JPH11253169A - Kit for gene diagnosis of leukemia - Google Patents
Kit for gene diagnosis of leukemiaInfo
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- JPH11253169A JPH11253169A JP10076502A JP7650298A JPH11253169A JP H11253169 A JPH11253169 A JP H11253169A JP 10076502 A JP10076502 A JP 10076502A JP 7650298 A JP7650298 A JP 7650298A JP H11253169 A JPH11253169 A JP H11253169A
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- primer
- leukemia
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は白血病を特異的且つ
高感度で迅速に検出・同定する遺伝子診断用キット及び
それを利用する遺伝子診断方法に関する。[0001] The present invention relates to a gene diagnosis kit for detecting and identifying leukemia quickly and specifically and with high sensitivity, and a gene diagnosis method using the kit.
【0002】[0002]
【従来の技術】白血病は造血器の代表的な悪性腫瘍で白
血病細胞がび漫性増殖を示す疾患である。主な治療法と
して化学療法が用いられており、その成績は近年著明な
進歩を遂げ、寛解率が70〜80%にも及んでいる。長
期生存者も年々増加しつつあるが再発例も少なくなく、
且つ正常細胞をも傷害する非特異的治療で種々の副作用
も存在する。2. Description of the Related Art Leukemia is a typical malignant tumor of the hematopoietic organ and is a disease in which leukemia cells show diffuse proliferation. Chemotherapy has been used as the main treatment, and the results have made remarkable progress in recent years, with remission rates ranging from 70 to 80%. The number of long-term survivors is increasing year by year, but there are many cases of recurrence,
In addition, there are various side effects due to non-specific treatment that also damages normal cells.
【0003】白血病の診断は従来から細胞化学を利用し
た特殊染色法を含む形態学観察によっているが、最近で
は免疫学的や遺伝子診断法等が取り入れられている。血
液細胞の染色に用いられているWright,Giemsa,May-Giem
sa染色では、Auer小体の出現例、急性前骨髄性白血
病症例を除くと白血病細胞の帰属決定が困難な例が少な
くない。最近細胞工学の進歩により白血病細胞のもつ各
種抗原に対するモノクローナル抗体が作製され免疫学的
方法によりAML細胞、ALL細胞、リンパ球の正確な
同定がなされ、細胞分化の程度を知る可能性がでてき
た。しかし正常な造血細胞においても膜表面抗原は認め
られ、白血病細胞の特異抗原となるものは非常に少な
く、免疫学的手法による診断の展開が困難になってい
る。そして、遺伝子工学の進展により、染色体や遺伝子
解析手段が疾患の診断、予後の予測、治療の正確な評価
に利用されるようになってきた。[0003] Diagnosis of leukemia has conventionally been based on morphological observation including a special staining method utilizing cytochemistry, but recently immunological and genetic diagnostic methods have been adopted. Wright, Giemsa, May-Giem used for blood cell staining
In sa staining, there are many cases where it is difficult to determine the assignment of leukemia cells except for the appearance of Auer bodies and acute promyelocytic leukemia. Recent advances in cell engineering have produced monoclonal antibodies against various antigens of leukemia cells, and the precise identification of AML cells, ALL cells, and lymphocytes has been made by immunological methods, and the possibility of knowing the degree of cell differentiation has emerged. . However, even on normal hematopoietic cells, membrane surface antigens are recognized, and there are very few specific antigens for leukemia cells, making it difficult to develop a diagnosis by immunological techniques. And, with the advance of genetic engineering, chromosome and gene analysis means have been used for diagnosis of disease, prediction of prognosis, and accurate evaluation of treatment.
【0004】一方、白血病では血液学的検査などの通常
の検査で腫瘍細胞が検出されない状態(完全寛解)でも
微量残存白血病細胞(Minimal Residual Disease:MR
D)が存在する場合が多い。このMRDの検出は治療効
果の判定、再発の早期診断とそれに基づく早期治療に役
立つ。当初、MRDの検出にPCR増幅法が利用された
が、数Kbを越える範囲で散在する染色体転座では普遍
的なプライマーを用いて切断点をはさんだ増幅ができな
かった。まもなく、逆転写酵素を用いてmRNAをcD
NAに変換したあと増幅するRT−PCRが考案され、
その適応が大きく広がった(Kawasaki,E.S., et. al.:P
roc.Natl.Acad.Sci.USA., 85:5698-5702, 1988)。On the other hand, in the case of leukemia, even when tumor cells are not detected by a normal test such as a hematological test (complete remission), a minimal residual leukemia cell (Minimal Residual Disease: MR)
D) is often present. This detection of MRD is useful for judging the therapeutic effect, for early diagnosis of recurrence, and for early treatment based on it. Initially, PCR amplification was used to detect MRD, but chromosomal translocations scattered over several Kb could not be amplified across breakpoints using universal primers. Soon, mRNA was converted to cD using reverse transcriptase.
RT-PCR that amplifies after converting to NA was devised,
The adaptation has been greatly expanded (Kawasaki, ES, et. Al .: P
roc.Natl.Acad.Sci.USA., 85: 5698-5702, 1988).
【0005】1994年 井上らは定量的RT−PCR
を用いて病型に関係なく、ほとんどすべての白血病細胞
において野生型WT1が高発現している事を示し、 W
T1が白血病の病態に重要な役割をしている事を示した
(Inoue,K.et.al., :Blood,84:3071-3079,1994)。[0005] 1994 Inoue et al. Quantitative RT-PCR
Shows that wild-type WT1 is highly expressed in almost all leukemia cells, regardless of the disease type.
It has been shown that T1 plays an important role in the pathogenesis of leukemia (Inoue, K. et. Al.,: Blood, 84: 3071-3079, 1994).
【0006】WT1遺伝子は小児腎臓病ウイルムス腫瘍
の主要遺伝子の一つとして単離されたがん抑制遺伝子で
あり、染色体11p13に存在し他の遺伝子の転写を調
節する機能を有し、泌尿生殖器の発生分化に関与してい
る。また、多種類の白血病においては普遍的に高発現し
ており、健常人とは明らかに有意差がある。 WT1遺
伝子は全長約50Kbで10個のエクソンからなる。エ
クソン7−10は各々1個ずつジンクフィンガードメイ
ンを持っている。[0006] The WT1 gene is a tumor suppressor gene isolated as one of the main genes of Wilms tumor of childhood renal disease. It is located on chromosome 11p13 and has the function of regulating the transcription of other genes. It is involved in development and differentiation. In addition, it is ubiquitously expressed in many types of leukemia, and there is a clear significant difference from healthy individuals. The WT1 gene is about 50 Kb in length and consists of 10 exons. Exons 7-10 each have one zinc finger domain.
【0007】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は迅速、
簡便で操作性の優れた高感度の白血病の特異的遺伝子診
断に用いられる核酸増幅用プライマー、核酸捕捉・検出
用プローブ、診断用キット法及び診断方法を提供するこ
とである。SUMMARY OF THE INVENTION The object of the present invention is rapid,
An object of the present invention is to provide a primer for nucleic acid amplification, a probe for nucleic acid capture / detection, a diagnostic kit method and a diagnostic method, which are used for a simple, highly operable and highly specific leukemia specific gene diagnosis.
【0008】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の目的
を達成するために、WT1mRNAの塩基配列の一部で
あるプライマー、及びプローブの検討を鋭意行い、本発
明を完成することが出来た。Means for Solving the Problems In order to achieve the above object, the present inventors have intensively studied primers and probes that are a part of the base sequence of WT1 mRNA, and have completed the present invention. Was.
【0009】即ち本発明は、配列番号1の塩基配列の中
の連続する15〜30塩基よりなるオリゴヌクレオチ
ド、または該オリゴヌクレオチドにおいてその機能を失
わない範囲で1乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付
加されたオリゴヌクレオチドよりなるNASBA(Nucl
eic Acid Sequence-Based Amplification)法による白
血病の遺伝子診断用に用いられる核酸増幅用プライマー
である。That is, the present invention relates to an oligonucleotide comprising 15 to 30 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or deleting one to several nucleotides in such an oligonucleotide as long as its function is not lost. NASBA comprising a substituted or added oligonucleotide (Nucl
It is a primer for nucleic acid amplification used for genetic diagnosis of leukemia by eic Acid Sequence-Based Amplification (Eic Acid Sequence-Based Amplification) method.
【0010】他の本発明は、その5’末端にRNAポリ
メラーゼのプロモーター配列を有し、配列番号2の塩基
配列の中の連続する15〜30塩基よりなるオリゴヌク
レオチド、または該オリゴヌクレオチドにおいてその機
能を失わない範囲で1乃至数個の塩基が欠失、置換若し
くは付加されたオリゴヌクレオチドよりなるNASBA
法による白血病の遺伝子診断用に用いられる核酸増幅用
プライマーである。Another aspect of the present invention relates to an oligonucleotide having a promoter sequence of RNA polymerase at its 5 'end and consisting of 15 to 30 contiguous bases in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or a function of the oligonucleotide. NASBA comprising an oligonucleotide in which one or several bases are deleted, substituted or added within a range not to lose
This is a primer for nucleic acid amplification used for genetic diagnosis of leukemia by the method.
【0011】更に他の本発明は、配列番号3の塩基配列
の中の連続する15〜30塩基よりなるオリゴヌクレオ
チド、または該オリゴヌクレオチドにおいてその機能を
失わない範囲で1乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは
付加されたオリゴヌクレオチドよりなるNASBA法に
よる白血病の遺伝子診断用に用いられる核酸捕捉プロー
ブまたは核酸検出プローブである。Still another object of the present invention is to provide an oligonucleotide consisting of 15 to 30 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, or to lack one to several nucleotides in the oligonucleotide so long as its function is not lost. It is a nucleic acid capture probe or a nucleic acid detection probe used for genetic diagnosis of leukemia by the NASBA method comprising a lost, substituted or added oligonucleotide.
【0012】更に他の本発明は、前記プライマーを含
み、必要に応じて前記捕捉プローブ、検出プローブを含
み、更に必要に応じて逆転写酵素、リボヌクレアーゼ
H、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、dNT
P、rNTPおよび緩衝剤を含むNASBA法用核酸増
幅用試薬である。[0012] Still another aspect of the present invention comprises the above-mentioned primers, if necessary, the above-mentioned capture probe and detection probe, and if necessary, reverse transcriptase, ribonuclease H, DNA polymerase, RNA polymerase, dNT.
It is a nucleic acid amplification reagent for NASBA method containing P, rNTP and a buffer.
【0013】更に他の本発明は、被検者より採取した試
料を検体として、白血病遺伝子WT1の塩基配列のエク
ソン7〜10に相当する配列の一部をフォワード・プラ
イマー(forward primer)とリバース・プライマー(r
everse primer)によりNASBA(Nucleic Acid Seq
uence-Based Amplification)法で増幅させ、白血病患
者の検体である場合に増幅された白血病遺伝子WT1の
塩基配列の一部に相当するRNAを捕捉・検出すること
により白血病であるとする白血病の特異的診断方法であ
る。In still another aspect of the present invention, a part of the sequence corresponding to exons 7 to 10 of the base sequence of the leukemia gene WT1 is obtained by using a sample collected from a subject as a specimen and a forward primer and a reverse primer. Primer (r
everse primer) with NASBA (Nucleic Acid Seq
uence-Based Amplification), and in the case of a sample of a leukemia patient, the leukemia specific leukemia is determined to be leukemia by capturing and detecting RNA corresponding to a part of the base sequence of the leukemia gene WT1 when the sample is a leukemia patient sample. This is a diagnostic method.
【0014】更に他の本発明は、前記診断方法におい
て、NASBA法で増幅する際に、内部標準物質として
阻害物質を共存させてWT1を定量する方法である。Still another aspect of the present invention is a method for quantifying WT1 in the above-mentioned diagnostic method in the presence of an inhibitor as an internal standard when amplifying by the NASBA method.
【0015】[0015]
【発明の実施の形態】NASBA法では、試料中の標的
核酸配列(RNA)に相補的な配列およびその5’末端
側にRNAポリメラーゼのプロモーター配列を有する第
1プライマーを試料中の標的核酸(RNA)にハイブリ
ダイズさせ、逆転写酵素によりDNAを合成し(工程
1)、RNA/DNAハイブリッドのRNAのみをリボ
ヌクレアーゼHにより分離して一本鎖DNA(第2鋳
型)を得(工程2)、ついで該一本鎖DNA(第2鋳
型)に標的核酸配列(DNA)に相補的な配列を有する
第2プライマーをハイブリダイズさせ、DNAポリメラ
ーゼにより伸長反応を行い、二本鎖DNAを得る(工程
3)。ついでプロモーター配列を認識するRNAポリメ
ラーゼを用いて、RNAのコピー(第3鋳型)を多数合
成する(工程4)。得られたRNA(第3鋳型)を鋳型
とし、逆転写酵素を使用した第2プライマーによるRN
A/DNAハイブリッドの合成(工程5)、リボヌクレ
アーゼHによるRNAのみを分離する一本鎖DNA(第
4鋳型)の合成(工程6)、得られた一本鎖DNA(第
4鋳型)を鋳型として、DNAポリメラーゼを使用した
第1プライマーによる二本鎖DNAの合成(工程7)、
RNAポリメラーゼを使用した該二本鎖DNAからRN
Aの多数コピー(第3鋳型)の合成(工程8)を行う。
これらの工程(工程5〜8)を繰り返すことにより、試
料中の核酸を増幅させることができる。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS In the NASBA method, a first primer having a sequence complementary to a target nucleic acid sequence (RNA) in a sample and a promoter sequence of an RNA polymerase at the 5 'end thereof is used as a target nucleic acid (RNA) in the sample. ), Synthesize DNA with reverse transcriptase (step 1), and separate only RNA of RNA / DNA hybrid with ribonuclease H to obtain single-stranded DNA (second template) (step 2). A second primer having a sequence complementary to the target nucleic acid sequence (DNA) is hybridized to the single-stranded DNA (second template), and an elongation reaction is performed with a DNA polymerase to obtain a double-stranded DNA (Step 3). . Next, a large number of RNA copies (third template) are synthesized using an RNA polymerase that recognizes the promoter sequence (step 4). Using the obtained RNA (third template) as a template, RN with a second primer using reverse transcriptase
Synthesis of A / DNA hybrid (step 5), synthesis of single-stranded DNA (fourth template) for separating only RNA by ribonuclease H (step 6), and using the obtained single-stranded DNA (fourth template) as a template Synthesis of double-stranded DNA with the first primer using DNA polymerase (Step 7),
RN from the double-stranded DNA using RNA polymerase
A multiple copy of A (third template) is synthesized (step 8).
By repeating these steps (steps 5 to 8), the nucleic acid in the sample can be amplified.
【0016】また別なNASBA法では、試料中の標的
核酸配列(DNA)に相補的な配列およびその5’末端
側にRNAポリメラーゼのプロモーター配列を有する第
1プライマーを試料中の標的核酸(DNA)にハイブリ
ダイズさせ、DNAポリメラーゼにより伸長させて二本
鎖DNAを合成し(工程1)、二本鎖DNAを分離して
一本鎖DNA(第2鋳型)を得(工程2)、ついで該一
本鎖DNA(第2鋳型)に標的核酸配列(DNA)に相
補的な配列を有する第2プライマーをハイブリダイズさ
せ、DNAポリメラーゼにより伸長反応を行い、二本鎖
DNAを得る(工程3)。ついでプロモーター配列を認
識するRNAポリメラーゼを用いて、RNAのコピー
(第3鋳型)を多数合成する(工程4)。得られたRN
A(第3鋳型)を鋳型とし、逆転写酵素を使用した第2
プライマーによるRNA/DNAハイブリッドの合成
(工程5)、リボヌクレアーゼHによるRNAのみを分
離する一本鎖DNA(第4鋳型)の合成(工程6)、得
られた一本鎖DNA(第4鋳型)を鋳型として、DNA
ポリメラーゼを使用した第1プライマーによる二本鎖D
NAの合成(工程7)、RNAポリメラーゼを使用した
該二本鎖DNAからRNAの多数コピー(第3鋳型)の
合成(工程8)を行う。これらの工程(工程5〜8)を
繰り返すことにより、試料中の核酸を増幅させることが
できる。In another NASBA method, a first primer having a sequence complementary to a target nucleic acid sequence (DNA) in a sample and an RNA polymerase promoter sequence at the 5 ′ end thereof is added to the target nucleic acid (DNA) in the sample. To obtain a single-stranded DNA (second template) by separating the double-stranded DNA (Step 2), and then separating the double-stranded DNA (Step 2). A second primer having a sequence complementary to the target nucleic acid sequence (DNA) is hybridized to the single-stranded DNA (second template), and an elongation reaction is performed with a DNA polymerase to obtain a double-stranded DNA (Step 3). Next, a large number of RNA copies (third template) are synthesized using an RNA polymerase that recognizes the promoter sequence (step 4). RN obtained
A (third template) as a template and the second using reverse transcriptase
Synthesis of RNA / DNA hybrid using primers (step 5), synthesis of single-stranded DNA (fourth template) for separating RNA only by ribonuclease H (step 6), and obtaining of single-stranded DNA (fourth template) DNA as a template
Double-stranded D with first primer using polymerase
Synthesis of NA (step 7) and synthesis of multiple copies of RNA (third template) from the double-stranded DNA using RNA polymerase (step 8). By repeating these steps (steps 5 to 8), the nucleic acid in the sample can be amplified.
【0017】本発明に用いられるプライマーとしてはガ
ン抑制遺伝子WT1のエクソン7〜10までに相当する
DNA又はRNAの塩基配列の一部を任意に選択して用
いる。WT1の構造に関しては文献に記載されている
(THE ONCOGENE Facts Book pp333-336)。プライマー
としては下記のものが好ましい。As the primer used in the present invention, a part of the nucleotide sequence of DNA or RNA corresponding to exons 7 to 10 of the cancer suppressor gene WT1 is arbitrarily selected and used. The structure of WT1 is described in the literature (THE ONCOGENE Facts Book pp333-336). The following primers are preferred.
【0018】第2プライマーとしては、配列番号1の塩
基配列の中の連続する15〜30塩基よりなるオリゴヌ
クレオチドが好ましく、特にその12〜31番もしくは
47〜66番よりなるオリゴヌクレオチドが好ましい。
第1プライマーとしては、その5’末端にRNAポリメ
ラーゼのプロモーター配列を有し、配列番号2の塩基配
列の中の連続する15〜30塩基よりなるオリゴヌクレ
オチドが好ましく、特にその19〜38番もしくは51
〜70番よりなるオリゴヌクレオチドが好ましい。RN
Aポリメラーゼのプロモーターとしては、例えば配列番
号4のT7プロモーターが例示できる。プロモーター配
列は複製開始点までのスペーサーを含んでいてもよく、
例えば 5'-AGGA-3' などの配列を必要に応じてプロモーター配列の3’末端
に結合していてもよい。なお、これらのオリゴヌクレオ
チドにおいてその機能を失わない範囲で1乃至数個の塩
基が欠失、置換若しくは付加されたオリゴヌクレオチド
も本発明の範囲内である。As the second primer, an oligonucleotide consisting of consecutive 15 to 30 bases in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is preferred, and an oligonucleotide consisting of the 12th to 31st or 47 to 66th is particularly preferred.
As the first primer, an oligonucleotide having a promoter sequence of RNA polymerase at its 5 ′ end and consisting of 15 to 30 consecutive nucleotides in the base sequence of SEQ ID NO: 2 is preferable, and particularly the 19th to 38th or 51st nucleotide is preferred.
Oligonucleotides consisting of # 70 to # 70 are preferred. RN
Examples of the A polymerase promoter include the T7 promoter of SEQ ID NO: 4. The promoter sequence may include a spacer up to the replication origin,
For example, a sequence such as 5'-AGGA-3 'may be linked to the 3' end of the promoter sequence, if necessary. Note that oligonucleotides in which one to several bases are deleted, substituted, or added within a range not losing the function of these oligonucleotides are also within the scope of the present invention.
【0019】また、捕捉・検出のためのプローブとして
は同様にWT1のエクソン7〜10までに相当するDN
A又はRNAの塩基配列の一部を任意に選択して用いる
が、20〜40ヌクレオチドの長さを持つプローブであ
ることが好ましく、配列番号3の塩基配列の中の連続す
る15〜30塩基よりなるオリゴヌクレオチドがより好
ましく、特に81〜105番もしくは112〜132番
よりなるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、これら
のオリゴヌクレオチドにおいてその機能を失わない範囲
で1乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたオ
リゴヌクレオチドも本発明の範囲内である。Similarly, probes corresponding to exons 7 to 10 of WT1 are used as probes for capture / detection.
A part of the nucleotide sequence of A or RNA is arbitrarily selected and used, but it is preferably a probe having a length of 20 to 40 nucleotides, and more than 15 to 30 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 Are more preferred, and particularly preferred are oligonucleotides consisting of Nos. 81-105 or 112-132. Oligonucleotides in which one to several bases have been deleted, substituted or added in such oligonucleotides as long as their functions are not lost are also within the scope of the present invention.
【0020】本発明に使用される検体は血清、尿、唾
液、喀痰、腹水、胸水、髄液、骨髄液、臓器切片又は末
梢血液いずれでも可能であるが、増幅に用いられる核酸
物質は不安定であるので、出来るだけ早く抽出工程に入
るのがよい。すぐに使用しない場合には−20℃以下又
は−80℃で保存し、核酸の分解を抑制する必要があ
る。The sample used in the present invention can be any of serum, urine, saliva, sputum, ascites, pleural effusion, cerebrospinal fluid, bone marrow fluid, organ sections or peripheral blood, but the nucleic acid substance used for amplification is unstable. Therefore, it is better to start the extraction process as soon as possible. When not used immediately, it is necessary to store at −20 ° C. or lower or at −80 ° C. to suppress nucleic acid degradation.
【0021】次に、核酸の抽出は基本的に酵素類の変性
処理としてフェノール処理を行った後、アルコール沈殿
することにより行うのが好ましい。この方法によれば核
酸濃縮と、核酸溶液中に存在するフェノール、塩、ヌク
レオチドの除去、緩衝液の交換を同時に早く行うことが
出来る。RNAはアルカリや温度の影響を受けやすく、
材料や実験者由来の分解酵素により、DNAに比較して
分解されやすい。動物由来の材料には分解酵素が比較的
多く含まれるので、直ちにRNAを抽出しない場合には
瞬間的に凍結するのが好ましい。また、解凍後はすぐに
リボヌクレアーゼ阻害剤が含まれる液に浸すのが好まし
い。抽出法は数多く開発され、簡便法(EDTA−SD
S−Phenol−Ethanol)、塩化リチウム−尿素法、プロ
テアーゼK−デオキシリボヌクレアーゼ法、フェノール
−SDS法、グアニジンチオシアネート−塩化セシウム
法、グアニジンチオシアネート−トリフルオロ酢酸セシ
ウム法、アシッドグアニジンチオシアネート−フェノー
ル−クロロホルム法(AGPC法)、バナジルリボヌク
レオシド複合法等があるが、本発明においては分解の少
ないRNAが得られるAGPC法が好ましい。Next, it is preferable that the nucleic acid is basically extracted by subjecting the enzyme to phenol treatment as a denaturation treatment, followed by alcohol precipitation. According to this method, the concentration of nucleic acid, the removal of phenol, salts and nucleotides present in the nucleic acid solution, and the replacement of the buffer can be simultaneously and quickly performed. RNA is susceptible to alkali and temperature,
It is easily degraded by DNA or by a decomposing enzyme derived from the experimenter as compared with DNA. Since animal-derived materials contain a relatively large amount of a degrading enzyme, it is preferable to freeze instantaneously if RNA is not immediately extracted. In addition, it is preferable to immerse immediately in a solution containing a ribonuclease inhibitor after thawing. Many extraction methods have been developed and a simple method (EDTA-SD
S-Phenol-Ethanol), lithium chloride-urea method, protease K-deoxyribonuclease method, phenol-SDS method, guanidine thiocyanate-cesium chloride method, guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method, acid guanidine thiocyanate-phenol-chloroform method ( AGPC method), a vanadyl ribonucleoside complex method, etc., and in the present invention, the AGPC method which can obtain RNA with little degradation is preferable.
【0022】本発明に用いるプライマーやプローブは前
記のとおりである。これらのヌクレオチドの合成は現
在、市販されているDNA/ RNA合成機を使用し、
それら合成機の合成条件に合わせて合成すれば、ほとん
ど問題ない。増幅効率をよくするためには、プライマー
の純度をよくすることが重要である。好ましくは合成さ
れたプライマーを液体クロマトで分画し、使用する。検
出用のプローブは検出方法によって異なってくる。ドッ
ト/サザンハイブリダイゼーションの場合、長さは20
〜40mer程度の長さがよい結果を示し、純度はさほ
ど高くなくとも良い。The primers and probes used in the present invention are as described above. The synthesis of these nucleotides currently uses a commercially available DNA / RNA synthesizer,
There is almost no problem if the synthesis is performed in accordance with the synthesis conditions of these synthesizers. In order to improve the amplification efficiency, it is important to improve the purity of the primer. Preferably, the synthesized primers are fractionated by liquid chromatography and used. The detection probe differs depending on the detection method. For dot / southern hybridization, the length is 20
A length of about 4040 mer shows good results, and the purity need not be very high.
【0023】NASBA法は他の測定法(PCR法(特
開昭60−281号公報参照)、RT−PCR法)と同様に
阻害物質を内部標準物質(competitor)として用いて遺
伝子を定量的に測定する事が可能である。competitorと
しては増幅部分中の捕捉プローブの配列部分を他の配列
に置換して使用することが良好な結果を得る為に重要で
ある。置換配列は長さがほぼ同じで相同性がないことが
好ましい。competitorは約1000mer程度のものが
好ましい。The NASBA method uses an inhibitor as an internal standard (competitor) to quantitatively analyze genes, similarly to other measurement methods (PCR method (see JP-A-60-281) and RT-PCR method). It is possible to measure. As a competitor, it is important to use the sequence portion of the capture probe in the amplification portion by substituting it with another sequence in order to obtain good results. Preferably, the replacement sequences are approximately the same length and have no homology. The competitor is preferably about 1000 mer.
【0024】[0024]
【実施例】次に、実施例をあげて更に詳細な説明をす
る。 実施例1 [NASBA法による各種検体中のWT1の検出]以下
に示す各検体からAGPC法による全RNA抽出を行
い、nuclease freewater(water)に溶解した。溶解後、
使用時まで−80℃に保存した。 1.培養細胞株 慢性骨髄性白血病細胞株 K562(RCB002
7) び慢性組織球リンパ腫細胞株 U937 DE4 (R
CBO435) 培地には10% FBS in Ham F12(K562),10%FBS in RPMI
1640(U937)を用い、CO2インキュベーターにて37
℃、5%CO2下の条件下で培養し、対数増殖期の細胞
をハーベストした。Next, a more detailed description will be given with reference to embodiments. Example 1 [Detection of WT1 in Various Samples by NASBA Method] Total RNA was extracted from each of the following samples by the AGPC method and dissolved in nuclease freewater (water). After dissolution,
Stored at -80 ° C until use. 1. Cultured cell line Chronic myeloid leukemia cell line K562 (RCB002
7) Chronic histiocytic lymphoma cell line U937 DE4 (R
CBO435) 10% FBS in Ham F12 (K562), 10% FBS in RPMI
Using 1640 (U937), 37 in CO 2 incubator
The cells were cultured under conditions of 5 ° C. and 5% CO 2 , and cells in the logarithmic growth phase were harvested.
【0025】2.ヒト単核球 正常ヒトリンパ球 健常人の末梢血約40mlから Ficoll-Paque(Pharma
cia)を用いてリンパ球を分離後、全RNAを抽出し
た。 検体 患者検体10検体からと同様にRNAを抽出した。 3.NASBA−dot hybridization 抽出した全RNAをwaterにて10段階希釈し、1pg/μ
l〜1μg/μlに濃度調整後、NASBA取扱説明書に従
いWT1 mRNA NASBAを行った。尚、本実施
例ではプライマーは配列番号1の12〜31番のヌクレ
オチドよりなるプライマーと、配列番号2の19〜38
番のオリゴヌクレオチドよりなりその5’末端にT7プ
ロモーター配列を有するプライマーを使用した。NAS
BA産物は検出時まで−20℃保存した。waterにて1
0倍希釈してdot blot hybridizationによる検出を行っ
た。hybridizationでは配列番号3の112〜132番
のオリゴヌクレオチドにアルカリフォスファターゼを標
識した検出プローブを用い、酵素反応時間は10分とし
た。2. Human mononuclear cells Normal human lymphocytes Ficoll-Paque (Pharma
After separating lymphocytes using cia), total RNA was extracted. Specimen RNA was extracted in the same manner as from 10 patient specimens. 3. NASBA-dot hybridization The extracted total RNA was diluted in 10 steps with water, and 1 pg / μ
After adjusting the concentration to 1 to 1 μg / μl, WT1 mRNA NASBA was performed according to the NASBA instruction manual. In this example, the primers were a primer consisting of nucleotides 12 to 31 of SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of nucleotides 19 to 38 of SEQ ID NO: 2.
A primer consisting of the oligonucleotide No. 5 and having a T7 promoter sequence at its 5 ′ end was used. NAS
BA products were stored at -20 ° C until detection. at water 1
After dilution by 0-fold, detection by dot blot hybridization was performed. In hybridization, a detection probe obtained by labeling oligonucleotides 112 to 132 of SEQ ID NO: 3 with alkaline phosphatase was used, and the enzyme reaction time was 10 minutes.
【0026】4.RT−PCR 井上らの方法(Blood,88:2267-2278,1996)に準じて全
RNA 2μgを逆転写後、WT1及びβ-actinに対す
るPCRをおこなった。PCR時のテンプレート量はR
T反応開始時の全RNA(2μg/30μl)から計算して1
67ngに相当する反応液量(2.5μl)を10
0(1)とし、最大10-5(1.67pg相当)まで連
続10倍希釈したRT反応液を50μlのPCR反応系
に加えた。ここで使用したWT1のプライマーはWT1
遺伝子のエクソン7及びエクソン10を挟む483bp
の領域用を、β-actinのプライマーはβ-acti
n遺伝子のエクソン1及びエクソン3を挟む540bp
の領域用を用いた。4. RT-PCR After reverse transcription of 2 μg of total RNA according to the method of Inoue et al. (Blood, 88: 2267-2278, 1996), PCR was performed on WT1 and β-actin. The amount of template during PCR is R
Calculated from total RNA (2 μg / 30 μl) at the start of T reaction, 1
The reaction solution volume (2.5 μl) corresponding to 67 ng was
The reaction mixture was set to 0 (1), and a 10-fold serially diluted RT reaction solution up to 10 −5 (corresponding to 1.67 pg) was added to 50 μl of the PCR reaction system. The primer of WT1 used here is WT1
483 bp across exon 7 and exon 10 of the gene
The primer for β-actin is β-acti
540 bp flanking exon 1 and exon 3 of n gene
Area was used.
【0027】反応時間については、WT1の場合35サ
イクル、β-actinの場合18サイクル繰り返し
た。増幅産物を4℃に保存した。得られたPCR反応液
(50μl)から12μlを取り、3μlの染色液を加
えた後、1.3%アガロースで電気泳動し、泳動終了
後、ゲルを0.5μg/mlのエチジュウムブロマイド
(0.5xTBE緩衝液)に浸し室温下で25分染色し
た後、UVトランスイルミネーター上で増幅断片を確認
すると共にポラロイド撮影装置(Polaroid MP/type667f
ilm)にて撮影した。結果は表1に示した。K562に
おけるWT1発現量を1とした場合の相対感度はRT−
PCR法(cDNA希釈試験)から求めた値と近似する
結果が得られた。健常人検体ではその発現が認められ
ず、RT−PCR法と同様10-5程度の感度差が得られ
た。The reaction time was repeated 35 cycles for WT1 and 18 cycles for β-actin. The amplification product was stored at 4 ° C. Take 12 μl of the obtained PCR reaction solution (50 μl), add 3 μl of the staining solution, and electrophorese with 1.3% agarose. After completion of the electrophoresis, the gel is subjected to 0.5 μg / ml ethidium bromide ( After immersion in 0.5 × TBE buffer and staining at room temperature for 25 minutes, the amplified fragment was confirmed on a UV transilluminator and a Polaroid MP / type667f was used.
ilm). The results are shown in Table 1. When the WT1 expression level in K562 is 1, the relative sensitivity is RT-
The result was similar to the value obtained from the PCR method (cDNA dilution test). No expression was observed in the sample from a healthy subject, and a sensitivity difference of about 10 -5 was obtained as in the RT-PCR method.
【0028】[0028]
【表1】 表1.NASBA法によるWT1 mRNAの検出 RT-PCRによる感度 相対感度* Sample WT-1 β-actin RT-PCR NASBA ───────────────────────────── K562 #1 ≦10-5 10-2 100 100 U937 DE-4 10-3 ≦10-2 10-3-10-2 10-2 健常人 PB ≧100 10-2 ≦10-5 ≦10-5 ───────────────────────────── K562 #2 10-4 10-2 100 100 検体 No.1 BM 10-1 10-2 10-4-10-3 10-3 No.2 PB 100 ≦10-2 ≦10-4 10-4 No.3 BM 10-2 10-2 10-2 10-2 No.4 PB ≧100 10-2 ≦10-5 ≦10-5 ───────────────────────────── * NASBA:K562の検出感度(RNA10pg/μl)を100(1)とし た場合の各サンプルの相対感度(発現量)で示した。 * RT−PCR:目視で各検体のβ―actin発現量とK562のβ―actin発現 量がほぼ一致するときのWT1発現量の差から、検出感度を100(1)とした 場合の各サンプルの相対感度(発現量)を求めた。 PB:末梢血 BM:骨髄[Table 1] Table 1. Detection of WT1 mRNA by NASBA method Sensitivity by RT-PCR Relative sensitivity * Sample WT-1 β-actin RT-PCR NASBA ──────────────────────── ───── K562 # 1 ≤10 -5 10 -2 10 0 10 0 U937 DE-4 10 -3 ≤10 -2 10 -3 -10 -2 10 -2 Healthy PB ≥10 0 10 -2 ≤ 10 -5 ≤10 -5 ───────────────────────────── K562 # 2 10 -4 10 -2 10 0 10 0 Sample No.1 BM 10 -1 10 -2 10 -4 -10 -3 10 -3 No.2 PB 100 0 ≤10 -2 ≤10 -4 10 -4 No.3 BM 10 -2 10 -2 10 -2 10 -2 No.4 PB ≧ 10 0 10 -2 ≦ 10 -5 ≦ 10 -5 ───────────────────────────── * NASBA: indicated by the detection sensitivity of K562 relative sensitivity of each sample in the case of (RNA10pg / μl) and 10 0 (1) (expression level). * RT-PCR: each sample in the case of the difference of WT1 expression level when beta-actin expression level of each sample was visually and beta-actin expression amount of K562 almost coincide, the detection sensitivity and 10 0 (1) Was determined for relative sensitivity (expression level). PB: peripheral blood BM: bone marrow
【0029】実施例2 [NASBA法による(外部標準合成RNA 希釈
(半)定量系)各種検体のWT1検出] 1)WT1外部標準用RNA の合成 NASBA増幅領域を含むWT1 cDNAの一部をpS
P64(Promega)に組み込んだ3種類のプラスミド(pKS0
2,pK03及び pK06)を用いて合成RNA(sRNA)をin
vitro合成した。即ち、これらのプラスミドDNAを制
限酵素処理してcDNAの3’末端で切断してlinear f
ormとした後、MEGAscript kits を用いてRNAを合成
した。プラスミド精製・RNA合成はpKS02とpKS06が2
回、pKS03で3回実施し、得られたRNAは変性ゲル電
気泳動で転写産物長を確認すると共に、定量時260n
mの吸光度から各々のコピー数を算出した。測定時にこ
れらのsRNAを water で1〜5コピー/μl前後に希
釈し、外部標準として使用した。Example 2 [WT1 Detection of Various Samples by NASBA Method (External Standard Synthetic RNA Dilution (Semi) Quantitative System)] 1) Synthesis of WT1 External Standard RNA A part of the WT1 cDNA containing the NASBA amplification region was pS
Three types of plasmids (pKS0) integrated into P64 (Promega)
2, pK03 and pK06) to synthesize synthetic RNA (sRNA)
Synthesized in vitro. That is, these plasmid DNAs were treated with a restriction enzyme and cleaved at the 3 ′ end of the cDNA to obtain a linear DNA fragment.
After that, RNA was synthesized using MEGAscript kits. PKS02 and pKS06 for plasmid purification and RNA synthesis
3 times with pKS03, and the obtained RNA was transcribed by denaturing gel electrophoresis to confirm the length of the transcript.
Each copy number was calculated from the absorbance of m. At the time of measurement, these sRNAs were diluted to about 1 to 5 copies / μl with water and used as an external standard.
【0030】2)検体 培養細胞K562を含む10臨床検体についてNASB
A法及びRT−PCR法により測定した。 3)測定 RNAを water で適宜希釈し、40μlスケールでNA
SBA法による増幅反応を行った。検出はNASBA産
物20μlをDNAプローブ自動分析装置(東洋紡製)
(日本臨床 自動化学会会誌:20巻、718頁、1995年)
にて測定した。各検体における検出感度(シグナルが検
出される最低濃度)と外部標準sRNAの検出感度か
ら、検体RNA1μgあたりのWT1発現量(コピー
数)を算出した。 4)プライマー及びプローブは、配列番号1の12〜3
1番のヌクレオチドよりなるプライマーと、配列番号2
の19〜38番のオリゴヌクレオチドよりなりその5’
末端にT7プロモーター配列を有するプライマー、およ
び配列番号3の81〜105番および112〜132番
のオリゴヌクレオチドよりなるプローブを使用した。 5)RT−PCR法による測定は実施例1に従った。結
果は表2に示した。外部標準を用いるNASBA法によ
るWTI検出はRT−PCRに比べ低値での感度が優れ
ていた。2) Specimens NASB for 10 clinical specimens including cultured cells K562
A was measured by the A method and the RT-PCR method. 3) Measurement RNA is appropriately diluted with water, and NA is measured on a 40 μl scale.
An amplification reaction by the SBA method was performed. For detection, use 20 µl of the NASBA product with a DNA probe automatic analyzer (Toyobo)
(Journal of the Japan Society of Clinical Automation: Volume 20, page 718, 1995)
Was measured. The WT1 expression level (copy number) per 1 μg of the sample RNA was calculated from the detection sensitivity (minimum concentration at which a signal was detected) in each sample and the detection sensitivity of the external standard sRNA. 4) Primers and probes are 12 to 3 of SEQ ID NO: 1.
A primer consisting of the first nucleotide and SEQ ID NO: 2
5 'consisting of oligonucleotides 19 to 38
A primer having a T7 promoter sequence at the end and a probe consisting of oligonucleotides 81 to 105 and 112 to 132 of SEQ ID NO: 3 were used. 5) The measurement by the RT-PCR method followed Example 1. The results are shown in Table 2. The WTI detection by the NASBA method using an external standard was superior in sensitivity at a low value compared to RT-PCR.
【0031】[0031]
【表2】 表2.NASBAによるWT1の測定 Sample WT-1 mRNA level(copies/μg) No. Tissue RT-PCR NASBA ─────────────────────── 1 PB ≦102 102 2 PB ≦102 101.5 3 BM ≦102 100.5 4 PB 104 104.5 5 BM 103.5 104 6 BM 104.5 105 7 BM 102.5 102 8 PB 104 103.5 9 CL ≦102 101.5 10 K562,CL 106.5 106 ─────────────────────── PB:末梢血 BM:骨髄 CL:細胞株[Table 2] Table 2. WT1 measurement by NASBA Sample WT-1 mRNA level (copies / μg) No. Tissue RT-PCR NASBA ─────────────────────── 1 PB ≤ 10 2 10 2 2 PB ≦ 10 2 10 1.5 3 BM ≦ 10 2 10 0.5 4 PB 10 4 10 4.5 5 BM 10 3.5 10 4 6 BM 10 4.5 10 5 7 BM 10 2.5 10 2 8 PB 10 4 10 3.5 9 CL ≦ 10 2 10 1.5 10 K562, CL 10 6.5 10 6 ─────────────────────── PB: peripheral blood BM: bone marrow CL: cell line
【0032】実施例3 [内部標準(QA)を用いたcompetitiveNASBA法
によるWT1 mRNAの測定] 1) competitive NASBA competitorRNA(QA)の合成は以下のように行っ
た。増幅領域内の捕捉プローブ部分において、長さが同
じで配列だけが違うものを作製した。In vitro合成され
たQAを40μlのNASBA反応系に102,104、
106コピー加え、次いで検体RNAを各1μgずつ加え
た後、増幅反応を行った。増幅産物を水にて100倍希
釈後、DNAプローブ自動分析装置で WT1/QA各
捕捉用マイクロプレートならびに検出プローブで測定
し、各シグナルの対数比(log(WT1/QA))を取
り、回帰式から発現量(コピー/μg)を算出した。
又、K562に対する相対感度は、K562全RNA
2ロット、4サンプルの定量結果の平均値を基準に算出
した。 2)検体 臨床検体22検体を用いた。 3)測定 実施例2に従って測定した。 4)プライマー及びプローブ 実施例2と同様のものを使用した。 5)RT−PCR法 実施例1に従って実施した。結果は表3に示した。内部
標準を用いるcompetitive NASBA法によるWTI
検出はRNA単一量当たりの発現量をコピー数で捕える
ことができ、操作性、迅速性の点でも優れていた。Example 3 [Measurement of WT1 mRNA by competitive NASBA method using internal standard (QA)] 1) Synthesis of competitive NASBA competitor RNA (QA) was performed as follows. A capture probe portion in the amplification region having the same length but different sequence was prepared. In vitro-synthesized QA was added to 10 2 , 10 4 ,
After adding 10 6 copies and then adding 1 μg of each sample RNA, an amplification reaction was performed. After the amplification product was diluted 100 times with water, it was measured with a WT1 / QA capture microplate and a detection probe with a DNA probe automatic analyzer, and the logarithmic ratio (log (WT1 / QA)) of each signal was obtained, and the regression equation was obtained. Then, the expression level (copy / μg) was calculated.
The relative sensitivity to K562 was determined by K562 total RNA.
Calculated based on the average value of the quantitative results of two lots and four samples. 2) Samples 22 clinical samples were used. 3) Measurement Measured according to Example 2. 4) Primers and probes The same primers as in Example 2 were used. 5) RT-PCR method It carried out according to Example 1. The results are shown in Table 3. WTI by competitive NASBA method using internal standard
Detection was able to capture the expression level per RNA single quantity by copy number, and was excellent in operability and rapidity.
【0033】[0033]
【表3】 表3. competitiveNASBA法によるWT1 mRNAの測定 Sample competitive NASBA RT-PCR No. Tissue copies/μg 相対感度 相対感度 ──────────────────────────── 1 BM 104.66 10-2.60 10-3.52 2 PB 103.14 10-4.12 10-4.36 3 BM 105.32 10-1.94 10-0.42 4 BM 104.91 10-2.35 10-3.00 5 BM 103.17 10-4.09 10-3.66 6 BM 104.58 10-2.68 10-3.07 7 BM 104.89 10-2.37 10-2.74 8 PB 103.42 10-3.84 10-4.11 9 BM 105.39 10-1.87 10-2.17 10 PB 105.15 10-2.11 10-2.40 11 BM 104.90 10-2.36 10-2.89 12 BM 105.76 10-1.50 10-0.29 13 PB 105.16 10-2.10 10-1.66 14 PB 105.04 10-2.22 10-1.47 15 PB 103.23 10-4.03 10-4.09 16 BM 103.44 10-3.82 17 BM 103.97 10-3.29 10-3.13 18 BM 104.43 10-2.83 19 PB 104.95 10-2.31 10-1.47 20 BM 103.46 10-3.80 21 BM 104.65 10-2.61 10-2.92 22 PB 104.31 10-2.95 10-2.72 K562(mean) 107.26 100 100 ──────────────────────────── PB:末梢血 BM:骨髄[Table 3] Table 3. WT1 mRNA assay by competitive NASBA method Sample competitive NASBA RT-PCR No. Tissue copies / μg Relative sensitivity Relative sensitivity ─────────────────────────── ─ 1 BM 10 4.66 10 -2.60 10 -3.52 2 PB 10 3.14 10 -4.12 10 -4.36 3 BM 10 5.32 10 -1.94 10 -0.42 4 BM 10 4.91 10 -2.35 10 -3.00 5 BM 10 3.17 10 -4.09 10 - 3.66 6 BM 10 4.58 10 -2.68 10 -3.07 7 BM 10 4.89 10 -2.37 10 -2.74 8 PB 10 3.42 10 -3.84 10 -4.11 9 BM 10 5.39 10 -1.87 10 -2.17 10 PB 10 5.15 10 -2.11 10 - 2.40 11 BM 10 4.90 10 -2.36 10 -2.89 12 BM 10 5.76 10 -1.50 10 -0.29 13 PB 10 5.16 10 -2.10 10 -1.66 14 PB 10 5.04 10 -2.22 10 -1.47 15 PB 10 3.23 10 -4.03 10 - 4.09 16 BM 10 3.44 10 -3.82 17 BM 10 3.97 10 -3.29 10 -3.13 18 BM 10 4.43 10 -2.83 19 PB 10 4.95 10 -2.31 10 -1.47 20 BM 10 3.46 10 -3.80 21 BM 10 4.65 10 -2.61 10 -2.92 22 PB 10 4.31 10 -2.95 10 -2.72 K562 (mean) 10 7.26 10 0 10 0 ────────────────────── ───── PB: peripheral blood BM: bone marrow
【0034】[0034]
【発明の効果】本発明の診断方法は迅速、簡便で操作性
の優れた高感度の白血病の遺伝子診断用キット及び診断
法である。Industrial Applicability The diagnostic method of the present invention is a rapid, simple, highly operable, highly sensitive kit for diagnosing leukemia and a diagnostic method.
【0035】[0035]
【配列表】 配列番号:1 配列の長さ:80 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列: TGTGTGCTTA CCCAGGCTGC AATAAGAGAT ATTTTAAGCT GTCCCACTTA CAGATGCACA 60 GCAGGAAGCA CACTGGTGAG 80[Sequence List] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 80 Sequence type: Number of nucleic acid chains: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Sequence: TGTGTGCTTA CCCAGGCTGC AATAAGAGAT ATTTTAAGCT GTCCCACTTA CAGATGCACA 60 GCAGGAAGCA CACTGGTGAG 80
【0036】配列番号:2 配列の長さ:80 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列: ATGTTGTGAT GGCGGACTAA TTCATCTGAC CGGGCAAACT TTTTCTGACA ACTTGGCCAC 60 CGACAGCTGA AGGGCTTTTC 80Sequence number: 2 Sequence length: 80 Sequence type: Number of nucleic acid chains: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA sequence: ATGTTGTGAT GGCGGACTAA TTCATCTGAC CGGGCAAACT TTTTCTGACA ACTTGGCCAC 60 CGACAGCTGA AGGGCTTTTC 80
【0037】配列番号:3 配列の長さ:180 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列: AAACCATACC AGTGTGACTT CAAGGACTGT GAACGAAGGT TTTCTCGTTC AGACCAGCTC 60 AAAAGACACC AAAGGAGACA TACAGGTGTG AAACCATTCC AGTGTAAAAC TTGTCAGCGA 120 AAGTTCTCCC GGTCCGACCA CCTGAAGACC CACACCAGGA CTCATACAGG TAAAACAAGT 180SEQ ID NO: 3 Sequence length: 180 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence: AAACCATACC AGTGTGACTT CAAGGACTGT GAACGAAGGT TTTCTCGTTC AGACCAGCTC 60 AAAAGACACC AAAGGAGACA TACAGGTGTG AAACCATTCC AGTGTAAAAC TTGTCAGCGA 120 AAGTTCTCCC GGTCCGACCA CCTGAAGACC CACACCAGGA CTCATACAGG TAAAACAAGT 180
【0038】配列番号:4 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列: AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAG 27SEQ ID NO: 4 Sequence length: 27 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence: AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAG 27
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 杉山 治夫 大阪府箕面市船場西2−19−30 (72)発明者 大野 紘宇 東京都渋谷区笹塚1−32−13 (72)発明者 林 司 静岡県伊東市八幡野291−1 (72)発明者 宝田 裕 滋賀県大津市堅田二丁目1番1号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 瀬川 昌也 滋賀県大津市堅田二丁目1番1号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 川口 竜二 東京都日野市新町五丁目6番50号 株式会 社エスアールエル遺伝子・染色体解析セン ター内 (72)発明者 小林 優 東京都日野市新町五丁目6番50号 株式会 社エスアールエル遺伝子・染色体解析セン ター内 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Haruo Sugiyama 2-19-30, Senba-nishi, Minoh-shi, Osaka (72) Inventor Kou Ohno 1-32-13 Sasazuka, Shibuya-ku, Tokyo (72) Inventor Tsukasa Hayashi 291-1 Yawata, Ito City, Shizuoka Prefecture (72) Inventor Hiroshi Takada 2-1-1 Katata, Otsu City, Shiga Prefecture Inside Toyobo Co., Ltd. Research Laboratory (72) Inventor Masaya Segawa 2-1-1 Katata, Otsu City, Shiga Prefecture No. 1 Toyobo Co., Ltd. Research Institute (72) Inventor Ryuji Kawaguchi 5-650 Shinmachi, Hino-shi, Tokyo Inside SRL Gene and Chromosome Analysis Center (72) Inventor Yu Kobayashi Shinmachi, Hino-shi, Tokyo Gochome 6-50, SRL Gene / Chromosome Analysis Center
Claims (17)
5〜30塩基よりなるオリゴヌクレオチド、または該オ
リゴヌクレオチドにおいてその機能を失わない範囲で1
乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたオリゴ
ヌクレオチドよりなるNASBA(Nucleic Acid Seque
nce-Based Amplification)法による白血病の遺伝子診
断用に用いられる核酸増幅用プライマー。(1) a sequence consisting of consecutive 1s in the base sequence of SEQ ID NO: 1;
An oligonucleotide consisting of 5 to 30 bases, or 1 as long as the function of the oligonucleotide is not lost;
NASBA (Nucleic Acid Sequence) consisting of an oligonucleotide in which a few bases are deleted, substituted or added
Primer for nucleic acid amplification used for genetic diagnosis of leukemia by the nce-based amplification method.
〜31番もしくは47〜66番のオリゴヌクレオチド、
または該オリゴヌクレオチドにおいてその機能を失わな
い範囲で1乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加さ
れたオリゴヌクレオチドである請求項1のプライマー。2. The oligonucleotide according to claim 1, wherein the oligonucleotide is 12
Oligonucleotides # 31 to # 47 or # 47 to # 66,
2. The primer according to claim 1, wherein the oligonucleotide is an oligonucleotide in which one to several bases have been deleted, substituted or added within a range not to lose its function.
ロモーター配列を有し、配列番号2の塩基配列の中の連
続する15〜30塩基よりなるオリゴヌクレオチド、ま
たは該オリゴヌクレオチドにおいてその機能を失わない
範囲で1乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加され
たオリゴヌクレオチドよりなるNASBA法による白血
病の遺伝子診断用に用いられる核酸増幅用プライマー。3. An oligonucleotide having a promoter sequence of RNA polymerase at its 5 ′ end and comprising 15 to 30 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or a range in which the function of the oligonucleotide is not lost 1. A primer for nucleic acid amplification used for genetic diagnosis of leukemia by the NASBA method comprising an oligonucleotide in which one or several bases have been deleted, substituted or added.
〜38番もしくは51〜70番のオリゴヌクレオチド、
または該オリゴヌクレオチドにおいて1乃至数個の塩基
が欠失、置換若しくは付加されたオリゴヌクレオチドで
ある請求項3のプライマー。4. The oligonucleotide according to claim 1, wherein the oligonucleotide comprises
Oligonucleotides # 38 or # 51-70,
4. The primer according to claim 3, wherein the oligonucleotide is an oligonucleotide in which one to several bases are deleted, substituted or added.
5〜30塩基よりなるオリゴヌクレオチド、または該オ
リゴヌクレオチドにおいてその機能を失わない範囲で1
乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたオリゴ
ヌクレオチドよりなるNASBA法による白血病の遺伝
子診断用に用いられる核酸捕捉プローブ。5. A continuous 1 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
An oligonucleotide consisting of 5 to 30 bases, or 1 as long as the function of the oligonucleotide is not lost;
A nucleic acid capture probe comprising an oligonucleotide having several to three bases deleted, substituted or added and used for genetic diagnosis of leukemia by the NASBA method.
〜105番もしくは112〜132番のオリゴヌクレオ
チド、または該オリゴヌクレオチドにおいてその機能を
失わない範囲で1乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは
付加されたオリゴヌクレオチドである請求項5のプロー
ブ。6. The oligonucleotide according to claim 6, wherein the oligonucleotide is 81 of SEQ ID NO: 3.
6. The probe according to claim 5, which is an oligonucleotide of Nos. 105 to 112 or 112 to 132, or an oligonucleotide in which one to several bases have been deleted, substituted or added within a range not losing its function.
5〜30塩基よりなるオリゴヌクレオチド、または該オ
リゴヌクレオチドにおいてその機能を失わない範囲で1
乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたオリゴ
ヌクレオチドよりなるNASBA法による白血病の遺伝
子診断用に用いられる核酸検出プローブ。7. A continuous 1 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
An oligonucleotide consisting of 5 to 30 bases, or 1 as long as the function of the oligonucleotide is not lost;
And a nucleic acid detection probe comprising an oligonucleotide having several to three bases deleted, substituted or added and used for genetic diagnosis of leukemia by the NASBA method.
〜105番もしくは112〜132番のオリゴヌクレオ
チド、または該オリゴヌクレオチドにおいてその機能を
失わない範囲で1乃至数個の塩基が欠失、置換若しくは
付加されたオリゴヌクレオチドである請求項7のプロー
ブ。8. The oligonucleotide according to claim 8, wherein the oligonucleotide is 81 of SEQ ID NO: 3.
The probe according to claim 7, which is an oligonucleotide of Nos. 105 to 112 or 112 to 132, or an oligonucleotide in which one to several bases have been deleted, substituted or added within a range not losing its function.
くは4のプライマーを含むNASBA法用核酸増幅用試
薬。9. A reagent for nucleic acid amplification for NASBA method, comprising the primer according to claim 1 or 2 and claim 3 or 4.
ーブおよび請求項7もしくは8の検出プローブを含む請
求項9の試薬。10. The reagent according to claim 9, further comprising the capture probe according to claim 5 or 6 and the detection probe according to claim 7 or 8.
ゼH、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、dN
TP、rNTPおよび緩衝剤を含有する請求項9または
10の試薬。11. Further, reverse transcriptase, ribonuclease H, DNA polymerase, RNA polymerase, dN
11. The reagent according to claim 9 or 10, comprising TP, rNTP and a buffer.
て、白血病遺伝子WT1の塩基配列のエクソン7〜10
に相当する配列の一部をフォワード・プライマー(forw
ard primer)とリバース・プライマー(reverse prim
er)によりNASBA(Nucleic Acid Sequence-Based
Amplification)法で増幅させ、白血病患者の検体であ
る場合に増幅された白血病遺伝子WT1の塩基配列の一
部に相当するRNAを捕捉・検出することにより白血病
であるとする白血病の特異的診断方法。12. A sample collected from a subject is used as a sample, and exons 7 to 10 of the base sequence of the leukemia gene WT1.
Part of the sequence corresponding to the forward primer (forw
ard primer) and reverse primer (reverse prim)
er) by NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based
(Amplification) A specific method for diagnosing leukemia as leukemia by capturing and detecting an RNA corresponding to a part of the base sequence of the leukemia gene WT1 when the sample is a leukemia patient sample.
の前記フォワード・プライマーとリバース・プライマー
の間に設定したプローブを利用して行うことを特徴とす
る請求項12の診断方法。13. The diagnostic method according to claim 12, wherein the capture / detection is performed using a probe set between the forward primer and the reverse primer in the base sequence of WT1.
たは2のプライマーである請求項12または13の診断
方法。14. The diagnostic method according to claim 12, wherein the forward primer is the primer according to claim 1 or 2.
は4のプライマーである請求項12〜14のいずれか1
項の診断方法。15. The method according to claim 12, wherein the reverse primer is the primer according to claim 3 or 4.
Term diagnosis method.
ローブであり、検出用プローブが請求項7または8のプ
ローブである請求項13の診断方法。16. The diagnostic method according to claim 13, wherein the capture probe is the probe according to claim 5 or 6, and the detection probe is the probe according to claim 7 or 8.
断方法において、NASBA法で増幅する際に、内部標
準物質として阻害物質を共存させてWT1を定量する方
法。17. The method for diagnosing WT1 in the diagnostic method according to claim 12, wherein an inhibitor is used as an internal standard in the amplification by the NASBA method.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10076502A JPH11253169A (en) | 1998-03-10 | 1998-03-10 | Kit for gene diagnosis of leukemia |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10076502A JPH11253169A (en) | 1998-03-10 | 1998-03-10 | Kit for gene diagnosis of leukemia |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11253169A true JPH11253169A (en) | 1999-09-21 |
Family
ID=13607019
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10076502A Pending JPH11253169A (en) | 1998-03-10 | 1998-03-10 | Kit for gene diagnosis of leukemia |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH11253169A (en) |
-
1998
- 1998-03-10 JP JP10076502A patent/JPH11253169A/en active Pending
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