JPH11158200A

JPH11158200A - ヒト成長ホルモン・亜鉛複合体及びその用途

Info

Publication number: JPH11158200A
Application number: JP10269389A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Yamagata; 豊山縣; Masafumi Omae; 雅文御前; Susumu Iwasa; 進岩佐
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-09-26
Filing date: 1998-09-24
Publication date: 1999-06-15

Abstract

(57)【要約】【課題】封入率を高め、初期放出の抑制されたヒト成長
ホルモン含有徐放性製剤の提供。【解決手段】ヒト成長ホルモンと亜鉛とを約１：１.６
から約１：２.４のモル比で含有するヒト成長ホルモン
・亜鉛複合体及び生体内分解性ポリマーを含有してなる
徐放性製剤。【効果】本発明によれば、製剤操作が容易で、ヒト成長
ホルモンの封入率を高め、初期放出の抑制された安定し
た持続性を示すヒト成長ホルモン含有徐放性製剤が得ら
れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト成長ホルモン
と亜鉛とを約１：１.６から約１：２.４のモル比で含有
するヒト成長ホルモン・亜鉛複合体、該成長ホルモン・
亜鉛複合体と生体内分解性ポリマーとを含有してなる徐
放性製剤等に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト成長ホルモン（以下、ＧＨと略記す
ることがある）は、近年では遺伝子工学的手法により大
量に生産することが可能であり、医療分野において従来
の下垂体性小人症だけでなく、ターナー症候群、小児慢
性腎疾患、軟骨異栄養症や成人ＧＨ分泌不全症にも臨床
応用される等幅広く使用されている。また、高齢化社会
において顕著な骨粗鬆症や、更には鬱血性心疾患への適
用も期待されている。ＧＨは、その生体内での安定性を考慮して、従来より筋
肉内あるいは皮下への注射による反復投与が用いられて
おり、また長期に亘って投与されることが多い為、患者
の肉体的負担は非常に大きいという問題がある。例えば
下垂体性小人症の場合には、乳幼児あるいは若年患者に
対して、数カ月から１０年以上という長期に亘る連日皮
下投与がなされているのが実情である。一方、数週間か
ら数カ月に一度の投与で十分な薬効を発揮するＧＨ含有
徐放性製剤の開発が報告されている（Ｓ.Ｔ.Ｐ.Ｐｈａ
ｒｍａ.Ｓｃｉ., ４（６）, ４３７−４４１頁, １９９
４年；ＮａｔｕｒｅＭｅｄ., ２（７）, ７９５−７９
９頁, １９９６年；Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｅｘｐ.Ｔｈｅｒ.,
２８１, １４３１−１４３９頁, １９９７年；ＷＯ９
４／１２１５８；ＷＯ９５／２９６６４；ＷＯ９７／
０１３３１）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来のＧＨ含有徐放性
製剤では、主薬であるＧＨを水溶液（水相）とした後に
ポリマーを溶解した有機溶媒（油相）に添加して、いわ
ゆるＷ／Ｏエマルションを形成し、これを用いて徐放性
製剤を製造していたが、製造工程あるいは保管中におけ
るＧＨの変性が顕著であり、また十分な封入率及び徐放
性が得られない。一方、ＧＨ粉体をポリマーを溶解した
有機溶媒（油相）に直接添加し、分散させたいわゆるＳ
／Ｏ分散液を用いて徐放性製剤を製造する方法もある
が、Ｓ／Ｏ分散液を液体窒素中に噴霧することにより安
定性を確保することが必要であり、大量生産には不適当
である。また、ＧＨは一般に粒径が大きく粉砕して用い
られるが、この粉砕時に大きな活性低下が生じるほか、
高ＧＨ含量の均一Ｓ／Ｏ型分散液の調製が困難であっ
た。このように、製剤工程中でのＧＨの安定性の保持やＧＨ
の活性低下の少ない微粒化は非常に困難であり、収率の
良い、しかも高ＧＨ含量の均一かつ安定した品質の徐放
性製剤をＧＨの活性を低下させることなく大量生産する
ことはきわめて困難であった。そこで、これらの困難を
克服した臨床上有用な長期に亘る安定した徐放性を示す
ヒト成長ホルモンの製剤及びこのような徐放性製剤を収
率良く大量に製造する方法が望まれる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは種々鋭意研
究を進め、ＧＨと亜鉛とを約１：１.６から約１：２.４
のモル比で含有するＧＨ・亜鉛複合体を初めて製造し、
この複合体が予想外にも、実質的に水溶性で、ＧＨが活
性低下することなく、ＧＨ自体に比べて有利に粉体の微
粒化が可能であり、しかも得られる粒子径が小さいＧＨ
・亜鉛複合体を用いて徐放性製剤を製造すると、製造工
程中にＧＨが変性することなく、ＧＨ封入率の向上及び
徐放性の改善した安定な品質の徐放性製剤を大量生産で
きること等を見出した。即ち、本発明は（１）ヒト成長
ホルモンと亜鉛とを約１：１.６から約１：２.４のモル
比で含有するヒト成長ホルモン・亜鉛複合体、（２）水
溶性である上記（１）記載のヒト成長ホルモン・亜鉛複
合体、（３）約１０μｍ以下の平均粒子径を有する上記
（１）記載のヒト成長ホルモン・亜鉛複合体、（４）上
記（１）記載のヒト成長ホルモン・亜鉛複合体と生体内
分解性ポリマーとを含有してなる徐放性製剤、（５）生
体内分解性ポリマーが脂肪族ポリエステルである上記
（４）記載の徐放性製剤、（６）脂肪族ポリエステルが
乳酸／グリコール酸ポリマーである上記（５）記載の徐
放性製剤、（７）乳酸／グリコール酸ポリマーの組成比
（モル％）が１００／０ないし約４０／６０である上記
（６）記載の徐放性製剤、

【０００５】（８）脂肪族ポリエステルの重量平均分子
量が約３,０００ないし約２０,０００である上記（５）
記載の徐放性製剤、（９）脂肪族ポリエステルが多価金
属との塩である上記（５）記載の徐放性製剤、（１０）
多価金属が亜鉛である上記（９）記載の徐放性製剤、
（１１）マイクロカプセルである上記（４）記載の徐放
性製剤、（１２）マイクロカプセルが注射用である上記
（１１）記載の徐放性製剤、（１３）ヒト成長ホルモン
の初期放出率が約５０％以下である上記（４）記載の徐
放性製剤、（１４）ヒト成長ホルモンと亜鉛とを約１：
１.６から約１：２.４のモル比で混合することを特徴と
するヒト成長ホルモン・亜鉛複合体の製造方法、（１
５）ヒト成長ホルモンと亜鉛とを約１：１.６から約
１：２.４のモル比で含有するヒト成長ホルモン・亜鉛
複合体を形成し、粉砕することを特徴とする微粒化され
たヒト成長ホルモンの製造方法、（１６）ヒト成長ホル
モンと亜鉛とを約１：１.６から約１：２.４のモル比で
含有するヒト成長ホルモン・亜鉛複合体の、ヒト成長ホ
ルモン含有徐放性製剤製造のための使用、（１７）ヒト
成長ホルモンと亜鉛とを約１：１.６から約１：２.４の
モル比で含有するヒト成長ホルモン・亜鉛複合体を、生
体内分解性ポリマーを含む油相に分散して得られたＳ／
Ｏ型分散液を水相に添加し、Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルション
として水中乾燥に付すことを特徴とする徐放性製剤の製
造法、（１８）上記（１）記載のヒト成長ホルモン・亜
鉛複合体を含有することを特徴とする医薬製剤、及び
（１９）上記（１）記載のヒト成長ホルモン・亜鉛複合
体を含有することを特徴とする下垂体小人症の予防治療
剤等を提供する。

【０００６】本発明で用いられるＧＨは、天然型（抽出
物等）あるいは遺伝子組換え型（Ｎａｔｕｒｅ２８１
巻，５４４頁（１９７９）、同２９３巻，４０８頁（１
９８１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８０巻，３９７頁（１９８３）、Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ. ５巻，１６１頁（１９８１）等）のいずれでも
よいが、安全性及び品質の面から遺伝子組換え型ＧＨが
好ましい。また、本発明では、ＧＨとしてこれらのムテ
イン、誘導体、類縁体及び活性フラグメント（Ｊ.Ｂｉ
ｏｌ.Ｃｈｅm., ２５３巻，２６７９頁（１９７８）、
Ｂ.Ｂ.Ｒ.Ｃ. ９２巻，５１１頁（１９８０）、Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌ., １０９巻，１３０１頁（１９８
１）、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ. ３巻，４９頁（１９８
９）等）等を使用してもよい。本発明のＧＨ・亜鉛複合
体は、最終的にＧＨと亜鉛とのモル比が約１：１.６か
ら約１：２.４になる限りは、如何なる合成法で合成さ
れていてもよく、例えば複合体一般に用いられる合成法
に従って合成されてもよい。通常、ＧＨと例えば水溶性
亜鉛塩とを接触させること等で、本発明のＧＨ・亜鉛複
合体を得ることができる。この接触（反応）は、溶媒特
に水性溶媒中で行うことが好ましい。接触時間は約１分
ないし約１時間で、接触温度は約４ないし約３７℃（好
ましくは常温）で行うことができる。この反応に用いら
れる水溶性亜鉛塩としては、例えば亜鉛と無機酸との塩
あるいは亜鉛と有機酸との塩等が挙げられ、無機酸とし
ては例えば塩酸、硫酸、硝酸等が、有機酸としては脂肪
族カルボン酸、芳香族カルボン酸等が挙げられる。ここ
において有機酸として用いられる脂肪族カルボン酸とし
ては、例えば脂肪族モノカルボン酸、脂肪族ジカルボン
酸、脂肪族トリカルボン酸等が挙げられる。これらの脂
肪族カルボン酸は、飽和あるいは不飽和のいずれであっ
てもよい。脂肪族カルボン酸は、好ましくは炭素数２な
いし９の脂肪族カルボン酸等である。

【０００７】このような脂肪族モノカルボン酸として
は、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族モノカルボン
酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプ
ロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプ
リン酸等）及び炭素数２ないし９の不飽和脂肪族モノカ
ルボン酸（例えば、アクリル酸、プロピオール酸、メタ
クリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸等）が挙げられ
る。脂肪族ジカルボン酸としては、例えば炭素数２ない
し９の飽和脂肪族ジカルボン酸（例えば、マロン酸、コ
ハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸等）及び
炭素数２ないし９の不飽和脂肪族ジカルボン酸（例え
ば、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸
等）が挙げられる。脂肪族トリカルボン酸としては、例
えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族トリカルボン酸（例
えば、トリカルバリル酸、１,２,３−ブタントリカルボ
ン酸等）が挙げられる。上記した脂肪族カルボン酸は、
水酸基を１又は２個有していてもよく、このような例と
しては、例えばグリコール酸、乳酸、グリセリン酸、タ
ルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等が挙げられ
る。脂肪族カルボン酸としては、好ましくは脂肪族モノ
カルボン酸である。脂肪族カルボン酸は、更に好ましく
は炭素数２ないし９の脂肪族モノカルボン酸、特に好ま
しくは炭素数２又は３の飽和脂肪族モノカルボン酸であ
る。脂肪族カルボン酸の特に好ましい具体例としては、
例えば酢酸等が挙げられる。また、前記有機酸として用
いられる芳香族カルボン酸としては、例えば安息香酸、
サリチル酸等が挙げられ、好ましくは安息香酸である。

【０００８】より具体的には、本発明のＧＨ・亜鉛複合
体は、例えばＧＨと水溶性亜鉛塩とを水性溶媒（例え
ば、ＧＨ及び水溶性亜鉛塩の溶解度に影響を与えない程
度（例えば約１ないし１０％(Ｗ／Ｗ)）のエタノール又
はアセトンを含有していてもよい水溶液等、好ましくは
水等）中でＧＨと亜鉛が約１：１.６から約１：２.４、
好ましくは約１：１.８から約１：２.２の混合比（モル
比）になるように混合することにより製造される。該複
合体は、ＧＨと亜鉛との分子間の結合により生じた化合
物（錯塩、複塩、塩、有機金属化合物等）又は結合様式
の異なる化合物の混在物であってもよい。ＧＨと亜鉛と
の組成比（モル比）は約１：１.６から約１：２.４の範
囲、好ましくは約１：１.８から約１：２.２、より好ま
しくは約１：２がよい。また、本発明のＧＨ・亜鉛複合
体は、約１：１.６から約１：２.４のモル比で含有され
るＧＨと亜鉛の総てが複合体を形成していることが好ま
しいが、ＧＨ及び／又は亜鉛の一部分が複合体を形成せ
ずに含まれていてもよい。上記混合時の水溶液のｐＨ
は、ＧＨの生物活性を損なわず、またＧＨ及び亜鉛塩そ
れぞれの溶解性を大きく減少させないｐＨが採用され
る。混合操作は、通常蒸留水中で実施されるが、必要に
応じて弱酸性、中性あるいは弱アルカリ性（ｐＨ６ない
し９）に調整した水溶液中で実施してもよい。またＧＨ
及び用いる水溶性亜鉛塩の水中における濃度は、それぞ
れ単独の溶解度範囲内であればいずれでもよい。このよ
うにして得られたＧＨ・亜鉛複合体水溶液は、沈殿がほ
とんどみられず、実質的に水溶性である。本発明のＧＨ
・亜鉛複合体が水溶性であるとは、例えば常温で水（ｐ
Ｈ６ないし８）１ｍｌに該複合体が約２ｍｇ以上溶解す
ればよい。このＧＨ・亜鉛複合体水溶液は、真空乾燥あ
るいは凍結乾燥し粉末化した後、医薬製剤、好ましくは
徐放性製剤の製造用として用いられる。得られるＧＨ・
亜鉛複合体の粉末は非常に嵩が低く、亜鉛を含まないフ
リーのＧＨの嵩高い粉末に比べて取り扱いが容易で、徐
放性製剤を大量生産する上できわめて有利である。具体
的には、ＧＨ・亜鉛複合体の平均粒子径は約１０μｍ以
下、好ましくは約４ないし約７μｍの粉末とすることが
できる。また後述する生体内分解性ポリマーを溶解した
有機溶媒液に分散させた時、その粒子径が小さい為、Ｇ
Ｈの封入率の向上及び徐放性の改善にもきわめて有利で
ある。具体的には、徐放性製剤において、ＧＨの封入率
として約９０％以上を、ＧＨの徐放性として初期放出率
約５０％以下を達成することができる。

【０００９】本発明の徐放性製剤中、ＧＨ・亜鉛複合体
の含量は、一般的に約０.１ないし約４０％（Ｗ／
Ｗ）、好ましくは約１ないし約２０％（Ｗ／Ｗ）であ
る。生体内分解性ポリマーとしては、水に難溶又は不溶
である高分子重合物（ポリマー）、例えば脂肪族ポリエ
ステル〔例えば、α−ヒドロキシカルボン酸類（例え
ば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）、ヒドロ
キシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸等）、ヒドロキ
シトリカルボン酸（例えば、クエン酸等）等の１種以上
から合成された単独重合体（ホモポリマー）、共重合体
（コポリマー）、あるいはこれらの混合物〕、ポリ−α
−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、
ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸等）が挙げられ
る。これらは、適宜の割合で混合して用いてもよい。重
合の形式はランダム、ブロック、グラフトの何れでもよ
い。生体内分解性ポリマーは、好ましくは脂肪族ポリエ
ステル〔例えば、α−ヒドロキシカルボン酸類（例え
ば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）、ヒドロ
キシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸等）、ヒドロキ
シトリカルボン酸（例えば、クエン酸等）等の１種以上
から合成されたホモポリマー、コポリマー、あるいはこ
れらの混合物〕である。上記した脂肪族ポリエステル
中、α−ヒドロキシカルボン酸類（例えば、グリコール
酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）の１種以上から合成され
たホモポリマー、コポリマーが生体内分解性及び生体適
合性の観点から好ましい。脂肪族ポリエステルは、特に
好ましくはα−ヒドロキシカルボン酸類（例えば、グリ
コール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）の１種以上から合
成されたコポリマーである。また、これらのコポリマー
は混合して使用されてもよい。

【００１０】上記α−ヒドロキシカルボン酸類はＤ−
体、Ｌ−体、及びＤ、Ｌ−体の何れでもよいが、Ｄ−体
／Ｌ−体（モル／モル％）が約７５／２５ないし約２５
／７５の範囲のものが好ましい。Ｄ−体／Ｌ−体（モル
／モル％）は、更に好ましくは約６０／４０ないし約３
０／７０である。上記α−ヒドロキシカルボン酸類のコ
ポリマーの例としてはグリコール酸と他のα−ヒドロキ
シ酸類との共重合体が挙げられ、該α−ヒドロキシ酸類
としては乳酸、２−ヒドロキシ酪酸等が好ましい。α−
ヒドロキシカルボン酸類のコポリマーは、好ましくは乳
酸−グリコール酸コポリマー、２−ヒドロキシ酪酸−グ
リコール酸コポリマー等であり、特に好ましくは乳酸−
グリコール酸コポリマー等である。

【００１１】乳酸−グリコール酸ホモポリマー又はコポ
リマー（以下、両者を総称して単に乳酸−グリコール酸
ポリマー又はＰＬＧＡと称する）において、その組成比
（乳酸／グリコール酸比、以下Ｌ／Ｇと略記することが
ある）（モル／モル％）は約１００／０ないし約４０／
６０が好ましい。該組成比は、更に好ましくは約９０／
１０ないし約４５／５５である。組成比は、特に好まし
くは約８０／２０ないし約４５／５５である。乳酸−グ
リコール酸ポリマーの重量平均分子量は約３,０００な
いし約２０,０００、好ましくは約３,０００ないし約１
６,０００、更に好ましくは約６,０００ないし約１４,
０００である。また、乳酸−グリコール酸ポリマーの分
散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１.２ない
し約４.０が好ましい。更に好ましくは、約１.５ないし
約３.５である。乳酸−グリコール酸ポリマーは、自体
公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に
記載の方法に従って合成できる。該ポリマーは無触媒脱
水重縮合で合成されたものが好ましい。２−ヒドロキシ
酪酸−グリコール酸コポリマーにおいて、グリコール酸
が約１０ないし約７５モル％、残りが２−ヒドロキシ酪
酸である場合が好ましい。更に好ましくは、グリコール
酸が約２０ないし約７５モル％の場合である。特に好ま
しくは、グリコール酸が約３０ないし約７０モル％の場
合である。２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸コポリマ
ーの重量平均分子量は、約２,０００ないし約２０,００
０が好ましい。２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸コポ
リマーの分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約
１.２ないし約４.０が好ましい。分散度は、特に好まし
くは約１.５ないし約３.５である。２−ヒドロキシ酪酸
−グリコール酸コポリマーは公知の製造法、例えば特開
昭６１−２８５２１号及び特開平５−１１２４６５号公
報に記載の方法に従って合成できる。該共重合体は無触
媒脱水重縮合で合成されたものが好ましい。上記α−ヒ
ドロキシカルボン酸類のホモポリマーの好ましい例とし
ては乳酸のホモポリマー（ポリ乳酸）が挙げられる。ポ
リ乳酸の重量平均分子量は約３,０００ないし約２０,０
００、好ましくは約３,０００ないし約１４,０００であ
る。ポリ乳酸は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１
−２８５２１号公報に記載の方法に従って合成できる。
該ホモポリマーは無触媒脱水重縮合で合成されたものが
好ましい。

【００１２】上記した２−ヒドロキシ酪酸−グリコール
酸コポリマーは、更にポリ乳酸と混合して使用してもよ
い。該ポリ乳酸としては、Ｄ−体、Ｌ−体及びこれらの
混合物の何れでもよいが、Ｄ−体／Ｌ−体（モル／モル
％）が約７５／２５ないし約２０／８０の範囲のものが
好ましい。Ｄ−体／Ｌ−体（モル／モル％）は、更に好
ましくは約６０／４０ないし約２５／７５である。Ｄ−
体／Ｌ−体（モル／モル％）は、特に好ましくは約５５
／４５ないし約２５／７５である。該ポリ乳酸の重量平
均分子量は、約１,５００ないし約２０,０００、好まし
くは約１,５００ないし約１０,０００である。また、ポ
リ乳酸の分散度は約１.２ないし約４.０が好ましい。分
散度は、特に好ましくは約１.５ないし約３.５である。
ポリ乳酸の製造法については、乳酸の二量体であるラク
タイドを開環重合する方法と乳酸を脱水重縮合する方法
が知られている。本発明で使用する比較的低分子のポリ
乳酸を得るためには、乳酸を直接脱水重縮合する方法が
好ましい。該方法は、例えば特開昭６１−２８５２１号
公報に記載されている。２−ヒドロキシ酪酸−グリコー
ル酸コポリマーとポリ乳酸とを混合して使用する場合、
その混合比は例えば約１０／９０ないし約９０／１０
（重量％）である。混合比は、好ましくは約２０／８０
ないし約８０／２０である。混合比は、更に好ましくは
約３０／７０ないし約７０／３０である。

【００１３】本明細書中、重量平均分子量とは、重量平
均分子量が１２０,０００、５２,０００、２２,００
０、９,２００、５,０５０、２,９５０、１,０５０、５
８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質として
ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で
測定したポリスチレン換算の分子量をいう。ＧＰＣ測定
により数平均分子量も計算される。分散度は重量平均分
子量と数平均分子量とから計算される。ＧＰＣ測定はＧ
ＰＣカラムＫＦ８０４Ｌｘ２（昭和電工製）、ＲＩモ
ニターＬ−３３００（日立製作所製）を使用し、移動相
としてクロロホルムを用いる。

【００１４】上記した無触媒脱水重縮合で合成される共
重合体は、一般的に末端に遊離のカルボキシル基を有す
る。本発明において、生体内分解性ポリマーは、好まし
くは末端に遊離のカルボキシル基を有する。末端に遊離
のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーとは、
ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平
均分子量とがほぼ一致する生体内分解性ポリマーであ
る。末端基定量による数平均分子量は、以下のようにし
て算出される。約１ないし３ｇの生体内分解性ポリマー
をアセトン(２５ｍｌ）とメタノール（５ｍｌ)との混合
溶媒に溶解し、フェノールフタレインを指示薬としてこ
の溶液中のカルボキシル基を０.０５Ｎアルコール性水
酸化カリウム溶液で室温での撹拌下、速やかに滴定して
末端基定量による数平均分子量を次式で算出する。末端基定量による数平均分子量＝２０,０００Ａ／ＢＡ：生体内分解性ポリマーの質量 (ｇ) Ｂ：滴定終点までに添加した０.０５Ｎアルコール性水
酸化カリウム溶液 (ｍｌ) 例えば、１種類以上のα−ヒドロキシ酸類から無触媒脱
水重縮合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を
有するポリマーでは、ＧＰＣ測定による数平均分子量と
末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する。これ
に対し、環状二量体から触媒を用いて開環重合法で合成
され、末端に遊離カルボキシル基を本質的には有しない
ポリマーでは、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ
測定による数平均分子量を大きく上回る。この相違によ
って末端に遊離のカルボキシル基を有するポリマーは末
端に遊離カルボキシル基を有しないポリマーと明確に区
別することができる。

【００１５】末端基定量による数平均分子量が絶対値で
あるのに対してＧＰＣ測定による数平均分子量は各種分
析、解析条件（例えば移動相の種類、カラムの種類、基
準物質、スライス幅の選択、ベースラインの選択等）に
よって変動する相対値であるため、一義的な数値化は困
難であるが、例えばＧＰＣ測定による数平均分子量と末
端基定量による数平均分子量とがほぼ一致するとは、末
端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均
分子量の約０.５ないし約２倍の範囲内であることを意
味する。好ましくは、末端基定量による数平均分子量が
ＧＰＣ測定による数平均分子量の約０.８ないし約１.５
倍の範囲内である。また、末端基定量による数平均分子
量がＧＰＣ測定による数平均分子量を大きく上回ると
は、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による
数平均分子量の約２倍を越える場合をいう。また、本発
明の生体内分解性ポリマーとしては、上記した生体内分
解性ポリマーの金属塩も好ましく用いられる。例えば、
ＷＯ９７／０１３３１号公報に記載の各種生体分解性
ポリマーの多価金属塩、好ましくは二価金属塩、とりわ
け乳酸−グリコール酸共重合体の亜鉛塩が好ましく用い
られる。これら生体内分解性ポリマーはＷＯ９７／０
１３３１号公報に記載の方法及びこれに準じる変法によ
り製造することができる。また、生体内分解性ポリマーの多価金属塩が亜鉛の場合
には、生体分解性ポリマーと酸化亜鉛とを有機溶媒中で
反応させることによって製造することもできる。該製造
法においては、まず生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛と
を有機溶媒中に共存させて、生体内分解性ポリマー・酸
化亜鉛複合体の有機溶媒溶液を製造する。この際、生体
内分解性ポリマーの溶液中濃度は分子量、有機溶媒等の
種類によって異なるが、例えば約０.１ないし約８０％
（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約１ないし約７０％（Ｗ／
Ｗ）、更に好ましくは約２ないし約６０％（Ｗ／Ｗ）で
ある。また添加する酸化亜鉛量は、有機溶媒の種類によ
って異なるが、例えば生体内分解性ポリマー量の約０.
００１ないし約２％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０.０１
ないし約１．５％（Ｗ／Ｗ）、更に好ましくは約０.１
ないし約１％（Ｗ／Ｗ）である。有機溶媒への生体内分
解性ポリマー及び酸化亜鉛の添加順序は、生体内分解性
ポリマーの有機溶媒溶液に酸化亜鉛を粉末状であるいは
該有機溶媒に懸濁した状態で添加してもよく、逆に酸化
亜鉛の有機溶媒懸濁液中に生体内分解性ポリマーの有機
溶媒溶液を添加してもよい。また、両者を粉末状で混和
後、有機溶媒を添加してもよい。

【００１６】ＰＬＧＡ・酸化亜鉛複合体等の生体内分解
性ポリマー・酸化亜鉛複合体の溶液を、生体内分解性ポ
リマーと酸化亜鉛とから製造する方法の条件は、用いる
生体内分解性ポリマーの種類、酸化亜鉛の粒子径、有機
溶媒の種類、これらの組成等により適宜変更されるが、
例えばポリマーとしてＰＬＧＡを用いる場合、通常、約
０ないし約３０℃好ましくは約２ないし約２５℃で、約
１ないし約１６８時間、好ましくは約１２ないし約９６
時間、更に好ましくは約２４ないし約４８時間反応させ
ることにより、ＰＬＧＡ・酸化亜鉛複合体を得ることが
できる。ここで、ＰＬＧＡ・酸化亜鉛複合体の生成は、
添加時には懸濁状態である酸化亜鉛が有機溶媒に溶解
し、澄明な溶液状態となることにより肉眼的に確認する
ことが可能であり、前記範囲に限定される事なく、目視
による液状の観察を指標として、反応時間を決定しても
よい。同反応は、ＰＬＧＡと酸化亜鉛とを単に有機溶媒中に共
存させることによっても進行するが、適当な撹拌、振と
う手段により、撹拌、振とう下で反応させることは、反
応時間短縮において有利である。また、同様に超音波照
射下で反応させることも好ましい。得られた生体内分解
性ポリマー・酸化亜鉛複合体は、本発明において好まし
くは有機溶媒溶液の状態で次工程に用いられるが、所望
によっては有機溶媒を除去し、一旦固体状としてもよ
い。

【００１７】本発明の徐放性製剤は、ＧＨと亜鉛とを約
１：１.６から約１：２.４のモル比で含有するＧＨ・亜
鉛複合体（好ましくは粉末）を、生体内分解性ポリマー
（以下、生体内分解性ポリマーが金属塩の場合も含めて
「生体内分解性ポリマー」と略称する。）を溶解した有
機溶媒液（油相）に分散させた分散液（好ましくはＳ／
Ｏ型分散液）から溶媒を除去することにより製造され
る。その製造法としては、例えば水中乾燥法、相分離
法、噴霧乾燥法あるいはこれらに準ずる方法等が挙げら
れる。以下に、徐放性製剤として、例えばマイクロカプ
セルを製造する場合について記述する。（ａ）水中乾燥
法（Ｓ／Ｏ／Ｗ法）：本方法においては、まず生体内分
解性ポリマーの有機溶媒溶液を作製する。本発明の徐放
性製剤の製造時に使用する有機溶媒は、沸点が１２０℃
以下であることが好ましい。該有機溶媒としては、例え
ばハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、クロ
ロホルム、四塩化炭素）、アルコール類（例えば、エタ
ノール、メタノール）、アセトニトリル等が挙げられ
る。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。有機
溶媒は、好ましくはジクロロメタン、アセトニトリル、
特に好ましくはジクロロメタンが用いられる。生体内分
解性ポリマーの有機溶媒溶液中の濃度は、生体内分解性
ポリマーの分子量、有機溶媒の種類等によって異なる
が、一般的には約０.０１ないし約８０％（Ｗ／Ｗ）か
ら選ばれる。更に好ましくは約０.１ないし約７０％
（Ｗ／Ｗ）、特に好ましくは約１ないし約６０％（Ｗ／
Ｗ）である。

【００１８】このようにして得られた生体内分解性ポリ
マーの有機溶媒溶液（油相）中に、ＧＨ・亜鉛複合体を
添加し分散させる。この際、ＧＨ・亜鉛複合体の添加量
は、生体内分解性ポリマーに対するＧＨ・亜鉛複合体の
重量比の上限が約０.４まで、好ましくは約０.２までと
なるようにする。また、分散方法として、ＧＨ・亜鉛複
合体粉末として添加して均一分散させてもよく、また、
ＧＨ・亜鉛複合体の凍乾乾燥した塊を直接添加し、油相
中で粉砕・混合することにより均一分散させてもよい。
次いでこのようにして調製された有機溶媒分散液（Ｓ／
Ｏ型分散液）を更に水性溶媒（水相）中に添加して、タ
ービン型撹拌器あるいは超音波装置等を用いてＳ／Ｏ／
Ｗ型エマルションを形成させる。以後、油相溶媒を蒸発
させマイクロカプセルを製造する。この際の水相体積
は、一般的には油相体積の約１ないし約１０,０００倍
から選ばれる。更に好ましくは約５ないし約２,０００
倍から選ばれる。特に好ましくは約１０ないし約１,０
００倍から選ばれる。上記外水相中には、乳化剤を加え
てもよい。該乳化剤としては、一般的に安定なＳ／Ｏ／
Ｗ型エマルションを形成できるものであれば何れでもよ
い。乳化剤としては、例えばアニオン性界面活性剤、非
イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導
体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カ
ルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒア
ルロン酸等が挙げられる。これらは適宜組み合わせて使
用してもよい。外水相中の乳化剤の濃度は、好ましくは
約０.００１ないし約２０％（Ｗ／Ｖ）である。更に好
ましくは約０.０１ないし約１０％（Ｗ／Ｖ）、特に好
ましくは約０.０５ないし約５％（Ｗ／Ｖ）である。

【００１９】このようにして得られたマイクロカプセル
は、遠心分離あるいは濾過操作により分取した後、マイ
クロカプセルの表面に付着している乳化剤等を蒸留水に
よる洗浄で除去し、再び蒸留水等に分散して凍結乾燥す
る。その後必要であれば、加温してマイクロカプセル中
の水分及び有機溶媒を更に除去する。減圧下に加温して
もよい。加温条件としては、用いた生体内分解性ポリマ
ーのガラス転移温度以上で、マイクロカプセルの各粒子
が互いに付着しない程度の温度で加熱乾燥する。好まし
くは、生体内分解性ポリマーのガラス転移温度からガラ
ス転移温度より約３０℃高い温度の範囲で加熱乾燥す
る。ここにおいてガラス転移温度とは、示差走査熱量計
を用い、加温速度毎分約１０ないし約２０℃で昇温した
際に得られる中間点を云う。

【００２０】（ｂ）相分離法（コアセルベーション法）本法においては、前記のＳ／Ｏ型分散液にコアセルベー
ション剤を撹拌下徐々に加えマイクロカプセルを析出、
固化させる。該コアセルベーション剤は、上記分散液の
約０.０１ないし約１,０００倍の体積量が加えられる。
更に好ましくは、約０.０５ないし約５００倍の体積量
である。特に好ましくは、約０.１ないし約２００倍の
体積量である。コアセルベーション剤としては、生体内
分解性ポリマーを溶解する有機溶媒と混和する高分子
系、鉱物油系又は植物油系の化合物で使用した生体内分
解性ポリマーを溶解しないものであればよい。具体的に
は、例えばシリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿
実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサ
ン、ｎ−ヘプタン等が用いられる。これらは２種以上混
合して用いてもよい。このようにして得られたマイクロ
カプセルを濾過分取した後、ヘプタン等により繰り返し
洗浄してコアセルベーション剤を除去する。更に、前記
（ａ）と同様に洗浄し、次いで凍結乾燥する。水中乾燥
法及びコアセルベーション法でのマイクロカプセルの製
造では、粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を加え
てもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトー
ル、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例えば、コー
ンスターチ等）、ヒアルロン酸あるいはこのアルカリ金
属塩等の水溶性多糖、グリシン、フィブリン、コラーゲ
ン等の蛋白質、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム
等の無機塩類等が適宜用いられる。

【００２１】（ｃ）噴霧乾燥法本法においては、前記Ｓ／Ｏ型分散液を、ノズルを用い
てスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧
し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発さ
せ、マイクロカプセルを製造する。該ノズルとしては、
例えば二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型
等がある。この際所望により、上記の分散液と同時に、
マイクロカプセル粒子同志の凝集防止を目的として前記
凝集防止剤の水溶液を別ノズルより噴霧することも有効
である。このようにして得られたマイクロカプセルは、
前記（ａ）と同様にして洗浄し、必要であれば加温（要
すれば減圧下）により、水分及び有機溶媒を更に除去す
る。

【００２２】本発明で用いられる徐放性製剤は微粒子状
であることが好ましい。なぜならば徐放性製剤は、皮下
あるいは筋肉内注射に通常使用される注射針を通して投
与される方が、患者に対し過度の苦痛を与えることがな
いからである。該徐放性製剤の粒子径は、例えば平均粒
子径として約０.１ないし約３００μｍ、好ましくは約
１ないし約１５０μｍ、特に好ましくは約２ないし約１
００μｍである。本明細書において、マイクロカプセル
とは薬物（ＧＨ・亜鉛複合体）とマイクロカプセル基剤
（生体内分解性ポリマー）とを含有する微粒子であれば
よく（マイクロスフィアとも称する）、その具体例とし
ては、例えば１個の粒子中に１個の薬物コアを含有する
マイクロカプセル、１個の粒子中に多数の薬物コアを含
有する多核マイクロカプセルが挙げられる。

【００２３】本発明の徐放性製剤は、例えばマイクロカ
プセルとして、あるいはマイクロカプセルを原料物質と
して種々の剤形に製剤化し、非経口剤（例えば、筋肉
内、皮下、臓器等への注射剤又は埋め込み剤、鼻腔、直
腸、子宮等への経粘膜剤等）、経口剤（例えば、カプセ
ル剤（例えば、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒
剤、散剤等の固形製剤、懸濁剤等の液剤等）等として投
与することができる。本発明において、徐放性製剤は特
に注射用であることが好ましい。例えば、徐放性製剤が
マイクロカプセルである場合、マイクロカプセルを分散
剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（バイオラッド社）、Ｈ
ＣＯ−６０（日光ケミカルズ）等の界面活性剤、カルボ
キシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアル
ロン酸等の多糖類等）、保存剤（例えば、メチルパラベ
ン、プロピルパラベン等）、等張化剤（例えば、塩化ナ
トリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖等）
等と共に水性懸濁剤とすることにより実用的な注射用徐
放製剤が得られる。また、ゴマ油、コーン油等の植物油
あるいはこれにレシチン等のりん脂質を混合したもの、
あるいは中鎖脂肪酸トリグリセリド（例えば、ミグリオ
ール８１２（Ｈｕｌｓ．Ａ．Ｇ．））と共に分散して油
性懸濁剤として実際に使用できる徐放性注射剤とする。

【００２４】徐放性製剤が例えばマイクロカプセルであ
る場合、マイクロカプセルの粒子径は、懸濁注射剤とし
て使用する場合には、その分散度、通針性を満足する範
囲であればよく、例えば平均粒子径として約０.１ない
し約３００μｍの範囲が挙げられる。粒子径は、好まし
くは約１ないし約１５０μｍ、特に好ましくは約２ない
し約１００μｍの範囲である。上記したマイクロカプセ
ルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方
法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等
が挙げられるが、特に限定されない。

【００２５】本発明の徐放性製剤は、低毒性で哺乳動物
（例えば、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、
ウサギ等）に対して安全に用いることができる。本発明
の徐放性製剤は、成長ホルモン分泌不全症、ターナー症
候群、下垂体性小人症、慢性腎疾患、軟骨異栄養症、成
人性下垂体不全症、ダウン症候群、シルバー症候群、骨
形成不全症、骨粗鬆症、あるいは若年性慢性関節症、更
には鬱血性心不全症等の治療又は予防に有効である。徐
放性製剤の投与量は、放出の持続時間、対象疾患、対象
動物等により異なるが、ＧＨの有効濃度が体内で保持さ
れる量であればよい。例えば、ヒト成長ホルモン徐放性
製剤で２週間型製剤を下垂体性小人症の患者に投与する
場合、有効成分として、通常約０.０１ないし約５ｍｇ
／ｋｇ体重、好ましくは約０.０３ないし約１ｍｇ／ｋ
ｇ体重の範囲から適宜選び、２週間に１回投与するのが
よい。本発明のＧＨ・亜鉛複合体は、低毒性であり、原
末のままでもよいが、通常、医薬製剤用担体、例えば賦
形剤（例えば、炭酸カルシウム、カオリン、炭酸水素ナ
トリウム、乳糖、可溶性デンプン、コーンスターチ、結
晶セルロース、タルク、グラニュー糖、多孔性物質
等）、結合剤（例えば、デキストリン、ゴム類、アルフ
ァ化澱粉、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、
ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プルラン等）、
増粘剤（例えば、天然ガム類、セルロース誘導体等）、
崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロースカルシウ
ム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン、
低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、部分アルファ
化澱粉等）、溶剤（例えば、注射用水、生理食塩水、リ
ンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ゴマ
油、トウモロコシ油等）、分散剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ
８０、ＨＣＯ６０、カルボキシメチルセルロース、アル
ギン酸ナトリウムなど）、懸濁化剤（例えば、ラウリル
硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム等）、溶解補助
剤（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリ
コール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノ
ール、トリスアミノメタン、トリエタノールアミン、炭
酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等）、無痛化剤（例
えば、ベンジルアルコール等）、緩衝剤（例えば、リン
酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等）、滑沢剤（例え
ば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウ
ム、タルク、澱粉、安息香酸ナトリウム等）、着色剤
（例えば、タール色素、カラメル、三二酸化鉄、酸化チ
タン、リボフラビン類等）、矯味剤（例えば、甘味類、
香料等）、安定化剤（例えば、亜硫酸ナトリウム、アス
コルビン酸等）及び保存剤（例えば、パラベン類、ソル
ビン酸等）等の中から適宜、適量用いて、常法に従って
調製された医薬製剤として投与することもできる。前記
医薬製剤用担体を含んでいてもよい本発明の医薬製剤
は、前記徐放性製剤と同様に前記疾患を予防・治療する
のに、本発明のＧＨ・亜鉛複合体の有効な量を適宜含有
する。本発明のＧＨ・亜鉛複合体の医薬製剤中の含有量
は、通常、医薬製剤全体の約０.１ないし約１００重量
％である。徐放性製剤は、常温あるいは冷所に保存され
るが、好ましくは冷所である。ここでいう常温あるいは
冷所とは日本薬局方において定義されるものである。即
ち、常温とは１５℃ないし２５℃、冷所とは１５℃以下
を意味する。

【００２６】

【発明の実施の形態】以下に参考例、実施例、比較例及
び試験例を挙げて、更に具体的に説明するが、これらは
本発明を限定するものではない。また本発明の明細書に
おいてアミノ酸等の略号で表示する場合には、ＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号ある
いは当該分野における慣用略号に基づくものであり、そ
の例を下に示す。またアミノ酸に関して光学異性がある
場合は、特に明示しなければＬ−体を示す。ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムＧｌｙ：グリシンＡｌａ：アラニンＶａｌ：バリンＬｅｕ：ロイシンＩｌｅ：イソロイシンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＣｙｓ：システインＭｅｔ：メチオニンＧｌｕ：グルタミン酸Ｇｌｎ：グルタミンＡｓｐ：アスパラギン酸Ａｓｎ：アスパラギンＬｙｓ：リジンＡｒｇ：アルギニンＨｉｓ：ヒスチジンＰｈｅ：フェニルアラニンＴｙｒ：チロシンＴｒｐ：トリプトファンＰｒｏ：プロリンＡｓｘ：Ａｓｐ＋ＡｓｎＧｌｘ：Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ

【００２７】

【実施例】参考例１Ｔ７プロモーターを用いたヒト成
長ホルモン（ＧＨ）発現ベクターの構築ＧＨの構造遺伝子はプラスミドｐＨＧＨ１０７（特公平
６−１２９９６に記載、寄託番号ＡＴＣＣ３１５３８及
びＡＴＣＣ４００１１）からＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶ
で切断し約０．７５ｋｂの断片を単離した。一方、ｐＥ
Ｔ−３Ｃ〔Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ.，ジーン
（Ｇｅｎｅ）、５６巻、１２５頁（１９８７年）〕をＮ
ｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、Ｔ７プロモーター及び
アンピシリン耐性遺伝子を有する約４.６ｋｂの断片を
単離した。両断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ
Ｂｌｕｎｔｉｎｇｋｉｔ、宝酒造株式会社製）で平滑
末端とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、大腸菌
ＪＭ１０９に導入し、アンピシリン耐性を指標として形
質転換体を選択した。出現したコロニーの中から１２個
を拾い、これらからプラスミドを調製し制限酵素Ｐｓｔ
Ｉによる切断パターンを調べたところ、６個のコロニー
からのプラスミドにおいてＧＨ遺伝子が正しい方向で挿
入されていることがわかった。この中の１株から得られ
たプラスミドをｐＴＧＡ２０１と命名した。

【００２８】参考例２大腸菌でのＭｅｔ−ＧＨの発現大腸菌ＪＭ１０９を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子で組み換えられているラムダファージ（スチュ
ディエ、スプラ）で溶原化した。その後、参考例１で得
られたＧＨ発現ベクターｐＴＧＡ２０１をこの大腸菌Ｊ
Ｍ１０９（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ
３）／ｐＴＧＡ２０１を得た。この形質転換細胞を、５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ペプ
トン、０.５％酵母エキス、０.５％塩化ナトリウム）１
リットルを含む２リットル容フラスコ中で３０℃、１６
時間振とう培養した。得られた培養液を、０.０２％ニ
ューポールＬＢ−６２５（消泡剤；三洋化成工業製）及
び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２０リットルの
ＬＢ培地を仕込んだ５０リットル容発酵槽へ移植して、
３７℃、６時間通気撹拌培養した。この培養液を３６０
リットルの主発酵培地（１.６８％リン酸一水素ナトリ
ウム、０.３％リン酸二水素カリウム、０.１％塩化アン
モニウム、０.０５％塩化ナトリウム、０.０２４６％硫
酸マグネシウム、０.０２％ニューポールＬＢ−６２
５、０.０００５％塩酸チアミン、１.５％ブドウ糖、
１．５％カザミノ酸）を仕込んだ５００リットル容発酵
槽に移植して、３７℃で通気撹拌培養を開始した。培養
液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、５.
９５ｍｇ／リットル分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に培養を続
け、４時間後に培養液を遠心分離して、約４.５ｋｇの
湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。上記の形質転換
大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）／ｐＴＧＡ２０１は、受託
番号ＦＥＲＭＢＰ−５６３２として通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託され、
また受託番号ＩＦＯ１６００１として財団法人発酵研
究所（ＩＦＯ）に寄託されている。

【００２９】参考例３Ｍｅｔ−ＧＨの活性化参考例２で得られた菌体２ｋｇに５０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８.０）６リット
ルを加えて菌体を溶解後、遠心分離（１００００ｒｐ
ｍ、１２０分間）を行った。得られた上澄液６リットル
に５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０.２８ｍＭＧＳＳＧ、１.
４ｍＭＧＳＨ、０.７Ｍアルギニン（ｐＨ８.０）１８リ
ットルを加えてｐＨ８.０に調整した後、４℃で５日間
活性化を行った。

【００３０】参考例４Ｍｅｔ−ＧＨの精製参考例３で活性化の終了した再生液をペリコンカセット
システム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で、２０ｍＭトリ
ス／ＨＣｌ、２.５Ｍ尿素（ｐＨ８.０）を加えながら電
気伝導度が１０ｍＳ以下になるまで脱塩、濃縮を行った
後、得られた濃縮液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、６
０分間）し、濃縮液の上清５リットルを得た。ついでこ
の液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ
８.０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカ
ラム（２０ｃｍφ×８４ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、
十分に洗浄した後、０ないし２５％Ｂ（Ｂ＝２０ｍＭト
リス／ＨＣｌ、２.５Ｍ尿素、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐ
Ｈ８.０）の濃度勾配で１００分間、３００ｍｌ／分の
流速で溶出を行い、Ｍｅｔ−ＧＨ画分として１０リット
ルの溶出液を得た。更に、この溶出液をペリコンカセッ
トシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮、脱塩し
た。更に、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬ
Ｃシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ
−５ＰＷカラム（２１ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー社）に通
液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２.５
Ｍ尿素（ｐＨ８.０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−（Ｎ
−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐ
Ｈ４.０）とによる７０ないし８５％ＢのｐＨ勾配で、
７０分間、３２０ｍｌ／分の流速で溶出を行い、Ｍｅｔ
−ＧＨ画分６リットルを得た。この溶出液に２Ｍトリス
／ＨＣｌ（ｐＨ７.８）溶液３００ｍｌ加えてｐＨ７.２
に調整し、ついでペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ
膜、ミリポア社）で濃縮、脱塩し、９，９７９ミリグラ
ムのＭｅｔ−ＧＨを得た。

【００３１】参考例５Ｎ末端Ｍｅｔの除去参考例４で得たＭｅｔ−ＧＨ溶液１６５０ｍｌに２.５
Ｍグリオキシル酸、３５ｍＭ硫酸銅、６Ｍピリジン溶液
４１３ｍｌを加えよく撹拌した後２５℃で６０分間反応
させた。次いで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２.５Ｍ尿
素（ｐＨ８.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５
カラム（１１.３ｃｍφ×１２５ｃｍ、ファルマシア
社）に３リットル／ｈの流速で通液し、平衡化と同じ緩
衝液を用いて展開し、溶出してきたＭｅｔ−ＧＨのジケ
トン体画分を、よく撹拌しながら直接４Ｍ酢酸、４Ｍ酢
酸ナトリウム、８０ｍＭｏ−フェニレンジアミン、３Ｍ
尿素溶液４リットル中に加えた。溶出終了後、この反応
溶液８リットルを４℃に３日間静置した。静置後、ペリ
コンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で４
リットルに濃縮し、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２.５Ｍ
尿素（ｐＨ８.０）で平衡化したセファデックスＧ−２
５カラム（１１.３ｃｍφ×１４０ｃｍ、ファルマシア
社）に３リットル／ｈの流速で通液し、ＧＨ画分４.７
リットルを集めた。更に、高速液体クロマトグラフ法
（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、こ
の溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２１ｃｍ×３０ｃ
ｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリ
ス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８.０）、Ｂ＝５０ｍ
ＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］
＋２.５Ｍ尿素（ｐＨ４.０）とによる７０ないし８５％
ＢのｐＨ勾配で、７０分間、３２０ｍｌ／分の流速で溶
出を行い、ＧＨ画分１０リットルを得た。このＧＨ画分
に２Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.８）溶液を５００ｍｌ
加えてｐＨ７．２に調整後、ミニタンII（ＰＴＧＣ膜、
ミリポア社）で濃縮し、この濃縮液５００ｍｌを蒸留水
で平衡化したセファクリルＳ−１００カラム（１１３.
ｃｍφ×５０ｃｍ、ファルマシア社）に２リットル／ｈ
の流速で通液、展開しＧＨ画分１６５１ｍｌを得た。更
に、この溶液をミリパック６０（ミリポア社）でろ過
し、ＧＨ溶液１４８７ｍｌ（３３０９ｍｇのＧＨ）を得
た。

【００３２】参考例６ＧＨの性状確認（ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた
分析参考例５で得られたＧＨに１００ｍＭＤＴＴを含むサン
プルバッファー［Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２
２７，６８０（１９７０）］を等量加えてよく撹拌
し、９５℃で２分間加熱後、マルチゲル１０／２０（第
一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクー
マシー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
ｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅ）で染色した結果、約２
２ｋｄに単一バンドが認められたことから、精製ＧＨは
ほぼ単一であることが確認された。

【００３３】（ｂ）アミノ酸組成分析アミノ酸組成をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日
立）を用いて決定した。その結果、得られたＧＨのアミ
ノ酸組成はｃＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸
組成と一致した（表１）。

【表１】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １モル当たりのＧＨの塩基配列アミノ酸残基数から予測される値 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ａｓｘ２０.２２０Ｔｈｒ¹⁾ １０.０１０Ｓｅｒ¹⁾ １６.７１８Ｇｌｘ２７.０２７Ｐｒｏ８.１８Ｇｌｙ８.２８Ａｌａ７.６７ＣｙｓＮ.Ｄ.²⁾ ４Ｖａｌ７.０７Ｍｅｔ３.０３Ｉｌｅ７.７８Ｌｅｕ２７.９２６Ｔｙｒ８.１８Ｐｈｅ１２.７１３Ｈｉｓ３.２３Ｌｙｓ８.９９Ａｒｇ１０.９１１Ｔｒｐ０.８１ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 酸加水分解（６ＮＨＣｌ−４％チオグリコール酸、１
１０℃、２４及び４８時間加水分解の平均値）１）０時間に外挿した値２）未検出約２０μｇを用いて分析を行った。

【００３４】（ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムズ社、モデル４７７Ａ）を用い
て決定した。その結果、得られたＧＨのＮ末端アミノ酸
配列はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたＧＨのＮ末端
アミノ酸配列と一致した（表２）。

【表２】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 検出されたＧＨの塩基配列残基Ｎｏ．ＰＴＨ¹⁾−アミノ酸から予測される（ｐｍｏｌ）アミノ酸 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １Ｐｈｅ（９４９）Ｐｈｅ２Ｐｒｏ（４０４）Ｐｒｏ３Ｔｈｒ（４２２）Ｔｈｒ４Ｉｌｅ（７４４）Ｉｌｅ５Ｐｒｏ（２８３）Ｐｒｏ６Ｌｅｕ（５１４）Ｌｅｕ７Ｓｅｒ（１３６）Ｓｅｒ８Ａｒｇ（３６）Ａｒｇ９Ｌｅｕ（３７７）Ｌｅｕ１０Ｐｈｅ（４０８）Ｐｈｅ１１Ａｓｐ（７７）Ａｓｐ１２Ａｓｎ（２３０）Ａｓｎ１３Ａｌａ（４３５）Ａｌａ１４Ｍｅｔ（３３４）Ｍｅｔ１５Ｌｅｕ（３９８）Ｌｅｕ１６Ａｒｇ（６７）Ａｒｇ１７Ａｌａ（４８８）Ａｌａ１８Ｈｉｓ（３０）Ｈｉｓ１９Ａｒｇ（４２）Ａｒｇ２０Ｌｅｕ（４０６）Ｌｅｕ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １）フェニルチオヒダントイン１ｎｍｏｌを用いて分析を行った。

【００３５】（ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日
立）を用いて決定した。得られたＧＨのＣ末端アミノ酸
はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたＣ末端アミノ酸と
一致した（表３）。

【表３】気相ヒドラジン分解法（１００℃，６時間）１８ｎｍｏ
ｌを用いて分析を行った。（ｅ）ＧＨの活性測定参考例５で得られた精製ＧＨのＮｂ２細胞〔ジャーナル
・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メ
タボリズム、５１巻、１０５８頁（１９８０）〕に対す
る増殖促進効果は、標準品（ケミコンインターナショナ
ル社、Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳ
Ａ）と同等であった。

【００３６】実施例１ (１) ＧＨ・亜鉛複合体の製造参考例５に準じて得られた遺伝子組換え型ＧＨ水溶液
（２ｍｇ／ｍｌ）１２０ｍｌに、ＧＨ１モルに対する亜
鉛のモル比が１.８及び２.０となるような２種の濃度の
酢酸亜鉛水溶液０.５ｍｌをそれぞれ添加し、凍結乾燥
して、ＧＨ・亜鉛複合体（約２３０ｍｇ）を得た。 (２) ＧＨ含有マイクロカプセルの製造乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５
０／５０, ポリスチレン換算平均分子量＝１２,０００,
粘度＝０.１４５ｄｌ／ｇ）１.８９ｇをジクロロメタ
ン４ｍｌに溶解し、更に酸化亜鉛１０ｍｇを添加後、２
５℃で撹拌（６０ｒｐｍ）し完全に溶解した。このポリ
マーの有機溶媒溶液に上記(１)で得られたＧＨ・亜鉛複
合体１００ｍｇを添加しポリトロン（キネマチカ社）で
微粒化した。次いで得られたＳ／Ｏ分散液を０.１％ポ
リビニルアルコール水溶液８００ｍｌに添加し、ホモミ
キサーを用いて撹拌・乳化した。室温で２時間水中乾燥
した後、蒸留水で水洗し凍結乾燥することによりＧＨ含
有マイクロカプセル（１.０７ｇ（１：１.８）、０.９
１ｇ（１：２.０））を得た。

【００３７】比較例１ (１) ＧＨ粉体の製造参考例５に準じて作製した遺伝子組換え型ＧＨ水溶液
（２ｍｇ／ｍｌ）１２０ｍｌに、ＧＨ１モルに対して亜
鉛のモル比が０, ３.０, ４.０, ５.０, ６.０となるよ
うに種々の濃度の酢酸亜鉛水溶液０.５ｍｌをそれぞれ
添加し、凍結乾燥して、ＧＨ粉体（約２３０ｍｇ）を得
た。 (２) ＧＨ含有マイクロカプセルの製造実施例１−(２)と同様の操作により、上記(１)記載のＧ
Ｈ粉体を用いてＧＨ含有マイクロカプセル（０.９５ｇ
（１：０）、１.２３ｇ（１：３）、１.１３ｇ（１：
４）、１.２８ｇ（１：５）、１.２７ｇ（１：６））を
得た。

【００３８】試験例１実施例１−(２)及び比較例１−(２)で製造したマイクロ
カプセルを用いて以下の実験を実施した。 (１) ＧＨ含量実施例１−(２)及び比較例１−(２)で製造したマイクロ
カプセル４mgにアセトニトリル３００μｌを添加し、基
剤である乳酸−グリコール酸共重合体を溶解し、更に
０.０２％ウシ血清アルブミン−０.０５％トリフルオロ
酢酸含有水溶液７００μｌを添加撹拌して、ＧＨを抽出
した。遠心分離により得られた上清を、高速液体クロマ
トグラフィーに供してマイクロカプセル中のＧＨ含量を
定量した。ＧＨ封入率は得られたマイクロカプセル中の
ＧＨ含量を添加したＧＨ量から理論的に算出されるＧＨ
含量で除して求めた。〔表４〕に結果を示す。〔表４〕の結果より、ＧＨ１モルに対してモル比１.８
又は２.０の亜鉛を含有する本発明の複合体を用いた場
合において９０％以上のＧＨ封入率が得られた。これよ
り、本発明のＧＨ・亜鉛複合体を含有する徐放性製剤が
優れたＧＨ封入率を有することは明らかである。 (２) ｉｎｖｉｖｏ放出性免疫抑制ＳＤラット（雄性，６週齢）に６ｍｇＧＨ／ラ
ットに実施例１−(２)及び比較例１−(２)で製造したマ
イクロカプセルを皮下投与し、経時的に採血し、その血
清中ＧＨ濃度をラジオイムノアッセイ・キット（Ａｂビ
ーズＨＧＨ：栄研化学）により測定した。免疫抑制ＳＤ
ラットは、プログラフ（藤沢薬品）を、マイクロカプセ
ル投与３日前に０.４ｍｇ／ラット及び投与時、投与４,
７, １１, １４日後にそれぞれ０.２ｍｇ／ラット量を
皮下投与し作成した。血清中ＧＨ濃度推移より得られた
ＡＵＣとクリアランスを基に、マイクロカプセル投与後
１日までに放出されたＧＨ量、及びそれ以降１−１８日
までに放出されたＧＨ量を算出した。初期放出率は、マ
イクロカプセル投与後１日までに放出されたＧＨ量を投
与したＧＨ量で除して求めた。〔表４〕に結果を示す。
〔表４〕の結果より、ＧＨ１モルに対する亜鉛のモル比
が１.８又は２.０の複合体を含有するマイクロカプセル
が、初期放出量（投与後１日（２４時間）までの放出
量）が小さく（初期放出率：約３０％以下）、その後の
放出量（投与後１日（２４時間をこえ１８日までの放出
量)が大きい結果となった。比較例１−(２)で製造され
たマイクロカプセルはいずれも初期放出量が大きく（初
期放出率：約５０％以上）、従ってその後の放出量が小
さく、十分な徐放性が得られなかった。これより、本発
明のＧＨ・亜鉛複合体を含有する徐放性製剤が優れた徐
放性を有するのは明らかである。

【表４】

【００３９】試験例２参考例５に準じて得られた遺伝子組換え型ＧＨ水溶液
（２ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌに、ＧＨ１モルに対する亜鉛の
モル比が０, １.４, １.６, １.８, ２.０, ２.２, ２.
４, ３.０, ４.０, ５.０, ６.０となるように種々の濃
度の酢酸亜鉛水溶液５０μｌを添加し、凍結乾燥した。
得られた凍結乾燥粉末をジクロロメタン２ｍｌ中に分散
後、ボルテックスミキサーにより粉砕・微粒化しレーザ
ー回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ２０００Ａ；島
津）を用いて粒度分布を測定した。結果を〔図１〕に示
す（図中、粒度（平均粒子径μｍ）は●で示す。）。
〔図１〕の結果に示すとおり、ＧＨ１モルに対する亜鉛
のモル比が１.６ないし２.４で含有するＧＨ・亜鉛複合
体は５μｍ以下の平均粒子径を示した。これより、本発
明のＧＨ・亜鉛複合体が微粒化されていることは明らか
である。

【００４０】試験例３参考例５に準じて得られた遺伝子組換え型ＧＨ水溶液
（２ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌに、ＧＨ１モルに対する亜鉛の
モル比が０, １.０, ２.０, ３.０, ４.０, ５.０, ６.
０, ７.０, ８.０となるように種々の濃度の酢酸亜鉛水
溶液２５μｌを添加し、１２,０００回転／分で５分間
遠心分離した。得られた上清をフィルター（０.４５μ
ｍ）濾過した後、高速液体クロマトグラフィーによりＧ
Ｈ濃度を定量し、不溶性複合体形成率（不溶性複合体中
に含有されるＧＨのＧＨ総添加量に対する比率（％））
を算出した。結果を〔図２〕に示す（図中、不溶性複合
体形成率を○で示す）。〔図２〕の結果より、ＧＨ１モ
ルに対する亜鉛のモル比が２.０以下の場合においては
共存する不溶成分が３０％以下であり、本発明のＧＨ・
亜鉛複合体が実質的に水溶性であることは明らかであ
る。これより、本発明のＧＨ・亜鉛複合体が実質的に水
溶性であることは明らかである。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、ヒト成長ホルモンの封
入率を高め、初期放出の抑制された安定した持続性を示
すヒト成長ホルモン徐放性製剤が得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＧＨ・亜鉛複合体中のＧＨと亜鉛の組成比の変
化に併う、粒度分布の変動を示す。

【図２】ＧＨ・亜鉛複合体中のＧＨと亜鉛の組成比の変
化に併う、複合体の水溶解性の変動を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト成長ホルモンと亜鉛とを約１：１.６
から約１：２.４のモル比で含有するヒト成長ホルモン
・亜鉛複合体。
【請求項２】水溶性である請求項１記載のヒト成長ホル
モン・亜鉛複合体。
【請求項３】約１０μｍ以下の平均粒子径を有する請求
項１記載のヒト成長ホルモン・亜鉛複合体。
【請求項４】請求項１記載のヒト成長ホルモン・亜鉛複
合体と生体内分解性ポリマーとを含有してなる徐放性製
剤。
【請求項５】生体内分解性ポリマーが脂肪族ポリエステ
ルである請求項４記載の徐放性製剤。
【請求項６】脂肪族ポリエステルが乳酸／グリコール酸
ポリマーである請求項５記載の徐放性製剤。
【請求項７】乳酸／グリコール酸ポリマーの組成比（モ
ル％）が１００／０ないし約４０／６０である請求項６
記載の徐放性製剤。
【請求項８】脂肪族ポリエステルの重量平均分子量が約
３,０００ないし約２０,０００である請求項５記載の徐
放性製剤。
【請求項９】脂肪族ポリエステルが多価金属との塩であ
る請求項５記載の徐放性製剤。
【請求項１０】多価金属が亜鉛である請求項９記載の徐
放性製剤。
【請求項１１】マイクロカプセルである請求項４記載の
徐放性製剤。
【請求項１２】マイクロカプセルが注射用である請求項
１１記載の徐放性製剤。
【請求項１３】ヒト成長ホルモンの初期放出率が約５０
％以下である請求項４記載の徐放性製剤。
【請求項１４】ヒト成長ホルモンと亜鉛塩とを約１：
１.６から約１：２.４のモル比で混合することを特徴と
するヒト成長ホルモン・亜鉛複合体の製造方法。
【請求項１５】ヒト成長ホルモンと亜鉛とを約１：１.
６から約１：２.４のモル比で含有するヒト成長ホルモ
ン・亜鉛複合体を形成し、粉砕することを特徴とする微
粒化されたヒト成長ホルモンの製造方法。
【請求項１６】ヒト成長ホルモンと亜鉛とを約１：１.
６から約１：２.４のモル比で含有するヒト成長ホルモ
ン・亜鉛複合体のヒト成長ホルモン含有徐放性製剤の製
造のための使用。
【請求項１７】ヒト成長ホルモンと亜鉛とを約１：１.
６から約１：２.４のモル比で含有するヒト成長ホルモ
ン・亜鉛複合体を、生体内分解性ポリマーを含む油相に
分散して得られたＳ／Ｏ型分散液を水相に添加し、Ｓ／
Ｏ／Ｗ型エマルションとして水中乾燥に付すことを特徴
とする徐放性製剤の製造法。
【請求項１８】請求項１記載のヒト成長ホルモン・亜鉛
複合体を含有することを特徴とする医薬製剤。
【請求項１９】請求項１記載のヒト成長ホルモン・亜鉛
複合体を含有することを特徴とする下垂体小人症の予防
治療剤。