JPH11160302A - ３−デオキシグルコソンの分析方法 - Google Patents
３−デオキシグルコソンの分析方法Info
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- JPH11160302A JPH11160302A JP9328957A JP32895797A JPH11160302A JP H11160302 A JPH11160302 A JP H11160302A JP 9328957 A JP9328957 A JP 9328957A JP 32895797 A JP32895797 A JP 32895797A JP H11160302 A JPH11160302 A JP H11160302A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ３ＤＧを迅速に分析することができる分析方
法を提供する。 【解決手段】 ３ＤＧを、２，３−ブタンジオンととも
に、２，３−ジアミノナフタレンでラベル化し、これを
ＨＰＬＣのサンプルとする。そして、ジフェニル基また
はシアノ基を有する固定相を用い、ＨＰＬＣ分析を行
う。このときの溶離液は、Ａ液（50mMリン酸：アセトニ
トリル：メタノール＝7：1.5：1.5（体積比））、Ｂ液
（50mMリン酸：アセトニトリル：メタノール＝2： 4 ：
4（体積比））を用いる。図１のチャート図に示すよう
に、３ＤＧの溶離時間は、３．２７０分となり、２，３
−ブタンジオン（２，３−ＢＤ）の溶離時間は、６．０
８７分となる。
法を提供する。 【解決手段】 ３ＤＧを、２，３−ブタンジオンととも
に、２，３−ジアミノナフタレンでラベル化し、これを
ＨＰＬＣのサンプルとする。そして、ジフェニル基また
はシアノ基を有する固定相を用い、ＨＰＬＣ分析を行
う。このときの溶離液は、Ａ液（50mMリン酸：アセトニ
トリル：メタノール＝7：1.5：1.5（体積比））、Ｂ液
（50mMリン酸：アセトニトリル：メタノール＝2： 4 ：
4（体積比））を用いる。図１のチャート図に示すよう
に、３ＤＧの溶離時間は、３．２７０分となり、２，３
−ブタンジオン（２，３−ＢＤ）の溶離時間は、６．０
８７分となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、３−デオキシグル
コソン（以下、「３ＤＧ」という。）の検出または定量
に用いられる分析方法に関するものである。
コソン（以下、「３ＤＧ」という。）の検出または定量
に用いられる分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、糖尿病性合併症の研究において、
メイラード反応の関与が示唆されている。このメイラー
ド反応は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸等のア
ミノ基とケトンやアルデヒド、特に還元糖等のカルボニ
ル基とがシッフ塩基を形成し、これが転移反応や脱水反
応等を経て、最終的に重合することにより、褐色物質が
生成される反応である。このメイラード反応に伴い、タ
ンパク質の架橋度や重合度が増し、タンパク質の変性が
生じる。このメイラード反応の生成物および中間代謝産
物が原因となり、例えば、腎症、網膜症、神経症等の糖
尿病性合併症が併発するとされている。
メイラード反応の関与が示唆されている。このメイラー
ド反応は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸等のア
ミノ基とケトンやアルデヒド、特に還元糖等のカルボニ
ル基とがシッフ塩基を形成し、これが転移反応や脱水反
応等を経て、最終的に重合することにより、褐色物質が
生成される反応である。このメイラード反応に伴い、タ
ンパク質の架橋度や重合度が増し、タンパク質の変性が
生じる。このメイラード反応の生成物および中間代謝産
物が原因となり、例えば、腎症、網膜症、神経症等の糖
尿病性合併症が併発するとされている。
【０００３】前記メイラード反応の中間代謝産物の一つ
として、３ＤＧが知られている。この３ＤＧは、グルコ
ースとタンパク質から生成されるジカルボニル化合物で
あり、タンパク質の架橋形成において、そのカルボニル
基がタンパク質のアミノ基と反応することにより、強力
な架橋剤（クロスリンカー）として作用している。この
３ＤＧの性質について、さらに研究が行われたところ、
３ＤＧは、糖尿病状態で増加することが証明され、ま
た、糖尿病性合併症の発症に重要な役割を果たしている
ことが示唆されている。このような点から、３ＤＧは、
糖尿病性合併症のマーカーとして、基礎研究や臨床検査
に有用とされており、現在、血液、尿等の体液や各種臓
器等の生体試料中の３ＤＧ濃度が測定されている。しか
し、この３ＤＧは、非常に不安定であり、また反応性も
高いため、正確な定量分析が困難であった。
として、３ＤＧが知られている。この３ＤＧは、グルコ
ースとタンパク質から生成されるジカルボニル化合物で
あり、タンパク質の架橋形成において、そのカルボニル
基がタンパク質のアミノ基と反応することにより、強力
な架橋剤（クロスリンカー）として作用している。この
３ＤＧの性質について、さらに研究が行われたところ、
３ＤＧは、糖尿病状態で増加することが証明され、ま
た、糖尿病性合併症の発症に重要な役割を果たしている
ことが示唆されている。このような点から、３ＤＧは、
糖尿病性合併症のマーカーとして、基礎研究や臨床検査
に有用とされており、現在、血液、尿等の体液や各種臓
器等の生体試料中の３ＤＧ濃度が測定されている。しか
し、この３ＤＧは、非常に不安定であり、また反応性も
高いため、正確な定量分析が困難であった。
【０００４】この問題に対し、種々の分析方法が提案さ
れている。例えば、特開平７−９８３１７号公報には、
13Ｃもしくは14Ｃでラベル化した３ＤＧ誘導体を内部標
準物質としてガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ／
ＭＳ）により、定量する方法が開示されている。しか
し、この方法は、操作が煩雑であり、さらに、放射線同
位元素を用いる場合、安全性に問題が生じる場合があ
る。
れている。例えば、特開平７−９８３１７号公報には、
13Ｃもしくは14Ｃでラベル化した３ＤＧ誘導体を内部標
準物質としてガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ／
ＭＳ）により、定量する方法が開示されている。しか
し、この方法は、操作が煩雑であり、さらに、放射線同
位元素を用いる場合、安全性に問題が生じる場合があ
る。
【０００５】他方、前記ＧＣ／ＭＳに比べ、操作が容易
であるという理由等から、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）による分析方法も検討されている。
であるという理由等から、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）による分析方法も検討されている。
【０００６】例えば、３ＤＧを２，３−ジアミノナフタ
レンでラベル化して、特定の光波長で吸収を示す安定な
誘導体を調製し、これをＨＰＬＣにより分析する方法
（山田浩幸、神戸大学医学部紀要、第９９頁から第１０
７頁、Ｖｏｌ．５５，Ｎｏ４（１９９５））が提案され
ている。この方法では、３ＤＧと同様に二個の隣接する
カルボニル基を有するヘキサンジオン等を内部標準物質
として用い、３ＤＧとともに、２，３−ジアミノナフタ
レンでラベル化し、得られた両ラベル化物質をＨＰＬＣ
で溶離した後、両者のエリア面積の比率により、３ＤＧ
濃度を定量している。
レンでラベル化して、特定の光波長で吸収を示す安定な
誘導体を調製し、これをＨＰＬＣにより分析する方法
（山田浩幸、神戸大学医学部紀要、第９９頁から第１０
７頁、Ｖｏｌ．５５，Ｎｏ４（１９９５））が提案され
ている。この方法では、３ＤＧと同様に二個の隣接する
カルボニル基を有するヘキサンジオン等を内部標準物質
として用い、３ＤＧとともに、２，３−ジアミノナフタ
レンでラベル化し、得られた両ラベル化物質をＨＰＬＣ
で溶離した後、両者のエリア面積の比率により、３ＤＧ
濃度を定量している。
【０００７】しかし、前記の方法では、ラベル化された
３ＤＧおよび内部標準物質が全て溶出されるのに、約６
０分を要する。したがって、実験的もしくは研究的に３
ＤＧ濃度を測定する場合は問題ないが、臨床検査等のよ
うに多数の検体を分析する場合には、時間がかかりすぎ
るという問題があった。
３ＤＧおよび内部標準物質が全て溶出されるのに、約６
０分を要する。したがって、実験的もしくは研究的に３
ＤＧ濃度を測定する場合は問題ないが、臨床検査等のよ
うに多数の検体を分析する場合には、時間がかかりすぎ
るという問題があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、臨床検査等にも充分対応できるような、短時間で分
析が可能な３ＤＧの分析方法を提供することである。
は、臨床検査等にも充分対応できるような、短時間で分
析が可能な３ＤＧの分析方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明の３ＤＧの分析方法は、３ＤＧをＨＰＬＣに
より分析する方法であって、前記ＨＰＬＣにジフェニル
基およびシアノ基の少なくとも一つの基を有する固定相
を用いることを特徴とする。
に、本発明の３ＤＧの分析方法は、３ＤＧをＨＰＬＣに
より分析する方法であって、前記ＨＰＬＣにジフェニル
基およびシアノ基の少なくとも一つの基を有する固定相
を用いることを特徴とする。
【００１０】本発明者は、３ＤＧの分析を行うにあたっ
て、ＨＰＬＣによる分析を中心として、分析時間の短縮
化を図るために、一連の研究および綿密な検討を行っ
た。その結果、本発明者は、分析時間を大幅に短縮でき
る前記二種類の固定相を突き止めた。前記二種類の固定
相を用いた場合、分析時間を約１０分以内とすることが
可能となり、従来方法と比較して、大幅に分析時間を短
縮することができる。この大幅な分析時間の短縮化によ
って、多数の検体を処理することができ、臨床検査等に
も充分に対応できるようになる。
て、ＨＰＬＣによる分析を中心として、分析時間の短縮
化を図るために、一連の研究および綿密な検討を行っ
た。その結果、本発明者は、分析時間を大幅に短縮でき
る前記二種類の固定相を突き止めた。前記二種類の固定
相を用いた場合、分析時間を約１０分以内とすることが
可能となり、従来方法と比較して、大幅に分析時間を短
縮することができる。この大幅な分析時間の短縮化によ
って、多数の検体を処理することができ、臨床検査等に
も充分に対応できるようになる。
【００１１】本発明の分析方法において、内部標準物質
を用いることが好ましい。ＨＰＬＣを行う際に、前記内
部標準物質を併用することにより、定量分析の分析精度
を向上させることができる。
を用いることが好ましい。ＨＰＬＣを行う際に、前記内
部標準物質を併用することにより、定量分析の分析精度
を向上させることができる。
【００１２】本発明の分析方法において、３ＤＧを、例
えば、２，３−ジアミノナフタレンによりラベルするこ
とが好ましく、また、前記内部標準物質も前記物質でラ
ベルすることが好ましい。ラベル化剤としては、前記物
質の他に、例えば、４，５−ジアミノピリジン、ｏ−フ
ェニレンジアミン、２，３−ジアミノフェノール、９，
１０−ジアミノフェナントレン、４，５−アミノ−６−
ヒドロキシピリミジン、５，６−ジアミノ−２，３−ジ
シアノピラジン、５，６−ジアミノ−２，４−ジヒドロ
キシピリミジン、４，５−ジアミノ−６−ヒドロキシ−
２−メルカプトピリミジン、３，４−ジアミノ安息香
酸、３，４−ジアミノピリジン、４，５−ジアミノ−
２，６−ジメルカプトピリミジン等が使用できる。
えば、２，３−ジアミノナフタレンによりラベルするこ
とが好ましく、また、前記内部標準物質も前記物質でラ
ベルすることが好ましい。ラベル化剤としては、前記物
質の他に、例えば、４，５−ジアミノピリジン、ｏ−フ
ェニレンジアミン、２，３−ジアミノフェノール、９，
１０−ジアミノフェナントレン、４，５−アミノ−６−
ヒドロキシピリミジン、５，６−ジアミノ−２，３−ジ
シアノピラジン、５，６−ジアミノ−２，４−ジヒドロ
キシピリミジン、４，５−ジアミノ−６−ヒドロキシ−
２−メルカプトピリミジン、３，４−ジアミノ安息香
酸、３，４−ジアミノピリジン、４，５−ジアミノ−
２，６−ジメルカプトピリミジン等が使用できる。
【００１３】本発明の分析方法において、前記内部標準
物質として、例えば、２，３−ブタンジオン、ヘキサン
ジオン等を使用でき、２，３−ブタンジオンが好まし
い。
物質として、例えば、２，３−ブタンジオン、ヘキサン
ジオン等を使用でき、２，３−ブタンジオンが好まし
い。
【００１４】本発明の分析方法において、一液の溶離液
で溶離を行うことが好ましい。一液の溶離液で溶離する
ことにより、固定相の平衡化を省略することが可能であ
り、また、グラジェント溶出に用いる溶離液の調製の手
間も省くことができる。すなわち、一液で溶離を行え
ば、一検体に費やす全分析時間をより短くすることがで
き、また、本発明の分析方法を自動分析機に適用する際
に、装置の構造が簡単になり、さらに、自動化の設定等
もより簡単になる。
で溶離を行うことが好ましい。一液の溶離液で溶離する
ことにより、固定相の平衡化を省略することが可能であ
り、また、グラジェント溶出に用いる溶離液の調製の手
間も省くことができる。すなわち、一液で溶離を行え
ば、一検体に費やす全分析時間をより短くすることがで
き、また、本発明の分析方法を自動分析機に適用する際
に、装置の構造が簡単になり、さらに、自動化の設定等
もより簡単になる。
【００１５】
【発明の実施の形態】つぎに、本発明の実施の形態につ
いて説明する。本発明の分析方法は、例えば、３ＤＧを
内部標準物質と伴にラベル化し、これをＨＰＬＣにより
分析することにより実施できる。
いて説明する。本発明の分析方法は、例えば、３ＤＧを
内部標準物質と伴にラベル化し、これをＨＰＬＣにより
分析することにより実施できる。
【００１６】まず、３ＤＧおよび内部標準物質のラベル
化を行う。前記内部標準物質としては、先に述べた物質
が使用できる。また、前記ラベル化に使用するラベル化
剤としては、先に述べた物質が使用できる。ラベル化剤
として、２，３−ジアミノナフタレンを使用する場合、
前記３ＤＧおよび前記内部標準物質が有する二個の隣接
するカルボニル基と、前記２，３−ジアミノナフタレン
が有する二個の隣接するアミノ基とが結合し、前記両物
質から、それぞれベンゾキノキサリン骨格を持つラベル
化された物質が生成される。
化を行う。前記内部標準物質としては、先に述べた物質
が使用できる。また、前記ラベル化に使用するラベル化
剤としては、先に述べた物質が使用できる。ラベル化剤
として、２，３−ジアミノナフタレンを使用する場合、
前記３ＤＧおよび前記内部標準物質が有する二個の隣接
するカルボニル基と、前記２，３−ジアミノナフタレン
が有する二個の隣接するアミノ基とが結合し、前記両物
質から、それぞれベンゾキノキサリン骨格を持つラベル
化された物質が生成される。
【００１７】ラベル化は、３ＤＧ、内部標準物質、ラベ
ル化剤を水性溶媒中で混合して、反応させる事により行
う。前記水性溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＡＤＡ緩衝
液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等が使
用できる。
ル化剤を水性溶媒中で混合して、反応させる事により行
う。前記水性溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＡＤＡ緩衝
液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等が使
用できる。
【００１８】そして、前記ラベル化の反応液に硫酸等を
添加し、反応を停止させる。ついで、反応物を酢酸エチ
ル等の有機溶媒により抽出し、前記有機溶媒を除去し
て、得られた結晶をＨＰＬＣの溶離液により再度溶解し
たものを、ＨＰＬＣのサンプルとする。
添加し、反応を停止させる。ついで、反応物を酢酸エチ
ル等の有機溶媒により抽出し、前記有機溶媒を除去し
て、得られた結晶をＨＰＬＣの溶離液により再度溶解し
たものを、ＨＰＬＣのサンプルとする。
【００１９】つぎに、前記ラベル化３ＤＧおよびラベル
化内部標準物質のＨＰＬＣによる分析を行う。
化内部標準物質のＨＰＬＣによる分析を行う。
【００２０】本発明において、ＨＰＬＣに用いるカラム
には、例えば、前記ジフェニル基および前記シアノ基の
少なくとも一つが結合している充填剤を充填する。この
充填剤は、特に制限されず、市販のものを使用できる。
には、例えば、前記ジフェニル基および前記シアノ基の
少なくとも一つが結合している充填剤を充填する。この
充填剤は、特に制限されず、市販のものを使用できる。
【００２１】前記ＨＰＬＣにおいて、カラムのサイズ等
は、その分析条件に応じ適宜決定されるが、本発明にお
いては、通常、カラムの長さが約１５０ｍｍ、カラムの
内径が約４．６ｍｍである。このサイズのカラムを用い
た場合の前記ＨＰＬＣの各条件は、以下に示すとおりで
ある。。
は、その分析条件に応じ適宜決定されるが、本発明にお
いては、通常、カラムの長さが約１５０ｍｍ、カラムの
内径が約４．６ｍｍである。このサイズのカラムを用い
た場合の前記ＨＰＬＣの各条件は、以下に示すとおりで
ある。。
【００２２】前記ＨＰＬＣにおいて、検出波長は、使用
するラベル化剤に応じて、適宜決定されるが、例えば、
２１５〜３２０ｎｍが好ましい。ラベル化剤として、
２，３−ジアミノナフタレンを使用する場合は、２６８
ｎｍが好ましい。
するラベル化剤に応じて、適宜決定されるが、例えば、
２１５〜３２０ｎｍが好ましい。ラベル化剤として、
２，３−ジアミノナフタレンを使用する場合は、２６８
ｎｍが好ましい。
【００２３】前記ＨＰＬＣにおいて、二液の溶離液で溶
離させる場合、その溶離液および溶離液のグラジェント
の条件は、その分析条件に応じ適宜決定されるが、例え
ば、以下の溶離液組成およびグラジェント条件が好まし
い。 Ａ液 50mMリン酸：アセトニトリル：メタノール＝7：1.5：1.5 （体積比） Ｂ液 50mMリン酸：アセトニトリル：メタノール＝2： 4 ： 4 （体積比）
離させる場合、その溶離液および溶離液のグラジェント
の条件は、その分析条件に応じ適宜決定されるが、例え
ば、以下の溶離液組成およびグラジェント条件が好まし
い。 Ａ液 50mMリン酸：アセトニトリル：メタノール＝7：1.5：1.5 （体積比） Ｂ液 50mMリン酸：アセトニトリル：メタノール＝2： 4 ： 4 （体積比）
【００２４】 グラジェント条件 ： 溶出時間（分） Ａ液（体積％）： Ｂ液（体積％） 0− 8 100 ： 0 8−30 100−0 ： 0−100 30−40 0 ： 100
【００２５】しかし、本発明は、一液の溶離液で溶離す
ることが可能であり、この場合、溶離液は、例えば、前
記Ａ液が使用できる。
ることが可能であり、この場合、溶離液は、例えば、前
記Ａ液が使用できる。
【００２６】前記ＨＰＬＣにおいて、溶離液の流速は、
その分析条件に応じ適宜決定されるが、好ましくは約１
ｍｌ／分である。
その分析条件に応じ適宜決定されるが、好ましくは約１
ｍｌ／分である。
【００２７】このＨＰＬＣにより、３ＤＧを検出するこ
とができる。また、予め、検量線を作成しておけば、前
記ＨＰＬＣ分析により得られたラベル化３ＤＧおよびラ
ベル化内部標準物質の両エリア面積の面積比から、３Ｄ
Ｇ濃度を求めることができる。
とができる。また、予め、検量線を作成しておけば、前
記ＨＰＬＣ分析により得られたラベル化３ＤＧおよびラ
ベル化内部標準物質の両エリア面積の面積比から、３Ｄ
Ｇ濃度を求めることができる。
【００２８】なお、以上説明した例は、３ＤＧのみを検
体とした例であるが、例えば、血液、尿等の夾雑物を含
む検体についても、本発明を適用できる。この場合は、
血液等について前記と同様にしてラベル化を行い、続い
て、前記と同様にしてＨＰＬＣにより測定する。
体とした例であるが、例えば、血液、尿等の夾雑物を含
む検体についても、本発明を適用できる。この場合は、
血液等について前記と同様にしてラベル化を行い、続い
て、前記と同様にしてＨＰＬＣにより測定する。
【００２９】
【実施例】つぎに、本発明の実施例について比較例と併
せて説明する。
せて説明する。
【００３０】（実施例１） （１）３ＤＧの合成 ３ＤＧの合成は、先に述べた特開平７−９８３１７号公
報の実施例１の記載に準じて行った。すなわち、グルコ
ース（２．０ｇ，１０．７ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）と
ｐ−トルイジン（１．１ｇ，１０．３ｍｍｏｌ，０．９
２ｅｑ．）とを、９５重量％エタノール４５ｍｌと酢酸
２．２ｍｌの混合液に懸濁し、この懸濁液を、３０分間
加熱還流撹拌した。この反応溶液は、５分後に均一溶液
となり、３０分後には茶色に変色した。前記反応溶液に
ベンゾイルヒドラジン（３．３ｇ，２４．４ｍｍｏｌ，
２．１８ｅｑ．）を添加して、７時間、加熱還流撹拌を
行った後、前記反応溶液を室温で一晩放置すると、結晶
が析出した。この結晶をろ紙（孔径１μｍ）で濾取し、
前記結晶を、すばやく冷メタノール２０ｍｌで三回洗浄
し、続いて冷ジエチルエーテル２０ｍｌで三回洗浄し
た。前記洗浄液を回収し、これを室温で風乾させ、３Ｄ
Ｇ−ビス−ベンゾイルヒドラゾンの粗結晶（１．６０
ｇ，回収率３６．８％）を得た。この粗結晶を９５重量
％エタノール１００ｍｌに溶解し、再結晶を行った結
果、白色針結晶（１．２５ｇ，回収率２８．７％）が得
られた。
報の実施例１の記載に準じて行った。すなわち、グルコ
ース（２．０ｇ，１０．７ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）と
ｐ−トルイジン（１．１ｇ，１０．３ｍｍｏｌ，０．９
２ｅｑ．）とを、９５重量％エタノール４５ｍｌと酢酸
２．２ｍｌの混合液に懸濁し、この懸濁液を、３０分間
加熱還流撹拌した。この反応溶液は、５分後に均一溶液
となり、３０分後には茶色に変色した。前記反応溶液に
ベンゾイルヒドラジン（３．３ｇ，２４．４ｍｍｏｌ，
２．１８ｅｑ．）を添加して、７時間、加熱還流撹拌を
行った後、前記反応溶液を室温で一晩放置すると、結晶
が析出した。この結晶をろ紙（孔径１μｍ）で濾取し、
前記結晶を、すばやく冷メタノール２０ｍｌで三回洗浄
し、続いて冷ジエチルエーテル２０ｍｌで三回洗浄し
た。前記洗浄液を回収し、これを室温で風乾させ、３Ｄ
Ｇ−ビス−ベンゾイルヒドラゾンの粗結晶（１．６０
ｇ，回収率３６．８％）を得た。この粗結晶を９５重量
％エタノール１００ｍｌに溶解し、再結晶を行った結
果、白色針結晶（１．２５ｇ，回収率２８．７％）が得
られた。
【００３１】エタノール６０ｍｌ、水１００ｍｌ、酢酸
２．４ｍｌの混合溶液に前記３ＤＧ−ビス−ベンゾイル
ヒドラゾン２．０ｇ（４．８０ｍｍｏｌ）を懸濁し、こ
の懸濁液を室温撹拌しながら、ベンズアルデヒド３．２
ｍｌ（３２．０４ｍｍｏｌ）の滴下を行った。滴下後、
温度を上げて、６時間、加熱還流撹拌を行い、続いて、
温度を徐々に室温に戻し、３時間放置した。この溶液
を、６０ｍｌまで濃縮してエタノールを除去し、この濃
縮液に水１００ｍｌを添加した。そして、この溶液を室
温で一晩放置し、沈殿したベンズアルデヒド−ベンゾイ
ルヒドラゾンを濾別して、得られた濾液を４０ｍｌまで
濃縮した。この濃縮液をエーテル２０ｍｌで五回抽出し
て、得られた水層をシロップ状になるまで濃縮し、これ
を粗３ＤＧとした。
２．４ｍｌの混合溶液に前記３ＤＧ−ビス−ベンゾイル
ヒドラゾン２．０ｇ（４．８０ｍｍｏｌ）を懸濁し、こ
の懸濁液を室温撹拌しながら、ベンズアルデヒド３．２
ｍｌ（３２．０４ｍｍｏｌ）の滴下を行った。滴下後、
温度を上げて、６時間、加熱還流撹拌を行い、続いて、
温度を徐々に室温に戻し、３時間放置した。この溶液
を、６０ｍｌまで濃縮してエタノールを除去し、この濃
縮液に水１００ｍｌを添加した。そして、この溶液を室
温で一晩放置し、沈殿したベンズアルデヒド−ベンゾイ
ルヒドラゾンを濾別して、得られた濾液を４０ｍｌまで
濃縮した。この濃縮液をエーテル２０ｍｌで五回抽出し
て、得られた水層をシロップ状になるまで濃縮し、これ
を粗３ＤＧとした。
【００３２】（２）３ＤＧの精製 前記粗３ＤＧをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに
より精製した。前記シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ーの各条件を下記に示す。
より精製した。前記シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ーの各条件を下記に示す。
【００３３】（シリカゲルカラム）商品名 Ｗａｋｏ
ｇｅｌ Ｃ−２００（３ｃｍ×２３ｃｍ、和光純薬社
製）
ｇｅｌ Ｃ−２００（３ｃｍ×２３ｃｍ、和光純薬社
製）
【００３４】 （溶離液） Ａ液 クロロホルム：メタノール：水＝７：２：０．２（体積比） Ｂ液 クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．２（体積比）
【００３５】（溶離条件）前記溶離液Ａ８００ｍｌによ
り溶離を行い、続いて、前記溶離液Ｂ１００ｍｌにより
溶離を行った。
り溶離を行い、続いて、前記溶離液Ｂ１００ｍｌにより
溶離を行った。
【００３６】 流速 ： １０ｍｌ／分 分取条件 ： ５０ｍｌ／１Ｆｒａｃｔｉｏｎ
【００３７】前記シリカゲルカラムクロマトグラフィー
により分取されたＦｒａｃｔｉｏｎＮｏ．１〜１８のサ
ンプルを、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供し、
目的の３ＤＧを検出した。前記ＴＬＣの各条件を下記に
示す。
により分取されたＦｒａｃｔｉｏｎＮｏ．１〜１８のサ
ンプルを、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供し、
目的の３ＤＧを検出した。前記ＴＬＣの各条件を下記に
示す。
【００３８】（薄層） 商品名 ＭＥＲＣＫ ＨＰＴＬＣ Ｓｌｉｃａ Ｇｅｌ
６０（メルク社製） （展開溶媒） クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．３（体積
比） （検出試薬） ２Ｍ ＨＣｌの２，４−ジニトロフェニルヒドラジン飽
和溶液
６０（メルク社製） （展開溶媒） クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．３（体積
比） （検出試薬） ２Ｍ ＨＣｌの２，４−ジニトロフェニルヒドラジン飽
和溶液
【００３９】その結果、単一のスポットが確認されたＦ
ｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．８〜１５の分取溶液を回収し
て、溶出溶媒を除去した後、これを２０ｍｌの蒸留水に
溶解し、凍結乾燥を行った。そして、最終的に０．３４
ｇの精製３ＤＧを得た。なお、この精製３ＤＧについ
て、後述の方法によりラベル化した後、ＮＭＲ分析を行
い、これが３ＤＧであることを確認した。
ｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．８〜１５の分取溶液を回収し
て、溶出溶媒を除去した後、これを２０ｍｌの蒸留水に
溶解し、凍結乾燥を行った。そして、最終的に０．３４
ｇの精製３ＤＧを得た。なお、この精製３ＤＧについ
て、後述の方法によりラベル化した後、ＮＭＲ分析を行
い、これが３ＤＧであることを確認した。
【００４０】（３）サンプルの調製 前記３ＤＧを、濃度が０．５ｍｇ／ｌ、１．０ｍｇ／ｌ
となるように、１０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶
解した。そして、これらの各３ＤＧ溶液１ｍｌに、０．
００５％（ｗ／ｖ）２，３−ブタンジオン（東京化成社
製）溶液５０μｌを添加した。続いて、これらの溶液
に、０．１％（ｗ／ｖ）２，３−ジアミノナフタレン
（同人化学社製）溶液を１００μｌ添加し、室温で一晩
撹拌して、ラベル化を行った。この反応液に対し、酢酸
エチル０．５ｍｌで、ラベル化物質の抽出を行った。こ
の抽出操作は、二回行った。そして、前記抽出液を遠心
エバポレーターに供して、前記酢酸エチルを減圧除去
し、得られた結晶を前記溶離液Ａ１００μｌで再溶解し
て、これをＨＰＬＣのサンプルとした。
となるように、１０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶
解した。そして、これらの各３ＤＧ溶液１ｍｌに、０．
００５％（ｗ／ｖ）２，３−ブタンジオン（東京化成社
製）溶液５０μｌを添加した。続いて、これらの溶液
に、０．１％（ｗ／ｖ）２，３−ジアミノナフタレン
（同人化学社製）溶液を１００μｌ添加し、室温で一晩
撹拌して、ラベル化を行った。この反応液に対し、酢酸
エチル０．５ｍｌで、ラベル化物質の抽出を行った。こ
の抽出操作は、二回行った。そして、前記抽出液を遠心
エバポレーターに供して、前記酢酸エチルを減圧除去
し、得られた結晶を前記溶離液Ａ１００μｌで再溶解し
て、これをＨＰＬＣのサンプルとした。
【００４１】（４）ＨＰＬＣによる分析 前記サンプルについて、ＨＰＬＣによる分析を行った。
その条件は、下記に示すとおりである。
その条件は、下記に示すとおりである。
【００４２】 （ＨＰＬＣ） ポンプ ： 商品名 Ｗａｔｅｒｓ６００Ｅ（ウォーターズ社製） オーブン ： 商品名 オーブンＣＴＯ−６Ａ（島津製作所社製） 検出器 ： 商品名 Ｗａｔｅｒｓ ９９６ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｓ Ａ ｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ウォーターズ社製） 温度 ： ３５℃ 検出波長 ： ２６８ｎｍ 試料注入量 ： １０μｌ カラム ： 商品名 ＵＬＴＲＯＮ３００−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ（１５０× ４．６ｍｍＩ．Ｄ．，信和化工社製） 修飾基：ジフェニル基
【００４３】 （溶離液） Ａ液 50mMリン酸：アセトニトリル：メタノール＝7：1.5：1.5 （体積比） Ｂ液 50mMリン酸：アセトニトリル：メタノール＝2： 4 ： 4 （体積比） 流速 ： １．０ｍｌ／分
【００４４】 グラジェント条件 ： 溶出時間（分） Ａ液（体積％）： Ｂ液（体積％） 0− 8 100 ： 0 8−30 100−0 ： 0−100 30−40 0 ： 100
【００４５】前記３ＤＧ濃度が１．０ｍｇ／ｌであるサ
ンプルのＨＰＬＣの結果を、図１のチャート図に示す。
図１は、波長２６８ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ．）と
溶離時間（分）との関係を示すチャート図である。ま
た、同図において、「Ｌ」はラベル化剤である２，３−
ジアミノナフタレン、「３ＤＧ」はラベル化された３Ｄ
Ｇ、「２，３−ＢＤ」はラベル化された２，３−ブタン
ジオンの吸光度のピークをそれぞれ示す。他のチャート
図も同様である。
ンプルのＨＰＬＣの結果を、図１のチャート図に示す。
図１は、波長２６８ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ．）と
溶離時間（分）との関係を示すチャート図である。ま
た、同図において、「Ｌ」はラベル化剤である２，３−
ジアミノナフタレン、「３ＤＧ」はラベル化された３Ｄ
Ｇ、「２，３−ＢＤ」はラベル化された２，３−ブタン
ジオンの吸光度のピークをそれぞれ示す。他のチャート
図も同様である。
【００４６】図１に示すように、ラベル化３ＤＧおよび
ラベル化２，３−ブタンジオンの溶離時間はそれぞれ、
３．２７０分、６．０８７分であった。この結果から、
３ＤＧおよび内部標準物質が、従来方法（約６０分）よ
りも格段に早く溶離されたことがわかる。
ラベル化２，３−ブタンジオンの溶離時間はそれぞれ、
３．２７０分、６．０８７分であった。この結果から、
３ＤＧおよび内部標準物質が、従来方法（約６０分）よ
りも格段に早く溶離されたことがわかる。
【００４７】（実施例２）カラムとして、修飾基がシア
ノ基である商品名ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ（１５０×
４．６ｍｍＩ．Ｄ．，ＹＭＣ社製）を用いた他は、実施
例１と同じ操作および同じ条件で、ＨＰＬＣ分析を行っ
た。３ＤＧ濃度が１．０ｍｇ／ｌであるサンプルのＨＰ
ＬＣの結果を、図２のチャート図に示す。
ノ基である商品名ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ（１５０×
４．６ｍｍＩ．Ｄ．，ＹＭＣ社製）を用いた他は、実施
例１と同じ操作および同じ条件で、ＨＰＬＣ分析を行っ
た。３ＤＧ濃度が１．０ｍｇ／ｌであるサンプルのＨＰ
ＬＣの結果を、図２のチャート図に示す。
【００４８】図２に示すように、ラベル化３ＤＧおよび
ラベル化２，３−ブタンジオンの溶離時間はそれぞれ、
４．６７７分、８．８７７分であった。この結果から、
３ＤＧおよび内部標準物質が、従来方法よりも格段に早
く溶離されたことがわかる。
ラベル化２，３−ブタンジオンの溶離時間はそれぞれ、
４．６７７分、８．８７７分であった。この結果から、
３ＤＧおよび内部標準物質が、従来方法よりも格段に早
く溶離されたことがわかる。
【００４９】（比較例１）カラムとして、修飾基がトリ
メチルシリル基である商品名ＹＭＣ−ＰａｃｋＴＭＳ
（１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．，ＹＭＣ社製）を用いた
他は、実施例１と同じ操作および同じ条件で、ＨＰＬＣ
分析を行った。３ＤＧ濃度が１．０ｍｇ／ｌであるサン
プルのＨＰＬＣの結果を、図３のチャート図に示す
メチルシリル基である商品名ＹＭＣ−ＰａｃｋＴＭＳ
（１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．，ＹＭＣ社製）を用いた
他は、実施例１と同じ操作および同じ条件で、ＨＰＬＣ
分析を行った。３ＤＧ濃度が１．０ｍｇ／ｌであるサン
プルのＨＰＬＣの結果を、図３のチャート図に示す
【００５０】図３に示すように、ラベル化３ＤＧおよび
ラベル化２，３−ブタンジオンの溶離時間はそれぞれ、
７．９１５分、１９．３３２分であった。従来の溶離時
間６０分に比べると短縮化されたが、実施例１および２
と比較すると、その短縮化は充分ではない。
ラベル化２，３−ブタンジオンの溶離時間はそれぞれ、
７．９１５分、１９．３３２分であった。従来の溶離時
間６０分に比べると短縮化されたが、実施例１および２
と比較すると、その短縮化は充分ではない。
【００５１】（比較例２）カラムとして、修飾基がフェ
ニル基である商品名ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｈ（１５０×
４．６ｍｍＩ．Ｄ．，ＹＭＣ社製）を用いた他は、実施
例１と同じ条件で、ＨＰＬＣ分析を行った。３ＤＧ濃度
が１．０ｍｇ／ｌであるサンプルのＨＰＬＣの結果を、
図４のチャート図に示す。
ニル基である商品名ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｈ（１５０×
４．６ｍｍＩ．Ｄ．，ＹＭＣ社製）を用いた他は、実施
例１と同じ条件で、ＨＰＬＣ分析を行った。３ＤＧ濃度
が１．０ｍｇ／ｌであるサンプルのＨＰＬＣの結果を、
図４のチャート図に示す。
【００５２】図４に示すように、ラベル化３ＤＧおよび
ラベル化２，３−ブタンジオンの溶離時間はそれぞれ、
９．３８８分、２０．５３８分であった。従来の溶離時
間６０分に比べると短縮化されたが、実施例１および２
と比較するとその短縮化は充分ではない。
ラベル化２，３−ブタンジオンの溶離時間はそれぞれ、
９．３８８分、２０．５３８分であった。従来の溶離時
間６０分に比べると短縮化されたが、実施例１および２
と比較するとその短縮化は充分ではない。
【００５３】（比較例３）カラムとして、修飾基がアル
キル基（Ｃ４）である商品名ＹＭＣ−ＰａｃｋＣ４（１
５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．，ＹＭＣ社製）を用いた他
は、実施例１と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行った。３Ｄ
Ｇ濃度が１．０ｍｇ／ｌであるサンプルのＨＰＬＣの結
果を、図５のチャート図に示す。
キル基（Ｃ４）である商品名ＹＭＣ−ＰａｃｋＣ４（１
５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．，ＹＭＣ社製）を用いた他
は、実施例１と同じ条件でＨＰＬＣ分析を行った。３Ｄ
Ｇ濃度が１．０ｍｇ／ｌであるサンプルのＨＰＬＣの結
果を、図５のチャート図に示す。
【００５４】図５に示すように、ラベル化３ＤＧおよび
ラベル化２，３−ブタンジオンの溶離時間はそれぞれ、
９．１５３分、２１．０５３分であった。従来の溶離時
間６０分に比べると短縮化されたが、実施例１および２
と比較すると、その短縮化は充分ではない。
ラベル化２，３−ブタンジオンの溶離時間はそれぞれ、
９．１５３分、２１．０５３分であった。従来の溶離時
間６０分に比べると短縮化されたが、実施例１および２
と比較すると、その短縮化は充分ではない。
【００５５】（比較例４）カラムとして、修飾基がアル
キル基（Ｃ１８）である商品名Ｊ，ｓｐｈｅｒｅＯＤＳ
−Ｈ８０（１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．，ＹＭＣ社製）
を用いた他は、実施例１と同じ条件で、ＨＰＬＣ分析を
行った。３ＤＧ濃度が０．５ｍｇ／ｌであるサンプルの
ＨＰＬＣの結果を、図６のチャート図に示す。
キル基（Ｃ１８）である商品名Ｊ，ｓｐｈｅｒｅＯＤＳ
−Ｈ８０（１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．，ＹＭＣ社製）
を用いた他は、実施例１と同じ条件で、ＨＰＬＣ分析を
行った。３ＤＧ濃度が０．５ｍｇ／ｌであるサンプルの
ＨＰＬＣの結果を、図６のチャート図に示す。
【００５６】図６に示すように、ラベル化３ＤＧおよび
ラベル化２，３−ブタンジオンの溶離時間はそれぞれ、
１３．８７７分、２６．９４３分であった。従来の溶離
時間６０分に比べると短縮化されたが、実施例１および
２と比較すると、その短縮化は充分ではない。
ラベル化２，３−ブタンジオンの溶離時間はそれぞれ、
１３．８７７分、２６．９４３分であった。従来の溶離
時間６０分に比べると短縮化されたが、実施例１および
２と比較すると、その短縮化は充分ではない。
【００５７】以上の比較例は、実施例のジフェニル基ま
たはシアノ基と同程度の疎水性、または類似の構造の修
飾基を有する固定相を用いた例である。疎水性強度の順
に固定相を上から並べると下記のようになる。
たはシアノ基と同程度の疎水性、または類似の構造の修
飾基を有する固定相を用いた例である。疎水性強度の順
に固定相を上から並べると下記のようになる。
【００５８】（疎水性強度） （１） Ｊ，ｓｐｈｅｒｅＯＤＳ−Ｈ８０ （比較例
４） （２） ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ４ （比較例３） （３） ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＴＭＳ （比較例１） （４） ＵＬＴＲＯＮ３００−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ （実
施例１） （５） ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｈ （比較例２） （６） ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ （実施例２）
４） （２） ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ４ （比較例３） （３） ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＴＭＳ （比較例１） （４） ＵＬＴＲＯＮ３００−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ （実
施例１） （５） ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｈ （比較例２） （６） ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ （実施例２）
【００５９】このように、疎水性の強度と、３ＤＧおよ
び内部標準物質の流出速度との間に相関を認めることは
できない。すなわち、糖または糖誘導体のＨＰＬＣ分析
において、固定相を選択する際に、通常はその疎水性程
度を指標とするが、３ＤＧのＨＰＬＣ分析において、そ
の溶離時間の短縮化を図る場合、疎水性は、指標となり
得ないといえる。また、本発明で用いる固定相の一つと
して、ジフェニル基を有する固定相があるが、これと類
似するフェニル基を有する固定相を用いても（比較例
２）、本発明のような溶離時間の大幅な短縮は認められ
なかった。さらに、本発明にかかるジフェニル基とシア
ノ基との間に構造上の共通性を認めることも困難であ
る。したがって、３ＤＧのＨＰＬＣ分析において、その
溶離時間の短縮化を図る場合、固定相の修飾基の構造の
類似性も指標とすることは困難であるといえる。
び内部標準物質の流出速度との間に相関を認めることは
できない。すなわち、糖または糖誘導体のＨＰＬＣ分析
において、固定相を選択する際に、通常はその疎水性程
度を指標とするが、３ＤＧのＨＰＬＣ分析において、そ
の溶離時間の短縮化を図る場合、疎水性は、指標となり
得ないといえる。また、本発明で用いる固定相の一つと
して、ジフェニル基を有する固定相があるが、これと類
似するフェニル基を有する固定相を用いても（比較例
２）、本発明のような溶離時間の大幅な短縮は認められ
なかった。さらに、本発明にかかるジフェニル基とシア
ノ基との間に構造上の共通性を認めることも困難であ
る。したがって、３ＤＧのＨＰＬＣ分析において、その
溶離時間の短縮化を図る場合、固定相の修飾基の構造の
類似性も指標とすることは困難であるといえる。
【００６０】（実施例３） （１） サンプルの調製 実施例と同じ３ＤＧを、各濃度が０．１ｍｇ／ｌ、０．
２ｍｇ／ｌ、０．３ｍｇ／ｌ、０．５ｍｇ／ｌ、１．０
ｍｇ／ｌになるように、１０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）に溶解した。以後、各前記濃度において、実施例１
と同様して、ＨＰＬＣのサンプルを調製し，これらの各
前記濃度のサンプルを３回ずつＨＰＬＣに供した。
２ｍｇ／ｌ、０．３ｍｇ／ｌ、０．５ｍｇ／ｌ、１．０
ｍｇ／ｌになるように、１０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）に溶解した。以後、各前記濃度において、実施例１
と同様して、ＨＰＬＣのサンプルを調製し，これらの各
前記濃度のサンプルを３回ずつＨＰＬＣに供した。
【００６１】（２） ＨＰＬＣ条件 カラムとして、商品名ＵＬＴＲＯＮ ３００−Ｄｉｐｈ
ｅｎｙｌを用い、溶離は、実施例１に示すＡ液のみを用
いた。その他の条件は、全て実施例１と同様にして、Ｈ
ＰＬＣ分析を行った。その結果を、下記の表１および図
７に示す。前記表１は、各前記濃度（測定回数：３回）
におけるＨＰＬＣにより得られた、ラベル化３ＤＧおよ
びラベル化２，３ーブタンジオン（２，３−ＢＤ）の両
エリア面積値および前記両エリア面積比を示す。また、
図７は、３ＤＧ濃度と、前記エリア面積比との相関関係
を示すグラフである。また、同図中の式は、前記相関関
係を表す相関式であり、ｒ２は相関係数を示す。下記表
２および図８も同様である。
ｅｎｙｌを用い、溶離は、実施例１に示すＡ液のみを用
いた。その他の条件は、全て実施例１と同様にして、Ｈ
ＰＬＣ分析を行った。その結果を、下記の表１および図
７に示す。前記表１は、各前記濃度（測定回数：３回）
におけるＨＰＬＣにより得られた、ラベル化３ＤＧおよ
びラベル化２，３ーブタンジオン（２，３−ＢＤ）の両
エリア面積値および前記両エリア面積比を示す。また、
図７は、３ＤＧ濃度と、前記エリア面積比との相関関係
を示すグラフである。また、同図中の式は、前記相関関
係を表す相関式であり、ｒ２は相関係数を示す。下記表
２および図８も同様である。
【００６２】 （表１） ３ＤＧ濃度 ３ＤＧ ２，３−ＢＤ ３ＤＧ／２，３−ＢＤ エリア面積 エリア面積 のエリア面積比 （0mg／ｌ） １回目 0 4385256 0 ２回目 0 3855295 0 ３回目 0 4251662 0 （0.1mg／ｌ） １回目 66442 4026788 0.0165 ２回目 63684 4056738 0.0157 ３回目 52184 4109474 0.0127 （0.2mg／ｌ） １回目 236791 4101577 0.0577 ２回目 228292 4263277 0.0536 ３回目 183926 4030477 0.0456 （0.3mg／ｌ） １回目 410239 4229379 0.0970 ２回目 376434 3518453 0.1070 ３回目 304978 3173492 0.0961 （0.5mg／ｌ） １回目 707327 3084231 0.2293 ２回目 656687 3216962 0.2041 ３回目 549222 3378131 0.1626 （1.0mg／ｌ） １回目 1312835 3355770 0.3912 ２回目 1149027 3474600 0.3307 ３回目 996598 3790056 0.2630
【００６３】前記表１および図７の結果から、３ＤＧ濃
度と前記両エリア面積比との間には、高い相関関係が認
められる（ｒ２＝０．９４）。したがって、この図の直
線は、検量線になりうる。また、各濃度における３回の
測定において、測定値のばらつきが少なく、測定結果の
再現性が高かった。
度と前記両エリア面積比との間には、高い相関関係が認
められる（ｒ２＝０．９４）。したがって、この図の直
線は、検量線になりうる。また、各濃度における３回の
測定において、測定値のばらつきが少なく、測定結果の
再現性が高かった。
【００６４】（実施例４）カラムとして商品名ＹＭＣ−
Ｐａｃｋ ＣＮを用い、ＨＰＬＣのサンプルは実施例３
で調製したものを用い、その他は、実施例３と同様の操
作を行った。この結果を下記表２および図８に示す。
Ｐａｃｋ ＣＮを用い、ＨＰＬＣのサンプルは実施例３
で調製したものを用い、その他は、実施例３と同様の操
作を行った。この結果を下記表２および図８に示す。
【００６５】 （表２） ３ＤＧ濃度 ３ＤＧ ２，３−ＢＤ ３ＤＧ／２，３−ＢＤ エリア面積 エリア面積 のエリア面積比 （0mg／ｌ） １回目 0 4456774 0 ２回目 0 3984155 0 ３回目 0 4577287 0 （0.1mg／ｌ） １回目 164219 4272917 0.0384 ２回目 184469 4132784 0.0446 ３回目 113756 4257298 0.0267 （0.2mg／ｌ） １回目 320367 4191982 0.0764 ２回目 306601 4422616 0.0693 ３回目 286723 4109272 0.0698 （0.3mg／ｌ） １回目 486523 4212203 0.1155 ２回目 482069 3636962 0.1325 ３回目 434885 3329062 0.1306 （0.5mg／ｌ） １回目 865724 3156399 0.2743 ２回目 805869 3262945 0.2470 ３回目 761364 3576251 0.2129 （1.0mg／ｌ） １回目 1483243 3461650 0.4285 ２回目 1398294 3581523 0.3904 ３回目 1364151 4075638 0.3347
【００６６】前記表２および図８の結果から、３ＤＧ濃
度と前記両エリア面積比との間には、高い相関関係が認
められる（ｒ２＝０．９５８）。したがって、この図の
直線は、検量線となりうる。また、各濃度における３回
の測定において、測定値のばらつきが少なく、測定結果
の再現性が高かった。
度と前記両エリア面積比との間には、高い相関関係が認
められる（ｒ２＝０．９５８）。したがって、この図の
直線は、検量線となりうる。また、各濃度における３回
の測定において、測定値のばらつきが少なく、測定結果
の再現性が高かった。
【００６７】前記実施例４および５の結果より、本発明
の分析方法は、３ＤＧを精度良く、定量的に分析するこ
とができるといえる。
の分析方法は、３ＤＧを精度良く、定量的に分析するこ
とができるといえる。
【００６８】
【発明の効果】以上のように、本発明の分析方法は、Ｈ
ＰＬＣにおいてジフェニル基およびシアノ基の少なくと
も一つの基を有する固定相を用いることによって、３Ｄ
Ｇを１０分以内の短時間で分析することを可能とする。
また、本発明では、一液の溶離液で溶離を行うこともで
きるため、この場合は、一回の分析時間をより短縮化す
ることができる。さらに、本発明の分析方法によれば、
より簡単な分析系の提供や分析の自動化も可能である。
すなわち、本発明は、３ＤＧの分析において、多数のサ
ンプルを効率的に処理することを可能にし、これによ
り、糖尿病および糖尿病性合併症の臨床レベルでの検査
等において、３ＤＧを指標として有用に活用することを
実現させるものである。
ＰＬＣにおいてジフェニル基およびシアノ基の少なくと
も一つの基を有する固定相を用いることによって、３Ｄ
Ｇを１０分以内の短時間で分析することを可能とする。
また、本発明では、一液の溶離液で溶離を行うこともで
きるため、この場合は、一回の分析時間をより短縮化す
ることができる。さらに、本発明の分析方法によれば、
より簡単な分析系の提供や分析の自動化も可能である。
すなわち、本発明は、３ＤＧの分析において、多数のサ
ンプルを効率的に処理することを可能にし、これによ
り、糖尿病および糖尿病性合併症の臨床レベルでの検査
等において、３ＤＧを指標として有用に活用することを
実現させるものである。
【図１】本発明の一実施例におけるＨＰＬＣの結果を示
すチャート図である。
すチャート図である。
【図２】本発明のその他の実施例におけるＨＰＬＣの結
果を示すチャート図である。
果を示すチャート図である。
【図３】比較例におけるＨＰＬＣの結果を示すチャート
図である。
図である。
【図４】その他の比較例におけるＨＰＬＣの結果を示す
チャート図である。
チャート図である。
【図５】さらにその他の比較例におけるＨＰＬＣの結果
を示すチャート図である。
を示すチャート図である。
【図６】さらにその他の比較例におけるＨＰＬＣの結果
を示すチャート図である。
を示すチャート図である。
【図７】本発明のさらにその他の実施例における３ＤＧ
濃度と３ＤＧおよび内部標準物質のエリア面積比との相
関関係を表したグラフである。
濃度と３ＤＧおよび内部標準物質のエリア面積比との相
関関係を表したグラフである。
【図８】本発明のさらにその他の実施例における３ＤＧ
濃度と３ＤＧおよび内部標準物質のエリア面積比との相
関関係を表したグラフである。
濃度と３ＤＧおよび内部標準物質のエリア面積比との相
関関係を表したグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ
Claims (1)
- 【請求項１】 ３−デオキシグルコソンを高速液体クロ
マトグラフィーにより分析する方法であって、前記高速
液体クロマトグラフィーにジフェニル基およびシアノ基
の少なくとも一つの基を有する固定相を用いる分析方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9328957A JPH11160302A (ja) | 1997-11-28 | 1997-11-28 | ３−デオキシグルコソンの分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9328957A JPH11160302A (ja) | 1997-11-28 | 1997-11-28 | ３−デオキシグルコソンの分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11160302A true JPH11160302A (ja) | 1999-06-18 |
Family
ID=18216010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9328957A Pending JPH11160302A (ja) | 1997-11-28 | 1997-11-28 | ３−デオキシグルコソンの分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11160302A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7037742B2 (en) | 2001-07-23 | 2006-05-02 | Cree, Inc. | Methods of fabricating light emitting devices using mesa regions and passivation layers |
| JP2009121850A (ja) * | 2007-11-12 | 2009-06-04 | Nippon Torimu:Kk | 糖分解代謝物の測定方法 |
-
1997
- 1997-11-28 JP JP9328957A patent/JPH11160302A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7037742B2 (en) | 2001-07-23 | 2006-05-02 | Cree, Inc. | Methods of fabricating light emitting devices using mesa regions and passivation layers |
| JP2009121850A (ja) * | 2007-11-12 | 2009-06-04 | Nippon Torimu:Kk | 糖分解代謝物の測定方法 |
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