JPH11243961A - New catalase, gene of the same, and composition containing the same, and preparation of catalase by genetic engineering - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a gene (1) which is cloned from a specific bacterium with 5'- and 3'-primers synthesized from 5'- and 3'-terminal DNA sequences of a catalase gene of a specific bacterium, and (2) which expresses a new catalase which is useful to decompose H2 O2 remaining in a disinfectant for contact lens. SOLUTION: This gene is a new catalase gene cloned from Bacillus thermoglucosidasius (ATCC 43742) with proper 5'- and 3'-primers synthesized from 5'- and 3'-terminal DNA sequences of a catalase gene (kat 19) of B. subtilis YB 2003. The new active catalase having the amino acid sequence of the formula is obtained in a high yield by inserting the gene into an appropriate vector, transforming an appropriate host, cell, followed by expressing the gene.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なカタラー
ゼ、該カタラーゼの使用、及び該カタラーゼを調製する
方法に係わる。本発明は特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈ
ｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓからクローン化さ
れた新規なカタラーゼ、該カタラーゼを含有する組成
物、並びにカタラーゼを高収率で調製する方法であっ
て、遺伝子工学技術を用いてカタラーゼ遺伝子をクロー
ン化すること、発現ベクターを構築すること、及び宿主
細胞を形質転換することを含む方法に係わる。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel catalase, use of the catalase, and a method for preparing the catalase. The invention is particularly directed to Bacillus th
A novel catalase cloned from E. thermoglucosidasius, a composition containing the catalase, and a method for preparing catalase in high yield, wherein the catalase gene is cloned using genetic engineering techniques, and an expression vector is constructed. And transforming the host cell.

【０００２】[0002]

【従来の技術】殺菌、清浄化、漂白及び消毒活性を有す
る過酸化水素は通常コンタクトレンズ消毒薬及び繊維材
料漂白剤中に用いられ、合法の食品添加物として認めら
れてもいる。しかし、過酸化水素は高い反応性を有する
遊離酸素を発生しがちであることが知られており、前記
酸素の強力な酸化作用はタンパク質の変性を惹起する。
従って、過酸化水素を用いてコンタクトレンズを消毒
し、または繊維材料を漂白した後には残留する過酸化水
素を分解して、使用者が望ましくない損傷を被らないよ
うにしなければならない。BACKGROUND OF THE INVENTION Hydrogen peroxide having disinfecting, cleaning, bleaching and disinfecting activities is commonly used in contact lens disinfectants and textile bleaching agents and is also recognized as a legitimate food additive. However, it is known that hydrogen peroxide tends to generate highly reactive free oxygen, and the strong oxidizing action of the oxygen causes protein denaturation.
Therefore, contact lenses must be disinfected with hydrogen peroxide or the residual hydrogen peroxide must be decomposed after bleaching the fibrous material to prevent undesired damage to the user.

【０００３】そのために、当業者はしばしばカタラーゼ
を用いて過酸化水素残留物を分解し、この方法は通常最
も有効と認められてもいる。例えば米国特許第４，５８
５，４８８号、同第５，１４５，６４４号、同第５，３
６２，６４７号及び同第５，５２１，０９１号に開示さ
れた、コンタクトレンズの消毒薬中に残存する過酸化水
素を分解する方法では、消毒作業時にカタラーゼを添加
する。また、英国特許出願公開第２２１６１４９号及び
ＪＰ−Ａ−１０４７８１は、過酸化水素で漂白した基布
（ｔｅｘｔｉｌｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を更にカタラ
ーゼで処理し、それによって染色ステップの前に過酸化
水素残留物を分解するべきであることを教示している。[0003] To this end, those skilled in the art often use catalase to decompose hydrogen peroxide residues, and this method is also generally recognized as the most effective. For example, U.S. Pat.
No. 5,488, No. 5,145,644, No. 5,3
In the method disclosed in 62,647 and 5,521,091 for decomposing hydrogen peroxide remaining in a disinfectant for contact lenses, catalase is added during disinfection. Also, GB-A-2216149 and JP-A-104781 teach that a textile substrate bleached with hydrogen peroxide is further treated with catalase, thereby decomposing the hydrogen peroxide residue before the dyeing step. Teaches what to do.

【０００４】カタラーゼ［過酸化水素酸化還元酵素（Ｅ
Ｃ １．１１．１．６）］は、２個の過酸化水素分子
（Ｈ₂Ｏ₂）の、酸化による１個の酸素分子（Ｏ₂）への
変換及び還元による２個の水分子（Ｈ₂Ｏ）への変換を
触媒する酵素である。触媒反応は次のとおりである。Catalase [hydrogen peroxide oxidoreductase (E
C 1.11.1.6)] converts two hydrogen peroxide molecules (H ₂ O ₂ ) into one oxygen molecule (O ₂ ) by oxidation and two water molecules (H ₂ O ₂ ) by reduction. It is an enzyme that catalyzes the conversion to H ₂ O). The catalytic reaction is as follows.

【０００５】[0005]

【化１】 Embedded image

【０００６】カタラーゼは或る種の動物、植物及び微生
物細胞に存在し、前記細胞が好気的環境で生存するのに
必要な酵素である。現在入手可能なカタラーゼはほぼ総
てが上記細胞からの精製によって得られ、それらの中で
特にウシ肝臓由来のカタラーゼが、先に述べた目的のた
めに最も好ましいものであった。しかし、１９９０年、
ＢＳＥ（ウシ海綿状脳症）として知られる慢性ウイルス
疾患がヨーロッパの牧牛（ｃａｔｔｌｅ ｈｅｒｄｓ）
の間に突発した。最近の研究によって、上記疾患にはヒ
トも感染する恐れが有ることが明らかとなった［Ｄｅｌ
ｌａｒ及びＬａｃｅｙ， Ｎｕｔｒ． Ｈｅａｌｔｈ
（Ｂｉｃｅｓｔｅｒ） ７， ｐｐ．１１７−１３４，
１９９１； Ｄｅａｌｌｅｒ及びＬａｃｅｙ， Ｆｏ
ｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７， ｐｐ．２５３−２
８０， １９９０］。従って、工業的用途のためにウシ
肝カタラーゼに替えて微生物ソース由来などの、哺乳動
物以外に由来するカタラーゼを見出せれば有利である。Catalase is present in certain animal, plant and microbial cells and is an enzyme necessary for the cells to survive in an aerobic environment. Nearly all currently available catalase was obtained by purification from the cells, of which catalase, especially from bovine liver, was the most preferred for the purpose mentioned above. However, in 1990,
A chronic viral disease known as BSE (bovine spongiform encephalopathy) has caused cattle herds in Europe.
Broke out between. Recent studies have shown that humans can be infected with the disease [Del
lar and Racey, Nutr. Health
(Bicester) 7 pp. 117-134,
1991; Dealer and Racey, Fo
od Microbiol. 7 , pp. 253-2
80, 1990]. Therefore, it would be advantageous to find catalase derived from sources other than mammals, such as from a microbial source, instead of bovine liver catalase for industrial use.

【０００７】発酵によるカタラーゼ調製に用いられてい
る微生物に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｐ
ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ等が含まれる。例えば、米国
特許第３，１２３，５３９号にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｇｅｒ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａ
ｔｕｍなどの真菌に由来するカタラーゼが開示されてお
り、米国特許第２，６３５，０６９号、同第５，３６
０，７３２号及び国際特許出願公開第９３／１７７２１
号にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒから生じた
カタラーゼが開示されており、また米国特許第５，５２
１，０９１号にはＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ
及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに由来するカ
タラーゼが開示されている。上記諸特許中に教示された
カタラーゼは、微生物を発酵させ、細胞体を破壊し、そ
の後粗な抽出物を精製することを含む通常の方法で調製
される。[0007] Microorganisms used for the preparation of catalase by fermentation include Aspergillus niger , P
enicillium notatum , Microc
occus luteus and the like. For example, U.S. Pat. No. 3,123,539 describes Aspergillus.
s niger and Penicillium nota
and catalase derived are disclosed in fungi such as tum, U.S. Patent No. 2,635,069, the first 5,36
0,732 and WO 93/17721.
Discloses catalase from Aspergillus niger and is disclosed in US Pat.
Micrococcusluteus in the 1,091
And catalase from Aspergillus niger are disclosed. The catalase taught in the above patents is prepared by conventional methods, including fermenting microorganisms, destroying cell bodies, and then purifying the crude extract.

【０００８】しかし、上記のような発酵法で調製される
カタラーゼの収率は十分なものではない。例えば、米国
特許第３，１２３，５３９号にはＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕ
ｓｌｕｔｅｕｓの細胞体（湿潤重量９５ｌｂ．）から回
収した１０００ｇのタンパク質産物から５％のカタラー
ゼしか得られないことが開示されているし、米国特許第
２，６３５，０６９号はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｇｅｒの作用から得られる粗なタンパク質抽出物が１ｇ
当たり２．４単位のカタラーゼ活性しか有しないことを
教示している。カタラーゼ収率を改善するべく、米国特
許第５，３６０，７３２号では新規なＡｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｎｉｇｅｒ株の作製が試みられ、その結果得ら
れた触媒活性は粗なタンパク質抽出物１ｍｇ当たり１
４．１７単位である。国際特許出願公開第９３／１７７
２１号の表１に示されたデータによれば、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの比活性は１μｇ当たり約７．
５単位である。上記１４．１７単位の活性は１．９μｇ
のカタラーゼによってもたらされると計算される。換言
すれば、米国特許第５，３６０，７３２号で得られた粗
なタンパク質抽出物は０．２％未満のカタラーゼしか含
有しない。However, the yield of catalase prepared by the above fermentation method is not sufficient. For example, US Pat. No. 3,123,539 describes Micrococcu.
Cell bodies sluteus be (wet weight 95lb.) obtained only 5% of the catalase from the protein product of the recovered 1000g from being disclosed, U.S. Patent No. 2,635,069 Aspergillus ni
1 g of crude protein extract obtained from the action of ger
It teaches that it has only 2.4 units of catalase activity per unit. To improve catalase yield, US Patent No. 5,360,732 discloses a novel Aspergil.
rus niger strain was attempted, and the resulting catalytic activity was 1 / mg of crude protein extract.
4.17 units. International Patent Application Publication No. 93/177
According to the data shown in Table 1 of No. 21, Asperg
The specific activity of illus niger is about 7.
5 units. The activity of the above 14.17 units is 1.9 μg.
Of catalase. In other words, the crude protein extract obtained in US Pat. No. 5,360,732 contains less than 0.2% catalase.

【０００９】Ｓｈｕｉｃｈｉ Ｆｕｒｕｔａ及びＨｉｒ
ｏａｋｉ ＨａｙａｓｈｉはＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １
０７， ｐｐ．７０８−７１３， １９９０に、遺伝子
工学技術を用いての組み換えカタラーゼ遺伝子の発現を
開示している。しかし、産生されるカタラーゼの収率は
高くなく、更に精製する前は１６ｍｇ／４ｌでしかな
い。[0009] Shuichi Furuta and Hir
oaki Hayashi is J. Biochem. 1
07 pp. 708-713, 1990 discloses expression of a recombinant catalase gene using genetic engineering techniques. However, the yield of catalase produced is not high, only 16 mg / 4l before further purification.

【００１０】[0010]

【発明が解決しようとする課題】上述のように、当分野
で現在用いられているカタラーゼをそのソースと調製方
法との両方において改良する必要性は依然として存在す
る。As noted above, there is still a need to improve the catalase currently used in the art, both in its source and in its method of preparation.

【００１１】従って本発明は、新規なカタラーゼをクロ
ーン化することを目的とする。[0011] Accordingly, an object of the present invention is to clone a novel catalase.

【００１２】本発明は更に、微生物由来のカタラーゼを
遺伝子工学技術を用いて調製する方法を提供することも
目的とする。本発明によれば、カタラーゼを高収率で取
得できるのみでなく、得られたカタラーゼは優れた活性
を示し得る。Another object of the present invention is to provide a method for preparing catalase derived from a microorganism by using genetic engineering technology. According to the present invention, not only can catalase be obtained in high yield, but the obtained catalase can exhibit excellent activity.

【００１３】本発明は、本発明の上記方法実施の途上で
構築する新規な組み換えプラスミド及び新規な形質転換
細胞の提供も目的とする。Another object of the present invention is to provide a novel recombinant plasmid and a novel transformed cell constructed in the course of carrying out the above method of the present invention.

【００１４】本発明の新規なカタラーゼを含有する、コ
ンタクトレンズ上に残存する残留消毒薬中の過酸化水素
の分解に有用な組成物を提供することも本発明の目的で
ある。It is also an object of the present invention to provide a composition containing the novel catalase of the present invention, which is useful for decomposing hydrogen peroxide in a residual disinfectant remaining on a contact lens.

【００１５】[0015]

【課題を解決するための手段、及び発明の実施の形態】
本明細書の最初に、本発明と看做されるものを特定し、
かつそれについて明確に特許請求する特許請求の範囲各
項を挙げてあるが、本発明とその実施例に関する以下の
詳細な説明を読めば本発明をより良く理解できると考え
られる。Means for Solving the Problems and Embodiments of the Invention
At the outset of this specification, identify what is considered to be the invention,
While the following claims are hereby expressly recited, it is believed that the following detailed description of the invention and embodiments thereof will provide a better understanding of the invention.

【００１６】本発明の新規なカタラーゼ遺伝子は、Ｂｏ
ｌ及びＹａｓｈｉｎ， Ｇｅｎｅ１０９， ｐｐ．３１
−３７， １９９１に開示された枯草菌のカタラーゼ遺
伝子（ｋａｔ １９）の５′末端及び３′末端ＤＮＡ配
列から合成した適正な５′及び３′プライマーを用いて
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓ
ｉｕｓからクローン化する。得られた遺伝子を配列決定
したところ図５に示した配列が得られ、この遺伝子のｋ
ａｔ １９遺伝子との類似性は７４．４％である。本発
明の遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、このベクタ
ーで適当な宿主細胞を形質転換し、その後宿主細胞にお
いて前記遺伝子を発現させることにより、図６に示した
アミノ酸配列を有する本発明の新規なカタラーゼを得る
ことができる。本発明の提供する新規なカタラーゼはい
ずれの文献にも決して開示されていない。The novel catalase gene of the present invention is Bo Bo
1 and Yashin, Gene 109 , pp. 139-157 . 31
-37, 1991, using the appropriate 5 'and 3' primers synthesized from the 5 'and 3' end DNA sequences of the Bacillus subtilis catalase gene (kat 19).
Bacillus thermoglucosidas
clone from ius . When the obtained gene was sequenced, the sequence shown in FIG. 5 was obtained.
The similarity with the at19 gene is 74.4%. By inserting the gene of the present invention into an appropriate expression vector, transforming an appropriate host cell with the vector, and then expressing the gene in the host cell, the novel gene of the present invention having the amino acid sequence shown in FIG. Catalase can be obtained. The novel catalase provided by the present invention has never been disclosed in any literature.

【００１７】本発明は、遺伝子工学技術を用いてカタラ
ーゼを調製する方法も提供し、この方法は（ａ）適正な
転写プロモーターを有する発現ベクターにカタラーゼを
コードする遺伝子を挿入することによって組み換えプラ
スミドを構築し、（ｂ）前記組み換えプラスミドで適正
な宿主細胞を形質転換し、（ｃ）得られた形質転換細胞
を該細胞におけるカタラーゼ遺伝子の発現に適した条件
下に培養し、（ｄ）発現されたカタラーゼタンパク質を
精製することを含む。The present invention also provides a method for preparing catalase using genetic engineering techniques, which comprises the steps of (a) inserting a gene encoding catalase into an expression vector having an appropriate transcription promoter to convert a recombinant plasmid; Constructing, (b) transforming an appropriate host cell with the recombinant plasmid, (c) culturing the resulting transformed cell under conditions suitable for the expression of the catalase gene in the cell, and (d) expressing the transformed cell. Purifying the purified catalase protein.

【００１８】本発明の新規な方法は、先に述べた本発明
の新規なカタラーゼの作製に有用であるのみでなく、他
の微生物ソースに由来するカタラーゼのクローニングに
用いることも可能である。本発明の方法は特に、遺伝子
ライブラリーから得られる様々な微生物のカタラーゼ遺
伝子のＤＮＡ配列に基づいて適当なプライマーを設計
し、このプライマーを用いて所定の微生物の染色体に存
在するカタラーゼ遺伝子を増幅し、発現ベクターを構築
し、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、その後遺伝子
を発現させて所望のカタラーゼを得ることを含む。The novel method of the present invention is not only useful for producing the novel catalase of the present invention described above, but also can be used for cloning catalase derived from other microbial sources. In particular, the method of the present invention designs appropriate primers based on the DNA sequences of the catalase genes of various microorganisms obtained from the gene library, and amplifies the catalase gene present on the chromosome of a predetermined microorganism using the primers. , Constructing an expression vector, transforming a host cell with the vector, and then expressing the gene to obtain the desired catalase.

【００１９】本発明に有用な微生物は、カタラーゼ遺伝
子を有する任意の微生物、好ましくは細菌であり得る。
本発明の新規なカタラーゼの作製に本発明により用い得
る細菌は、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ ６０５１、６６３３など）、大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ）（ＡＴＣＣ ２９２６０など）及びＢａｃｉｌｌｕ
ｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ（ＡＴＣ
Ｃ ４３７４２など）であり得る。用いる微生物はいず
れか特定のものに限定されず、当業者が彼等自身の必要
に応じて選択することが可能である。The microorganism useful in the present invention can be any microorganism having a catalase gene, preferably a bacterium.
Bacteria that can be used according to the present invention to produce the novel catalase of the present invention include, for example, Bacillus subt.
ilis) (such as ATCC 6051,6633), E. coli (Escherichia coli) DH5α,
Pseudomonas aeruginos
a ) (such as ATCC 29260) and Bacillu
s thermoglucosidosis (ATC
C 43742). The microorganism used is not limited to any particular one, and can be selected by those skilled in the art according to their own needs.

【００２０】微生物に由来するカタラーゼ遺伝子の増幅
はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）など、いずれか通常
の方法を用いて行ない得る。ポリメラーゼ連鎖反応は１
９８０年代以降広く用いられている、所定の遺伝子を増
幅する技術であり（例えば米国特許第４，６８３，１９
５号及び同第４，６８３，２０２号参照）、そのプロト
コルは次のとおりである。まず、生物試料から標的核酸
を単離する。次に、二本鎖の標的遺伝子を変性させ、標
的遺伝子の各一方の側の単鎖の核酸配列に基づいて作製
したプライマーとアニールさせる。その後、適量のデオ
キシヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）の存在下にポリ
メラーゼを用いて増幅を行なう。必要な反応パラメータ
ー及び試薬は当業者に良く知られている。上述のポリメ
ラーゼ連鎖反応は、１段階ずつ生起させることも可能で
あるが、普通は市販の自動機械（即ちサーモサイクラ
ー）を用いて生起させる。[0020] The amplification of the catalase gene derived from a microorganism can be performed using any conventional method such as the polymerase chain reaction (PCR). The polymerase chain reaction is 1
This is a technique for amplifying a predetermined gene, which has been widely used since the 980s (for example, see US Pat.
No. 5 and No. 4,683,202), and the protocol is as follows. First, a target nucleic acid is isolated from a biological sample. Next, the double-stranded target gene is denatured and annealed with a primer prepared based on the single-stranded nucleic acid sequence on each side of the target gene. Then, an appropriate amount of deoxynucleotide triphosphate (deoxynucleot
Amplification is carried out using a polymerase in the presence of ide triphosphates. The required reaction parameters and reagents are well known to those skilled in the art. Although the polymerase chain reaction described above can occur step by step, it is usually initiated using a commercially available automated machine (ie, a thermocycler).

【００２１】増幅によって得たカタラーゼ遺伝子を、通
常の方法を用いて適当な発現ベクターに挿入する。前記
発現ベクターにはｐＢＲ、ｐＵＣ、ｐＵＢまたはｐＥＴ
シリーズのプラスミドなどの、細菌、酵母、哺乳動物ま
たは昆虫細胞発現系において有用な任意のベクターが含
まれる。当業者であれば、通常使用または選択するベク
ターの中から自身の必要に応じて適正なものを採用し得
る。The catalase gene obtained by the amplification is inserted into an appropriate expression vector using a usual method. The expression vector may include pBR, pUC, pUB or pET.
Included are any vectors useful in bacterial, yeast, mammalian or insect cell expression systems, such as a series of plasmids. A person skilled in the art can adopt an appropriate vector from the commonly used or selected vectors according to his / her needs.

【００２２】構築した発現ベクターを後に適正な宿主細
胞の形質転換に用い、その後宿主細胞において発現させ
る。本発明によれば、用い得る宿主細胞には例えば細菌
細胞（大腸菌や枯草菌など）、酵母細胞（醸造（ｂｒｅ
ｗｉｎｇ）酵母など）、哺乳動物細胞（マウス線維芽細
胞など）及び昆虫細胞が含まれ、好ましいのは細菌細胞
で、大腸菌細胞であれば更に好ましい。形質転換細胞
を、異種遺伝子保有（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｔｉｃ）プ
ラスミドの大量発現を容易にする条件下に培養し、その
後所望のタンパク質産物を分離する。本発明によれば、
粗なタンパク質抽出物は１５〜５０％の活性カタラーゼ
を含有する。ヒスチジンアフィニティークロマトグラフ
ィーやアセトン沈澱などの通常の方法で精製後、純度９
５％のカタラーゼを得ることができる。The constructed expression vector is later used for transformation of a suitable host cell, and is then expressed in the host cell. According to the present invention, host cells that can be used include, for example, bacterial cells (such as E. coli and Bacillus subtilis), yeast cells (such as brewed (bre
wing) yeasts), mammalian cells (such as mouse fibroblasts) and insect cells, preferably bacterial cells, more preferably E. coli cells. The transformed cells are cultured under conditions that facilitate large-scale expression of the heterologous plasmid, after which the desired protein product is isolated. According to the present invention,
The crude protein extract contains 15-50% active catalase. After purification by ordinary methods such as histidine affinity chromatography and acetone precipitation,
5% catalase can be obtained.

【００２３】カタラーゼを本発明の方法に従って作製す
ることは、操作が単純でしかも低コストである点のみで
なく、発酵などの通常の方法のいずれによるよりも大量
に作製できる点でも有利である。加えて、作製したカタ
ラーゼは著しく優れた触媒活性を有し、従って過酸化水
素分解のための組成物、特にコンタクトレンズ上に残存
する残留過酸化水素除去のための組成物中に用いるのに
きわめて適している。The production of catalase according to the method of the present invention is advantageous not only in that the operation is simple and inexpensive, but also in that it can be produced in a larger amount than by any conventional method such as fermentation. In addition, the prepared catalase has a remarkably excellent catalytic activity, and is therefore extremely suitable for use in compositions for decomposing hydrogen peroxide, especially for removing residual hydrogen peroxide remaining on contact lenses. Are suitable.

【００２４】本発明はその一形態において、本発明の新
規なカタラーゼを含有する、コンタクトレンズ上に残存
する残留過酸化水素を分解する組成物を提供する。[0024] In one aspect, the present invention provides a composition containing the novel catalase of the present invention, which decomposes residual hydrogen peroxide remaining on a contact lens.

【００２５】本発明により作製されたカタラーゼを含有
する組成物の調製、並びに該組成物の組成及び適用方法
はいずれも当業者に良く知られている。参考文献には、
例えば米国特許第５，５２１，０９１号、同第５，３６
２，６４７号、同第５，１４５，６４４号及び同第４，
５８５，４８８号が含まれると考えられる。上記組成物
は溶液剤として、または錠剤、カプセル剤等を含めた固
体形態として調製し得る。The preparation of the composition containing catalase prepared according to the present invention, as well as the composition and application of said composition, are all well known to those skilled in the art. References include:
For example, US Patent Nos. 5,521,091 and 5,36
Nos. 2,647, 5,145,644 and 4,
No. 585,488 is believed to be included. The compositions may be prepared as solutions or as solid forms, including tablets, capsules and the like.

【００２６】一具体例において本発明の組成物は、本発
明のカタラーゼを含有する水性でかつ実質的に等張性の
液体媒質を含む。前記水性でかつ実質的に等張性の液体
媒質は好ましくは、通常の緩衝液成分をｐＨ調節有効量
で含有する。更に好ましくは、緩衝液成分は液体媒質の
ｐＨを約３〜約１０、例えば約６〜約８に調節するのに
有効である。In one embodiment, the composition of the present invention comprises an aqueous, substantially isotonic liquid medium containing the catalase of the present invention. The aqueous and substantially isotonic liquid medium preferably contains conventional buffer components in a pH-adjusting effective amount. More preferably, the buffer component is effective to adjust the pH of the liquid medium to about 3 to about 10, for example, about 6 to about 8.

【００２７】カタラーゼの用量は好ましくは、消毒済み
のコンタクトレンズ上の過酸化水素含有媒質中に存在す
る過酸化水素を総て分解するのに十分であり、しかもレ
ンズ自体、及び安全で快適な装着に有害でない量とす
る。典型的には、用いるカタラーゼは、カタラーゼ活性
が液体媒質１ｍｌ当たり約１０〜約１０００、より好ま
しくは約２０〜約８００国際単位となる量で存在させ
る。The dose of catalase is preferably sufficient to decompose any hydrogen peroxide present in the hydrogen peroxide-containing medium on the disinfected contact lens, yet the lens itself and safe and comfortable wearing Amount not harmful to Typically, the catalase used is present in an amount such that the catalase activity is from about 10 to about 1000, more preferably from about 20 to about 800 international units per ml of liquid medium.

【００２８】別の具体例では、本発明の組成物は錠剤、
カプセル剤、１種以上の固体粒子等の形態で存在し得る
固体組成物である。前記固体組成物は被覆された部分、
例えば芯と、遮蔽もしくは放出遅延化要素とを有する。
被覆部分もしくは芯は本発明のカタラーゼを含有する。
遮蔽要素（ポリビニルピロリドン及びポリビニルアルコ
ールなどの水溶性ビニルポリマー； 水溶性タンパク
質； 多糖及びメチルセルロースなどのセルロース誘導
体を含み得る）は、最初に組成物が過酸化水素含有液体
媒質と接触した後媒質中へのカタラーゼの放出を、好ま
しくはレンズが過酸化水素によって消毒されるのに十分
な時間だけ遅延させるように機能する。このような組成
物の調製の詳細については、先に挙げた文献を参照し得
る。In another embodiment, the composition of the present invention comprises a tablet,
Capsules are solid compositions that may be in the form of one or more solid particles. The solid composition is a coated part,
For example, it has a wick and a shielding or release delaying element.
The coated portion or core contains the catalase of the present invention.
The shielding element (which may include water-soluble vinyl polymers such as polyvinylpyrrolidone and polyvinyl alcohol; water-soluble proteins; polysaccharides and cellulose derivatives such as methylcellulose) is first introduced into the medium after the composition is contacted with a hydrogen peroxide-containing liquid medium. Preferably acts to delay the release of catalase by a time sufficient to disinfect the lens with hydrogen peroxide. For details of the preparation of such compositions, reference may be made to the references cited above.

【００２９】[0029]

【実施例】本発明の内容を、以下の非限定的な実施例に
よって更に詳述する。The content of the present invention will be further described by the following non-limiting examples.

【００３０】実施例１ 発現プラスミドｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ １９の構築 Ａ．枯草菌からの染色体ＤＮＡの抽出 Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ（１０ｇ）、Ｂａｃｔｏ−
ｙｅａｓｔ抽出物（５ｇ）及びＮａＣｌ（１０ｇ）を１
ｌの脱イオン水に溶解させた。溶液のｐＨ値を１Ｎ Ｎ
ａＯＨで７．５に調節した。溶液を高圧滅菌及び冷却し
て、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地と呼称さ
れる培地を得た。この培地に２ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌア
ンピシリンを補充してＬＢ／Ａｍｐ培地とした。 Example 1 Construction of Expression Plasmid pET 20b / kat 19 Extraction of chromosomal DNA from Bacillus subtilis Bacto-trypton (10 g), Bacto-trypton
yeast extract (5 g) and NaCl (10 g)
dissolved in 1 deionized water. PH value of the solution is 1N
Adjusted to 7.5 with aOH. The solution was autoclaved and cooled to obtain a medium called Luria-Bertani (LB) medium. This medium was supplemented with 2 ml of 50 mg / ml ampicillin to obtain LB / Amp medium.

【００３１】枯草菌株（ＡＴＣＣ ６０５１）を３ｍｌ
のＬＢブイヨン中で３７℃で２４時間振盪下に培養し
た。培養物を１５分間遠心し（５ｋｒｐｍ／分）、水で
１回洗浄し、その後再び遠心した。上清を除去後、試料
に０．７５ｍｌの水を添加し、次いで抽出のために０．
７５ｍｌのフェノールを添加した。３０分後、抽出物を
１５分間遠心し（１２ｋｒｐｍ）、下層を除去した後
０．７５ｍｌのフェノールで３０分間抽出した。得られ
た抽出物を１５分間遠心し（１２ｋｒｐｍ）、フェノー
ル層を除去した後０．７５ｍｌのクロロホルムで１５分
間抽出し、再び遠心した（１２ｋｒｐｍ）。下層を除去
し、抽出物に２体積のエタノールを添加し、更に１５分
間遠心（１２ｋｒｐｍ）を行なった。ＤＮＡが沈澱した
のでこれを７５％エタノールで１回洗浄し、ｐＨ７．５
の１０ｍＭトリス−ＨＣｌと１ｍＭＥＤＴＡとを含有す
るＴＥ緩衝液で溶解させた。3 ml of Bacillus subtilis strain (ATCC 6051)
In LB broth at 37 ° C. for 24 hours with shaking. The culture was centrifuged for 15 minutes (5 krpm / min), washed once with water and then centrifuged again. After removing the supernatant, 0.75 ml of water was added to the sample and then 0.1 ml for extraction.
75 ml of phenol was added. After 30 minutes, the extract was centrifuged for 15 minutes (12 krpm), and after removing the lower layer, extracted with 0.75 ml of phenol for 30 minutes. The obtained extract was centrifuged for 15 minutes (12 krpm), the phenol layer was removed, extracted with 0.75 ml of chloroform for 15 minutes, and centrifuged again (12 krpm). The lower layer was removed, 2 volumes of ethanol were added to the extract, and the mixture was further centrifuged (12 krpm) for 15 minutes. Since the DNA precipitated, it was washed once with 75% ethanol, and the pH was 7.5.
Was dissolved in a TE buffer containing 10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA.

【００３２】Ｂ．枯草菌カタラーゼ遺伝子（ｋａｔ １
９）のクローニング ５′及び３′プライマーの合成 ：Ｂｏｌ及びＹａｓｈｉ
ｎ， Ｇｅｎｅ １０９， ｐｐ．３１−３７， １９
９１に開示された枯草菌ＹＢ ２００３のカタラーゼ遺
伝子（ｋａｔ １９遺伝子； 図２参照）の５′及び
３′末端配列に基づき、ＤＮＡ配列 ＴＴＣＡＴＡＴＧＡＧＴＴＣＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＡＣ
ＡＡＣＴ （この配列はＮｄｅＩ制限酵素の遺伝子を含む）を有す
る５′プライマーＮｄｅＩ−ｋａｔ １９（＋）と、Ｄ
ＮＡ配列 ＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＡＡ
ＴＣＧＧＣＡＡ （この配列はＸｈｏＩ制限酵素の遺伝子を含む）を有す
る３′プライマーｋａｔ１９−ＸｈｏＩ（−）とを合成
した。B. Bacillus subtilis catalase gene (kat 1
9) Cloning Synthesis of 5 'and 3' primers : Bol and Yashi
n, Gene 109 , pp. 31-37, 19
Based on the 5 'and 3' terminal sequences of the catalase gene (kat 19 gene; see FIG. 2) of Bacillus subtilis YB 2003 disclosed in No. 91, TT CATTAG AGTTCAAAATAACTGAC
5 'primer NdeI-kat 19 (+) with AACT (this sequence contains the gene for NdeI restriction enzyme);
NA sequence TT CTCGAG TTAAGAATCTTTTTTAA
A 3 'primer kat19-XhoI (-) with TCGGCAA (this sequence contains the gene for the XhoI restriction enzyme) was synthesized.

【００３３】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：１０μ
ｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１０μｌの１０×ＰＣ２緩
衝液（５０μＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．１、１６ｍＭ
硫酸アンモニウム、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び１５０
μｇ／ｍｌ ＢＳＡ含有）１．０μｌの０．２μｇ／ｍ
ｌ ５′プライマー、１．０μｌの０．２μｇ／ｍｌ
３′プライマー、７８μｌの水及び１．０μｌの５Ｕ／
μｌ Ｋｌｅｎｔａｑ（ＬＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）を含有する溶液に０．５μｇの枯
草菌染色体ＤＮＡを添加し、次いで５０μｌの鉱油を添
加した。サーモサイクラー（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ；
ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ， ＵＳＡ）の反応パラメーター
を次のように設定した。即ち、９４℃で１分間の操作を
１サイクル実施し、９４℃で３０秒間、５４℃で１分
間、及び７２℃で１．５分間の三つの操作を３０サイク
ル繰り返すこととした。ポリメラーゼ連鎖反応後、得ら
れた生成物をＱＩＡ高速Ｓｐｉｎ ＰＣＲ精製試薬キッ
ト（ＱＩＡＧＥＮ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製
し、その後１００μｌの水で溶離した。０．８％アガロ
ースゲル電気泳動に基づき、かつエチジウムブロミドで
の染色を行なう分析によって増幅生成物を、前以って予
測した大きさの、即ち約１．５ｋｂの所望のＤＮＡ断片
として同定した。 Polymerase chain reaction (PCR) : 10 μm
1 2.5 mM dNTP, 10 μl 10 × PC2 buffer (50 μM Tris-HCl, pH 9.1, 16 mM
Ammonium sulfate, 3.5 mM MgCl ₂ and 150
μg / ml BSA) 1.0 μl 0.2 μg / m
l 5 'primer, 1.0 μl 0.2 μg / ml
3 'primer, 78 μl water and 1.0 μl 5 U /
μl Klentaq (LA Technology
Inc. , USA) was added with 0.5 μg of B. subtilis chromosomal DNA, followed by 50 μl of mineral oil. Thermocycler (Robocycler;
(STRATAGENE, USA) reaction parameters were set as follows. That is, an operation at 94 ° C. for 1 minute was performed for one cycle, and three operations of 94 ° C. for 30 seconds, 54 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1.5 minutes were repeated for 30 cycles. After the polymerase chain reaction, the resulting product was purified using the QIA Fast Spin PCR Purification Reagent Kit (QIAGEN, Germany) and then eluted with 100 μl of water. The amplification product was identified as the desired DNA fragment of the previously predicted size, ie, about 1.5 kb, by analysis based on 0.8% agarose gel electrophoresis and staining with ethidium bromide.

【００３４】Ｃ．発現プラスミドｐＥＴ ２０ｂ／ｋａ
ｔ １９の構築（図１） ＰＣＲ生成物を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化
し、３７℃で３時間反応させ、その後アガロースゲル電
気泳動により分離して約１．５ｋｂの断片を得た。この
ＤＮＡ断片を電気泳動で溶離し、続いてＱＩＡ高速Ｓｐ
ｉｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。精製したＤ
ＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと１６℃で１６時間反応
させることにより、制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで予
め消化した発現ベクターｐＥＴ ２０ｂ（Ｎｏｖｏｇｅ
ｎ， ＵＳＡ）に挿入した。連結後、反応混合物を用い
てＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換し、その後ｐＥ
Ｔ２０ｂより大きい組み換えプラスミドを選別した。制
限酵素と、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０
ＤＮＡ配列決定キット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）及びプライマーとしてのＴ
７プロモーター配列（ＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧ）を用いるＳａｎｇｅｒ法に基づくＤＮＡ
配列決定技術とを用いる分析によって１．５ｋｂのクロ
ーン化ＤＮＡ断片がｋａｔ １９遺伝子であることを確
認し、このようにして発現プラスミドｐＥＴ ２０ｂ／
ｋａｔ １９の構築を完了した。C. Expression plasmid pET 20b / ka
Construction of t19 (FIG. 1) The PCR product was digested with restriction enzymes NdeI and XhoI, reacted at 37 ° C. for 3 hours, and then separated by agarose gel electrophoresis to obtain a fragment of about 1.5 kb. This DNA fragment was eluted by electrophoresis, followed by QIA fast Sp.
Purified using the in PCR purification kit. Purified D
NA was reacted with T4 DNA ligase at 16 ° C. for 16 hours to obtain an expression vector pET 20b (Novoge) previously digested with restriction enzymes NdeI and XhoI.
n, USA). After ligation, the reaction mixture is used to transform DH5α competent cells, followed by pE5
Recombinant plasmids larger than T20b were selected. Restriction enzymes and Sequence Version 2.0
DNA sequencing kit (United States
Biochemical) and T as primer
7 promoter sequence (ATTAATACGACTCAC
DNA based on the Sanger method using TATAGG)
Analysis using a sequencing technique confirmed that the 1.5 kb cloned DNA fragment was the kat 19 gene and thus the expression plasmid pET 20b /
The construction of kat 19 was completed.

【００３５】実施例２ 発現プラスミドｐＥＴ １５ｂ／ｋａｔ １９の構築
（図３） ｋａｔ １９遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで
消化し、その後アガロースゲル電気泳動で分離して約
１．５ｋｂの断片を得た。このＤＮＡ断片を電気泳動で
溶離し、ＱＩＡ高速Ｓｐｉｎ ＰＣＲ精製キットを用い
て精製した。精製したＤＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
と１６℃で１６時間反応させることにより、制限酵素Ｎ
ｄｅＩ及びＸｈｏＩで予め消化した発現ベクターｐＥＴ
１５ｂに連結し、それによって発現プラスミドｐＥＴ
１５ｂ／ｋａｔ １９の構築を完了した。Ｔ７プロモ
ーター配列をプライマーとして用いて５′末端ＤＮＡ配
列を決定し、発現プラスミドｐＥＴ １５ｂ／ｋａｔ
１９をクローン化したことを確認した。 Example 2 Construction of Expression Plasmid pET 15b / kat 19
(FIG. 3) The kat 19 gene was digested with restriction enzymes NdeI and XhoI, and then separated by agarose gel electrophoresis to obtain a fragment of about 1.5 kb. The DNA fragment was eluted by electrophoresis and purified using a QIA high speed Spin PCR purification kit. By reacting the purified DNA with T4 DNA ligase at 16 ° C. for 16 hours, the restriction enzyme N
Expression vector pET previously digested with deI and XhoI
15b, whereby the expression plasmid pET
Construction of 15b / kat 19 was completed. The 5 'terminal DNA sequence was determined using the T7 promoter sequence as a primer, and the expression plasmid pET 15b / kat was determined.
19 was confirmed to be cloned.

【００３６】実施例３ 発現プラスミドｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ ＴＧの構築
（図４） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓ
ｉｕｓ （ＡＴＣＣ ４３７４２）の細胞を５５℃で培養
し、得られた細菌培養物から染色体ＤＮＡを、実施例１
に述べた方法に従い抽出した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈ
ｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓのカタラーゼ遺伝
子を増幅する操作は、試料をＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅ
ｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ染色体ＤＮＡとした
こと以外実施例１の操作と同様である。 Example 3 Construction of expression plasmid pET 20b / kat TG
(Figure 4) Bacillus thermoglucosidas
ius (ATCC 43742) cells were cultured at 55 ° C., and chromosomal DNA was obtained from the resulting bacterial culture according to Example 1.
Extracted according to the method described in (1). Bacillus th
In the operation of amplifying the catalase gene of E. thermoglucosidasius , the sample is subjected to Bacillus the
The procedure is the same as that of Example 1 except that the chromosomal DNA is rmoglucosidosis chromosomal DNA.

【００３７】ポリメラーゼ連鎖反応後、１．５ｋｂのＤ
ＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を精製し、３７℃で２
時間制限酵素ＸｈｏＩで消化し、再び精製し、その後４
℃で貯蔵した。After the polymerase chain reaction, 1.5 kb of D
An NA fragment was obtained. This DNA fragment was purified, and
Digest with the time restriction enzyme XhoI and purify again, then
Stored at ° C.

【００３８】発現ベクターｐＥＴ ２０ｂを３７℃で２
時間制限酵素ＮｄｅＩで消化し、これを精製後Ｋｌｅｎ
ｏｗ酵素で処理した。ベクターを再び精製し、３７℃で
２時間制限酵素ＸｈｏＩで消化した。０．８％アガロー
スゲルを用いてＤＮＡを分離し、得られた３．７ｋｂ断
片を電気泳動によって溶離し、ＱＩＡ高速ＳｐｉｎＰＣ
Ｒ精製キットを用いて精製して、後続ステップにおいて
有用なｐＥＴ ２０ｂベクターを作製した（このベクタ
ーのＮｄｅＩ部位は満たされ、ＸｈｏＩ部位は切断され
て開いたままであった）。次に、前記ベクターを先に述
べた１．５ｋｂ断片に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結して１６℃で１６時間インキュベートし、得られた
ベクターを用いてＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換
した。選別操作後、発現ベクターｐＥＴ ２０ｂ／ｋａ
ｔ ＴＧを得た。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ
２．０ ＤＮＡ配列決定キットを用いるＳａｎｇｅｒ法
に基づくＤＮＡ配列分析を行なったところ、クローン化
したＤＮＡ断片（そのＤＮＡ配列を図５に示す）がｋａ
ｔ １９遺伝子に対して７４．４％の類似性を有するこ
とが判明した。加えて、このＤＮＡ断片の翻訳によって
得られるタンパク質産物（そのアミノ酸配列を図６に示
す）は枯草菌の栄養（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ）細胞カタ
ラーゼに対して８１．０％の類似性を有することが判明
した。The expression vector pET 20b was added at 37 ° C. for 2 hours.
After digestion with the time-restricting enzyme NdeI,
ow enzyme. The vector was purified again and digested with the restriction enzyme Xhol at 37 ° C for 2 hours. The DNA was separated using a 0.8% agarose gel and the resulting 3.7 kb fragment was eluted by electrophoresis and analyzed by QIA high speed SpinPC.
Purification was performed using the R purification kit to create a useful pET 20b vector in subsequent steps (the NdeI site of this vector was filled and the XhoI site was cut open). Next, the vector was ligated to the 1.5 kb fragment described above using T4 DNA ligase, incubated at 16 ° C. for 16 hours, and DH5α competent cells were transformed with the obtained vector. After the selection operation, the expression vector pET 20b / ka
tTG was obtained. Sequence Version
2.0 DNA sequence analysis based on the Sanger method using a DNA sequencing kit revealed that the cloned DNA fragment (the DNA sequence of which is shown in FIG. 5) was ka.
It was found to have 74.4% similarity to the t19 gene. In addition, the protein product obtained by translation of this DNA fragment (the amino acid sequence of which is shown in FIG. 6) was found to have 81.0% similarity to Bacillus subtilis vegetative cell catalase.

【００３９】実施例４ 発現プラスミドｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ ＨＰＩＩの構
築（図７） 大腸菌ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， ＵＳＡ）の染
色体ＤＮＡを、実施例１に述べた方法に従って抽出し
た。Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７３， ｐｐ．５
１４−５２０， １９９１に開示された大腸菌ＨＰＩＩ
遺伝子のＤＮＡ配列（図８参照）に基づき、ＤＮＡ配列 ＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＧＣＡＡＣＡＴＡＡＣＧＡＡＡ
ＡＧＡＡＣ （この配列は制限酵素ＮｄｅＩの遺伝子を含む）を有す
る５′プライマーＮｄｅＩ−ＨＰＩＩ（＋）と、ＤＮＡ
配列 ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴＴＧＴＣＡ
ＡＴＣＴＴＡＧＧ （この配列は制限酵素ＸｈｏＩの遺伝子を含む）を有す
る３′プライマーＨＰＩＩ−ＸｈｏＩ（−）とを合成し
た。大腸菌ＤＨ５αの染色体ＤＮＡを鋳型として用い
て、ＨＰＩＩ遺伝子を実施例１に示したのと同じＰＣＲ
条件下に増幅した（ただし、プライマー伸長時間は２分
とした）。その結果、２．０ｋｂ（予測した大きさ）の
ＤＮＡ断片を得た。 Example 4 Construction of expression plasmid pET 20b / kat HPII
Construction (FIG. 7) Chromosomal DNA of E. coli DH5α (GIBCO BRL, USA) was extracted according to the method described in Example 1. J. Bacteriol. 173 , pp. 5
14-520, 1991.
Based on the DNA sequence of the gene (see FIG. 8), the DNA sequence was TCCCATATGTCGCAACATAACGAAA
5 'primer NdeI-HPII (+) having AGAAC (this sequence contains the gene for restriction enzyme NdeI), and DNA
Sequence TTTCTCGAGGGCAGGAATTTTGTCA
A 3 'primer HPII-XhoI (-) having ATCTTAGG (this sequence contains the gene for the restriction enzyme XhoI) was synthesized. Using the chromosomal DNA of Escherichia coli DH5α as a template, the same PCR as in Example 1 was performed using the HPII gene as in Example 1.
Amplification was performed under the conditions (provided that the primer extension time was 2 minutes). As a result, a DNA fragment of 2.0 kb (predicted size) was obtained.

【００４０】発現プラスミドｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ
ＨＰＩＩの構築は、実施例１に述べた方法に従って行な
った。制限酵素及びＤＮＡ配列決定技術を用いる分析に
よって、２．０ｋｂのクローン化ＤＮＡ断片がＨＰＩＩ
遺伝子であることを確認した。Expression plasmid pET 20b / kat
The construction of HPII was performed according to the method described in Example 1. Analysis using restriction enzymes and DNA sequencing techniques revealed that the 2.0 kb cloned DNA fragment was HPII.
It was confirmed to be a gene.

【００４１】上述のプラスミドｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ
１９、ｐＥＴ １５ｂ／ｋａｔ１９、ｐＥＴ ２０ｂ
／ｋａｔ ＨＰＩＩ及びｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ ＴＧ
は、ブダペスト条約に従い１９９７年１１月１８日付で
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）， １２３０１ Ｐａｒｋ
ｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ
２０８５２， ＵＳＡに、受託番号第ＡＴＣＣ ２０
９４６７号、第ＡＴＣＣ ２０９４６９号、第ＡＴＣＣ
２０９４７０号及び第ＡＴＣＣ ２０９４６８号の下
にそれぞれ寄託した。The above plasmid pET 20b / kat
19, pET 15b / kat19, pET 20b
/ Kat HPII and pET 20b / kat TG
Is based on the Budapest Treaty, dated November 18, 1997 on the American Type Culture
selection (ATCC), 12301 Park
raw Drive, Rockville, MD
20852, USA, accession number ATCC 20
No. 9467, ATCC No. 209469, No. ATCC
Nos. 209470 and ATCC 209468, respectively.

【００４２】実施例５ カタラーゼの発現 発現ベクターｐＥＴ ２０ｂ、ｐＥＴ １５ｂ、ｐＥＴ
２０ｂ／ｋａｔ １９、ｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ Ｔ
Ｇ及びｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ ＨＰＩＩを用いて大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の細胞を形質転換し、これらの
細菌を２０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ培地中で、Ｏ．Ｄ．６０
０値が２．０に達するまで３７℃で攪拌下に培養した。
培養物に０．１ｍＭイソプロピルチオ−β−ガラクトシ
ド（ＩＰＴＧ）を添加してカタラーゼの発現を誘導し
た。２４時間後、細菌を回収した。各１．５ｍｌの回収
細菌懸濁液を遠心し、その後上清を除去した。懸濁液
に、まず１５０μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．０）を添加し、次いで０．１Ｍジチオトレイ
トール、２％ ＳＤＳ、０．０８Ｍトリス−Ｃｌ、１５
％グリセロール及び０．０６％ブロモフェノールブルー
を含有する２倍電気泳動タンパク質染料１５０μｌを添
加した。混合物を９５℃で５分間加熱し、その後５分間
遠心した（１２ｋｒｐｍ）。次に、得られた上清各２０
μｌの１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ない、細菌内
に存在するタンパク質を総て分析した。結果を図９に示
す。図中左から右へ、ｐＥＴ １５ｂ、ｐＥＴ １５ｂ
／ｋａｔ１９、ｐＥＴ ２０ｂ、ｐＥＴ ２０ｂ／ｋａ
ｔ １９、ｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ ＴＧ及びｐＥＴ
２０ｂ／ｋａｔ ＨＰＩＩでそれぞれ形質転換された大
腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株において発現されたカタラー
ゼの電気泳動結果である。図９によれば、上記細菌内に
存在する全タンパク質の約１５〜５０％はカタラーゼで
ある。換言すれば、カタラーゼ発現ベクターを保有する
上記のような宿主細胞はいずれもカタラーゼを非常に高
い収率で産生し得た。 Example 5 Expression of catalase Expression vectors pET 20b, pET 15b, pET
20b / kat 19, pET 20b / kat T
G and pET 20b / kat HPII were used to transform cells of the E. coli strain BL21 (DE3), and these bacteria were transformed into O.C. D. 60
The cells were cultured with stirring at 37 ° C. until the 0 value reached 2.0.
Catalase expression was induced by adding 0.1 mM isopropylthio-β-galactoside (IPTG) to the culture. After 24 hours, the bacteria were collected. Each 1.5 ml of the recovered bacterial suspension was centrifuged, after which the supernatant was removed. To the suspension, first add 150 μl of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), then 0.1 M dithiothreitol, 2% SDS, 0.08 M Tris-Cl, 15
150 μl of a 2 × electrophoretic protein dye containing% glycerol and 0.06% bromophenol blue was added. The mixture was heated at 95 ° C. for 5 minutes and then centrifuged for 5 minutes (12 krpm). Next, each of the obtained supernatants was 20
μl of 12% SDS-PAGE analysis was performed to analyze all proteins present in the bacteria. FIG. 9 shows the results. From left to right in the figure, pET 15b, pET 15b
/ Kat19, pET 20b, pET 20b / ka
t19, pET 20b / kat TG and pET
FIG. 4 shows the results of electrophoresis of catalase expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) strain, each of which was transformed with 20b / kat HPII. According to FIG. 9, about 15 to 50% of the total protein present in the bacterium is catalase. In other words, any of the above host cells carrying the catalase expression vector could produce catalase in very high yield.

【００４３】実施例６ カタラーゼの精製 発現ベクターｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ １９で形質転換
したＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖｏｇｅｎ， ＵＳＡ）
株の細胞を１００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ培地に接種し、
Ｏ．Ｄ．６００＝２．０となるまで３７℃で振盪下に培
養した。０．１ＭＩＰＴＧで発現誘導後、培養物を遠心
して培地を除去した。細菌細胞を１０ｍｌの５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．４）中に再懸濁させ、
音波処理によって破壊した。１５分間遠心（１２ｋｒｐ
ｍ）後、細菌破片を沈澱させ、上清を回収した。この上
清を等量のアセトン（４℃で添加）と３０分間混合し、
遠心し、上清を除去した。得られた沈澱物を１０ｍｌの
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．４に溶解さ
せ、４℃で１２時間貯蔵し、５分間遠心した（５ｋｒｐ
ｍ）。遠心の結果得られた上清を回収して精製操作を完
了した。 Example 6 Purification of catalase BL21 (DE3) transformed with the expression vector pET 20b / kat 19 (Novogen, USA)
Inoculate the cells of the strain into 100 ml of LB / Amp medium,
O. D. The cells were cultured with shaking at 37 ° C. until 600 = 2.0. After induction of expression with 0.1 MIPTG, the culture was centrifuged to remove the medium. Bacterial cells are resuspended in 10 ml of 50 mM sodium phosphate buffer, pH 6.4,
Broken by sonication. Centrifuge for 15 minutes (12 krp
After m), bacterial debris was precipitated and the supernatant was collected. This supernatant was mixed with an equal volume of acetone (added at 4 ° C.) for 30 minutes,
After centrifugation, the supernatant was removed. The obtained precipitate was dissolved in 10 ml of 50 mM sodium phosphate buffer, pH 6.4, stored at 4 ° C. for 12 hours, and centrifuged for 5 minutes (5 krp).
m). The supernatant obtained as a result of the centrifugation was collected to complete the purification operation.

【００４４】他方、発現ベクターｐＥＴ １５ｂ／ｋａ
ｔ １９、ｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔＴＧ及びｐＥＴ ２
０ｂ／ｋａｔ ＨＰＩＩを保有するＢＬ２１（ＤＥ３）
株の細胞を個々に１００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ培地に接種
し、３７℃で振盪下に培養した。Ｏ．Ｄ．６００値が
２．０に達したところで０．１Ｍ ＩＰＴＧを添加し、
培養を更に２４時間継続した。培養物を遠心し、その後
培地を除去してから、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．９）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール及
び５ｍＭイミダゾールを含有するＩＭＡＣ−５を２０ｍ
ｌ添加して細菌を再懸濁させた。次に、音波処理によっ
て細菌細胞を破壊した。遠心後、細菌破片を沈澱させ、
得られた上清を回収した。カタラーゼの精製は２．５ｍ
ｌ容のヒスチジンアフィニティークロマトグラフィーカ
ラム（Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ樹脂； Ｎｏｖｏｇｅｎ）を用
いて、Ｎｏｖｏｇｅｎが示唆するプロトコル（ｐＥＴ
Ｈｉｓ． Ｔｏｇ^TG Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ， Ｎｏｖｏｇｅｎ）に従って行なった。On the other hand, the expression vector pET 15b / ka
t19, pET 20b / katTG and pET 2
BL21 (DE3) possessing 0b / kat HPII
The cells of the strain were individually inoculated into 100 ml of LB / Amp medium and cultured at 37 ° C. with shaking. O. D. When the 600 value reached 2.0, 0.1 M IPTG was added,
Culture was continued for another 24 hours. The culture is centrifuged, then the medium is removed before the 20 mM Tris-HCl (pH
7.9), IMAC-5 containing 0.5 M NaCl, 10% glycerol and 5 mM imidazole in 20 m
1 was added to resuspend the bacteria. Next, the bacterial cells were destroyed by sonication. After centrifugation, bacterial debris is precipitated,
The obtained supernatant was collected. Catalase purification is 2.5m
Using a 1-volume histidine affinity chromatography column (His-Bind resin; Novogen), the protocol suggested by Novogen (pET
His. Tog ^TG System Protocol
s, Novogen).

【００４５】精製したタンパク質の量及び活性を次のよ
うに測定した。タンパク質量は、標準としてウシ血清ア
ルブミンを用いる、Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｃｏ．から得たタ
ンパク質定量分析用試薬及び操作によって測定した。カ
タラーゼ活性は、先に述べたようにして得たカタラーゼ
の反応によってもたらされる、５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０； ２５℃）中に存在する過酸化
水素の波長２４０ｎｍのＵＶ光下でのＯＤ値の変化即ち
分解率を測定することにより確認した。前記緩衝液が含
有する過酸化水素の初期濃度は２０ｍＭとし、また測定
間隔は２０秒とした。カタラーゼ活性は、１μｍｏｌの
過酸化水素が１分で分解される場合を１単位（Ｕ）と定
義する。The amount and activity of the purified protein were measured as follows. Protein levels were determined using Bio-RAD Co. using bovine serum albumin as a standard. The measurement was performed using the reagent for quantitative analysis of protein obtained from the above and the operation. Catalase activity was determined by the reaction of catalase obtained as described above, under the UV light of 240 nm wavelength of hydrogen peroxide present in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0; 25 ° C.). It was confirmed by measuring the change in the OD value, that is, the decomposition rate. The initial concentration of hydrogen peroxide contained in the buffer was 20 mM, and the measurement interval was 20 seconds. Catalase activity is defined as 1 unit (U) when 1 μmol of hydrogen peroxide is decomposed in 1 minute.

【００４６】様々なカタラーゼの量及び活性を、上述の
方法に従って測定した。加えて、カタラーゼの純度を１
２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によって測定
した（各カタラーゼを５μｇずつ使用）。結果を図１０
に示す。図中左端にタンパク質標準を示し、その隣りか
ら右方へ順に、発現ベクターｐＥＴ １５ｂ／ｋａｔ１
９、ｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ １９、ｐＥＴ ２０ｂ／
ｋａｔ ＴＧ及びｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ ＨＰＩＩに
よってそれぞれ発現されたカタラーゼを示す。この電気
泳動結果は、いずれのタンパク質も９５％より高い純度
を有することを示している。これらのカタラーゼの比活
性は次のとおりである。： 発現ベクター 比活性（Ｕ／μｇ） ｐＥＴ １５ｂ／ｋａｔ １９ １８〜２２ ｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ １９ １８〜２２ ｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ ＴＧ ３０〜４０ ｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ ＨＰＩＩ １０〜１４。The amounts and activities of various catalase were determined according to the method described above. In addition, catalase purity of 1
It was measured by 2% polyacrylamide gel electrophoresis analysis (5 μg of each catalase was used). FIG. 10 shows the results.
Shown in The protein standard is shown at the left end in the figure, and the expression vector pET 15b / kat1
9, pET 20b / kat 19, pET 20b /
Catalase expressed by kat TG and pET 20b / kat HPII, respectively. The electrophoresis results show that both proteins have a purity higher than 95%. The specific activities of these catalase are as follows. : Specific activity of the expression vector (U / μg) pET 15b / kat 19 18-22 pET 20b / kat 19 18-22 pET 20b / kat TG 30-40 pET 20b / kat HPII 10-14.

【００４７】この表から、本発明により作製したカタラ
ーゼはいずれも優れた触媒活性を有することが知見され
る。加えて、これらのカタラーゼの比活性は総て、市販
のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来カタラーゼ
の比活性（Ｍｅｒｃｋカタログによれば約５Ｕ／μｇ、
Ｓｉｇｍａカタログによれば約４〜８Ｕ／μｇ）より優
れている。From this table, it is found that the catalase prepared according to the present invention has excellent catalytic activity. In addition, the specific activity of all of these catalase was the specific activity of catalase from commercially available Aspergillus niger (about 5 U / μg, according to Merck catalogue,
About 4-8 U / μg) according to the Sigma catalog.

【００４８】実施例７ コンタクトレンズ消毒薬中に存在する過酸化水素への分
解作用 市販のコンタクトレンズ消毒薬は、典型的には約３％
（ｗ／ｖ）の過酸化水素を含有する。消毒操作は次のと
おりである。消毒するべきコンタクトレンズを過酸化水
素の３％（ｗ／ｖ）水溶液１０ｍｌに２０分間浸漬し
た。その後、消毒済みのコンタクトレンズを過酸化水素
溶液から取り出して１０ｍｌのカタラーゼ含有水溶液に
浸漬した。あるいは他の場合には、過酸化水素溶液に直
接カタラーゼを添加する。約１０〜２０後、消毒済みの
コンタクトレンズを溶液から取り出し、食塩液で洗浄
し、装着者の眼内に配置した。コンタクトレンズ用消毒
薬が含有する過酸化水素の分解における本発明のカタラ
ーゼの性能を試験するべく、実施例６に従って作製した
各カタラーゼを所定量即ち５０μｇずつ、過酸化水素の
３％水溶液に添加した。試験したカタラーゼが過酸化水
素を有効に分解してその濃度を０．０２％（ｗ／ｖ）未
満とするのに５分しか掛からないことが判明した。明ら
かに、本発明のカタラーゼの有効性は使用可能な市販製
品のそれを上回る。 Example 7 Separation into hydrogen peroxide present in a contact lens disinfectant
Solution action commercial contact lens disinfectants is typically from about 3%
(W / v) hydrogen peroxide. The disinfection operation is as follows. The contact lens to be disinfected was immersed in 10 ml of a 3% (w / v) aqueous solution of hydrogen peroxide for 20 minutes. Thereafter, the disinfected contact lens was taken out of the hydrogen peroxide solution and immersed in 10 ml of a catalase-containing aqueous solution. Alternatively, in other cases, catalase is added directly to the hydrogen peroxide solution. After about 10-20, the disinfected contact lens was removed from the solution, washed with saline and placed in the eye of the wearer. In order to test the performance of the catalase of the present invention in decomposing hydrogen peroxide contained in the disinfectant for contact lenses, a predetermined amount, ie, 50 μg, of each catalase prepared according to Example 6 was added to a 3% aqueous solution of hydrogen peroxide. . It was found that it took only 5 minutes for the catalase tested to effectively decompose hydrogen peroxide to a concentration of less than 0.02% (w / v). Clearly, the effectiveness of the catalase of the present invention exceeds that of commercially available products.

【００４９】実施例８ 固体組成物 遅延放出層によって囲繞された芯を有する層状錠剤を調
製する。この層状錠剤は次の組成を有する。：芯 塩化ナトリウム ８９．４ｍｇ 二塩基型リン酸ナトリウム（無水物） １２．５ｍｇ 一塩基型リン酸ナトリウム一水和物（無水物） ０．８７ｍｇ ポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ． ３３５０） １．０５ｍｇ 凍結乾燥した本発明のカタラーゼ ２５００国際単位被覆層 ヒドロキシプロピルメチルセルロース ８ｍｇ。 Example 8 A layered tablet having a core surrounded by a solid composition delayed release layer is prepared. This layered tablet has the following composition: : Core sodium chloride 89.4 mg Dibasic sodium phosphate (anhydrous) 12.5 mg Monobasic sodium phosphate monohydrate (anhydrous) 0.87 mg Polyethylene glycol (MW 3350) 1.05 mg Freezing 8 mg of the dried catalase 2500 international unit coating layer hydroxypropyl methylcellulose of the present invention.

【００５０】実施例９ 溶液組成物 次の組成を有する二単位投与量（１０ｍｌ）製剤を調製
する。： 塩化ナトリウム ０．８５％ 二塩基型リン酸ナトリウム七水和物 ０．４０２％ 一塩基型リン酸ナトリウム一水和物 ０．０９１％ エデテート・二ナトリウム ０．１００％ 液状の本発明のカタラーゼ¹⁾ ２６０国際単位／ｍｌ 精製水 ＱＳ−ａｄ¹⁾ ； 液状カタラーゼは３５〜４０重量％のグリセロー
ル及び１０重量％のエタノール含有。 Example 9 Solution Composition A two unit dose (10 ml) formulation having the following composition is prepared. : Sodium chloride 0.85% dibasic sodium phosphate heptahydrate 0.402% monobasic sodium phosphate monohydrate 0.091% edetate disodium 0.100% liquid catalase ¹ of the present invention ⁾ 260 international units / ml purified water QS-ad ¹⁾ ; liquid catalase contains 35-40% by weight of glycerol and 10% by weight of ethanol.

【００５１】[0051]

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１４４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列[Sequence List] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 1449 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid sequence

【００５２】[0052]

【表４】 [Table 4]

【００５３】[0053]

【表５】 [Table 5]

【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：４８３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列SEQ ID NO: 2 Sequence length: 483 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: protein sequence

【００５５】[0055]

【表６】 [Table 6]

【００５６】[0056]

【表７】 [Table 7]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】発現プラスミドｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ １９
の構築の説明図である。FIG. 1. Expression plasmid pET 20b / kat 19
It is explanatory drawing of construction of.

【図２】カタラーゼｋａｔ １９遺伝子のＤＮＡ配列で
ある。FIG. 2 is a DNA sequence of catalase kat 19 gene.

【図３】発現プラスミドｐＥＴ １５ｂ／ｋａｔ １９
の構築の説明図である。FIG. 3. Expression plasmid pET 15b / kat 19
It is explanatory drawing of construction of.

【図４】発現プラスミドｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ ＴＧ
の構築の説明図である。FIG. 4. Expression plasmid pET 20b / kat TG
It is explanatory drawing of construction of.

【図５】カタラーゼｋａｔ ＴＧ遺伝子のＤＮＡ配列で
ある。FIG. 5 is a DNA sequence of catalase kat TG gene.

【図６】カタラーゼＴＧのアミノ酸配列である。FIG. 6 is an amino acid sequence of catalase TG.

【図７】発現プラスミドｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ ＨＰ
ＩＩの構築の説明図である。FIG. 7: Expression plasmid pET 20b / kat HP
It is explanatory drawing of construction of II.

【図８】カタラーゼｋａｔ ＨＰＩＩ遺伝子のＤＮＡ配
列である。FIG. 8 is a DNA sequence of catalase kat HPII gene.

【図８ａ】図８に示した配列の続きである。FIG. 8a is a continuation of the arrangement shown in FIG.

【図９】形質転換株において発現されたカタラーゼの１
２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動写真である。図中
左から右へ、ｐＥＴ １５ｂ、ｐＥＴ １５ｂ／ｋａｔ
１９、ｐＥＴ ２０ｂ、ｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ １
９、ｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ ＴＧ及びｐＥＴ ２０ｂ
／ｋａｔ ＨＰＩＩでそれぞれ形質転換された大腸菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）株において発現されたカタラーゼの電
気泳動結果である。FIG. 9 shows one of the catalase expressed in the transformed strain.
It is a 2% polyacrylamide gel electrophoresis photograph. From left to right in the figure, pET 15b, pET 15b / kat
19, pET 20b, pET 20b / kat 1
9, pET 20b / kat TG and pET 20b
/ Kat E. coli B transformed respectively with HPII
It is an electrophoresis result of catalase expressed in L21 (DE3) strain.

【図１０】形質転換株において発現されたカタラーゼの
精製後の１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動写真で
ある。図中左から右へ、ｐＥＴ １５ｂ／ｋａｔ １
９、ｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ １９、ｐＥＴ ２０ｂ／
ｋａｔ ＴＧ及びｐＥＴ ２０ｂ／ｋａｔ ＨＰＩＩで
それぞれ形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に
おいて発現されたカタラーゼの精製後の電気泳動結果で
ある。FIG. 10 is a photograph of a 12% polyacrylamide gel electrophoresis after purification of catalase expressed in a transformant. From left to right in the figure, pET 15b / kat 1
9, pET 20b / kat 19, pET 20b /
FIG. 9 shows the results of electrophoresis after purification of catalase expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) strain transformed with kat TG and pET 20b / kat HPII, respectively.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 チエン−カイ・ロ 台湾、タイペイ、シー−チー、カン−ニ ン・ストリート、レイン・169、102──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification symbol FI // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:07) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 9/08 C12R 1:19 (C12N 9/08 C12R 1:07) (C12N 9/08 C12R 1: 125) (72) Inventor Qian-Chi-Lo Taiwan, Taipei, C-Chi, Kang-Nin Street, Rain 169, 102

Claims (17)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 次の核酸配列 【表１】 【表２】 とその縮重配列を含むカタラーゼ遺伝子。1. The following nucleic acid sequence: [Table 2] And a catalase gene containing its degenerate sequence. 【請求項２】 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕ
ｃｏｓｉｄａｓｉｕｓに由来することを特徴とする請求
項１に記載の遺伝子。2. Bacillus thermoglu
The gene according to claim 1, wherein the gene is derived from E.cosidius . 【請求項３】 次のアミノ酸配列 【表３】 とその機能性フラグメントを含むカタラーゼ。3. The following amino acid sequence: And catalase containing its functional fragments. 【請求項４】 微生物由来のカタラーゼを遺伝学的技術
を用いて調製する方法であって、（ａ）適正な転写プロ
モーターを有する発現ベクターに前記カタラーゼをコー
ドする遺伝子を挿入することによって組み換えプラスミ
ドを構築し、（ｂ）前記組み換えプラスミドで適正な宿
主細胞を形質転換し、（ｃ）得られた形質転換細胞を該
細胞におけるカタラーゼ遺伝子の発現に適した条件下に
培養し、（ｄ）発現されたカタラーゼタンパク質を精製
することを含む方法。4. A method for preparing a catalase derived from a microorganism using a genetic technique, comprising: (a) inserting a gene encoding said catalase into an expression vector having an appropriate transcription promoter to convert a recombinant plasmid; Constructing, (b) transforming an appropriate host cell with the recombinant plasmid, (c) culturing the resulting transformed cell under conditions suitable for the expression of the catalase gene in the cell, and (d) expressing the transformed cell. A purified catalase protein. 【請求項５】 微生物が細菌であることを特徴とする請
求項４に記載の方法。5. The method according to claim 4, wherein the microorganism is a bacterium. 【請求項６】 細菌を枯草菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈ
ｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ及び大腸菌の中か
ら選択することを特徴とする請求項５に記載の方法。6. The method according to claim 6, wherein the bacterium is Bacillus thaliana.
The method according to claim 5, wherein the method is selected from thermoglucosidosis and Escherichia coli. 【請求項７】 前記カタラーゼをコードする遺伝子が請
求項２に記載の遺伝子であることを特徴とする請求項４
に記載の方法。7. The gene according to claim 2, wherein the gene encoding catalase is the gene according to claim 2.
The method described in. 【請求項８】 宿主細胞が大腸菌細胞であることを特徴
とする請求項４に記載の方法。8. The method according to claim 4, wherein the host cell is an E. coli cell. 【請求項９】 微生物由来のカタラーゼを発現させるた
めの組み換えプラスミドであって、微生物由来のカタラ
ーゼをコードする遺伝子を発現ベクターに挿入すること
によって構築される組み換えプラスミド。9. A recombinant plasmid for expressing a microorganism-derived catalase, which is constructed by inserting a gene encoding a microorganism-derived catalase into an expression vector. 【請求項１０】 微生物が細菌であることを特徴とする
請求項９に記載の組み換えプラスミド。10. The recombinant plasmid according to claim 9, wherein the microorganism is a bacterium. 【請求項１１】 細菌が枯草菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔ
ｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ及び大腸菌の中
から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の組
み換えプラスミド。11. The bacterium is Bacillus subtilis, Bacillus t.
11. The recombinant plasmid according to claim 10, wherein the plasmid is selected from the group consisting of thermoglucosidosis and Escherichia coli. 【請求項１２】 微生物由来のカタラーゼをコードする
遺伝子が請求項２に記載の遺伝子であることを特徴とす
る請求項９に記載の組み換えプラスミド。12. The recombinant plasmid according to claim 9, wherein the gene encoding catalase derived from a microorganism is the gene according to claim 2. 【請求項１３】 発現ベクターが大腸菌発現系に有用な
発現ベクターであることを特徴とする請求項９に記載の
組み換えプラスミド。13. The recombinant plasmid according to claim 9, wherein the expression vector is a useful expression vector for an E. coli expression system. 【請求項１４】 ＡＴＣＣ ２０９４６７、２０９４６
８、２０９４６９及び２０９４７０の中から選択される
ことを特徴とする請求項９に記載の組み換えプラスミ
ド。14. ATCC 209467, 20946.
The recombinant plasmid according to claim 9, which is selected from 8, 209469 and 209470. 【請求項１５】 微生物由来のカタラーゼを発現させる
ための形質転換細胞であって、請求項９から１４のいず
れか１項に記載の組み換えプラスミドで形質転換した宿
主細胞である形質転換細胞。15. A transformed cell for expressing a microorganism-derived catalase, which is a host cell transformed with the recombinant plasmid according to any one of claims 9 to 14. 【請求項１６】 宿主細胞が大腸菌細胞であることを特
徴とする請求項１５に記載の形質転換細胞。16. The transformed cell according to claim 15, wherein the host cell is an E. coli cell. 【請求項１７】 コンタクトレンズ上に残存する残留消
毒薬中の過酸化水素の分解に用いられる組成物であっ
て、請求項３に記載のカタラーゼを有効量で含有する組
成物。17. A composition used for decomposing hydrogen peroxide in a residual disinfectant remaining on a contact lens, comprising a catalase according to claim 3 in an effective amount.