JPH1121298A - Hyperesthesia-inhibiting peptide - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject new peptide originated from the precursor protein of bovine nociceptin, having a specific amino acid sequence, having an activity for inhibiting a hyperesthesia-inducing action, and useful as a hyperesthesia inhibitor, etc. SOLUTION: This new hyperesthesia-inhibiting peptide contains an amino acid sequence of the formula, has an excellent hyperesthesia-inhibiting action, and is useful as a new hyperesthesia inhibitor, etc. The new hyperesthesia- inhibiting peptide is obtained by screening a bovine brain cDNA library with a rat nociceptin precursor cDNA fragment as a probe in order to analyze the structure of a bovine nociceptin precursor protein, analyzing the structure of the obtained bovine nociceptin precursor cDNA, synthesizing a latent cleavable peptide, screening the peptide and subsequently confirming that a peptide corresponding to the 111-127 amino acid sequence has an excellent hyperesthesia- inhibiting action.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は新規な知覚過敏抑制
ペプチドに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel hypersensitivity inhibitory peptide.

【０００２】[0002]

【従来の技術】脊髄後角は疼痛伝達の重要な部位であり
そして多くの伝達物質が入ってくる疼痛情報の調節に関
与している（Yaksh, T. L. et al, Textbook of Pain,
2nd Edn, 283-320, Churchill Livingstone, Edinburg
h, 1989）。シナプス後ニューロンの興奮性や応答性の
亢進、求心性末端の形態学的又は機能的変化によって明
示されるように、侵襲性刺激や非侵襲性刺激に対する感
受性の亢進が脊髄における長期の機能変化に関与し得る
ことが明白になっている（Woolf, C. J., Textbookof P
ain, 3rd Edn, 101-112, Churchill Livingstone, Edin
burgh, 1994）。オピオイド医薬品は上行性及び下行性
疼痛経路を調節することによって鎮静効果をもたらし、
そしてオピオイドレセプターは疼痛伝達における役割の
究明に多くの研究がなされている。最近、オーファンオ
ピオイド様レセプターの内因性リガンドとして、ラッ
ト、ブタ及びウシ脳からヘプタデカペプチド、ノシセプ
チン（又はオーファニンFQ）が単離同定されたことによ
り、オピオイド研究において非常な注目を浴びている
（Meunier, J. C. et al., Nature, 377, 532-535, 199
5、 Reinscheid, R. K. et al., Science, 270, 792-79
4, 1995、Okuda-Ashitaka, E. et al., Mol. Brain Re
s., 43, 96-104, 1996）。（ヒトではORL1、このラット
対応物はLC132及びROR-C）。生体内ではノシセプチンは
より大きな前駆体蛋白質から産生され、ラット、マウス
及びヒトのプレ体ｃＤＮＡ並びに遺伝子構造はすでに報
告されている（Nothacker, H. P. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 93, 8677-8682, 1996; Pan, Y. X. e
t al., Biochem. J., 315, 11-13, 1996; Houtani, T.
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 219, 714-7
19, 1996; Mollereau, C. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 93, 8666-8670, 1996）。BACKGROUND OF THE INVENTION The dorsal horn of the spinal cord is an important site of pain transmission and is involved in the regulation of incoming pain information, where many transmitters are involved (Yaksh, TL et al, Textbook of Pain,
2nd Edn, 283-320, Churchill Livingstone, Edinburg
h, 1989). Increased susceptibility to invasive and non-invasive stimuli leads to long-term functional changes in the spinal cord, as evidenced by increased excitability and responsiveness of postsynaptic neurons, and morphological or functional changes in afferent terminals. It is clear that they can be involved (Woolf, CJ, Textbookof P
ain, 3rd Edn, 101-112, Churchill Livingstone, Edin
burgh, 1994). Opioid drugs provide sedative effects by modulating ascending and descending pain pathways,
And much research has been done on the role of opioid receptors in pain transmission. Recently, the heptadecapeptide, nociceptin (or orphanin FQ) has been isolated and identified from rat, pig and bovine brains as an endogenous ligand for orphan opioid-like receptors, which has attracted great attention in opioid research ( Meunier, JC et al., Nature, 377 , 532-535, 199
5, Reinscheid, RK et al., Science, 270 , 792-79
4, 1995, Okuda-Ashitaka, E. et al., Mol.
s., 43 , 96-104, 1996). (ORL1 in humans, their rat counterparts are LC132 and ROR-C). In vivo, nociceptin is produced from a larger precursor protein, and rat, mouse and human preform cDNA and gene structure have been previously reported (Nothacker, HP et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 93 , 8677-8682, 1996; Pan, YX e
t al., Biochem. J., 315 , 11-13, 1996; Houtani, T.
et al., Biochem. Biophys. Res.Commun., 219 , 714-7
19, 1996; Mollereau, C. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 93 , 8666-8670, 1996).

【０００３】ノシセプチンの生理作用としてこれまで、
運動活性の低下（Reinsheid,R.K. et al., Science, 27
0, 792-794, 1995）、末梢の感覚神経終末からのタキキ
ニンの分泌の抑制（Guiliani, S., et al., Br. J. Pha
rmacol., 118, 1567-1569, 1996）、ラット大脳皮質か
らのグルタミン酸分泌の抑制（Nicol, B. et al., Br.
J. Pharmacol., 119, 1081-1083, 1996）、カエルの卵
におけるＫ⁺チャンネルの抑制（Matthes, H. et al., M
ol. Pharmacol., 50, 447-450, 1996）作用などが報告
されており、本発明者らも最近、i.t.（髄腔内）投与で
ノシセプチンが覚醒マウスでの、非侵襲性の触覚刺激に
応答して異痛応答（アロディニア、Allodynia）を、そ
して侵襲性の刺激に応答して知覚過敏応答を誘導するこ
とを報告した（Hara, N. et al., Br. J. Pharmacol.,
121, 401-408, 1997）。しかしながら、ノシセプチンの
生理作用に影響を与える生体成分についてはなにも知ら
れていない。[0003] As a physiological action of nociceptin,
Decreased locomotor activity (Reinsheid, RK et al., Science, 27
0 , 792-794, 1995), suppression of tachykinin secretion from peripheral sensory nerve endings (Guiliani, S., et al., Br. J. Pha
rmacol., 118 , 1567-1569, 1996), suppression of glutamate secretion from rat cerebral cortex (Nicol, B. et al., Br.
J. Pharmacol., 119 , 1081-1083, 1996), suppression of K ⁺ channels in frog eggs (Matthes, H. et al., M.
ol. Pharmacol., 50, 447-450, 1996), and the present inventors have recently reported that nociceptin induced non-invasive tactile stimulation in awake mice by it (intrathecal) administration. (Hara, N. et al., Br. J. Pharmacol., 2001), reported to induce an allodynic response in response to allodynia (Allodynia) and in response to invasive stimuli.
121 , 401-408, 1997). However, nothing is known about biological components that affect the physiological action of nociceptin.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】ノシセプチンによる知
覚過敏誘導作用を抑制するペプチドを提供することにあ
る。An object of the present invention is to provide a peptide which suppresses the hypersensitivity-inducing effect of nociceptin.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ウシノシ
セプチン前駆体を解析するために、プローブとしてラッ
トのノシセプチン前駆体ｃＤＮＡフラグメント（225〜4
90）を使用して、1,019 bp長のｃＤＮＡ挿入物を含有す
るクローンをウシ脳ｃＤＮＡライブラリーから単離した
（Okuda-Ashitaka, E., et al., Mol. Brain Res., 43,
96-104, 1996）。ウシのノシセプチン前駆体蛋白質
は、176個のアミノ酸残基からなっている（図１）。ヒ
ト、マウス及びラットのノシセプチン前駆体に対してそ
れぞれ86、74及び72％の相同性が存在する。これら４種
の前駆体のアミノ酸配列を比較検討すると、ノシセプチ
ン配列は塩基性アミノ酸残基Ｌys-Ａrg対に挟まれた形
で位置している。ウシの前駆体蛋白質はさらに３つの潜
在的開裂部位を有している: ２つの部位、Ｌys-Ａrgは
ノシセプチンの上流に位置し、そして１つの部位、Ａrg
-Ａrg-Ａrgはノシセプチンの下流に位置している。これ
らの潜在的開裂部位から４つのプロセッシング生成物の
可能性が示唆された。すなわち、 BRL-2（98〜108位に1
1個のアミノ酸残基）、BRL-3（111〜127位に17個のアミ
ノ酸残基）、BRL-4（149〜165位に17個のアミノ酸残
基）及びBRL-5（169〜176位に８個のアミノ酸残基）で
ある。このように、前駆体中、ノシセプチンは二つの塩
基性アミノ酸に挟まれた形で存在し、さらに他の部位に
おいても塩基アミノ酸を両端に保持するペプチドが存在
する。このことは、生体内で産生され生理機能を発現す
る可能性を有する。そこで本発明者らは、これらの推定
上のペプチドが生体内で生物学的に活性であるかどうか
を解明するために、我々はこれらペプチドを化学的に合
成しそして覚醒マウスにおけるノシセプチン誘発性の疼
痛応答に与える効果を研究した。その結果、驚くべきこ
とに、BRL-3がノシセプチンによる知覚過敏誘導作用を
抑制することを見いだした。さらに、BRL-3部位に相当
するヒト、マウスのプレノシセプチン部位の合成ペプチ
ドも同作用を有し、活性中心がそのＣ末端側にあること
を見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち本発
明は、配列番号１、２、３及び４に記載される知覚過敏
抑制ペプチド、配列番号３に記載のペプチドのアミノ酸
配列の１つ又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換、又は
付加されたアミノ酸配列を有する知覚過敏抑制作用を有
するペプチド、配列番号４に記載にペプチドを一部とし
て保有する知覚過敏抑制ペプチド、これらペプチドの化
学修飾された知覚抑制作用を有するペプチド誘導体、配
列番号３に記載のヒトペプチドと反応する抗体、及びこ
れらペプチドを有効成分とする医薬組成物、知覚過敏抑
制剤、に関する。Means for Solving the Problems The present inventors have analyzed a rat nociceptin precursor cDNA fragment (225 to 4) as a probe in order to analyze a bovine nociceptin precursor.
90) was used to isolate a clone containing a 1,019 bp long cDNA insert from a bovine brain cDNA library (Okuda-Ashitaka, E., et al., Mol. Brain Res., 43 ,
96-104, 1996). Bovine nociceptin precursor protein consists of 176 amino acid residues (FIG. 1). There are 86, 74 and 72% homology to human, mouse and rat nociceptin precursors, respectively. When comparing the amino acid sequences of these four precursors, the nociceptin sequence is located between the basic amino acid residue Lys-Arg pairs. The bovine precursor protein has three additional potential cleavage sites: two sites, Lys-Arg, are located upstream of nociceptin, and one site, Arg
-Arg-Arg is located downstream of nociceptin. These potential cleavage sites suggested the possibility of four processing products. In other words, BRL-2 (1
One amino acid residue), BRL-3 (17 amino acid residues at positions 111-127), BRL-4 (17 amino acid residues at positions 149-165), and BRL-5 (positions 169-176) 8 amino acid residues). As described above, in the precursor, nociceptin exists in a form sandwiched between two basic amino acids, and a peptide holding the basic amino acid at both ends also exists at other sites. This has the potential to be produced in vivo and express physiological functions. Thus, to elucidate whether these putative peptides are biologically active in vivo, we synthesized these peptides chemically and induced nociceptin-induced in awake mice. The effect on pain response was studied. As a result, they have surprisingly found that BRL-3 suppresses the hypersensitivity-inducing effect of nociceptin. Furthermore, synthetic peptides at the human and mouse prenociceptin sites corresponding to the BRL-3 site also have the same effect, and they have found that the active center is located at the C-terminal side, thereby completing the present invention. That is, the present invention relates to a hypersensitivity inhibitory peptide described in SEQ ID NO: 1, 2, 3, and 4, wherein one or more amino acids of the amino acid sequence of the peptide described in SEQ ID NO: 3 are deleted, substituted or added. Peptide having a hypersensitivity inhibitory action having the amino acid sequence described above, a hypersensitivity inhibitory peptide having a peptide as a part of SEQ ID NO: 4, a peptide derivative of these peptides having a chemically modified inhibitory action, SEQ ID NO: 3 And a pharmaceutical composition and a hypersensitivity inhibitor containing the peptide as an active ingredient.

【０００６】本発明者らが解析したウシプレノシセプチ
ンアミノ酸配列とヒト、マウス及びラットのそのアミノ
酸配列を比較し、塩基性アミノ酸の間に位置するペプチ
ド、すなわちプロセシングにより生体内で生成され生理
活性を発現すると予想されるペプチドを合成し、初め
て、BRL-3に相当するペプチドが知覚過敏抑制作用を有
することを開示したものである。本発明は、配列番号３
に記載のペプチドのアミノ酸を１つ又は複数個、欠失、
付加又は置換された、該活性を有するペプチドも含まれ
る。また、活性中心がＣ末端部ヘキサペプチドに存在す
ることが確認されたことから、このペプチドを一部とし
て含む、該活性を有するペプチドも本発明に含まれる。
このヘキサペプチドはさらに短くしても活性を発現する
と予想される。さらに、経口投与などを目的として、本
発明の活性ペプチドを基に、化学修飾を施したペプチド
誘導体も本発明に含まれる。[0006] The amino acid sequence of bovine prenocyseptin analyzed by the present inventors is compared with that of human, mouse and rat, and a peptide located between basic amino acids, that is, a bioactivity produced in the living body by processing is determined. It discloses that, for the first time, a peptide expected to be expressed is synthesized, and that a peptide corresponding to BRL-3 has an inhibitory effect on hyperesthesia. The present invention relates to SEQ ID NO: 3.
One or more amino acids of the peptide according to, deletion,
Peptides having the activity added or substituted are also included. In addition, since the active center was confirmed to be present in the C-terminal hexapeptide, a peptide having the activity and including this peptide as a part is also included in the present invention.
This hexapeptide is expected to exhibit activity even if it is shorter. Furthermore, the present invention also includes peptide derivatives chemically modified based on the active peptide of the present invention for oral administration and the like.

【０００７】[0007]

【発明の実施の形態】ペプチドの合成は、液相法、固相
法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自
動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は
常法により行うことができる。抗体の作製は、常法に従
い作製することができ、例えば、ペプチドとキャリア蛋
白質との複合体を抗原として、マウス、兎、モルモット
などに接種免疫することによりポリクロナール抗体を作
製することができる。モノクロナール抗体の作製は、免
疫された動物の脾臓又はリンパ節から得られた抗体産生
細胞と骨髄腫細胞と細胞融合させ、ハイブリドーマとし
て単離されるが、いずれも公知の方法に準ずることがで
きる。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び
抗体断片も本発明に含まれる。これら抗体は、生体試料
中の本発明ペプチド濃度の測定に利用することができ、
疾患との相関性研究に、また医薬として利用することが
期待される。本発明のペプチドは、知覚過敏抑制剤とし
て有効であり、経口的、局所的静注的、皮下注的などに
より投与することができ、局所もしくは静脈内投与が好
ましい。体重に応じて有効量を１〜20mlの生理食塩水に
溶解して用いる。製剤の形としては、水和剤、水溶剤、
錠剤、カプセル剤、粉剤、座剤などが使用でき、これら
製剤の担体としては薬学的に許容される賦形剤、崩壊剤
など通常の医薬品に使用されているものが用いられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Peptide can be synthesized according to a conventional method such as a liquid phase method or a solid phase method, and usually an automatic synthesizer can be used. The synthesis of the chemically modified product can be performed by a conventional method. Antibodies can be prepared according to a conventional method. For example, a polyclonal antibody can be prepared by inoculating mice, rabbits, guinea pigs and the like with a complex of a peptide and a carrier protein as an antigen and inoculating the complex. Monoclonal antibodies can be prepared by cell fusion of antibody-producing cells obtained from the spleen or lymph nodes of the immunized animal with myeloma cells and isolated as hybridomas, all of which can be performed according to known methods. Antibodies include chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and antibody fragments. These antibodies can be used for measuring the concentration of the peptide of the present invention in a biological sample,
It is expected to be used for research on correlation with diseases and as a medicine. The peptide of the present invention is effective as a hypersensitivity inhibitor and can be administered orally, topically, intravenously, subcutaneously, or the like, and is preferably administered locally or intravenously. An effective amount is used by dissolving it in 1 to 20 ml of physiological saline depending on the body weight. Formulations include wettable powders, aqueous solvents,
Tablets, capsules, powders, suppositories and the like can be used, and as carriers for these preparations, those used in ordinary pharmaceuticals such as pharmaceutically acceptable excipients and disintegrants are used.

【０００８】[0008]

【実施例】以下に本発明を具体的に説明するが、本発明
はこれらに限定されない。 実施例１ ペプチド合成 保護ペプチド樹脂の合成は、Wang樹脂（p-benzyloxyben
zyl alcohol resin）を出発原料とし、Fmoc法を適用し
たABI433A自動合成機を用いて行った。FastMoc ^TM 0.25
MonPvPk（Monitor Previous Peak）のプロトコールに従
い、0.25mmolスケールで、遂次アミノ酸誘導体を伸長し
保護ペプチド樹脂を合成した。ただし、縮合剤はHBTUに
換えてHATUを用いた。従って、実際の縮合条件は、Fmoc
-アミノ酸誘導体/HATU/DIEA（4/4/6当量）である。ま
た、用いたアミノ酸側鎖保護基は以下に示すとおりであ
る。アルギニンはPmc（2,2,5,7,8-pentamethylchroman-
6-sulphonyl）基、セリン、スレオニン、チロシン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸はtart-butyl基、グルタミ
ン酸はtrityl基で側鎖官能基が保護されている。保護ペ
プチド樹脂のＮ末端Fmoc基を20％ピペリジンで除去した
後、適当な添加剤を含むTFA（トリフルオロ酢酸）で処
理することにより、残る全保護基の除去及びペプチドを
樹脂から切断し、粗遊離ペプチドを得た。粗ペプチドは
0.1％TFA含有アセトニトリル水溶液を溶離液とした逆相
HPLCで精製した。本発明にて使用したペプチドの合成
法、精製法とも同じ操作で行っているので、ROR-C3（17
アミノ酸残基、ウシ）の結果を代表例として掲げる。得
られた保護ペプチド樹脂0.995gをTFA（TFA/H2O/triisop
ropyl saline＝95/2.5/2.5）30mlを用い、室温で２時間
処理した。樹脂を濾去し、濾液を減圧濃縮した。得られ
た油状残査にエーテルを加え粉末とした。粉末を濾取
し、エーテルで洗浄した。粉末を乾燥後、50％酢酸100m
lに溶解し、水で希釈した後凍結乾燥した。凍結乾燥品4
60mg（Wang resinからの収率：95.5％）を得た。このう
ち100mgを飽和グアニジン塩酸水で調製した25％酢酸水3
0mlに溶かし、YMC pack ODS（SH-363-5,30×250mm）カ
ラムに適用した。16％アセトニトリル/0.1％TFAから40
％アセトニトリル/0.1％TFAへの直線勾配による溶出（8
0分、流速：20ml/min）で精製した。当該ペプチドを含
む画分を集め、アセトニトリルを減圧留去後、凍結乾燥
し80mg得た。 アミノ酸分析（6N塩酸加水分解、110度、22時間） Thr(1)0.93, Glu(8)8.28, Gly(2)1.98, Val(1)1.00, Il
e(1)0.98, Leu(2)2.06,Lys(1)1.01, NH3(3)3.04,Pro(1)
0.95 質量分析：FD MS[M+II]+ 1929.9(理論値：1929.1)DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be specifically described below.
Is not limited to these. Example 1 Peptide Synthesis The synthesis of a protected peptide resin was performed using Wang resin (p-benzyloxyben).
zyl alcohol resin) as a starting material and apply the Fmoc method
ABI433A automatic synthesizer was used. FastMoc ^TM 0.25
Follow the MonPvPk (Monitor Previous Peak) protocol
In the 0.25 mmol scale, successive amino acid derivatives
A protected peptide resin was synthesized. However, the condensing agent is HBTU
HATU was used instead. Therefore, the actual condensation conditions are Fmoc
-Amino acid derivative / HATU / DIEA (4/4/6 equivalents). Ma
The amino acid side chain protecting groups used are as shown below.
You. Arginine is Pmc (2,2,5,7,8-pentamethylchroman-
6-sulphonyl) group, serine, threonine, tyrosine,
Spartic acid and glutamic acid are tart-butyl groups, glutamic acid
The acid has a side chain functional group protected by a trityl group. Protection
N-terminal Fmoc group of peptide resin was removed with 20% piperidine
Then, treat with TFA (trifluoroacetic acid) containing appropriate additives.
Removal of all remaining protecting groups and the peptide
Cleavage from the resin yielded the crude free peptide. The crude peptide
Reversed phase eluted with acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA
Purified by HPLC. Synthesis of peptide used in the present invention
ROR-C3 (17
Amino acid residues, bovine) are shown as representative examples. Profit
0.995 g of the protected peptide resin was added to TFA (TFA / H2O / triisop
ropyl saline = 95 / 2.5 / 2.5) Use 30ml for 2 hours at room temperature
Processed. The resin was removed by filtration, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. Obtained
Ether was added to the resulting oily residue to make a powder. Filter the powder
And washed with ether. After drying the powder, 50% acetic acid 100m
l, diluted with water and lyophilized. Lyophilized product 4
60 mg (yield from Wang resin: 95.5%) was obtained. This
25% acetic acid aqueous solution prepared with 100 mg of saturated guanidine hydrochloride aqueous solution
Dissolve in 0 ml, and use YMC pack ODS (SH-363-5, 30 x 250 mm)
Applied to ram. 16% acetonitrile / 0.1% TFA to 40
Elution with a linear gradient to 8% acetonitrile / 0.1% TFA (8
Purification was carried out at 0 min, at a flow rate of 20 ml / min). Including the peptide
Fractions were collected, acetonitrile was distilled off under reduced pressure, and then lyophilized.
80 mg were obtained. Amino acid analysis (6N HCl hydrolysis, 110 ° C, 22 hours) Thr (1) 0.93, Glu (8) 8.28, Gly (2) 1.98, Val (1) 1.00, Il
e (1) 0.98, Leu (2) 2.06, Lys (1) 1.01, NH3 (3) 3.04, Pro (1)
0.95 mass spectrometry: FD MS [M + II] + 1929.9 (theoretical: 1929.1)

【０００９】実施例２ ノシセプチンによる知覚過敏に
対する作用 異痛（アロディニア、Allodynia）に関する実験は、南
の方法に準じて行った（Minami, T. et al., Pain, 57,
217-223, 1994）。22±2ｇの体重の雄ddＹマウスを使
用し、マイクロシリンジに取り付けた27ゲージのステン
レス鋼針（0.35mm、外径）を、Ｈylden及びＷilcoxの方
法（Hylden, J. L. K. et al., Eur. J.Pharmacol., 6
7, 313-316, 1980）を少し修正してＬ５とＬ６椎骨の間
に挿入した。媒体中の医薬品を覚醒マウスのi.t.（髄
腔）に徐々に注入した。注入量は５μlであった。i.t.
注入後、各マウスは、床に木製チップを敷いた13×8.5
×13cmのPlexiglass個室に入れた。機械的異痛は、本質
的にＹaksh及びＨartyの方法（Yaksh, T. L. et al.,
J. Pharmacol. Exp. Ther., 224, 501-507, 1988）に従
って絵筆でマウスの側腹部を軽くなでて５分毎に１回50
分間に亘って評価した。異痛応答は次のようにランク付
けた: ０、応答無し; １、軽くきーきー鳴いてなでてい
るプローブから逃れようと試みる; ２、なでているプロ
ーブで誘発されて激しくきーきー鳴き、プローブを咬む
か又は逃れようとする強い作用。かくして、６匹のマウ
スの考えられる最高累積得点はどの５分間であっても 2
×6＝12であり、そしてこれを100％とした。異痛に与え
る合成ペプチドの効果を評価するために、ノシセプチン
50pgをi.t.注入して10分後及び５分後に得られた異痛の
最高得点で効果を評価した。Example 2 Effect of Nociceptin on Hypersensitivity Experiments on allodynia (Allodynia) were performed according to the southern method (Minami, T. et al., Pain, 57 ,
217-223, 1994). Using a male ddY mouse weighing 22 ± 2 g, a 27 gauge stainless steel needle (0.35 mm, outer diameter) attached to a microsyringe was used according to the method of Hylden and Wilcox (Hylden, JLK et al., Eur. Pharmacol., 6
7 , 313-316, 1980) with minor modifications and inserted between the L5 and L6 vertebrae. Pharmaceuticals in the vehicle were slowly injected into it (the intrathecal cavity) of awake mice. The injection volume was 5 μl. it
After injection, each mouse received 13 x 8.5 with wooden chips on the floor
It was put in a Plexiglass private room of × 13 cm. Mechanical allodynia is essentially the method of Yaksh and Harty (Yaksh, TL et al.,
J. Pharmacol. Exp. Ther., 224 , 501-507, 1988) lightly stroke the mouse's flank with a paintbrush once every 5 minutes for 50 minutes.
Evaluated over minutes. Allodynia response was ranked as: 0, no response; 1, trying to escape lightly stroking probe; 2, violently triggered by stroking probe -Squeak, strong action of biting or trying to escape the probe. Thus, the highest possible cumulative score for six mice was 2 for any 5 minutes.
× 6 = 12 and this was taken as 100%. To evaluate the effect of synthetic peptides on allodynia, nociceptin
The effect was evaluated by the highest score of allodynia obtained 10 minutes and 5 minutes after injecting 50 pg it.

【００１０】ノシセプチン（50pg／マウス）のi.t.注入
５分後、最初の刺激により顕著な異痛応答が誘発され、
10〜15分で最高値に達し、そして50分の実験期間中続い
た。ノシセプチンと等量のBRL-3の同時注入はノシセプ
チン誘導異痛を50分の実験期間中顕著に阻止した。i.t.
ノシセプチンの５分前にBRL-3を投与することによって
同じ阻止効果が観察されたことから、BRL-3とノシセプ
チンの直接的相互作用はないことが確認された。Five minutes after it injection of nociceptin (50 pg / mouse), the first stimulus elicits a marked allodynic response,
The maximum was reached in 10-15 minutes and continued for the duration of the 50 minute experiment. Co-infusion of nociceptin and an equivalent amount of BRL-3 markedly prevented nociceptin-induced allodynia during the 50 min experimental period. it
The same inhibitory effect was observed by administering BRL-3 5 minutes before nociceptin, confirming that there was no direct interaction between BRL-3 and nociceptin.

【００１１】ノシセプチンと各合成ペプチドを同時に覚
醒マウスのくも膜下腔に注入した。対照マウスには生理
食塩水を与えた。ノシセプチン誘導異痛の評価はi.t.注
入10分後に行い、ノシセプチン単独に対する異痛得点を
100％とした。その結果、図２に示されるように、ノシ
セプチン（50pg）によって生じた異痛は、BRL-3によっ
て用量依存的に抑制され、ID₅₀値は400fgであった（表
１）。しかし乍ら、BRL-2、BRL-4及びBRL-5は500ngまで
の投与量でノシセプチン誘導異痛に影響を与えなかっ
た。BRL-3のi.t.投与はそれ自体では異痛を誘導しなか
った。Nociceptin and each synthetic peptide were simultaneously injected into the subarachnoid space of awake mice. Control mice received saline. Evaluation of nociceptin-induced allodynia was performed 10 minutes after it injection and the allodynia score for nociceptin alone was evaluated.
100%. As a result, as shown in FIG. 2, allodynia caused by nociceptin (50 pg) was suppressed by BRL-3 in a dose-dependent manner, and the ID ₅₀ value was 400 fg (Table 1). However, BRL-2, BRL-4 and BRL-5 did not affect nociceptin-induced allodynia at doses up to 500 ng. It administration of BRL-3 by itself did not induce allodynia.

【００１２】実施例３ ホットプレート試験 マウスを55℃に維持したホットプレート上に置き、そし
てマウスが最初の回避応答（足をなめるか、跳び上がる
か又は素早く足を踏み鳴らす）を示すまでの経過時間を
Woolfeの方法に準じて記録した（Woolfe, G. and MacDo
nald, J. Pharmacol. Exp. Ther., 80, 300-307, 194
4）。ホットプレートに対するマウスの応答時間はノシ
セプチン50pgと500pgのBRL-2, -3, -4, -5 それぞれと
同時に覚醒マウスのくも膜下腔に注入し、15分後に測定
した。動物は各実験で１回の測定にしか使用しなかっ
た。異痛及び痛覚過敏に関する研究は、当地の倫理委員
会の承認を受け、そしてEthics Committee of the Inte
rnational Association for the Study of Painの指針
に従って実施した。Example 3 Hot Plate Test The mouse is placed on a hot plate maintained at 55 ° C. and the time elapsed until the mouse exhibits its first avoidance response (licking, jumping or quickly tapping). To
Recorded according to Woolfe's method (Woolfe, G. and MacDo
nald, J. Pharmacol. Exp.Ther., 80 , 300-307, 194
Four). The response time of the mouse to the hot plate was measured by injecting 50 pg of nociceptin and 500 pg of BRL-2, -3, -4, and -5 into the subarachnoid space of awake mice at the same time, and 15 minutes later. Animals were used for only one measurement in each experiment. Studies on allodynia and hyperalgesia have been approved by the local ethics committee and have been approved by the Ethics Committee of the
The study was conducted according to the guidelines of the rnational Association for the Study of Pain.

【００１３】図３に、ノシセプチン誘発痛覚過敏に与え
る合成ペプチドの効果を示した。i.t.生理的食塩水（1
7.6±0.85秒、ｎ＝8）と比較して、ノシセプチン50pgの
i.t.投与はi.t.注入15分後に応答潜伏期間を8.7±0.63
秒にまで短縮した。ノシセプチン誘発痛覚過敏は500pg
のBRL-3及びBRL-4によって顕著に減弱された（それぞ
れ、15.2±1.03秒及び14.0±0.31秒）。BRL-2及びBRL-5
はノシセプチン誘発痛覚過敏には影響を与えなかった。
これらの結果は、BRL-3がノシセプチンによって誘発さ
れた異痛応答及び痛覚過敏応答を共に抑制したことを示
している。FIG. 3 shows the effect of the synthetic peptide on nociceptin-induced hyperalgesia. it physiological saline (1
7.6 ± 0.85 sec, n = 8) compared to 50 pg of nociceptin
It administration has a response latency of 8.7 ± 0.63 15 minutes after it injection
Seconds. Nociceptin-induced hyperalgesia is 500 pg
Significantly attenuated by BRL-3 and BRL-4 (15.2 ± 1.03 seconds and 14.0 ± 0.31 seconds, respectively). BRL-2 and BRL-5
Had no effect on nociceptin-induced hyperalgesia.
These results indicate that BRL-3 inhibited both nociceptin-induced allodynia and hyperalgesia responses.

【００１４】実施例４ PGE2による異痛及び痛覚過敏に
対する効果 本発明者らは、プロスタグランジンＥ２（PGE2）のi.t.
投与が覚醒マウスで異痛及び痛覚過敏を誘導することを
報告した（Uda, R. et al., Brain Res., 510,26-32, 1
990）。そこで、BRL-3がPGE2誘導疼痛応答を減弱させ得
るかどうかを試験した。実験方法は、実施例２に記載と
同じ方法で、ノシセプチンの代わりにPGE2 10ngとBRL-3
を同時にi.t.投与して５分後に得られた異痛の最高得点
で効果を評価した。対照マウスには生理食塩水を与え、
PGE2単独投与に対する得点を100％とした。その結果、
図４に示されるように、PGE2によって誘発された異痛は
BRL-3によって用量依存的に抑制され、ID₅₀値（95％の
信頼限界）は56.8pg（2.49pg〜739pg）であった。Example 4 Effect of PGE2 on allodynia and hyperalgesia The present inventors have proposed that prostaglandin E2 (PGE2)
It was reported that administration induced allodynia and hyperalgesia in awake mice (Uda, R. et al., Brain Res., 510 , 26-32, 1
990). Thus, it was tested whether BRL-3 could attenuate the PGE2-induced pain response. The experimental method was the same as that described in Example 2, except that nociceptin was replaced with 10 ng of PGE2 and BRL-3.
Was administered simultaneously at the same time, and the effect was evaluated by the highest score of allodynia obtained 5 minutes after it was administered. Control mice received saline,
The score for PGE2 alone administration was taken as 100%. as a result,
As shown in FIG. 4, allodynia induced by PGE2
It was suppressed in a dose-dependent manner by BRL-3 and had an ID ₅₀ value (95% confidence limit) of 56.8 pg (2.49 pg to 739 pg).

【００１５】痛覚過敏に対する効果は、実施例３に記載
の方法で行った。PGE2（10ng）を単独で又は10ngのBRL-
3と同時に覚醒マウスのくも膜下腔に注入した。i.t.注
入30分後に評価した。その結果、図５に示すように、生
理的食塩水を注入した対照マウスは14.7±0.85秒の潜伏
期間でホットプレートに応答した。i.t.投与したPGE2
（10ng）は応答潜伏期間を8.5±0.58秒にまで短縮し、
そしてこれもまた、１ngのBRL-3の同時注入によって、
対照と同じレベル（14.0±0.81秒）に戻された。これら
の結果はBRL-3が、ノシセプチンだけでなくPGE2によっ
て誘発された異痛や痛覚過敏も阻止したことを示してお
り、そしてBRL-3が脊髄レベルでの疼痛伝達で調節役割
を果たし得ることを示唆している。The effect on hyperalgesia was performed by the method described in Example 3. PGE2 (10ng) alone or 10ng BRL-
Simultaneously with 3, the mice were injected into the subarachnoid space of awake mice. Evaluated 30 minutes after it injection. As a result, as shown in FIG. 5, the control mice injected with physiological saline responded to the hot plate with an incubation period of 14.7 ± 0.85 seconds. PGE2 administered it
(10ng) reduces response latency to 8.5 ± 0.58 seconds,
And this too, by co-injecting 1 ng of BRL-3,
It was returned to the same level as the control (14.0 ± 0.81 seconds). These results indicate that BRL-3 blocked not only nociceptin but also PGE2-induced allodynia and hyperalgesia, and that BRL-3 may play a regulatory role in pain transmission at the spinal cord level It suggests.

【００１６】実施例５ 構造活性相関 次に、本発明者らは、他動物種の前駆体蛋白質のプロセ
ッシングされた部分が同じ生物学的活性を有しているか
どうかを確認した。BRL-3の両側にはＬys-Ａrg対が109
〜110位と128〜129位に配置されていたが、ヒト、ラッ
ト及びマウスの前駆体蛋白質には前者の開裂部位が無
く、それぞれ30、35及び41個のアミノ酸残基のプロセッ
シングされる生成物の可能性が示唆される（図１）。こ
れは長さが変動しそして種間保持の低いアミノ酸配列を
限定しているように思われるが、ペプチド間の長さの変
動は６個のアミノ酸モチーフＤＡＥＰＧＡ及びれに類し
たアミノ酸配列の繰り返し: マウスで３回、ラットで２
回、そしてヒトで１回によるものであり、そしてBRL-3
に対応するこれらペプチドのＣ末端の半分は種間でかな
り保持されている。我々はマウス前駆体蛋白質のBRL-3
対応部位（MRL-3と記す）及びヒト前駆体蛋白質のBRL-3
対応部位（HRL-3と記す）ヘプタデカペプチド、BRL-3の
カルボキシル末端オクタペプチド（ＥＩＥＱＫＱＬＱ）
（BRL-3-8Ｐと記す）及び種間で100％保持されているヘ
キサペプチド（ＥＱＫＱＬＱ）（RL-3-6Ｐと記す）を合
成し、そしてこれらがノシセプチン誘発異痛を抑制する
能力を試験した。その結果、これらの合成ペプチド、MR
L-3、HRL-3、BRL-3-8Ｐ及びRL-3-6Ｐは全て用量依存的
に異痛を抑制し、ID₅₀値はそれぞれ５pg、500pg、400fg
及び20pgであった（表１、図６）。これらの結果は、ノ
シセプチン前駆体のプロセッシングされたペプチドのカ
ルボキシル末端共用部分が生物学的活性に重要であるこ
とを示している。合成したペプチドの活性は表１に示し
た。Example 5 Structure-Activity Relationship Next, the present inventors confirmed whether the processed portions of the precursor protein of another animal species have the same biological activity. Lys-Arg pairs on both sides of BRL-3 109
The human, rat and mouse precursor proteins have no cleavage site and are processed at 30, 35 and 41 amino acid residues, respectively, although they are located at positions ~ 110 and 128-129. (Fig. 1). While this appears to limit amino acid sequences that vary in length and have low interspecies retention, the length variation between the peptides is a repeat of the six amino acid motif DAEPGA and similar amino acid sequences: 3 times with mice, 2 times with rats
Times, and once in humans, and BRL-3
The C-terminal half of these peptides, corresponding to, is highly conserved among species. We use mouse precursor protein BRL-3
Corresponding site (denoted as MRL-3) and BRL-3 of human precursor protein
Corresponding site (HRL-3) heptadecapeptide, carboxyl terminal octapeptide of BRL-3 (EIEQKQLQ)
(Described as BRL-3-8P) and hexapeptides (EQKQLQ) (designated as RL-3-6P) that are 100% retained between species, and tested for their ability to suppress nociceptin-induced allodynia did. As a result, these synthetic peptides, MR
L-3, HRL-3, BRL-3-8P and RL-3-6P all suppressed allodynia in a dose-dependent manner, with ID ₅₀ values of 5 pg, 500 pg and 400 fg, respectively.
And 20 pg (Table 1, FIG. 6). These results indicate that the carboxyl terminal shared portion of the processed peptide of nociceptin precursor is important for biological activity. Table 1 shows the activities of the synthesized peptides.

【００１７】[0017]

【表１】 [Table 1]

【００１８】実施例６ BRL-3の生体内分布 マウス脊髄におけるこの新規ペプチドの分布を抗MRL-3
抗体を用いて試験した。抗BRL-3及び抗MRL-3 ポリクロ
ーナル抗血清は、以前に報告された方法（Okuda-Ashita
ka, E. et al., J. Biol. Chem., 271, 31255-31261, 1
996）に従って、抗原としてアオガイヘモシアニンとの
抱合体を用い、ウサギに免疫し作製した。得られた抗BR
L-3抗体は、BRL-3-8Ｐ抱合セファロース 4Ｂカラムで精
製した。免疫学的組織染色は以下に手法で行った。ddＹ
マウスをフェノバルビタールで麻酔し、リン酸緩衝生理
的食塩液（PBS）、続いてリン酸緩衝液中４％のパラホ
ルムアルデヒドで潅流した。脊髄を取り出し、同じ固定
液中４℃で一夜固定し、そして30％蔗糖を含有する冷リ
ン酸緩衝液中に保持した。切片（40μm）は凍結ミクロ
トームで切断した。これらの切片を、MRL-3又はノシセ
プチンに対する抗血清（Phoenix Pharmaceuticals, In
c.）と共に室温で一夜インキュベートし、10％の正常ヤ
ギ血清及び0.2％のトリトンＸ-100を含有するＰＢＳで
洗浄し、そしてＣy3抗ウサギIgＧで処理した。クリプト
ン／アルゴンレーザーを備えたBioRadMCR-1000共焦点顕
微鏡上でデジタル画像をとらえ、そしてFuji Pictograp
hy 3000プリンターで印刷した。Example 6 Biodistribution of BRL-3 The distribution of this novel peptide in the mouse spinal cord was determined by anti-MRL-3
Tested with antibodies. Anti-BRL-3 and anti-MRL-3 polyclonal antisera were obtained by previously reported methods (Okuda-Ashita
ka, E. et al., J. Biol. Chem., 271 , 31255-31261, 1
According to 996), rabbits were immunized and prepared using a conjugate with blue mussel hemocyanin as an antigen. Obtained anti-BR
The L-3 antibody was purified on a BRL-3-8P conjugated Sepharose 4B column. Immunological tissue staining was performed by the following method. ddY
Mice were anesthetized with phenobarbital and perfused with phosphate buffered saline (PBS) followed by 4% paraformaldehyde in phosphate buffer. Spinal cords were removed, fixed in the same fixative overnight at 4 ° C., and kept in cold phosphate buffer containing 30% sucrose. Sections (40 μm) were cut with a freezing microtome. These sections were prepared using antisera against MRL-3 or nociceptin (Phoenix Pharmaceuticals, Ind.).
c.) overnight at room temperature, washed with PBS containing 10% normal goat serum and 0.2% Triton X-100, and treated with Cy3 anti-rabbit IgG. Capture digital images on a BioRad MCR-1000 confocal microscope equipped with a krypton / argon laser and use Fuji Pictograp
Printed on hy 3000 printer.

【００１９】MRL-3 様の免疫反応性は脊髄後角の浅層に
豊富であったが、脊髄灰白質の深層にも存在した。この
染色は反応混合物にMRL-3を添加することによって消失
した。更に、MRL-3 様の免疫反応性の分布は、抗ノシセ
プチン抗体を使用して検出されるノシセプチンの分布と
殆ど同一であるように思われた。MRL-3様免疫反応性も
またノシセプチン様免疫反応性もカプサイシン処理によ
って影響を受けず、これらのペプチドが一次求心性ニュ
ーロンよりはむしろ中枢性ニューロンで生成、放出さ
れ、そしてそれによって疼痛伝達を反対方向に調節する
ことを示している。MRL-3-like immunoreactivity was abundant in the shallow layer of the dorsal horn of the spinal cord, but also deep in the spinal gray matter. This staining was abolished by adding MRL-3 to the reaction mixture. Furthermore, the distribution of MRL-3-like immunoreactivity appeared to be almost identical to the distribution of nociceptin detected using anti-nociceptin antibodies. Neither MRL-3-like nor nociceptin-like immunoreactivity is affected by capsaicin treatment, and these peptides are produced and released in central rather than primary afferent neurons, thereby opposing pain transmission This indicates that the direction is adjusted.

【００２０】実施例７ ウシ脳内因性BRL-3の確認 生体内でのBRL-3ペプチドの存在を確認するために、我
々はウシ脳の海馬、視床下部、内側嗅皮質及び中隔から
得られる内因性BRL-3の精製を試みた。ウシ脳の海馬、
視床下部、内側嗅皮質及び中隔を地方屠殺場で残りの領
域から分離し、ドライアイスで急速冷凍し、そして使用
まで−80℃で貯蔵した。冷凍ウシ脳（203ｇ）を小片に
切断しそして２容量（ｖ/ｗ）の沸騰水中で10分間熱処
理して内在性プロテアーゼを不活性化した。冷却後、水
層を0.5Ｍの酢酸（AcOH）の最終濃度にし、そして沸騰
させた組織はUltra-Turraxホモジナイザーを用いて最高
速度で２分間ホモジネートして抽出した。このホモジネ
ートを8,500×ｇで30分間遠心し、そして上清液（280m
l）を粗抽出物として使用した。凍結乾燥後、粗抽出物
を0.1Ｍ AcOH 5mlに溶解し、そして0.1Ｍ AcOHで平衡化
したBio-Gel P-4カラム（1.5×100cm）に適用した。ノ
シセプチン（分子量 1,810）を含有する溶出物で推定し
た分子量1,900程度のフラクションを集め、中和し、そ
して抗BRL-3 抗体を抱合したアフィニティクロマトグラ
フィーに付した。カラム（0.7×３cm）は、100mＭ Ｎa
Ｃlを含有する0.1Ｍ トリス-ＨＣl 50mlで洗浄し、そし
て次に吸着された物質を0.2Ｍ グリシン-ＨＣl、pH 2.5
で溶出した。溶出物の分別物をグルタールアルデヒドで
ウシ血清アルブミンと結合させ、そしてドットブロット
装置を使用してニトロセルロース膜に適用し、抗BRL-3
抗体を使用して免疫ブロット法で評価した。BRL-3 免疫
反応性物質を含有する溶出物を合わせ、そしてTSK ODS-
120Ｔカラム（4.6×250mm、Tosoh、東京都）を使用して
RP-HPLCに付し、そして0.1％トリフルオロ酢酸中30〜45
％のCH₃CNの40分間直線的勾配で溶出した。免疫反応性
フラクションは、気相自動蛋白質シークエンサーを使用
して直接アミノ酸配列決定に付した。その結果、図１の
ウシプレノシセプチンアミノ酸配列、No.111-127位に相
当する、BRL-3と同一であった。このペプチドの収量は
概ね300pmolであると推定された。このペプチドの同一
性は、マトリックス補助レーザー脱着イオン化を有する
飛行時間マススペクトロメーターによる質量分析法で確
認され、コンピューター検索（PRF/SEQDBデータベー
ス、Protein Research Foundation、日本国大阪府）は
既知のペプチドとの相同性を全く示さない。Example 7 Identification of bovine brain endogenous BRL-3 To confirm the presence of the BRL-3 peptide in vivo, we obtain from the hippocampus, hypothalamus, medial olfactory cortex and septum of bovine brain. Purification of endogenous BRL-3 was attempted. The hippocampus of the bovine brain,
The hypothalamus, medial olfactory cortex and septum were separated from the remaining area at a local slaughterhouse, snap frozen on dry ice, and stored at -80 ° C until use. Frozen bovine brain (203 g) was cut into small pieces and heat treated in 2 volumes (v / w) of boiling water for 10 minutes to inactivate endogenous proteases. After cooling, the aqueous layer was brought to a final concentration of 0.5 M acetic acid (AcOH), and the boiled tissues were extracted using a Ultra-Turrax homogenizer at maximum speed for 2 minutes. The homogenate was centrifuged at 8,500 × g for 30 minutes, and the supernatant (280 m
l) was used as crude extract. After lyophilization, the crude extract was dissolved in 5 ml of 0.1 M AcOH and applied to a Bio-Gel P-4 column (1.5 x 100 cm) equilibrated with 0.1 M AcOH. Fractions having a molecular weight of about 1,900 estimated from an eluate containing nociceptin (molecular weight: 1,810) were collected, neutralized, and subjected to affinity chromatography conjugated with an anti-BRL-3 antibody. The column (0.7 × 3 cm) is 100 mM Na
Wash with 50 ml of 0.1 M Tris-HCl containing Cl and then remove the adsorbed material with 0.2 M glycine-HCl, pH 2.5
Eluted. The eluate fractions were conjugated to bovine serum albumin with glutaraldehyde and applied to nitrocellulose membrane using a dot blot apparatus to generate anti-BRL-3
The antibodies were used for immunoblot evaluation. Combine the eluates containing BRL-3 immunoreactive material and TSK ODS-
Using a 120T column (4.6 × 250mm, Tosoh, Tokyo)
RP-HPLC and 30-45 in 0.1% trifluoroacetic acid
Eluted with a linear gradient of 40% CH ₃ CN for 40 minutes. The immunoreactive fraction was subjected to direct amino acid sequencing using a gas phase automated protein sequencer. As a result, it was identical to BRL-3, which corresponds to the bovine prenociceptin amino acid sequence of FIG. 1 and Nos. 111-127. The yield of this peptide was estimated to be approximately 300 pmol. The identity of this peptide was confirmed by mass spectrometry with a time-of-flight mass spectrometer with matrix-assisted laser desorption ionization, and a computer search (PRF / SEQDB database, Protein Research Foundation, Osaka, Japan) revealed that Shows no homology.

【００２１】以上の結果から、BRL-3がこのペプチドに
特異的なレセプターと相互作用し、そしてそれによって
中枢神経系で新しい神経伝達物質系が構築されることを
示唆している。新規な知覚過敏抑制剤として期待され
る。The above results suggest that BRL-3 interacts with a receptor specific for this peptide and thereby establishes a new neurotransmitter system in the central nervous system. It is expected as a new hypersensitivity inhibitor.

【００２２】[0022]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Glu Pro Gly Leu Glu Glu Val Gly Glu Ile Glu Gln Lys Gln Leu 1 5 10 15 Gln SEQ ID NO: 1 Sequence length: 17 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence Thr Glu Pro Gly Leu Glu Glu Val Gly Glu Ile Glu Gln Lys Gln Leu 1 5 10 15 Gln

【００２３】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Glu Pro Gly Ala Asp Asp Ala Glu Glu Val Glu Gln Lys Gln Leu 1 5 10 15 GlnSEQ ID NO: 2 Sequence length: 17 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide sequence Ala Glu Pro Gly Ala Asp Asp Ala Glu Glu Val Glu Gln Lys Gln Leu 1 5 10 15 Gln

【００２４】配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Glu Pro Gly Met Glu Glu Ala Gly Glu Met Glu Gln Lys Gln Leu 1 5 10 15 GlnSEQ ID NO: 3 Sequence length: 17 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide sequence Pro Glu Pro Gly Met Glu Glu Ala Gly Glu Met Glu Gln Lys Gln Leu 1 5 10 15 Gln

【００２５】配列番号：４ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Gln Lys Gln Leu Gln 1 5SEQ ID NO: 4 Sequence length: 6 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide sequence Glu Gln Lys Gln Leu Gln 15

【００２６】[0026]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】ウシ、ヒト、マウス及びラットのノシセプチン
前駆体のアミノ酸配列。FIG. 1. Amino acid sequence of bovine, human, mouse and rat nociceptin precursor.

【図２】ノシセプチンによる異痛に対するペプチドの効
果。ノシセプチン（50pg／マウス）単独（白丸）、BRL-
2（黒丸）、BRL-3（白三角)、BRL-4（黒三角）、BRL-5
（白四角）。平均値±s.e.m.（ｎ＝６）、ノシセプチン
注入群と比較して、*ｐ＜0.05、**ｐ＜0.01。FIG. 2: Effect of peptide on allodynia due to nociceptin. Nociceptin (50 pg / mouse) alone (open circle), BRL-
2 (black circle), BRL-3 (white triangle), BRL-4 (black triangle), BRL-5
(White square). Mean ± sem (n = 6), * p <0.05, ** p <0.01 compared to nociceptin-injected group.

【図３】ノシセプチンによる痛覚過敏に対するペプチド
の効果。ノシセプチン（50pg／マウス）を500pgのBRL-
2、BRL-3、BRL-4又はBRL-5と同時に覚醒マウスの髄腔内
に注入。各点は平均値±s.e.m.（ｎ＝８）。ノシセプチ
ン注入群と比較して、**ｐ＜0.01。FIG. 3. Effect of peptide on nociceptin-induced hyperalgesia. Nociceptin (50 pg / mouse) was added to 500 pg of BRL-
2. BRL-3, BRL-4 or BRL-5 is injected into the cerebrospinal cavity of awake mice at the same time. Each point is an average value ± sem (n = 8). ** p <0.01 compared to nociceptin infusion group.

【図４】PGE2による異痛に対するBRL-3の効果。平均値
±s.e.m.（ｎ＝６）。PGE2注入群と比較して、**ｐ＜0.
01。FIG. 4. Effect of BRL-3 on allodynia caused by PGE2. Mean ± sem (n = 6). ** p <0 compared to PGE2 injection group.
01.

【図５】PGE2による痛覚過敏に対するBRL-3の効果。平
均値±s.e.m.（ｎ＝10）。PGE2注入群と比較して、**ｐ
＜0.01。FIG. 5: Effect of BRL-3 on hyperalgesia by PGE2. Mean ± sem (n = 10). ** p compared to PGE2 injection group
<0.01.

【図６】ノシセプチンによる異痛に対する各種合成ペプ
チド（i.t.注入）の効果。ノシセプチン（50pg／マウ
ス）単独（×）、BRL-3（黒丸）、MRL-3（白丸）、HRL-
3（黒三角）、BRL-3-8Ｐ（白三角）、MRL-3-8Ｐ（黒四
角）及びRL-3-6Ｐ（白四角）。FIG. 6 shows the effect of various synthetic peptides (it injection) on allodynia caused by nociceptin. Nociceptin (50 pg / mouse) alone (x), BRL-3 (black circle), MRL-3 (white circle), HRL-
3 (closed triangle), BRL-3-8P (open triangle), MRL-3-8P (closed square) and RL-3-6P (open square).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＱ ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI C12P 21/08 A61K 37/02 AAAQ

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】配列番号１に記載の知覚過敏抑制ペプチ
ド。(1) a hypersensitivity suppressing peptide according to SEQ ID NO: 1; 【請求項２】配列番号２に記載の知覚過敏抑制ペプチ
ド。2. The hypersensitive hypersensitivity peptide according to SEQ ID NO: 2. 【請求項３】配列番号３に記載の知覚過敏抑制ペプチ
ド。3. A peptide for suppressing hypersensitivity according to SEQ ID NO: 3. 【請求項４】配列番号４に記載の知覚過敏抑制ペプチ
ド。4. A peptide for suppressing hypersensitivity according to SEQ ID NO: 4. 【請求項５】配列番号３に記載のペプチドのアミノ酸配
列の、１つ又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換、又は
付加されたアミノ酸配列を有する、知覚過敏抑制作用を
有するペプチド。5. A peptide having an inhibitory effect on hyperesthesia, wherein one or more amino acids of the amino acid sequence of the peptide shown in SEQ ID NO: 3 have a deletion, substitution or addition amino acid sequence. 【請求項６】配列番号４に記載のペプチドを一部として
含むことを特徴とする、知覚過敏抑制作用を有するペプ
チド。6. A peptide having an inhibitory effect on hyperesthesia, which comprises the peptide of SEQ ID NO: 4 as a part. 【請求項７】請求項５に記載のペプチドを化学的に修飾
した、知覚過敏抑制作用を有するペプチド誘導体。7. A peptide derivative having a hypersensitivity inhibitory activity, wherein the peptide according to claim 5 is chemically modified. 【請求項８】請求項１ないし７に記載のペプチドを有効
成分とする知覚過敏抑制剤。8. A hypersensitivity inhibitor comprising the peptide according to claim 1 as an active ingredient. 【請求項９】配列番号３に記載の知覚過敏抑制ペプチド
に対する抗体。9. An antibody against the hypersensitivity suppressing peptide of SEQ ID NO: 3.