JPH11264819A - Sensor for detection of verotoxin in blood - Google Patents
Sensor for detection of verotoxin in bloodInfo
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- JPH11264819A JPH11264819A JP10067299A JP6729998A JPH11264819A JP H11264819 A JPH11264819 A JP H11264819A JP 10067299 A JP10067299 A JP 10067299A JP 6729998 A JP6729998 A JP 6729998A JP H11264819 A JPH11264819 A JP H11264819A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】抗原抗体反応に基づく表面プ
ラズモン共鳴バイオセンサー（ＳＰＲセンサー）用測定
チップを用いて、ベロ毒素に対する抗体を測定する方法
に関する。The present invention relates to a method for measuring an antibody against verotoxin using a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor (SPR sensor) based on an antigen-antibody reaction.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、病原性大腸菌Ｏ−１５７による食
中毒が流行し重篤な病状を呈しており、重大な問題とな
っている。Ｏ−１５７感染予防、検出のため食材、患者
の糞便を対象とした免疫検査、ＰＣＲによる遺伝子検査
用試薬キットが市販されている。この様なキットは免疫
検査では、大腸菌の表面タンパク、表面ペプチド、Ｏ抗
原、Ｈ抗原、ＰＣＲではベロ毒素ＶＴ１、ＶＴ２遺伝子
を検出するシステムがほとんどである。一方、Ｏ−１５
７感染症に関しては、近年急激に広まった病気であり、
病態、治療法とも確定されておらず、患者のベッドサイ
ドモニタリングは、治療において非常に重要である。こ
の場合の検査対象は、病理機構より血中ベロ毒素、ＶＴ
１、ＶＴ２である。しかし、市販の簡易検出試薬キット
には、ベロ毒素自身を検出物質としたものがほとんどな
く、また、簡易キット自身の検出操作がＥＩＡでは定量
性はあるが、操作が煩雑、イムノクロマト法では操作は
簡便であるが、定量性に乏しいという問題がある。ま
た、数少ないベロ毒素検出キットとしては、ラテックス
凝集法があるが感度が低い等の問題がある。2. Description of the Related Art In recent years, food poisoning due to pathogenic Escherichia coli O-157 has become epidemic and has presented a serious medical condition, which has become a serious problem. Reagent kits for genetic testing by PCR and immunoassays for foods and feces of patients for prevention and detection of O-157 infection are commercially available. Most of such kits detect a surface protein, a surface peptide, an O antigen, an H antigen of Escherichia coli in an immunoassay, and a system for detecting the Vero toxin VT1 and VT2 genes in PCR. On the other hand, O-15
About 7 infectious diseases, it is disease which spread rapidly in recent years,
Neither the condition nor the treatment method has been determined, and bedside monitoring of patients is very important in treatment. In this case, the test target is blood toxin, VT according to the pathological mechanism.
1, VT2. However, there are few commercially available simple detection reagent kits that use verotoxin itself as a detection substance, and the detection operation of the simple kit itself is quantitative with EIA, but the operation is complicated, and the operation is difficult with immunochromatography. Although simple, there is a problem of poor quantitativeness. In addition, there is a latex agglutination method as a rare kit for detecting a toxin, but there is a problem such as low sensitivity.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、Ｏ−
１５７感染症のベッドサイト・モニタリングに適した検
出システムの開発を課題とする。The object of the present invention is to provide an O-
The objective is to develop a detection system suitable for bed site monitoring of 157 infection.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者は、血中ベロ毒素ＶＴ１、ＶＴ２を非
標識で簡便な検出システムである表面プラズモン共鳴バ
イオセンサー（ＳＰＲセンサー）で検出することが極め
て有効であることを見出した。すなわち、本発明は、
（１）透明基板、該透明基板上に配置される金属膜及び
該金属膜上に固定されるベロ毒素に対する抗体を備えて
いることを特徴とする表面プラズモン共鳴バイオセンサ
ー用測定チップ、（２）ベロ毒素に対する抗体がＯ−１
５７由来のＶＴ１、ＶＴ２に対する抗体である（１）記
載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ、
（３）ベロ毒素に対する抗体が、疎水結合あるいは静電
結合により金属膜上に固定されることを特徴とする
（１）記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定
チップ、（４）前記疎水結合あるいは静電結合が有機ケ
イ素膜を形成することを特徴とする（３）に記載の表面
プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ、（５）前
記有機ケイ素膜がシランカップリング剤により形成され
た膜であることを特徴とする、（４）に記載の表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ、（６）透明基
板上に配置される金属が金であることを特徴とする
（１）記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定
チップ、（７）疎水結合による膜が金属とフッ素の化合
物又は金属とフッ素の混合物を主成分とすることを特徴
とする（３）記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー
用測定チップ、（８）前記金属が金であることを特徴と
する（７）記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用
測定チップ、（９）疎水結合による膜が金属と炭素の化
合物又は金属と炭素の混合物を主成分とすることを特徴
とする（３）記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー
用測定チップ、（１０）前記金属が金であることを特徴
とする（９）記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー
用測定チップ、（１１）疎水結合による膜がフッ素系ガ
スを含むプラズマに曝すことにより形成されることを特
徴とする（３）記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサ
ー用測定チップ、（１２）疎水結合による膜が炭素を含
むプラズマに曝すことにより形成されることを特徴とす
る（３）記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップ、（１３）疎水結合による膜がシロキサンを主
成分とすることを特徴とする（３）記載の表面プラズモ
ン共鳴バイオセンサー用測定チップ、（１４）疎水結合
による膜がフッ素含有有機化合物を主成分とすることを
特徴とする（３）記載の表面プラズモン共鳴バイオセン
サー用測定チップ、（１５）疎水結合あるいは静電結合
による膜がチオールであることを特徴とする（３）記載
の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ、
（１６）前記チオール膜がアルカンチオールによって形
成された膜であることを特徴とする（１５）記載の表面
プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ、（１７）
透明基板上に金属膜を配置した後、該金属膜の上に疎水
結合または静電結合により膜を形成し、次いで該膜上に
ベロ毒素に対する抗体を配置することを特徴とする、表
面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方
法に関する。表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定
チップは、図２に示すような構造を有する。即ち、ガラ
ス基板１’上に成膜された金属膜２’の上に、多孔性材
料５が形成されており、この多孔性材料５の表面及び内
部に酵素、抗体等の生理活性物質が坦持又は固定されて
いる。この多孔性材料５としては、例えば合成繊維、天
然繊維、無機繊維等からなる織物、編物、不織布や、多
孔性の無機又は有機材料などが使用される（特開平３−
１６４１９５号公報参照）。また、市販品（BIAcore 20
00用、ファルマシアバイオセンサー社製）では、この多
孔性材料５としてカルボキシメチルデキストランが用い
られている。Means for Solving the Problems In view of the above problems, as a result of intensive studies, the present inventors have developed a surface plasmon resonance biosensor (SPR sensor) which is a simple, unlabeled and simple detection system for blood verotoxins VT1 and VT2. It has been found that detection is extremely effective. That is, the present invention
(1) a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor, comprising: a transparent substrate; a metal film disposed on the transparent substrate; and an antibody against verotoxin fixed on the metal film. Antibody against Vero toxin is O-1
The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to (1), which is an antibody against VT1 and VT2 derived from 57.
(3) The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to (1), wherein the antibody against Vero toxin is immobilized on a metal film by a hydrophobic bond or an electrostatic bond, (4) the hydrophobic bond or the static bond. (3) The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to (3), wherein the electrobonding forms an organosilicon film, and (5) the organosilicon film is a film formed by a silane coupling agent. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to (4), wherein the metal disposed on the transparent substrate is gold, wherein the metal is gold. (7) The surface chip according to (3), wherein the film formed by the hydrophobic bond mainly contains a compound of metal and fluorine or a mixture of metal and fluorine. A measurement chip for a plasmon resonance biosensor; (8) the measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to (7), wherein the metal is gold; (3) The surface plasmon resonance biosensor measurement chip according to (3), wherein the mixture is mainly composed of a mixture of metal and carbon. (10) The surface plasmon according to (9), wherein the metal is gold. A measurement chip for a resonance biosensor, (11) a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to (3), wherein the membrane by hydrophobic bonding is formed by exposing to a plasma containing a fluorine-based gas; The surface plasmon resonance biocell according to (3), wherein the film by hydrophobic bonding is formed by exposing to a plasma containing carbon. (13) a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to (3), wherein the film by the hydrophobic bond is mainly composed of siloxane; and (14) a film containing a fluorine-containing organic compound by the hydrophobic bond. (3) The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to (3), wherein (15) the membrane by hydrophobic bonding or electrostatic bonding is thiol. Measurement chip for plasmon resonance biosensor,
(16) The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to (15), wherein the thiol film is a film formed of alkanethiol, (17).
After arranging a metal film on a transparent substrate, forming a film on the metal film by hydrophobic bonding or electrostatic bonding, and then arranging an antibody against verotoxin on the film, surface plasmon resonance The present invention relates to a method for manufacturing a measurement chip for a biosensor. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor has a structure as shown in FIG. That is, a porous material 5 is formed on a metal film 2 ′ formed on a glass substrate 1 ′, and a physiologically active substance such as an enzyme or an antibody is carried on the surface and inside of the porous material 5. Held or fixed. As the porous material 5, for example, a woven fabric, a knitted fabric, a nonwoven fabric made of synthetic fiber, natural fiber, inorganic fiber, or the like, a porous inorganic or organic material, and the like are used (Japanese Patent Laid-Open No. Hei.
164195). In addition, commercial products (BIAcore 20
(Pharmacia Biosensor Co. for 00) uses carboxymethyl dextran as the porous material 5.
【０００５】しかしながら、測定対象物と実質的にかつ
効率的に相互作用する生理活性物質は、多孔性材料５の
表面に存在するだけであるため、多孔性材料５の内部に
坦持又は固定されている生理活性物質は有効に機能せ
ず、その分感度が低下することとなる。また、生理活性
物質を金属膜に固定する方法としては、ＬＢ（Langmuir
-Blodgett）法が用いられる場合もあるが（特開平５ー
２８８６７２号公報参照）、ＬＢ膜と金属膜との結合が
弱く、ＬＢ膜が生理活性物質と共に脱落するという問題
がある。更に、従来の金属表面に反応性単分子膜を介し
てタンパク質を反応固定する方法では、一端に反応性基
を有し他端に金属表面上の酸化膜と反応し吸着される活
性基を有する有機分子を用いて、金属表面に化学吸着法
により反応性単分子膜を形成した後、前記反応性基を化
学処理して-OH基を付加し、更にシアノブロマイド法や
アルデヒド法を用いて、単分子膜表面をタンパク質のア
ミノ基と反応する官能基にタンパクのアミノ基を反応さ
せて固定することを構成要件としているので、タンパク
質を固定するための試薬が必要であり、その為に工程数
が増え、反応に要する時間が多くかかるという欠点を有
していた。However, since the physiologically active substance that substantially and efficiently interacts with the object to be measured only exists on the surface of the porous material 5, it is carried or fixed inside the porous material 5. The physiologically active substance does not function effectively, and the sensitivity is reduced accordingly. As a method of fixing a physiologically active substance to a metal film, LB (Langmuir
(Blodgett) method may be used (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-288672), but there is a problem that the bond between the LB film and the metal film is weak and the LB film falls off together with the physiologically active substance. Furthermore, in the conventional method of immobilizing a protein on a metal surface via a reactive monolayer, a reactive group is provided at one end and an active group which reacts with and is adsorbed to an oxide film on the metal surface at the other end. Using an organic molecule, after forming a reactive monomolecular film on the metal surface by a chemisorption method, chemically treating the reactive group to add an -OH group, and further using a cyanobromide method or an aldehyde method, The component requirement is to react the amino group of the protein with the functional group that reacts with the amino group of the protein on the surface of the monomolecular film, so that a reagent for immobilizing the protein is required, and therefore the number of steps And the reaction takes a long time.
【０００６】そこで、本発明では、化学結合（共有結
合）に代えて疎水結合或いは静電結合を起こさせること
により、この欠点を解消させた。疎水結合を起こさせる
場合は、疎水表面を最外層に有する必要があるので、飽
和アルキル鎖末端あるいはフッ素原子を含む金化合物ま
たは金とフッ素の混合物を用いる。疎水結合において、
フッ素原子を含む金化合物または金とフッ素の混合物を
形成するためには、従来の薄膜形成技術である、スパッ
タ法、真空蒸着法、イオンプレーティング法、ＣＶＤ
法、プラズマ重合法、ドライエッチング法、スピンコー
ティング法等が利用できる。疎水結合の固定化手順を図
８に示す。Therefore, in the present invention, this disadvantage has been solved by causing a hydrophobic bond or an electrostatic bond instead of a chemical bond (covalent bond). In the case of causing hydrophobic bonding, it is necessary to have a hydrophobic surface in the outermost layer. Therefore, a saturated alkyl chain terminal or a gold compound containing a fluorine atom or a mixture of gold and fluorine is used. In the hydrophobic bond,
In order to form a gold compound containing a fluorine atom or a mixture of gold and fluorine, conventional thin film forming techniques such as sputtering, vacuum deposition, ion plating, and CVD are used.
Method, plasma polymerization method, dry etching method, spin coating method and the like can be used. FIG. 8 shows the procedure for immobilizing hydrophobic bonds.
【０００７】スパッタ法によってフッ素原子を含む金化
合物または金とフッ素の混合物を主成分とする薄膜を得
るためには、金又は表面をフッ素化させた金を主体とす
るターゲットを用い、アルゴン、ネオン、キセノン、ヘ
リウム、窒素等のスパッターガス単独又はこれらのスパ
ッターガスとフッ素、四フッ化炭素、六フッ化硫黄、三
フッ化窒素、三フッ化塩素等のフッ素源となるガスとを
組み合わせた雰囲気中で、直流又は高周波放電によりス
パッター成膜する。このとき、必要に応じて酸素、窒
素、炭酸ガス等の酸素源、窒素源、炭素源となるガスを
混合することもできる。ここで、雰囲気ガスの組成、圧
力、スパッター電力等の成膜条件を変えることにより、
膜の組成、組織、構造等を変え、疎水性、屈折率、消衰
係数を調整することができる。真空蒸着法によってフッ
素原子を含む金化合物または金とフッ素の混合物を主成
分とする薄膜を得るためには、タングステン製バスケッ
ト、タングステンメッキされたコイルまたはボート、カ
ーボンるつぼ等による抵抗加熱法、又は、電子線照射に
よるいわゆるＥＢ蒸着法により、金、又は予めフッ素化
させた金を蒸着源として用いる。In order to obtain a thin film mainly containing a gold compound containing a fluorine atom or a mixture of gold and fluorine by a sputtering method, a target mainly composed of gold or a surface-fluorinated gold is used. , Xenon, helium, nitrogen or other sputter gas alone or an atmosphere combining these sputter gases with a fluorine source gas such as fluorine, carbon tetrafluoride, sulfur hexafluoride, nitrogen trifluoride or chlorine trifluoride Inside, a sputter film is formed by direct current or high frequency discharge. At this time, if necessary, a gas serving as an oxygen source such as oxygen, nitrogen, or carbon dioxide, a nitrogen source, or a carbon source can be mixed. Here, by changing the film forming conditions such as the composition of the atmosphere gas, the pressure, and the sputtering power,
The hydrophobicity, refractive index, and extinction coefficient can be adjusted by changing the composition, structure, structure, and the like of the film. In order to obtain a thin film mainly containing a gold compound containing fluorine atoms or a mixture of gold and fluorine by a vacuum evaporation method, a tungsten basket, a tungsten-plated coil or boat, a resistance heating method using a carbon crucible, or the like, or Gold or pre-fluorinated gold is used as an evaporation source by a so-called EB evaporation method using electron beam irradiation.
【０００８】この際、フッ素、四フッ化炭素及びその他
のフッ化炭素化合物、六フッ化硫黄及びその他のフッ化
硫黄化合物、三フッ化窒素、三フッ化塩素等のフッ素源
となるガスと、必要に応じて、酸素、窒素、炭酸ガス等
の酸素源、窒素源、炭素源となるガスとの混合ガスを雰
囲気とすることができる。この場合も、蒸着条件を変え
ることにより、膜の組成、組織、構造等を変え、疎水
性、屈折率、消衰係数を調整することができる。さら
に、イオンプレーティング法によって、フッ素原子を含
む金化合物または金とフッ素の混合物を主成分とする薄
膜を得るためには、金、又は予めフッ素化させた金を蒸
着源として用い、フッ素、四フッ化炭素、六フッ化硫
黄、三フッ化窒素、三フッ化塩素等のフッ素源となるガ
スと、必要に応じて、酸素、窒素、炭酸ガス等の酸素
源、窒素源、炭素源となるガスとの混合ガスを雰囲気と
すればよい。この場合も、成膜条件により、疎水性、屈
折率、消衰係数を調整することができる。At this time, a fluorine source gas such as fluorine, carbon tetrafluoride and other carbon fluoride compounds, sulfur hexafluoride and other sulfur fluoride compounds, nitrogen trifluoride and chlorine trifluoride, If necessary, a mixed gas with an oxygen source such as oxygen, nitrogen, or carbon dioxide, a nitrogen source, or a gas serving as a carbon source can be used as the atmosphere. Also in this case, by changing the deposition conditions, the film composition, structure, structure, and the like can be changed, and the hydrophobicity, refractive index, and extinction coefficient can be adjusted. Further, in order to obtain a thin film containing a gold compound containing a fluorine atom or a mixture of gold and fluorine as a main component by an ion plating method, gold or gold which has been fluorinated in advance is used as a deposition source. Fluorine source gas such as carbon fluoride, sulfur hexafluoride, nitrogen trifluoride, chlorine trifluoride, etc. and, if necessary, oxygen source such as oxygen, nitrogen, carbon dioxide gas, nitrogen source, carbon source The atmosphere may be a gas mixture with a gas. Also in this case, the hydrophobicity, the refractive index, and the extinction coefficient can be adjusted depending on the film forming conditions.
【０００９】ＣＶＤ法としては、金表面にシロキサン膜
を主成分とする薄膜を形成するために、ヘキサメチレン
ジシロキサン（ＨＭＤＳＯ）等のシロキサンモノマーを
アルゴン等のキャリアーガスで導入し、酸素等の雰囲気
中で化学気相成長（ＣＶＤ）法で成膜する。必要に応じ
て、フッ素含有シロキサンモノマーや四フッ化炭素等の
フッ素源となるガスを混合することもできるし、また、
シロキサンモノマーを入れずに、フッ素源ガス等を用い
てフッ素化合物（プラズマ重合膜）を形成することもで
きる。ここで、雰囲気ガスの組成、圧力、電力等の成膜
条件を変えることにより、膜の組成、組織、構造等を変
え、疎水性等を調整することができる。スピンコーティ
ング法としては、例えばアモルファスフッ素樹脂である
「サイトップ（アサヒガラス製）」を金属膜上に塗布す
ることにより、ＳＰＲ基板として供することができる。In the CVD method, a siloxane monomer such as hexamethylenedisiloxane (HMDSO) is introduced with a carrier gas such as argon to form a thin film mainly composed of a siloxane film on a gold surface, and an atmosphere such as oxygen is introduced. The film is formed by a chemical vapor deposition (CVD) method in the inside. If necessary, a fluorine source gas such as a fluorine-containing siloxane monomer or carbon tetrafluoride can be mixed, or
A fluorine compound (plasma polymerized film) can also be formed using a fluorine source gas or the like without adding a siloxane monomer. Here, by changing the film formation conditions such as the composition, pressure, and power of the atmosphere gas, the composition, structure, structure, and the like of the film can be changed, and the hydrophobicity and the like can be adjusted. As a spin coating method, for example, an amorphous fluororesin “CYTOP (made by Asahi Glass)” is applied on a metal film to provide an SPR substrate.
【００１０】上記の説明は、フッ素原子を含む金化合物
または金とフッ素の混合物を対象に行ったが、フッ素の
代わりに炭素を用いても同様である。一方、疎水結合の
一つとして、有機ケイ素膜を、シランカップリング剤を
用いて、シランカップリング剤中の加水分解基を、金属
膜２中の金属原子と結合させ、末端は生理活性物質と物
理吸着による結合を生ぜしめる方法がある。これにより
金属膜２、有機ケイ素膜３及び生理活性物質の三者は固
定化される。有機ケイ素膜３とは、Ｓｉ−Ｏ及びＳｉ−
Ｃ結合を分子内に含む高分子からなる膜をいう。Although the above description has been directed to a gold compound containing a fluorine atom or a mixture of gold and fluorine, the same applies when carbon is used instead of fluorine. On the other hand, as one of the hydrophobic bonds, an organic silicon film is bonded to a metal atom in the metal film 2 by using a silane coupling agent to bond a hydrolyzable group in the silane coupling agent to a terminal, and a terminal is formed by a physiologically active substance. There is a method of generating a bond by physical adsorption. Thereby, the metal film 2, the organic silicon film 3, and the physiologically active substance are fixed. The organic silicon film 3 includes Si—O and Si—
Refers to a film made of a polymer containing a C bond in the molecule.
【００１１】シランカップリング剤とは、その分子中に
ビニル基、エポキシ基、アミノ基、メルカプト基のよう
な有機材料と親和性のある有機官能基と、メトキシ基、
エトキシ基のような無機材料と親和性のある加水分解基
を有する有機ケイ素化合物のことをいう。本発明に使用
できるシランカップリング剤は、上記定義に該当するも
のであればいかなるものでもよく、構造式ＣＦ3（Ｃ
Ｈ2）ｎＳｉ（ＯＣＨ3）3のトリフルオロメチルトリメ
トキシシラン、２、２、２ートリフルオロメチルトリメ
トキシシラン、３、３、３ートリフルオロプロピルトリ
メトキシシラン、４、４、４ートリフルオロブチルトリ
メトキシシラン、８、８、８ートリフルオロオクチルト
リメトキシシラン、１８、１８、１８−トリフルオロオ
クタデシルトリメトキシシラン等、構造式ＣＦ3（Ｃ
Ｈ2）ｎＳｉ（ＯＣＨ2ＣＨ3）3 のトリフルオロメチル
トリエトキシシラン、４、４、４−トリフルオロブチル
トリエトキシシラン、アミノプロピルジエトキシメチル
シラン、１８、１８、１８−トリフルオロオクタデシル
トリエトキシシラン等、構造式ＣＨ3（ＣＨ2）ｎＳｉ
（ＯＣＨ3）3 のメチルトリメトキシシラン、エチルト
リメトキシシラン、プロピルルトリメトキシシラン、オ
クタデシルトリメトキシシラン等、構造式ＣＨ3（Ｃ
Ｈ2）ｎＳｉ（ＯＣＨ2ＣＨ3）3のメチルトリエトキシシ
ラン、ペンチルトリエトキシシラン、オクタデシルトリ
メトキシシラン等を単独又は組み合わせて使用すること
ができる。なお、上記構造式のｎはいずれも０〜１７の
整数である。The silane coupling agent includes an organic functional group having an affinity for an organic material such as a vinyl group, an epoxy group, an amino group and a mercapto group, a methoxy group,
It refers to an organosilicon compound having a hydrolyzable group having an affinity for an inorganic material such as an ethoxy group. The silane coupling agent that can be used in the present invention may be any silane coupling agent as long as it satisfies the above definition, and has a structural formula of CF 3 (C
H 2 ) nSi (OCH 3 ) 3 trifluoromethyltrimethoxysilane, 2,2,2-trifluoromethyltrimethoxysilane, 3,3,3-trifluoropropyltrimethoxysilane, 4,4,4-trimethylsilane A structural formula CF 3 (C, such as fluorobutyltrimethoxysilane, 8,8,8-trifluorooctyltrimethoxysilane, 18,18,18-trifluorooctadecyltrimethoxysilane, etc.
H 2) nSi (OCH 2 CH 3) 3 trifluoromethyl triethoxy silane, 4,4,4-trifluoro-butyl triethoxysilane, aminopropyl diethoxymethyl silane, 18,18,18- trifluoroacetic octadecyltriethoxysilane Silane, structural formula CH 3 (CH 2 ) nSi
(OCH 3) 3 of methyltrimethoxysilane, ethyltrimethoxysilane, propyl Le trimethoxysilane, octadecyl trimethoxysilane, structural formula CH 3 (C
H 2) nSi (OCH 2 CH 3) 3 of methyltriethoxysilane, pen triethoxysilane can be used alone or in combination octadecyl trimethoxysilane. Note that n in the above structural formulas is an integer of 0 to 17.
【００１２】次に、静電結合については、物理吸着法と
して金表面に生理活性物質を固定化するために、両者の
間に硫黄化合物を用いることが可能であり、一般に硫黄
化合物の中でも、操作性、緻密性、安定性などに鑑み、
チオール、中でもアルカンチオールが本発明の場合、特
に適している。なお、チオール化合物の場合疎水結合も
可能である。アルカンチオールとは、直鎖アルキル鎖
の、一方の末端にメチル基、アミノ基、メルカプト基、
トリフルオロ基のような有機材料と親和性のある有機官
能基と、他方の末端にＳＨ基を有する有機硫黄化合物の
ことをいう。アルカンチオールとしては、疎水結合の場
合、1-プロパンチオール、1-ブタンチオール、1-ヘキサ
デカンチオール等ＣＨ3（ＣＨ2）ｎＳＨ（ｎ=1〜15）の
構造式を有するものである。また、静電結合の場合、メ
ルカプト酢酸、3-メルカプトプロピオン酸等ＨＯＯＣ
（ＣＨ2）ｎＳＨ（ｎ=1〜15）や、アミノエタンチオー
ル等 Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）ｎＳＨ（n=1〜15）が挙げられ
る。Next, in the case of electrostatic bonding, it is possible to use a sulfur compound between the two in order to immobilize a physiologically active substance on the gold surface as a physical adsorption method. In consideration of properties, denseness, stability, etc.,
Thiols, especially alkanethiols, are particularly suitable for the present invention. In the case of a thiol compound, a hydrophobic bond is also possible. Alkanethiol is a straight-chain alkyl chain with a methyl group, amino group, mercapto group,
An organic sulfur compound having an organic functional group having an affinity for an organic material such as a trifluoro group and an SH group at the other end. The alkanethiol has a structural formula of CH 3 (CH 2 ) nSH (n = 1 to 15) such as 1-propanethiol, 1-butanethiol, 1-hexadecanethiol in the case of a hydrophobic bond. In the case of electrostatic coupling, HOOC such as mercaptoacetic acid, 3-mercaptopropionic acid, etc.
(CH 2) nSH (n = 1~15) and aminoethanethiol etc. H 2 N (CH 2) nSH (n = 1~15) , and the like.
【００１３】ｐＨをアルカリ側に傾けることにより、末
端カルボキシル基がアニオンリッチとなり、これが生理
活性物質のプラス荷電を有する官能基（例えばリジン残
基中のアミノ基）と静電結合を形成する。また、ｐＨを
酸性側に傾けることにより、カチオンリッチとなり、こ
れが生理活性物質のマイナス荷電を有する官能基（例え
ばアスパラギン酸残基中のカルボキシル基）と静電結合
を形成する。なお、静電結合による有機ケイ素膜の形成
も可能である。例えば、シランカップリング剤として、
構造式Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）ｎＳｉ（ＯＣＨ3）3 のアミノメ
チルトリメトキシシラン、２ーアミノエチルトリメトキ
シシラン、３ーアミノプロピルトリメトキシシラン、４
ーアミノブチルトリメトキシシラン、８ーアミノオクチ
ルトリメトキシシラン、１８ーアミノオクタデシルトリ
メトキシシラン等、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）ｎＳｉ（ＯＣ2Ｈ5）
3 のアミノメチルトリエトキシシラン、２ーアミノエチ
ルトリエトキシシラン、３ーアミノプロピルトリエトキ
シシラン、５ーアミノペンチルトリエトキシシラン、８
ーアミノオクチルトリメトキシシラン、１８ーアミノオ
クタデシルトリメトキシシラン等を用いることにより、
ｐＨを酸性側に傾け、末端のアミノ基がカチオンリッチ
となる。これに対して、マイナス荷電を有する官能基
（カルボキシル基、スルフォニル基等）と４級化アミノ
基が静電結合を形成する。なお、上記構造式のｎはいず
れも０〜１７の整数である。By tilting the pH toward the alkali side, the terminal carboxyl group becomes anion-rich, and this forms an electrostatic bond with a positively charged functional group (eg, an amino group in a lysine residue) of the physiologically active substance. In addition, by inclining the pH to the acidic side, it becomes cation-rich, and this forms an electrostatic bond with a negatively charged functional group (for example, a carboxyl group in an aspartic acid residue) of the physiologically active substance. It is also possible to form an organic silicon film by electrostatic coupling. For example, as a silane coupling agent,
Aminomethyltrimethoxysilane of structural formula H 2 N (CH 2 ) nSi (OCH 3 ) 3 , 2-aminoethyltrimethoxysilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane, 4
-Aminobutyltrimethoxysilane, 8-aminooctyltrimethoxysilane, 18-aminooctadecyltrimethoxysilane, etc., H 2 N (CH 2 ) nSi (OC 2 H 5 )
3 , aminoaminotriethoxysilane, 2-aminoethyltriethoxysilane, 3-aminopropyltriethoxysilane, 5-aminopentyltriethoxysilane, 8
-Aminooctyltrimethoxysilane, 18-aminooctadecyltrimethoxysilane, etc.
By tilting the pH to the acidic side, the terminal amino group becomes cation-rich. On the other hand, a functional group having a negative charge (such as a carboxyl group or a sulfonyl group) and a quaternary amino group form an electrostatic bond. Note that n in the above structural formulas is an integer of 0 to 17.
【００１４】静電結合の固定化手順を図９に示す。以
下、本発明を詳細に説明する。本発明において用いる表
面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ（以下、
単に「測定チップ」という）とは、表面プラズモン共鳴
バイオセンサーに使用されるチップであって、該センサ
ーより照射された光を透過及び反射する部分、並びにベ
ロ毒素に対する抗体及びそれを固定化する部分とを含む
部材をいい、該センサーの本体に固着されるものであっ
てもよく、また脱着可能なものであってもよい。FIG. 9 shows a procedure for fixing the electrostatic coupling. Hereinafter, the present invention will be described in detail. Measurement chip for surface plasmon resonance biosensor used in the present invention (hereinafter, referred to as
A "measurement chip" is a chip used for a surface plasmon resonance biosensor, which transmits and reflects light emitted from the sensor, and an antibody against verotoxin and a portion for immobilizing the antibody. And may be fixed to the main body of the sensor, or may be removable.
【００１５】本発明で用いる測定チップは、透明基板、
該透明基板上に配置される金属膜、該金属膜上に配置さ
れる疎水結合又は静電結合した膜、及び該膜上に配置さ
れるベロ毒素に対する抗体を備えている。ここで、「透
明基板上に配置される金属膜」とは、金属膜が直接接し
て透明基板上に配置されている場合のほか、金属膜が透
明基板に直接接することなく、他の層を介して配置され
ている場合をも含む意である。「金属膜上に配置される
疎水結合又は静電結合した膜」及び「該膜上に配置され
るベロ毒素に対する抗体」も上記と同様の意味である。
本発明の一例による測定チップの断面概略図を、有機ケ
イ素膜を形成する方法を例として図１に示す。The measuring chip used in the present invention is a transparent substrate,
It comprises a metal film disposed on the transparent substrate, a hydrophobic or electrostatically bonded film disposed on the metal film, and an antibody against verotoxin disposed on the film. Here, the `` metal film disposed on the transparent substrate '' refers to not only the case where the metal film is directly in contact with the transparent substrate but also the other layer without the metal film directly contacting the transparent substrate. It is intended to include the case where they are arranged through the intermediary. The terms "hydrophobically or electrostatically bonded membrane disposed on a metal membrane" and "antibody to verotoxin disposed on the membrane" have the same meaning as described above.
FIG. 1 is a schematic cross-sectional view of a measurement chip according to an example of the present invention, taking a method for forming an organosilicon film as an example.
【００１６】本実施例により用いられる測定チップは、
透明基板１と、透明基板１上に形成された金属膜２と、
金属膜２の上に形成された有機ケイ素膜３と、有機ケイ
素膜３の表面に固定化されたベロ毒素に対する抗体とを
有する。透明基板１としては、通常表面プラズモン共鳴
バイオセンサー用の測定チップに使用されるものであれ
ばどのようなものでもよく、一般的にはガラス、ポリエ
チレンテレフタレート、ポリカーボネートなどのレーザ
ー光等に対して透明な材料からなるものが使用でき、偏
光に対して異方性を示さず、かつ加工性の優れた材料が
望ましく、その厚さは0.1 〜20mm程度である。金属膜２
としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなもので
あれば特に限定されない。この金属膜２に使用すること
のできる金属の種類としては、金、銀、銅、アルミニウ
ム、白金等が挙げられ、それらを単独で又は組み合わせ
て使用することができる。また、上記透明基板１への付
着性を考慮して、透明基板１と金、銀等からなる層との
間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。The measuring chip used in this embodiment is:
A transparent substrate 1, a metal film 2 formed on the transparent substrate 1,
An organic silicon film 3 formed on the metal film 2 and an antibody against verotoxin immobilized on the surface of the organic silicon film 3 are provided. The transparent substrate 1 may be any substrate as long as it is generally used for a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor, and is generally transparent to laser light such as glass, polyethylene terephthalate, and polycarbonate. It is desirable to use a material which does not show anisotropy with respect to polarized light and has excellent workability, and has a thickness of about 0.1 to 20 mm. Metal film 2
Is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur. Examples of the types of metals that can be used for the metal film 2 include gold, silver, copper, aluminum, platinum, and the like, and these can be used alone or in combination. In addition, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the transparent substrate 1 and a layer made of gold, silver, or the like in consideration of the adhesion to the transparent substrate 1.
【００１７】金属膜２の膜厚は、100 〜2000Åであるの
が好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。30
00Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出
することができない。また、クロム等からなる介在層を
設ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが
好ましい。金属膜２の形成は常法によって行えばよく、
例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング
法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うこと
ができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いるの
が好ましい。有機ケイ素膜３は、ケイ素原子が上下方向
に重ならない単分子層膜であることが好ましい。単分子
層膜にすることにより、生理活性物質と相互作用する測
定対象物と、入射した光が反射する面との距離を短くす
ることができ、良好な感度が得られるとともに、使用す
るシランカップリング剤の量を必要最小限に抑え、コス
トの低減化を図ることができる。The thickness of the metal film 2 is preferably from 100 to 2000 °, more preferably from 200 to 600 °. 30
If it exceeds 00 °, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. When an intervening layer made of chromium or the like is provided, the thickness of the intervening layer is preferably 5 to 50 °. The formation of the metal film 2 may be performed by an ordinary method.
For example, it can be performed by a sputtering method, an evaporation method, an ion plating method, an electroplating method, an electroless plating method, or the like. Among these methods, it is preferable to use the sputtering method. The organic silicon film 3 is preferably a monolayer film in which silicon atoms do not overlap in the vertical direction. By forming a monolayer film, the distance between the measurement target that interacts with the physiologically active substance and the surface from which the incident light is reflected can be shortened, and good sensitivity can be obtained. The amount of the ring agent can be minimized, and the cost can be reduced.
【００１８】また、有機ケイ素膜３は、最密充填構造を
とるのが好ましい。最密充填構造とは、有機ケイ素膜３
を構成するＳｉ及びＯの網目構造中に他の分子が貫入す
る余地のないほど、網目構造が緻密であることをいう。
最密充填構造をとることにより、生理活性物質を高い密
度で均等に固定することができ、測定感度を向上させる
ことができる。有機ケイ素膜３が最密充填構造をとるか
どうかは、以下の方法により確認することができる。プ
ロピルエトキシシラン（シランカップリング剤である３
−アミノプロピルトリエトキシシランのアミノ基を水素
原子で置換した化合物）を用いて金属膜２上に有機ケイ
素膜３を形成させる。プロピルエトキシシランは、強い
疎水性を有する化合物なので、有機ケイ素膜２の表面の
濡れ程度により、プロピルエトキシシランの密度（即
ち、有機ケイ素膜３の細密充填の程度）を知ることがで
きる。即ち、シリンジにより蒸留水を滴下した際に表面
が一様に水滴を弾くのであれば有機ケイ素膜３は細密充
填構造をとっており、表面が部分的にしか水を弾かない
のであれば、細密充填構造をとっておらず、Ｓｉ及びＯ
の網目構造に空隙が存在することが推測される。The organic silicon film 3 preferably has a close-packed structure. The close-packed structure refers to the organic silicon film 3
Means that the network structure is so dense that there is no room for other molecules to penetrate into the network structure of Si and O.
By adopting the close-packed structure, the physiologically active substance can be uniformly fixed at a high density, and the measurement sensitivity can be improved. Whether or not the organic silicon film 3 has a close-packed structure can be confirmed by the following method. Propylethoxysilane (silane coupling agent 3
(A compound in which the amino group of aminopropyltriethoxysilane is substituted with a hydrogen atom) to form the organosilicon film 3 on the metal film 2. Since propylethoxysilane is a compound having strong hydrophobicity, the density of propylethoxysilane (that is, the degree of close packing of the organic silicon film 3) can be known from the degree of wetting of the surface of the organic silicon film 2. That is, if the surface repels water droplets uniformly when distilled water is dropped with a syringe, the organosilicon film 3 has a finely packed structure, and if the surface only partially repels water, It does not have a filling structure, and is composed of Si and O
It is presumed that voids exist in the network structure of.
【００１９】有機ケイ素膜３は、例えば、シランカップ
リング剤を用いることにより形成させることができる。
具体的には、シランカップリング剤の飽和蒸気中に金属
膜２を一定時間暴露する方法（飽和蒸気法）、シランカ
ップリング剤を含む溶液中に金属膜２を一定時間浸漬す
る方法（浸漬法）、スピンコータを用いる方法（スピン
コーティング法）、グラビア印刷機を用いる方法（グラ
ビア法）などにより成膜することができる。本発明にお
いては、これらのいずれの方法を用いてもよいが、細密
充填構造をとる単分子層膜を形成させるためには、飽和
蒸気法を用いるのが好ましい。飽和蒸気法においては、
暴露時の温度、湿度なども単分子層構造及び細密充填構
造の形成に影響を与えるが、暴露時間が最も重要な要素
である。暴露時間が長すぎると単分子層構造が得られ
ず、また、暴露時間が短すぎると細密充填構造が得られ
ない。暴露時間は、通常、１〜600 分とするのが好まし
く、15〜90分とするのが更に好ましい。The organic silicon film 3 can be formed by using, for example, a silane coupling agent.
Specifically, a method of exposing the metal film 2 to a saturated vapor of the silane coupling agent for a predetermined time (saturated vapor method), and a method of immersing the metal film 2 in a solution containing the silane coupling agent for a predetermined time (immersion method) ), A method using a spin coater (spin coating method), a method using a gravure printing machine (gravure method), and the like. In the present invention, any of these methods may be used, but it is preferable to use a saturated vapor method in order to form a monolayer film having a finely packed structure. In the saturated steam method,
The temperature and humidity at the time of exposure also affect the formation of the monolayer structure and the close-packed structure, but the exposure time is the most important factor. If the exposure time is too long, a monolayer structure cannot be obtained, and if the exposure time is too short, a finely packed structure cannot be obtained. The exposure time is usually preferably from 1 to 600 minutes, more preferably from 15 to 90 minutes.
【００２０】抗ベロ毒素抗体は、市販のものでもよい
が、ベロ毒素を免疫して得ることも可能である。ベロ毒
素抗体に特異性が高ければ、ポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体の何れでも良い。ベロ毒素には、ＶＴ
１、ＶＴ２の２種類が存在するが、両者とも検出できる
ことが好ましい。本発明では、抗ＶＴ１抗体及び抗ＶＴ
２抗体を、同一の測定基板に固定しても良いし、別々の
測定基板に固定しても良い。以下、「抗ベロ毒素抗体」
は抗ＶＴ１抗体及び抗ＶＴ２抗体を指すものとする。抗
ベロ毒素抗体を用いた場合、通常は抗体４のＦｃフラグ
メントが有機ケイ素膜３の表面のみに固定化され、抗体
は単分子層状態に形成される。但し、抗体４のＦａｂフ
ラグメントが有機ケイ素膜３から離れる程、感度や反応
速度が低下するため、図２に示すようにＦａｂフラグメ
ント（図２(a) ）又はＦ(ａｂ')2 フラグメント（図２
(b) ）を直接有機ケイ素膜３に固定化して、感度や反応
速度を向上させてもよい。The anti-verotoxin antibody may be commercially available, but can also be obtained by immunizing with verotoxin. Either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used as long as the specificity of the Vero toxin antibody is high. Vero toxin has VT
1. There are two types, VT2, and it is preferable that both can be detected. In the present invention, an anti-VT1 antibody and an anti-VT
The two antibodies may be immobilized on the same measurement substrate, or may be immobilized on separate measurement substrates. Hereinafter, "anti-verotoxin antibody"
Refers to anti-VT1 and anti-VT2 antibodies. When an anti-verotoxin antibody is used, the Fc fragment of the antibody 4 is usually immobilized only on the surface of the organosilicon film 3, and the antibody is formed in a monolayer state. However, as the Fab fragment of the antibody 4 moves away from the organosilicon film 3, the sensitivity and the reaction rate decrease, so that the Fab fragment (FIG. 2A) or the F (ab ') 2 fragment (FIG. 2
(b)) may be directly immobilized on the organosilicon film 3 to improve the sensitivity and the reaction rate.
【００２１】固定化方法は常法によって行えばよく、例
えば、所定量の抗ベロ毒素抗体を有機ケイ素膜３に所定
時間接触させることにより固定化することができる。ま
た、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサー
に測定チップを設置して一定流量の抗ベロ毒素抗体を所
定時間（所定量）流すことによっても固定化できる。抗
ベロ毒素抗体を用いた場合であって、抗体４のＦａｂフ
ラグメントを直接有機ケイ素膜３に固定化する場合に
は、パパインを用いて抗体４を部分分解した後、同様の
処理を行えばよい。一方、抗体４のＦ(ａｂ')2 フラグ
メントを直接有機ケイ素膜３に固定化する場合には、ペ
プシンを用いて抗体４を部分分解した後、同様の処理を
行えばよい。このようにシランカップリング剤に直接抗
ベロ毒素抗体を強固に固定化することにより、当該測定
チップを洗浄しても抗ベロ毒素抗体の固定化を維持でき
るため、繰り返し測定に使用することができるという利
点が得られる。The immobilization may be carried out by a conventional method. For example, the immobilization can be performed by bringing a predetermined amount of an anti-verotoxin antibody into contact with the organosilicon film 3 for a predetermined time. Alternatively, the immobilization can be performed by installing a measurement chip on a flow cell type surface plasmon resonance biosensor and flowing a constant flow rate of the anti-verotoxin antibody for a predetermined time (a predetermined amount). When an anti-verotoxin antibody is used and the Fab fragment of the antibody 4 is directly immobilized on the organosilicon film 3, the same treatment may be performed after partially decomposing the antibody 4 using papain. . On the other hand, when the F (ab ′) 2 fragment of the antibody 4 is directly immobilized on the organosilicon film 3, the same treatment may be performed after the antibody 4 is partially decomposed using pepsin. By firmly immobilizing the anti-verotoxin antibody directly on the silane coupling agent as described above, the immobilization of the anti-verotoxin antibody can be maintained even when the measurement chip is washed, and thus can be used for repeated measurement. The advantage is obtained.
【００２２】本発明の測定チップは、例えば、図３に示
されるような表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用
することができる。この表面プラズモン共鳴バイオセン
サーは、カートリッジブロック７と、光源８と、検出器
９とを有し、カートリッジブロック７の上に本発明の測
定チップ10を設置して使用する。測定チップ10は、透明
基板が上になるように設置する。カートリッジブロック
７の上面には凹部が設けられており、この凹部と上記測
定チップ10とで測定セル71が構成される。測定セル71
は、流路72、73によりカートリッジブロック７の外部に
連通しており、試料は流路72を通じて測定セル71中に流
れ込み、測定に供された後流路73を通じて外部に排出さ
れる。光源８からは、測定チップ10の透明基板に向かっ
て単色光が照射され（入射光80）、測定チップ10の裏面
に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、検出器
９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を検出す
ることができる。The measurement chip of the present invention can be used, for example, for a surface plasmon resonance biosensor as shown in FIG. This surface plasmon resonance biosensor has a cartridge block 7, a light source 8, and a detector 9, and is used by mounting the measurement chip 10 of the present invention on the cartridge block 7. The measurement chip 10 is set so that the transparent substrate faces upward. A concave portion is provided on the upper surface of the cartridge block 7, and the concave portion and the measuring chip 10 constitute a measuring cell 71. Measurement cell 71
Is connected to the outside of the cartridge block 7 by the flow paths 72 and 73, and the sample flows into the measurement cell 71 through the flow path 72, and is discharged outside through the flow path 73 after being subjected to the measurement. The monochromatic light is emitted from the light source 8 toward the transparent substrate of the measurement chip 10 (incident light 80), and the reflected light 90 reflected by the metal film provided on the back surface of the measurement chip 10 enters the detector 9. Light. The detector 9 can detect the intensity of the reflected light 90.
【００２３】上記のような構造によって、ある入射角θ
に対して谷を形成する反射光強度曲線が得られる。反射
光強度曲線における谷は、表面プラズモン共鳴によるも
のである。即ち、光が測定チップ10の透明基板と外との
界面で全反射するときに、その界面にエバネッセント波
といわれる表面波が生じ、一方、金属膜にも表面プラズ
モンといわれる表面波が生じる。この２つの表面波の波
数が一致すると共鳴が起こり、光のエネルギーの一部が
表面プラズモンを励起するために使用され、反射光の強
度が低下する。ここで、表面プラズモンの波数は、金属
膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の影響を受けるた
め、測定対象物質と抗ベロ毒素抗体との相互作用により
媒質の屈折率が変化すると、表面プラズモン共鳴が生じ
る入射角θが変化する。従って、反射光強度曲線の谷の
ずれによって、測定対象物質の濃度の変化を検知するこ
とができる。入射角θの変化量は共鳴シグナルといわ
れ、10-4°の変化を１RUとして表す。With the above structure, a certain incident angle θ
, A reflected light intensity curve forming a valley is obtained. The valley in the reflected light intensity curve is due to surface plasmon resonance. That is, when light is totally reflected at the interface between the transparent substrate and the outside of the measurement chip 10, a surface wave called an evanescent wave is generated at the interface, and a surface wave called a surface plasmon is also generated on the metal film. When the wave numbers of the two surface waves match, resonance occurs, and part of the light energy is used to excite surface plasmons, and the intensity of the reflected light decreases. Here, the wave number of the surface plasmon is affected by the refractive index of the medium very close to the surface of the metal film, so that when the refractive index of the medium changes due to the interaction between the substance to be measured and the anti-verotoxin antibody, the surface plasmon The incident angle θ at which resonance occurs changes. Therefore, it is possible to detect a change in the concentration of the measurement target substance due to the shift of the valley of the reflected light intensity curve. The change amount of the incident angle θ is called a resonance signal, and a change of 10 −4 ° is represented as 1 RU.
【００２４】[0024]
【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明を更に
具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に
限定されるものではない。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
【００２５】〔実施例１〕本実施例では、図１に示され
るような構成を有する測定チップを作製した。Example 1 In this example, a measuring chip having a configuration as shown in FIG. 1 was manufactured.
【００２６】透明基板としては、18mm×18mm、厚さ0.17
mmのカバーグラス（松浪硝子工業社製）を使用した。こ
の透明基板上に、スパッタリングによりクロムからなる
層、次いで金からなる層を形成した。スパッタリング
は、クロムについては100 Ｗ，30秒間、金については10
0 Ｗ，150 秒間で行った。得られたクロム層の厚さは3
2.2Åであり、金層の厚さは474 Åであった。上記の金
属膜を有する透明基板を、シランカップリング剤の飽和
蒸気中に暴露し、金属膜上に有機ケイ素膜を形成させ
た。まず、広口シャーレに原液のままのプロピルトリエ
トキシシラン及び3ーアミノプロピルトリエトキシシラ
ンを30ｍl入れ、室温で24時間放置し、シャーレ内部を
プロピルトリエトキシシランの飽和蒸気で満たした。次
に、上記で作製した透明基板を金属膜部分が露出するよ
うにアルミ製のマスク（支持具）に固定し、このマスク
をシャーレの開口部に載せ、60分間放置し、カバーグラ
スの金属膜上に有機ケイ素膜を形成させ、続いてその上
に8.2×10-3mg/mlの濃度の抗ＶＴ１抗体及び抗ＶＴ２抗
体をそれぞれ独立した領域に50ml滴下し、90分静置し
た。リンス後自然乾燥して測定チップを作製した。As the transparent substrate, 18 mm × 18 mm, thickness 0.17
mm cover glass (Matsunami Glass Industry Co., Ltd.) was used. On this transparent substrate, a layer made of chromium and then a layer made of gold were formed by sputtering. Sputtering is 100 W for 30 seconds for chromium and 10 W for gold.
The test was performed at 0 W for 150 seconds. The thickness of the obtained chrome layer is 3
2.2 mm and the thickness of the gold layer was 474 mm. The transparent substrate having the above metal film was exposed to saturated vapor of a silane coupling agent to form an organosilicon film on the metal film. First, 30 ml of undiluted propyltriethoxysilane and 3-aminopropyltriethoxysilane were placed in a wide-mouthed petri dish, allowed to stand at room temperature for 24 hours, and the inside of the petri dish was filled with saturated vapor of propyltriethoxysilane. Next, the transparent substrate prepared above was fixed to an aluminum mask (support) so that the metal film portion was exposed, and the mask was placed on the opening of a petri dish and left for 60 minutes to form a cover glass metal film. An organosilicon film was formed thereon, and subsequently, 50 ml of an anti-VT1 antibody and an anti-VT2 antibody at a concentration of 8.2 × 10 −3 mg / ml were dropped on independent regions, respectively, and allowed to stand for 90 minutes. After rinsing, the sample was air-dried to prepare a measurement chip.
【００２７】この測定チップを、市販の表面プラズモン
共鳴バイオセンサー（ファルマシアバイオセンサー社
製、BIAcore2000 ）のカートリッジブロック上に設置し
た。このセンサーは図３に示すような構造を有する。抗
体を固定化した測定チップを設置した測定セルに、被検
体として全血を流すが、0.01、0.1、1、10、100 nｇ/ｍ
ｌに希釈、調製したＶＴ１及びＶＴ２を、各々流速５μ
l/分で10分間流しながら光強度を測定し、共鳴シグナル
（RU）を求めた。この結果を図４に示す。図中、●はＶ
Ｔ１を測定した場合である。■はＶＴ２を測定した場合
である。図４に示すように、試料濃度と共鳴シグナルに
正比例に類似した右肩上がりの関係がみられた。これ
は、抗体の特異的反応に起因するものであるものと推測
される。これより、本実施例による測定チップを用いれ
ば、共鳴シグナルの値を測定することにより血中ベロ毒
素を定量することができる。The measurement chip was mounted on a cartridge block of a commercially available surface plasmon resonance biosensor (BIAcore2000, manufactured by Pharmacia Biosensor). This sensor has a structure as shown in FIG. Whole blood is flowed as a subject into a measurement cell on which a measurement chip on which an antibody is immobilized is placed.
VT1 and VT2 diluted and prepared at a flow rate of 5 μl each.
The light intensity was measured while flowing at l / min for 10 minutes to determine the resonance signal (RU). The result is shown in FIG. In the figure, ● is V
This is the case where T1 was measured. (2) shows the case where VT2 was measured. As shown in FIG. 4, there was a right-sloping relationship similar to the sample concentration and the resonance signal in direct proportion. This is presumed to be due to the specific reaction of the antibody. Thus, by using the measurement chip according to the present embodiment, the blood toxin can be quantified by measuring the value of the resonance signal.
【００２８】[0028]
【発明の効果】本発明により、Ｏ−１５７感染症のベッ
ドサイト・モニタリングに適した検出システムとして簡
便でかつ正確な手法が開発され、Ｏ−１５７感染症の治
療に顕著な効果を奏する。According to the present invention, a simple and accurate method has been developed as a detection system suitable for bed-site monitoring of O-157 infection, which has a remarkable effect in treating O-157 infection.
【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]
【図１】本発明の一例による測定チップの概略断面図で
ある。FIG. 1 is a schematic sectional view of a measuring chip according to an example of the present invention.
【図２】本発明の別の例による測定チップの概略断面図
である。FIG. 2 is a schematic sectional view of a measuring chip according to another example of the present invention.
【図３】本発明の測定チップに使用する表面プラズモン
共鳴バイオセンサーの概念図である。FIG. 3 is a conceptual diagram of a surface plasmon resonance biosensor used for the measurement chip of the present invention.
【図４】抗ＶＴ１抗体及び抗ＶＴ２抗体濃度と、共鳴シ
グナルとの関係を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the relationship between the concentration of anti-VT1 antibody and anti-VT2 antibody and the resonance signal.
【図５】スパッタリング法による膜形成を示す図であ
る。FIG. 5 is a diagram showing film formation by a sputtering method.
【図６】ドライエッチング法による成膜構成を示す図で
ある。FIG. 6 is a diagram showing a film formation configuration by a dry etching method.
【図７】ＣＶＤ法による成膜構成図である。FIG. 7 is a diagram showing a film formation configuration by a CVD method.
【図８】疎水結合における抗体固定化手順を示す。FIG. 8 shows a procedure for immobilizing an antibody in a hydrophobic bond.
【図９】静電結合における抗体固定化手順を示す。FIG. 9 shows an antibody immobilization procedure in electrostatic binding.
１…透明基板 ２…金属膜 ３…有機ケイ素膜 ４…抗ベロ毒素抗体 ５…多孔性材料 ６…共有結合膜 ７…カートリッジブロック 71…測定セル 72，73…流路 ８…光源 80…入射光 ９…検出器 90…反射光 10…測定チップ DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Transparent substrate 2 ... Metal film 3 ... Organosilicon film 4 ... Anti-verotoxin antibody 5 ... Porous material 6 ... Covalent bonding film 7 ... Cartridge block 71 ... Measurement cell 72, 73 ... Flow path 8 ... Light source 80 ... Incident light 9 Detector 90 Reflected light 10 Measurement chip
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐藤 公治 東京都新宿区市谷加賀町一丁目１番１号 大日本印刷株式会社内 ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuing on the front page (72) Inventor Koji Sato 1-1-1 Ichigaya-Kagacho, Shinjuku-ku, Tokyo Dai Nippon Printing Co., Ltd.
Claims (17)
属膜及び該金属膜上に固定されるベロ毒素に対する抗体
を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴バイ
オセンサー用測定チップ。1. A measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor, comprising: a transparent substrate; a metal film disposed on the transparent substrate; and an antibody against verotoxin immobilized on the metal film.
のＶＴ１、ＶＴ２に対する抗体である請求項１記載の表
面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。2. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 1, wherein the antibody against verotoxin is an antibody against VT1 and VT2 derived from O-157.
いは静電結合により金属膜上に固定されることを特徴と
する請求項１記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー
用測定チップ。3. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 1, wherein the antibody against Vero toxin is immobilized on the metal film by hydrophobic bonding or electrostatic bonding.
イ素膜を形成することを特徴とする請求項３に記載の表
面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。4. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 3, wherein the hydrophobic bond or the electrostatic bond forms an organic silicon film.
剤により形成された膜であることを特徴とする、請求項
４に記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チ
ップ。5. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 4, wherein the organosilicon film is a film formed by a silane coupling agent.
ことを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴バ
イオセンサー用測定チップ。6. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 1, wherein the metal disposed on the transparent substrate is gold.
物又は金属とフッ素の混合物を主成分とすることを特徴
とする請求項３記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサ
ー用測定チップ。7. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 3, wherein the film formed by the hydrophobic bond is mainly composed of a compound of metal and fluorine or a mixture of metal and fluorine.
求項７記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定
チップ。8. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 7, wherein the metal is gold.
又は金属と炭素の混合物を主成分とすることを特徴とす
る請求項３記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用
測定チップ。9. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 3, wherein the film formed by the hydrophobic bond is mainly composed of a compound of metal and carbon or a mixture of metal and carbon.
請求項９記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップ。10. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 9, wherein the metal is gold.
むプラズマに曝すことにより形成されることを特徴とす
る請求項３記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用
測定チップ。11. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 3, wherein the film by the hydrophobic bond is formed by exposing to a plasma containing a fluorine-based gas.
マに曝すことにより形成されることを特徴とする請求項
３記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チッ
プ。12. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 3, wherein the film by the hydrophobic bond is formed by exposing to a plasma containing carbon.
分とすることを特徴とする請求項３記載の表面プラズモ
ン共鳴バイオセンサー用測定チップ。13. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 3, wherein the film formed by the hydrophobic bond contains siloxane as a main component.
合物を主成分とすることを特徴とする請求項３記載の表
面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。14. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 3, wherein the membrane formed by the hydrophobic bond contains a fluorine-containing organic compound as a main component.
チオールであることを特徴とする請求項３記載の表面プ
ラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。15. The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to claim 3, wherein the membrane formed by the hydrophobic bond or the electrostatic bond is thiol.
よって形成された膜であることを特徴とする請求項１５
記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チッ
プ。16. The thiol film according to claim 15, wherein the thiol film is a film formed of alkanethiol.
The measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor according to the above.
金属膜の上に疎水結合または静電結合により膜を形成
し、次いで該膜上にベロ毒素に対する抗体を配置するこ
とを特徴とする、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用
測定チップの製造方法。17. A method comprising: after disposing a metal film on a transparent substrate, forming a film on the metal film by hydrophobic bonding or electrostatic bonding, and then disposing an antibody against verotoxin on the film. To manufacture a measurement chip for a surface plasmon resonance biosensor.
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|---|---|---|---|
| JP10067299A JPH11264819A (en) | 1998-03-17 | 1998-03-17 | Sensor for detection of verotoxin in blood |
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| JP10067299A JPH11264819A (en) | 1998-03-17 | 1998-03-17 | Sensor for detection of verotoxin in blood |
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| Publication Number | Publication Date |
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| JPH11264819A true JPH11264819A (en) | 1999-09-28 |
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| JP (1) | JPH11264819A (en) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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1998
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