JPH11178590A - デカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子 - Google Patents
デカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子Info
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- JPH11178590A JPH11178590A JP10262075A JP26207598A JPH11178590A JP H11178590 A JPH11178590 A JP H11178590A JP 10262075 A JP10262075 A JP 10262075A JP 26207598 A JP26207598 A JP 26207598A JP H11178590 A JPH11178590 A JP H11178590A
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- ala
- amino acid
- leu
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 プレニル二リン酸合成酵素及びその遺伝子の
提供。 【解決手段】 配列番号２で表されるアミノ酸配列から
なるタンパク質、又は該アミノ酸配列において少なくと
も１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列からなり、プレニル二リン酸合成酵素活性をも
たらすタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、
該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターによ
って形質転換された形質転換体、並びにプレニル二リン
酸合成酵素及びユビキノン-10 の製造方法。
提供。 【解決手段】 配列番号２で表されるアミノ酸配列から
なるタンパク質、又は該アミノ酸配列において少なくと
も１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列からなり、プレニル二リン酸合成酵素活性をも
たらすタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、
該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターによ
って形質転換された形質転換体、並びにプレニル二リン
酸合成酵素及びユビキノン-10 の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、デカプレニル二リ
ン酸合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を
含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換され
た形質転換体並びにデカプレニル二リン酸合成酵素及び
ユビキノン-10 の製造方法に関する。
ン酸合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を
含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換され
た形質転換体並びにデカプレニル二リン酸合成酵素及び
ユビキノン-10 の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】イソプレノイドは自然界において23,000
種以上存在する最も多様な化合物群であり、それらの中
にはステロール、カロテノイド、糖キャリアー脂質、プ
レニルキノン、プレニル化タンパクなどが含まれる（図
１）。これらのイソプレノイド化合物の生合成過程にお
いて基本となる炭素骨格の形成、すなわち炭素数５のイ
ソプレン単位であるイソペンテニル二リン酸(IPP)のhea
d-to-tail型の重合的縮合反応を触媒する酵素は、プレ
ニル二リン酸合成酵素と総称される。それぞれのプレニ
ル二リン酸合成酵素は生成するプレニル二リン酸の鎖
長、立体構造等の違いにより大きく四種類に分類される
（表１）。
種以上存在する最も多様な化合物群であり、それらの中
にはステロール、カロテノイド、糖キャリアー脂質、プ
レニルキノン、プレニル化タンパクなどが含まれる（図
１）。これらのイソプレノイド化合物の生合成過程にお
いて基本となる炭素骨格の形成、すなわち炭素数５のイ
ソプレン単位であるイソペンテニル二リン酸(IPP)のhea
d-to-tail型の重合的縮合反応を触媒する酵素は、プレ
ニル二リン酸合成酵素と総称される。それぞれのプレニ
ル二リン酸合成酵素は生成するプレニル二リン酸の鎖
長、立体構造等の違いにより大きく四種類に分類される
（表１）。
【０００３】
【表１】
【０００４】短鎖プレニル二リン酸合成酵素（プレニル
トランスフェラーゼＩ）に属するのはゲラニル二リン酸
(GPP、C10)合成酵素、ファルネシル二リン酸(FPP、C15)
合成酵素(Eberhardt,N.L. et al.,(1975) J.Biol.Chem.
250,863-866) 、ゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP、C2
0)合成酵素(Sagami,H. et al., (1994) J.Biol.Chem.26
9, 20561-20566)等である。これらの酵素によって生合
成される短鎖のプレニル二リン酸は水溶性であり、他の
グループに属するポリプレニル二リン酸合成酵素のアリ
ル性プライマー基質としても供給される。
トランスフェラーゼＩ）に属するのはゲラニル二リン酸
(GPP、C10)合成酵素、ファルネシル二リン酸(FPP、C15)
合成酵素(Eberhardt,N.L. et al.,(1975) J.Biol.Chem.
250,863-866) 、ゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP、C2
0)合成酵素(Sagami,H. et al., (1994) J.Biol.Chem.26
9, 20561-20566)等である。これらの酵素によって生合
成される短鎖のプレニル二リン酸は水溶性であり、他の
グループに属するポリプレニル二リン酸合成酵素のアリ
ル性プライマー基質としても供給される。
【０００５】中鎖プレニル二リン酸合成酵素（プレニル
トランスフェラーゼII）にはヘキサプレニル二リン酸(H
exPP、C30)合成酵素(Fujii,H. et al.,(1982) J.Biol.C
hem.257,14610) 、ヘプタプレニル二リン酸(HepPP、C3
5)合成酵素(Takahashi,I. etal.,(1980)J.Biol.Chem.25
5,4539)等が属する。これらの酵素が前述の短鎖プレニ
ル二リン酸合成酵素と大きく異なる点は、互いに単独で
は触媒機能を持たない２種類のタンパク質より形成され
るヘテロ二量体型の酵素であるということである。これ
らは、通常解離して存在するが、基質が存在すると会合
し、酵素としての機能を発現する。これらの酵素による
生成物は疎水性が高く、ミセルを形成する性質があるに
もかかわらず、酵素活性発現に脂質や界面活性剤等を必
要としない。これは、中鎖プレニル二リン酸合成酵素が
このような動的な解離、会合を繰り返す特殊な酵素系で
あるためであると考えられている。
トランスフェラーゼII）にはヘキサプレニル二リン酸(H
exPP、C30)合成酵素(Fujii,H. et al.,(1982) J.Biol.C
hem.257,14610) 、ヘプタプレニル二リン酸(HepPP、C3
5)合成酵素(Takahashi,I. etal.,(1980)J.Biol.Chem.25
5,4539)等が属する。これらの酵素が前述の短鎖プレニ
ル二リン酸合成酵素と大きく異なる点は、互いに単独で
は触媒機能を持たない２種類のタンパク質より形成され
るヘテロ二量体型の酵素であるということである。これ
らは、通常解離して存在するが、基質が存在すると会合
し、酵素としての機能を発現する。これらの酵素による
生成物は疎水性が高く、ミセルを形成する性質があるに
もかかわらず、酵素活性発現に脂質や界面活性剤等を必
要としない。これは、中鎖プレニル二リン酸合成酵素が
このような動的な解離、会合を繰り返す特殊な酵素系で
あるためであると考えられている。
【０００６】Ｅ型長鎖プレニル二リン酸合成酵素（プレ
ニルトランスフェラーゼIII ）にはオクタプレニル二リ
ン酸(OctPP、C40)合成酵素、デカプレニル二リン酸(DP
P、C50)合成酵素等が属する。これらの酵素はプレニル
トランスフェラーゼIIとは異なり非解離性のホモダイマ
ーであり、ポリプレニル二リン酸キャリアータンパク質
により活性化される(Ohnuma,S. et al.,(1991)J.Biol.C
hem.266,23706-23713)。この活性化は、疎水性の反応生
成物を酵素の活性部位から除去することにより触媒のタ
ーンオーバーを維持するものと考えられている。
ニルトランスフェラーゼIII ）にはオクタプレニル二リ
ン酸(OctPP、C40)合成酵素、デカプレニル二リン酸(DP
P、C50)合成酵素等が属する。これらの酵素はプレニル
トランスフェラーゼIIとは異なり非解離性のホモダイマ
ーであり、ポリプレニル二リン酸キャリアータンパク質
により活性化される(Ohnuma,S. et al.,(1991)J.Biol.C
hem.266,23706-23713)。この活性化は、疎水性の反応生
成物を酵素の活性部位から除去することにより触媒のタ
ーンオーバーを維持するものと考えられている。
【０００７】Ｚ型長鎖プレニル二リン酸合成酵素（プレ
ニルトランスフェラーゼIV）にはノナプレニル二リン酸
(E,E-ファルネシル-all-Z-ヘキサプレニル二リン酸、C4
5)合成酵素、ウンデカプレニル二リン酸(E,E-ファルネ
シル-all-Z-オクタプレニル二リン酸、C55)合成酵素等
が属する。これらの酵素による反応の生成物は細菌の細
胞壁生合成の際、糖のキャリアー脂質として働く。活性
発現にはリン脂質や界面活性剤の添加が必要である。ま
た、プレニルトランスフェラーゼIIIに分類されているD
PP合成酵素も活性発現に界面活性剤が必要であることが
知られている。
ニルトランスフェラーゼIV）にはノナプレニル二リン酸
(E,E-ファルネシル-all-Z-ヘキサプレニル二リン酸、C4
5)合成酵素、ウンデカプレニル二リン酸(E,E-ファルネ
シル-all-Z-オクタプレニル二リン酸、C55)合成酵素等
が属する。これらの酵素による反応の生成物は細菌の細
胞壁生合成の際、糖のキャリアー脂質として働く。活性
発現にはリン脂質や界面活性剤の添加が必要である。ま
た、プレニルトランスフェラーゼIIIに分類されているD
PP合成酵素も活性発現に界面活性剤が必要であることが
知られている。
【０００８】ところで、土壌細菌パラコッカス・デニト
リフィカンス（Paracoccus denitrificans）は、ヒトの
ミトコンドリアの起源とも考えられているバクテリアで
ある。そして、他のバクテリアよりも呼吸鎖および酸化
的リン酸化機構が効率的であり、一つの組織としてまと
まっていること等の点で、よりミトコンドリアに近い特
徴を有している(John, P. et al.,(1975) Nature 254,
495-498)。パラコッカス・デニトリフィカンスからは、
これまで３種のプレニル二リン酸合成酵素活性が確認さ
れている（図２）。すなわち、ジメチルアリル二リン酸
(DMAPP)と二分子のIPPがＥ型に縮合してFPPを生成するF
PP合成酵素、FPPより６分子のIPPがＺ型に縮合してノナ
プレニル二リン酸(NPP)を生成するNPP合成酵素(Ishii,
K. et al.,(1986) Biochem. J. 233, 773-777) 、そし
てFPPより７分子のIPPがＥ型に縮合してDPPを生成するD
PP合成酵素(Ishii, K. et al.,(1983) Biochem. Biophy
s.Res. Commun. 116, 500-506)である。
リフィカンス（Paracoccus denitrificans）は、ヒトの
ミトコンドリアの起源とも考えられているバクテリアで
ある。そして、他のバクテリアよりも呼吸鎖および酸化
的リン酸化機構が効率的であり、一つの組織としてまと
まっていること等の点で、よりミトコンドリアに近い特
徴を有している(John, P. et al.,(1975) Nature 254,
495-498)。パラコッカス・デニトリフィカンスからは、
これまで３種のプレニル二リン酸合成酵素活性が確認さ
れている（図２）。すなわち、ジメチルアリル二リン酸
(DMAPP)と二分子のIPPがＥ型に縮合してFPPを生成するF
PP合成酵素、FPPより６分子のIPPがＺ型に縮合してノナ
プレニル二リン酸(NPP)を生成するNPP合成酵素(Ishii,
K. et al.,(1986) Biochem. J. 233, 773-777) 、そし
てFPPより７分子のIPPがＥ型に縮合してDPPを生成するD
PP合成酵素(Ishii, K. et al.,(1983) Biochem. Biophy
s.Res. Commun. 116, 500-506)である。
【０００９】NPP合成酵素により生成するNPPはこのバク
テリアの細胞壁生合成に必須な糖担体脂質となる。しか
し、既にクローニングされ解析が進んでいる数種のＥ型
プレニル二リン酸合成酵素とは異なり、NPP合成酵素や
ウンデカプレニル二リン酸合成酵素のようなＺ型の縮合
反応を触媒するプレニル二リン酸合成酵素については、
その構造と触媒機能との関係は未だ明らかにされていな
い。
テリアの細胞壁生合成に必須な糖担体脂質となる。しか
し、既にクローニングされ解析が進んでいる数種のＥ型
プレニル二リン酸合成酵素とは異なり、NPP合成酵素や
ウンデカプレニル二リン酸合成酵素のようなＺ型の縮合
反応を触媒するプレニル二リン酸合成酵素については、
その構造と触媒機能との関係は未だ明らかにされていな
い。
【００１０】また、DPP合成酵素により生成するDPPは、
このバクテリアの産生する電子伝達系の成分であるユビ
キノン-10のプレニル側鎖に代謝される。細菌のプレニ
ルトランスフェラーゼII、III に分類される酵素におい
て生合成されるC30からC50までのポリプレニル二リン酸
は、いずれも各々のメナキノンおよびユビキノンの側鎖
の前駆体として供給される。従って、それぞれの酵素の
生成物の鎖長はそのままその酵素の由来する細菌のプレ
ニルキノンの側鎖長に反映する。プレニルキノンの中で
もユビキノン-10は、ヒトの補酵素Q(CoQ)と側鎖長が同
一であることより、パラコッカス・デニトリフィカンス
から工業的に抽出され、医薬品として利用されている。
ユビキノンは以前より慢性心臓疾患に対し有効であるこ
とが知られており、抗不整脈剤としても有効であるた
め、アントラサイクリン抗ガン剤投与による不整脈防止
等にも利用されている(Fujioka,T. et al., Tohoku J.
Exp.Med. (1983) 141 suppl. 453-463)。
このバクテリアの産生する電子伝達系の成分であるユビ
キノン-10のプレニル側鎖に代謝される。細菌のプレニ
ルトランスフェラーゼII、III に分類される酵素におい
て生合成されるC30からC50までのポリプレニル二リン酸
は、いずれも各々のメナキノンおよびユビキノンの側鎖
の前駆体として供給される。従って、それぞれの酵素の
生成物の鎖長はそのままその酵素の由来する細菌のプレ
ニルキノンの側鎖長に反映する。プレニルキノンの中で
もユビキノン-10は、ヒトの補酵素Q(CoQ)と側鎖長が同
一であることより、パラコッカス・デニトリフィカンス
から工業的に抽出され、医薬品として利用されている。
ユビキノンは以前より慢性心臓疾患に対し有効であるこ
とが知られており、抗不整脈剤としても有効であるた
め、アントラサイクリン抗ガン剤投与による不整脈防止
等にも利用されている(Fujioka,T. et al., Tohoku J.
Exp.Med. (1983) 141 suppl. 453-463)。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、デカプレニ
ル二リン酸合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺
伝子を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転
換された形質転換体並びにデカプレニル二リン酸合成酵
素及びユビキノン-10 の製造方法を提供することを目的
とする。
ル二リン酸合成酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺
伝子を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転
換された形質転換体並びにデカプレニル二リン酸合成酵
素及びユビキノン-10 の製造方法を提供することを目的
とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、パラコッカス・デニト
リフィカンスから長鎖のデカプレニル二リン酸合成酵素
遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成
するに至った。すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は
（ｂ）の組換えタンパク質である。 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質 （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において少な
くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつデカプレニル二リン酸合成
酵素活性を有するタンパク質
基づいて鋭意研究を行った結果、パラコッカス・デニト
リフィカンスから長鎖のデカプレニル二リン酸合成酵素
遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成
するに至った。すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は
（ｂ）の組換えタンパク質である。 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質 （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において少な
くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつデカプレニル二リン酸合成
酵素活性を有するタンパク質
【００１３】さらに、本発明は、前記（ａ）又は（ｂ）
の組換えタンパク質をコードする遺伝子である。該遺伝
子としては、例えば配列番号１で表される塩基配列を含
むものが挙げられる。さらに、本発明は、前記遺伝子を
含有する組換えベクターである。さらに、本発明は、前
記組換えベクターによって形質転換された形質転換体で
ある。
の組換えタンパク質をコードする遺伝子である。該遺伝
子としては、例えば配列番号１で表される塩基配列を含
むものが挙げられる。さらに、本発明は、前記遺伝子を
含有する組換えベクターである。さらに、本発明は、前
記組換えベクターによって形質転換された形質転換体で
ある。
【００１４】さらに、本発明は、前記形質転換体を培地
に培養し、得られる培養物からデカプレニル二リン酸合
成酵素を採取することを特徴とするデカプレニル二リン
酸合成酵素の製造方法である。さらに、本発明は、前記
形質転換体からユビキノン-10 を抽出することを特徴と
するユビキノン-10 の製造方法である。
に培養し、得られる培養物からデカプレニル二リン酸合
成酵素を採取することを特徴とするデカプレニル二リン
酸合成酵素の製造方法である。さらに、本発明は、前記
形質転換体からユビキノン-10 を抽出することを特徴と
するユビキノン-10 の製造方法である。
【００１５】以下、本発明を詳細に説明する。これま
で、プレニル二リン酸合成酵素（以下、プレニルトラン
スフェラーゼともいう）には、種を越えて高度に保存さ
れた領域が７つ存在することが知られている（Koyama,
T. et al.(1993)J.Biochem.113,355)。本発明では、各
種プレニルトランスフェラーゼ間で高度に保存されてい
るアミノ酸配列を基にしてプライマー用の縮重オリゴヌ
クレオチドをデザインし、これらのプライマーを各種組
み合わせて、土壌細菌パラコッカス・デニトリフィカン
ス（Paracoccus denitrificans；以下、「P.denitrific
ans 」という）由来のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ
を行い、増幅された部分配列をプローブとしてスクリー
ニングすることにより、本発明の遺伝子を得ることがで
きる。
で、プレニル二リン酸合成酵素（以下、プレニルトラン
スフェラーゼともいう）には、種を越えて高度に保存さ
れた領域が７つ存在することが知られている（Koyama,
T. et al.(1993)J.Biochem.113,355)。本発明では、各
種プレニルトランスフェラーゼ間で高度に保存されてい
るアミノ酸配列を基にしてプライマー用の縮重オリゴヌ
クレオチドをデザインし、これらのプライマーを各種組
み合わせて、土壌細菌パラコッカス・デニトリフィカン
ス（Paracoccus denitrificans；以下、「P.denitrific
ans 」という）由来のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ
を行い、増幅された部分配列をプローブとしてスクリー
ニングすることにより、本発明の遺伝子を得ることがで
きる。
【００１６】１．プレニル二リン酸合成酵素をコードす
る遺伝子のクローニング (1) ゲノムＤＮＡの調製 まず、プレニル二リン酸合成酵素の産生菌、例えば土壌
細菌P. denitrificansの培養細胞からゲノムＤＮＡを調
製する。ゲノムＤＮＡの調製は公知のいずれの手法をも
用いることができる。例えば、酵母エキス２ｇ、ポリペ
プトン10ｇ、MgSO4・7H2O 1g、蒸留水１L を含む培地(80
2培地) に上記菌株を植菌し、30℃で１日〜数日（飽和
するまで）培養する。続いて微生物菌体をリゾチームで
処理し、さらにラウリル硫酸ナトリウム等の界面活性剤
で処理した後、フェノール、クロロホルム、エーテル等
の有機溶媒で除タンパクし、エタノールで沈殿させるこ
とにより容易にゲノムDNAを調製することができる(Sait
o, H. et al.,(1963) Biochim. Biophys Acta 72, 619-
629)。
る遺伝子のクローニング (1) ゲノムＤＮＡの調製 まず、プレニル二リン酸合成酵素の産生菌、例えば土壌
細菌P. denitrificansの培養細胞からゲノムＤＮＡを調
製する。ゲノムＤＮＡの調製は公知のいずれの手法をも
用いることができる。例えば、酵母エキス２ｇ、ポリペ
プトン10ｇ、MgSO4・7H2O 1g、蒸留水１L を含む培地(80
2培地) に上記菌株を植菌し、30℃で１日〜数日（飽和
するまで）培養する。続いて微生物菌体をリゾチームで
処理し、さらにラウリル硫酸ナトリウム等の界面活性剤
で処理した後、フェノール、クロロホルム、エーテル等
の有機溶媒で除タンパクし、エタノールで沈殿させるこ
とにより容易にゲノムDNAを調製することができる(Sait
o, H. et al.,(1963) Biochim. Biophys Acta 72, 619-
629)。
【００１７】次に、得られるゲノムＤＮＡをベクタープ
ラスミドにつないでゲノムＤＮＡライブラリーを調製す
る。その調製は公知の方法に従って行うことができる。
例えば、適当な制限酵素（例えばEcoRI 、BamHI、Hind
III、Sau3AI、MboI、PstI等）を用いてゲノムのＤＮＡ
鎖とプラスミドのＤＮＡ鎖を切断した後、ＤＮＡリガー
ゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ等）で処理するか、又は
その切断末端の状態によってはターミナルトランスフェ
ラーゼ若しくはＤＮＡポリメラーゼ等で処理した後、Ｄ
ＮＡリガーゼを作用させてＤＮＡ鎖を結合する（Molecu
lar cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 269, 1
982; Nelson T. et al., Method in Enzymol., 68, 41,
(1979))。ここで用いられるベクターとしては、λファ
ージベクター（λgt10、Charon 4A 、EMBL-3等) 、プラ
スミドベクター（pBR322、pSC101、pUC19 、pUC119、pA
CYC117）などが挙げられ、前記ＤＮＡ断片をこれらのベ
クターに組み込んだ後、大腸菌（DH1 、HB101 、JM109
、C600、MV1184、TH2 ）等を形質転換してゲノムＤＮ
Ａライブラリーを得ることができる。
ラスミドにつないでゲノムＤＮＡライブラリーを調製す
る。その調製は公知の方法に従って行うことができる。
例えば、適当な制限酵素（例えばEcoRI 、BamHI、Hind
III、Sau3AI、MboI、PstI等）を用いてゲノムのＤＮＡ
鎖とプラスミドのＤＮＡ鎖を切断した後、ＤＮＡリガー
ゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ等）で処理するか、又は
その切断末端の状態によってはターミナルトランスフェ
ラーゼ若しくはＤＮＡポリメラーゼ等で処理した後、Ｄ
ＮＡリガーゼを作用させてＤＮＡ鎖を結合する（Molecu
lar cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 269, 1
982; Nelson T. et al., Method in Enzymol., 68, 41,
(1979))。ここで用いられるベクターとしては、λファ
ージベクター（λgt10、Charon 4A 、EMBL-3等) 、プラ
スミドベクター（pBR322、pSC101、pUC19 、pUC119、pA
CYC117）などが挙げられ、前記ＤＮＡ断片をこれらのベ
クターに組み込んだ後、大腸菌（DH1 、HB101 、JM109
、C600、MV1184、TH2 ）等を形質転換してゲノムＤＮ
Ａライブラリーを得ることができる。
【００１８】(2) スクリーニング用プローブの作製 まず、前記ゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションによ
りスクリーニングするためのプローブを作製する。目的
のＤＮＡに対してより特異性の高いプローブを作製する
ためには、各生物種間でアミノ酸残基の保存性の高い領
域をコードするオリゴヌクレオチドを作製するのが適当
と考えられる。なお、プローブは、通常の化学合成によ
り得ることができる。この条件に合うものとして、図３
を基に、以下の保存アミノ酸配列を選択する。
りスクリーニングするためのプローブを作製する。目的
のＤＮＡに対してより特異性の高いプローブを作製する
ためには、各生物種間でアミノ酸残基の保存性の高い領
域をコードするオリゴヌクレオチドを作製するのが適当
と考えられる。なお、プローブは、通常の化学合成によ
り得ることができる。この条件に合うものとして、図３
を基に、以下の保存アミノ酸配列を選択する。
【００１９】領域Ｉの「(Gly又はGlu) Gly Lys Arg Ile
Arg Pro」配列（配列番号３） 領域IIの「(Thr又はMet) Ala (Ser 又はThr) Leu (Val,
Ile 又はLeu) His Asp」配列（配列番号４）、「Ala Se
r Leu Leu His Asp Asp 」配列（配列番号５）及び「Al
a Asp Leu Arg Arg Gly 」配列（配列番号６） 領域III の「Leu Ala Gly Asp Phe Leu Leu 」配列（配
列番号７） 領域IVの「Gly Glu Leu Leu Gln Leu 」配列（配列番号
８） 領域V の「Lys Thr Ala Leu Leu Ile 」配列（配列番号
９） 領域VIの「Phe Gln Leu Ile Asp Asp 」配列（配列番号
10）、「Asp Asp IleLeu Asp Phe 」配列（配列番号1
1）、「Gly Lys Asn Val Gly Asp Asp 」配列（配列番
号12）及び「Asp Asp (Leu,Ile又はMet) Leu Asp (Tyr
又はPhe) (Asn 又はThr)」配列（配列番号13）
Arg Pro」配列（配列番号３） 領域IIの「(Thr又はMet) Ala (Ser 又はThr) Leu (Val,
Ile 又はLeu) His Asp」配列（配列番号４）、「Ala Se
r Leu Leu His Asp Asp 」配列（配列番号５）及び「Al
a Asp Leu Arg Arg Gly 」配列（配列番号６） 領域III の「Leu Ala Gly Asp Phe Leu Leu 」配列（配
列番号７） 領域IVの「Gly Glu Leu Leu Gln Leu 」配列（配列番号
８） 領域V の「Lys Thr Ala Leu Leu Ile 」配列（配列番号
９） 領域VIの「Phe Gln Leu Ile Asp Asp 」配列（配列番号
10）、「Asp Asp IleLeu Asp Phe 」配列（配列番号1
1）、「Gly Lys Asn Val Gly Asp Asp 」配列（配列番
号12）及び「Asp Asp (Leu,Ile又はMet) Leu Asp (Tyr
又はPhe) (Asn 又はThr)」配列（配列番号13）
【００２０】ここで、領域Ｉ、II、III、IV、V及びVI
は、Koike-Takeshita, A. et al.,(1995) J. Biol. Che
m. 270, 18396-18400 に記載されたバチルス・ステアロ
サーモフィラス(Bacillus stearothermophylus) 由来の
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列のう
ち、それぞれ第43〜53番目、第74〜95番目、第110 〜11
9番目、第145 〜150 番目、第170 〜175 番目、第204
〜230 番目の領域である。
は、Koike-Takeshita, A. et al.,(1995) J. Biol. Che
m. 270, 18396-18400 に記載されたバチルス・ステアロ
サーモフィラス(Bacillus stearothermophylus) 由来の
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸配列のう
ち、それぞれ第43〜53番目、第74〜95番目、第110 〜11
9番目、第145 〜150 番目、第170 〜175 番目、第204
〜230 番目の領域である。
【００２１】なお、生物種間における保存アミノ酸配列
の検討は、バチルス・ステアロサーモフィラス、エッシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）、サッカロミセス
・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ラットお
よびヒトのFPS 、エルウィニア・ヘルビコラ（ Erwinia
herbicola）およびエルウィニア・ウレドボラ（Erwini
a uredovora ）のGGPS並びにサッカロミセス・セレビシ
エのHexPS 等、既知のプレニル二リン酸合成酵素の間で
行うことができる。これらのアミノ酸配列を基にして以
下のオリゴヌクレオチドプローブを作製する。
の検討は、バチルス・ステアロサーモフィラス、エッシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）、サッカロミセス
・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ラットお
よびヒトのFPS 、エルウィニア・ヘルビコラ（ Erwinia
herbicola）およびエルウィニア・ウレドボラ（Erwini
a uredovora ）のGGPS並びにサッカロミセス・セレビシ
エのHexPS 等、既知のプレニル二リン酸合成酵素の間で
行うことができる。これらのアミノ酸配列を基にして以
下のオリゴヌクレオチドプローブを作製する。
【００２２】すなわち、本発明では、各種プレニルトラ
ンスフェラーゼ間で高度に保存されているアミノ酸配
列、また、特にヘキサプレニル二リン酸(HexPP,C30)、
ヘプタプレニル二リン酸(HepPP,C35)(Koike-Takeshita,
A. et al.(1995) J. Biol. Chem. 270, 18396-18400)
及びオクタプレニル二リン酸(OctPP,C40)(Jeong, J.
H.,et al. DNA Seq. 4, 59-67(1993))のような中鎖およ
び長鎖のプレニルトランスフェラーゼに特徴的に見られ
る配列を基にして、例えば以下に示す縮重プライマーを
12種類デザインする。
ンスフェラーゼ間で高度に保存されているアミノ酸配
列、また、特にヘキサプレニル二リン酸(HexPP,C30)、
ヘプタプレニル二リン酸(HepPP,C35)(Koike-Takeshita,
A. et al.(1995) J. Biol. Chem. 270, 18396-18400)
及びオクタプレニル二リン酸(OctPP,C40)(Jeong, J.
H.,et al. DNA Seq. 4, 59-67(1993))のような中鎖およ
び長鎖のプレニルトランスフェラーゼに特徴的に見られ
る配列を基にして、例えば以下に示す縮重プライマーを
12種類デザインする。
【００２３】 センスプライマー S1（配列番号３の配列をもとに設計）: 5'-(CG)(AG)CGG(AT)AA(AG)C(AG)(CGT)AT(CGT)CGTCC-3'（配列番号14） S2（配列番号４の配列をもとに設計）: 5'-A(CT)(ACGT)GC(GT)(AT)C(ACGT)CT(ACGT)(CGT)T(ACGT)CACGA-3'（配列番号15 ) S3（配列番号３の配列をもとに設計）: 5'-GG(ACGT)GG(ACGT)AA(AG)CG(ACGT)AT(ACT)CG(ACGT)CC-3'（配列番号16） S4（配列番号５の配列をもとに設計）: 5'-GC(ACGT)TC(ACGT)CT(ACGT)CT(ACGT)CA(CT)GACGA-3'（配列番号17） S5（配列番号６の配列をもとに設計）: 5'-GC(ACGT)GA(CT)TT(AG)(AC)G(ACGT)(AC)G(ACGT)GG-3'（配列番号18） S6（配列番号７の配列をもとに設計）: 5'-(CT)T(ACGT)GC(ACGT)GG(ACGT)GA(CT)TT(CT)TT(AG)TT-3'（配列番号19）
【００２４】 アンチセンスプライマー； A1（配列番号13の配列をもとに設計）: 5'-(GT)T(AG)(AT)AATCGAG(TA)A(ACT)(AG)TC(AG)TC-3'（配列番号20） A2（配列番号８の配列をもとに設計）: 5'-(ACGT)A(AG)(CT)TG(CT)AA(ACGT)A(AG)(CT)TC(ACGT)CC-3'（配列番号21） A3（配列番号９の配列をもとに設計）: 5'-(AGT)AT(ACGT)AG(ACGT)AG(ACGT)GC(ACGT)GT(TC)TT-3'（配列番号22） A4（配列番号10の配列をもとに設計）: 5'-(AG)TC(AG)TC(AGT)AT(CT)AA(CT)TG(AG)AA-3'（配列番号23） A5（配列番号11の配列をもとに設計）: 5'-(AG)AA(AG)TC(ACGT)A(AG)(AGT)AT(AG)TC(AG)TC-3'（配列番号24） A6（配列番号12の配列をもとに設計）: 5'-(AG)TC(AG)TC(ACGT)CC(ACGT)AC(AG)TT(CT)TT(ACGT)CC-3'（配列番号25）
【００２５】(3) プレニル二リン酸合成酵素遺伝子の一
部の遺伝子のクローニング P.denitrificans のゲノムＤＮＡからの本発明の遺伝子
のスクリーニングは、公知の手法、例えばサザンハイブ
リダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、
ＰＣＲ及びこれらの組合せ等によって行うことができ
る。例えば、P.denitrificans のゲノムＤＮＡについ
て、上記プライマーを組み合わせてＰＣＲを行い、プレ
ニル二リン酸合成酵素遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。
目的の遺伝子を含むと思われるＤＮＡ断片を電気泳動で
分離・回収し、ベクターと連結反応後、大腸菌を形質転
換してクローニングする。このようにして得られたＤＮ
Ａ断片（pCR14）は、プレニル二リン酸合成酵素遺伝子
を全長取得するためのプローブとして適している。
部の遺伝子のクローニング P.denitrificans のゲノムＤＮＡからの本発明の遺伝子
のスクリーニングは、公知の手法、例えばサザンハイブ
リダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、
ＰＣＲ及びこれらの組合せ等によって行うことができ
る。例えば、P.denitrificans のゲノムＤＮＡについ
て、上記プライマーを組み合わせてＰＣＲを行い、プレ
ニル二リン酸合成酵素遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。
目的の遺伝子を含むと思われるＤＮＡ断片を電気泳動で
分離・回収し、ベクターと連結反応後、大腸菌を形質転
換してクローニングする。このようにして得られたＤＮ
Ａ断片（pCR14）は、プレニル二リン酸合成酵素遺伝子
を全長取得するためのプローブとして適している。
【００２６】(4) プレニル二リン酸合成酵素遺伝子全長
のクローニング プローブpCR14 は、前述のようにP.denitrificansのプ
レニル二リン酸合成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片
である。そこで、本発明のプレニル二リン酸合成酵素の
ペプチドをコードする遺伝子をスクリーニングするに
は、pCR14 を用いて例えば以下のように行う。Sau3AIで
部分消化したゲノムＤＮＡの10〜5 kbpの部分をアガロ
ースゲルより抽出し、pUC119のBamHI 部位に挿入して、
大腸菌JM109株を形質転換し、ＤＮＡライブラリーを作
製する。そしてプローブを用いてコロニーハイブリダイ
ゼーションを行う。
のクローニング プローブpCR14 は、前述のようにP.denitrificansのプ
レニル二リン酸合成酵素遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片
である。そこで、本発明のプレニル二リン酸合成酵素の
ペプチドをコードする遺伝子をスクリーニングするに
は、pCR14 を用いて例えば以下のように行う。Sau3AIで
部分消化したゲノムＤＮＡの10〜5 kbpの部分をアガロ
ースゲルより抽出し、pUC119のBamHI 部位に挿入して、
大腸菌JM109株を形質転換し、ＤＮＡライブラリーを作
製する。そしてプローブを用いてコロニーハイブリダイ
ゼーションを行う。
【００２７】(5) 塩基配列の決定 前記のようにして得られたクローンを適当な制限酵素で
消化してアガロースゲル中で電気泳動し、その泳動パタ
ーンと泳動距離から制限酵素地図を作成する。この制限
酵素地図を基にＤＮＡ断片のデリーション（小断片化）
を行い、活性を示す最小のクローンを得、活性を示すＤ
ＮＡについて塩基配列の解析を行う。塩基配列は、イン
サートの片側から欠失させたデリーションクローンを正
逆両方向について作製したものを用いて決定すればよ
い。
消化してアガロースゲル中で電気泳動し、その泳動パタ
ーンと泳動距離から制限酵素地図を作成する。この制限
酵素地図を基にＤＮＡ断片のデリーション（小断片化）
を行い、活性を示す最小のクローンを得、活性を示すＤ
ＮＡについて塩基配列の解析を行う。塩基配列は、イン
サートの片側から欠失させたデリーションクローンを正
逆両方向について作製したものを用いて決定すればよ
い。
【００２８】スクリーニングされたクローンを、適当な
制限酵素、例えばEcoRI 、PstIなどで切断後、pUC119、
pUC19 等のプラスミドにクローニングし、通常用いられ
る塩基配列分析方法、例えばSangarらのジデオキシ法(S
anger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74,
5463(1977)) 等によって目的とするＤＮＡの塩基配列を
決定することができる。塩基配列の決定は、塩基配列自
動分析装置、例えばT7Sequencing Kit（ファルマシア
社）等を用いて行うことができる。
制限酵素、例えばEcoRI 、PstIなどで切断後、pUC119、
pUC19 等のプラスミドにクローニングし、通常用いられ
る塩基配列分析方法、例えばSangarらのジデオキシ法(S
anger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74,
5463(1977)) 等によって目的とするＤＮＡの塩基配列を
決定することができる。塩基配列の決定は、塩基配列自
動分析装置、例えばT7Sequencing Kit（ファルマシア
社）等を用いて行うことができる。
【００２９】(6) 遺伝子の同定 プレニル二リン酸合成酵素遺伝子と予想される領域を発
現ベクターに組み込み、大腸菌を形質転換する。培養菌
体を破砕して得られた粗酵素抽出液の活性を測定するこ
とにより、本発明のプレニル二リン酸合成酵素、特にデ
カプレニル二リン酸合成酵素を同定することができる。
また、形質転換体のユビキノン側鎖長を測定することに
より遺伝子の同定をすることができる。
現ベクターに組み込み、大腸菌を形質転換する。培養菌
体を破砕して得られた粗酵素抽出液の活性を測定するこ
とにより、本発明のプレニル二リン酸合成酵素、特にデ
カプレニル二リン酸合成酵素を同定することができる。
また、形質転換体のユビキノン側鎖長を測定することに
より遺伝子の同定をすることができる。
【００３０】配列番号１にプレニルトランスフェラーゼ
をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号２に本発明
のプレニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す
が、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する限り、配
列番号２で表されるアミノ酸の少なくとも１個（好まし
くは１個又は数個）に欠失、置換、付加等の変異が生じ
てもよい。また、配列番号１で表される塩基配列のほ
か、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポリペプチド
をコードする配列についても本発明の遺伝子に含まれ
る。
をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号２に本発明
のプレニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す
が、プレニルトランスフェラーゼ活性を有する限り、配
列番号２で表されるアミノ酸の少なくとも１個（好まし
くは１個又は数個）に欠失、置換、付加等の変異が生じ
てもよい。また、配列番号１で表される塩基配列のほ
か、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポリペプチド
をコードする配列についても本発明の遺伝子に含まれ
る。
【００３１】なお、上記変異の導入は、公知の方法、例
えばKunkel法（Kunkel, T. A. Proc. Natl. Acad. Sc
i.(1985) 82, 488)等により容易に行うことができる。
このようにして塩基配列が決定された後は、化学合成に
より、又はＰＣＲ等により得られたＤＮＡ断片を用いて
ハイブリダイズさせることにより、目的とする遺伝子を
得ることができる。
えばKunkel法（Kunkel, T. A. Proc. Natl. Acad. Sc
i.(1985) 82, 488)等により容易に行うことができる。
このようにして塩基配列が決定された後は、化学合成に
より、又はＰＣＲ等により得られたＤＮＡ断片を用いて
ハイブリダイズさせることにより、目的とする遺伝子を
得ることができる。
【００３２】２．組換えベクター及び形質転換体の作製 本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
遺伝子を組み込むことにより得ることができる。また、
本発明の形質転換体は、本発明の組み換えベクターを、
該組み換えベクターを作製する際に用いたベクターに適
合する宿主中に導入することにより得られる。精製され
た遺伝子を、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマ
ルチクローニングサイトに挿入して組換えベクターを作
製し、当該組換えベクターを用いて、宿主細胞を形質転
換する。
遺伝子を組み込むことにより得ることができる。また、
本発明の形質転換体は、本発明の組み換えベクターを、
該組み換えベクターを作製する際に用いたベクターに適
合する宿主中に導入することにより得られる。精製され
た遺伝子を、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマ
ルチクローニングサイトに挿入して組換えベクターを作
製し、当該組換えベクターを用いて、宿主細胞を形質転
換する。
【００３３】DNA 断片を挿入するためのベクター DNA
は、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定され
ず、例えばプラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられ
る。プラスミド DNAとしては、例えばプラスミド pUC11
8 (宝酒造社製)、pUC119 (宝酒造社製)、pBluescript S
K+ (Stratagene 社製)、pGEM-T (Promega 社製) 等が挙
げられ、ファージ DNAとしては、例えば M13mp18、M13m
p19 等が挙げられる。宿主としては、目的とする遺伝子
を発現できるものであれば特に限定されず、真核細胞及
び原核細胞のいずれをも用いることができる。例えば、
大腸菌 (Escherichia coli）、バチルス・ズブチリス
(Bacillus subtilis)等の細菌、サッカロミセス・セレ
ビシエ (Saccharomyces cerevisiae) 等の酵母、COS 細
胞、CHO細胞等の動物細胞などが挙げられる。
は、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定され
ず、例えばプラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられ
る。プラスミド DNAとしては、例えばプラスミド pUC11
8 (宝酒造社製)、pUC119 (宝酒造社製)、pBluescript S
K+ (Stratagene 社製)、pGEM-T (Promega 社製) 等が挙
げられ、ファージ DNAとしては、例えば M13mp18、M13m
p19 等が挙げられる。宿主としては、目的とする遺伝子
を発現できるものであれば特に限定されず、真核細胞及
び原核細胞のいずれをも用いることができる。例えば、
大腸菌 (Escherichia coli）、バチルス・ズブチリス
(Bacillus subtilis)等の細菌、サッカロミセス・セレ
ビシエ (Saccharomyces cerevisiae) 等の酵母、COS 細
胞、CHO細胞等の動物細胞などが挙げられる。
【００３４】大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合
は、本発明の組換えベクターが該宿主中で自律複製可能
であると同時に、プロモーター、本発明の遺伝子、転写
終結配列を含む構成であることが好ましい。例えば、大
腸菌としては XL1-Blue (Stratagene 社製)、JM109
（宝酒造社製) 等が挙げられ、発現ベクターとしては、
例えば pTrc99A、pET 発現系等が挙げられる。プロモー
ターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであ
ればいずれを用いてもよい。例えば、trp プロモータ
ー、lac プロモーター、PLプロモーター、PRプロモータ
ーなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが
用いられる。本発明では、大腸菌の形質転換は、例えば
Hanahanの方法（Hanahan D. J., Mol. Biol.(1983) 16
6, 557）により行うことができる。
は、本発明の組換えベクターが該宿主中で自律複製可能
であると同時に、プロモーター、本発明の遺伝子、転写
終結配列を含む構成であることが好ましい。例えば、大
腸菌としては XL1-Blue (Stratagene 社製)、JM109
（宝酒造社製) 等が挙げられ、発現ベクターとしては、
例えば pTrc99A、pET 発現系等が挙げられる。プロモー
ターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであ
ればいずれを用いてもよい。例えば、trp プロモータ
ー、lac プロモーター、PLプロモーター、PRプロモータ
ーなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが
用いられる。本発明では、大腸菌の形質転換は、例えば
Hanahanの方法（Hanahan D. J., Mol. Biol.(1983) 16
6, 557）により行うことができる。
【００３５】酵母を宿主として用いる場合は、発現ベク
ターとして、例えば YEp13、YCp50等が挙げられる。プ
ロモーターとしては、例えば gal 1プロモーター、gal
10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクタ
ーの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション
法（Becker D. M., Methods. Enzymol., 194, 182-187
(1991)）、スフェロプラスト法（Hinnen A., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 75, 1929-1933 (1978)）、酢酸リ
チウム法（Ito H., J. Bacteriol., 153, 163-168 (198
3)）等が挙げられる。
ターとして、例えば YEp13、YCp50等が挙げられる。プ
ロモーターとしては、例えば gal 1プロモーター、gal
10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクタ
ーの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション
法（Becker D. M., Methods. Enzymol., 194, 182-187
(1991)）、スフェロプラスト法（Hinnen A., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 75, 1929-1933 (1978)）、酢酸リ
チウム法（Ito H., J. Bacteriol., 153, 163-168 (198
3)）等が挙げられる。
【００３６】動物細胞を宿主として用いる場合は、発現
ベクターとして例えばpSG5、pREP4、pZeoSV等が用いら
れる。動物細胞への組換え体 DNAの導入方法としては、
例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム
沈殿法等が挙げられる。なお、ベクター DNAとしてプラ
スミド DNAを用いる場合、例えば EcoRI DNA断片を挿入
する際、プラスミド DNAを制限酵素 EcoRIを用いて消化
しておく。次いで、DNA 断片と切断されたベクター DNA
とを混合し、これに、例えば T4 DNA リガーゼ (宝酒造
社製) を作用させて組換えベクターを得る。
ベクターとして例えばpSG5、pREP4、pZeoSV等が用いら
れる。動物細胞への組換え体 DNAの導入方法としては、
例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム
沈殿法等が挙げられる。なお、ベクター DNAとしてプラ
スミド DNAを用いる場合、例えば EcoRI DNA断片を挿入
する際、プラスミド DNAを制限酵素 EcoRIを用いて消化
しておく。次いで、DNA 断片と切断されたベクター DNA
とを混合し、これに、例えば T4 DNA リガーゼ (宝酒造
社製) を作用させて組換えベクターを得る。
【００３７】３. プレニルトランスフェラーゼの生産 前記のようにして得られた組換え体ベクターを保有する
形質転換体を培養すれば、本発明のプレニルトランスフ
ェラーゼを生産することができる。培養方法は、通常の
固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好
ましい。形質転換体を培養する培地としては、例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等から選ばれる１種以上
の窒素源に、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化第二鉄等の無機塩類の１種以上を添加し、更に
必要により糖質原料、抗生物質、ビタミン等を適宜添加
したものが用いられる。また、必要により培地に IPTG
等を添加して、遺伝子の発現を誘導してもよい。培養開
始時の培地の pH は6.8 〜7.5 に調節し、培養は通常28
〜42℃、好ましくは37℃前後で５時間〜一晩、通気撹拌
培養、振盪培養等により行う。
形質転換体を培養すれば、本発明のプレニルトランスフ
ェラーゼを生産することができる。培養方法は、通常の
固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好
ましい。形質転換体を培養する培地としては、例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等から選ばれる１種以上
の窒素源に、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化第二鉄等の無機塩類の１種以上を添加し、更に
必要により糖質原料、抗生物質、ビタミン等を適宜添加
したものが用いられる。また、必要により培地に IPTG
等を添加して、遺伝子の発現を誘導してもよい。培養開
始時の培地の pH は6.8 〜7.5 に調節し、培養は通常28
〜42℃、好ましくは37℃前後で５時間〜一晩、通気撹拌
培養、振盪培養等により行う。
【００３８】培養終了後、培養物より本発明のプレニル
トランスフェラーゼを採取するには、通常のタンパク質
精製手段を用いることができる。すなわち、リゾチーム
等の酵素を用いた溶菌処理、超音波破砕処理、磨砕処理
等により菌体を破壊し、プレニルトランスフェラーゼを
菌体外に排出させる。次いで、濾過又は遠心分離等を用
いて不溶物を除去し、粗ポリペプチド溶液を得る。
トランスフェラーゼを採取するには、通常のタンパク質
精製手段を用いることができる。すなわち、リゾチーム
等の酵素を用いた溶菌処理、超音波破砕処理、磨砕処理
等により菌体を破壊し、プレニルトランスフェラーゼを
菌体外に排出させる。次いで、濾過又は遠心分離等を用
いて不溶物を除去し、粗ポリペプチド溶液を得る。
【００３９】上記粗ポリペプチド溶液から、ポリペプチ
ドをさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を使
用することができる。例えば、硫安塩析法、イオン交換
クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ
過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わせること
により行う。
ドをさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を使
用することができる。例えば、硫安塩析法、イオン交換
クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ
過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わせること
により行う。
【００４０】４．ユビキノン-10 の生産 ユビキノンは、多くの生物において電子伝達系成分とし
て知られており、生物種によってそのイソプレノイド側
鎖の長さが異なるものである。大腸菌では、OPP 合成酵
素によって供給されるイソプレンユニット８のイソプレ
ン側鎖、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae) では６のイソプレン側鎖、ヒトで
は10のイソプレン側鎖をそれぞれ持っている。
て知られており、生物種によってそのイソプレノイド側
鎖の長さが異なるものである。大腸菌では、OPP 合成酵
素によって供給されるイソプレンユニット８のイソプレ
ン側鎖、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae) では６のイソプレン側鎖、ヒトで
は10のイソプレン側鎖をそれぞれ持っている。
【００４１】一般に、大腸菌が有するユビキノンは10の
イソプレン側鎖を持っていないが、本発明の遺伝子を大
腸菌に導入した形質転換体から、10のイソプレン側鎖を
有するユビキノン（ユビキノン-10 ）を得ることができ
る。すなわち、大腸菌を超音波処理等により破砕し、菌
体成分をヘキサン抽出し、最後にHPLCにかけることによ
りユビキノン-10 が得られる。
イソプレン側鎖を持っていないが、本発明の遺伝子を大
腸菌に導入した形質転換体から、10のイソプレン側鎖を
有するユビキノン（ユビキノン-10 ）を得ることができ
る。すなわち、大腸菌を超音波処理等により破砕し、菌
体成分をヘキサン抽出し、最後にHPLCにかけることによ
りユビキノン-10 が得られる。
【００４２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明は、これら実施例にその技術的
範囲が限定されるものではない。 〔実施例１〕 プレニルトランスフェラーゼ遺伝子のク
ローニング これまで、プレニルトランスフェラーゼには種を越えて
高度に保存された領域が７つあるということが知られて
いる。そこで、本発明では、各種プレニルトランスフェ
ラーゼ間で高度に保存されているアミノ酸配列を基にし
て縮重オリゴヌクレオチドをデザインし、これらのプラ
イマーを各種組み合わせてP.denitrificansのゲノムDNA
を鋳型としてPCRを行い、それにより増幅した部分配列
をプローブとしてスクリーニングを行うことによりクロ
ーニングを行った。なお、クローニングを行うにあた
り、制限酵素及びその他のDNA修飾酵素は宝酒造、東洋
紡、New England BioLabsのものを使用した。
説明する。但し、本発明は、これら実施例にその技術的
範囲が限定されるものではない。 〔実施例１〕 プレニルトランスフェラーゼ遺伝子のク
ローニング これまで、プレニルトランスフェラーゼには種を越えて
高度に保存された領域が７つあるということが知られて
いる。そこで、本発明では、各種プレニルトランスフェ
ラーゼ間で高度に保存されているアミノ酸配列を基にし
て縮重オリゴヌクレオチドをデザインし、これらのプラ
イマーを各種組み合わせてP.denitrificansのゲノムDNA
を鋳型としてPCRを行い、それにより増幅した部分配列
をプローブとしてスクリーニングを行うことによりクロ
ーニングを行った。なお、クローニングを行うにあた
り、制限酵素及びその他のDNA修飾酵素は宝酒造、東洋
紡、New England BioLabsのものを使用した。
【００４３】(1) P.denitrificansのゲノムDNAの調製
及びゲノムライブラリーの作製 P.denitrificansは、802 培地（ポリペプトン10ｇ、酵
母エキス２ｇ、MgSO4・7H2O 1ｇ、蒸留水 1L 、pH 7.0）
100mlに植菌し、30℃で飽和するまで培養した。その後
菌体を集菌し、Frederickらの方法に従いゲノムDNAを調
製した。なお、P.denitrificans は、American Type Cu
lture Collectionより得た（ATCC14907）。P.denitrifi
cansのゲノムDNAを制限酵素で部分分解し、ある一定の
長さのDNA断片を回収し、ライブラリーを作製する。こ
れにより、ゲノムライブラリー全体からスクリーニング
する場合に比べスクリーニング効率が向上する。
及びゲノムライブラリーの作製 P.denitrificansは、802 培地（ポリペプトン10ｇ、酵
母エキス２ｇ、MgSO4・7H2O 1ｇ、蒸留水 1L 、pH 7.0）
100mlに植菌し、30℃で飽和するまで培養した。その後
菌体を集菌し、Frederickらの方法に従いゲノムDNAを調
製した。なお、P.denitrificans は、American Type Cu
lture Collectionより得た（ATCC14907）。P.denitrifi
cansのゲノムDNAを制限酵素で部分分解し、ある一定の
長さのDNA断片を回収し、ライブラリーを作製する。こ
れにより、ゲノムライブラリー全体からスクリーニング
する場合に比べスクリーニング効率が向上する。
【００４４】はじめに50μg のゲノムDNAに1 UのSau3AI
を加え、37℃でインキュベートを開始した。インキュベ
ートを始めてから５分毎に90分まで一定量サンプリング
し、反応を止めた。サンプルを0.8％アガロースゲルで
電気泳動した後、10〜5 kbpの断片を回収し、それぞれ
のDNA断片をpUC119-BamHIベクターに連結し、大腸菌DH5
αを形質転換した。形質転換した大腸菌をLB培地で培養
し、30％グリセロール濃度でグリセロールストックを作
製した。このようにして約2000個のクローンを含むライ
ブラリーを10個作製し、さらに、これらのライブラリー
よりプラスミドDNAを回収した。
を加え、37℃でインキュベートを開始した。インキュベ
ートを始めてから５分毎に90分まで一定量サンプリング
し、反応を止めた。サンプルを0.8％アガロースゲルで
電気泳動した後、10〜5 kbpの断片を回収し、それぞれ
のDNA断片をpUC119-BamHIベクターに連結し、大腸菌DH5
αを形質転換した。形質転換した大腸菌をLB培地で培養
し、30％グリセロール濃度でグリセロールストックを作
製した。このようにして約2000個のクローンを含むライ
ブラリーを10個作製し、さらに、これらのライブラリー
よりプラスミドDNAを回収した。
【００４５】(2) PCR プライマーのデザイン 本発明では、各種プレニルトランスフェラーゼ間で高度
に保存されているアミノ酸配列、また、特にヘキサプレ
ニル二リン酸(HexPP,C30)、ヘプタプレニル二リン酸(He
pPP,C35)(Koike-Takeshita A. et al.(1995) J. Biol.
Chem. 270, 18396-18400)及びオクタプレニル二リン酸
(OctPP,C40)(Jeong, J. H., et al. DNASeq. 4, 59-67
(1993))のような中鎖および長鎖のプレニルトランスフ
ェラーゼに特徴的に見られる配列を基にして、例えば以
下に示す縮重プライマーを12種類デザインした。
に保存されているアミノ酸配列、また、特にヘキサプレ
ニル二リン酸(HexPP,C30)、ヘプタプレニル二リン酸(He
pPP,C35)(Koike-Takeshita A. et al.(1995) J. Biol.
Chem. 270, 18396-18400)及びオクタプレニル二リン酸
(OctPP,C40)(Jeong, J. H., et al. DNASeq. 4, 59-67
(1993))のような中鎖および長鎖のプレニルトランスフ
ェラーゼに特徴的に見られる配列を基にして、例えば以
下に示す縮重プライマーを12種類デザインした。
【００４６】センスプライマー: S1:5'-(CG)(AG)CGG(AT)AA(AG)C(AG)(CGT)AT(CGT)CGTCC-
3'（配列番号14） S2:5'-A(CT)(ACGT)GC(GT)(AT)C(ACGT)CT(ACGT)(CGT)T(A
CGT)CACGA-3'（配列番号15） S3:5'-GG(ACGT)GG(ACGT)AA(AG)CG(ACGT)AT(ACT)CG(ACG
T)CC-3'（配列番号16） S4:5'-GC(ACGT)TC(ACGT)CT(ACGT)CT(ACGT)CA(CT)GACGA-
3'（配列番号17） S5:5'-GC(ACGT)GA(CT)TT(AG)(AC)G(ACGT)(AC)G(ACGT)GG
-3'（配列番号18） S6:5'-(CT)T(ACGT)GC(ACGT)GG(ACGT)GA(CT)TT(CT)TT(A
G)TT-3'（配列番号19）
3'（配列番号14） S2:5'-A(CT)(ACGT)GC(GT)(AT)C(ACGT)CT(ACGT)(CGT)T(A
CGT)CACGA-3'（配列番号15） S3:5'-GG(ACGT)GG(ACGT)AA(AG)CG(ACGT)AT(ACT)CG(ACG
T)CC-3'（配列番号16） S4:5'-GC(ACGT)TC(ACGT)CT(ACGT)CT(ACGT)CA(CT)GACGA-
3'（配列番号17） S5:5'-GC(ACGT)GA(CT)TT(AG)(AC)G(ACGT)(AC)G(ACGT)GG
-3'（配列番号18） S6:5'-(CT)T(ACGT)GC(ACGT)GG(ACGT)GA(CT)TT(CT)TT(A
G)TT-3'（配列番号19）
【００４７】アンチセンスプライマー； A1:5'-(GT)T(AG)(AT)AATCGAG(TA)A(ACT)(AG)TC(AG)TC-
3'（配列番号20） A2:5'-(ACGT)A(AG)(CT)TG(CT)AA(ACGT)A(AG)(CT)TC(ACG
T)CC-3'（配列番号21） A3:5'-(AGT)AT(ACGT)AG(ACGT)AG(ACGT)GC(ACGT)GT(TC)T
T-3'（配列番号22） A4:5'-(AG)TC(AG)TC(AGT)AT(CT)AA(CT)TG(AG)AA-3'（配
列番号23） A5:5'-(AG)AA(AG)TC(ACGT)A(AG)(AGT)AT(AG)TC(AG)TC-
3'（配列番号24） A6:5'-(AG)TC(AG)TC(ACGT)CC(ACGT)AC(AG)TT(CT)TT(ACG
T)CC-3'（配列番号25）
3'（配列番号20） A2:5'-(ACGT)A(AG)(CT)TG(CT)AA(ACGT)A(AG)(CT)TC(ACG
T)CC-3'（配列番号21） A3:5'-(AGT)AT(ACGT)AG(ACGT)AG(ACGT)GC(ACGT)GT(TC)T
T-3'（配列番号22） A4:5'-(AG)TC(AG)TC(AGT)AT(CT)AA(CT)TG(AG)AA-3'（配
列番号23） A5:5'-(AG)AA(AG)TC(ACGT)A(AG)(AGT)AT(AG)TC(AG)TC-
3'（配列番号24） A6:5'-(AG)TC(AG)TC(ACGT)CC(ACGT)AC(AG)TT(CT)TT(ACG
T)CC-3'（配列番号25）
【００４８】(3) PCRによるプレニルトランスフェラー
ゼ遺伝子断片の増幅 PCRは宝酒造（株）のTaKaRa Taqを用いた。通常の反応
の組成は以下の通りである。テンプレートはP.denitrif
icansのゲノムDNAを用いた。
ゼ遺伝子断片の増幅 PCRは宝酒造（株）のTaKaRa Taqを用いた。通常の反応
の組成は以下の通りである。テンプレートはP.denitrif
icansのゲノムDNAを用いた。
【００４９】PCRは、宝酒造のDNAサーマルサイクラーPJ
2000を用いて以下に示すサイクルで行った。すなわち、
97℃で30秒、40℃で30秒及び70℃で１分のサイクルを１
サイクルとしてこれを５サイクル行い、続いて97℃で30
秒、55℃で30秒及び70℃で１分のサイクルを１サイクル
としてこれを30サイクル行った。PCR終了後、１×TBE・
５％アクリルアミドゲルで電気泳動を行い、増幅された
DNA断片を確認し（図４）、ゲル回収法でDNA断片を回収
した。プライマーS4（配列番号17）及びA6（配列番号2
5）を用いた反応により得られたDNAクローンをpCR14 と
する。その後、pCR14 を精製し、pT7BlueT-ベクター(No
vagen) にサブクローニングし、自動塩基配列決定装置
（ABIPRISMTM 310 Genetic Analyzer ）で塩基配列を決
定した後、遺伝子解析ソフトGENETIXで解析し、他のプ
レニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と比較した。
2000を用いて以下に示すサイクルで行った。すなわち、
97℃で30秒、40℃で30秒及び70℃で１分のサイクルを１
サイクルとしてこれを５サイクル行い、続いて97℃で30
秒、55℃で30秒及び70℃で１分のサイクルを１サイクル
としてこれを30サイクル行った。PCR終了後、１×TBE・
５％アクリルアミドゲルで電気泳動を行い、増幅された
DNA断片を確認し（図４）、ゲル回収法でDNA断片を回収
した。プライマーS4（配列番号17）及びA6（配列番号2
5）を用いた反応により得られたDNAクローンをpCR14 と
する。その後、pCR14 を精製し、pT7BlueT-ベクター(No
vagen) にサブクローニングし、自動塩基配列決定装置
（ABIPRISMTM 310 Genetic Analyzer ）で塩基配列を決
定した後、遺伝子解析ソフトGENETIXで解析し、他のプ
レニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と比較した。
【００５０】その結果、pCR14 のコードするアミノ酸配
列は、大腸菌のOctPP 合成酵素のアミノ酸配列と45.7
％、B.stearothermophilusのHepPP 合成酵素のアミノ酸
配列と35.5％、大腸菌のFPP 合成酵素のアミノ酸配列と
31.8％の相同性を示した（図５）。
列は、大腸菌のOctPP 合成酵素のアミノ酸配列と45.7
％、B.stearothermophilusのHepPP 合成酵素のアミノ酸
配列と35.5％、大腸菌のFPP 合成酵素のアミノ酸配列と
31.8％の相同性を示した（図５）。
【００５１】(4) サザンブロットによる解析 サブクローニングし塩基配列を決定したPCR産物につい
て、前記縮重オリゴプライマー(S4及びA6) より内側の
配列を基にして新たに下記の配列を有するPCRプライマ
ー（BS及びBA; 図６）をデザインし、ハイブリダイゼー
ションのプローブとして用いるためのDNA断片をPCRで増
幅し、回収した。 センスプライマー BS : 5'-CCGGCCGACGCAAACCTT-3'(配列番号26） アンチセンスプライマー BA : 5'-CTGCTGCACCGCCGGGTC-3'(配列番号27） 増幅は、97℃で30秒、55℃で30秒及び72℃で１分の反応
を１サイクルとしてこれを30サイクル行った。
て、前記縮重オリゴプライマー(S4及びA6) より内側の
配列を基にして新たに下記の配列を有するPCRプライマ
ー（BS及びBA; 図６）をデザインし、ハイブリダイゼー
ションのプローブとして用いるためのDNA断片をPCRで増
幅し、回収した。 センスプライマー BS : 5'-CCGGCCGACGCAAACCTT-3'(配列番号26） アンチセンスプライマー BA : 5'-CTGCTGCACCGCCGGGTC-3'(配列番号27） 増幅は、97℃で30秒、55℃で30秒及び72℃で１分の反応
を１サイクルとしてこれを30サイクル行った。
【００５２】これにより増幅された300 bpの断片をプロ
ーブとしてP.denitrificansのゲノムDNAのサザンブロッ
ト解析を行った。PCR産物については、市販のキット（R
eady To Go DNA Labelling Beads(Pharmacia)）を用
い、[α-35S]dCTP(Amersham)で標識した。標識の方法は
キットのプロトコールに従った。フィルターは、P.deni
trificans の染色体DNA 10μg をApaI、EcoRI およびBa
mHIで完全消化したものを0.5×TBE・0.7％アガロースゲ
ルで電気泳動したのちにアルカリ変性し、ニトロセルロ
ースメンブレンフィルター（BIORADのゼータプローブ・
ブロッティング膜(Zeta Probe Brotting Membranes) 及
びAmersham社のHybond-N+）にトランスファーし、作製
した。ハイブリダイゼーション溶液の組成はプローブと
の相同性により以下のように変え、42℃の一定温度でフ
ィルターをインキュベートし、プレハイブリダイゼーシ
ョン、ハイブリダイゼーションを行った。
ーブとしてP.denitrificansのゲノムDNAのサザンブロッ
ト解析を行った。PCR産物については、市販のキット（R
eady To Go DNA Labelling Beads(Pharmacia)）を用
い、[α-35S]dCTP(Amersham)で標識した。標識の方法は
キットのプロトコールに従った。フィルターは、P.deni
trificans の染色体DNA 10μg をApaI、EcoRI およびBa
mHIで完全消化したものを0.5×TBE・0.7％アガロースゲ
ルで電気泳動したのちにアルカリ変性し、ニトロセルロ
ースメンブレンフィルター（BIORADのゼータプローブ・
ブロッティング膜(Zeta Probe Brotting Membranes) 及
びAmersham社のHybond-N+）にトランスファーし、作製
した。ハイブリダイゼーション溶液の組成はプローブと
の相同性により以下のように変え、42℃の一定温度でフ
ィルターをインキュベートし、プレハイブリダイゼーシ
ョン、ハイブリダイゼーションを行った。
【００５３】
【００５４】
【００５５】ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件も
以下のように変えた。 厳しい条件（相同性100％に相当） 0.1％SDS・0.1×SSC 68 ℃ 中程度の条件（相同性50％に相当） 0.1％SDS・2×SSC 55 ℃ 洗浄の終了したフィルターは、Fujiイメージングプレー
トに曝し、Fuji BAS-2000 バイオイメージ・アナライザ
ー・システム（Bioimage Analyzer System）で解析を行
った。
以下のように変えた。 厳しい条件（相同性100％に相当） 0.1％SDS・0.1×SSC 68 ℃ 中程度の条件（相同性50％に相当） 0.1％SDS・2×SSC 55 ℃ 洗浄の終了したフィルターは、Fujiイメージングプレー
トに曝し、Fuji BAS-2000 バイオイメージ・アナライザ
ー・システム（Bioimage Analyzer System）で解析を行
った。
【００５６】その結果、厳しいハイブリダイズ条件（検
出されるバンドとプライマーの相同性が100％相当）で
は、ゲノムDNAをApaIで切断した場合16.5 kbpのバンド
が、EcoRIで切断した場合18.5 kbpのバンドが、また、B
amHIで切断した場合11.2 kbpのバンドとやや弱くハイブ
リダイズしている4.2 kbpのバンドがそれぞれ確認され
た（図７Ａ）。BamHI で切断した場合のやや弱い4.2 kb
pのバンドには、今回得られたプレニルトランスフェラ
ーゼ遺伝子と考えられる配列に非常に相同性の高い配
列、すなわちP.denitrificansの持つ別のプレニルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子（FPP合成酵素遺伝子）が含まれ
ているものと予想される。
出されるバンドとプライマーの相同性が100％相当）で
は、ゲノムDNAをApaIで切断した場合16.5 kbpのバンド
が、EcoRIで切断した場合18.5 kbpのバンドが、また、B
amHIで切断した場合11.2 kbpのバンドとやや弱くハイブ
リダイズしている4.2 kbpのバンドがそれぞれ確認され
た（図７Ａ）。BamHI で切断した場合のやや弱い4.2 kb
pのバンドには、今回得られたプレニルトランスフェラ
ーゼ遺伝子と考えられる配列に非常に相同性の高い配
列、すなわちP.denitrificansの持つ別のプレニルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子（FPP合成酵素遺伝子）が含まれ
ているものと予想される。
【００５７】一方、中程度のハイブリダイズ条件（検出
されるバンドとプライマーの相同性が50％相当）では、
ゲノムDNAをApaIで切断した場合、さらに7.4 kbpのバン
ドが、EcoRIで切断した場合は5.3 kbpのバンドが、ま
た、BamHIで切断した場合は5.2kbpのバンドがそれぞれ
確認された（図７Ｂ）。これらについては、他のプレニ
ルトランスフェラーゼ遺伝子である可能性が高いと予想
される。
されるバンドとプライマーの相同性が50％相当）では、
ゲノムDNAをApaIで切断した場合、さらに7.4 kbpのバン
ドが、EcoRIで切断した場合は5.3 kbpのバンドが、ま
た、BamHIで切断した場合は5.2kbpのバンドがそれぞれ
確認された（図７Ｂ）。これらについては、他のプレニ
ルトランスフェラーゼ遺伝子である可能性が高いと予想
される。
【００５８】(5) コロニーハイブリダイゼーションによ
る全長遺伝子回収 PCRにより増幅された遺伝子断片を含む完全長の遺伝子
を回収するため、サザンハブリダイゼーションに使用し
たプローブを用い、コロニーハイブリダイゼーションを
行った。はじめにP.denitrificansのゲノムDNAをSau3AI
で限定分解した後、その10〜5 kbpの断片を回収し、pUC
119のBamHIベクターにサブクローニングすることによ
り、約2000個のクローンを含むライブラリーを別々に10
個作製した。これらのライブラリーについてプラスミド
を回収し、制限酵素EcoRIで切断した後サザンハイブリ
ダイゼーションを行い、確実に目的の遺伝子配列が含ま
れるライブラリーを選別した。
る全長遺伝子回収 PCRにより増幅された遺伝子断片を含む完全長の遺伝子
を回収するため、サザンハブリダイゼーションに使用し
たプローブを用い、コロニーハイブリダイゼーションを
行った。はじめにP.denitrificansのゲノムDNAをSau3AI
で限定分解した後、その10〜5 kbpの断片を回収し、pUC
119のBamHIベクターにサブクローニングすることによ
り、約2000個のクローンを含むライブラリーを別々に10
個作製した。これらのライブラリーについてプラスミド
を回収し、制限酵素EcoRIで切断した後サザンハイブリ
ダイゼーションを行い、確実に目的の遺伝子配列が含ま
れるライブラリーを選別した。
【００５９】その結果、10個のライブラリー(No.1 〜N
o.10)のうち、No.9およびNo.10のライブラリーに強くハ
イブリダイズしたバンドが検出された（図８）。サザン
ハイブリダイゼーションで最も強くバンドが検出された
ライブラリーのNo.10についてコロニーハイブリダイゼ
ーションを行ったところ、３個のポジティブなクローン
を得ることができた。それらについてプラスミドを回収
し、それらをp11A1、p11A2、p11C1とした。これらのク
ローンは約７kbpのインサートを持っていたため目的遺
伝子が含まれているかどうかをPCRによって確認した。
ハイブリダイゼーションのプライマーを作製する際に使
用したPCRプライマーのBS、BAを用いてPCRを行い、pCR1
4と同様のバンドが増幅されるかどうかによって判断し
た（図９）。PCR は、98℃で30秒、67℃で30秒及び74℃
で30秒の反応を１サイクルとしてこれを25サイクル行っ
た。
o.10)のうち、No.9およびNo.10のライブラリーに強くハ
イブリダイズしたバンドが検出された（図８）。サザン
ハイブリダイゼーションで最も強くバンドが検出された
ライブラリーのNo.10についてコロニーハイブリダイゼ
ーションを行ったところ、３個のポジティブなクローン
を得ることができた。それらについてプラスミドを回収
し、それらをp11A1、p11A2、p11C1とした。これらのク
ローンは約７kbpのインサートを持っていたため目的遺
伝子が含まれているかどうかをPCRによって確認した。
ハイブリダイゼーションのプライマーを作製する際に使
用したPCRプライマーのBS、BAを用いてPCRを行い、pCR1
4と同様のバンドが増幅されるかどうかによって判断し
た（図９）。PCR は、98℃で30秒、67℃で30秒及び74℃
で30秒の反応を１サイクルとしてこれを25サイクル行っ
た。
【００６０】その結果、p11A1(レーン1)のみがpCR14(レ
ーン4)と同様の約300 bpのDNAが増幅された（図９）。p
11A2、p11C1についてはこの条件によるPCRでは増幅が認
められなかったため、これらは全長が含まれていないか
あるいは他のプレニルトランスフェラーゼ遺伝子である
と考えられる。
ーン4)と同様の約300 bpのDNAが増幅された（図９）。p
11A2、p11C1についてはこの条件によるPCRでは増幅が認
められなかったため、これらは全長が含まれていないか
あるいは他のプレニルトランスフェラーゼ遺伝子である
と考えられる。
【００６１】次に、p11A1について約7 kbpのインサート
中のどこにpCR14と同一の配列が含まれているか、ま
た、プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の全長が含まれ
ているかを、制限酵素地図を作製することにより確認し
た（図10）。その結果、pCR14と同一の配列はp11A1のイ
ンサートの末端より約1.1〜1.5 kbpの位置にあることが
わかった。プレニルトランスフェラーゼの平均的な遺伝
子長が約１kbpであること、及びpCR14には保存領域のII
からVIまでが含まれていることより、p11A1のインサー
ト中には全長のプレニルトランスフェラーゼ遺伝子配列
が含まれていると予想された。
中のどこにpCR14と同一の配列が含まれているか、ま
た、プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の全長が含まれ
ているかを、制限酵素地図を作製することにより確認し
た（図10）。その結果、pCR14と同一の配列はp11A1のイ
ンサートの末端より約1.1〜1.5 kbpの位置にあることが
わかった。プレニルトランスフェラーゼの平均的な遺伝
子長が約１kbpであること、及びpCR14には保存領域のII
からVIまでが含まれていることより、p11A1のインサー
ト中には全長のプレニルトランスフェラーゼ遺伝子配列
が含まれていると予想された。
【００６２】(6) p11A1のデリーションおよび塩基配列
決定 まずp11A1に含まれるプレニルトランスフェラーゼ遺伝
子の全塩基配列を決定することにした。pCR14と同一の
配列より４kbp下流の位置にあるBglIIサイトよりデリー
ションを進行させ、最後にpCR14の430 bp上流の位置に
あるBamHIサイトで切り出した後、pUC119のSmaI-BamHI
ベクターに連結した。コロニーハイブリダイゼーション
によりスクリーニングし、回収したp11A1についてBglII
で切断した後、ExoヌクレアーゼIII でDNAを末端より消
化し、適当な時間で反応を止めた。その後、Mungbeanヌ
クレアーゼ、クレノウフラグメントで処理することによ
りDNA末端を平滑にし、最後にBamHI で切断することでD
NA断片を切り出した。
決定 まずp11A1に含まれるプレニルトランスフェラーゼ遺伝
子の全塩基配列を決定することにした。pCR14と同一の
配列より４kbp下流の位置にあるBglIIサイトよりデリー
ションを進行させ、最後にpCR14の430 bp上流の位置に
あるBamHIサイトで切り出した後、pUC119のSmaI-BamHI
ベクターに連結した。コロニーハイブリダイゼーション
によりスクリーニングし、回収したp11A1についてBglII
で切断した後、ExoヌクレアーゼIII でDNAを末端より消
化し、適当な時間で反応を止めた。その後、Mungbeanヌ
クレアーゼ、クレノウフラグメントで処理することによ
りDNA末端を平滑にし、最後にBamHI で切断することでD
NA断片を切り出した。
【００６３】3.5％アクリルアミドゲルで電気泳動した
後DNA断片をゲル回収し、pUC119のBamHI-SmaIベクター
に連結した。これを用いて大腸菌DH5αを形質転換し、
単一形質転換体を数個選別し、プラスミドを回収した。
これらのデリーション産物を持つプラスミドをABI社製
のシークエンサーにかけ、全長の遺伝子の塩基配列を決
定した。その結果、pCR14と同一の塩基配列を含み、ま
た、そのアミノ酸一次配列においてプレニルトランスフ
ェラーゼに特徴的な７つの保存領域を持つORFが見い出
された（図11；配列番号28）。ORF には、翻訳開始点の
可能性があるATG コドンは４箇所存在した。このうち、
シャイン-ダルガルノ(Shine-Dalgarno)のコンセンサス
配列に近く、距離が妥当である３番目のメチオニンが翻
訳開始点であると考えられる。
後DNA断片をゲル回収し、pUC119のBamHI-SmaIベクター
に連結した。これを用いて大腸菌DH5αを形質転換し、
単一形質転換体を数個選別し、プラスミドを回収した。
これらのデリーション産物を持つプラスミドをABI社製
のシークエンサーにかけ、全長の遺伝子の塩基配列を決
定した。その結果、pCR14と同一の塩基配列を含み、ま
た、そのアミノ酸一次配列においてプレニルトランスフ
ェラーゼに特徴的な７つの保存領域を持つORFが見い出
された（図11；配列番号28）。ORF には、翻訳開始点の
可能性があるATG コドンは４箇所存在した。このうち、
シャイン-ダルガルノ(Shine-Dalgarno)のコンセンサス
配列に近く、距離が妥当である３番目のメチオニンが翻
訳開始点であると考えられる。
【００６４】このORFのアミノ酸一次配列をこれまでに
クローニングされている主なプレニルトランスフェラー
ゼの一次配列と比較したところ、E.coliのFPP合成酵素
では34.9％、B.stearothermophilusのFPP合成酵素とは3
1.1％、Erwinia uredovoraのGGPP合成酵素とは31.8％、
M.luteusBP-26のHexPP合成酵素とは26.3％、B.stearoth
ermophilusのHepPP合成酵素とは34.4％、E.coliのOctPP
合成酵素とは44.2％の相同性があった（図12）。なお、
デリーションを行う過程においてp11A1に含まれるプレ
ニルトランスフェラーゼのORFの下流の約1 kbpの塩基配
列について解析を行った。
クローニングされている主なプレニルトランスフェラー
ゼの一次配列と比較したところ、E.coliのFPP合成酵素
では34.9％、B.stearothermophilusのFPP合成酵素とは3
1.1％、Erwinia uredovoraのGGPP合成酵素とは31.8％、
M.luteusBP-26のHexPP合成酵素とは26.3％、B.stearoth
ermophilusのHepPP合成酵素とは34.4％、E.coliのOctPP
合成酵素とは44.2％の相同性があった（図12）。なお、
デリーションを行う過程においてp11A1に含まれるプレ
ニルトランスフェラーゼのORFの下流の約1 kbpの塩基配
列について解析を行った。
【００６５】その結果、ORFの終止コドンTGAの25塩基下
流（図11及び配列番号28に示される塩基配列のうち第11
74〜1201番目）に繰り返し配列及びTが連続した典型的
なターミネーター配列がみられた。よって、このプレニ
ルトランスフェラーゼ遺伝子の下流にオペロンを構成し
ているORFは無いことがわかった。また、ORFの上流のBa
mHIサイトの上流約１kbpについても塩基配列も決定した
ところ、プレニルトランスフェラーゼ遺伝子のORFの上
流に、3.3 kbpのすでにクローニングされ解析されてい
るP.denitrificansのβ-ケトチオラーゼ遺伝子及びアセ
チル-CoAレダクターゼ遺伝子のオペロンが存在している
ことがわかった(Yabutani,T. et al.,(1995)FEMS Micro
bial. Lett.133,85-90) 。これら２つの遺伝子はオペロ
ンを形成しているが、ターミネーターで終結しているた
め、本発明の遺伝子のORFとはオペロンを形成してはい
ない（図13）。
流（図11及び配列番号28に示される塩基配列のうち第11
74〜1201番目）に繰り返し配列及びTが連続した典型的
なターミネーター配列がみられた。よって、このプレニ
ルトランスフェラーゼ遺伝子の下流にオペロンを構成し
ているORFは無いことがわかった。また、ORFの上流のBa
mHIサイトの上流約１kbpについても塩基配列も決定した
ところ、プレニルトランスフェラーゼ遺伝子のORFの上
流に、3.3 kbpのすでにクローニングされ解析されてい
るP.denitrificansのβ-ケトチオラーゼ遺伝子及びアセ
チル-CoAレダクターゼ遺伝子のオペロンが存在している
ことがわかった(Yabutani,T. et al.,(1995)FEMS Micro
bial. Lett.133,85-90) 。これら２つの遺伝子はオペロ
ンを形成しているが、ターミネーターで終結しているた
め、本発明の遺伝子のORFとはオペロンを形成してはい
ない（図13）。
【００６６】〔実施例２〕プレニルトランスフェラーゼ
大量発現系の構築 本発明では、ORFの開始コドンのATGの位置にNcoIサイト
を導入し、大量発現用ベクターであるpTrc99AのNcoIサ
イトにサブクローニングすることによりpTrc99Aの持つ
強力なtrcプロモーターとSD配列で強制発現させる系を
構築した。これまでに分かっているプレニルトランスフ
ェラーゼの７つの保存領域を基に予想される開始コドン
のおおよその位置に存在するATGのメチオニンコドンを
開始コドンとしたORFを導入した発現プラスミドを作製
した。
大量発現系の構築 本発明では、ORFの開始コドンのATGの位置にNcoIサイト
を導入し、大量発現用ベクターであるpTrc99AのNcoIサ
イトにサブクローニングすることによりpTrc99Aの持つ
強力なtrcプロモーターとSD配列で強制発現させる系を
構築した。これまでに分かっているプレニルトランスフ
ェラーゼの７つの保存領域を基に予想される開始コドン
のおおよその位置に存在するATGのメチオニンコドンを
開始コドンとしたORFを導入した発現プラスミドを作製
した。
【００６７】(1) 大量発現用プラスミドの作製 塩基配列確認の結果明らかになったプレニルトランスフ
ェラーゼと考えられるORFのうち、３番目のメチオニン
を開始コドンとするORFを、発現ベクターであるpTrc99A
のNcoI-BamHIサイトに導入した。まず、変異オリゴプラ
イマーを用いてPCRを行うことによりベクター導入用の
制限酵素サイトを導入した。翻訳開始点とするMetのATG
コドンにはNcoIサイト(CCATGG)を、また終止コドンTGA
の84 bp下流にはBamHI サイト(GGATCC)を導入した。こ
の際、開始コドンの次のアミノ酸が変わらないようにデ
ザインした。それぞれの制限酵素サイト導入用PCRプラ
イマーの配列は以下に示す通りである。 センスプライマー DP03 : 5'-ATCGCCCATGGGCATGAACGAAAACGTCTC-3'（配列番号29） NcoI アンチセンスプライマー DP13 : 5'-GAGGGATCCTATAACAACTGAGGCAGCG-3'（配列番号30） BamHI
ェラーゼと考えられるORFのうち、３番目のメチオニン
を開始コドンとするORFを、発現ベクターであるpTrc99A
のNcoI-BamHIサイトに導入した。まず、変異オリゴプラ
イマーを用いてPCRを行うことによりベクター導入用の
制限酵素サイトを導入した。翻訳開始点とするMetのATG
コドンにはNcoIサイト(CCATGG)を、また終止コドンTGA
の84 bp下流にはBamHI サイト(GGATCC)を導入した。こ
の際、開始コドンの次のアミノ酸が変わらないようにデ
ザインした。それぞれの制限酵素サイト導入用PCRプラ
イマーの配列は以下に示す通りである。 センスプライマー DP03 : 5'-ATCGCCCATGGGCATGAACGAAAACGTCTC-3'（配列番号29） NcoI アンチセンスプライマー DP13 : 5'-GAGGGATCCTATAACAACTGAGGCAGCG-3'（配列番号30） BamHI
【００６８】これらのプライマーを用いてPCRを行うこ
とにより末端に制限酵素サイトを持つ遺伝子断片を増幅
した。PCRに用いるポリメラーゼはDNA合成の正確性およ
び増幅効率においてTaqDNAポリメラーゼ、PfuDNAポリメ
ラーゼ等より優れているといわれるTOYOBO(株)のKOD DN
Aポリメラーゼ(Barnes, W. M. (1994) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 91, 2216-2220)を採用した。PCRの反応時
の組成およびサイクルは以下に示す通りである。
とにより末端に制限酵素サイトを持つ遺伝子断片を増幅
した。PCRに用いるポリメラーゼはDNA合成の正確性およ
び増幅効率においてTaqDNAポリメラーゼ、PfuDNAポリメ
ラーゼ等より優れているといわれるTOYOBO(株)のKOD DN
Aポリメラーゼ(Barnes, W. M. (1994) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 91, 2216-2220)を採用した。PCRの反応時
の組成およびサイクルは以下に示す通りである。
【００６９】
【００７０】PCR は、98℃で30秒、67℃で30秒及び74℃
で30秒の反応を１サイクルとしてこれを25サイクル行っ
た。PCR終了後、制限酵素NcoIおよびBamHI で切断し、
0.8％アガロース電気泳動の後回収した。NcoI-BamHI遺
伝子断片をpTrc99A(Amann, E. et al.(1988) Gene 69,
301-305)のNcoI-BamHIベクターにサブクローニングし
た。このようにして得られた発現プラスミドをpDPm3と
した。これらについてもシークエンスを行いベクターと
の連結部位の配列の確認を行った。
で30秒の反応を１サイクルとしてこれを25サイクル行っ
た。PCR終了後、制限酵素NcoIおよびBamHI で切断し、
0.8％アガロース電気泳動の後回収した。NcoI-BamHI遺
伝子断片をpTrc99A(Amann, E. et al.(1988) Gene 69,
301-305)のNcoI-BamHIベクターにサブクローニングし
た。このようにして得られた発現プラスミドをpDPm3と
した。これらについてもシークエンスを行いベクターと
の連結部位の配列の確認を行った。
【００７１】その結果、間違いなくプレニルトランスフ
ェラーゼのORFが挿入されており、またNcoIサイトにフ
レームシフトすることなく連結されているかを確認し
た。その後、この発現用プラスミドpDPm3で大腸菌DH5α
を形質転換した。なお、発現用プラスミドpDPm3を保有
する大腸菌DH5α（pDPm3/DH5α) は、工業技術院生命工
学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）
に、FERM BP-6259として寄託されている。
ェラーゼのORFが挿入されており、またNcoIサイトにフ
レームシフトすることなく連結されているかを確認し
た。その後、この発現用プラスミドpDPm3で大腸菌DH5α
を形質転換した。なお、発現用プラスミドpDPm3を保有
する大腸菌DH5α（pDPm3/DH5α) は、工業技術院生命工
学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）
に、FERM BP-6259として寄託されている。
【００７２】(2) 大腸菌におけるプレニルトランスフェ
ラーゼの大量発現 大量発現プラスミドpDPm3で形質転換された大腸菌を50
μg/mlのアンピシリンを含むLB培地(1% バクトトリプト
ン、0.5% 酵母エキス、0.5% NaCl、0.1%グルコース)
に植菌し、37℃で一晩培養した。次にこの菌体培養液1m
l を50μg/mlのアンピシリンを含むM9栄養培地(0.2% M9
塩、0.2%グリセロール、0.2%酵母エキス)100mlに植菌
し、30℃で培養した。濁度がA600 = 0.6〜0.8に達した
ところでイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（I
PTG）を最終濃度 1 mMになるように添加し、さらに30℃
で一晩培養した。
ラーゼの大量発現 大量発現プラスミドpDPm3で形質転換された大腸菌を50
μg/mlのアンピシリンを含むLB培地(1% バクトトリプト
ン、0.5% 酵母エキス、0.5% NaCl、0.1%グルコース)
に植菌し、37℃で一晩培養した。次にこの菌体培養液1m
l を50μg/mlのアンピシリンを含むM9栄養培地(0.2% M9
塩、0.2%グリセロール、0.2%酵母エキス)100mlに植菌
し、30℃で培養した。濁度がA600 = 0.6〜0.8に達した
ところでイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（I
PTG）を最終濃度 1 mMになるように添加し、さらに30℃
で一晩培養した。
【００７３】培養液を遠心分離(4℃、1,000×g、10分）
した後、50 mM リン酸カリウムバッファー（pH 7.2）で
洗浄し、得られた菌体を溶解バッファー(50 mMリン酸カ
リウムバッファー(pH 7.2)、5 mM EDTA、1 mMβ-メルカ
プトエタノール、1 mM PMSF)に懸濁し、超音波処理
（（超音波10秒−氷冷２分）×10サイクル）することで
後菌体を破砕した。超音波処理はBRANSON社製のSONIFIE
R250を使用した。破砕後の溶液を遠心分離(4℃、15,000
×g、30分）した後の上清を粗酵素抽出液として回収し
た。
した後、50 mM リン酸カリウムバッファー（pH 7.2）で
洗浄し、得られた菌体を溶解バッファー(50 mMリン酸カ
リウムバッファー(pH 7.2)、5 mM EDTA、1 mMβ-メルカ
プトエタノール、1 mM PMSF)に懸濁し、超音波処理
（（超音波10秒−氷冷２分）×10サイクル）することで
後菌体を破砕した。超音波処理はBRANSON社製のSONIFIE
R250を使用した。破砕後の溶液を遠心分離(4℃、15,000
×g、30分）した後の上清を粗酵素抽出液として回収し
た。
【００７４】次に、プレニルトランスフェラーゼ活性の
測定を以下の通り行った。適量の粗酵素抽出液を用い、
下に示す組成の反応液により種々のアリル性プライマー
及び［1-14C]IPP (54 または57 Ci/mol; Amersham)を加
えた200 μl の反応溶液を調製し、37℃で1 時間インキ
ュベーションを行い酵素反応させた。その後、飽和食塩
水 200μl および飽和食塩水飽和n-BuOH 1mlを加えてよ
く撹拌し、遠心分離することにより反応生成物を抽出し
た。BuOH層のうち200 μl を取り、クリアゾル３mlを加
え、液体シンチレーションカウンターでBuOH抽出液中の
放射能量を測定することで酵素活性を求めた。酵素活性
は、１分あたり反応生成物中に取り込まれたIPP 量(nmo
l)を１単位(unit)とした。 反応液の組成 その結果、IPTGで誘導をかけたpDPm3で形質転換した大
腸菌において、外来遺伝子由来と考えられるプレニルト
ランスフェラーゼ活性が確認された（表２）。
測定を以下の通り行った。適量の粗酵素抽出液を用い、
下に示す組成の反応液により種々のアリル性プライマー
及び［1-14C]IPP (54 または57 Ci/mol; Amersham)を加
えた200 μl の反応溶液を調製し、37℃で1 時間インキ
ュベーションを行い酵素反応させた。その後、飽和食塩
水 200μl および飽和食塩水飽和n-BuOH 1mlを加えてよ
く撹拌し、遠心分離することにより反応生成物を抽出し
た。BuOH層のうち200 μl を取り、クリアゾル３mlを加
え、液体シンチレーションカウンターでBuOH抽出液中の
放射能量を測定することで酵素活性を求めた。酵素活性
は、１分あたり反応生成物中に取り込まれたIPP 量(nmo
l)を１単位(unit)とした。 反応液の組成 その結果、IPTGで誘導をかけたpDPm3で形質転換した大
腸菌において、外来遺伝子由来と考えられるプレニルト
ランスフェラーゼ活性が確認された（表２）。
【００７５】
【表２】 なお、同じpDPm3で形質転換した大腸菌でもIPTGで誘導
をかけなかった大腸菌では有意のプレニルトランスフェ
ラーゼ活性が確認されなかった。このことは、このプレ
ニルトランスフェラーゼ活性の発現がtrcプロモーター
の強い制御下にあることを示している。
をかけなかった大腸菌では有意のプレニルトランスフェ
ラーゼ活性が確認されなかった。このことは、このプレ
ニルトランスフェラーゼ活性の発現がtrcプロモーター
の強い制御下にあることを示している。
【００７６】(3) 反応生成物の逆相TLC による分析 次に、このプレニルトランスフェラーゼにより生成した
プレニル二リン酸の酸性ホスファターゼによる加水分解
産物を逆相薄層液体クロマトグラフィー（TLC）で分析
した。なお、酸性ホスファターゼはBoehringerMannheim
社より購入し、逆相薄層クロマトグラフィープレートは
Whatman Chemical SeparationのLKC18を使用した。粗酵
素抽出液を用いて反応を行った後にn-ブタノール(n-BuO
H)で抽出した反応生成物（プレニル二リン酸）を、以下
に示す組成の反応溶液中で酸性ホスファターゼによって
対応するプレノールに加水分解した（Fujii,H. et al.
(1982) Biochim. Biophys. Acta. 712, 716-718）。
プレニル二リン酸の酸性ホスファターゼによる加水分解
産物を逆相薄層液体クロマトグラフィー（TLC）で分析
した。なお、酸性ホスファターゼはBoehringerMannheim
社より購入し、逆相薄層クロマトグラフィープレートは
Whatman Chemical SeparationのLKC18を使用した。粗酵
素抽出液を用いて反応を行った後にn-ブタノール(n-BuO
H)で抽出した反応生成物（プレニル二リン酸）を、以下
に示す組成の反応溶液中で酸性ホスファターゼによって
対応するプレノールに加水分解した（Fujii,H. et al.
(1982) Biochim. Biophys. Acta. 712, 716-718）。
【００７７】
【００７８】加水分解反応は37℃で一晩行った。反応終
了後飽和食塩水１ml及び3ml のn-ペンタンを加え、撹拌
することによりプレノールをペンタンで抽出した。ペン
タン層を回収し、H2Oで洗浄した後、遠心エバポレータ
ーで濃縮したペンタン抽出液を逆相TLC(LKC-18)で展開
し、反応生成物の同定を行った（展開溶媒；アセトン：
H2O = 19:1）。基準試料とした各種プレノールの位置は
ヨウ素蒸気に当てることによって可視化した。TLCプレ
ートをFujiイメージングプレートに曝し、これをFuji B
AS-2000 バイオイメージアナライザーで解析することに
より放射性のプレノールの位置を検出した。結果を図14
に示す。
了後飽和食塩水１ml及び3ml のn-ペンタンを加え、撹拌
することによりプレノールをペンタンで抽出した。ペン
タン層を回収し、H2Oで洗浄した後、遠心エバポレータ
ーで濃縮したペンタン抽出液を逆相TLC(LKC-18)で展開
し、反応生成物の同定を行った（展開溶媒；アセトン：
H2O = 19:1）。基準試料とした各種プレノールの位置は
ヨウ素蒸気に当てることによって可視化した。TLCプレ
ートをFujiイメージングプレートに曝し、これをFuji B
AS-2000 バイオイメージアナライザーで解析することに
より放射性のプレノールの位置を検出した。結果を図14
に示す。
【００７９】宿主大腸菌において確認されているプレニ
ルトランスフェラーゼ活性はFPP合成酵素、OPP合成酵素
及びウンデカプレニル二リン酸合成酵素の３種である
が、pDPm3で形質転換した大腸菌においてはデカプレニ
ル二リン酸(DPP) が生成されていることがわかった（図
14Ｂ）。従って、本発明の遺伝子はDPP合成酵素遺伝子
であることが明らかになった。また、このDPP合成酵素
についてアリル性プライマーの基質特異性について検討
した。なお、酵素活性の単位(unit)は前記と同様であ
る。その結果、GPPでもやや活性はあるものの、やはりF
PPでの活性が最大になった（表３，酵素活性54.4）。さ
らに、EEE-ゲラニルゲラニル二リン酸(trans-GGPP)およ
びZEE-ゲラニルゲラニル二リン酸(cis-GGPP)を基質とし
て用いた場合、cis-GGPPではほとんど活性がなかったの
に対し、trans-GGPPでは強い活性があったことより、本
発明の酵素がE型の鎖延長酵素であることが裏付けられ
た。
ルトランスフェラーゼ活性はFPP合成酵素、OPP合成酵素
及びウンデカプレニル二リン酸合成酵素の３種である
が、pDPm3で形質転換した大腸菌においてはデカプレニ
ル二リン酸(DPP) が生成されていることがわかった（図
14Ｂ）。従って、本発明の遺伝子はDPP合成酵素遺伝子
であることが明らかになった。また、このDPP合成酵素
についてアリル性プライマーの基質特異性について検討
した。なお、酵素活性の単位(unit)は前記と同様であ
る。その結果、GPPでもやや活性はあるものの、やはりF
PPでの活性が最大になった（表３，酵素活性54.4）。さ
らに、EEE-ゲラニルゲラニル二リン酸(trans-GGPP)およ
びZEE-ゲラニルゲラニル二リン酸(cis-GGPP)を基質とし
て用いた場合、cis-GGPPではほとんど活性がなかったの
に対し、trans-GGPPでは強い活性があったことより、本
発明の酵素がE型の鎖延長酵素であることが裏付けられ
た。
【００８０】
【表３】
【００８１】(4) プレニルトランスフェラーゼの大量発
現の確認 発現用プラスミドによる酵素の大量発現の確認は、粗酵
素抽出液を和科盛(株)RESEP GEL 12.5％を用いてSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により解析
し、クマシーブリリアントブルー R-250で染色したバン
ドの位置を分子量マーカー(SDS-PAGE Molecular Weight
Standards、Broad Range BIORAD) と比較することによ
り行った。方法は、基本的にLaemmliの方法（Laemmli,
U.K.,(1970) Nature 227,680-685)に従った。その結
果、15,000×gの沈澱画分に、36 kDa付近に大量発現し
たと考えられるバンドが確認された（図15，レーン
６）。
現の確認 発現用プラスミドによる酵素の大量発現の確認は、粗酵
素抽出液を和科盛(株)RESEP GEL 12.5％を用いてSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により解析
し、クマシーブリリアントブルー R-250で染色したバン
ドの位置を分子量マーカー(SDS-PAGE Molecular Weight
Standards、Broad Range BIORAD) と比較することによ
り行った。方法は、基本的にLaemmliの方法（Laemmli,
U.K.,(1970) Nature 227,680-685)に従った。その結
果、15,000×gの沈澱画分に、36 kDa付近に大量発現し
たと考えられるバンドが確認された（図15，レーン
６）。
【００８２】(5) ユビキノンの側鎖長の解析 pDPm3により形質転換した大腸菌よりユビキノンを抽出
し、イソプレン側鎖の鎖長を分析した。ユビキノン抽出
の方法は以下に示す通りである。まず、0.3gの湿潤菌体
を２mlのメタノール−0.3% NaCl 溶液（10:1 V/V) （以
下「抽出溶液」という）に懸濁し、超音波処理を行った
（30分×４回）。次に１mlの抽出溶液を加え、ヘキサン
抽出を２回行った。抽出溶液で洗浄し、ヘキサンを除去
したのち、１mlのエタノールに溶解し、HPLCを行った。
HPLCは日立（株）のものを用い、カラムはLiChrosorb R
P-18(5μm)（MERCK)を用いた。溶出溶媒はEtOH（99.8
％）で1ml/分で流し、275 nmで検出した。その結果、図
16及び表４に示すように、ベクタープラスミドpTrc99A
のみを形質転換した大腸菌ではユビキノン-8(UQ-8)のみ
が検出されたが、pDPm3で形質転換した大腸菌ではユビ
キノンのうち約20％がユビキノン-10(UQ-10)に置き換わ
った。さらに、IPTGで誘導をかけて培養したpDPm3で形
質転換した大腸菌については全体の約70％がUQ-10に置
き換わっていた。
し、イソプレン側鎖の鎖長を分析した。ユビキノン抽出
の方法は以下に示す通りである。まず、0.3gの湿潤菌体
を２mlのメタノール−0.3% NaCl 溶液（10:1 V/V) （以
下「抽出溶液」という）に懸濁し、超音波処理を行った
（30分×４回）。次に１mlの抽出溶液を加え、ヘキサン
抽出を２回行った。抽出溶液で洗浄し、ヘキサンを除去
したのち、１mlのエタノールに溶解し、HPLCを行った。
HPLCは日立（株）のものを用い、カラムはLiChrosorb R
P-18(5μm)（MERCK)を用いた。溶出溶媒はEtOH（99.8
％）で1ml/分で流し、275 nmで検出した。その結果、図
16及び表４に示すように、ベクタープラスミドpTrc99A
のみを形質転換した大腸菌ではユビキノン-8(UQ-8)のみ
が検出されたが、pDPm3で形質転換した大腸菌ではユビ
キノンのうち約20％がユビキノン-10(UQ-10)に置き換わ
った。さらに、IPTGで誘導をかけて培養したpDPm3で形
質転換した大腸菌については全体の約70％がUQ-10に置
き換わっていた。
【００８３】
【表４】 このことから、単離した遺伝子がデカプレニル二リン酸
合成酵素をコードしていることが確認できた。また、本
来大腸菌はユビキノン-10 を産生する能力を有してない
が、この遺伝子で大腸菌を形質転換することにより、大
腸菌にユビキノン-10 を産生させることが可能となった
（図17）。
合成酵素をコードしていることが確認できた。また、本
来大腸菌はユビキノン-10 を産生する能力を有してない
が、この遺伝子で大腸菌を形質転換することにより、大
腸菌にユビキノン-10 を産生させることが可能となった
（図17）。
【００８４】
【発明の効果】本発明により、プレニル二リン酸合成酵
素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換え
ベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換
体、プレニル二リン酸合成酵素の製造方法及び異種微生
物によるユビキノン-10 の製造方法が提供される。本発
明の酵素及び遺伝子は、酵素の生産、ユビキノン-10 の
生産等に利用できる点で有用である。
素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換え
ベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換
体、プレニル二リン酸合成酵素の製造方法及び異種微生
物によるユビキノン-10 の製造方法が提供される。本発
明の酵素及び遺伝子は、酵素の生産、ユビキノン-10 の
生産等に利用できる点で有用である。
【００８５】
SEQUENCE LISTING <110> TOYOTA JIDOSHA KABUSIKI KAISHA <120> DECAPRENYL DIPHOSPHATE SYNTHETASE GENE <130> P98-0161 <140> <141> <150> JP 97/251675 <151> 1997-09-17 <160> 30 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1002 <212> DNA <213> Paracoccus denitrificans <220> <221> CDS <222> (1)..(999) <400> 1 atg ggc atg aac gaa aac gtc tcc aag ccg ctc gac cgg ctc tcc gtg 48 Met Gly Met Asn Glu Asn Val Ser Lys Pro Leu Asp Arg Leu Ser Val 1 5 10 15 gaa ctg gcc ggg gat atg gac cgg gtc aat gcg ctg atc cgc gag cgc 96 Glu Leu Ala Gly Asp Met Asp Arg Val Asn Ala Leu Ile Arg Glu Arg 20 25 30 atg gcc agc cgc cac gcc ccc cgc att ccg gaa gtg acc gcg cat ctg 144 Met Ala Ser Arg His Ala Pro Arg Ile Pro Glu Val Thr Ala His Leu 35 40 45 gtc gag gcc ggc ggc aag cgg ctg cgg ccg atg ctg gtg ctg gcg gcg 192 Val Glu Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Met Leu Val Leu Ala Ala 50 55 60 gcg cgg ctg tgc ggc tat cag ggg aac agc cat gtg ctg ctg gcc gcg 240 Ala Arg Leu Cys Gly Tyr Gln Gly Asn Ser His Val Leu Leu Ala Ala 65 70 75 80 gcg gtc gag ttc atc cat acc gcg acg ctt ctg cac gac gac gtg gtc 288 Ala Val Glu Phe Ile His Thr Ala Thr Leu Leu His Asp Asp Val Val 85 90 95 gat gaa agc cag cag cgg cgc ggc cgg ccg acg gcc aac ctt ctg tgg 336 Asp Glu Ser Gln Gln Arg Arg Gly Arg Pro Thr Ala Asn Leu Leu Trp 100 105 110 gac aac aag tcc agc gtg ctg gtc ggc gac tac ctg ttc gcg cgc agc 384 Asp Asn Lys Ser Ser Val Leu Val Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Arg Ser 115 120 125 ttc cag ctg atg gcg gat acg gaa agc atg cag gtc atg cgc atc ttg 432 Phe Gln Leu Met Ala Asp Thr Glu Ser Met Gln Val Met Arg Ile Leu 130 135 140 gcc aat gcc agc gcc acc atc gcc gag ggc gag gtg ctg cag ctg acc 480 Ala Asn Ala Ser Ala Thr Ile Ala Glu Gly Glu Val Leu Gln Leu Thr 145 150 155 160 gcc gcg cag gac gtc tcg acc acc gag gac acc tat atc cag atc gtg 528 Ala Ala Gln Asp Val Ser Thr Thr Glu Asp Thr Tyr Ile Gln Ile Val 165 170 175 cgc ggc aag aca gcg gcg ctg ttt tcc gcc gcg acc gag gcg ggg gcg 576 Arg Gly Lys Thr Ala Ala Leu Phe Ser Ala Ala Thr Glu Ala Gly Ala 180 185 190 gtg gtg gcc ggc gcc gac ccg gcg gtg cag cag gcg ctg ttc gac tat 624 Val Val Ala Gly Ala Asp Pro Ala Val Gln Gln Ala Leu Phe Asp Tyr 195 200 205 ggc gat gcg ctg ggg atc gcc ttc cag atc gtg gac gac ctg ctg gat 672 Gly Asp Ala Leu Gly Ile Ala Phe Gln Ile Val Asp Asp Leu Leu Asp 210 215 220 tac ggc ggc tcg acc acg acc atc ggc aag aac gtc ggc gac gat ttc 720 Tyr Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ile Gly Lys Asn Val Gly Asp Asp Phe 225 230 235 240 cgc gag cgc aag ctg acg ctg ccg gtg atc aag gcc atc gcc cgc gcc 768 Arg Glu Arg Lys Leu Thr Leu Pro Val Ile Lys Ala Ile Ala Arg Ala 245 250 255 gac gag gcc gag cgc gcc ttc tgg gaa cgc acc atc ggc cag ggc cgg 816 Asp Glu Ala Glu Arg Ala Phe Trp Glu Arg Thr Ile Gly Gln Gly Arg 260 265 270 cag gac gag gcc gac ctg gcc acc gcg ctg gag atc ctg cgc cgc cgc 864 Gln Asp Glu Ala Asp Leu Ala Thr Ala Leu Glu Ile Leu Arg Arg Arg 275 280 285 gag gcg ctg gag gcc gcc cgc gcc gat gcg atc gcc tgg gcc ggc cgt 912 Glu Ala Leu Glu Ala Ala Arg Ala Asp Ala Ile Ala Trp Ala Gly Arg 290 295 300 gcc aag gcc gcg ctg caa gcc gcg ccc gac cag ccc ctg cgc cgc atc 960 Ala Lys Ala Ala Leu Gln Ala Ala Pro Asp Gln Pro Leu Arg Arg Ile 305 310 315 320 ctg gcg gac ctg gcg gat ttc gtg gtc tcg cgc ctg tcc tga 1002 Leu Ala Asp Leu Ala Asp Phe Val Val Ser Arg Leu Ser 325 330 <210> 2 <211> 333 <212> PRT <213> Paracoccus denitrificans <400> 2 Met Gly Met Asn Glu Asn Val Ser Lys Pro Leu Asp Arg Leu Ser Val 1 5 10 15 Glu Leu Ala Gly Asp Met Asp Arg Val Asn Ala Leu Ile Arg Glu Arg 20 25 30 Met Ala Ser Arg His Ala Pro Arg Ile Pro Glu Val Thr Ala His Leu 35 40 45 Val Glu Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Met Leu Val Leu Ala Ala 50 55 60 Ala Arg Leu Cys Gly Tyr Gln Gly Asn Ser His Val Leu Leu Ala Ala 65 70 75 80 Ala Val Glu Phe Ile His Thr Ala Thr Leu Leu His Asp Asp Val Val 85 90 95 Asp Glu Ser Gln Gln Arg Arg Gly Arg Pro Thr Ala Asn Leu Leu Trp 100 105 110 Asp Asn Lys Ser Ser Val Leu Val Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Arg Ser 115 120 125 Phe Gln Leu Met Ala Asp Thr Glu Ser Met Gln Val Met Arg Ile Leu 130 135 140 Ala Asn Ala Ser Ala Thr Ile Ala Glu Gly Glu Val Leu Gln Leu Thr 145 150 155 160 Ala Ala Gln Asp Val Ser Thr Thr Glu Asp Thr Tyr Ile Gln Ile Val 165 170 175 Arg Gly Lys Thr Ala Ala Leu Phe Ser Ala Ala Thr Glu Ala Gly Ala 180 185 190 Val Val Ala Gly Ala Asp Pro Ala Val Gln Gln Ala Leu Phe Asp Tyr 195 200 205 Gly Asp Ala Leu Gly Ile Ala Phe Gln Ile Val Asp Asp Leu Leu Asp 210 215 220 Tyr Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ile Gly Lys Asn Val Gly Asp Asp Phe 225 230 235 240 Arg Glu Arg Lys Leu Thr Leu Pro Val Ile Lys Ala Ile Ala Arg Ala 245 250 255 Asp Glu Ala Glu Arg Ala Phe Trp Glu Arg Thr Ile Gly Gln Gly Arg 260 265 270 Gln Asp Glu Ala Asp Leu Ala Thr Ala Leu Glu Ile Leu Arg Arg Arg 275 280 285 Glu Ala Leu Glu Ala Ala Arg Ala Asp Ala Ile Ala Trp Ala Gly Arg 290 295 300 Ala Lys Ala Ala Leu Gln Ala Ala Pro Asp Gln Pro Leu Arg Arg Ile 305 310 315 320 Leu Ala Asp Leu Ala Asp Phe Val Val Ser Arg Leu Ser 325 330 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of hexaprenyl diphosphate synthetase f
rom Saccharomyces cerevisiae, heptaprenyl diphosph
ate synthetase from Bacillus stearothermophilus o
r octaprenyl diphosphate synthetase from Escherich
ia coli. <220> <221> PEPTIDE <222> 1 <223> Xaa represents Gly or Glu <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of hexaprenyl diphosphate synthetase f
rom Micrococcus luteus or Saccharomyces cerevisia
e, heptaprenyl diphosphate synthetase from Bacill
us stearothermophilus, or octaprenyl diphosphate s
ynthetase from Escherichia coli. <220> <221> PEPTIDE <222> 1 <223> Xaa represents Thr or Met <220> <221> PEPTIDE <222> 3 <223> Xaa represents Thr or Ser <220> <221> PEPTIDE <222> 5 <223> Xaa represents Val, Ile or Leu <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of hexaprenyl diphosphate synthetase f
rom Micrococcus luteus or Saccharomyces cerevisia
e, heptaprenyl diphosphate synthetase from Bacill
us stearothermophilus, or octaprenyl diphosphate s
ynthetase from Escherichia coli. <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of heptaprenyl diphosphate synthetase
from Bacillus stearothermophilus. <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of hexaprenyl diphosphate synthetase f
rom Saccharomyces cerevisiae. <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of hexaprenyl diphosphate synthetase f
rom Micrococcus luteus or octaprenyl diphosphate s
ynthetase from Escherichia coli. <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of heptaprenyl diphosphate synthetase
from Bacillus stearothermophilus. <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of octaprenyl diphosphate synthetase f
rom Escherichia coli. <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of heptaprenyl diphosphate synthetase
from Bacillus stearothermophilus. <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of octaprenyl diphosphate synthetase f
rom Escherichia coli. <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of hexaprenyl diphosphate synthetase f
rom Micrococcus luteus or Saccharomyces cerevisia
e, heptaprenyl diphosphate synthetase from Bacill
us stearothermophilus, or octaprenyl diphosphate s
ynthetase from Escherichia coli. <220> <221> PEPTIDE <222> 3 <223> Xaa represents Leu, Ile or Met <220> <221> PEPTIDE <222> 6 <223> Xaa represents Tyr or Phe <220> <221> PEPTIDE <222> 7 <223> Xaa represents Asn or Thr <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Saccharomyces cerevisiae or octaprenyl
diphosphate synthetase from Escherichia coli. <400> 14 srcggwaarc rbatbcgtcc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Micrococcus luteus or Saccharomyces cer
evisiae, heptaprenyl diphosphate synthetase from B
acillus stearothermophilus, or octaprenyl diphosph
ate synthetase from Escherichia coli. <220> <221> modified base <222> 3 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 9 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 12 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 15 <223> n represents a, g, c or t <400> 15 ayngckwcnc tnbtncacga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Saccharomyces cerevisiae or octaprenyl
diphosphate synthetase from Escherichia coli. <220> <221> modified base <222> 3 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 6 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 12 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 18 <223> n represents a, g, c or t <400> 16 ggnggnaarc gnathcgncc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Micrococcus luteus or Saccharomyces cer
evisiae, heptaprenyl diphosphate synthetase from B
acillus stearothermophilus, or octaprenyl diphosph
ate synthetase from Escherichia coli. <220> <221> modified base <222> 3 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 6 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 9 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 12 <223> n represents a, g, c or t <400> 17 gcntcnctnc tncaygacga 20 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofheptaprenyl diphosphate synt
hetase from Bacillus stearothermophilus. <220> <221> modified base <222> 3 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 12 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 15 <223> n represents a, g, c or t <400> 18 gcngayttrm gnmgngg 17 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Saccharomyces cerevisiae. <220> <221> modified base <222> 3 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 6 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 9 <223> n represents a, g, c or t <400> 19 ytngcnggng ayttyttrtt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Micrococcus luteus or Saccharomyces cer
evisiae, heptaprenyl diphosphate synthetase from B
acillus stearothermophilus, or octaprenyl diphosph
ate synthetase from Escherichia coli. <400> 20 ktrwaatcga gwahrtcrtc 20 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Micrococcus luteus or octaprenyldiphosp
hate synthetase from Escherichia coli. <220> <221> modified base <222> 1 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 10 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 16 <223> n represents a, g, c or t <400> 21 narytgyaan arytcncc 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofheptaprenyl diphosphate synt
hetase from Bacillus stearothermophilus. <220> <221> modified base <222> 4 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 7 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 10 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 13 <223> n represents a, g, c or t <400> 22 datnagnagn gcngtytt 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofoctaprenyl diphosphate synth
etase from Escherichia coli. <400> 23 rtcrtcdaty aaytgraa 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofheptaprenyl diphosphate synt
hetase from Bacillus stearothermophilus. <220> <221> modified base <222> 7 <223> n represents a, g, c or t <400> 24 raartcnard atrtcrtc 18 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofoctaprenyl diphosphate synth
etase from Escherichia coli. <220> <221> modified base <222> 7 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 10 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 19 <223> n represents a, g, c or t <400> 25 rtcrtcnccn acrttyttnc c 21 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on sequence o
f 312 to 386 of pRC14. <400> 26 ccggccgacg caaacctt 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on complement
ary sequence of 592 to 609 of pRC14. <400> 27 ctgctgcacc gccgggtc 18 <210> 28 <211> 1219 <212> DNA <213> Paracoccus denitrificans <220> <221> CDS <222> (151)..(1149) <400> 28 10gatcccctcg gccgccagca ggtcggcggc gcgggtgatg agaagcgggt cggtggtgcg 60 cagaagctct ttcatgacat gggaaagtta cgcggctgtt gcgcatgtgt ccatggcgtg 120 gcaatggctg gcggcgaaag gggatcgctg atg ggc atg aac gaa aac gtc tcc 174 Met Gly Met Asn Glu Asn Val Ser 1 5 aag ccg ctc gac cgg ctc tcc gtg gaa ctg gcc ggg gat atg gac cgg 222 Lys Pro Leu Asp Arg Leu Ser Val Glu Leu Ala Gly Asp Met Asp Arg 10 15 20 gtc aat gcg ctg atc cgc gag cgc atg gcc agc cgc cac gcc ccc cgc 270 Val Asn Ala Leu Ile Arg Glu Arg Met Ala Ser Arg His Ala Pro Arg 25 30 35 40 att ccg gaa gtg acc gcg cat ctg gtc gag gcc ggc ggc aag cgg ctg 318 Ile Pro Glu Val Thr Ala His Leu Val Glu Ala Gly Gly Lys Arg Leu 45 50 55 cgg ccg atg ctg gtg ctg gcg gcg gcg cgg ctg tgc ggc tat cag ggg 366 Arg Pro Met Leu Val Leu Ala Ala Ala Arg Leu Cys Gly Tyr Gln Gly 60 65 70 aac agc cat gtg ctg ctg gcc gcg gcg gtc gag ttc atc cat acc gcg 414 Asn Ser His Val Leu Leu Ala Ala Ala Val Glu Phe Ile His Thr Ala 75 80 85 acg ctt ctg cac gac gac gtg gtc gat gaa agc cag cag cgg cgc ggc 462 Thr Leu Leu His Asp Asp Val Val Asp Glu Ser Gln Gln Arg Arg Gly 90 95 100 cgg ccg acg gcc aac ctt ctg tgg gac aac aag tcc agc gtg ctg gtc 510 Arg Pro Thr Ala Asn Leu Leu Trp Asp Asn Lys Ser Ser Val Leu Val 105 110 115 120 ggc gac tac ctg ttc gcg cgc agc ttc cag ctg atg gcg gat acg gaa 558 Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Arg Ser Phe Gln Leu Met Ala Asp Thr Glu 125 130 135 agc atg cag gtc atg cgc atc ttg gcc aat gcc agc gcc acc atc gcc 606 Ser Met Gln Val Met Arg Ile Leu Ala Asn Ala Ser Ala Thr Ile Ala 140 145 150 gag ggc gag gtg ctg cag ctg acc gcc gcg cag gac gtc tcg acc acc 654 Glu Gly Glu Val Leu Gln Leu Thr Ala Ala Gln Asp Val Ser Thr Thr 155 160 165 gag gac acc tat atc cag atc gtg cgc ggc aag aca gcg gcg ctg ttt 702 Glu Asp Thr Tyr Ile Gln Ile Val Arg Gly Lys Thr Ala Ala Leu Phe 170 175 180 tcc gcc gcg acc gag gcg ggg gcg gtg gtg gcc ggc gcc gac ccg gcg 750 Ser Ala Ala Thr Glu Ala Gly Ala Val Val Ala Gly Ala Asp Pro Ala 185 190 195 200 gtg cag cag gcg ctg ttc gac tat ggc gat gcg ctg ggg atc gcc ttc 798 Val Gln Gln Ala Leu Phe Asp Tyr Gly Asp Ala Leu Gly Ile Ala Phe 205 210 215 cag atc gtg gac gac ctg ctg gat tac ggc ggc tcg acc acg acc atc 846 Gln Ile Val Asp Asp Leu Leu Asp Tyr Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ile 220 225 230 ggc aag aac gtc ggc gac gat ttc cgc gag cgc aag ctg acg ctg ccg 894 Gly Lys Asn Val Gly Asp Asp Phe Arg Glu Arg Lys Leu Thr Leu Pro 235 240 245 gtg atc aag gcc atc gcc cgc gcc gac gag gcc gag cgc gcc ttc tgg 942 Val Ile Lys Ala Ile Ala Arg Ala Asp Glu Ala Glu Arg Ala Phe Trp 250 255 260 gaa cgc acc atc ggc cag ggc cgg cag gac gag gcc gac ctg gcc acc 990 Glu Arg Thr Ile Gly Gln Gly Arg Gln Asp Glu Ala Asp Leu Ala Thr 265 270 275 280 gcg ctg gag atc ctg cgc cgc cgc gag gcg ctg gag gcc gcc cgc gcc 1038 Ala Leu Glu Ile Leu Arg Arg Arg Glu Ala Leu Glu Ala Ala Arg Ala 285 290 295 gat gcg atc gcc tgg gcc ggc cgt gcc aag gcc gcg ctg caa gcc gcg 1086 Asp Ala Ile Ala Trp Ala Gly Arg Ala Lys Ala Ala Leu Gln Ala Ala 300 305 310 ccc gac cag ccc ctg cgc cgc atc ctg gcg gac ctg gcg gat ttc gtg 1134 Pro Asp Gln Pro Leu Arg Arg Ile Leu Ala Asp Leu Ala Asp Phe Val 315 320 325 10gtc tcg cgc ctg tcc tgaccaaagc ccccgcacaa atgaaaaagc ccggcgcatg 1189 Val Ser Arg Leu Ser 330 tgccgggctt ttcctttgcc tgaagcgctg 1219 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide having a NcoI site. <400> 29 atcgcccatg ggcatgaacg aaaacgtctc 30 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide having a BamHI sit
e. <400> 30 gagggatcct ataacaactg aggcagcg 28
id sequence of hexaprenyl diphosphate synthetase f
rom Saccharomyces cerevisiae, heptaprenyl diphosph
ate synthetase from Bacillus stearothermophilus o
r octaprenyl diphosphate synthetase from Escherich
ia coli. <220> <221> PEPTIDE <222> 1 <223> Xaa represents Gly or Glu <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of hexaprenyl diphosphate synthetase f
rom Micrococcus luteus or Saccharomyces cerevisia
e, heptaprenyl diphosphate synthetase from Bacill
us stearothermophilus, or octaprenyl diphosphate s
ynthetase from Escherichia coli. <220> <221> PEPTIDE <222> 1 <223> Xaa represents Thr or Met <220> <221> PEPTIDE <222> 3 <223> Xaa represents Thr or Ser <220> <221> PEPTIDE <222> 5 <223> Xaa represents Val, Ile or Leu <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of hexaprenyl diphosphate synthetase f
rom Micrococcus luteus or Saccharomyces cerevisia
e, heptaprenyl diphosphate synthetase from Bacill
us stearothermophilus, or octaprenyl diphosphate s
ynthetase from Escherichia coli. <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of heptaprenyl diphosphate synthetase
from Bacillus stearothermophilus. <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of hexaprenyl diphosphate synthetase f
rom Saccharomyces cerevisiae. <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of hexaprenyl diphosphate synthetase f
rom Micrococcus luteus or octaprenyl diphosphate s
ynthetase from Escherichia coli. <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of heptaprenyl diphosphate synthetase
from Bacillus stearothermophilus. <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of octaprenyl diphosphate synthetase f
rom Escherichia coli. <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of heptaprenyl diphosphate synthetase
from Bacillus stearothermophilus. <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of octaprenyl diphosphate synthetase f
rom Escherichia coli. <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on preserved amino ac
id sequence of hexaprenyl diphosphate synthetase f
rom Micrococcus luteus or Saccharomyces cerevisia
e, heptaprenyl diphosphate synthetase from Bacill
us stearothermophilus, or octaprenyl diphosphate s
ynthetase from Escherichia coli. <220> <221> PEPTIDE <222> 3 <223> Xaa represents Leu, Ile or Met <220> <221> PEPTIDE <222> 6 <223> Xaa represents Tyr or Phe <220> <221> PEPTIDE <222> 7 <223> Xaa represents Asn or Thr <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Saccharomyces cerevisiae or octaprenyl
diphosphate synthetase from Escherichia coli. <400> 14 srcggwaarc rbatbcgtcc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Micrococcus luteus or Saccharomyces cer
evisiae, heptaprenyl diphosphate synthetase from B
acillus stearothermophilus, or octaprenyl diphosph
ate synthetase from Escherichia coli. <220> <221> modified base <222> 3 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 9 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 12 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 15 <223> n represents a, g, c or t <400> 15 ayngckwcnc tnbtncacga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Saccharomyces cerevisiae or octaprenyl
diphosphate synthetase from Escherichia coli. <220> <221> modified base <222> 3 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 6 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 12 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 18 <223> n represents a, g, c or t <400> 16 ggnggnaarc gnathcgncc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Micrococcus luteus or Saccharomyces cer
evisiae, heptaprenyl diphosphate synthetase from B
acillus stearothermophilus, or octaprenyl diphosph
ate synthetase from Escherichia coli. <220> <221> modified base <222> 3 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 6 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 9 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 12 <223> n represents a, g, c or t <400> 17 gcntcnctnc tncaygacga 20 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofheptaprenyl diphosphate synt
hetase from Bacillus stearothermophilus. <220> <221> modified base <222> 3 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 12 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 15 <223> n represents a, g, c or t <400> 18 gcngayttrm gnmgngg 17 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Saccharomyces cerevisiae. <220> <221> modified base <222> 3 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 6 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 9 <223> n represents a, g, c or t <400> 19 ytngcnggng ayttyttrtt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Micrococcus luteus or Saccharomyces cer
evisiae, heptaprenyl diphosphate synthetase from B
acillus stearothermophilus, or octaprenyl diphosph
ate synthetase from Escherichia coli. <400> 20 ktrwaatcga gwahrtcrtc 20 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofhexaprenyl diphosphate synth
etase from Micrococcus luteus or octaprenyldiphosp
hate synthetase from Escherichia coli. <220> <221> modified base <222> 1 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 10 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 16 <223> n represents a, g, c or t <400> 21 narytgyaan arytcncc 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofheptaprenyl diphosphate synt
hetase from Bacillus stearothermophilus. <220> <221> modified base <222> 4 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 7 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 10 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 13 <223> n represents a, g, c or t <400> 22 datnagnagn gcngtytt 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofoctaprenyl diphosphate synth
etase from Escherichia coli. <400> 23 rtcrtcdaty aaytgraa 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofheptaprenyl diphosphate synt
hetase from Bacillus stearothermophilus. <220> <221> modified base <222> 7 <223> n represents a, g, c or t <400> 24 raartcnard atrtcrtc 18 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on preserved
amino acid sequence ofoctaprenyl diphosphate synth
etase from Escherichia coli. <220> <221> modified base <222> 7 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 10 <223> n represents a, g, c or t <220> <221> modified base <222> 19 <223> n represents a, g, c or t <400> 25 rtcrtcnccn acrttyttnc c 21 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on sequence o
f 312 to 386 of pRC14. <400> 26 ccggccgacg caaacctt 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based on complement
ary sequence of 592 to 609 of pRC14. <400> 27 ctgctgcacc gccgggtc 18 <210> 28 <211> 1219 <212> DNA <213> Paracoccus denitrificans <220> <221> CDS <222> (151)..(1149) <400> 28 10gatcccctcg gccgccagca ggtcggcggc gcgggtgatg agaagcgggt cggtggtgcg 60 cagaagctct ttcatgacat gggaaagtta cgcggctgtt gcgcatgtgt ccatggcgtg 120 gcaatggctg gcggcgaaag gggatcgctg atg ggc atg aac gaa aac gtc tcc 174 Met Gly Met Asn Glu Asn Val Ser 1 5 aag ccg ctc gac cgg ctc tcc gtg gaa ctg gcc ggg gat atg gac cgg 222 Lys Pro Leu Asp Arg Leu Ser Val Glu Leu Ala Gly Asp Met Asp Arg 10 15 20 gtc aat gcg ctg atc cgc gag cgc atg gcc agc cgc cac gcc ccc cgc 270 Val Asn Ala Leu Ile Arg Glu Arg Met Ala Ser Arg His Ala Pro Arg 25 30 35 40 att ccg gaa gtg acc gcg cat ctg gtc gag gcc ggc ggc aag cgg ctg 318 Ile Pro Glu Val Thr Ala His Leu Val Glu Ala Gly Gly Lys Arg Leu 45 50 55 cgg ccg atg ctg gtg ctg gcg gcg gcg cgg ctg tgc ggc tat cag ggg 366 Arg Pro Met Leu Val Leu Ala Ala Ala Arg Leu Cys Gly Tyr Gln Gly 60 65 70 aac agc cat gtg ctg ctg gcc gcg gcg gtc gag ttc atc cat acc gcg 414 Asn Ser His Val Leu Leu Ala Ala Ala Val Glu Phe Ile His Thr Ala 75 80 85 acg ctt ctg cac gac gac gtg gtc gat gaa agc cag cag cgg cgc ggc 462 Thr Leu Leu His Asp Asp Val Val Asp Glu Ser Gln Gln Arg Arg Gly 90 95 100 cgg ccg acg gcc aac ctt ctg tgg gac aac aag tcc agc gtg ctg gtc 510 Arg Pro Thr Ala Asn Leu Leu Trp Asp Asn Lys Ser Ser Val Leu Val 105 110 115 120 ggc gac tac ctg ttc gcg cgc agc ttc cag ctg atg gcg gat acg gaa 558 Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Arg Ser Phe Gln Leu Met Ala Asp Thr Glu 125 130 135 agc atg cag gtc atg cgc atc ttg gcc aat gcc agc gcc acc atc gcc 606 Ser Met Gln Val Met Arg Ile Leu Ala Asn Ala Ser Ala Thr Ile Ala 140 145 150 gag ggc gag gtg ctg cag ctg acc gcc gcg cag gac gtc tcg acc acc 654 Glu Gly Glu Val Leu Gln Leu Thr Ala Ala Gln Asp Val Ser Thr Thr 155 160 165 gag gac acc tat atc cag atc gtg cgc ggc aag aca gcg gcg ctg ttt 702 Glu Asp Thr Tyr Ile Gln Ile Val Arg Gly Lys Thr Ala Ala Leu Phe 170 175 180 tcc gcc gcg acc gag gcg ggg gcg gtg gtg gcc ggc gcc gac ccg gcg 750 Ser Ala Ala Thr Glu Ala Gly Ala Val Val Ala Gly Ala Asp Pro Ala 185 190 195 200 gtg cag cag gcg ctg ttc gac tat ggc gat gcg ctg ggg atc gcc ttc 798 Val Gln Gln Ala Leu Phe Asp Tyr Gly Asp Ala Leu Gly Ile Ala Phe 205 210 215 cag atc gtg gac gac ctg ctg gat tac ggc ggc tcg acc acg acc atc 846 Gln Ile Val Asp Asp Leu Leu Asp Tyr Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ile 220 225 230 ggc aag aac gtc ggc gac gat ttc cgc gag cgc aag ctg acg ctg ccg 894 Gly Lys Asn Val Gly Asp Asp Phe Arg Glu Arg Lys Leu Thr Leu Pro 235 240 245 gtg atc aag gcc atc gcc cgc gcc gac gag gcc gag cgc gcc ttc tgg 942 Val Ile Lys Ala Ile Ala Arg Ala Asp Glu Ala Glu Arg Ala Phe Trp 250 255 260 gaa cgc acc atc ggc cag ggc cgg cag gac gag gcc gac ctg gcc acc 990 Glu Arg Thr Ile Gly Gln Gly Arg Gln Asp Glu Ala Asp Leu Ala Thr 265 270 275 280 gcg ctg gag atc ctg cgc cgc cgc gag gcg ctg gag gcc gcc cgc gcc 1038 Ala Leu Glu Ile Leu Arg Arg Arg Glu Ala Leu Glu Ala Ala Arg Ala 285 290 295 gat gcg atc gcc tgg gcc ggc cgt gcc aag gcc gcg ctg caa gcc gcg 1086 Asp Ala Ile Ala Trp Ala Gly Arg Ala Lys Ala Ala Leu Gln Ala Ala 300 305 310 ccc gac cag ccc ctg cgc cgc atc ctg gcg gac ctg gcg gat ttc gtg 1134 Pro Asp Gln Pro Leu Arg Arg Ile Leu Ala Asp Leu Ala Asp Phe Val 315 320 325 10gtc tcg cgc ctg tcc tgaccaaagc ccccgcacaa atgaaaaagc ccggcgcatg 1189 Val Ser Arg Leu Ser 330 tgccgggctt ttcctttgcc tgaagcgctg 1219 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide having a NcoI site. <400> 29 atcgcccatg ggcatgaacg aaaacgtctc 30 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide having a BamHI sit
e. <400> 30 gagggatcct ataacaactg aggcagcg 28
【配列表フリーテキスト】配列番号3：サッカロミセス
・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合成酵素、
バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプタプレニ
ル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリからのオ
クタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から
設計したペプチド。配列番号3： XaaはGly又はGluを表
す（存在位置：1）。 配列番号4：ミクロコッカス・ルテウス若しくはサッカ
ロミセス・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合
成酵素、バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプ
タプレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリ
からのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸
配列から設計したペプチド。配列番号4： XaaはThr又は
Metを表す（存在位置：1）。配列番号4： XaaはThr又は
Serを表す（存在位置：3）。配列番号4： XaaはVal、Il
e又はLeuを表す（存在位置：5）。 配列番号5：ミクロコッカス・ルテウス若しくはサッカ
ロミセス・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合
成酵素、バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプ
タプレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリ
からのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸
配列から設計したペプチド。 配列番号6：バチルス・ステアロサーモフィラスからの
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列か
ら設計したペプチド。 配列番号7：サッカロミセス・セレビシエからのヘキサ
プレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から設計
したペプチド。 配列番号8：ミクロコッカス・ルテウスからのヘキサプ
レニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリから
のオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列
から設計したペプチド。 配列番号9：バチルス・ステアロサーモフィラスからの
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列か
ら設計したペプチド。 配列番号10：エッシェリヒア・コリからのオクタプレニ
ル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から設計したペ
プチド。 配列番号11：バチルス・ステアロサーモフィラスからの
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列か
ら設計したペプチド。 配列番号12：エッシェリヒア・コリからのオクタプレニ
ル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から設計したペ
プチド。 配列番号13：ミクロコッカス・ルテウス若しくはサッカ
ロミセス・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合
成酵素、バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプ
タプレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリ
からのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸
配列から設計したペプチド。配列番号13：XaaはLeu、Il
e又はMetを表す（存在位置：3）。配列番号13：XaaはTy
r又はPheを表す（存在位置：6）。配列番号13：XaaはAs
n又はThrを表す（存在位置：7）。 配列番号14：サッカロミセス・セレビシエからのヘキサ
プレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリか
らのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配
列から設計したオリゴヌクレオチド。 配列番号15：ミクロコッカス・ルテウス若しくはサッカ
ロミセス・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合
成酵素、バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプ
タプレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリ
からのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸
配列から設計したオリゴヌクレオチド。 配列番号15：nはa、g、c又はtを表す（存在位置：3）。
配列番号15：nはa、g、c又はtを表す（存在位置：9）。
配列番号15：nはa、g、c又はtを表す（存在位置：1
2）。配列番号15：nはa、g、c又はtを表す（存在位置：
15）。 配列番号16：サッカロミセス・セレビシエからのヘキサ
プレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリか
らのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配
列から設計したオリゴヌクレオチド。配列番号16：nは
a、g、c又はtを表す（存在位置：3）。配列番号16：nは
a、g、c又はtを表す（存在位置：6）。配列番号16：nは
a、g、c又はtを表す（存在位置：12）。配列番号16：n
はa、g、c又はtを表す（存在位置：18）。 配列番号17：ミクロコッカス・ルテウス若しくはサッカ
ロミセス・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合
成酵素、バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプ
タプレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリ
からのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸
配列から設計したオリゴヌクレオチド。配列番号17：n
はa、g、c又はtを表す（存在位置：3）。配列番号17：n
はa、g、c又はtを表す（存在位置：6）。配列番号17：n
はa、g、c又はtを表す（存在位置：9）。配列番号17：n
はa、g、c又はtを表す（存在位置：12）。 配列番号18：バチルス・ステアロサーモフィラスからの
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列か
ら設計したオリゴヌクレオチド。配列番号18：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：3）。配列番号18：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：12）。配列番号18：nは
a、g、c又はtを表す（存在位置：15）。 配列番号19：サッカロミセス・セレビシエからのヘキサ
プレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から設計
したオリゴヌクレオチド。配列番号19：nはa、g、c又は
tを表す（存在位置：3）。配列番号19：nはa、g、c又は
tを表す（存在位置：6）。配列番号19：nはa、g、c又は
tを表す（存在位置：9）。 配列番号20：ミクロコッカス・ルテウス若しくはサッカ
ロミセス・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合
成酵素、バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプ
タプレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリ
からのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸
配列から設計したオリゴヌクレオチド。 配列番号21：ミクロコッカス・ルテウスからのヘキサプ
レニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリから
のオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列
から設計したオリゴヌクレオチド。配列番号21：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：1）。配列番号21：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：10）。配列番号21：nは
a、g、c又はtを表す（存在位置：16）。 配列番号22：バチルス・ステアロサーモフィラスからの
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列か
ら設計したオリゴヌクレオチド。配列番号22：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：4）。配列番号22：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：7）。配列番号22：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：10）。配列番号22：nは
a、g、c又はtを表す（存在位置：13）。 配列番号23：エッシェリヒア・コリからのオクタプレニ
ル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から設計したオ
リゴヌクレオチド。 配列番号24：バチルス・ステアロサーモフィラスからの
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列か
ら設計したオリゴヌクレオチド。配列番号24：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：7）。 配列番号25：エッシェリヒア・コリからのオクタプレニ
ル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から設計したオ
リゴヌクレオチド。配列番号25：nはa、g、c又はtを表
す（存在位置：7）。配列番号25：nはa、g、c又はtを表
す（存在位置：10）。配列番号25：nはa、g、c又はtを
表す（存在位置：19）。 配列番号26：pRC14の312〜386番目の配列に基づいて設
計したオリゴヌクレオチド。 配列番号27：pRC14の592〜609番目の相補配列に基づい
て設計したオリゴヌクレオチド。 配列番号29：NcoI部位を有するように設計したオリゴヌ
クレオチド。 配列番号30：BamHI部位を有するように設計したオリゴ
ヌクレオチド。
・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合成酵素、
バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプタプレニ
ル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリからのオ
クタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から
設計したペプチド。配列番号3： XaaはGly又はGluを表
す（存在位置：1）。 配列番号4：ミクロコッカス・ルテウス若しくはサッカ
ロミセス・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合
成酵素、バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプ
タプレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリ
からのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸
配列から設計したペプチド。配列番号4： XaaはThr又は
Metを表す（存在位置：1）。配列番号4： XaaはThr又は
Serを表す（存在位置：3）。配列番号4： XaaはVal、Il
e又はLeuを表す（存在位置：5）。 配列番号5：ミクロコッカス・ルテウス若しくはサッカ
ロミセス・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合
成酵素、バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプ
タプレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリ
からのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸
配列から設計したペプチド。 配列番号6：バチルス・ステアロサーモフィラスからの
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列か
ら設計したペプチド。 配列番号7：サッカロミセス・セレビシエからのヘキサ
プレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から設計
したペプチド。 配列番号8：ミクロコッカス・ルテウスからのヘキサプ
レニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリから
のオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列
から設計したペプチド。 配列番号9：バチルス・ステアロサーモフィラスからの
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列か
ら設計したペプチド。 配列番号10：エッシェリヒア・コリからのオクタプレニ
ル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から設計したペ
プチド。 配列番号11：バチルス・ステアロサーモフィラスからの
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列か
ら設計したペプチド。 配列番号12：エッシェリヒア・コリからのオクタプレニ
ル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から設計したペ
プチド。 配列番号13：ミクロコッカス・ルテウス若しくはサッカ
ロミセス・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合
成酵素、バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプ
タプレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリ
からのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸
配列から設計したペプチド。配列番号13：XaaはLeu、Il
e又はMetを表す（存在位置：3）。配列番号13：XaaはTy
r又はPheを表す（存在位置：6）。配列番号13：XaaはAs
n又はThrを表す（存在位置：7）。 配列番号14：サッカロミセス・セレビシエからのヘキサ
プレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリか
らのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配
列から設計したオリゴヌクレオチド。 配列番号15：ミクロコッカス・ルテウス若しくはサッカ
ロミセス・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合
成酵素、バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプ
タプレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリ
からのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸
配列から設計したオリゴヌクレオチド。 配列番号15：nはa、g、c又はtを表す（存在位置：3）。
配列番号15：nはa、g、c又はtを表す（存在位置：9）。
配列番号15：nはa、g、c又はtを表す（存在位置：1
2）。配列番号15：nはa、g、c又はtを表す（存在位置：
15）。 配列番号16：サッカロミセス・セレビシエからのヘキサ
プレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリか
らのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配
列から設計したオリゴヌクレオチド。配列番号16：nは
a、g、c又はtを表す（存在位置：3）。配列番号16：nは
a、g、c又はtを表す（存在位置：6）。配列番号16：nは
a、g、c又はtを表す（存在位置：12）。配列番号16：n
はa、g、c又はtを表す（存在位置：18）。 配列番号17：ミクロコッカス・ルテウス若しくはサッカ
ロミセス・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合
成酵素、バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプ
タプレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリ
からのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸
配列から設計したオリゴヌクレオチド。配列番号17：n
はa、g、c又はtを表す（存在位置：3）。配列番号17：n
はa、g、c又はtを表す（存在位置：6）。配列番号17：n
はa、g、c又はtを表す（存在位置：9）。配列番号17：n
はa、g、c又はtを表す（存在位置：12）。 配列番号18：バチルス・ステアロサーモフィラスからの
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列か
ら設計したオリゴヌクレオチド。配列番号18：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：3）。配列番号18：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：12）。配列番号18：nは
a、g、c又はtを表す（存在位置：15）。 配列番号19：サッカロミセス・セレビシエからのヘキサ
プレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から設計
したオリゴヌクレオチド。配列番号19：nはa、g、c又は
tを表す（存在位置：3）。配列番号19：nはa、g、c又は
tを表す（存在位置：6）。配列番号19：nはa、g、c又は
tを表す（存在位置：9）。 配列番号20：ミクロコッカス・ルテウス若しくはサッカ
ロミセス・セレビシエからのヘキサプレニル二リン酸合
成酵素、バチルス・ステアロサーモフィラスからのヘプ
タプレニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリ
からのオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸
配列から設計したオリゴヌクレオチド。 配列番号21：ミクロコッカス・ルテウスからのヘキサプ
レニル二リン酸合成酵素又はエッシェリヒア・コリから
のオクタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列
から設計したオリゴヌクレオチド。配列番号21：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：1）。配列番号21：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：10）。配列番号21：nは
a、g、c又はtを表す（存在位置：16）。 配列番号22：バチルス・ステアロサーモフィラスからの
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列か
ら設計したオリゴヌクレオチド。配列番号22：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：4）。配列番号22：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：7）。配列番号22：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：10）。配列番号22：nは
a、g、c又はtを表す（存在位置：13）。 配列番号23：エッシェリヒア・コリからのオクタプレニ
ル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から設計したオ
リゴヌクレオチド。 配列番号24：バチルス・ステアロサーモフィラスからの
ヘプタプレニル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列か
ら設計したオリゴヌクレオチド。配列番号24：nはa、
g、c又はtを表す（存在位置：7）。 配列番号25：エッシェリヒア・コリからのオクタプレニ
ル二リン酸合成酵素の保存アミノ酸配列から設計したオ
リゴヌクレオチド。配列番号25：nはa、g、c又はtを表
す（存在位置：7）。配列番号25：nはa、g、c又はtを表
す（存在位置：10）。配列番号25：nはa、g、c又はtを
表す（存在位置：19）。 配列番号26：pRC14の312〜386番目の配列に基づいて設
計したオリゴヌクレオチド。 配列番号27：pRC14の592〜609番目の相補配列に基づい
て設計したオリゴヌクレオチド。 配列番号29：NcoI部位を有するように設計したオリゴヌ
クレオチド。 配列番号30：BamHI部位を有するように設計したオリゴ
ヌクレオチド。
【図１】イソプレノイド化合物の生合成を示す図であ
る。
る。
【図２】P.denitrificans におけるプレニル二リン酸生
合成経路を示す図である。
合成経路を示す図である。
【図３】PCR プライマーのデザインを示す図である。
【図４】アクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真
である。
である。
【図５】アミノ酸配列の相同性を比較した図である。
【図６】PCR プライマーのデザインを示す図である。
【図７】サザンハイブリダイゼーションの結果を示す電
気泳動写真である。
気泳動写真である。
【図８】サザンハイブリダイゼーションの結果を示す電
気泳動写真である。
気泳動写真である。
【図９】サザンハイブリダイゼーションの結果を示す電
気泳動写真である。
気泳動写真である。
【図１０】プラスミドp11A1の構造を示す図である。
【図１１】プラスミドp11A1に含まれるオープンリーデ
ィングフレームを示す図である。
ィングフレームを示す図である。
【図１２】種々のプレニルトランスフェラーゼのアミノ
酸配列を比較した図である。
酸配列を比較した図である。
【図１３】本発明の遺伝子の上流及び下流の領域に含ま
れる遺伝子の構造を示す模式図である。
れる遺伝子の構造を示す模式図である。
【図１４】逆相薄層液体クロマトグラフの写真である。
【図１５】SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果
を示す写真である。
を示す写真である。
【図１６】キノンの側鎖の分析結果を示す図である。
【図１７】各菌体におけるユビキノン生成比率を示す図
である。
である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１０年９月２８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１４】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/66 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパ
ク質。 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質 （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において少な
くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつデカプレニル二リン酸合成
酵素活性を有するタンパク質 - 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパ
ク質をコードする遺伝子。 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質 （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において少な
くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつデカプレニル二リン酸合成
酵素活性を有するタンパク質 - 【請求項３】 配列番号１で表される塩基配列を含む、
請求項２記載の遺伝子。 - 【請求項４】 請求項２又は３記載の遺伝子を含む組換
えベクター。 - 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターによって
形質転換された形質転換体。 - 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培地に培養
し、得られる培養物からデカプレニル二リン酸合成酵素
を採取することを特徴とするデカプレニル二リン酸合成
酵素の製造方法。 - 【請求項７】 請求項５記載の形質転換体からユビキノ
ン-10 を抽出することを特徴とするユビキノン-10 の製
造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10262075A JPH11178590A (ja) | 1997-09-17 | 1998-09-16 | デカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25167597 | 1997-09-17 | ||
| JP9-251675 | 1997-09-17 | ||
| JP10262075A JPH11178590A (ja) | 1997-09-17 | 1998-09-16 | デカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11178590A true JPH11178590A (ja) | 1999-07-06 |
Family
ID=26540308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10262075A Pending JPH11178590A (ja) | 1997-09-17 | 1998-09-16 | デカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11178590A (ja) |
Cited By (7)
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-
1998
- 1998-09-16 JP JP10262075A patent/JPH11178590A/ja active Pending
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