JPH11169196A - バンコマイシン耐性菌の検出方法及び検出用培地 - Google Patents
バンコマイシン耐性菌の検出方法及び検出用培地Info
- Publication number
- JPH11169196A JPH11169196A JP30881397A JP30881397A JPH11169196A JP H11169196 A JPH11169196 A JP H11169196A JP 30881397 A JP30881397 A JP 30881397A JP 30881397 A JP30881397 A JP 30881397A JP H11169196 A JPH11169196 A JP H11169196A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vancomycin
- medium
- resistant
- growth
- lactam
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
耐性黄色ブドウ球菌を検出する方法、培地、キットを提
供する。 【解決手段】バンコマイシンとβ−ラクタム剤との拮抗
反応を利用したヘテロ型バンコマイシン耐性黄色ブドウ
球菌の検出方法。
Description
バンコマイシン耐性菌の検出方法及び検出用培地に関す
る。さらに詳しくは、本発明は、バンコマイシン耐性黄
色ブドウ球菌の検出方法及び検出用培地に関する。本発
明はまた、このような検出用培地を含むバンコマイシン
耐性黄色ブドウ球菌の検出用キットに関する。
数の抗生物質が開発されて細菌感染の治療に用いられて
きた。これらの抗生物質のうちで重要なものには、β−
ラクタム、グリコペプチド、マクロライド、キノロン、
テトラサイクリン及びアミノグリコシドが含まれる。
抗生物質に対して耐性である細菌の突然変異株が出現す
る頻度も増加しており、近年、MRSA(メチシリン耐
性黄色ブドウ球菌:Methicillin-resistant Staphyloco
ccus aureus)感染症として大きな問題となっている。
これは、ペニシリンに耐性化した黄色ブドウ球菌に効力
を有する抗菌薬として最初に開発されたペニシリナーゼ
に加水分解されにくいペニシリンであるメチシリンの名
称を付けてこのように呼ばれている。しかしながら、M
RSAの本態は、メチシリンのみならず、β−ラクタム
剤と呼称される抗菌薬、すなわち、耐性ブドウ球菌用ペ
ニシリンをはじめとする全てのペニシリン系、第1、第
2、第3、第4世代と呼ばれる全てのセフェム系、ある
いはモノバクタム系、カルバペネム系といった、現在市
販されているほとんど全てのβ−ラクタム薬に耐性を示
す性質を有していることである。
うこともある)は、ストレプトミセス・オリエンタリス
(Streptomyces orientalis)の産生する環状グリコペ
プチド系抗生物質であり、2つの糖(グルコース、バン
コサミン)と7つのアミノ酸で構成されている。その分
子量の大きさから、外膜を通過しにくいためグラム陰性
菌には効果がないが、グラム陽性菌には強い効果をもっ
ている。
ムレインモノマー末端のD-Ala-D-Alaに結合し、ムレイ
ンモノマーが細胞壁に取り込まれる段階を阻害する(Ra
bindra K. Sinha et al., J. Bacteriol. 96:374-382,
1968; Nieto, M. et al., Biochem. J. 123: 773-787,
1971; Nieto, M. et al., Biochem. J. 123:789-803,19
71; Joel P. Mackay et al., J. Am. Chem. Soc. 116:3
481-4590, 1994))。その結果、細菌の細胞壁が泥弱化
し、細胞内内圧に抗しきれず死滅する。
6年にペニシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症治療に使用
されていたが、ペニシリナーゼに安定な半合成ペニシリ
ンが開発されたことと、バンコマイシン自体の腎毒性の
強さからあまり使用されなくなっていた。日本では、1
981年に骨髄移植時の消化管殺菌のみの適応で、経口
用塩酸バンコマイシンが承認された。その後、MRSA
感染症の拡大により、1991年にバンコマイシン静注
剤が承認された。
きたにもかかわらず、耐性菌が出現せず、そのためMR
SAの出現後はその特効薬として広く使用されてきた。
しかしながら、同系統のアボパルシンが家畜に大量投与
されたことによってアボパルシン耐性腸球菌が出現し
た。この菌はバンコマイシンに対しても交差耐性を示す
バンコマイシン耐性腸球菌(Vancomycin-resistant Ent
erococcus:VRE)であった。これは、抗菌薬には必ず耐
性菌が出現することの証明でもあった。
ンコマイシン耐性菌は、上記の腸球菌(Enterococcus
属)とCNSの表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermid
es)(Sanyal, D. et al., J. Antimicrob. Chemother. 3
2:267-278, 1993)とS. haemolyticus(Veach, LA. et a
l., J. Clin. Microbiol. 28:2064-2068, 1990; Auber
t,G. et al., J. Antimicrob. Chemother. 25:491-493,
1990)で報告されているが、黄色ブドウ球菌では報告さ
れていなかった。
マイシン投与を受けたにもかかわらず、症状の改善が認
められないばかりか、徐々に悪化傾向にあった生後4ヶ
月の肺動脈閉鎖症男児の心臓手術正中切開部に生じたM
RSA創感染部位から、バンコマイシンに対して耐性を
示す黄色ブドウ球菌株であるMu50を検出し、純培養的に
分離した(Hiramatsu, K. et al., J. Antimicrob. Chem
other. 40:135-136, 1997)。バンコマイシン投与で治
療できないことから、バンコマイシンのMu50に対する抗
菌力をしらべたところ、この株のNCCLS(National Comm
ittee for Clinical Laboratory Standards)法に従っ
たMIC(最小発育阻止濃度:完全に増殖を阻止する抗菌
剤の最小濃度である)は8μg/mlであった。この値
はNCCLSの基準によればバンコマイシン軽度耐性に
分類される(National Committee for Clinical Labora
tory Standards villanova.Pa. 1993)。この菌は、VRE
で認められるvanA, vanB, vanC遺伝子群は検出されず、
全く新しい耐性機構をもつものであった。
は、バンコマイシン濃度と生存細胞数から得られるポピ
ュレーションカーブから、バンコマイシンに対して均一
に高い耐性を有する菌株であると考えられた。
イシンに対するMIC値が8μg/mlより低いMRSA
でも、バンコマイシン治療失敗例が存在することを発見
した。バンコマイシン治療の奏功しなかったMRSA肺炎の
症例から分離したこの株(Mu3株)のMIC値は2μg/m
lであり、NCCLSの基準では感受性菌に分類され
る。しかし、この株は、約10-6以上の頻度でバンコマ
イシン耐性黄色ブドウ球菌(VRSA:MIC値が8μg/m
l)を生み出すことが確認された。
の耐性度をもつ不均一な集団であることが示唆され(図
1)、本発明らはこれをヘテロVRSAと命名した(Hirama
tsuet al., Lancet, in Press)。
値が8μg/mlのVRSAを生じ、バンコマイシン無効の
感染症を引き起こすことから、早期の段階で検出するこ
とが極めて重要である。しかしながら、ヘテロVRSAはMI
C値が低く、通常の検出方法では検出することができな
い。そこで、簡便、迅速で、かつ確実にこのようなバン
コマイシン軽度耐性黄色ブドウ球菌を検出する方法が求
められている。
たように、MRSA感染症の治療にβ−ラクタム剤と組
み合わせて使用されてきた。これは、バンコマイシンと
β−ラクタム剤とがMRSA感染症に対して相乗的効果
を有すると考えられていたからである。
おいては、驚くべきことにバンコマイシンとβ−ラクタ
ム剤とが拮抗することを本発明者らは見いだした。この
知見は従来の医学界の常識を全く覆すものである。
ヘテロ型バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌を簡便、迅
速、確実に検出する方法、培地及びキットを提供するも
のである。
タム剤との拮抗反応を利用したヘテロ型バンコマイシン
耐性黄色ブドウ球菌の検出方法、検出培地及び検出用キ
ットを提供する。
実施することが可能である。液体培養法及び寒天平板培
養法を含む。
本発明は、以下の工程: a)バンコマイシン及びβ−ラクタム剤を含有するグラ
ム陽性菌が生育する液体培地中に試験菌液を入れる、 b)バンコマイシン耐性菌の生育に十分な時間培養す
る、そして d)液体培地中におけるバンコマイシン耐性菌の生育を
観察する、ことからなる。
えば本発明は、以下の工程: a)バンコマイシン及びβ−ラクタム剤を含有するグラ
ム陽性菌が生育する寒天平板培地上に試験菌液を塗抹す
る、 b)バンコマイシン耐性菌の生育に十分な時間培養す
る、そして d)寒天平板上におけるバンコマイシン耐性菌の生育を
観察する、ことからなる。
本発明の検出方法は、例えば以下の工程: a)バンコマイシンを含有するグラム陽性菌が生育する
寒天培地上に試験菌液を塗抹する、 b)β−ラクタム剤含有ディスクをa)で調製した培地
上に置く、 c)バンコマイシン耐性菌の生育に十分な時間培養す
る、そして d)ディスク周辺におけるバンコマイシン耐性菌の生育
を観察する、ことからなる。
菌の生育を目視で観察できて判定が容易であること、試
験法が簡単であること及び均一な結果が得られることな
どからβ−ラクタム剤ディスクを用いる寒天平板培養法
による簡易検出法が好ましい。この簡易検出法はディス
ク周囲にβ−ラクタム剤の濃度のグラジエントが形成さ
れるため、広い濃度範囲において耐性菌の検出を行うこ
とが可能となり、従って新しいタイプの耐性菌が出現し
たときにも容易にこれを検出することができる。
ム陽性菌が生育する培地中に、バンコマイシン、及び場
合によりβ−ラクタム剤を含むバンコマイシン耐性黄色
ブドウ球菌の検出用培地も提供する。上述した第1及び
第2の態様では、培地にβ−ラクタム剤を含むが、β−
ラクタム剤ディスクを用いて行う第3の態様では、培地
にβ−ラクタム剤を含まない。
菌検出方法に使用するグラム陽性菌が生育する培地と
は、特に限定されないが、例えば、TSB(Tripticase So
y Broth)、TSA(Tripticase Soy Agar)、MHB(Muller
Hinton Broth)、MHA(MullerHinton Agar)、コロン
ビア寒天培地、MSA(Mannitol Salt Agar)等を使用す
ることができる。特に好ましいのはHI(Heart Infusio
n)培地、HIA(Heart Infusion Agar)培地、BHI(Brai
n Heart Infusion)培地、BHIA (Brain Heart Infusio
n Agar)培地である。
/mlであることが好ましく、4μg/mlであること
が最も好ましい。
ことが好ましく、6.5〜7.5であることがより好ま
しく、pH7.0であることが最も好ましい。pHの調
整はリン酸ナトリウム−リン酸系などの緩衝液を用いて
行うことができる。
は1以上の細胞壁合成系をサポートする物質をさらに含
む。細胞壁合成系をサポートする物質はアミノ酸、糖、
ペプチド、ムレインモノマー前駆体、無機塩、ビタミン
類、核酸構成成分、ATPからなる群より選択されるこ
とが好ましい。アミノ酸としては例えばリジン、グルタ
ミン酸、グリシン、アラニン、グルタミンなどが好まし
く、アミノ酸はD体、L体又はDL体のいずれであって
もよい。糖としては例えばグルコース、グルコサミン、
ムラミン酸などが好ましく、ペプチドとしては例えばAl
a-Glu、Ala-Glu-Lys、Ala-Glu-Lys-Ala-Ala、Ala-Alaな
どが好ましく、無機塩としては例えばMnCl2、MgCl2、Fe
Cl2などが好ましく、ビタミン類としては例えばチアミ
ン、ニコチンアミドなどが好ましく、核酸構成成分とし
ては例えばウラシル、ウリジン、ウリジンモノホスフェ
ートなどが好ましい。
は培地全体中の濃度として、例えばアミノ酸では0.0
01〜10%が好ましく、0.01〜1%がより好まし
い。糖の添加量は0.1〜20%が好ましく、1〜10
%がより好ましい。ペプチドの添加量は0.001〜1
0%が好ましく、0.01〜1%がより好ましい。無機
塩の添加量は0.00001〜1.0%が好ましく、
0.0001〜0.1%がより好ましい。ビタミン類の
添加量は0.00001〜0.1%が好ましく、0.0
001〜0.01%がより好ましい。核酸構成成分の添
加量は0.001〜1.0%が好ましく、0.01〜
0.1%がより好ましい。ムレインモノマー前駆体の添
加量は0.001〜10%が好ましく、0.01〜1%
がより好ましい。ATPの添加量は0.00001〜
1.0%が好ましく、0.001〜0.1%がより好ま
しい。
を適宜組み合わせて、追加成分溶液を調製しておき、本
発明のヘテロVRSA検出用培地に添加することができる。
好ましい追加成分溶液の一例を実施例に示すが、これに
限定されず、種々の組み合わせが可能である。
剤はペニシリン系、セフェム系、モノバクタム系及びカ
ルバペネム系などの抗菌剤を含み、ペニシリン系抗菌剤
としては例えば、MZPC(メズロシリン)、TIPC
(チカルシリン)、MCI−PC(クロキサシリン)、
AMPC/CVA(オーグメンチン)、AMPC(アモ
キシシリン)、ABPC/SBT(スルタミシン)、T
IPC/CVA(チカルシリン/クラブラン酸)、PC
−G(ペニシリン)、ABPC(アンピシリン)、CB
PC(カルベニシリン)、SBPC(スルベニシリ
ン)、PIPC(ピペラシリン)、MPI−PC(オキ
サシリン)が挙げられ、セフェム系抗菌剤としては例え
ば、CPZ(セフォペラゾン)、CZX(セフチゾキシ
ム)、CXM(セフロキシム)、LMOX(モクサラク
タム)、CCL(セファクロル)、CFPM(セフェピ
ム)、CAZ(セフタジジム)、CTT(セフォテタ
ン)、CTRX(セフトリアキソン)、CPR(セフピ
ロム)、CDZM(セフォジジム)、FMOX(フロモ
キセフ)、CFIX(セフィキシム)、CBPZ(セフ
ブペラゾン)、CFTM(セフテラム)、CMNX(セ
フミノクス)、CPM(セフピラミド)、CPZ/SB
T(セフォペラゾン/スルバクタム)、CPDX(セフ
ポドキシム)、CETB(セフチブテン)、CFDN
(セフジニル)、CEMT(セフェタメト)、CET
(セファロチン)、CEZ(セファゾリン)、CEX
(セファレキシン)、CMZ(セフメタゾール)、CT
M(セフォチアム)、CFS(セフスロジン)、CMX
(セフメノキシム)、CFX(セフォキシチン)、CT
X(セフォタキシム)、CMD(セファマンドール)が
挙げられ、モノバクタム系抗菌剤としては例えばCRM
N(カルモナム)、AZT(アズトレオナム)、が挙げ
られ、カルバペネム系抗菌剤としては例えばIPM/C
S(イミペネム/シラスタチン)、PAPM/BP(カ
ルベニン)、MEPM(メロペネム)、BIPM(ビア
ペネム)が挙げられる。後述の実施例で示すように、本
発明の方法はこれらのいずれの系統のβ−ラクタム剤を
用いても検出が可能であった。これらのβ−ラクタム剤
の複数を用いて検出を確実にすることが好ましい。
種類により、またβ−ラクタム剤の種類によっても異な
り、当業者は検出に用いるそれぞれのβ−ラクタム剤の
至適濃度をディスクを用いる簡単な予備試験により容易
に定めることができる。また後述するように、感受性試
験用ディスクとして市販されている種々のβ−ラクタム
剤ディスクを本発明の方法に用いることができることも
明らかになった。
/ディスク含むディスク略号)、CFM5(CFIXを
5μg/ディスク含むディスク略号)及びATM30
(AZTを5μg/ディスク含むディスク略号)などの
市販のディスクを組み合わせて実施できる。
以下の工程を含む: (1)試験菌をTripto soy broth(TSB)一夜培養液に、
もしくは単一のコロニーを新鮮TSBに懸濁し、生理食
塩水にてOD578nmで0.3(マックファーランド
#1)の菌液を作成する、(2)直ちにバンコマイシン
耐性試験用培地に滅菌綿棒を用いて塗末する(このとき
最低2方向から塗末することが好ましい)、(3)β−
ラクタム剤のディスクを置き、ピンセットを用いてディ
スクを軽く押さえる、(4)35〜37℃で、24時間
〜48時間培養する、(5)ディスク周囲の菌の発育の
有無を観察する。
る場合にはヘテロVRSAと判定する。ディスク周囲のみな
らず、培地全面に発育を認める場合にはホモVRSA と判
定する。また、培地に全く発育を認めない場合には感受
性菌と判定する。
ブドウ球菌の検出方法及び検出培地に加えて、バンコマ
イシン耐性黄色ブドウ球菌の検出用キットを提供するも
のである。該検出用キットには、本発明のバンコマイシ
ン耐性黄色ブドウ球菌の検出用培地を少なくとも含み、
この検出用培地はあらゆるフォーマットのものでありう
る。キットには、その他に1以上の種類のβ−ラクタム
剤含有ディスク、塗抹用綿棒、標準菌液、使用説明書な
どを含めてもよい。
以上の頻度でホモVRSA(MIC値が8μg/ml)を生み
出すことが確認された。また、ヘテロVRSAは日本の大学
病院で検出されるMRSAの約10%に見いだされ、多くの
バンコマイシン治療無効症例に関与している可能性があ
る。
治療薬である。しかしながら、今回、本発明者らが見い
だしたように、ヘテロVRSAではバンコマイシンとβ−ラ
クタム剤が拮抗作用を示す。従って、ヘテロVRSAが検出
された場合には、バンコマイシンとβ−ラクタム剤との
併用を避けるべきであり、バンコマイシンの乱用をこの
まま継続すれば、間違いなくバンコマイシン耐性菌は増
加するであろう。
確実な検出が非常に重要であり、これによってMRSAの治
療薬を決定することができる。新規知見に基づく本発明
の臨床的な意味は極めて重大である。
く説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本
明細書の記載に基づき、種々の変更、修飾が当業者には
可能であり、これらも本発明の範囲に含まれる。
男性)からMu3株を臨床的に分離した。この患者はバン
コマイシン(42mg/kg/日)で12日間治療した
が無効であり、バンコマイシン治療の最後の4日間は肺
炎が悪化していた。次いで、この患者をアンピシリン/
スルバクタムとアルベカシンの組み合わせによって10
日間治療することに成功した。組み合わせ治療の終了直
前にこの患者の膿痰からMu3を分離した。
0)は、本発明者らが、肺動脈閉鎖症4ヶ月男児の心臓
手術正中切開部に生じたMRSA創感染部位から分離した、
(Hiramatsu, K. et al., J. Antimicrob. Chemother.
40:135-136, 1997)。
本人男性)の膿痰から分離した。この患者は突発性慢性
腎不全(Ccr=11.5ml/分)にかかっており、肺炎は21
日間にわたるバンコマイシン(4〜5日ごとに0.5又
は1.0g)で治療に成功した。
6538P)は、国立予防衛生研究所から購入した。
間インキュベーションした後の5x104CFU/sp
otの増殖を阻害する抗生物質の最小発育阻止濃度をMI
C値とした。この方法で測定したMu3株のMIC値は2μg
/mlであり、NCCLSの基準では感受性菌に分類され
る。
ン分析)は、細胞懸濁液(578nmにおいてOD 0.3まで培
養した一夜培養液を希釈して調製)及びその連続希釈液
50μlを種々の濃度のバンコマイシンを含有するBHI
寒天平板に塗抹することによって実施した。平板は37
℃で48時間インキュベートし、成熟コロニー数を計数
した。細胞懸濁液50μl中に理論上含まれる耐性細胞
数を計算し、両対数グラフにプロットした。
Mu50、Mu3のポピュレーション分析をバンコマイシン感
受性のMRSA H1及びFDA209Pのポピュレーション分析と比
較した結果を図1に示す。Mu50細胞は4μg/mlバン
コマイシン中で100%生育でき、10μg/mlバン
コマイシンでも約0.001%の細胞が生育できた。
コマイシンでほぼ99.99%の細胞が阻害されたの
で、Mu50よりもバンコマイシンに感受性であると考えら
れた。しかしながら、Mu3はMu50と同様に、5〜9μg
/mlバンコマイシンの存在下でも生育できる耐性サブ
ポピュレーションを含んでいた。
びFDA209Pの細胞は、その100%が4μg/mlで完
全に生育阻害された。
生存細胞数から得られるポピュレーションカーブから、
バンコマイシンに対して均一に高い耐性を有する菌株で
あると考えられ、本発明者らはこれをホモVRSA(vancom
ycin-resistant Stapylococcus aureus) と命名し、一
方Mu3株はポピュレーションカーブから種々の耐性度の
細胞を含む不均一な集団であることが確認され、本発明
らはバンコマイシン感受性株と区別するために、これを
ヘテロVRSAと命名した。
Aの出現 Mu3株中に含まれる耐性細胞がMu50のようなホモVRSAを
生じうるかを検討した。種々の濃度のバンコマイシンに
Mu3をさらすことによって、Mu3のサブクローンを得た。
(1〜8μg/mlのバンコマイシン選択濃度でそれぞ
れ10サブクローン、また9μg/mlのバンコマイシ
ン選択濃度で2サブクローン)を得て、そのMIC値を決
定した。表1は耐性サブクローンの出現頻度及びMICの
分布を示す。
るにつれて、サブクローンのMIC値範囲も上昇した。し
かしながら、Mu50のバンコマイシン耐性レベル(MICが
8μg/ml)を達成したサブクローンが得られたの
は、選択に用いたバンコマイシン濃度が8及び9μg/
mlの場合のみであった。
からホモVRSAが約10-6以上の頻度で出現することを確
認した。
リーニング 日本の大学病院7施設から入手した合計129のMRSA株
と、日本の非大学病院195施設から入手した合計97
0のMRSA株を試験した。試験は簡易法ポピュレーション
分析により行った。すなわち、一夜培養した菌液をOD 5
78nmで0.3に調整し、その菌液を4μg/mlバンコ
マイシンを含むBHI寒天平板上にスポットした。平板を
37℃で48時間インキュベートし、24時間後及び4
8時間後に細胞の生育を観察した。48時間で細胞の生
育が全く観察されない場合には、バンコマイシンに対し
て感受性と考えられる。24時間以内にコンフルエント
な生育が観察される場合には、この株はホモVRSAと疑わ
れる。48時間以内に計数しうる数(1〜30)のコロ
ニーが観察される場合には、この株はヘテロVRSAと疑わ
れる。バンコマイシン8μg/mlで選択したときに、
バンコマイシン8μg/ml又はそれ以上のMICを有
し、かつその耐性レベルが薬剤不含培地中で9日間培養
した後にも安定に維持されるようなサブクローンを生じ
たときに、ホモVRSAであると最終的に判定した。
は大学病院由来の1検体のみであり、その他の日本の病
院からは検出されなかった。一方、ヘテロVRSAは大学病
院で9.3%(12/129)、非大学病院で1.3%
(13/970)であった。
うにして行った。
添加MHA、BHIA及びHIAの各培地を用いてMIC
値を求めた。得られた結果を図2に示す。MHAでは、
FDA209P株、MRSA H1株は0.5μg/ml、Mu3株は1
μg/ml、Mu50株は4μg/mlを示した。ウマ血清
添加MHAではいずれも2倍近い値を示した。Mu3株を
バンコマイシン8μg/mlで選択して得られたMu3-8R
株とMu50株は8μg/mlであった。このMIC値と同様
のMICを示した培地はBHIAとHIAであった。
on法でMICを測定して(1)の結果と比較した。図3に
示すように、FDA209P株は0.5μg/ml、MRSA H1株
は1μg/ml、Mu3株は2μg/ml、Mu50株は8μ
g/mlを示した。BHIA、HIAにおけるagar dil
ution法のMIC値はこれらの結果を反映しており、BHI
A及びHIAがVRSA検出培地として適していること
が示唆された。
びBHIAの各培地を用いてMu3株のポピュレーション
分析を行い、さらに培地を検討した。図4に示すよう
に、STA(Sensitivity Test Agar)、MHA、TS
Aと比べて、HIA及びBHIAではバンコマイシン濃
度の約2倍高濃度側にシフトしたポピュレーションカー
ブを示し、耐性株の検出に適していると考えられた。
シンとβ−ラクタム剤の併用効果 バンコマイシンとβ−ラクタム剤との併用効果を寒天平
板希釈法によるChecker board法によって行い、下記の
式よりminimal fractional inhibitory concentration
index(min. FIC index)を算出し、下記に示す基準で
相乗効果、相加効果、不完及び拮抗作用を判定した。得
られた結果を表2に示す。
6, Mu46, Mu49は、本発明者らが臨床材料から分離したM
RSA株である。
β−ラクタム剤でバンコマイシンとの拮抗作用が観察さ
れた。
剤の拮抗作用 バンコマイシンとβ−ラクタム剤(SBT/ABPC)
との拮抗作用を、バンコマイシン1μg/ml含有培地
を用いたポピュレーション解析により確認した。
種々の濃度のSBT/ABPCを添加した培地上におけ
るMu3株の生育を調べた。図5に示すように、バンコマ
イシン1μg/ml単独を含む培地での残存生存率は1
03CFU/mlであるが、SBT/ABPCを添加し
た場合、0.125〜8μg/mlの範囲で残存生存率
の増加が確認された。これはSBT/ABPCとバンコ
マイシンの明確な拮抗現象を示すものである。
イシン耐性の誘導 β−ラクタム剤の存在の有無によるヘテロVRSAであるMu
3株のバンコマイシン耐性の変化を検討した。バンコマ
イシン0〜4μg/mlの濃度勾配を有するBHIA培
地のグラジエントゲルを作成して検討した。このグラジ
エントゲルの一方にはβ−ラクタム剤を含まず、他方に
はβ−ラクタム剤であるCZXを0.1μg/ml添加
した。
SA H1株及びホモVRSAのMu50を対照として用いた。
TCC6538P)、MRSA H1株ではCZX添加の有無にかかわ
らず、低いMIC値を示し、またMu50株ではCZX添加の
有無にかかわらず、高いMIC値を示した。ところが、Mu3
株ではCZX無添加培地に比べて、CZX添加培地では
より高いMIC値にシフトすることが観察された。これは
β−ラクタム剤の添加によってバンコマイシン耐性が誘
導されたことを示す。
によるバンコマイシン耐性の誘導 β−ラクタム剤によるバンコマイシン耐性の誘導をβ−
ラクタム剤のディスクを用いて試験した。
3株を試験菌として用いた。
A培地に、マクファーランド1.0に合わせたMu3株を
塗抹し、種々のβ−ラクタム剤ディスク(PCG 10
μg/ml、CEZ 10μg/ml、CZX 10μ
g/ml、LMOX 100μg/ml)をのせて、3
7℃で20時間インキュベートした。
ラクタム剤でもディスク周囲に生育円が観察され、β−
ラクタム剤によってバンコマイシン耐性が誘導されるこ
とが確認された。
50株では、平板の全面に菌が生育した。
クの至適誘導濃度を検討した。
3株を試験菌として用いた。
A培地に、マクファーランド1.0に合わせたMu3株を
塗抹し、濃度の異なるβ−ラクタム剤ディスク(CMZ
10μg/ml及び30μg/mlディスク)をのせ
て、37℃で20時間インキュベートした。
lではディスク周囲に均一な生育が観察され、30μg
/mlではディスク周囲に一定の距離をおいてリング状
に生育が観察された。この試験から、ヘテロVRSA検出に
おいては、β−ラクタム剤に至適誘導濃度が存在するこ
とがわかる。
が検出に及ぼす効果を試験した。
pH7.0に調整し、滅菌濾過することによって追加成
分溶液を調製した。
ml含有のHIA培地、並びに同じ培地に上記の追加成
分溶液を添加した培地を調製した(実際には、上記の追
加成分溶液中にHIA培地の成分を加えることによって
調製)。両方の培地全面にヘテロVRSA(Mu3株)を塗抹
した。β−ラクタム剤としてCZX 10μg/ml、
及び30μg/mlを用いて、ヘテロVRSA(Mu3株)の
検出を比較した。
いたときの結果である(左側が追加成分溶液を添加しな
い場合、右側が添加した場合である)。HIA培地のみ
でも検出が可能であるが、追加成分溶液を添加した方が
より明確に検出できることがわかる。
用いたときの結果である(左側が追加成分溶液を添加し
ない場合、右側が添加した場合である)。HIA培地の
みでは検出されず、追加成分溶液を添加すると、非常に
明確に検出できることがわかる。
測定結果 ペニシリン系、セフェム系、その他のβ−ラクタム剤デ
ィスクを用いて、Mu3株及び本発明者が別途分離したヘ
テロVRSAであるJ4-9株の検出を行った。バンコマイシン
4μg/mlを含むBHIA培地(実施例9に記載の追
加成分溶液を含む)で、35℃でインキュベートし、2
4時間後及び48時間後に結果を判定した。
ニーができたことを示し、”in”はディスクとくっつい
てコロニーができたことを示す。また、生育の大きさを
目視で判定し、1+〜3+で評価した。また、星印は2
4時間後には観察されなかったが、48時間後に観察さ
れたことを示す。
ヘテロVRSAの検出が可能であることが判明した。
の方法では検出不可能なヘテロVRSAの検出を行うことが
できる。ヘテロVRSAはホモVRSAの前駆体であると考えら
れ、これを早期に検出することが、適切な治療薬を選択
するうえで重要である。本発明の方法では、β−ラクタ
ム剤ディスク周囲に濃度グラジエントが形成されるた
め、現在までに発見されたヘテロVRSA株の検出のみでな
く、新規に出現するヘテロVRSA株であっても、グラジエ
ント濃度のいずれかの部位で検出できる可能性が高い。
本発明の臨床分野における利用は極めて大きい。
及びバンコマイシン感受性のMRSA H1とFDA209Pのポピュ
レーションカーブを示す。
を用いて種々の菌のMIC値を求めた結果を示す。
を測定し、HIA及びBHIA培地による寒天平板希釈法で測
定したMICと比較した結果を示す。
の各培地を用いてMu3株のポピュレーション分析を行っ
た結果を示す。
を示すポピュレーション解析の結果を示す。
ンコマイシン耐性の変化をグラジエントゲル培地を用い
て試験した結果を示す。
によるバンコマイシン耐性の誘導試験の結果を示す。
タム剤濃度と得られるコロニーの一例を示す。
る、追加成分の添加の効果を示す。
る、追加成分の添加の効果を示す。
Claims (15)
- 【請求項1】バンコマイシンとβ−ラクタム剤との拮抗
反応を利用したヘテロ型バンコマイシン耐性黄色ブドウ
球菌の検出方法。 - 【請求項2】β−ラクタム剤がペニシリン系抗菌剤、セ
フェム系抗菌剤、モノバクタム系抗菌剤、カルバペネム
系抗菌剤及びβ−ラクタマーゼ阻害剤からなる群より選
択される請求項1記載の方法。 - 【請求項3】以下の工程: a)バンコマイシン及びβ−ラクタム剤を含有するグラ
ム陽性菌が生育する液体培地中に試験菌液を入れる、 b)バンコマイシン耐性菌の生育に十分な時間培養す
る、そして d)液体培地中におけるバンコマイシン耐性菌の生育を
観察する、ことからなる、請求項1記載の検出方法。 - 【請求項4】以下の工程: a)バンコマイシン及びβ−ラクタム剤を含有するグラ
ム陽性菌が生育する寒天平板培地上に試験菌液を塗抹す
る、 b)バンコマイシン耐性菌の生育に十分な時間培養す
る、そして d)寒天平板上におけるバンコマイシン耐性菌の生育を
観察する、ことからなる、請求項1記載の検出方法。 - 【請求項5】以下の工程: a)バンコマイシンを含有するグラム陽性菌が生育する
寒天平板培地上に試験菌液を塗抹する、 b)β−ラクタム剤含有ディスクをa)で調製した培地
上に置く、 c)バンコマイシン耐性菌の生育に十分な時間培養す
る、そして d)ディスク周辺におけるバンコマイシン耐性菌の生育
を観察する、ことからなる、請求項1記載の検出方法。 - 【請求項6】グラム陽性菌が生育する培地がHI培地、
HIA培地,BHI培地又はBHIA培地である請求項
3〜5のいずれかに記載の検出方法。 - 【請求項7】培地中のバンコマイシン濃度が3〜6μg
/mlである請求項1〜6のいずれかに記載の検出方
法。 - 【請求項8】培地中のバンコマイシン濃度が4μg/m
lである請求項7記載の検出方法。 - 【請求項9】複数のβ−ラクタム剤を組み合わせて検出
を行う請求項1記載の検出方法。 - 【請求項10】グラム陽性菌が生育する培地中に、バン
コマイシン、及び場合によりβ−ラクタム剤を含むバン
コマイシン耐性黄色ブドウ球菌の検出用培地。 - 【請求項11】グラム陽性菌が生育する培地がHI培
地、HIA培地、BHI培地又はBHIA培地である請
求項10記載の培地。 - 【請求項12】培地中のバンコマイシン濃度が3〜6μ
g/mlである請求項10又は11記載の培地。 - 【請求項13】培地中のバンコマイシン濃度が4μg/
mlである請求項12記載の培地。 - 【請求項14】請求項10記載のバンコマイシン耐性黄
色ブドウ球菌の検出用培地を少なくとも含むバンコマイ
シン耐性黄色ブドウ球菌の検出用キット。 - 【請求項15】1以上の種類のβ−ラクタム剤含有ディ
スクをさらに含む請求項14記載の検出用キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP30881397A JPH11169196A (ja) | 1997-11-11 | 1997-11-11 | バンコマイシン耐性菌の検出方法及び検出用培地 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP30881397A JPH11169196A (ja) | 1997-11-11 | 1997-11-11 | バンコマイシン耐性菌の検出方法及び検出用培地 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11169196A true JPH11169196A (ja) | 1999-06-29 |
Family
ID=17985631
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP30881397A Pending JPH11169196A (ja) | 1997-11-11 | 1997-11-11 | バンコマイシン耐性菌の検出方法及び検出用培地 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH11169196A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100440746B1 (ko) * | 2001-02-07 | 2004-07-23 | (주)비엠에스 | 항생물질 내성균 선별을 위한 유전형 분석키트 |
JP2011530303A (ja) * | 2008-08-13 | 2011-12-22 | ビオメリュー | 黄色ブドウ球菌をコアグラーゼ陰性ブドウ球菌と区別することができる培養培地 |
-
1997
- 1997-11-11 JP JP30881397A patent/JPH11169196A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100440746B1 (ko) * | 2001-02-07 | 2004-07-23 | (주)비엠에스 | 항생물질 내성균 선별을 위한 유전형 분석키트 |
JP2011530303A (ja) * | 2008-08-13 | 2011-12-22 | ビオメリュー | 黄色ブドウ球菌をコアグラーゼ陰性ブドウ球菌と区別することができる培養培地 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5883074A (en) | Potentiators of antibacterial agents | |
Brismar et al. | Piperacillin-tazobactam versus imipenem-cilastatin for treatment of intra-abdominal infections | |
CN107530364A (zh) | 治疗细菌感染的方法 | |
KR20090085122A (ko) | 베타 락타마제의 용도 | |
Mekonen et al. | Successful treatment of persistent bacteremia due to vancomycin-resistant, ampicillin-resistant Enterococcus faecium | |
KR20130064004A (ko) | 기존 세파계 항생제 및 베타 락타마제 저해제로 배합된 내성균주에 기인한 감염증의 치료 및 예방을 위한 복합항생제 | |
Chatterjee et al. | High prevalence of co-expression of newer [beta]-lactamases (ESBLs, Amp-C-[beta]-lactamases, and metallo-[beta]-lactamases) in gram-negative bacilli | |
RU2593363C2 (ru) | Композиции, включающие антибактериальное средство и тазобактам | |
JP3014090B2 (ja) | バンコマイシン耐性菌の検出方法及び検出用培地 | |
JP2003518072A (ja) | 抗生物質耐性微生物の感染の治療および/または予防のための方法および組成物 | |
Sabath et al. | Increasing the usefulness of antibiotics: Treatment of infections caused by gram‐negative bacilli | |
JPH11169196A (ja) | バンコマイシン耐性菌の検出方法及び検出用培地 | |
US20060040871A1 (en) | Bacterial transforming agent | |
US20060073156A1 (en) | Fosfomycin and n-acetylcysteine for the treatment of biofilms caused by escheric ia coli and other pathogens of the urinary tract | |
US20040176349A1 (en) | Antibacterial composition | |
Karunakaran et al. | Eikenella corrodens from a brain abscess | |
Alpert et al. | Imipenem/cilastatin for the treatment of infections in hospitalized children | |
US20200215169A1 (en) | Antibacterial methods and related kits | |
US6369050B1 (en) | Antibacterial agents | |
Oshiro et al. | The antagonistic effects of a combination of vancomycin and minocycline in Staphylococcus aureus with heterogeneous resistance to vancomycin | |
Lal et al. | A comparison of pivmecillinam/pivampicillin and co-trimoxazole in hospitalized patients with acute exacerbations of chronic bronchitis | |
Karyakarte et al. | Incidence and Susceptibility Pattern of Acinetobacter Species among Clinical Isolates in a Tertiary Care Hospital | |
Igarashi et al. | Alternative activity of β-lactam antibiotics against methicillin-and cephem-resistant Staphylococcus aureus in the presence of respiratory tract mucus | |
Almohana et al. | Extended spectrum ß-lactamase (ESBL) mediated resistance to third generation cephalosporins in urinary tract infection isolates of Klebseilla pneumonia | |
JP2019141104A (ja) | 抗菌性合剤の探索方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041028 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060929 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Effective date: 20061226 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Effective date: 20070104 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070529 |