等に寄与しているものと推定される。従
って、その使用量はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類に対して１〜１０００当量、好まし
くは１．５〜５００当量、特に好ましくは２〜３００当
量の割合で採用される。Embedded image Can be represented by In the general formula (2), R ₁ is
Hydrogen atom, alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, 2 to 1 carbon atoms
0 is an alkenyl group, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, and the aryl group is an alkyl group, a halogen group, a nitro group,
It may be substituted with a hydroxyl group, an amino group or the like. R ₂ is
A methyl group or an ethyl group, and R ₃ has 1 to 10 carbon atoms.
An alkyl group, an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms, and an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, and the aryl group may be substituted with an alkyl group, a halogen group, a nitro group, a hydroxyl group, an amino group, or the like. Further, R ₁ and R ₃ may be bonded to each other to form a ring together with the carbon atom of the carbonyl group and the nitrogen atom of the amide group to which each is bonded. N,
Specific examples of the N-disubstituted carboxylic acid amide compound include N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N, N-dimethylacrylamide,
N-dimethylpropionamide, N, N-dimethylbenzamide , N-methyl-2-pyrrolidone and N-ethyl
-2-pyrrolidone and the like. This N, N
The di-substituted carboxylic acid amide compound is indispensable for the production of the chemiluminescent reagent of the present invention, and N, N′-disubstituted-9,
After forming a complex with 9'-bisacridinium salts,
Along with the reduction reaction of the acridinium salt structure, it changes to a compound having a higher luminescence yield, and is involved as a reaction component in the production reaction of the chemiluminescent reagent of the present invention, and for imparting water solubility of the reaction product. It is presumed to have contributed. Therefore, the amount used is 1 to 1000 equivalents, preferably 1.5 to 500 equivalents, and particularly preferably 2 to 300 equivalents to N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salts. Adopted in.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 佐藤 未央 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Toshifumi Katsuragi 1-9-4 Horinouchi, Adachi-ku, Tokyo Dainichi Seika Industry Co., Ltd. Technology Research Center (72) Inventor Mio Sato 1-chome Horinouchi, Adachi-ku, Tokyo 9-4 Dainichi Seika Kogyo Co., Ltd. Technology Research Center

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体
若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原若しくは抗体又
はそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペルオ
キシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体
を生成させた後、化学発光試薬として、Ｎ，Ｎ’−ジ置
換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ
置換カルボン酸アミド化合物の存在下において紫外線照
射下で還元剤と接触させることにより得られる化学発光
試薬を添加し、水素受容体の存在下において化学発光さ
せ、その発光量を測定することにより試料中の抗原又は
抗体の含有量を定量することを特徴とする化学発光酵素
免疫測定方法。1. An antibody or an antigen labeled with a peroxidase enzyme is mixed with an antigen or an antibody to be measured in a sample or an aggregate thereof to form an immune complex comprising a peroxidase enzyme-labeled-antigen-antibody complex by an antigen-antibody reaction. After that, as a chemiluminescent reagent, N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts are brought into contact with a reducing agent under ultraviolet irradiation in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound. Chemiluminescence characterized by adding a chemiluminescent reagent obtained by the reaction, causing chemiluminescence in the presence of a hydrogen acceptor, and quantifying the antigen or antibody content in the sample by measuring the amount of luminescence. Enzyme immunoassay. 【請求項２】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類が下記一般式（１） 【化１】 （上記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² は、アルキ
ル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群
より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよ
く、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、水素原子、アルキル
基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハ
ロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又
は異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎ
は１又は２である。）で表される化合物である請求項１
に記載の化学発光酵素免疫測定方法。2. The N, N′-disubstituted-9,9′-
Bisacridinium salts are represented by the following general formula (1): (In the above general formula (1), R ¹ and R ² are selected from the group consisting of an alkyl group, an aryl group and a halogenated aryl group, and may be the same or different from each other, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ And R ⁶ are selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, an alkoxy group, an aryloxy group, and a halogen atom, and may be the same or different from each other; X is an n-valent anion;
Is 1 or 2. 2) a compound represented by the formula:
4. The method for immunoassay of a chemiluminescent enzyme according to 4. 【請求項３】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類がＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’
−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１又
は２に記載の化学発光酵素免疫測定方法。3. The N, N′-disubstituted-9,9′-
Bisacridinium salts are N, N'-disubstituted-9,9 '
The chemiluminescent enzyme immunoassay according to claim 1 or 2, which is bisacridinium dinitrate. 【請求項４】 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミ
ド化合物がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアセトアミド及びＮ−メチル−２−ピロリドンか
らなる群より選択される少なくとも一種の化合物である
請求項１〜３のいずれかの請求項に記載の化学発光酵素
免疫測定方法。4. The N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound is at least one compound selected from the group consisting of N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methyl-2-pyrrolidone. The chemiluminescent enzyme immunoassay according to any one of claims 1 to 3. 【請求項５】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類を、前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換カル
ボン酸アミド化合物の存在下において前記還元剤と接触
させる際に、更に、蟻酸が添加されてなる請求項１〜４
のいずれかの請求項に記載の化学発光酵素免疫測定方
法。5. The N, N′-disubstituted-9,9′-
The formic acid is further added when the bisacridinium salt is brought into contact with the reducing agent in the presence of the N, N'-disubstituted carboxylic acid amide compound.
The chemiluminescent enzyme immunoassay according to any one of claims 1 to 4. 【請求項６】 前記還元剤が水素化リチウムアルミ
ニウムであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか
の請求項に記載の化学発光酵素免疫測定方法。6. The method according to claim 1, wherein the reducing agent is lithium aluminum hydride. 【請求項７】 前記水素受容体が過酸化水素である
請求項１〜６のいずれかの請求項に記載の化学発光酵素
免疫測定方法。7. The method according to claim 1, wherein the hydrogen acceptor is hydrogen peroxide. 【請求項８】 前記化学発光反応を行なう際に、発
光増強剤を更に、含有させてなる請求項１〜７のいずれ
かの請求項に記載の化学発光酵素免疫測定方法。8. The chemiluminescent enzyme immunoassay according to claim 1, further comprising a luminescence enhancer when performing the chemiluminescence reaction. 【請求項９】 前記発光増強剤がフェノール性化合
物である請求項８に記載の化学発光酵素免疫測定方法。9. The method according to claim 8, wherein the luminescence enhancer is a phenolic compound.