JPH11133014A - Method and apparatus for analyzing amino acid - Google Patents
Method and apparatus for analyzing amino acidInfo
- Publication number
- JPH11133014A JPH11133014A JP9300212A JP30021297A JPH11133014A JP H11133014 A JPH11133014 A JP H11133014A JP 9300212 A JP9300212 A JP 9300212A JP 30021297 A JP30021297 A JP 30021297A JP H11133014 A JPH11133014 A JP H11133014A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pores
- column
- amino acid
- silica gel
- mobile phase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、アミノ酸分析方法
および装置に関する。更に詳しくは、いわゆるロッドカ
ラムを用いたアミノ酸分析に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method and an apparatus for analyzing amino acids. More specifically, the present invention relates to amino acid analysis using a so-called rod column.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来より液体クロマトグラフを用いたア
ミノ酸分析が行われており、これは、例えば液体クロマ
トグラフ用カラムで分離した各アミノ酸成分をオルトフ
タルアルデヒド（ＯＰＡ）及びメルカプトエタノールと
反応させて発蛍光性の化合物を生成させ、この化合物の
蛍光強度または吸光光度を分析するものである。また、
試薬としてメルカプトエタノールの代わりにＮ−アセチ
ル−L −システインを用いる方法、カラムで分離する前
に反応試薬と反応させる方法などがある。2. Description of the Related Art Amino acid analysis using a liquid chromatograph has been conventionally performed, for example, by reacting each amino acid component separated by a liquid chromatographic column with orthophthalaldehyde (OPA) and mercaptoethanol. A fluorescent compound is generated, and the fluorescence intensity or the absorbance of the compound is analyzed. Also,
There are a method using N-acetyl-L-cysteine instead of mercaptoethanol as a reagent, a method of reacting with a reaction reagent before separation on a column, and the like.
【０００３】これら方法で用いられれる液体クロマトグ
ラフ用カラムは、通常多孔質球状シリカゲル粒子を均一
に充填したカラムが用いられる。液体クロマトグラフに
おいては、溶質が粒子表面や細孔表面の固定相と疎水
性、イオン交換などの相互作用を行い、溶質によって異
なる相互作用の差により分離が生じる。この相互作用が
平衡に達するのに必要な距離（理論段高）が小さいほど
相互作用の回数が多くなり、分離能が大きくなる。理論
段高を小さくするには充填剤の粒子径を小さくすること
が必要である。また、分析時間を短くするには、移動相
速度を大きくしなければならないが、溶質の輸送は、粒
子間では移動相の対流によって、粒子細孔内では拡散に
よって行われており、拡散による移動速度は対流による
よりも遅いため、高流速において特に拡散係数が非常に
小さいアミノ酸の分析においてはブロードなピークを導
くことになる。これを避けるには充填剤粒子を小さく
し、拡散距離を短くしなければならない。[0003] As the column for liquid chromatography used in these methods, a column usually packed with porous spherical silica gel particles uniformly is used. In a liquid chromatograph, a solute interacts with a stationary phase on the surface of particles or pores such as hydrophobicity and ion exchange, and separation occurs due to a difference in interaction depending on the solute. The smaller the distance (theoretical plate height) required for this interaction to reach equilibrium, the greater the number of interactions and the greater the resolution. To reduce the theoretical plate height, it is necessary to reduce the particle size of the filler. In order to shorten the analysis time, the velocity of the mobile phase must be increased.However, solute transport is performed by convection of the mobile phase between particles, and diffusion is performed in the pores of the particles. The velocity is slower than by convection, leading to a broad peak at high flow rates, especially in the analysis of amino acids with very low diffusion coefficients. To avoid this, the filler particles must be small and the diffusion distance must be short.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、充填剤
粒子の小径化にともない、粒子間空隙のサイズが小さく
なり、カラムに移動相を流すために高圧が必要となる。
現在では、粒子径５μｍの充填剤を用いた１〜２万段の
理論段数をもつカラムが最も一般的である。１．５μ
ｍ、２μｍなどの小さな粒子径をもつ粒子充填型カラム
も作成されているが、高負荷圧のため、カラム長さを短
くしたり、移動相流速を遅くしてもちいなければなら
ず、真の高性能化が達成されているとは言い難い。However, as the size of the filler particles is reduced, the size of the interparticle space is reduced, and a high pressure is required to flow the mobile phase through the column.
At present, columns having a theoretical plate number of 10,000 to 20,000 using a filler having a particle diameter of 5 μm are the most common. 1.5μ
Particle-packed columns with small particle diameters such as m and 2 μm have also been prepared, but due to the high load pressure, the length of the column must be reduced or the mobile phase flow rate must be reduced. It is hard to say that high performance has been achieved.
【０００５】そこで、本発明は、負荷圧を増加させるこ
となく、流速に依存しない高分離能なアミノ酸分析法の
提供を目的とする。Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for analyzing amino acids having high resolution without depending on the flow rate without increasing the load pressure.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するため、互いに連続したμｍサイズの細孔（スルー
ポア）と、ｎｍサイズの細孔（メソポア）を有するシリ
カ骨格が絡み合った構造をもつ２重細孔構造のシリカゲ
ル表面にシリル化剤で化学修飾してなるカラムを用いた
アミノ酸分析法を提供する。In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a structure in which a silica skeleton having continuous μm-size pores (through pores) and nm-size pores (mesopores) is intertwined. The present invention provides an amino acid analysis method using a column obtained by chemically modifying a silica gel surface having a double pore structure with a silylating agent.
【０００７】ここで、２重細孔構造のシリカゲル（シリ
カロッド）は、ケイ素アルコキシドを加水分解・重縮合
するゾル・ゲル法によって作成するのが好ましい。加水
分解・重縮合は、例えば有機高分子の酸性溶液中におい
て行う。有機高分子としては、例えばポリスチレンスル
ホン酸のナトリウムまたはカリウム塩、ポリアクリル
酸、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリエチ
レンオキシド、ポリビニルピロリドン等を用いることが
できるが、これらに限定されない。また、有機高分子に
代えてホルミアルデヒドと多価アルコールとの混合物を
用いてもよく、多価アルコールとしては例えばグリセリ
ンを用いる。また、酸性溶液としては、例えば酢酸、塩
酸等を用いることができるが、酢酸が好ましく、酸性溶
液の濃度は、０．００１mol/l 〜１mol/l が好ましい。The silica gel (silica rod) having a double pore structure is preferably prepared by a sol-gel method for hydrolyzing and polycondensing silicon alkoxide. The hydrolysis and polycondensation are performed, for example, in an acidic solution of an organic polymer. Examples of the organic polymer include, but are not limited to, sodium or potassium salts of polystyrene sulfonic acid, polyacrylic acid, polyallylamine, polyethyleneimine, polyethylene oxide, polyvinylpyrrolidone, and the like. Further, a mixture of formaldehyde and a polyhydric alcohol may be used instead of the organic polymer, and for example, glycerin is used as the polyhydric alcohol. As the acidic solution, for example, acetic acid, hydrochloric acid or the like can be used, but acetic acid is preferred, and the concentration of the acidic solution is preferably 0.001 mol / l to 1 mol / l.
【０００８】ケイ素アルコキシドとしては、テトラメト
キシシラン、テトラエトキシシラン、メチルトリメトキ
シシラン、エチルトリメトキシシラン、ビニルトリメト
キシシランを用いることができるが、これらに限定され
ない。なお、ケイ素アルコキシドを加水分解・重縮合し
て反応溶液のゲル化を行った後、アンモニア水溶液に浸
漬する工程（溶媒置換）を加えると細孔径を制御しやす
くなる。[0008] As the silicon alkoxide, tetramethoxysilane, tetraethoxysilane, methyltrimethoxysilane, ethyltrimethoxysilane, and vinyltrimethoxysilane can be used, but not limited thereto. After the silicon alkoxide is hydrolyzed and polycondensed to gel the reaction solution, a step of immersing in an aqueous ammonia solution (solvent replacement) facilitates control of the pore diameter.
【０００９】作成した２重細孔構造のシリカゲルは、μ
ｍサイズの細孔（スルーポア）と、ｎｍサイズのメソポ
アを有するシリカ骨格が絡み合っている。ここで、スル
ーポアの細孔径は０．５〜４μｍ、さらには０．８〜３
μｍが好ましい。０．５μｍより小さいと、負荷圧が大
きくなりすぎ、４μｍより大きいと性能が低下するため
である。またメソポアの細孔径は２〜５０ｎｍ、さらに
は８〜３０ｎｍが好ましい。２ｎｍより小さいと、細孔
内での溶質の拡散が困難であり、５０ｎｍより大きいと
表面積が小さく分離が不十分になるためである。スルー
ポアの細孔径は、反応系の組成及び温度、ｐＨ、有機高
分子の分子量等の各種条件によって変わり、これら条件
を調節することによって、所望の細孔径が得られる。ま
た、メソポアサイズは溶媒置換条件により調節される。[0009] The silica gel having a double-pore structure is made of μ
The m-sized pores (through pores) are intertwined with the silica skeleton having nm-sized mesopores. Here, the pore diameter of the through pore is 0.5 to 4 μm, and further, 0.8 to 3 μm.
μm is preferred. If it is smaller than 0.5 μm, the load pressure becomes too large, and if it is larger than 4 μm, the performance is reduced. The pore diameter of the mesopore is preferably 2 to 50 nm, more preferably 8 to 30 nm. If it is smaller than 2 nm, it is difficult to diffuse the solute in the pores, and if it is larger than 50 nm, the surface area is small and the separation becomes insufficient. The pore diameter of the through-pore varies depending on various conditions such as the composition of the reaction system, temperature, pH, and the molecular weight of the organic polymer, and a desired pore diameter can be obtained by adjusting these conditions. Also, the mesopore size is adjusted by the solvent replacement conditions.
【００１０】２重細孔構造のシリカゲルの表面はシリル
化剤で化学修飾して液体クロマトグラフ用カラムが作成
される。シリル化剤としては、例えばオクタデシルシリ
ル化剤およびトリメリルシリ化剤、アミノプロピルトリ
メトキシシランが好ましく、オクタデシルシリル化剤と
しては、例えばオクタデシルジメチル−Ｎ，Ｎ−ジエチ
ルアミノシラン、トリメリルシリ化剤としては、例えば
1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザンが好ましい。シリ
カゲル表面のシリル化は、シリカゲルとオクタデシルシ
リル化剤との反応後、残存しているシラノール量を最小
にするため二次シリルを行うのが好ましい。二次シリル
化剤としては前述の1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザ
ンを用いることができる。シリル化剤の濃度としては、
ベンゼン、トルエン等の有機溶剤中に濃度１vol ％以上
１００vol ％まで、好ましくは、１０〜５０vol ％が好
ましく、シリル化はシリル化剤の溶液中にシリカゲルを
浸して行うか、シリカゲルの細孔にシリル化剤を液体ク
ロマトグラフなどにより送液して行っても良い。The surface of silica gel having a double pore structure is chemically modified with a silylating agent to prepare a column for liquid chromatography. As the silylating agent, for example, octadecyl silylating agent, trimeryl silylating agent, and aminopropyltrimethoxysilane are preferable. As the octadecyl silylating agent, for example, octadecyldimethyl-N, N-diethylaminosilane, and as the trimeryl silylating agent, for example,
1,1,1,3,3,3-Hexamethyldisilazane is preferred. For the silylation of the silica gel surface, it is preferable to perform secondary silyl after the reaction of the silica gel with the octadecyl silylating agent in order to minimize the amount of the remaining silanol. As the secondary silylating agent, the above-mentioned 1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazane can be used. As the concentration of the silylating agent,
The concentration is preferably from 1 vol% to 100 vol%, and more preferably from 10 to 50 vol%, in an organic solvent such as benzene or toluene. The silylation is carried out by immersing the silica gel in a solution of a silylating agent, or by applying silyl to the pores of the silica gel. The agent may be sent by a liquid chromatograph or the like.
【００１１】上述のカラムは、移動相を送液する送液ポ
ンプと、カラムからの溶離液を検出する検出器とを組み
合わせることによりアミノ酸分析装置が構成される。こ
の装置においては、移動相線速度を従来より上げること
ができ、０．３〜２０ｍｍ／ｓ、好ましくは１ｍｍ／ｓ
以上とできる。移動相線速度の制御は、移動相を送液す
る送液ポンプの制御、カラム背圧の制御等により行え
る。また、移動相線速度は時間によって変更しても良い
（流速グラジエント）。The above-mentioned column constitutes an amino acid analyzer by combining a liquid sending pump for sending a mobile phase and a detector for detecting an eluent from the column. In this apparatus, the mobile phase linear velocity can be increased from the conventional one, and is 0.3 to 20 mm / s, preferably 1 mm / s.
I can do that. The control of the mobile phase linear velocity can be performed by controlling a liquid feed pump for feeding the mobile phase, controlling a column back pressure, and the like. In addition, the mobile phase linear velocity may be changed with time (flow velocity gradient).
【００１２】検出器は、紫外可視分光光度計、電気化学
検出器、フォトダイオードアレイ検出器、ＲＩ検出器、
蛍光検出器、マススペクトル検出器、光散乱検出器、旋
光度検出器などを用いることができ、試料の導入は公知
のオートインジェクタを使用することができる。The detector includes an ultraviolet-visible spectrophotometer, an electrochemical detector, a photodiode array detector, an RI detector,
A fluorescence detector, a mass spectrum detector, a light scattering detector, an optical rotation detector, and the like can be used, and a known auto injector can be used to introduce a sample.
【００１３】[0013]
＜実験例１：分析用カラムの作成＞ （１）２重細孔構造のシリカゲルロッドの作成 分子量１０、０００のポリエチレンオキシド、ＰＥＯ
（Aldrich)８．８ｇを０．０１Ｎ酢酸水溶液（ナカライ
テスク、試薬特級）１００ｍｌに溶解し、氷冷下でテト
ラメトキシシラン５０μｌ、ＴＭＯＳ（東京化成工業）
を加えて３０分間攪拌し、加水分解した。この溶液をヘ
リウムガスによって２分間脱気し、内径１０ｍｍの筒状
の型に流し込んだ後、４０℃の恒温槽に入れてゲル化し
た。一晩エージングしたシリカゲルを型から出して、水
に浸した。そして０．０１Ｎアンモニア水溶液（ナカラ
イテスク、試薬特級）による１２０℃、３時間の溶媒置
換処理を行い、５０℃で３日間乾燥した後、６００℃に
おいて２時間熱処理を行った。できたロッドは、スル−
ポア１．６μｍ、メソポア１２ｎｍであった。<Experimental Example 1: Preparation of analytical column> (1) Preparation of silica gel rod having double pore structure Polyethylene oxide having molecular weight of 10,000, PEO
(Aldrich) 8.8 g was dissolved in 100 ml of 0.01 N acetic acid aqueous solution (Nacalai Tesque, special grade of reagent), and under ice-cooling, 50 μl of tetramethoxysilane, TMOS (Tokyo Chemical Industry)
Was added and stirred for 30 minutes to hydrolyze. This solution was degassed with helium gas for 2 minutes, poured into a cylindrical mold having an inner diameter of 10 mm, and then gelled in a constant temperature bath at 40 ° C. The overnight aged silica gel was removed from the mold and immersed in water. Then, a solvent replacement treatment was performed at 120 ° C. for 3 hours with a 0.01 N ammonia aqueous solution (Nacalai Tesque, reagent grade), dried at 50 ° C. for 3 days, and then heat-treated at 600 ° C. for 2 hours. The resulting rod is
The pore was 1.6 μm and the mesopore was 12 nm.
【００１４】以上の方法で調整したものを８３ｍｍ長に
成形加工した後、ジクロロメタン（ナカライテスク、試
薬特級）中１０分間超音波洗浄した。乾燥したシリカロ
ッドにフィルターとポリテトラフルオロエチレン（ＰＴ
ＦＥ）製エンドキャップをＰＴＦＥ製熱収縮性チューブ
で覆って取り付け、回りをエポキシ樹脂で固めてロッド
カラムとした。The product prepared by the above method was formed into a length of 83 mm, and then subjected to ultrasonic cleaning in dichloromethane (Nacalai Tesque, special grade of reagent) for 10 minutes. Dry silica rod with filter and polytetrafluoroethylene (PT
An end cap made of FE) was attached by covering with a heat-shrinkable tube made of PTFE, and the periphery was solidified with epoxy resin to form a rod column.
【００１５】（２）オクタデシルジメチル−Ｎ，Ｎ−ジ
エチルアミノシラン（ＯＤＳ−ＤＥＳ）の合成 １Ｌ三角フラスコのオクタデシルジメチルクロロシラン
（ナカライテスク）５０ｇのｎ−ヘキサン（ナカライテ
スク、試薬特級）溶液６００ｍｌを入れ、ジエチルアミ
ン（ナカライテスク、試薬特級）６０ｍｌを加えて５０
℃で１時間攪拌した。その後、生成した塩を取り除くた
めに反応溶液をＰＴＦＥ製メンブランフィルターで濾過
し、溶媒を減圧留去した。(2) Octadecyldimethyl-N, N-di
Synthesis of Ethylaminosilane (ODS-DES) A 1 L Erlenmeyer flask was charged with 600 ml of a solution of 50 g of octadecyldimethylchlorosilane (Nacalai Tesque) in n-hexane (Nacalai Tesque, reagent grade), and added with 60 ml of diethylamine (Nacalai Tesque, reagent grade) to add 50 ml.
Stirred at C for 1 hour. Thereafter, the reaction solution was filtered through a PTFE membrane filter in order to remove the generated salt, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
【００１６】（３）オクタデシルシリル化及び二次シリ
ル化 シリカゲルのシリル化は、液体クロマトグラフによる送
液を用いて次の方法で行った。最初にテトラヒドロフ
ランを流速１ｍｌ／ｍｉｎで３０分間送液、移動相を
トルエンに変えてさらに３０分間送液、１０ｍｌイン
ジェクトループにＯＤＳ−ＤＥＡの２０％(V/V) トルエ
ン溶液を注入し、６０℃、流速０．０３ｍｌ／ｍｉｎで
６時間送液することにより反応、反応後、トルエン、
テトラヒドラフランを流速１ｍｌ／ｍｉｎでそれぞれ３
０分間送液してカラム内を洗浄、充分な反応率を得る
ため、これらの操作を再度繰り返した。(3) Octadecyl silylation and secondary silyl
Silylation Le silica gel was carried out in the following manner using the liquid feed by the liquid chromatograph. First, tetrahydrofuran is sent at a flow rate of 1 ml / min for 30 minutes, the mobile phase is changed to toluene, and the liquid is sent for another 30 minutes. A 20% (V / V) toluene solution of ODS-DEA is injected into a 10 ml injection loop, and the temperature is 60 ° C. The reaction was carried out by sending the solution at a flow rate of 0.03 ml / min for 6 hours.
Tetrahydrafuran at a flow rate of 1 ml / min.
These operations were repeated again in order to wash the inside of the column by sending the solution for 0 minute and obtain a sufficient reaction rate.
【００１７】シリカゲルとオクタデシルシリル化剤との
反応後、残存しているシラノール量を最小にするために
二次シリル化を行った。1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシ
ラザン、ＨＭＤＳ（ナカライテスク、ガスクロマトグラ
フィーシリル化用）、２０％(V/V) トルエン溶液を使用
し、オクタデシルシリル化と同様の作用を行った。After the reaction of the silica gel with the octadecyl silylating agent, secondary silylation was performed to minimize the amount of residual silanol. Using 1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazane, HMDS (Nacalai Tesque, for gas chromatography silylation), and a 20% (V / V) toluene solution, the same action as octadecylsilylation Was done.
【００１８】＜実験例２；アミノ酸の分析＞実験例１で
作成した本発明のカラムを使って以下の分析条件でアミ
ノ酸を分析した。 （１）試料の調整法 アミノ酸（グリシン、トレオニン、プロリン、アルギニ
ン、チロシン）５０ｍｇを反応溶液（エタノール／０．
１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ９）／フェニルイソチオシアネ
ート＝７／２／１、ｖ／ｖ）１ｍｌに混ぜ、１５分間室
温で攪拌した。溶媒、未反応試薬を減圧留去し、試料希
釈溶液（０．０５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．８、０．１
Ｍ過塩素酸ナトリウム含有）／アセトニトリル＝９７／
３、v ／ｖ）１ｍｌに溶解し、各誘導体化アミノ酸の溶
液を０．１ｍｌずつとって混合し、試料とした。<Experimental Example 2: Analysis of Amino Acid> Amino acids were analyzed using the column of the present invention prepared in Experimental Example 1 under the following analysis conditions. (1) Sample preparation method 50 mg of amino acids (glycine, threonine, proline, arginine, tyrosine) were added to a reaction solution (ethanol / 0.1.
The mixture was mixed with 1 ml of 1M borate buffer (pH 9) / phenylisothiocyanate = 7/2/1, v / v) and stirred at room temperature for 15 minutes. The solvent and unreacted reagent were distilled off under reduced pressure, and the sample diluted solution (0.05 M phosphate buffer (pH 6.8, 0.1
M containing sodium perchlorate) / acetonitrile = 97 /
3, v / v) was dissolved in 1 ml, 0.1 ml of each derivatized amino acid solution was mixed and used as a sample.
【００１９】 （２）分析条件 試料：４μｌ 移動相：Ａ→Ａ／Ｂ（７５／２５、v ／ｖ）へのグラジエント Ａ：０．０５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．８、０．１Ｍ過塩素酸ナトリ ウム含有）／アセトニトリル＝９７／３（v ／ｖ） Ｂ：０．０５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．８、０．１Ｍ過塩素酸ナトリ ウム含有）／アセトニトリル＝５０／５０（v ／ｖ） グラジエント時間：１min 、３min 、６min 移動相線速度：１ｍｍ／ｓ、３ｍｍ／s ポンプ：ＬＣ−１０ＡＤ型ポンプ（島津製作所製） カラム温度：３０℃ 検出器：島津ＳＰＤ−６ＡＶ型紫外線吸収検出器（２５４ｎｍ） カラム負荷圧：３０ｋｇ／ｃｍ2 、６３ｋｇ／ｃｍ2 、８８ｋｇ／ｃｍ2 なお、比較のためカラムのみを従来の市販の粒子充填カ
ラム（ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ Ｃ18 ＵＧ）に代えて同
様に分析した。(2) Analysis conditions Sample: 4 μl Mobile phase: A → Gradient to A / B (75/25, v / v) A: 0.05 M phosphate buffer (pH 6.8, 0.1 M perchlorine) B: 0.05 M phosphate buffer (pH 6.8, containing 0.1 M sodium perchlorate) / acetonitrile = 50/50 (v / v) Gradient time: 1 min, 3 min, 6 min Mobile phase linear velocity: 1 mm / s, 3 mm / s Pump: LC-10AD type pump (manufactured by Shimadzu Corporation) Column temperature: 30 ° C. Detector: Shimadzu SPD-6AV type ultraviolet absorption detector (254 nm) column load pressure: 30kg / cm 2, 63kg / cm 2, 88kg / cm 2 Here, cash only columns for comparison with conventional commercial particle packed column (CAPCELLPAK C18 UG) It was analyzed in the same manner as Te.
【００２０】（３）分析結果 図１〜３が本発明の方法により分析したクロマトグラ
ム、図４〜６は、市販の粒子充填カラムを用い分析した
クロマトグラムである（但し、図１は、カラム負荷圧３
０ｋｇ／ｃｍ2 、移動相線速度１ｍｍ／ｓ、グラジエン
ト時間６分で分析した図、図２はカラム負荷圧３０ｋｇ
／ｃｍ2 、移動相線速度１ｍｍ／ｓ、グラジエント時間
３分で分析した図、図３はカラム負荷圧８８ｋｇ／ｃｍ
2 、移動相線速度３ｍｍ／ｓ、グラジエント時間１分で
分析した図、図４はカラム負荷圧６３ｋｇ／ｃｍ2 、移
動相線速度１ｍｍ／ｓ、グラジエント時間６分で分析し
た図、図５はカラム負荷圧６３ｋｇ／ｃｍ2 、移動相線
速度１ｍｍ／ｓ、グラジエント時間３分で分析した図、
図６はカラム負荷圧２０ｋｇ／ｃｍ2 、移動相線速度３
ｍｍ／ｓ、グラジエント時間１分で分析した図であ
る）。なお、図１〜６中、ａはグリシン、ｂはトレオニ
ン、ｃはプロリン、ｄはアルギニン、ｅはチロシンのピ
ークを示し、また、図の横軸は溶出時間、縦軸は吸光光
度である。(3) Analysis Results FIGS. 1 to 3 are chromatograms analyzed by the method of the present invention, and FIGS. 4 to 6 are chromatograms analyzed by using a commercially available particle-packed column. Load pressure 3
FIG. 2 shows an analysis at 0 kg / cm 2 , a mobile phase linear velocity of 1 mm / s, and a gradient time of 6 minutes.
/ Cm 2 , mobile phase linear velocity 1 mm / s, gradient time 3 minutes, FIG. 3 shows column load pressure 88 kg / cm
2 , a diagram analyzed at a mobile phase linear velocity of 3 mm / s and a gradient time of 1 minute, FIG. 4 is a diagram analyzed at a column load pressure of 63 kg / cm 2 , a mobile phase linear speed of 1 mm / s and a gradient time of 6 minutes, and FIG. The figure was analyzed with a column load pressure of 63 kg / cm 2 , a mobile phase linear velocity of 1 mm / s and a gradient time of 3 minutes.
FIG. 6 shows a column load pressure of 20 kg / cm 2 and a mobile phase linear velocity of 3
mm / s and a gradient time of 1 minute). 1 to 6, a represents glycine, b represents threonine, c represents proline, d represents arginine, and e represents the peak of tyrosine, and the horizontal axis of the figure is the elution time, and the vertical axis is the absorbance.
【００２１】図１、２と図３の対比より分かるように本
発明の方法によれば、移動相線速度を3 倍にしてもアミ
ノ酸を分離することができる。これに対して、従来法で
は図４と図６の対比でわかるように移動相線速度を3 倍
にすれば、アミノ酸を分離できない。As can be seen from a comparison between FIGS. 1 and 2 and FIG. 3, according to the method of the present invention, amino acids can be separated even when the mobile phase linear velocity is tripled. In contrast, in the conventional method, amino acids cannot be separated if the mobile phase linear velocity is tripled, as can be seen from a comparison between FIG. 4 and FIG.
【００２２】また、本発明ではグラジエント時間を短縮
（６分から３分、１分）しても、図１〜３に示すように
アミノ酸を分離することができるが、従来法では図４〜
６に示すようにグラジエント時間を短縮すれば、アミノ
酸を分離できない。In the present invention, amino acids can be separated as shown in FIGS. 1 to 3 even if the gradient time is shortened (from 6 minutes to 3 minutes or 1 minute).
When the gradient time is shortened as shown in FIG. 6, amino acids cannot be separated.
【００２３】[0023]
【発明の効果】本発明によれば、従来の粒子充填カラム
より流速に依存しない高性能、高速分離のカラムを提供
することができる。また、本発明の方法は、グラジエン
ト溶出による分析時間の短縮を可能とした。According to the present invention, it is possible to provide a high-performance, high-speed separation column independent of the flow rate as compared with a conventional particle-packed column. In addition, the method of the present invention has made it possible to shorten the analysis time by gradient elution.
【図１】本発明の方法により移動相線速度１ｍｍ／ｓ、
グラジエント時間６分で分析したクロマトグラムFIG. 1 shows a mobile phase linear velocity of 1 mm / s according to the method of the present invention.
Chromatogram analyzed with a gradient time of 6 minutes
【図２】本発明の方法により移動相線速度１ｍｍ／ｓ、
グラジエント時間３分で分析したクロマトグラムFIG. 2 shows a mobile phase linear velocity of 1 mm / s according to the method of the present invention.
Chromatogram analyzed with a gradient time of 3 minutes
【図３】本発明の方法により移動相線速度３ｍｍ／ｓ、
グラジエント時間１分で分析したクロマトグラムFIG. 3 shows a mobile phase linear velocity of 3 mm / s according to the method of the present invention.
Chromatogram analyzed with 1 minute gradient time
【図４】従来の方法により移動相線速度１ｍｍ／ｓ、グ
ラジエント時間６分で分析したクロマトグラムFIG. 4 is a chromatogram analyzed by a conventional method at a mobile phase linear velocity of 1 mm / s and a gradient time of 6 minutes.
【図５】従来の方法により移動相線速度１ｍｍ／ｓ、グ
ラジエント時間３分で分析したクロマトグラムFIG. 5 is a chromatogram analyzed by a conventional method at a mobile phase linear velocity of 1 mm / s and a gradient time of 3 minutes.
【図６】従来の方法により移動相線速度３ｍｍ／ｓ、グ
ラジエント時間６分で分析したクロマトグラムFIG. 6 is a chromatogram analyzed by a conventional method at a mobile phase linear velocity of 3 mm / s and a gradient time of 6 minutes.
ａ：グリシン、ｂ：トレオニン、ｃ：プロリン、ｄ：ア
ルギニン、ｅ：チロシンa: glycine, b: threonine, c: proline, d: arginine, e: tyrosine
Claims (5)
ア）と、２〜５０ｎｍサイズの細孔（メソポア）を有す
るシリカ骨格が絡み合った構造をもつ２重細孔構造のシ
リカゲル表面にシリル化剤で化学修飾してなるカラムを
用いてアミノ酸を分析することを特徴とするアミノ酸分
析法。1. Silylation on the surface of a silica gel having a double-pore structure having a structure in which a silica skeleton having pores (through pores) having a size of 0.5 to 4 μm and pores (mesopores) having a size of 2 to 50 nm is entangled. An amino acid analysis method comprising analyzing an amino acid using a column chemically modified with an agent.
びトリメリルシリ化剤、アミノプロピルトリメトキシシ
ランである請求項１記載のアミノ酸分析法。2. The method according to claim 1, wherein the silylating agent is an octadecyl silylating agent, a trimeryl silylating agent or aminopropyltrimethoxysilane.
メチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノシランであり、トリメ
リルシリ化剤が1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザンで
ある請求項２記載のアミノ酸分析法。3. The amino acid according to claim 2, wherein the octadecyl silylating agent is octadecyldimethyl-N, N-diethylaminosilane, and the trimeryl silylating agent is 1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazane. Analytical method.
ア）と、２〜５０ｎｍサイズの細孔（メソポア）を有す
るシリカ骨格が絡み合った構造をもつ２重細孔構造のシ
リカゲル表面にシリル化剤で化学修飾してなるカラム
と、該カラムに移動相を送液する送液ポンプと、該カラ
ムからの溶離液を検出する検出器とからなるアミノ酸分
析装置。4. A silica gel having a double pore structure having a structure in which a silica skeleton having pores (through pores) of 0.5 to 4 μm size and pores (mesopores) of 2 to 50 nm size is entangled. An amino acid analyzer comprising: a column chemically modified with an agent; a liquid sending pump for sending a mobile phase to the column; and a detector for detecting an eluent from the column.
度を０．３〜２０ｍｍ／ｓとする制御部を設けたことを
特徴とするアミノ酸分析装置。5. The amino acid analyzer according to claim 4, further comprising a controller for controlling the linear velocity of the mobile phase to 0.3 to 20 mm / s.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9300212A JPH11133014A (en) | 1997-10-31 | 1997-10-31 | Method and apparatus for analyzing amino acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9300212A JPH11133014A (en) | 1997-10-31 | 1997-10-31 | Method and apparatus for analyzing amino acid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11133014A true JPH11133014A (en) | 1999-05-21 |
Family
ID=17882077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9300212A Pending JPH11133014A (en) | 1997-10-31 | 1997-10-31 | Method and apparatus for analyzing amino acid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11133014A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002350412A (en) * | 2001-05-23 | 2002-12-04 | Nobuo Tanaka | Multidimensional high performance liquid chromatograph |
| US7361278B2 (en) | 2002-07-18 | 2008-04-22 | Canon Kabushiki Kaisha | Process for producing mass transfer device and apparatus for production thereof |
| CN112452311A (en) * | 2020-10-12 | 2021-03-09 | 南京江北新区生物医药公共服务平台有限公司 | Proline bonded silica gel mass spectrum capillary chromatographic column |
-
1997
- 1997-10-31 JP JP9300212A patent/JPH11133014A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002350412A (en) * | 2001-05-23 | 2002-12-04 | Nobuo Tanaka | Multidimensional high performance liquid chromatograph |
| US7361278B2 (en) | 2002-07-18 | 2008-04-22 | Canon Kabushiki Kaisha | Process for producing mass transfer device and apparatus for production thereof |
| CN112452311A (en) * | 2020-10-12 | 2021-03-09 | 南京江北新区生物医药公共服务平台有限公司 | Proline bonded silica gel mass spectrum capillary chromatographic column |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Qiu et al. | Development of silica-based stationary phases for high-performance liquid chromatography | |
| Schweitz et al. | Molecularly imprinted microparticles for capillary electrochromatographic enantiomer separation of propranolol | |
| Fanali et al. | Enantioseparations by capillary electrochromatography | |
| US4775520A (en) | Spherical SiO2 particles | |
| Lu et al. | Preparation and characterization of silica monolith modified with bovine serum albumin‐gold nanoparticles conjugates and its use as chiral stationary phases for capillary electrochromatography | |
| Zheng et al. | Recent developments and applications of molecularly imprinted monolithic column for HPLC and CEC | |
| US5869152A (en) | Silica materials | |
| EP2161573B1 (en) | Monolith adsorbent and method and apparatus for adsorbing samples with the same | |
| Wistuba et al. | Recent progress in enantiomer separation by capillary electrochromatography | |
| Adly et al. | Cyclodextrin‐functionalized monolithic capillary columns: preparation and chiral applications | |
| Wistuba | Chiral silica-based monoliths in chromatography and capillary electrochromatography | |
| US20070095736A1 (en) | Tube structure with sol-gel zirconia coating | |
| Marechal et al. | Is click chemistry attractive for separation sciences? | |
| Lei et al. | Hybrid monolithic columns with nanoparticles incorporated for capillary electrochromatography | |
| D’Orazio et al. | Enantiomers separation by capillary electrochromatography using polysaccharide‐based stationary phases | |
| Khoo et al. | Advancements in the preparation and application of monolithic silica columns for efficient separation in liquid chromatography | |
| Zhou et al. | Preparation of β‐cyclodextrin‐gold nanoparticles modified open tubular column for capillary electrochromatographic separation of chiral drugs | |
| Hsieh et al. | Titanium dioxide nanoparticles‐coated column for capillary electrochromatographic separation of oligopeptides | |
| Li et al. | Facile preparation of ethanediamine-β-cyclodextrin modified capillary column for electrochromatographic enantioseparation of Dansyl amino acids | |
| Chirica et al. | A simple procedure for the preparation of fritless columns by entrapping conventional high performance liquid chromatography sorbents | |
| Yangfang et al. | Preparation and evaluation of monodispersed, submicron, non‐porous silica particles functionalized with β‐CD derivatives for chiral‐pressurized capillary electrochromatography | |
| JP2009515180A (en) | particle | |
| JPH11133014A (en) | Method and apparatus for analyzing amino acid | |
| Sakai-Kato et al. | Integration of biomolecules into analytical systems by means of silica sol-gel technology | |
| Zhai et al. | Chiral separation performance of micrometer‐sized monodispersed silica spheres with high protein loading |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041026 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041129 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20060524 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060608 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060727 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060822 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061226 |