JPH11253169A - Kit for gene diagnosis of leukemia - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a primer for nucleic acid amplification which consists of a specific oligonucleotide and the like and is suitable for sensitive and specific gene diagnosis, for leukemia, which is rapid and simple, and has excellent operability, by NASBA method. SOLUTION: This primer consists of an oligonucleotide of a continuous base sequence at position 15-30, 12-31, or 47-66 shown by the formula, or an oligonucleotide which one or more base(s) is/are deleted from, substituted, or added to the oligonucleotide without losing its function. It is preferable to diagnose leukemia by preparing a reagent for nucleic acid amplification for NASBA method using the primer followed by capturing/detecting RNA corresponding to a part of the base sequence of leukemia gene WT 1 using the reagent.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は白血病を特異的且つ
高感度で迅速に検出・同定する遺伝子診断用キット及び
それを利用する遺伝子診断方法に関する。[0001] The present invention relates to a gene diagnosis kit for detecting and identifying leukemia quickly and specifically and with high sensitivity, and a gene diagnosis method using the kit.

【０００２】[0002]

【従来の技術】白血病は造血器の代表的な悪性腫瘍で白
血病細胞がび漫性増殖を示す疾患である。主な治療法と
して化学療法が用いられており、その成績は近年著明な
進歩を遂げ、寛解率が７０〜８０％にも及んでいる。長
期生存者も年々増加しつつあるが再発例も少なくなく、
且つ正常細胞をも傷害する非特異的治療で種々の副作用
も存在する。2. Description of the Related Art Leukemia is a typical malignant tumor of the hematopoietic organ and is a disease in which leukemia cells show diffuse proliferation. Chemotherapy has been used as the main treatment, and the results have made remarkable progress in recent years, with remission rates ranging from 70 to 80%. The number of long-term survivors is increasing year by year, but there are many cases of recurrence,
In addition, there are various side effects due to non-specific treatment that also damages normal cells.

【０００３】白血病の診断は従来から細胞化学を利用し
た特殊染色法を含む形態学観察によっているが、最近で
は免疫学的や遺伝子診断法等が取り入れられている。血
液細胞の染色に用いられているWright,Giemsa,May-Giem
sa染色では、Ａｕｅｒ小体の出現例、急性前骨髄性白血
病症例を除くと白血病細胞の帰属決定が困難な例が少な
くない。最近細胞工学の進歩により白血病細胞のもつ各
種抗原に対するモノクローナル抗体が作製され免疫学的
方法によりＡＭＬ細胞、ＡＬＬ細胞、リンパ球の正確な
同定がなされ、細胞分化の程度を知る可能性がでてき
た。しかし正常な造血細胞においても膜表面抗原は認め
られ、白血病細胞の特異抗原となるものは非常に少な
く、免疫学的手法による診断の展開が困難になってい
る。そして、遺伝子工学の進展により、染色体や遺伝子
解析手段が疾患の診断、予後の予測、治療の正確な評価
に利用されるようになってきた。[0003] Diagnosis of leukemia has conventionally been based on morphological observation including a special staining method utilizing cytochemistry, but recently immunological and genetic diagnostic methods have been adopted. Wright, Giemsa, May-Giem used for blood cell staining
In sa staining, there are many cases where it is difficult to determine the assignment of leukemia cells except for the appearance of Auer bodies and acute promyelocytic leukemia. Recent advances in cell engineering have produced monoclonal antibodies against various antigens of leukemia cells, and the precise identification of AML cells, ALL cells, and lymphocytes has been made by immunological methods, and the possibility of knowing the degree of cell differentiation has emerged. . However, even on normal hematopoietic cells, membrane surface antigens are recognized, and there are very few specific antigens for leukemia cells, making it difficult to develop a diagnosis by immunological techniques. And, with the advance of genetic engineering, chromosome and gene analysis means have been used for diagnosis of disease, prediction of prognosis, and accurate evaluation of treatment.

【０００４】一方、白血病では血液学的検査などの通常
の検査で腫瘍細胞が検出されない状態（完全寛解）でも
微量残存白血病細胞（Minimal Residual Disease：ＭＲ
Ｄ）が存在する場合が多い。このＭＲＤの検出は治療効
果の判定、再発の早期診断とそれに基づく早期治療に役
立つ。当初、ＭＲＤの検出にＰＣＲ増幅法が利用された
が、数Ｋｂを越える範囲で散在する染色体転座では普遍
的なプライマーを用いて切断点をはさんだ増幅ができな
かった。まもなく、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡをｃＤ
ＮＡに変換したあと増幅するＲＴ−ＰＣＲが考案され、
その適応が大きく広がった（Kawasaki,E.S., et. al.:P
roc.Natl.Acad.Sci.USA., 85:5698-5702, 1988）。On the other hand, in the case of leukemia, even when tumor cells are not detected by a normal test such as a hematological test (complete remission), a minimal residual leukemia cell (Minimal Residual Disease: MR)
D) is often present. This detection of MRD is useful for judging the therapeutic effect, for early diagnosis of recurrence, and for early treatment based on it. Initially, PCR amplification was used to detect MRD, but chromosomal translocations scattered over several Kb could not be amplified across breakpoints using universal primers. Soon, mRNA was converted to cD using reverse transcriptase.
RT-PCR that amplifies after converting to NA was devised,
The adaptation has been greatly expanded (Kawasaki, ES, et. Al .: P
roc.Natl.Acad.Sci.USA., 85: 5698-5702, 1988).

【０００５】１９９４年 井上らは定量的ＲＴ−ＰＣＲ
を用いて病型に関係なく、ほとんどすべての白血病細胞
において野生型ＷＴ１が高発現している事を示し、 Ｗ
Ｔ１が白血病の病態に重要な役割をしている事を示した
（Inoue,K.et.al., :Blood,84:3071-3079,1994）。[0005] 1994 Inoue et al. Quantitative RT-PCR
Shows that wild-type WT1 is highly expressed in almost all leukemia cells, regardless of the disease type.
It has been shown that T1 plays an important role in the pathogenesis of leukemia (Inoue, K. et. Al.,: Blood, 84: 3071-3079, 1994).

【０００６】ＷＴ１遺伝子は小児腎臓病ウイルムス腫瘍
の主要遺伝子の一つとして単離されたがん抑制遺伝子で
あり、染色体１１ｐ１３に存在し他の遺伝子の転写を調
節する機能を有し、泌尿生殖器の発生分化に関与してい
る。また、多種類の白血病においては普遍的に高発現し
ており、健常人とは明らかに有意差がある。 ＷＴ１遺
伝子は全長約５０Ｋｂで１０個のエクソンからなる。エ
クソン７−１０は各々１個ずつジンクフィンガードメイ
ンを持っている。[0006] The WT1 gene is a tumor suppressor gene isolated as one of the main genes of Wilms tumor of childhood renal disease. It is located on chromosome 11p13 and has the function of regulating the transcription of other genes. It is involved in development and differentiation. In addition, it is ubiquitously expressed in many types of leukemia, and there is a clear significant difference from healthy individuals. The WT1 gene is about 50 Kb in length and consists of 10 exons. Exons 7-10 each have one zinc finger domain.

【０００７】[0007]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は迅速、
簡便で操作性の優れた高感度の白血病の特異的遺伝子診
断に用いられる核酸増幅用プライマー、核酸捕捉・検出
用プローブ、診断用キット法及び診断方法を提供するこ
とである。SUMMARY OF THE INVENTION The object of the present invention is rapid,
An object of the present invention is to provide a primer for nucleic acid amplification, a probe for nucleic acid capture / detection, a diagnostic kit method and a diagnostic method, which are used for a simple, highly operable and highly specific leukemia specific gene diagnosis.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の目的
を達成するために、ＷＴ１ｍＲＮＡの塩基配列の一部で
あるプライマー、及びプローブの検討を鋭意行い、本発
明を完成することが出来た。Means for Solving the Problems In order to achieve the above object, the present inventors have intensively studied primers and probes that are a part of the base sequence of WT1 mRNA, and have completed the present invention. Was.

【０００９】即ち本発明は、配列番号１の塩基配列の中
の連続する１５〜３０塩基よりなるオリゴヌクレオチ
ド、または該オリゴヌクレオチドにおいてその機能を失
わない範囲で１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付
加されたオリゴヌクレオチドよりなるＮＡＳＢＡ（Nucl
eic Acid Sequence-Based Amplification）法による白
血病の遺伝子診断用に用いられる核酸増幅用プライマー
である。That is, the present invention relates to an oligonucleotide comprising 15 to 30 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or deleting one to several nucleotides in such an oligonucleotide as long as its function is not lost. NASBA comprising a substituted or added oligonucleotide (Nucl
It is a primer for nucleic acid amplification used for genetic diagnosis of leukemia by eic Acid Sequence-Based Amplification (Eic Acid Sequence-Based Amplification) method.

【００１０】他の本発明は、その５’末端にＲＮＡポリ
メラーゼのプロモーター配列を有し、配列番号２の塩基
配列の中の連続する１５〜３０塩基よりなるオリゴヌク
レオチド、または該オリゴヌクレオチドにおいてその機
能を失わない範囲で１乃至数個の塩基が欠失、置換若し
くは付加されたオリゴヌクレオチドよりなるＮＡＳＢＡ
法による白血病の遺伝子診断用に用いられる核酸増幅用
プライマーである。Another aspect of the present invention relates to an oligonucleotide having a promoter sequence of RNA polymerase at its 5 'end and consisting of 15 to 30 contiguous bases in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or a function of the oligonucleotide. NASBA comprising an oligonucleotide in which one or several bases are deleted, substituted or added within a range not to lose
This is a primer for nucleic acid amplification used for genetic diagnosis of leukemia by the method.

【００１１】更に他の本発明は、配列番号３の塩基配列
の中の連続する１５〜３０塩基よりなるオリゴヌクレオ
チド、または該オリゴヌクレオチドにおいてその機能を
失わない範囲で１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは
付加されたオリゴヌクレオチドよりなるＮＡＳＢＡ法に
よる白血病の遺伝子診断用に用いられる核酸捕捉プロー
ブまたは核酸検出プローブである。Still another object of the present invention is to provide an oligonucleotide consisting of 15 to 30 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, or to lack one to several nucleotides in the oligonucleotide so long as its function is not lost. It is a nucleic acid capture probe or a nucleic acid detection probe used for genetic diagnosis of leukemia by the NASBA method comprising a lost, substituted or added oligonucleotide.

【００１２】更に他の本発明は、前記プライマーを含
み、必要に応じて前記捕捉プローブ、検出プローブを含
み、更に必要に応じて逆転写酵素、リボヌクレアーゼ
Ｈ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴ
Ｐ、ｒＮＴＰおよび緩衝剤を含むＮＡＳＢＡ法用核酸増
幅用試薬である。[0012] Still another aspect of the present invention comprises the above-mentioned primers, if necessary, the above-mentioned capture probe and detection probe, and if necessary, reverse transcriptase, ribonuclease H, DNA polymerase, RNA polymerase, dNT.
It is a nucleic acid amplification reagent for NASBA method containing P, rNTP and a buffer.

【００１３】更に他の本発明は、被検者より採取した試
料を検体として、白血病遺伝子ＷＴ１の塩基配列のエク
ソン７〜１０に相当する配列の一部をフォワード・プラ
イマー（forward primer）とリバース・プライマー（r
everse primer）によりＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Seq
uence-Based Amplification）法で増幅させ、白血病患
者の検体である場合に増幅された白血病遺伝子ＷＴ１の
塩基配列の一部に相当するＲＮＡを捕捉・検出すること
により白血病であるとする白血病の特異的診断方法であ
る。In still another aspect of the present invention, a part of the sequence corresponding to exons 7 to 10 of the base sequence of the leukemia gene WT1 is obtained by using a sample collected from a subject as a specimen and a forward primer and a reverse primer. Primer (r
everse primer) with NASBA (Nucleic Acid Seq
uence-Based Amplification), and in the case of a sample of a leukemia patient, the leukemia specific leukemia is determined to be leukemia by capturing and detecting RNA corresponding to a part of the base sequence of the leukemia gene WT1 when the sample is a leukemia patient sample. This is a diagnostic method.

【００１４】更に他の本発明は、前記診断方法におい
て、ＮＡＳＢＡ法で増幅する際に、内部標準物質として
阻害物質を共存させてＷＴ１を定量する方法である。Still another aspect of the present invention is a method for quantifying WT1 in the above-mentioned diagnostic method in the presence of an inhibitor as an internal standard when amplifying by the NASBA method.

【００１５】[0015]

【発明の実施の形態】ＮＡＳＢＡ法では、試料中の標的
核酸配列（ＲＮＡ）に相補的な配列およびその５’末端
側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第
１プライマーを試料中の標的核酸（ＲＮＡ）にハイブリ
ダイズさせ、逆転写酵素によりＤＮＡを合成し（工程
１）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみをリボ
ヌクレアーゼＨにより分離して一本鎖ＤＮＡ（第２鋳
型）を得（工程２）、ついで該一本鎖ＤＮＡ（第２鋳
型）に標的核酸配列（ＤＮＡ）に相補的な配列を有する
第２プライマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラ
ーゼにより伸長反応を行い、二本鎖ＤＮＡを得る（工程
３）。ついでプロモーター配列を認識するＲＮＡポリメ
ラーゼを用いて、ＲＮＡのコピー（第３鋳型）を多数合
成する（工程４）。得られたＲＮＡ（第３鋳型）を鋳型
とし、逆転写酵素を使用した第２プライマーによるＲＮ
Ａ／ＤＮＡハイブリッドの合成（工程５）、リボヌクレ
アーゼＨによるＲＮＡのみを分離する一本鎖ＤＮＡ（第
４鋳型）の合成（工程６）、得られた一本鎖ＤＮＡ（第
４鋳型）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼを使用した
第１プライマーによる二本鎖ＤＮＡの合成（工程７）、
ＲＮＡポリメラーゼを使用した該二本鎖ＤＮＡからＲＮ
Ａの多数コピー（第３鋳型）の合成（工程８）を行う。
これらの工程（工程５〜８）を繰り返すことにより、試
料中の核酸を増幅させることができる。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS In the NASBA method, a first primer having a sequence complementary to a target nucleic acid sequence (RNA) in a sample and a promoter sequence of an RNA polymerase at the 5 'end thereof is used as a target nucleic acid (RNA) in the sample. ), Synthesize DNA with reverse transcriptase (step 1), and separate only RNA of RNA / DNA hybrid with ribonuclease H to obtain single-stranded DNA (second template) (step 2). A second primer having a sequence complementary to the target nucleic acid sequence (DNA) is hybridized to the single-stranded DNA (second template), and an elongation reaction is performed with a DNA polymerase to obtain a double-stranded DNA (Step 3). . Next, a large number of RNA copies (third template) are synthesized using an RNA polymerase that recognizes the promoter sequence (step 4). Using the obtained RNA (third template) as a template, RN with a second primer using reverse transcriptase
Synthesis of A / DNA hybrid (step 5), synthesis of single-stranded DNA (fourth template) for separating only RNA by ribonuclease H (step 6), and using the obtained single-stranded DNA (fourth template) as a template Synthesis of double-stranded DNA with the first primer using DNA polymerase (Step 7),
RN from the double-stranded DNA using RNA polymerase
A multiple copy of A (third template) is synthesized (step 8).
By repeating these steps (steps 5 to 8), the nucleic acid in the sample can be amplified.

【００１６】また別なＮＡＳＢＡ法では、試料中の標的
核酸配列（ＤＮＡ）に相補的な配列およびその５’末端
側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する第
１プライマーを試料中の標的核酸（ＤＮＡ）にハイブリ
ダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて二本
鎖ＤＮＡを合成し（工程１）、二本鎖ＤＮＡを分離して
一本鎖ＤＮＡ（第２鋳型）を得（工程２）、ついで該一
本鎖ＤＮＡ（第２鋳型）に標的核酸配列（ＤＮＡ）に相
補的な配列を有する第２プライマーをハイブリダイズさ
せ、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応を行い、二本鎖
ＤＮＡを得る（工程３）。ついでプロモーター配列を認
識するＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡのコピー
（第３鋳型）を多数合成する（工程４）。得られたＲＮ
Ａ（第３鋳型）を鋳型とし、逆転写酵素を使用した第２
プライマーによるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの合成
（工程５）、リボヌクレアーゼＨによるＲＮＡのみを分
離する一本鎖ＤＮＡ（第４鋳型）の合成（工程６）、得
られた一本鎖ＤＮＡ（第４鋳型）を鋳型として、ＤＮＡ
ポリメラーゼを使用した第１プライマーによる二本鎖Ｄ
ＮＡの合成（工程７）、ＲＮＡポリメラーゼを使用した
該二本鎖ＤＮＡからＲＮＡの多数コピー（第３鋳型）の
合成（工程８）を行う。これらの工程（工程５〜８）を
繰り返すことにより、試料中の核酸を増幅させることが
できる。In another NASBA method, a first primer having a sequence complementary to a target nucleic acid sequence (DNA) in a sample and an RNA polymerase promoter sequence at the 5 ′ end thereof is added to the target nucleic acid (DNA) in the sample. To obtain a single-stranded DNA (second template) by separating the double-stranded DNA (Step 2), and then separating the double-stranded DNA (Step 2). A second primer having a sequence complementary to the target nucleic acid sequence (DNA) is hybridized to the single-stranded DNA (second template), and an elongation reaction is performed with a DNA polymerase to obtain a double-stranded DNA (Step 3). Next, a large number of RNA copies (third template) are synthesized using an RNA polymerase that recognizes the promoter sequence (step 4). RN obtained
A (third template) as a template and the second using reverse transcriptase
Synthesis of RNA / DNA hybrid using primers (step 5), synthesis of single-stranded DNA (fourth template) for separating RNA only by ribonuclease H (step 6), and obtaining of single-stranded DNA (fourth template) DNA as a template
Double-stranded D with first primer using polymerase
Synthesis of NA (step 7) and synthesis of multiple copies of RNA (third template) from the double-stranded DNA using RNA polymerase (step 8). By repeating these steps (steps 5 to 8), the nucleic acid in the sample can be amplified.

【００１７】本発明に用いられるプライマーとしてはガ
ン抑制遺伝子ＷＴ１のエクソン７〜１０までに相当する
ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列の一部を任意に選択して用
いる。ＷＴ１の構造に関しては文献に記載されている
（THE ONCOGENE Facts Book pp333-336）。プライマー
としては下記のものが好ましい。As the primer used in the present invention, a part of the nucleotide sequence of DNA or RNA corresponding to exons 7 to 10 of the cancer suppressor gene WT1 is arbitrarily selected and used. The structure of WT1 is described in the literature (THE ONCOGENE Facts Book pp333-336). The following primers are preferred.

【００１８】第２プライマーとしては、配列番号１の塩
基配列の中の連続する１５〜３０塩基よりなるオリゴヌ
クレオチドが好ましく、特にその１２〜３１番もしくは
４７〜６６番よりなるオリゴヌクレオチドが好ましい。
第１プライマーとしては、その５’末端にＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を有し、配列番号２の塩基配
列の中の連続する１５〜３０塩基よりなるオリゴヌクレ
オチドが好ましく、特にその１９〜３８番もしくは５１
〜７０番よりなるオリゴヌクレオチドが好ましい。ＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーターとしては、例えば配列番
号４のＴ７プロモーターが例示できる。プロモーター配
列は複製開始点までのスペーサーを含んでいてもよく、
例えば 5'-AGGA-3' などの配列を必要に応じてプロモーター配列の３’末端
に結合していてもよい。なお、これらのオリゴヌクレオ
チドにおいてその機能を失わない範囲で１乃至数個の塩
基が欠失、置換若しくは付加されたオリゴヌクレオチド
も本発明の範囲内である。As the second primer, an oligonucleotide consisting of consecutive 15 to 30 bases in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is preferred, and an oligonucleotide consisting of the 12th to 31st or 47 to 66th is particularly preferred.
As the first primer, an oligonucleotide having a promoter sequence of RNA polymerase at its 5 ′ end and consisting of 15 to 30 consecutive nucleotides in the base sequence of SEQ ID NO: 2 is preferable, and particularly the 19th to 38th or 51st nucleotide is preferred.
Oligonucleotides consisting of # 70 to # 70 are preferred. RN
Examples of the A polymerase promoter include the T7 promoter of SEQ ID NO: 4. The promoter sequence may include a spacer up to the replication origin,
For example, a sequence such as 5'-AGGA-3 'may be linked to the 3' end of the promoter sequence, if necessary. Note that oligonucleotides in which one to several bases are deleted, substituted, or added within a range not losing the function of these oligonucleotides are also within the scope of the present invention.

【００１９】また、捕捉・検出のためのプローブとして
は同様にＷＴ１のエクソン７〜１０までに相当するＤＮ
Ａ又はＲＮＡの塩基配列の一部を任意に選択して用いる
が、２０〜４０ヌクレオチドの長さを持つプローブであ
ることが好ましく、配列番号３の塩基配列の中の連続す
る１５〜３０塩基よりなるオリゴヌクレオチドがより好
ましく、特に８１〜１０５番もしくは１１２〜１３２番
よりなるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、これら
のオリゴヌクレオチドにおいてその機能を失わない範囲
で１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたオ
リゴヌクレオチドも本発明の範囲内である。Similarly, probes corresponding to exons 7 to 10 of WT1 are used as probes for capture / detection.
A part of the nucleotide sequence of A or RNA is arbitrarily selected and used, but it is preferably a probe having a length of 20 to 40 nucleotides, and more than 15 to 30 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 Are more preferred, and particularly preferred are oligonucleotides consisting of Nos. 81-105 or 112-132. Oligonucleotides in which one to several bases have been deleted, substituted or added in such oligonucleotides as long as their functions are not lost are also within the scope of the present invention.

【００２０】本発明に使用される検体は血清、尿、唾
液、喀痰、腹水、胸水、髄液、骨髄液、臓器切片又は末
梢血液いずれでも可能であるが、増幅に用いられる核酸
物質は不安定であるので、出来るだけ早く抽出工程に入
るのがよい。すぐに使用しない場合には−２０℃以下又
は−８０℃で保存し、核酸の分解を抑制する必要があ
る。The sample used in the present invention can be any of serum, urine, saliva, sputum, ascites, pleural effusion, cerebrospinal fluid, bone marrow fluid, organ sections or peripheral blood, but the nucleic acid substance used for amplification is unstable. Therefore, it is better to start the extraction process as soon as possible. When not used immediately, it is necessary to store at −20 ° C. or lower or at −80 ° C. to suppress nucleic acid degradation.

【００２１】次に、核酸の抽出は基本的に酵素類の変性
処理としてフェノール処理を行った後、アルコール沈殿
することにより行うのが好ましい。この方法によれば核
酸濃縮と、核酸溶液中に存在するフェノール、塩、ヌク
レオチドの除去、緩衝液の交換を同時に早く行うことが
出来る。ＲＮＡはアルカリや温度の影響を受けやすく、
材料や実験者由来の分解酵素により、ＤＮＡに比較して
分解されやすい。動物由来の材料には分解酵素が比較的
多く含まれるので、直ちにＲＮＡを抽出しない場合には
瞬間的に凍結するのが好ましい。また、解凍後はすぐに
リボヌクレアーゼ阻害剤が含まれる液に浸すのが好まし
い。抽出法は数多く開発され、簡便法（ＥＤＴＡ−ＳＤ
Ｓ−Phenol−Ethanol）、塩化リチウム−尿素法、プロ
テアーゼＫ−デオキシリボヌクレアーゼ法、フェノール
−ＳＤＳ法、グアニジンチオシアネート−塩化セシウム
法、グアニジンチオシアネート−トリフルオロ酢酸セシ
ウム法、アシッドグアニジンチオシアネート−フェノー
ル−クロロホルム法（ＡＧＰＣ法）、バナジルリボヌク
レオシド複合法等があるが、本発明においては分解の少
ないＲＮＡが得られるＡＧＰＣ法が好ましい。Next, it is preferable that the nucleic acid is basically extracted by subjecting the enzyme to phenol treatment as a denaturation treatment, followed by alcohol precipitation. According to this method, the concentration of nucleic acid, the removal of phenol, salts and nucleotides present in the nucleic acid solution, and the replacement of the buffer can be simultaneously and quickly performed. RNA is susceptible to alkali and temperature,
It is easily degraded by DNA or by a decomposing enzyme derived from the experimenter as compared with DNA. Since animal-derived materials contain a relatively large amount of a degrading enzyme, it is preferable to freeze instantaneously if RNA is not immediately extracted. In addition, it is preferable to immerse immediately in a solution containing a ribonuclease inhibitor after thawing. Many extraction methods have been developed and a simple method (EDTA-SD
S-Phenol-Ethanol), lithium chloride-urea method, protease K-deoxyribonuclease method, phenol-SDS method, guanidine thiocyanate-cesium chloride method, guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method, acid guanidine thiocyanate-phenol-chloroform method ( AGPC method), a vanadyl ribonucleoside complex method, etc., and in the present invention, the AGPC method which can obtain RNA with little degradation is preferable.

【００２２】本発明に用いるプライマーやプローブは前
記のとおりである。これらのヌクレオチドの合成は現
在、市販されているＤＮＡ／ ＲＮＡ合成機を使用し、
それら合成機の合成条件に合わせて合成すれば、ほとん
ど問題ない。増幅効率をよくするためには、プライマー
の純度をよくすることが重要である。好ましくは合成さ
れたプライマーを液体クロマトで分画し、使用する。検
出用のプローブは検出方法によって異なってくる。ドッ
ト／サザンハイブリダイゼーションの場合、長さは２０
〜４０ｍｅｒ程度の長さがよい結果を示し、純度はさほ
ど高くなくとも良い。The primers and probes used in the present invention are as described above. The synthesis of these nucleotides currently uses a commercially available DNA / RNA synthesizer,
There is almost no problem if the synthesis is performed in accordance with the synthesis conditions of these synthesizers. In order to improve the amplification efficiency, it is important to improve the purity of the primer. Preferably, the synthesized primers are fractionated by liquid chromatography and used. The detection probe differs depending on the detection method. For dot / southern hybridization, the length is 20
A length of about ４０40 mer shows good results, and the purity need not be very high.

【００２３】ＮＡＳＢＡ法は他の測定法（ＰＣＲ法（特
開昭60−281号公報参照）、ＲＴ−ＰＣＲ法）と同様に
阻害物質を内部標準物質（competitor）として用いて遺
伝子を定量的に測定する事が可能である。competitorと
しては増幅部分中の捕捉プローブの配列部分を他の配列
に置換して使用することが良好な結果を得る為に重要で
ある。置換配列は長さがほぼ同じで相同性がないことが
好ましい。competitorは約１０００ｍｅｒ程度のものが
好ましい。The NASBA method uses an inhibitor as an internal standard (competitor) to quantitatively analyze genes, similarly to other measurement methods (PCR method (see JP-A-60-281) and RT-PCR method). It is possible to measure. As a competitor, it is important to use the sequence portion of the capture probe in the amplification portion by substituting it with another sequence in order to obtain good results. Preferably, the replacement sequences are approximately the same length and have no homology. The competitor is preferably about 1000 mer.

【００２４】[0024]

【実施例】次に、実施例をあげて更に詳細な説明をす
る。 実施例１ ［ＮＡＳＢＡ法による各種検体中のＷＴ１の検出］以下
に示す各検体からＡＧＰＣ法による全ＲＮＡ抽出を行
い、nuclease freewater（water）に溶解した。溶解後、
使用時まで−８０℃に保存した。 １．培養細胞株 慢性骨髄性白血病細胞株 Ｋ５６２（ＲＣＢ００２
７） び慢性組織球リンパ腫細胞株 Ｕ９３７ ＤＥ４ （Ｒ
ＣＢＯ４３５） 培地には１０％ FBS in Ham F12(K562),10%FBS in RPMI
1640(U937)を用い、ＣＯ₂インキュベーターにて３７
℃、５％ＣＯ₂下の条件下で培養し、対数増殖期の細胞
をハーベストした。Next, a more detailed description will be given with reference to embodiments. Example 1 [Detection of WT1 in Various Samples by NASBA Method] Total RNA was extracted from each of the following samples by the AGPC method and dissolved in nuclease freewater (water). After dissolution,
Stored at -80 ° C until use. 1. Cultured cell line Chronic myeloid leukemia cell line K562 (RCB002
7) Chronic histiocytic lymphoma cell line U937 DE4 (R
CBO435) 10% FBS in Ham F12 (K562), 10% FBS in RPMI
Using 1640 (U937), 37 in CO ₂ incubator
The cells were cultured under conditions of 5 ° C. and 5% CO ₂ , and cells in the logarithmic growth phase were harvested.

【００２５】２．ヒト単核球 正常ヒトリンパ球 健常人の末梢血約４０ｍｌから Ficoll-Paque（Pharma
cia）を用いてリンパ球を分離後、全ＲＮＡを抽出し
た。 検体 患者検体１０検体からと同様にＲＮＡを抽出した。 ３．ＮＡＳＢＡ−dot hybridization 抽出した全ＲＮＡをwaterにて１０段階希釈し、１pg/μ
l〜1μg/μlに濃度調整後、ＮＡＳＢＡ取扱説明書に従
いＷＴ１ ｍＲＮＡ ＮＡＳＢＡを行った。尚、本実施
例ではプライマーは配列番号１の１２〜３１番のヌクレ
オチドよりなるプライマーと、配列番号２の１９〜３８
番のオリゴヌクレオチドよりなりその５’末端にＴ７プ
ロモーター配列を有するプライマーを使用した。ＮＡＳ
ＢＡ産物は検出時まで−２０℃保存した。waterにて１
０倍希釈してdot blot hybridizationによる検出を行っ
た。hybridizationでは配列番号３の１１２〜１３２番
のオリゴヌクレオチドにアルカリフォスファターゼを標
識した検出プローブを用い、酵素反応時間は１０分とし
た。2. Human mononuclear cells Normal human lymphocytes Ficoll-Paque (Pharma
After separating lymphocytes using cia), total RNA was extracted. Specimen RNA was extracted in the same manner as from 10 patient specimens. 3. NASBA-dot hybridization The extracted total RNA was diluted in 10 steps with water, and 1 pg / μ
After adjusting the concentration to 1 to 1 μg / μl, WT1 mRNA NASBA was performed according to the NASBA instruction manual. In this example, the primers were a primer consisting of nucleotides 12 to 31 of SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of nucleotides 19 to 38 of SEQ ID NO: 2.
A primer consisting of the oligonucleotide No. 5 and having a T7 promoter sequence at its 5 ′ end was used. NAS
BA products were stored at -20 ° C until detection. at water 1
After dilution by 0-fold, detection by dot blot hybridization was performed. In hybridization, a detection probe obtained by labeling oligonucleotides 112 to 132 of SEQ ID NO: 3 with alkaline phosphatase was used, and the enzyme reaction time was 10 minutes.

【００２６】４．ＲＴ−ＰＣＲ 井上らの方法（Blood,88:2267-2278,1996）に準じて全
ＲＮＡ ２μｇを逆転写後、ＷＴ１及びβ-actinに対す
るＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ時のテンプレート量はＲ
Ｔ反応開始時の全ＲＮＡ（2μg/30μl）から計算して１
６７ｎｇに相当する反応液量（２．５μｌ）を１０
⁰（１）とし、最大１０^-5（１．６７ｐｇ相当）まで連
続１０倍希釈したＲＴ反応液を５０μｌのＰＣＲ反応系
に加えた。ここで使用したＷＴ１のプライマーはＷＴ１
遺伝子のエクソン７及びエクソン１０を挟む４８３ｂｐ
の領域用を、β-ａｃｔｉｎのプライマーはβ-ａｃｔｉ
ｎ遺伝子のエクソン１及びエクソン３を挟む５４０ｂｐ
の領域用を用いた。4. RT-PCR After reverse transcription of 2 μg of total RNA according to the method of Inoue et al. (Blood, 88: 2267-2278, 1996), PCR was performed on WT1 and β-actin. The amount of template during PCR is R
Calculated from total RNA (2 μg / 30 μl) at the start of T reaction, 1
The reaction solution volume (2.5 μl) corresponding to 67 ng was
^The reaction mixture was set to ⁰ (1), and a 10-fold serially diluted RT reaction solution up to 10 ⁻⁵ (corresponding to 1.67 pg) was added to 50 μl of the PCR reaction system. The primer of WT1 used here is WT1
483 bp across exon 7 and exon 10 of the gene
The primer for β-actin is β-acti
540 bp flanking exon 1 and exon 3 of n gene
Area was used.

【００２７】反応時間については、ＷＴ１の場合３５サ
イクル、β-ａｃｔｉｎの場合１８サイクル繰り返し
た。増幅産物を４℃に保存した。得られたＰＣＲ反応液
（５０μｌ）から１２μｌを取り、３μｌの染色液を加
えた後、１．３％アガロースで電気泳動し、泳動終了
後、ゲルを０．５μｇ／mlのエチジュウムブロマイド
（０．５ｘＴＢＥ緩衝液）に浸し室温下で２５分染色し
た後、ＵＶトランスイルミネーター上で増幅断片を確認
すると共にポラロイド撮影装置（Polaroid MP/type667f
ilm）にて撮影した。結果は表１に示した。Ｋ５６２に
おけるＷＴ１発現量を１とした場合の相対感度はＲＴ−
ＰＣＲ法（ｃＤＮＡ希釈試験）から求めた値と近似する
結果が得られた。健常人検体ではその発現が認められ
ず、ＲＴ−ＰＣＲ法と同様１０^-5程度の感度差が得られ
た。The reaction time was repeated 35 cycles for WT1 and 18 cycles for β-actin. The amplification product was stored at 4 ° C. Take 12 μl of the obtained PCR reaction solution (50 μl), add 3 μl of the staining solution, and electrophorese with 1.3% agarose. After completion of the electrophoresis, the gel is subjected to 0.5 μg / ml ethidium bromide ( After immersion in 0.5 × TBE buffer and staining at room temperature for 25 minutes, the amplified fragment was confirmed on a UV transilluminator and a Polaroid MP / type667f was used.
ilm). The results are shown in Table 1. When the WT1 expression level in K562 is 1, the relative sensitivity is RT-
The result was similar to the value obtained from the PCR method (cDNA dilution test). No expression was observed in the sample from a healthy subject, and a sensitivity difference of about 10 ^-5 was obtained as in the RT-PCR method.

【００２８】[0028]

【表１】 表１．ＮＡＳＢＡ法によるＷＴ１ ｍＲＮＡの検出 RT-PCRによる感度 相対感度^* Sample WT-1 β-actin RT-PCR NASBA ───────────────────────────── K562 #1 ≦10^-5 10^-2 10⁰ 10⁰ U937 DE-4 10^-3 ≦10^-2 10^-3-10^-2 10^-2 健常人 PB ≧10⁰ 10^-2 ≦10^-5 ≦10^-5 ───────────────────────────── K562 #2 10^-4 10^-2 10⁰ 10⁰ 検体 No.1 BM 10^-1 10^-2 10^-4-10^-3 10^-3 No.2 PB 10⁰ ≦10^-2 ≦10^-4 10^-4 No.3 BM 10^-2 10^-2 10^-2 10^-2 No.4 PB ≧10⁰ 10^-2 ≦10^-5 ≦10^-5 ───────────────────────────── ＊ ＮＡＳＢＡ：Ｋ５６２の検出感度（ＲＮＡ１０pg/μl）を１０⁰（１）とし た場合の各サンプルの相対感度（発現量）で示した。 ＊ ＲＴ−ＰＣＲ：目視で各検体のβ―actin発現量とＫ５６２のβ―actin発現 量がほぼ一致するときのＷＴ１発現量の差から、検出感度を１０⁰（１）とした 場合の各サンプルの相対感度（発現量）を求めた。 ＰＢ：末梢血 ＢＭ：骨髄[Table 1] Table 1. Detection of WT1 mRNA by NASBA method Sensitivity by RT-PCR Relative sensitivity ^* Sample WT-1 β-actin RT-PCR NASBA ──────────────────────── ───── K562 # 1 ≤10 ^-5 10 ^-2 10 ⁰ 10 ⁰ U937 DE-4 10 ^-3 ≤10 ^-2 10 ^-3 -10 ^-2 10 ^-2 Healthy PB ≥10 ⁰ 10 ^-2 ≤ 10 ^-5 ≤10 ^-5 ───────────────────────────── K562 # 2 10 ^-4 10 ^-2 10 ⁰ 10 ⁰ Sample No.1 BM 10 ^-1 10 ^-2 10 ^-4 -10 ^-3 10 ^-3 No.2 PB 100 ⁰ ≤10 ^-2 ≤10 ^-4 10 ^-4 No.3 BM 10 ^-2 10 ^-2 10 ^-2 10 ^-2 No.4 PB ≧ 10 ⁰ 10 ^-2 ≦ 10 ^-5 ≦ 10 ^-5 ───────────────────────────── * NASBA: indicated by the detection sensitivity of K562 relative sensitivity of each sample in the case of (RNA10pg / μl) and 10 ⁰ (1) (expression level). * RT-PCR: each sample in the case of the difference of WT1 expression level when beta-actin expression level of each sample was visually and beta-actin expression amount of K562 almost coincide, the detection sensitivity and 10 ⁰ (1) Was determined for relative sensitivity (expression level). PB: peripheral blood BM: bone marrow

【００２９】実施例２ ［ＮＡＳＢＡ法による（外部標準合成ＲＮＡ 希釈
（半）定量系）各種検体のＷＴ１検出］ １）ＷＴ１外部標準用ＲＮＡ の合成 ＮＡＳＢＡ増幅領域を含むＷＴ１ ｃＤＮＡの一部をpS
P64（Promega）に組み込んだ３種類のプラスミド（pKS0
2,pK03及び pK06）を用いて合成ＲＮＡ(ｓＲＮＡ)をin
vitro合成した。即ち、これらのプラスミドＤＮＡを制
限酵素処理してｃＤＮＡの３’末端で切断してlinear f
ormとした後、MEGAscript kits を用いてＲＮＡを合成
した。プラスミド精製・ＲＮＡ合成はpKS02とpKS06が２
回、pKS03で３回実施し、得られたＲＮＡは変性ゲル電
気泳動で転写産物長を確認すると共に、定量時２６０ｎ
ｍの吸光度から各々のコピー数を算出した。測定時にこ
れらのｓＲＮＡを water で１〜５コピー／μl前後に希
釈し、外部標準として使用した。Example 2 [WT1 Detection of Various Samples by NASBA Method (External Standard Synthetic RNA Dilution (Semi) Quantitative System)] 1) Synthesis of WT1 External Standard RNA A part of the WT1 cDNA containing the NASBA amplification region was pS
Three types of plasmids (pKS0) integrated into P64 (Promega)
2, pK03 and pK06) to synthesize synthetic RNA (sRNA)
Synthesized in vitro. That is, these plasmid DNAs were treated with a restriction enzyme and cleaved at the 3 ′ end of the cDNA to obtain a linear DNA fragment.
After that, RNA was synthesized using MEGAscript kits. PKS02 and pKS06 for plasmid purification and RNA synthesis
3 times with pKS03, and the obtained RNA was transcribed by denaturing gel electrophoresis to confirm the length of the transcript.
Each copy number was calculated from the absorbance of m. At the time of measurement, these sRNAs were diluted to about 1 to 5 copies / μl with water and used as an external standard.

【００３０】２）検体 培養細胞Ｋ５６２を含む１０臨床検体についてＮＡＳＢ
Ａ法及びＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。 ３）測定 ＲＮＡを water で適宜希釈し、４０μlスケールでＮＡ
ＳＢＡ法による増幅反応を行った。検出はＮＡＳＢＡ産
物２０μlをＤＮＡプローブ自動分析装置（東洋紡製）
(日本臨床 自動化学会会誌：20巻、７１８頁、1995年）
にて測定した。各検体における検出感度（シグナルが検
出される最低濃度）と外部標準ｓＲＮＡの検出感度か
ら、検体ＲＮＡ１μｇあたりのＷＴ１発現量（コピー
数）を算出した。 ４）プライマー及びプローブは、配列番号１の１２〜３
１番のヌクレオチドよりなるプライマーと、配列番号２
の１９〜３８番のオリゴヌクレオチドよりなりその５’
末端にＴ７プロモーター配列を有するプライマー、およ
び配列番号３の８１〜１０５番および１１２〜１３２番
のオリゴヌクレオチドよりなるプローブを使用した。 ５）ＲＴ−ＰＣＲ法による測定は実施例１に従った。結
果は表２に示した。外部標準を用いるＮＡＳＢＡ法によ
るＷＴＩ検出はＲＴ−ＰＣＲに比べ低値での感度が優れ
ていた。2) Specimens NASB for 10 clinical specimens including cultured cells K562
A was measured by the A method and the RT-PCR method. 3) Measurement RNA is appropriately diluted with water, and NA is measured on a 40 μl scale.
An amplification reaction by the SBA method was performed. For detection, use 20 µl of the NASBA product with a DNA probe automatic analyzer (Toyobo)
(Journal of the Japan Society of Clinical Automation: Volume 20, page 718, 1995)
Was measured. The WT1 expression level (copy number) per 1 μg of the sample RNA was calculated from the detection sensitivity (minimum concentration at which a signal was detected) in each sample and the detection sensitivity of the external standard sRNA. 4) Primers and probes are 12 to 3 of SEQ ID NO: 1.
A primer consisting of the first nucleotide and SEQ ID NO: 2
5 'consisting of oligonucleotides 19 to 38
A primer having a T7 promoter sequence at the end and a probe consisting of oligonucleotides 81 to 105 and 112 to 132 of SEQ ID NO: 3 were used. 5) The measurement by the RT-PCR method followed Example 1. The results are shown in Table 2. The WTI detection by the NASBA method using an external standard was superior in sensitivity at a low value compared to RT-PCR.

【００３１】[0031]

【表２】 表２．ＮＡＳＢＡによるＷＴ１の測定 Sample WT-1 mRNA level(copies/μg) No. Tissue RT-PCR NASBA ─────────────────────── 1 PB ≦10² 10² 2 PB ≦10² 10^1.5 3 BM ≦10² 10^0.5 4 PB 10⁴ 10^4.5 5 BM 10^3.5 10⁴ 6 BM 10^4.5 10⁵ 7 BM 10^2.5 10² 8 PB 10⁴ 10^3.5 9 CL ≦10² 10^1.5 10 K562,CL 10^6.5 10⁶ ─────────────────────── PB：末梢血 BM：骨髄 CL：細胞株[Table 2] Table 2. WT1 measurement by NASBA Sample WT-1 mRNA level (copies / μg) No. Tissue RT-PCR NASBA ─────────────────────── 1 PB ≤ 10 ² 10 ² 2 PB ≦ 10 ² 10 ^1.5 3 BM ≦ 10 ² 10 ^0.5 4 PB 10 ⁴ 10 ^4.5 5 BM 10 ^3.5 10 ⁴ 6 BM 10 ^4.5 10 ⁵ 7 BM 10 ^2.5 10 ² 8 PB 10 ⁴ 10 ^3.5 9 CL ≦ 10 ² 10 ^1.5 10 K562, CL 10 ^6.5 10 ⁶ ─────────────────────── PB: peripheral blood BM: bone marrow CL: cell line

【００３２】実施例３ ［内部標準（ＱＡ）を用いたcompetitiveＮＡＳＢＡ法
によるＷＴ１ ｍＲＮＡの測定］ １） competitive ＮＡＳＢＡ competitorＲＮＡ（ＱＡ）の合成は以下のように行っ
た。増幅領域内の捕捉プローブ部分において、長さが同
じで配列だけが違うものを作製した。In vitro合成され
たＱＡを４０μlのＮＡＳＢＡ反応系に１０²，１０⁴、
１０⁶コピー加え、次いで検体ＲＮＡを各１μgずつ加え
た後、増幅反応を行った。増幅産物を水にて１００倍希
釈後、ＤＮＡプローブ自動分析装置で ＷＴ１／ＱＡ各
捕捉用マイクロプレートならびに検出プローブで測定
し、各シグナルの対数比（log（ＷＴ１/ＱＡ））を取
り、回帰式から発現量（コピー／μg）を算出した。
又、Ｋ５６２に対する相対感度は、Ｋ５６２全ＲＮＡ
２ロット、４サンプルの定量結果の平均値を基準に算出
した。 ２）検体 臨床検体２２検体を用いた。 ３）測定 実施例２に従って測定した。 ４）プライマー及びプローブ 実施例２と同様のものを使用した。 ５）ＲＴ−ＰＣＲ法 実施例１に従って実施した。結果は表３に示した。内部
標準を用いるcompetitive ＮＡＳＢＡ法によるＷＴＩ
検出はＲＮＡ単一量当たりの発現量をコピー数で捕える
ことができ、操作性、迅速性の点でも優れていた。Example 3 [Measurement of WT1 mRNA by competitive NASBA method using internal standard (QA)] 1) Synthesis of competitive NASBA competitor RNA (QA) was performed as follows. A capture probe portion in the amplification region having the same length but different sequence was prepared. In vitro-synthesized QA was added to 10 ² , 10 ⁴ ,
After adding 10 ⁶ copies and then adding 1 μg of each sample RNA, an amplification reaction was performed. After the amplification product was diluted 100 times with water, it was measured with a WT1 / QA capture microplate and a detection probe with a DNA probe automatic analyzer, and the logarithmic ratio (log (WT1 / QA)) of each signal was obtained, and the regression equation was obtained. Then, the expression level (copy / μg) was calculated.
The relative sensitivity to K562 was determined by K562 total RNA.
Calculated based on the average value of the quantitative results of two lots and four samples. 2) Samples 22 clinical samples were used. 3) Measurement Measured according to Example 2. 4) Primers and probes The same primers as in Example 2 were used. 5) RT-PCR method It carried out according to Example 1. The results are shown in Table 3. WTI by competitive NASBA method using internal standard
Detection was able to capture the expression level per RNA single quantity by copy number, and was excellent in operability and rapidity.

【００３３】[0033]

【表３】 表３． competitiveＮＡＳＢＡ法によるＷＴ１ ｍＲＮＡの測定 Sample competitive NASBA RT-PCR No. Tissue copies/μg 相対感度 相対感度 ──────────────────────────── 1 BM 10^4.66 10^-2.60 10^-3.52 2 PB 10^3.14 10^-4.12 10^-4.36 3 BM 10^5.32 10^-1.94 10^-0.42 4 BM 10^4.91 10^-2.35 10^-3.00 5 BM 10^3.17 10^-4.09 10^-3.66 6 BM 10^4.58 10^-2.68 10^-3.07 7 BM 10^4.89 10^-2.37 10^-2.74 8 PB 10^3.42 10^-3.84 10^-4.11 9 BM 10^5.39 10^-1.87 10^-2.17 10 PB 10^5.15 10^-2.11 10^-2.40 11 BM 10^4.90 10^-2.36 10^-2.89 12 BM 10^5.76 10^-1.50 10^-0.29 13 PB 10^5.16 10^-2.10 10^-1.66 14 PB 10^5.04 10^-2.22 10^-1.47 15 PB 10^3.23 10^-4.03 10^-4.09 16 BM 10^3.44 10^-3.82 17 BM 10^3.97 10^-3.29 10^-3.13 18 BM 10^4.43 10^-2.83 19 PB 10^4.95 10^-2.31 10^-1.47 20 BM 10^3.46 10^-3.80 21 BM 10^4.65 10^-2.61 10^-2.92 22 PB 10^4.31 10^-2.95 10^-2.72 K562(mean) 10^7.26 10⁰ 10⁰ ──────────────────────────── PB:末梢血 BM:骨髄[Table 3] Table 3. WT1 mRNA assay by competitive NASBA method Sample competitive NASBA RT-PCR No. Tissue copies / μg Relative sensitivity Relative sensitivity ─────────────────────────── ^{─ 1 BM 10 4.66 10 -2.60 10} -3.52 2 PB 10 3.14 10 -4.12 10 -4.36 3 BM 10 5.32 10 -1.94 10 -0.42 4 BM 10 4.91 10 -2.35 10 -3.00 5 BM 10 3.17 10 -4.09 10 - ^{3.66 6 BM 10 4.58 10 -2.68 10} -3.07 7 BM 10 4.89 10 -2.37 10 -2.74 8 PB 10 3.42 10 -3.84 10 -4.11 9 BM 10 5.39 10 -1.87 10 -2.17 10 PB 10 5.15 10 -2.11 10 - ^{2.40 11 BM 10 4.90 10 -2.36 10} -2.89 12 BM 10 5.76 10 -1.50 10 -0.29 13 PB 10 5.16 10 -2.10 10 -1.66 14 PB 10 5.04 10 -2.22 10 -1.47 15 PB 10 3.23 10 -4.03 10 - ^4.09 16 BM 10 ^3.44 10 ^-3.82 17 BM 10 ^3.97 10 ^-3.29 10 ^-3.13 18 BM 10 ^4.43 10 ^-2.83 19 PB 10 ^4.95 10 ^-2.31 10 ^-1.47 20 BM 10 ^3.46 10 ^-3.80 21 BM 10 ^4.65 10 ^-2.61 10 ^{-2.92 22 PB 10 4.31 10 -2.95 10} -2.72 K562 (mean) 10 7.26 10 0 10 0 ────────────────────── ───── PB: peripheral blood BM: bone marrow

【００３４】[0034]

【発明の効果】本発明の診断方法は迅速、簡便で操作性
の優れた高感度の白血病の遺伝子診断用キット及び診断
法である。Industrial Applicability The diagnostic method of the present invention is a rapid, simple, highly operable, highly sensitive kit for diagnosing leukemia and a diagnostic method.

【００３５】[0035]

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：８０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TGTGTGCTTA CCCAGGCTGC AATAAGAGAT ATTTTAAGCT GTCCCACTTA CAGATGCACA 60 GCAGGAAGCA CACTGGTGAG 80[Sequence List] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 80 Sequence type: Number of nucleic acid chains: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Sequence: TGTGTGCTTA CCCAGGCTGC AATAAGAGAT ATTTTAAGCT GTCCCACTTA CAGATGCACA 60 GCAGGAAGCA CACTGGTGAG 80

【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：８０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： ATGTTGTGAT GGCGGACTAA TTCATCTGAC CGGGCAAACT TTTTCTGACA ACTTGGCCAC 60 CGACAGCTGA AGGGCTTTTC 80Sequence number: 2 Sequence length: 80 Sequence type: Number of nucleic acid chains: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA sequence: ATGTTGTGAT GGCGGACTAA TTCATCTGAC CGGGCAAACT TTTTCTGACA ACTTGGCCAC 60 CGACAGCTGA AGGGCTTTTC 80

【００３７】配列番号：３ 配列の長さ：１８０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： AAACCATACC AGTGTGACTT CAAGGACTGT GAACGAAGGT TTTCTCGTTC AGACCAGCTC 60 AAAAGACACC AAAGGAGACA TACAGGTGTG AAACCATTCC AGTGTAAAAC TTGTCAGCGA 120 AAGTTCTCCC GGTCCGACCA CCTGAAGACC CACACCAGGA CTCATACAGG TAAAACAAGT 180SEQ ID NO: 3 Sequence length: 180 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence: AAACCATACC AGTGTGACTT CAAGGACTGT GAACGAAGGT TTTCTCGTTC AGACCAGCTC 60 AAAAGACACC AAAGGAGACA TACAGGTGTG AAACCATTCC AGTGTAAAAC TTGTCAGCGA 120 AAGTTCTCCC GGTCCGACCA CCTGAAGACC CACACCAGGA CTCATACAGG TAAAACAAGT 180

【００３８】配列番号：４ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAG 27SEQ ID NO: 4 Sequence length: 27 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence: AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAG 27

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 杉山 治夫 大阪府箕面市船場西２−19−30 (72)発明者 大野 紘宇 東京都渋谷区笹塚１−32−13 (72)発明者 林 司 静岡県伊東市八幡野291−１ (72)発明者 宝田 裕 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 瀬川 昌也 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 川口 竜二 東京都日野市新町五丁目６番50号 株式会 社エスアールエル遺伝子・染色体解析セン ター内 (72)発明者 小林 優 東京都日野市新町五丁目６番50号 株式会 社エスアールエル遺伝子・染色体解析セン ター内 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Haruo Sugiyama 2-19-30, Senba-nishi, Minoh-shi, Osaka (72) Inventor Kou Ohno 1-32-13 Sasazuka, Shibuya-ku, Tokyo (72) Inventor Tsukasa Hayashi 291-1 Yawata, Ito City, Shizuoka Prefecture (72) Inventor Hiroshi Takada 2-1-1 Katata, Otsu City, Shiga Prefecture Inside Toyobo Co., Ltd. Research Laboratory (72) Inventor Masaya Segawa 2-1-1 Katata, Otsu City, Shiga Prefecture No. 1 Toyobo Co., Ltd. Research Institute (72) Inventor Ryuji Kawaguchi 5-650 Shinmachi, Hino-shi, Tokyo Inside SRL Gene and Chromosome Analysis Center (72) Inventor Yu Kobayashi Shinmachi, Hino-shi, Tokyo Gochome 6-50, SRL Gene / Chromosome Analysis Center

Claims (17)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 配列番号１の塩基配列の中の連続する１
５〜３０塩基よりなるオリゴヌクレオチド、または該オ
リゴヌクレオチドにおいてその機能を失わない範囲で１
乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたオリゴ
ヌクレオチドよりなるＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Seque
nce-Based Amplification）法による白血病の遺伝子診
断用に用いられる核酸増幅用プライマー。(1) a sequence consisting of consecutive 1s in the base sequence of SEQ ID NO: 1;
An oligonucleotide consisting of 5 to 30 bases, or 1 as long as the function of the oligonucleotide is not lost;
NASBA (Nucleic Acid Sequence) consisting of an oligonucleotide in which a few bases are deleted, substituted or added
Primer for nucleic acid amplification used for genetic diagnosis of leukemia by the nce-based amplification method. 【請求項２】 オリゴヌクレオチドが配列番号１の１２
〜３１番もしくは４７〜６６番のオリゴヌクレオチド、
または該オリゴヌクレオチドにおいてその機能を失わな
い範囲で１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加さ
れたオリゴヌクレオチドである請求項１のプライマー。2. The oligonucleotide according to claim 1, wherein the oligonucleotide is 12
Oligonucleotides # 31 to # 47 or # 47 to # 66,
2. The primer according to claim 1, wherein the oligonucleotide is an oligonucleotide in which one to several bases have been deleted, substituted or added within a range not to lose its function. 【請求項３】 その５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列を有し、配列番号２の塩基配列の中の連
続する１５〜３０塩基よりなるオリゴヌクレオチド、ま
たは該オリゴヌクレオチドにおいてその機能を失わない
範囲で１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加され
たオリゴヌクレオチドよりなるＮＡＳＢＡ法による白血
病の遺伝子診断用に用いられる核酸増幅用プライマー。3. An oligonucleotide having a promoter sequence of RNA polymerase at its 5 ′ end and comprising 15 to 30 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or a range in which the function of the oligonucleotide is not lost 1. A primer for nucleic acid amplification used for genetic diagnosis of leukemia by the NASBA method comprising an oligonucleotide in which one or several bases have been deleted, substituted or added. 【請求項４】 オリゴヌクレオチドが配列番号２の１９
〜３８番もしくは５１〜７０番のオリゴヌクレオチド、
または該オリゴヌクレオチドにおいて１乃至数個の塩基
が欠失、置換若しくは付加されたオリゴヌクレオチドで
ある請求項３のプライマー。4. The oligonucleotide according to claim 1, wherein the oligonucleotide comprises
Oligonucleotides # 38 or # 51-70,
4. The primer according to claim 3, wherein the oligonucleotide is an oligonucleotide in which one to several bases are deleted, substituted or added. 【請求項５】 配列番号３の塩基配列の中の連続する１
５〜３０塩基よりなるオリゴヌクレオチド、または該オ
リゴヌクレオチドにおいてその機能を失わない範囲で１
乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたオリゴ
ヌクレオチドよりなるＮＡＳＢＡ法による白血病の遺伝
子診断用に用いられる核酸捕捉プローブ。5. A continuous 1 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
An oligonucleotide consisting of 5 to 30 bases, or 1 as long as the function of the oligonucleotide is not lost;
A nucleic acid capture probe comprising an oligonucleotide having several to three bases deleted, substituted or added and used for genetic diagnosis of leukemia by the NASBA method. 【請求項６】 オリゴヌクレオチドが配列番号３の８１
〜１０５番もしくは１１２〜１３２番のオリゴヌクレオ
チド、または該オリゴヌクレオチドにおいてその機能を
失わない範囲で１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは
付加されたオリゴヌクレオチドである請求項５のプロー
ブ。6. The oligonucleotide according to claim 6, wherein the oligonucleotide is 81 of SEQ ID NO: 3.
6. The probe according to claim 5, which is an oligonucleotide of Nos. 105 to 112 or 112 to 132, or an oligonucleotide in which one to several bases have been deleted, substituted or added within a range not losing its function. 【請求項７】 配列番号３の塩基配列の中の連続する１
５〜３０塩基よりなるオリゴヌクレオチド、または該オ
リゴヌクレオチドにおいてその機能を失わない範囲で１
乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたオリゴ
ヌクレオチドよりなるＮＡＳＢＡ法による白血病の遺伝
子診断用に用いられる核酸検出プローブ。7. A continuous 1 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
An oligonucleotide consisting of 5 to 30 bases, or 1 as long as the function of the oligonucleotide is not lost;
And a nucleic acid detection probe comprising an oligonucleotide having several to three bases deleted, substituted or added and used for genetic diagnosis of leukemia by the NASBA method. 【請求項８】 オリゴヌクレオチドが配列番号３の８１
〜１０５番もしくは１１２〜１３２番のオリゴヌクレオ
チド、または該オリゴヌクレオチドにおいてその機能を
失わない範囲で１乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは
付加されたオリゴヌクレオチドである請求項７のプロー
ブ。8. The oligonucleotide according to claim 8, wherein the oligonucleotide is 81 of SEQ ID NO: 3.
The probe according to claim 7, which is an oligonucleotide of Nos. 105 to 112 or 112 to 132, or an oligonucleotide in which one to several bases have been deleted, substituted or added within a range not losing its function. 【請求項９】 請求項１もしくは２および請求項３もし
くは４のプライマーを含むＮＡＳＢＡ法用核酸増幅用試
薬。9. A reagent for nucleic acid amplification for NASBA method, comprising the primer according to claim 1 or 2 and claim 3 or 4. 【請求項１０】 さらに請求項５もしくは６の捕捉プロ
ーブおよび請求項７もしくは８の検出プローブを含む請
求項９の試薬。10. The reagent according to claim 9, further comprising the capture probe according to claim 5 or 6 and the detection probe according to claim 7 or 8. 【請求項１１】 さらに、逆転写酵素、リボヌクレアー
ゼＨ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ｄＮ
ＴＰ、ｒＮＴＰおよび緩衝剤を含有する請求項９または
１０の試薬。11. Further, reverse transcriptase, ribonuclease H, DNA polymerase, RNA polymerase, dN
11. The reagent according to claim 9 or 10, comprising TP, rNTP and a buffer. 【請求項１２】 被検者より採取した試料を検体とし
て、白血病遺伝子ＷＴ１の塩基配列のエクソン７〜１０
に相当する配列の一部をフォワード・プライマー（forw
ard primer）とリバース・プライマー（reverse prim
er）によりＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based
Amplification）法で増幅させ、白血病患者の検体であ
る場合に増幅された白血病遺伝子ＷＴ１の塩基配列の一
部に相当するＲＮＡを捕捉・検出することにより白血病
であるとする白血病の特異的診断方法。12. A sample collected from a subject is used as a sample, and exons 7 to 10 of the base sequence of the leukemia gene WT1.
Part of the sequence corresponding to the forward primer (forw
ard primer) and reverse primer (reverse prim)
er) by NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based
(Amplification) A specific method for diagnosing leukemia as leukemia by capturing and detecting an RNA corresponding to a part of the base sequence of the leukemia gene WT1 when the sample is a leukemia patient sample. 【請求項１３】 捕捉・検出をＷＴ１の塩基配列のうち
の前記フォワード・プライマーとリバース・プライマー
の間に設定したプローブを利用して行うことを特徴とす
る請求項１２の診断方法。13. The diagnostic method according to claim 12, wherein the capture / detection is performed using a probe set between the forward primer and the reverse primer in the base sequence of WT1. 【請求項１４】 フォワード・プライマーが請求項１ま
たは２のプライマーである請求項１２または１３の診断
方法。14. The diagnostic method according to claim 12, wherein the forward primer is the primer according to claim 1 or 2. 【請求項１５】 リバース・プライマーが請求項３また
は４のプライマーである請求項１２〜１４のいずれか１
項の診断方法。15. The method according to claim 12, wherein the reverse primer is the primer according to claim 3 or 4.
Term diagnosis method. 【請求項１６】 捕捉プローブが請求項５または６のプ
ローブであり、検出用プローブが請求項７または８のプ
ローブである請求項１３の診断方法。16. The diagnostic method according to claim 13, wherein the capture probe is the probe according to claim 5 or 6, and the detection probe is the probe according to claim 7 or 8. 【請求項１７】 請求項１２〜１６のいずれか１項の診
断方法において、ＮＡＳＢＡ法で増幅する際に、内部標
準物質として阻害物質を共存させてＷＴ１を定量する方
法。17. The method for diagnosing WT1 in the diagnostic method according to claim 12, wherein an inhibitor is used as an internal standard in the amplification by the NASBA method.