JPH11125634A - Solid phase for immunoassay - Google Patents
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- JPH11125634A JPH11125634A JP35218897A JP35218897A JPH11125634A JP H11125634 A JPH11125634 A JP H11125634A JP 35218897 A JP35218897 A JP 35218897A JP 35218897 A JP35218897 A JP 35218897A JP H11125634 A JPH11125634 A JP H11125634A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫測定（イムノ
アッセイ）に用いる固相に関する。The present invention relates to a solid phase used for immunoassay (immunoassay).
【０００２】[0002]
【従来の技術】抗原物質または抗体物質を測定し分析す
るための手法として、イムノアッセイ法は、簡便かつ特
異性が高いという利点を有する。中でも表面にあらかじ
め抗原あるいは抗体を結合させた担体（以下、固相とい
う）と検体中の測定すべき物質とを免疫反応させて物質
を検出する手法は古くからイムノアッセイ法の主流とな
っている。例えば、固相に測定すべき物質量に関連づけ
られた量の標識体を捕捉し、該固相を未反応成分と分離
した後、固相上の標識体量を計測して測定すべき物質量
を求める方法（ヘテロジニアス法）や、固相が測定すべ
き物質によって架橋されて凝集する程度を計測して測定
すべき物質量を求める方法（ホモジニアス法）などが有
名である。いずれの場合でも、これら固相を用いる測定
法では、固相に結合された物質は、結合状態でも溶液中
と同じ免疫反応性を有していることが前提とされてい
る。2. Description of the Related Art As a method for measuring and analyzing an antigenic substance or an antibody substance, an immunoassay method has an advantage that it is simple and has high specificity. Above all, immunoassay has long been the mainstream of the technique of detecting a substance by immunoreacting a carrier (hereinafter referred to as a solid phase) having a surface to which an antigen or an antibody is previously bound and a substance to be measured in a specimen. For example, after capturing the amount of the label associated with the amount of the substance to be measured on the solid phase, separating the solid phase from the unreacted components, and measuring the amount of the label on the solid phase, the amount of the substance to be measured (Heterogeneous method) and a method of measuring the extent to which the solid phase is cross-linked and aggregated by the substance to be measured to determine the amount of the substance to be measured (homogeneous method) are well known. In any case, in the measurement method using these solid phases, it is assumed that the substance bound to the solid phase has the same immunoreactivity as that in the solution even in the bound state.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、通常こ
れら活性成分と固相との結合はあまりコントロールされ
た状態で行われておらず、自発的な物理的吸着作用等に
任せることが多い。この場合、固相化する活性成分によ
っては、吸着による変性が起こって免疫活性が低下した
り、活性部位が吸着面側に隠れてしまい反応できなくな
ったり、あるいは活性部位が吸着面の近くにあるための
立体障害により反応性が低下したりということが起こ
る。実際、ハプテンやペプチドホルモン等の低分子物質
を抗原物質として直接固相に不溶化した場合に、抗原性
が低下し易いことは経験的公知事実であり、それを防ぐ
ための固相化の方法がいくつか検討されてすでに報告さ
れている。例えば、石川ら〔ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）、第８４巻、第９
３頁（１９７８）〕は、検体中の抗インスリン抗体の測
定において、インスリンを直接結合させた固相を用いる
よりも、先にウシ血清アルブミンを結合させた上にイン
スリンを結合させて不溶化した固相を用いる方が特異的
信号値が数倍高くなることを報告した。一方、高分子抗
原や抗体の場合は、固相に結合した活性成分の反応性に
ついて議論されることはほとんどない。また、先述のよ
うな反応性の低下は、血清のように夾雑物質を多量に含
む検体と接触したときに生じやすいことが予想される
が、そのような血清影響についてもほとんど検討される
ことはなかった。このような固相を用いた測定法では、
活性成分によっては、固相化することによって反応性が
低下し、測定系の検出感度を悪くしているにもかかわら
ず測定者がそのことを意識していないために、測るべき
物質の値が正しく評価されていない可能性も否定できな
い。However, the binding between these active ingredients and the solid phase is not usually carried out in a very controlled manner, and is often left to spontaneous physical adsorption. In this case, depending on the active component to be immobilized, denaturation due to adsorption occurs to decrease immunological activity, the active site is hidden on the adsorption surface side and cannot react, or the active site is near the adsorption surface Steric hindrance causes a decrease in reactivity. In fact, it is an empirically known fact that when low-molecular substances such as haptens and peptide hormones are directly insolubilized as an antigen substance in a solid phase, it is empirically known that the antigenicity tends to decrease. Some have been reviewed and reported. For example, Ishikawa et al. [Journal of Biochemistry, J. Biochem, Vol.
P.3 (1978)] states that in the measurement of anti-insulin antibody in a sample, bovine serum albumin was first bound and then insulin was bound and insolubilized, rather than using a solid phase to which insulin was directly bound. We reported that the specific signal value was several times higher when using the phase. On the other hand, in the case of high molecular weight antigens and antibodies, there is little discussion about the reactivity of the active ingredient bound to the solid phase. In addition, it is expected that the decrease in reactivity as described above is likely to occur when the sample comes into contact with a sample containing a large amount of contaminants, such as serum. Did not. In such a measurement method using a solid phase,
Depending on the active ingredient, the reactivity may decrease due to solid-phase immobilization, and the value of the substance to be measured may be reduced because the measurer is not conscious of the fact that the detection sensitivity of the measurement system is degraded. There is no denying that they may not be evaluated correctly.
【０００４】本発明の目的は、このような状況下活性成
分を固相に結合させる際に、直接吸着による変性や立体
障害による反応性の低下を起こさずに結合させ、さら
に、活性物質の易動性を高め、溶液中に近い状態で反応
しうるような固相を提供することにある。[0004] An object of the present invention is to bind an active ingredient to a solid phase under such circumstances without causing degradation by direct adsorption or reduction in reactivity due to steric hindrance. An object of the present invention is to provide a solid phase capable of increasing mobility and reacting in a state close to a solution.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明者は、免疫測定の
固相の調製において活性成分を２種または２分子以上の
介在物質を介して間接的に固相に結合させることによ
り、（１）活性成分の易動性が高くて、反応が立体障害
を受けにくい、（２）血清成分等による活性低下の少な
い、固相の作成が可能であることを見出し、本発明に到
った。Means for Solving the Problems In the preparation of a solid phase for immunoassay, the present inventor has proposed that (1) binding of an active ingredient to a solid phase indirectly via two or more intervening molecules. The present inventors have found that the mobility of the active ingredient is high, the reaction is hardly affected by steric hindrance, (2) a solid phase can be prepared with little decrease in activity due to serum components and the like, and the present invention has been accomplished.
【０００６】本発明は、以下の特徴を有するものであ
る。 （１）固相担体に、測定すべき物質と特異的に免疫複合
体を形成しうる物質（活性成分）が２種または２分子以
上の介在物質を介して間接的に結合されていることを特
徴とする免疫測定用固相。 （２）介在物質が蛋白質である（１）記載の免疫測定用
固相。 （３）介在物質が分子量１万以上の蛋白質である（２）
記載の免疫測定用固相。 （４）活性成分が特異的抗原である（３）記載の免疫測
定用固相。 （５）活性成分が特異的抗体である（３）記載の免疫測
定用固相。 （６）活性成分がヒト免疫不全ウィルスＩ型のｐ１７抗
原、ｐ２４抗原または逆転写酵素抗原である（４）記載
の免疫測定用固相。 （７）活性成分がヒト免疫不全ウィルスＩ型のｐ２４抗
原に対する抗体またはヒト成長ホルモンに対する抗体で
あるである（５）記載の免疫測定用固相。 （８）（１）記載の免疫測定用固相を免疫複合体転移法
における第１番目の固相として使用することを特徴とす
る免疫学的測定法。 （９）（１）記載の固相を含む免疫測定用キット。[0006] The present invention has the following features. (1) that a substance (active ingredient) capable of specifically forming an immune complex with the substance to be measured is indirectly bound to the solid phase carrier via two or more intervening substances; Characterized solid phase for immunoassay. (2) The solid phase for immunoassay according to (1), wherein the intervening substance is a protein. (3) The mediator is a protein having a molecular weight of 10,000 or more (2)
The solid phase for immunoassay described. (4) The immunoassay solid phase according to (3), wherein the active ingredient is a specific antigen. (5) The solid phase for immunoassay according to (3), wherein the active ingredient is a specific antibody. (6) The immunoassay solid phase according to (4), wherein the active ingredient is a human immunodeficiency virus type I p17 antigen, p24 antigen or reverse transcriptase antigen. (7) The solid phase for immunoassay according to (5), wherein the active ingredient is an antibody against p24 antigen of human immunodeficiency virus type I or an antibody against human growth hormone. (8) An immunoassay, wherein the solid phase for immunoassay according to (1) is used as a first solid phase in an immunocomplex transfer method. (9) An immunoassay kit comprising the solid phase according to (1).
【０００７】以下、本発明について説明する。本明細書
において、「測定すべき物質と特異的に免疫複合体を形
成しうる物質（活性成分）」とは、主に抗原測定の場合
の抗体、抗体測定の場合の抗原を意味する。すなわち、
測定すべき物質が抗体のときは、特異的抗原を意味す
る。例えば、抗ＨＩＶ抗体や抗ＨＢＶ抗体のような抗ウ
ィルス抗体を測定するときは相当するウィルス抗原を、
抗核抗体や抗サイログロブリン抗体のような自己抗体を
測定するときは相当する自己抗原を、アレルギー性Ｉｇ
Ｅを測定するときは相当するアレルゲンを、抗インター
フェロン抗体や抗成長ホルモン抗体のような抗蛋白製剤
抗体を測定するときは相当する蛋白質をいう。これら、
活性物質としての抗原物質は、分子全体であっても一部
分であってもよく、天然品でも合成品でもよい。特に、
抗ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）抗体測定に於けるｐ
１７抗原、ｐ２４抗原あるいは逆転写酵素抗原は好適な
活性成分の例である。Hereinafter, the present invention will be described. In the present specification, “a substance (active ingredient) capable of specifically forming an immune complex with a substance to be measured” mainly means an antibody in the case of measuring an antigen and an antigen in the case of measuring an antibody. That is,
When the substance to be measured is an antibody, it means a specific antigen. For example, when measuring an anti-virus antibody such as an anti-HIV antibody or an anti-HBV antibody,
When measuring an autoantibody such as an antinuclear antibody or an antithyroglobulin antibody, the corresponding autoantigen is replaced with an allergic Ig.
When measuring E, it refers to the corresponding allergen, and when measuring an anti-protein antibody such as an anti-interferon antibody or an anti-growth hormone antibody, it refers to the corresponding protein. these,
The antigenic substance as an active substance may be the whole or a part of the molecule, and may be a natural product or a synthetic product. Especially,
P in Anti-HIV (Human Immunodeficiency Virus) Antibody Measurement
The 17 antigen, p24 antigen or reverse transcriptase antigen are examples of suitable active ingredients.
【０００８】また、測定すべき物質が抗原のときは、活
性成分は特異的抗体を意味する。例えば、ＨＩＶのコア
抗原やＨＢＶの表面抗原のようなウィルス抗原を測定す
るときは相当する特異抗体を、その他、インスリンや甲
状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のような蛋白性ホルモン
類、Ｃ−反応性蛋白（ＣＲＰ）やフィブリン分解物（Ｆ
ＤＰ）のような血漿蛋白類、α−フェトプロテイン（Ａ
ＦＰ）や癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のような腫瘍マーカー
類、チロキシンやバソプレッシンのようなハプテン類等
を測定するときは各相当する抗体を意味する。これら特
異的抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗
体でもよく、抗体のクラスも限定されない。また、Ｆａ
ｂ、Ｆ（ａｂ’）2 やＦａｂ’のようなフラグメントで
あってもよい。Ｆａｂ’のＨｉｎｇｅ部分のＳＨ基を用
いて結合させる方法は、反応部位の方向性を揃える意味
で１つの好ましい形態である。特に、ＨＩＶ抗原の一
種、ｐ２４抗原の測定に於ける抗ｐ２４抗体Ｆａｂ’あ
るいはヒト成長ホルモンの測定に於ける抗ヒト成長ホル
モン抗体Ｆａｂ’は、好適な活性成分の例である。この
ように、本発明においては適当な活性成分を選択するこ
とにより、これまで免疫学測定法で測定し得た全ての抗
体、抗原の測定が可能である。When the substance to be measured is an antigen, the active ingredient means a specific antibody. For example, when measuring a viral antigen such as HIV core antigen or HBV surface antigen, the corresponding specific antibody is used, as well as other proteinaceous hormones such as insulin and thyroid stimulating hormone (TSH), and C-reactive protein. (CRP) and fibrin degradation products (F
Plasma proteins such as DP), α-fetoprotein (A
When measuring tumor markers such as FP) and carcinoembryonic antigen (CEA), and haptens such as thyroxine and vasopressin, the corresponding antibodies are meant. These specific antibodies may be polyclonal or monoclonal, and the class of the antibody is not limited. Also, Fa
It may be a fragment such as b, F (ab ') 2 or Fab'. The method of binding using the SH group of the Hinge portion of the Fab ′ is one preferable form from the viewpoint of uniforming the directionality of the reaction site. In particular, an anti-p24 antibody Fab ′ for the measurement of p24 antigen, a kind of HIV antigen, or an anti-human growth hormone antibody Fab ′ for the measurement of human growth hormone, are examples of suitable active ingredients. As described above, in the present invention, by selecting an appropriate active ingredient, it is possible to measure all antibodies and antigens which can be measured by the immunological assay.
【０００９】「固相担体」とは、免疫学的測定法におい
て通常使用される材質・形状のものを意味する。例え
ば、材質としては、ポリスチレン、ポリアクリル、ポリ
カーボネート、ポリメタクリレート、テフロン、セルロ
ース膜、紙、ガラス、アガロース、フェライト、ラテッ
クス（天然ゴム）等が挙げられる。形態としても何でも
よく、例えば、ビーズ、プレート、微粒子、スティッ
ク、ゲル等が挙げられる。[0009] The term "solid support" means a material and a shape usually used in an immunoassay. For example, examples of the material include polystyrene, polyacryl, polycarbonate, polymethacrylate, Teflon, cellulose film, paper, glass, agarose, ferrite, and latex (natural rubber). Any form may be used, and examples thereof include beads, plates, fine particles, sticks, and gels.
【００１０】「介在物質」とは、固相担体と活性成分の
間に介在する物質（スペーサー）を意味し、本発明の本
質的な要素である。本発明に於ける「介在物質」の材質
は、天然由来あるいは化学合成の高分子、特にタンパク
質である。しかし、測定対象物質の結合の立体障害を防
ぎ、測定系に悪影響を及ぼさないものであれば、核酸、
ポリヌクレオチド、デキストラン、有機高分子ポリマー
等も本発明の技術範囲に属する。「介在物質」のサイズ
（分子量）については、特に制限されないが、本発明の
効果をより強く現すためには、ある程度以上の大きさの
分子サイズを持っていることが好ましく、タンパク質の
場合、分子量１万から１００万程度のものが好適であ
り、特に分子量３万から５０万のものが好ましい。「介
在物質」の形態については、特に制限されないが、本発
明の効果をより強く現すためには、固相担体と活性成分
の距離を確保できる形態であることが好ましい。タンパ
ク質の場合、球状タンパク質が好ましい。アルブミン、
グロブリン等の血清、乳、あるいは卵白由来タンパク
質、種々の酵素、アビジン、ストレプトアビジン、マル
トース結合蛋白（ＭＢＰ）等の細菌分泌蛋白などが例示
される。しかし、コラーゲン、フィブロインなど繊維状
タンパク質も、測定対象物質の結合の立体障害を防ぎ、
測定系に悪影響を及ぼさないものであれば本発明の技術
範囲に属する。The term "intermediate" means a substance (spacer) interposed between the solid support and the active ingredient, and is an essential element of the present invention. The material of the "intermediate" in the present invention is a naturally derived or chemically synthesized polymer, particularly a protein. However, nucleic acids, as long as they prevent steric hindrance of binding of the substance to be measured and do not adversely affect the measurement system,
Polynucleotides, dextrans, organic high molecular polymers and the like also belong to the technical scope of the present invention. The size (molecular weight) of the “intermediate” is not particularly limited, but it is preferable that the “intermediate” has a molecular size of a certain size or more in order to exert the effects of the present invention more strongly. Those having a molecular weight of about 10,000 to 1,000,000 are preferable, and those having a molecular weight of 30,000 to 500,000 are particularly preferable. The form of the "intervening substance" is not particularly limited, but is preferably a form that can secure the distance between the solid support and the active ingredient in order to more strongly exert the effects of the present invention. For proteins, globular proteins are preferred. albumin,
Examples include serum-derived proteins such as globulin, milk or egg white-derived proteins, various enzymes, and bacterial secreted proteins such as avidin, streptavidin, and maltose binding protein (MBP). However, fibrous proteins such as collagen and fibroin also prevent steric hindrance of binding of the analyte,
Anything that does not adversely affect the measurement system belongs to the technical scope of the present invention.
【００１１】「２種または２分子以上の介在物質を介し
て間接的に結合されている」の意味するものは、前記介
在物質が２種以上、あるいは同種でも２分子以上、直列
に並んで、固相担体と活性成分を連結している状態であ
る。（１）固相担体と介在物質、（２）介在物質同士、
および（３）介在物質と活性成分の間の結合は、固相の
保存、測定の過程で容易に解離しないものであれば、原
則的にいかなる方法でもよい。以下に結合方法を例示す
る。[0011] What is meant by "indirectly linked via two or more kinds of intervening substances" is that two or more kinds of said intervening substances or two or more molecules of the same kind are arranged in series, This is a state in which the solid phase carrier and the active ingredient are linked. (1) solid phase carrier and mediator, (2) mediators,
And (3) the binding between the intervening substance and the active ingredient may be basically performed by any method as long as it is not easily dissociated during the storage and measurement of the solid phase. An example of the joining method will be described below.
【００１２】（１）固相担体と介在物質との結合には、
当該分野で公知の手法、例えば、ポリスチレンや活性炭
の固相にタンパク質を吸着させる、担体物質の官能基に
多価の架橋試薬を用いて共有結合的に結合させる、等の
方法が代表的である。(1) For the binding between the solid phase carrier and the intervening substance,
Representative methods known in the art, such as a method of adsorbing a protein to a solid phase of polystyrene or activated carbon, and a method of covalently bonding to a functional group of a carrier substance using a polyvalent crosslinking reagent, are typical. .
【００１３】（２）介在物質同士の結合には、１：介在
物質の官能基に多価の架橋試薬を用いて共有結合的に結
合させる方法、２：介在物質の一方にハプテン分子を導
入し、抗ハプテン抗体と結合させる方法、３：介在物質
が本来もつ、あるいは導入された物質間の親和性を利用
して結合させる方法、が用いられる。１：の方法に用い
られる架橋試薬の例としては、グルタルアルデヒド、Ｎ
−（ε−マレイミドカプロイロキシ）スクシニミド（Ｅ
ＭＣＳ）、Ｎ，Ｎ−（１，２−フェニレン）ビスマレイ
ミド、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、４，４’−ジチオビ
スフェニルアジド（ＤＴＢＰＡ）等が挙げられる。(2) The method of bonding between the intervening substances is as follows: 1: a method of covalently bonding to a functional group of the intervening substance using a polyvalent crosslinking reagent; 2: introducing a hapten molecule into one of the intervening substances. , A method of binding to an anti-hapten antibody, 3: a method of binding by utilizing the affinity between substances originally or introduced by an intervening substance. Examples of the crosslinking reagent used in the method of 1: include glutaraldehyde, N
-(Ε-maleimidocaproyloxy) succinimide (E
MCS), N, N- (1,2-phenylene) bismaleimide, N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), 4,4′-dithiobisphenylazide (DTBPA) and the like. .
【００１４】２：の方法に用いられるハプテンの例とし
ては、ジニトロフェニル基、トリニトロフェニル基、フ
ルオロセイン基、ジゴキシゲニン基等が挙げられる。介
在物質にハプテンを導入する方法としては、例えば、
２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−アミノ酸を用いて２，
４−ジニトロフェニル基を導入する公知の方法〔河野
ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・ア
ナリシス（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．）、第６
巻、第１０５頁（１９９２年）〕を用いて行えばよい。Examples of the hapten used in the method 2: include a dinitrophenyl group, a trinitrophenyl group, a fluorescein group, a digoxigenin group and the like. As a method of introducing a hapten into the intermediary substance, for example,
Using 2,4-dinitrophenyl-L-amino acid,
A known method for introducing a 4-dinitrophenyl group [Kono et al., Journal of Clinical Laboratory Analysis (J. Clin. Lab. Anal.), No. 6]
Vol. 105, 1992].
【００１５】３：の方法に用いられる親和性物質を利用
する代表的な例としては、介在物質の一方にビオチンを
導入しアビジン（あるいはストレプトアビジン）と結合
させる方法が挙げられる。介在物質にビオチン分子を導
入する方法としては、例えば、Ｎ−スクシニミジル−Ｄ
−ビオチンやスルホスクシニミジル−Ｎ−（Ｄ−ビオチ
ニル）−６−アミノヘキサノエート等のビオチン化試薬
を用いれば良い。アビジン（ストレプトアビジン）は１
分子中に複数のビオチン結合部位を持つので、他の２種
類のビオチン化物質を連結させることができ、介在物質
としては好適である。その他、親和性を利用する結合方
法としては糖鎖とレクチン、金属とキレート物質、リガ
ンドと受容体、相補的配列のポリヌクレオチド同士等の
組み合わせによる方法等も挙げられる。A typical example of using the affinity substance used in the method 3: is a method in which biotin is introduced into one of the intervening substances and bound to avidin (or streptavidin). As a method for introducing a biotin molecule into an intervening substance, for example, N-succinimidyl-D
A biotinylation reagent such as -biotin or sulfosuccinimidyl-N- (D-biotinyl) -6-aminohexanoate may be used. Avidin (streptavidin) is 1
Since the molecule has a plurality of biotin-binding sites, it is possible to link other two types of biotinylated substances, and it is suitable as an intervening substance. In addition, examples of the binding method utilizing affinity include a method using a combination of a sugar chain and a lectin, a metal and a chelating substance, a ligand and a receptor, a polynucleotide having a complementary sequence, and the like.
【００１６】また、上記１：、２：、３：の方法の他
に、任意のタンパク質を第一の介在物質とし、そのタン
パク質を抗原として認識する抗体を、第二の介在物質と
して用いても良い。In addition to the above-mentioned methods of 1: 2, 3 :, it is also possible to use any protein as the first mediator and use an antibody that recognizes the protein as an antigen as the second mediator. good.
【００１７】（３）介在物質と活性成分との結合には、
上記（２）と同様に、１：介在物質と活性成分の官能基
に多価の架橋試薬を用いて共有結合的に結合させる方
法、２：活性成分にハプテン分子を導入し、抗ハプテン
抗体を介在物質として用いて結合させる方法、３：活性
成分および介在物質が本来もつ、あるいは導入された物
質間の親和性を利用して結合させる方法、が用いられ
る。さらに４：抗原抗体反応を利用しても良い。さら
に、５：遺伝子工学の公知技術により、活性成分および
介在物質を融合発現させ、両者をペプチド鎖で結合され
た形で得ることも可能である。活性成分をウィルス抗原
のエピトープペプチドにする場合に好適な手法であり、
融合発現させるタンパク質としては、マルトース結合タ
ンパク（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼなどが利用可能である。(3) For the binding between the intervening substance and the active ingredient,
Similarly to the above (2), 1: a method of covalently bonding to a functional group of the intervening substance and the active ingredient using a polyvalent crosslinking reagent, 2: introducing a hapten molecule to the active ingredient, and preparing an anti-hapten antibody. A method of binding by using as an intervening substance, 3: a method of binding by utilizing affinity between an active ingredient and an intervening substance inherently or introduced substance are used. Further, 4: an antigen-antibody reaction may be used. 5: It is also possible to fuse and express the active ingredient and the mediator by a known technique of genetic engineering, and to obtain both in a form linked by a peptide chain. It is a suitable method when the active ingredient is used as an epitope peptide of a virus antigen,
As a protein to be fusion-expressed, maltose binding protein (MBP), glutathione-S-transferase and the like can be used.
【００１８】ヒト免疫不全ウィルスＩ型の「ｐ１７抗
原」とは、同ウィルスのｇａｇと呼ばれる遺伝子領域に
コードされて発現する分子量約１７０００の蛋白質で、
ウィルス粒子の構造維持に関与する蛋白質である。また
「ｐ２４抗原」とは、同じくｇａｇ領域にコードさせた
分子量約２４０００の蛋白質で、ウィルス粒子のコア
（核）を形成し、ウィルスのＲＮＡを包含する働きをも
つ蛋白質である。さらに、「逆転写酵素抗原」とは、ｐ
ｏｌと呼ばれる遺伝子領域にコードされて発現する分子
量約６６０００あるいは５１０００の蛋白質で、ウィル
スのＲＮＡを鋳型としてそれと相補的な配列をもつＤＮ
Ａを複製する機能をもつ蛋白質である〔ゲルダーブロム
（Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ）ら、バイロロジー（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ）、第１５６巻、第１７１頁（１９８７）〕。 The "p17 antigen" of human immunodeficiency virus type I is a protein having a molecular weight of about 17000 which is encoded and expressed by a gene region called gag of the virus.
It is a protein involved in maintaining the structure of virus particles. The “p24 antigen” is a protein having a molecular weight of about 24,000, which is also encoded in the gag region, forms a core (nucleus) of virus particles, and has a function of including viral RNA. Furthermore, “reverse transcriptase antigen” refers to p
ol, a protein with a molecular weight of about 66000 or 51,000 expressed by a gene region called a
A is a protein that has the function of replicating A [Gelderblom et al., Virology (Viro
156), vol. 156, p. 171 (1987)].
【００１９】本発明の固相は、これまで固相を用いて実
施されてきた全てのイムノアッセイにおいて使用可能で
ある。例えば、測定物質を２種類以上の固相間で移動さ
せることによって測定系の非特異信号を抑制し、検出感
度を著しく向上させることを特徴とする免疫複合体転移
法〔石川榮治著、「超高感度酵素免疫測定法」、学会出
版センター（１９９３）〕における固相に適用しても有
用である。このように、測定系はホモジニアス系でもヘ
テロジニアス系でもよく、測定物質もあらゆる抗原、抗
体の測定が可能である。また、被検液も血清、血漿、唾
液、尿、髄液等の生体液および緩衝液等何でもよく、検
出方法も比色、蛍光、発光、放射線、濁度等いっさいの
制限はない。The solid phase of the present invention can be used in all immunoassays that have been carried out using a solid phase. For example, a non-specific signal of a measurement system is suppressed by transferring a test substance between two or more solid phases, and the detection sensitivity is remarkably improved. Highly Sensitive Enzyme Immunoassay ”, published by Gakkai Shuppan Center (1993)]. As described above, the measurement system may be a homogeneous system or a heterogeneous system, and the measurement substance can measure all antigens and antibodies. The test liquid may be any of biological fluids such as serum, plasma, saliva, urine, and cerebrospinal fluid and buffers, and the detection method is not limited to colorimetry, fluorescence, luminescence, radiation, turbidity, and the like.
【００２０】[0020]
【実施例】以下、本発明の有用性を説明するために、実
施例としてＨＩＶ−１のｐ１７抗原、ｐ２４抗原、ＲＴ
抗原、抗ｐ２４抗体（Ｆａｂ’）あるいは抗ヒト成長ホ
ルモン抗体（Ｆａｂ’）を様々な形態で不溶化した固相
を用い、検体中の各抗原に対する抗体、あるいは各抗体
（Ｆａｂ’）に対する抗原の検出を行い、その結果を従
来技術と比較した例を示すが、もとより本発明はこれら
に限られるものではない。EXAMPLES Hereinafter, in order to explain the usefulness of the present invention, as examples, HIV-1 p17 antigen, p24 antigen, RT
Detection of an antibody against each antigen in a sample or an antigen against each antibody (Fab ') in a sample using a solid phase in which antigen, anti-p24 antibody (Fab') or anti-human growth hormone antibody (Fab ') is insolubilized in various forms. Are performed, and the results are compared with those of the prior art, but the present invention is not limited to these examples.
【００２１】実施例１ 本実施例では、ＨＩＶ−１，ｐ１７抗原を２種以上の蛋
白質を介して不溶化した固相を用いて抗ＨＩＶ抗体を含
む検体（陽性検体）および含まない検体（陰性検体）と
各固相を反応させたときの反応性の違いを、血清成分共
存下、非共存下でそれぞれ調べた。各物質の精製・調製
の詳細、および実験手順の詳細は以下の通りである。 〔緩衝液〕本実験では、以下の緩衝液を主に使用した。 緩衝液Ａ：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７．０ 緩衝液Ｂ：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ６．０、５ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ） 緩衝液Ｃ：０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝
液，ｐＨ７．０、１ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（フラク
ションＶ、インターゲン社、ニューヨーク）、１ｍｍｏ
ｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｇ／Ｌアジ化ナトリウムExample 1 In this example, a sample containing an anti-HIV antibody (positive sample) and a sample not containing the same (a negative sample) were prepared using a solid phase in which the HIV-1 and p17 antigens were insolubilized via two or more proteins. ) And each solid phase were examined for the difference in reactivity in the presence and absence of serum components. The details of the purification and preparation of each substance and the details of the experimental procedure are as follows. [Buffer] In this experiment, the following buffers were mainly used. Buffer A: 0.1 mol / L sodium phosphate buffer,
pH 7.0 Buffer B: 0.1 mol / L sodium phosphate buffer,
pH 6.0, 5 mmol / L ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Buffer C: 0.01 mol / L sodium phosphate buffer, pH 7.0, 1 g / L bovine serum albumin (Fraction V, Intergen, New York), 1 mmol
1 / L magnesium chloride, 1g / L sodium azide
【００２２】〔遺伝子組み換えＨＩＶ−１，ｐ１７抗原
（ｒｐ１７）の調製〕 （１）プラスミドの作製 ＨＩＶ−１単離株ＮＹ５（遺伝子バンク、登録番号ＨＩ
ＶＮＬ４３）およびＬＡＶ〔ワインホブソン（Ｗａｉｎ
−Ｈｏｂｓｏｎ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、第４０巻、第
９頁（１９８５）〕由来のＤＮＡを含むプラスミド（ｐ
ＮＬ４−３）〔足立ら、ジャーナル・オブ・バイロロジ
ー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第５９巻、第２８４頁（１９
８６）〕を鋳型として、ｐ１７抗原をコードするＤＮＡ
断片をｐ１７のＮ末端およびＣ末端の塩基配列に相当す
る２種類のプライマー（５'-ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡ
ＴＴＧＡＡＧＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣ
ＧＴＣＧＧＴＡ、５'-ＧＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＴＡＡ
ＴＴＴＴＧＧＣＴＧＡＣＣＴＧＧＣＴ、ベックス社、東
京）を用いたポリメラーゼ鎖反応法（ＰＣＲ法）で増幅
させた。続いて、ｒｐ１７をマルトース結合蛋白（ＭＢ
Ｐ）との融合蛋白として発現させるために、この増幅Ｄ
ＮＡ断片をｐＭＡＬ−ｃ２プラスミド（ニュー・イング
ランド・バイオラブズ社、マサチューセッツ州、米国）
に導入した。この時、ネイティブのｐ１７と同一のアミ
ノ酸配列を持つｒｐ１７を得るために、Ｎ末端側のプラ
イマーには本来のｐ１７のＮ末端アミノ酸のアミノ基側
にＸａ因子による切断用配列を挿入し、Ｃ末端側のプラ
イマーには本来のＣ末端アミノ酸の次に終始コドンを含
むように設計した。[Preparation of Recombinant HIV-1, p17 Antigen (rp17)] (1) Preparation of Plasmid HIV-1 Isolate NY5 (Genebank, Accession No. HI)
VNL43) and LAV [Wine Hobson (Wain)
-Hobson et al., Cell, Vol. 40, p. 9 (1985)].
NL4-3) [Adachi et al., Journal of Virology (J. Virol.), Vol. 59, p. 284 (19)
86)] as a template and DNA encoding the p17 antigen
The fragment was converted into two types of primers (5′-CGGGATCCGGTA) corresponding to the N-terminal and C-terminal nucleotide sequences of p17.
TTGAAGGTCGTATGGGTGGCGAGAGC
GTCGGGTA, 5'-GGTCTAGATCAGTAA
(TTTTGGCTGACCTGGCT, Vex, Tokyo) using the polymerase chain reaction method (PCR method). Subsequently, rp17 was converted to maltose binding protein (MB
P) to express it as a fusion protein with
The NA fragment was converted to a pMAL-c2 plasmid (New England Biolabs, Mass., USA)
Was introduced. At this time, in order to obtain rp17 having the same amino acid sequence as native p17, a sequence for cleavage by factor Xa was inserted into the N-terminal side primer on the amino group side of the original N-terminal amino acid of p17, and the C-terminal was obtained. The side primer was designed to include a stop codon next to the original C-terminal amino acid.
【００２３】（２）蛋白質の発現および精製 次に、このプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株（ライフ・テ
クノロジーズ・オリエンタル社、東京）に組み込んで形
質転換し、この大腸菌をイソプロピル−１−チオ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシドで誘導をかけながら増殖させ
た。続いて、大腸菌を５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含む
１５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５
中で超音波破砕し、遠心上清液を集めた。上清液を、同
緩衝液で平衡化したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）
セファロースにアプライした後、７５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化
ナトリウムを含む同緩衝液で溶出し、ｒｐ１７−ＭＢＰ
融合蛋白を含む分画を得た。さらに、ニュー・イングラ
ンド・バイオラブズ社のキットを用いて、同社の操作手
順書に従って、アミロース樹脂カラムを用いてｒｐ１７
−ＭＢＰのアフィニティー精製を行った。以下、ｒｐ１
７−ＭＢＰを用いる実験には本品を使用した。続いて、
ベーリンガー・マンハイム社（ドイツ）のキットを用い
て、同社の操作手順書に従って、ビオチニルＸａ因子に
よるｒｐ１７とＭＢＰの切断およびストレプトアビジン
カラムによるビオチニルＸａ因子の除去を行った。最後
に、ｒｐ１７は、１５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ６．７で平衡化したＳＰセファロース・ファ
ースト・フローカラム（ファルマシア・バイオテックＡ
Ｂ社、スウェーデン）を用い、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナ
トリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ６．７で溶出し精製した。精製したｒｐ１７−
ＭＢＰおよびｒｐ１７それぞれが単一であることは電気
泳動法にて確認した。(2) Expression and Purification of Protein Next, this plasmid was transformed into Escherichia coli DH5α strain (Life Technologies Oriental, Tokyo), and the Escherichia coli was transformed with isopropyl-1-thio-β-
The cells were grown under induction with D-galactopyranoside. Subsequently, Escherichia coli was treated with a 15 mmol / L sodium phosphate buffer solution containing 5 mmol / L EDTA, pH 7.5.
The mixture was sonicated in water and the supernatant of the centrifugation was collected. Supernatant was treated with diethylaminoethyl (DEAE) equilibrated with the same buffer.
After application to Sepharose, elution was carried out with the same buffer containing 75 mmol / L sodium chloride, and rp17-MBP
A fraction containing the fusion protein was obtained. Further, using a kit of New England Biolabs, according to the operating procedure of the company, and using an amylose resin column, rp17
-Affinity purification of MBP was performed. Hereinafter, rp1
This product was used in experiments using 7-MBP. continue,
Using a kit from Boehringer Mannheim (Germany), rp17 and MBP were cleaved with biotinyl Xa factor and biotinyl factor Xa was removed with a streptavidin column according to the manufacturer's protocol. Finally, rp17 is an SP Sepharose Fast Flow column (Pharmacia Biotech A) equilibrated with 15 mmol / L sodium phosphate buffer, pH 6.7.
(Company B, Sweden) and eluted with 15 mmol / L sodium phosphate buffer containing 0.5 mol / L sodium chloride, pH 6.7. Purified rp17-
It was confirmed by electrophoresis that MBP and rp17 were each single.
【００２４】〔２，４−ジニトロフェニル−ＭＢＰ−ｒ
ｐ１７の調製〕 （１）メルカプトアセチル−ＭＢＰ−ｒｐ１７の調製 ＭＢＰ−ｒｐ１７融合蛋白質１．２ｍｇを含む０．１ｍ
ｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．
４ｍｌに５０ｍｍｏｌ／ＬのＮ−サクシニミジル−Ｓ−
アセチルメルカプトアセテートを含むＮ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド溶液１３．５μｌを加え、３０℃で３０分
間インキュベートした。続いて、反応液に５μｌの１ｍ
ｏｌ／Ｌグリシルグリシン、ｐＨ７．０および２０μｌ
の０．１ｍｏｌ／Ｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０を加えて３
０℃で５分間インキュベートし、最後に、５０μｌの１
ｍｏｌ／Ｌヒドロキシルアミンを加えて３０℃で１０分
間インキュベートした。[2,4-dinitrophenyl-MBP-r
Preparation of p17] (1) Preparation of mercaptoacetyl-MBP-rp17 0.1 m containing 1.2 mg of MBP-rp17 fusion protein
ol / L sodium phosphate buffer, pH 7.0, 0.
50 mmol / L N-succinimidyl-S- in 4 ml
13.5 μl of an N, N-dimethylformamide solution containing acetylmercaptoacetate was added, and the mixture was incubated at 30 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 5 μl of 1 m was added to the reaction solution.
ol / L glycylglycine, pH 7.0 and 20 μl
0.1 mol / L, EDTA, pH 7.0
Incubate at 0 ° C. for 5 minutes and finally 50 μl of 1
mol / L hydroxylamine was added and incubated at 30 ° C. for 10 minutes.
【００２５】（２）２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リ
ジン−マレイミドの調製 ３μｍｏｌのεＮ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リ
ジンを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液３０μｌ
と１．５μｍｏｌのＮ−サクシニミジル−６−マレイミ
ドヘキサノエートを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
溶液１５μｌと１０５μｌの緩衝液Ａを混合し３０℃で
９０分間インキュベートした。 （３）２，４−ジニトロフェニル−ＭＢＰ−ｒｐ１７の
調製 上記、メルカプトアセチル−ＭＢＰ−ｒｐ１７溶液と
２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リジン−マレイミド溶
液を混合し、３０℃で６０分間インキュベートした。反
応後、反応液をセファデックスＧ−５０ファインカラム
（ファルマシア・バイオテック・ＡＢ社）に流し、ゲル
濾過クロマトグラフィー法にて２，４−ジニトロフェニ
ル−ＭＢＰ −ｒｐ１７と未反応の低分子試薬とを分離
した。２８０ｎｍと３６０ｎｍの吸光度から求めるアイ
ゼンらの方法〔Ｅｉｓｅｎら、ジャーナル・オブ・イム
ノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第７３巻、第２９
６頁（１９５４）〕で計算されたＭＢＰ−ｒｐ１７、１
分子あたりに導入された２，４−ジニトロフェニル基の
平均の数は、３．９個であった。(2) Preparation of 2,4-dinitrophenyl-L-lysine-maleimide 30 μl of N, N-dimethylformamide solution containing 3 μmol of εN-2,4-dinitrophenyl-L-lysine
Then, 15 μl of an N, N-dimethylformamide solution containing 1.5 μmol of N-succinimidyl-6-maleimidohexanoate and 105 μl of buffer A were mixed and incubated at 30 ° C. for 90 minutes. (3) Preparation of 2,4-dinitrophenyl-MBP-rp17 The above solution of mercaptoacetyl-MBP-rp17 and 2,4-dinitrophenyl-L-lysine-maleimide solution were mixed and incubated at 30 ° C. for 60 minutes. After the reaction, the reaction solution is applied to a Sephadex G-50 fine column (Pharmacia Biotech AB), and 2,4-dinitrophenyl-MBP-rp17 is reacted with an unreacted low molecular reagent by gel filtration chromatography. Was isolated. Eisen et al. Method from the absorbance at 280 nm and 360 nm [Eisen et al., Journal of Immunology (J. Immunol.), Vol. 73, No. 29
6 (1954)], MBP-rp17, 1
The average number of 2,4-dinitrophenyl groups introduced per molecule was 3.9.
【００２６】〔ビオチニル−ＭＢＰ−ｒｐ１７の調製〕
前述の２，４−ジニトロフェニル−ＭＢＰ−ｒｐ１７の
調製工程において、下記の操作で調製されたビオシチン
−マレイミド溶液を、２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−
リジン−マレイミド溶液に置き換えて同様の操作を行い
調製した。 （１）ビオシチン−マレイミドの調製 ３．１μｍｏｌのビオシチンを含む緩衝液Ａ、１１３μ
ｌと１．５μｍｏｌのＮ−サクシニミジル−６−マレイ
ミドヘキサノエートを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド溶液３７μｌとを混合し３０℃で９０分間インキュベ
ートした。[Preparation of biotinyl-MBP-rp17]
In the preparation process of 2,4-dinitrophenyl-MBP-rp17 described above, the biocytin-maleimide solution prepared by the following operation was converted to 2,4-dinitrophenyl-L-
The same procedure was repeated, except that the lysine-maleimide solution was used. (1) Preparation of biocytin-maleimide 3.1 μmol of buffer A containing biocytin, 113 μm
was mixed with 37 μl of an N, N-dimethylformamide solution containing 1.5 μmol of N-succinimidyl-6-maleimidohexanoate and incubated at 30 ° C. for 90 minutes.
【００２７】〔ビオチニル−ｒｐ１７の調製〕 （１）メルカプトアセチル−ｒｐ１７の調製 ０．８７ｍｇ（５１ｎｍｏｌ）のｒｐ１７を含む緩衝液
Ａ、４８０μｌに５ｍｍｏｌ／ＬのＮ−サクシニミジル
−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートを含むＮ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド溶液２２．５μｌを加え、３０℃で
３０分間インキュベートした。続いて、反応液に２５μ
ｌの１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．０および
２５μｌの０．１ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０を
加えて３０℃で１０分間インキュベートし、最後に、６
０μｌの１ｍｏｌ／Ｌヒドロキシルアミンを加えて３０
℃で１０分間インキュベートした。 （２）ビオシチン−マレイミドの調製 ０．３３μｍｏｌのビオシチンを含む緩衝液Ａ、１５μ
ｌと０．２μｍｏｌのＮ−サクシニミジル−６−マレイ
ミドヘキサノエートを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド溶液４．６μｌとを混合し３０℃で９０分間インキュ
ベートした。 （３）ビオチニル−ｒｐ１７の調製 上記、メルカプトアセチル−ｒｐ１７溶液とビオシチン
−マレイミド溶液を混合し、３０℃で６０分間インキュ
ベートした。続いて、反応溶液（６３３μｌ）に１３．
３ｍｇの尿素を添加（最終濃度０．３５ｍｏｌ／Ｌ）し
た後、セファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア・
バイオテック・ＡＢ社）を用いてゲル濾過クロマトグラ
フィー法にて精製した。ｒｐ１７の１分子あたりに導入
されたビオチン残基の平均の数は、減少したチオール基
の数から０．７個と推測された。[Preparation of biotinyl-rp17] (1) Preparation of mercaptoacetyl-rp17 Buffer A containing 0.87 mg (51 nmol) of rp17, 480 μl containing 5 mmol / L N-succinimidyl-S-acetylmercaptoacetate 22.5 μl of an N, N-dimethylformamide solution was added, and the mixture was incubated at 30 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 25 μl was added to the reaction solution.
of 1 mol / L Tris-HCl buffer, pH 7.0 and 25 μl of 0.1 mol / L EDTA, pH 7.0, and incubate at 30 ° C. for 10 minutes.
Add 0 μl of 1 mol / L hydroxylamine and add 30
Incubated at 10 ° C for 10 minutes. (2) Preparation of biocytin-maleimide Buffer A containing 0.33 μmol of biocytin, 15 μm
was mixed with 4.6 μl of an N, N-dimethylformamide solution containing 0.2 μmol of N-succinimidyl-6-maleimidohexanoate and incubated at 30 ° C. for 90 minutes. (3) Preparation of biotinyl-rp17 The above-mentioned mercaptoacetyl-rp17 solution and biocytin-maleimide solution were mixed and incubated at 30 ° C for 60 minutes. Subsequently, 13.3 μl was added to the reaction solution (633 μl).
After adding 3 mg of urea (final concentration 0.35 mol / L), a Sephadex G-25 column (Pharmacia.
(Biotech AB) by gel filtration chromatography. The average number of biotin residues introduced per molecule of rp17 was estimated to be 0.7 from the reduced number of thiol groups.
【００２８】〔β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−ｒｐ１７の
調製〕メルカプトアセチル−ｒｐ１７とマレイミド−β
−Ｄ−ガラクトシダーゼを反応させる公知の方法〔橋田
ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリー・ア
ナリシス（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．）、第７
巻、第３５３頁（１９９３年）〕により調製した。[Preparation of β-D-galactosidase-rp17] Mercaptoacetyl-rp17 and maleimide-β
-A known method of reacting D-galactosidase [Hashida et al., Journal of Clinical Laboratory Analysis (J. Clin. Lab. Anal.), No. 7.
353, 1993].
【００２９】〔ビオチニル−ウシ血清アルブミンの調
製〕マレイミド基を導入したウシ血清アルブミンにＮ−
ビオチニル−２−メルカプトエチルアミンを反応させる
公知の方法〔河野ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・
ラボラトリー・アナリシス（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａ
ｎａｌ．）、第２巻、第１９頁（１９８８）〕にて、ビ
オチニル−ウシ血清アルブミンを調製した。ウシ血清ア
ルブミン１分子あたりに導入されたビオチンの平均の数
は１３個であった。[Preparation of biotinyl-bovine serum albumin] N-
A known method of reacting biotinyl-2-mercaptoethylamine [Kono et al., Journal of Clinical.
Laboratory Analysis (J. Clin. Lab. A)
nal. ), Vol. 2, p. 19 (1988)], and biotinyl-bovine serum albumin was prepared. The average number of biotins introduced per bovine serum albumin molecule was 13.
【００３０】〔アフィニティー精製ウサギ抗２，４−ジ
ニトロフェニル−ウシ血清アルブミン抗体の調製〕 （１）ウサギ抗２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清ア
ルブミン抗体の精製 ウサギ抗２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミ
ン抗血清（シバヤギ、群馬）より塩析とイオン交換クロ
マトグラフィーを用いる公知の方法〔石川ら、ジャーナ
ル・オブ・イムノアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ）、第４巻、第２０９頁（１９８３年）〕にて抗２，
４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン抗体を精製
した。 （２）２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン
の調製 チオール基を導入したウシ血清アルブミンに、Ｎ−サク
シニミジル−６−マレイミドヘキサノエートを介してε
Ｎ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リジンを反応させ
る公知の方法〔橋田ら、ジャーナル・オブ・クリニカル
・ラボラトリー・アナリシス（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ
Ａｎａｌ）、第８巻、第８６頁（１９９４）〕により
２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミンを調製
した。ウシ血清アルブミン１分子あたりに結合した２，
４−ジニトロフェニル基の平均の数は６個であった。 （３）蛋白−セファローズ４Ｂの調製 ２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミンは、フ
ァルマシア社の手引書に従ってＣＮＢｒ−活性化セファ
ローズ４Ｂに不溶化した。 （４）アフィニティー精製ウサギ抗２，４−ジニトロフ
ェニル−ウシ血清アルブミン抗体の調製 ウサギ抗２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミ
ン抗体（ＩｇＧ）溶液を２，４−ジニトロフェニル−ウ
シ血清アルブミンカラムに吸着後、ｐＨ２．５で溶出す
る公知の方法〔橋田ら、アナリティカル・レターズ（Ａ
ｎａｌ．Ｌｅｔｔ．）、第１６巻、第３１頁（１９８
３）〕によりアフィニティー精製した。[Preparation of affinity purified rabbit anti-2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin antibody] (1) Purification of rabbit anti-2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin antibody Rabbit anti-2,4-dinitrophenyl-bovine A known method using salting out and ion exchange chromatography from serum albumin antiserum (Shibagoat, Gunma) [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay (J. Immunoassa).
y), Vol. 4, p. 209 (1983)]
The 4-dinitrophenyl-bovine serum albumin antibody was purified. (2) Preparation of 2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin Bovine serum albumin into which a thiol group was introduced was subjected to ε via N-succinimidyl-6-maleimidohexanoate.
A known method of reacting N-2,4-dinitrophenyl-L-lysine [Hashida et al., Journal of Clinical Laboratory Analysis (J Clin Lab)
Anal, Vol. 8, p. 86 (1994)] to prepare 2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin. 2, bound per molecule of bovine serum albumin
The average number of 4-dinitrophenyl groups was 6. (3) Preparation of protein-Sepharose 4B 2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin was insolubilized in CNBr-activated Sepharose 4B according to the manual of Pharmacia. (4) Preparation of affinity purified rabbit anti-2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin antibody A rabbit anti-2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin antibody (IgG) solution was applied to a 2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin column. After adsorption, elution is carried out at pH 2.5 [Hashida et al., Analytical Letters (A
nal. Lett. ), Volume 16, Page 31 (198
3) Affinity purification was performed.
【００３１】〔各種ｒｐ１７抗原不溶化ポリスチレンビ
ーズの調製〕ポリスチレンビーズ（直径３．２ｍｍ、イ
ムノケミカル社、岡山）への一番目の蛋白質の不溶化
は、物理的吸着にて行う公知の方法〔石川ら、スカンジ
ナビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｓｃａｎ
ｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）、第８巻（補７）、第４３頁
（１９７８）〕、〔橋田ら、ジャーナル・オブ・クリニ
カル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．）、第３３巻、第２９８頁（１９９５）〕
にて行った後、順次各蛋白質を反応させて調製した。 （１）ウシ血清アルブミン−ストレプトアビジン−ＭＢ
Ｐ−ｒｐ１７固相の調製 ビオチニル−ウシ血清アルブミン（０．１ｍｇ／ｍｌ、
１ｇ／Ｌアジ化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）を不溶化したポリス
チレンビーズにストレプトアビジン（０．１ｍｇ／ｍ
ｌ、１ｇ／Ｌのアジ化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／
Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）を一夜反応さ
せ、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃに
より洗浄後、それぞれのポリスチレンビーズをビオチニ
ル−ＭＢＰ−ｒｐ１７（５０〜１０００ｆｍｏｌ／１５
０μｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝液
Ｃ）と一夜反応させ調製した（図１、Ａ）。 （２）ウシ血清アルブミン−ストレプトアビジン−ｒｐ
１７固相の調製 （１）において、ビオチニル−ＭＢＰ−ｒｐ１７のかわ
りに、ビオチニル−ｒｐ１７（１００〜４０００ｆｍｏ
ｌ）を用いて調製した（図１、Ｂ）。 （３）抗２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミ
ン抗体−ＭＢＰ−ｒｐ１７固相の調製 アフィニティー精製ウサギ抗２，４−ジニトロフェニル
抗体（０．１ｍｇ／ｍｌ、１ｇ／Ｌアジ化ナトリウムを
含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
７．５）を不溶化し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム
を含む緩衝液Ｃにより洗浄した後、それぞれのポリスチ
レンビーズを２，４−ジニトロフェニル−ＭＢＰ−ｒｐ
１７（５０−３００ｆｍｏｌ／１５０μｌ、０．１ｍｏ
ｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃ）と一夜反応させ
て調製した（図１、Ｃ）。 （４）ストレプトアビジン−ＭＢＰ−ｒｐ１７固相の調
製 ストレプトアビジン（５〜５０μｇ／ｍｌ、１ｇ／Ｌア
ジ化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７．５）を不溶化し、０．１ｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃにより洗浄した後、それ
ぞれのポリスチレンビーズをビオチニル−ＭＢＰ−ｒｐ
１７（５０〜１０００ｆｍｏｌ／１５０μｌ、０．１ｍ
ｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃ）と一夜反応さ
せ調製した（図１、Ｄ）。[Preparation of Various rp17 Antigen-Insolubilized Polystyrene Beads] The first protein is insolubilized into polystyrene beads (3.2 mm in diameter, Immunochemical, Okayama) by a known method performed by physical adsorption [Ishikawa et al. Scandinavian Journal of Immunology (Scan)
d. J. Immunol), Volume 8 (Supplement 7), Page 43 (1978)], [Hashida et al., Journal of Clinical Microbiology (J. Clin. Micr).
obiol. 33), p. 298 (1995)]
After that, each protein was sequentially reacted and prepared. (1) Bovine serum albumin-streptavidin-MB
Preparation of P-rp17 solid phase Biotinyl-bovine serum albumin (0.1 mg / ml,
Streptavidin (0.1 mg / m2) was added to polystyrene beads in which 0.1 mol / L sodium phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 g / L sodium azide was insolubilized.
0.1 mol / l containing 1 g / L sodium azide
L sodium phosphate buffer, pH 7.5) and reacted with buffer C containing 0.1 mol / L sodium chloride. After that, each polystyrene bead was treated with biotinyl-MBP-rp17 (50-1000 fmol / 15).
It was prepared by reacting overnight with 0 μl of a buffer C containing 0.1 mol / L sodium chloride (FIG. 1, A). (2) Bovine serum albumin-streptavidin-rp
Preparation of Solid Phase 17 In (1), instead of biotinyl-MBP-rp17, biotinyl-rp17 (100-4000 fmo)
1) (FIG. 1, B). (3) Preparation of anti-2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin antibody-MBP-rp17 solid phase Affinity purified rabbit anti-2,4-dinitrophenyl antibody (0.1 mg / ml, containing 1 g / L sodium azide .1 mol / L sodium phosphate buffer, pH
7.5) was insolubilized and washed with buffer C containing 0.1 mol / L sodium chloride, and then each polystyrene bead was treated with 2,4-dinitrophenyl-MBP-rp.
17 (50-300 fmol / 150 μl, 0.1 mol
1 / L sodium chloride (buffer solution C) and reacted overnight (FIG. 1, C). (4) Preparation of streptavidin-MBP-rp17 solid phase Streptavidin (5 to 50 μg / ml, 0.1 mol / L sodium phosphate buffer containing 1 g / L sodium azide, pH 7.5) was insolubilized, and .1mol / L
After washing with buffer C containing sodium chloride, each polystyrene bead was washed with biotinyl-MBP-rp.
17 (50-1000 fmol / 150 μl, 0.1 m
ol / L sodium chloride (buffer solution C) overnight and prepared (FIG. 1, D).
【００３２】〔β−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定〕
β−Ｄ−ガラクトシダーゼの測定は、４−メチルウンベ
リフェリルガラクトシドを基質とする公知の方法〔今川
ら、アンナルス・クリニカル・バイオケミストリー（Ａ
ｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第２１巻、第３
１０頁（１９８４）〕で反応させ、生成した４−メチル
ウンベリフェロンの蛍光強度を分光蛍光光度計（ＲＦ−
５１０、島津製作所、京都）で測定した。蛍光値は、１
×１０-8ｍｏｌ／Ｌの４−メチルウンベリフェロンの示
す蛍光強度を１００として補正を行った。[Measurement of β-D-galactosidase activity]
β-D-galactosidase can be measured by a known method using 4-methylumbelliferyl galactoside as a substrate [Imakawa et al., Annals Clinical Biochemistry (A
nn. Clin. Biochem. ), Volume 21, Volume 3
10 (1984)], and the fluorescence intensity of 4-methylumbelliferone produced was measured using a spectrofluorometer (RF-
510, Shimadzu Corporation, Kyoto). The fluorescence value is 1
Correction was performed with the fluorescence intensity of 4-methylumbelliferone of 10-8 mol / L as 100.
【００３３】〔検体中の抗ｐ１７抗体の測定〕ｒｐ１７
抗原を不溶化した各種固相に対するＨＩＶ−１抗体陰性
検体および陽性検体の反応性を調べた。陰性検体として
は０．４ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃを、
陽性検体としては感染者血清を同緩衝液で１０4 倍に希
釈したものを用いた。各検体１０μｌと同緩衝液１４０
μｌを含む溶液に、ｒｐ１７を様々な方法で不溶化した
ポリスチレンビーズ１個を浸し、室温で一晩反応させ
た。ポリスチレンビーズは、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナト
リウムを含む緩衝液Ｃ、２ｍｌで２回洗浄した後、不活
性β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｍｕｔｅｉｎ、ベーリン
ガー・マンハイム社）５０μｇ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ−ｒｐ１７、１００ｆｍｏｌおよび０．４ｍｏｌ／
Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃ、１５０μｌ中で室温
で３．５時間反応させた。ポリスチレンビーズを上記と
同様の方法で洗浄した後、ポリスチレンビーズに結合し
たβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性を測定した。また、
各検体を含む反応液１５０μｌ中に抗ＨＩＶ−１抗体陰
性の正常血清１０μｌが添加された検体液と各種ポリス
チレンビーズを反応させて、上記と全く同様のアッセイ
を行った。[Measurement of Anti-p17 Antibody in Sample] rp17
The reactivity of the HIV-1 antibody negative sample and the positive sample with various solid phases in which the antigen was insolubilized was examined. Buffer C containing 0.4 mol / L sodium chloride as a negative sample,
As positive specimens were used as the infected person sera were diluted 104 times with the same buffer. 10 μl of each sample and the same buffer 140
One polystyrene bead in which rp17 was insolubilized by various methods was immersed in a solution containing μl, and reacted at room temperature overnight. The polystyrene beads were washed twice with 2 ml of buffer C containing 0.1 mol / L sodium chloride, then 50 μg of inactive β-D-galactosidase (Mutein, Boehringer Mannheim), β-D-galactosidase-rp17, 100 fmol and 0.4 mol /
The reaction was carried out at room temperature for 3.5 hours in 150 μl of buffer C containing L sodium chloride. After washing the polystyrene beads in the same manner as described above, the activity of β-D-galactosidase bound to the polystyrene beads was measured. Also,
The same assay as described above was performed by reacting various polystyrene beads with a sample solution to which 10 μl of anti-HIV-1 antibody-negative normal serum was added in 150 μl of a reaction solution containing each sample.
【００３４】正常血清を含まない場合と含む場合それぞ
れにおいて、各固相を抗ＨＩＶ−１抗体陰性検体および
陽性血清と各固相を反応させたときに、アッセイ後固相
に結合していたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定値
を表１に示す。なお、各種ｒｐ１７不溶化固相を作製す
る際に、反応させる構成物質の量を様々に変えて固相を
作製し検討を行ったが、表１には、それら固相を各々用
いてアッセイを行った中で最も陽性検体における活性値
が高値を示した例を、各形態の固相における測定値とし
て記載した。When the solid phase was reacted with the anti-HIV-1 antibody-negative sample and the positive serum in each of the cases where no normal serum was contained and in the case where normal serum was not contained, β- Table 1 shows the measured values of the activity of -D-galactosidase. In preparing various rp17-insolubilized solid phases, solid phases were prepared by changing the amount of constituents to be reacted in various ways, and a study was conducted. Table 1 shows that an assay was performed using each of these solid phases. The examples in which the activity value in the most positive specimen showed the highest value among them were described as the measured values in the solid phase of each form.
【００３５】比較例１ 本比較例では、検体中の抗ＨＩＶ−１，ｐ１７抗体の測
定を従来の公知の方法により作製されたｒｐ１７固相を
用いて行った。各物質の精製・調製の詳細は下記以外
は、実施例１と全て同じである。 〔各種ｒｐ１７抗原不溶化ポリスチレンビーズの調製〕 （１）ｒｐ１７固相の調製 ｒｐ１７（１〜１００μｇ／ｍｌ、１ｇ／Ｌのアジ化ナ
トリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．５）を反応させ調製した（図１、Ｅ）。 （２）ＭＢＰ−ｒｐ１７固相の調製 ＭＢＰ−ｒｐ１７（１〜１００μｇ／ｍｌ、１ｇ／Ｌの
アジ化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ７．５）を反応させ調製した（図１、
Ｆ）。 （３）ストレプトアビジン−ｒｐ１７固相の調製 ストレプトアビジン（５〜５０μｇ／ｍｌ、１ｇ／Ｌの
アジ化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ７．５）を不溶化し、０．１ｍｏｌ／
Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃにより洗浄した後、そ
れぞれのポリスチレンビーズをビオチニル−ｒｐ１７
（１００〜４０，０００ｆｍｏｌ／１５０μｌ、０．１
ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃ）と一夜反応
させ調製した（図１、Ｇ）。Comparative Example 1 In this comparative example, the measurement of anti-HIV-1 and p17 antibodies in a sample was carried out using an rp17 solid phase prepared by a conventionally known method. Details of purification and preparation of each substance are the same as those in Example 1 except for the following. [Preparation of various rp17 antigen-insoluble polystyrene beads] (1) Preparation of rp17 solid phase rp17 (1 to 100 µg / ml, 0.1 mol / L sodium phosphate buffer containing 1 g / L sodium azide, pH 7.5) (FIG. 1, E). (2) Preparation of MBP-rp17 solid phase MBP-rp17 (1 to 100 μg / ml, 0.1 mol / L sodium phosphate buffer containing 1 g / L sodium azide, pH 7.5) was reacted and prepared. Figure 1,
F). (3) Preparation of Streptavidin-rp17 Solid Phase Streptavidin (5 to 50 μg / ml, 0.1 mol / L sodium phosphate buffer containing 1 g / L sodium azide, pH 7.5) was insolubilized, and 0.1% was dissolved. 1 mol /
After washing with buffer C containing L sodium chloride, each polystyrene bead was washed with biotinyl-rp17.
(100-40,000 fmol / 150 μl, 0.1
It was prepared by reacting overnight with a buffer C) containing mol / L sodium chloride (FIG. 1, G).
【００３６】〔検体中の抗ｒｐ１７抗体の測定〕上記３
種類のｒｐ１７不溶化ポリスチレンビーズを用いて、実
施例１と同様の操作を行い、各固相に対する抗ＨＩＶ−
１抗体陰性検体および陽性検体中の抗ｐ１７抗体の反応
性を１０μｌの正常血清を含む系と含まない系で調べ
た。ただし、ｒｐ１７固相およびＭＢＰ−ｒｐ１７固相
を用いた測定における陽性検体は、感染者血清を０．４
ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃで１０3 倍
希釈したものを用いた。[Measurement of anti-rp17 antibody in sample]
Using the same type of rp17 insolubilized polystyrene beads, the same operation as in Example 1 was performed, and the anti-HIV-
The reactivity of the anti-p17 antibody in one antibody negative sample and the positive sample was examined in a system containing 10 μl of normal serum and a system not containing it. However, the positive sample in the measurement using the rp17 solid phase and the MBP-rp17 solid phase was 0.4% of the serum of the infected person.
It was prepared by diluting 10 3-fold with buffer C containing mol / L sodium chloride.
【００３７】結果を表１に、実施例１の結果と並べて示
した。なお、実施例１と同様、各固相において様々に条
件を変えて作製された中で最も陽性検体における測定値
が高値を示した例を、各形態の固相における値として記
載した。固相により陽性検体の測定希釈倍率が一部異な
るため、測定値は一律１０3 倍希釈での値となるよう
に希釈率の差を乗じて補正した値で示した。The results are shown in Table 1 together with the results of Example 1. As in Example 1, an example in which the measured value of the most positive specimen showed a high value among the solid phases prepared under various conditions was described as the value of the solid phase in each mode. Since the measurement dilution ratio of the positive sample is partially different depending on the solid phase, the measurement value is shown as a value corrected by multiplying the difference in the dilution ratio so as to be a value uniformly at 10 3 -fold dilution.
【００３８】[0038]
【表１】 [Table 1]
【００３９】実施例２ 本実施例では、本願発明法により調製した固相を用い
て、検体中の抗ＨＩＶ−１、ｐ１７抗体の検出感度に関
する実験を行った。各物質の精製・調製方法は実施例１
と同じである。 〔検体中の抗ｐ１７抗体の測定〕２種類の抗ＨＩＶ−１
抗体陽性血清を各々抗体陰性正常プール血清で順次希釈
したものを検体とし、固相として実施例１で作製したウ
シ血清アルブミン−ストレプトアビジン−ＭＢＰ−ｒｐ
１７固相（図１、Ａ）を用いて、検体中の抗ＨＩＶ−
１、ｐ１７抗体の検出を行った。両血清の各希釈検体に
おける測定値を表２に示した。また、対照として同じ固
相を用いて、陰性血清５０例についてアッセイしたとき
の測定結果（平均値および標準偏差）も表中に示した。Example 2 In this example, an experiment was conducted on the detection sensitivity of anti-HIV-1 and p17 antibodies in a sample using the solid phase prepared by the method of the present invention. The purification / preparation method of each substance is described in Example 1.
Is the same as [Measurement of anti-p17 antibody in sample] Two types of anti-HIV-1
A sample obtained by serially diluting the antibody-positive serum with the antibody-negative normal pool serum was used as a sample, and the bovine serum albumin-streptavidin-MBP-rp prepared in Example 1 was used as a solid phase.
Using 17 solid phases (FIG. 1, A), anti-HIV-
1. The p17 antibody was detected. Table 2 shows the measured values of each serum sample for each diluted sample. In addition, the measurement results (mean value and standard deviation) obtained by assaying 50 negative sera using the same solid phase as a control are also shown in the table.
【００４０】比較例２ 本比較例では、従来の技術で作製したＨＩＶ−１，ｐ１
７不溶化固相を用いて実施例２と同じ検体についてアッ
セイを行い、抗ＨＩＶ−１、ｐ１７抗体の検出感度の比
較実験を行った。各物質の精製・調製方法は実施例１お
よび比較例１と同じである。 〔抗ｐ１７抗体のウェスタン・ブロッティング検出〕ウ
ェスタン・ブロットキット「ＨＩＶ−オルソ」（Ｏｒｔ
ｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ニュー
・ジャージー州、米国）を用い、キットの操作手順書に
従って行った。Comparative Example 2 In this comparative example, HIV-1, p1 produced by a conventional technique were used.
The same sample as in Example 2 was assayed using the 7 insolubilized solid phase, and a comparative experiment was performed on the detection sensitivity of anti-HIV-1 and p17 antibodies. The purification / preparation method of each substance is the same as in Example 1 and Comparative Example 1. [Western blotting detection of anti-p17 antibody] Western blot kit "HIV-ortho" (Ort
ho Diagnostic Systems, New Jersey, U.S.A.) according to the kit operating instructions.
【００４１】〔検体中の抗ｐ１７抗体の測定〕実施例２
と同一の希釈試料を検体とし、比較例１で作製したｒｐ
１７固相（図１、Ｅ）を用いて検体中の抗ＨＩＶ−１、
ｐ１７抗体の検出を行った。さらに、同一検体について
ウェスタン・ブロッティングを行い、抗ｐ１７抗体のバ
ンドの発現の有無を調べた。結果を表２に、実施例２の
結果と並べて示した。「ＨＩＶ−オルソ」の結果は、ｐ
１７抗原に対する反応の有無（＋、−）で表した。[Measurement of Anti-p17 Antibody in Sample] Example 2
Rp prepared in Comparative Example 1
Using 17 solid phases (FIG. 1, E), anti-HIV-1,
The p17 antibody was detected. Furthermore, the same sample was subjected to Western blotting, and the presence or absence of the expression of an anti-p17 antibody band was examined. The results are shown in Table 2 along with the results of Example 2. The result of "HIV-ortho" is p
The presence or absence of a reaction to 17 antigens (+,-) was expressed.
【００４２】[0042]
【表２】 [Table 2]
【００４３】実施例３ 本実施例では、本願発明法により調製した固相を用い
て、ＨＩＶ−１陽性転化パネル血清中の抗ｐ１７抗体の
測定を行い、早期検出に関する検討を行った。各物質の
精製・調製方法は実施例１と同じである。 〔ＨＩＶ−１陽性転化パネル血清〕ＨＩＶ−１陽性転化
パネル血清は、ノース・アメリカン・バイオロジカルズ
社（フロリダ州、米国）およびボストン・バイオメディ
カ社（マサチューセッツ州、米国）より購入した。Example 3 In this example, the anti-p17 antibody in the HIV-1 positively converted panel serum was measured using the solid phase prepared by the method of the present invention, and the early detection was examined. The purification / preparation method of each substance is the same as in Example 1. [HIV-1 Positive Converted Panel Sera] HIV-1 positive converted panel sera was purchased from North American Biologicals (Florida, USA) and Boston Biomedica (Massachusetts, USA).
【００４４】〔パネル血清中の抗ｐ１７抗体の測定〕５
種類のＨＩＶ−１陽性転化パネル血清を検体とし、固相
として実施例１で作製したウシ血清アルブミン−ストレ
プトアビジン−ＭＢＰ−ｒｐ１７固相（図１、Ａ）を用
いて、検体中の抗ＨＩＶ−１、ｐ１７抗体の検出を行っ
た。それぞれのパネル血清の各採血日の検体における測
定値を表３に示す。[Measurement of anti-p17 antibody in panel serum]
Using the HIV-1 positive converted panel sera as a sample, and using the bovine serum albumin-streptavidin-MBP-rp17 solid phase (FIG. 1, A) prepared in Example 1 as a solid phase, anti-HIV- 1. The p17 antibody was detected. Table 3 shows the measured values of the respective panel sera in the samples on each blood collection day.
【００４５】比較例３ 本比較例では、市販の抗ＨＩＶ−１抗体検出キットを用
いて実施例３と同じ検体についてアッセイを行い、抗Ｈ
ＩＶ−１抗体検出時期の比較実験を行った。 〔抗ＨＩＶ−１抗体検出キット〕ＥＩＡの普及キットと
して「ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−
２ ３ＲＤ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＥＩＡ」キット
（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イリノイ
州、米国）を、凝集法のキットとして「セロディア−Ｈ
ＩＶ」キット（富士レビオ、東京）を、そして、ウェス
タン・ブロット法のキットは、比較例２で用いたオルソ
・ダイアグノスティック・システムス社のキットを用い
た。測定はいずれもキットの操作手順書に従って行っ
た。各キットの測定値は、ＥＩＡキットは測定吸光度
で、凝集法キットは凝集像を示す最大検体希釈倍率で、
ウェスタン・ブロットキットは各バンドに対する反応の
有無（＋、−）で表した。Comparative Example 3 In this comparative example, the same sample as in Example 3 was assayed using a commercially available anti-HIV-1 antibody detection kit, and the anti-H
A comparative experiment of the timing of detecting the IV-1 antibody was performed. [Anti-HIV-1 Antibody Detection Kit] As a spread kit for EIA, "RECOMBINANT HIV-1 / HIV-
2 3RD GENERATION EIA "kit (Abbott Laboratories, Illinois, USA) was used as a kit for the agglutination method," Serodia-H ".
The IV kit (Fujirebio, Tokyo) and the kit for Western blotting were the kits of Ortho Diagnostic Systems used in Comparative Example 2. All the measurements were performed according to the operation manual of the kit. The measured value of each kit is the measured absorbance of the EIA kit, the maximum specimen dilution ratio of the agglutination kit showing the agglutination image,
In the Western blot kit, the presence or absence (+,-) of the reaction to each band was represented.
【００４６】〔陽性転化パネル血清の抗ＨＩＶ抗体検
出〕実施例３と同一のＨＩＶ−１陽性転化パネル血清を
検体とし、ＥＩＡキット、凝集法キットおよびウェスタ
ン・ブロット法キットを用いて抗ＨＩＶ抗体の測定を行
った。それぞれのパネル血清の各採血日の検体における
測定値を表３に、実施例３の結果と並べて示した。[Detection of anti-HIV antibody in positively converted panel serum] The same HIV-1 positively converted panel serum as in Example 3 was used as a sample, and the anti-HIV antibody was detected using an EIA kit, an agglutination kit and a Western blot kit. A measurement was made. Table 3 shows the measured values of the panel sera in the samples on each blood collection day, along with the results of Example 3.
【００４７】[0047]
【表３】 [Table 3]
【００４８】実施例４ 本実施例では、ＨＩＶ−１のｐ２４抗原を２種以上の蛋
白質を介して不溶化した固相を用いて抗ＨＩＶ−１抗体
を含む検体（陽性検体）および含まない検体（陰性検
体）の反応性の違いを、血清成分共存下、非共存下でそ
れぞれ調べた。各物質の精製・調製の詳細、および実験
手順の詳細は以下の通りである。 〔遺伝子組み換えＨＩＶ−１，ｐ２４抗原（ｒｐ２４）
の調製〕遺伝子組み換えｐ２４（ｒｐ２４）は、実施例
１に記載のｒｐ１７の調製法と同様、ＭＢＰとの融合蛋
白質として大腸菌で発現させ、ＭＢＰ−ｒｐ２４として
いったん精製した後、Ｘａ因子でＭＢＰを切断して調製
した。Example 4 In this example, a sample containing an anti-HIV-1 antibody (positive sample) and a sample containing no anti-HIV-1 antibody (positive sample) were obtained using a solid phase in which the HIV-1 p24 antigen was insolubilized via two or more proteins. The difference in reactivity of the negative sample) was examined in the presence and absence of serum components. The details of the purification and preparation of each substance and the details of the experimental procedure are as follows. [Genetically modified HIV-1, p24 antigen (rp24)
Preparation] The recombinant p24 (rp24) was expressed in Escherichia coli as a fusion protein with MBP in the same manner as in the preparation method of rp17 described in Example 1, and once purified as MBP-rp24, MBP was digested with factor Xa. Prepared.
【００４９】〔β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−ｒｐ２４の
調製〕前出のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−ｒｐ１７と同
様の方法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−ｒｐ２４を
調製した。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１分子あたりに結
合したｒｐ２４の平均の数は約２分子であった。[Preparation of β-D-galactosidase-rp24] β-D-galactosidase-rp24 was prepared in the same manner as in the aforementioned β-D-galactosidase-rp17. The average number of rp24 bound per molecule of β-D-galactosidase was about 2 molecules.
【００５０】〔２，４−ジニトロフェニル−ＭＢＰ−ｒ
ｐ２４の調製〕前出の２，４−ジニトロフェニル−ＭＢ
Ｐ−ｒｐ１７と同様の方法により２，４−ジニトロフェ
ニル−ＭＢＰ−ｒｐ２４を調製した。ＭＢＰ−ｒｐ２
４、１分子あたりに導入された２，４−ジニトロフェニ
ル基の平均の数は、２．９個であった。[2,4-dinitrophenyl-MBP-r
Preparation of p24] 2,4-dinitrophenyl-MB described above
2,4-Dinitrophenyl-MBP-rp24 was prepared in the same manner as for P-rp17. MBP-rp2
4. The average number of 2,4-dinitrophenyl groups introduced per molecule was 2.9.
【００５１】〔ｒｐ２４抗原不溶化ポリスチレンビーズ
の調製〕アフィニティー精製ウサギ抗２，４−ジニトロ
フェニル−ウシ血清アルブミン抗体（０．１ｍｇ／ｍ
ｌ、１ｇ／Ｌアジ化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）を不溶化し、
０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃにより
洗浄した後、ポリスチレンビーズを２，４−ジニトロフ
ェニル−ＭＢＰ−ｒｐ２４（５０〜３００ｆｍｏｌ／１
５０μｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝
液Ｃ）と一夜反応させて調製した（図２、Ｈ）。[Preparation of rp24 antigen-insolubilized polystyrene beads] Affinity purified rabbit anti-2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin antibody (0.1 mg / m2)
0.1g / L containing 1g / L sodium azide
Sodium phosphate buffer, pH 7.5)
After washing with buffer C containing 0.1 mol / L sodium chloride, the polystyrene beads were washed with 2,4-dinitrophenyl-MBP-rp24 (50 to 300 fmol / 1).
It was prepared by reacting overnight with 50 μl of a buffer solution C containing 0.1 mol / L sodium chloride (FIG. 2, H).
【００５２】〔検体中の抗ｐ２４抗体の測定〕上記抗
２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン抗体−
ＭＢＰ−ｒｐ２４不溶化ポリスチレンビーズを用いて、
実施例１の抗ｐ１７抗体の測定方法と同様の操作を行
い、抗ＨＩＶ−１抗体陰性検体および陽性検体（１０3
倍希釈）の反応性を１０μｌの抗ＨＩＶ−１抗体陰性正
常血清を含む系と含まない系で調べた。結果を表４に示
した。なお、ＭＢＰ−ｒｐ２４の量を５０〜３００ｆｍ
ｏｌ／１５０μｌと変えて固相を調製したうち、最も陽
性検体が高値を示した例を表４に記載した。[Measurement of Anti-p24 Antibody in Sample] The above-mentioned anti-2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin antibody
Using MBP-rp24 insolubilized polystyrene beads,
The same operation as the method for measuring the anti-p17 antibody in Example 1 was performed, and the anti-HIV-1 antibody negative sample and the positive sample (10 3
The doubling dilution was tested for the system with and without 10 μl of anti-HIV-1 antibody negative normal serum. The results are shown in Table 4. In addition, the amount of MBP-rp24 is set to 50 to 300 fm.
Table 4 shows examples in which the most positive sample showed a high value among the solid phases prepared by changing the solid phase to ol / 150 μl.
【００５３】比較例４ 本比較例では、抗ＨＩＶ−１，ｐ２４抗体の測定を従来
の公知の方法により不溶化したｒｐ２４固相を用いて行
った。各物質の精製、調製の詳細は下記以外、実施例１
および４と同様である。 〔ｒｐ２４抗原不溶化ポリスチレンビーズの調製〕精製
ｒｐ２４（５〜５０μｇ／ｍｌ、１ｇ／Ｌのアジ化ナト
リウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．５）を反応させ調製した（図２、Ｉ）。Comparative Example 4 In this comparative example, the measurement of anti-HIV-1 and p24 antibodies was carried out using a rp24 solid phase insolubilized by a conventionally known method. The details of purification and preparation of each substance are as follows, except for the following.
And 4. [Preparation of rp24 antigen-insoluble polystyrene beads] Purified rp24 (5 to 50 µg / ml, 0.1 mol / L sodium phosphate buffer containing 1 g / L sodium azide, pH 7.5) was reacted and prepared (FIG. 2). , I).
【００５４】〔検体中の抗ｐ２４抗体の測定〕上記ｒｐ
２４抗原不溶化ポリスチレンビーズを用いて、実施例４
と同様の測定を行った。結果を表４に、実施例４の結果
と並べて示す。[Measurement of Anti-p24 Antibody in Sample]
Example 4 using 24 antigen insolubilized polystyrene beads
The same measurement was performed. The results are shown in Table 4 along with the results of Example 4.
【００５５】[0055]
【表４】 [Table 4]
【００５６】実施例５ 本実施例では、ＨＩＶ−１の逆転写酵素（ＲＴ）抗原を
２種以上の蛋白質を介して不溶化した固相を用いて抗Ｈ
ＩＶ−１抗体を含む検体（陽性検体）および含まない検
体（陰性検体）の反応性の違いを、血清成分共存下、非
共存下で調べた。各物質の精製・調製および実験手順の
詳細は以下の通りである。 〔遺伝子組み換えＨＩＶ−１，ＲＴ抗原（ｒＲＴ）の調
製〕遺伝子組み換えＲＴ（ｒＲＴ）は、蛋白質をコード
するｃＤＮＡを含む発現プラスミドを大腸菌に組み込ん
で発現させた後、塩析および各種カラムクロマトグラフ
ィー法にて精製を行う公知の方法〔斉藤ら、マイクロバ
イオロジー・アンド・イムノロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第３４巻、第５０９頁
（１９９０）〕に従って調製した。Example 5 In this example, an anti-H enzyme was prepared using a solid phase in which the reverse transcriptase (RT) antigen of HIV-1 was insolubilized via two or more proteins.
The difference in reactivity between a sample containing the IV-1 antibody (positive sample) and a sample not containing the antibody (negative sample) was examined in the presence and absence of serum components. The details of the purification / preparation of each substance and the experimental procedure are as follows. [Preparation of Recombinant HIV-1, RT Antigen (rRT)] Recombinant RT (rRT) is prepared by incorporating an expression plasmid containing a cDNA encoding a protein into Escherichia coli and expressing it, followed by salting out and various column chromatography methods. [Saito et al., Microbiology and Immunology (Microbio)
l. & Immunol. ), 34, 509 (1990)].
【００５７】〔２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清ア
ルブミン−ｒＲＴの調製〕 （１）２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン
の調製 実施例１の方法により調製した。 （２）２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン
−ｒＲＴの調製 Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエートを
用いてマレイミド基を導入した２，４−ジニトロフェニ
ル−ウシ血清アルブミンと、Ｎ−サクシニミジル−Ｓ−
アセチルメルカプトアセテートを用いてメルカプトアセ
チル基を導入したｒＲＴを反応させて２，４−ジニトロ
フェニル−ウシ血清アルブミン−ｒＲＴを調製する公知
の方法〔橋田ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボ
ラトリー・アナリシス（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａ
ｌ．）、第７巻、第３５３頁（１９９３）〕によった。
２，４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン１分子
あたりに結合したｒＲＴの平均の数は、約３個であっ
た。[Preparation of 2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin-rRT] (1) Preparation of 2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin Prepared by the method of Example 1. (2) Preparation of 2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin-rRT 2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin having a maleimide group introduced using N-succinimidyl-6-maleimidohexanoate, and N-succinimidyl -S-
A known method for preparing 2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin-rRT by reacting rRT into which a mercaptoacetyl group has been introduced using acetylmercaptoacetate [Hashida et al., Journal of Clinical Laboratory Analysis (J Clin.Lab.Ana
l. ), Vol. 7, p. 353 (1993)].
The average number of rRT bound per molecule of 2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin was about 3.
【００５８】〔β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−ｒＲＴの調
製〕 （１）メルカプトアセチル−ｒＲＴの調製 上記の方法により調製した。 （２）マレイミド−チオピリジル−β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼの調製 ４、４’−ジチオピリジンを用いてチオピリジル−β−
Ｄ−ガラクトシダーゼを調製した後、Ｎ−サクシニミジ
ル−６−マレイミドヘキサノエートを用いてマレイミド
−チオピリジル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを調製する
公知の方法〔橋中ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカ
ル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ）、第１７２巻、第１７９頁（１９９４）〕によっ
た。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１分子当たりに１〜２個
のマレイミド基が導入された。 （３）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−ｒＲＴの調製 メルカプトアセチル−ｒＲＴとマレイミド−チオピリジ
ル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを反応させてβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ−ｒＲＴを調製する公知の方法〔橋中
ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（前
出）〕によった。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１分子あた
りに結合したｒＲＴの数は、１〜２個であった。[Preparation of β-D-galactosidase-rRT] (1) Preparation of mercaptoacetyl-rRT Prepared by the above method. (2) Preparation of maleimide-thiopyridyl-β-D-galactosidase Thiopyridyl-β- using 4,4′-dithiopyridine
After preparing D-galactosidase, a known method for preparing maleimide-thiopyridyl-β-D-galactosidase using N-succinimidyl-6-maleimidohexanoate [Hashinaka et al., Journal of Immunological Methods ( J. Immunol.Method
s), Vol. 172, p. 179 (1994)]. One to two maleimide groups were introduced per molecule of β-D-galactosidase. (3) Preparation of β-D-galactosidase-rRT A known method of reacting mercaptoacetyl-rRT with maleimide-thiopyridyl-β-D-galactosidase to prepare β-D-galactosidase-rRT [Hashinaka et al., Journal. Of Immunological Methods (supra)]. The number of rRT bound per molecule of β-D-galactosidase was 1-2.
【００５９】〔ｒＲＴ抗原不溶化ポリスチレンビーズの
調製〕アフィニティー精製ウサギ抗２，４−ジニトロフ
ェニル−ウシ血清アルブミン抗体（０．１ｍｇ／ｍＬ緩
衝液Ａ）を不溶化したポリスチレンビーズに、２，４−
ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン−ｒＲＴ（５０
〜３００ｆｍｏｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを
含む緩衝液Ａ）を反応させ調製した（図３、Ｊ）。[Preparation of rRT antigen-insolubilized polystyrene beads] Affinity-purified rabbit anti-2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin antibody (0.1 mg / mL buffer A) was immobilized on 2,4-polystyrene beads.
Dinitrophenyl-bovine serum albumin-rRT (50
~ 300 fmol, buffer solution A containing 0.1 mol / L sodium chloride was prepared by reaction (Fig. 3, J).
【００６０】〔検体中の抗ＲＴ抗体の測定〕上記抗２，
４−ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン−ｒＲＴ不
溶化ポリスチレンビーズを用いて、実施例１の抗ｐ１７
抗体の測定と同様の操作を行い、抗ＨＩＶ−１抗体陰性
検体および陽性検体の反応性を１０μｌの抗ＨＩＶ−１
抗体陰性血清を含む系と含まない系で調べた。測定結果
を表５に示した。なお、２，４−ジニトロフェニル−ウ
シ血清アルブミン−ｒＲＴの量を５０〜３００ｆｍｏｌ
と変えて固相を調製したうち、最も陽性検体が高値を示
した例を表５に記載した。[Measurement of anti-RT antibody in sample]
Using 4-dinitrophenyl-bovine serum albumin-rRT insolubilized polystyrene beads, the anti-p17
The same operation as the measurement of the antibody was performed, and the reactivity of the anti-HIV-1 antibody negative sample and the positive sample was determined by 10 μl of the anti-HIV-1 antibody.
The tests were performed with and without the antibody negative serum. Table 5 shows the measurement results. The amount of 2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin-rRT was adjusted to 50 to 300 fmol.
Table 5 shows examples in which the most positive sample showed a high value among the solid phases prepared in the same manner.
【００６１】比較例５ 本比較例では、抗ＨＩＶ−１，ＲＴ抗体の測定を従来の
公知の方法によりｒＲＴを不溶化した固相を用いて行っ
た。各物質の精製・調製の詳細は、下記以外実施例１お
よび５と同様である。 〔ｒＲＴ抗原不溶化ポリスチレンビーズの調製〕精製ｒ
ＲＴ（５，１０μｇ／ｍＬ、１ｇ／Ｌのアジ化ナトリウ
ムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７．５）を反応させ調製した（図３、Ｋ）。Comparative Example 5 In this comparative example, the measurement of anti-HIV-1 and RT antibodies was carried out using a solid phase in which rRT was insolubilized by a conventionally known method. The details of purification and preparation of each substance are the same as in Examples 1 and 5, except for the following. [Preparation of rRT antigen-insoluble polystyrene beads]
RT (5, 10 μg / mL, 0.1 mol / L sodium phosphate buffer containing 1 g / L sodium azide, p
H7.5) was reacted (FIG. 3, K).
【００６２】〔検体中の抗ＲＴ抗体の測定〕上記ｒＲＴ
抗原不溶化ポリスチレンビーズを用いて、実施例５と同
様の測定を行った。結果を表５に、実施例５の結果と並
べて示す。[Measurement of Anti-RT Antibody in Sample]
The same measurement as in Example 5 was performed using antigen-insoluble polystyrene beads. The results are shown in Table 5 along with the results of Example 5.
【００６３】[0063]
【表５】 [Table 5]
【００６４】実施例６ 本実施例では、検体中のＨＩＶ−１，ｐ２４抗原の測定
において、抗ｐ２４抗体（Ｆａｂ’）を２種以上の蛋白
質を介して不溶化した固相を用いて陽性検体および陰性
検体の反応性の違いを、血清成分共存下、非共存下で調
べた。各物質の精製・調製および実験手順の詳細は以下
の通りである。 〔アフィニティー精製ウサギ抗ｐ２４Ｆａｂ’の調製〕
抗ｐ２４抗血清は、ｒｐ２４をウサギに免疫して調製し
た〔橋田ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロ
バイオロジー（前出）〕。続いて、塩析とイオン交換ク
ロマトグラフィーによるＩｇＧの精製、ペプシンによる
Ｆｃ断片の消化、ｒｐ２４−非特異ウサギＩｇＧ結合カ
ラムによるアフィニティー精製、２−メルカプトエチル
アミンによる還元、の一連の操作によりアフィニティー
精製抗ｐ２４Ｆａｂ’を調製した〔橋田ら、ジャーナル
・オブ・クリニカル・ラボラトリー・アナリシス（Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．第１０巻、第３０２頁
（１９９６）〕。Example 6 In this example, in the measurement of HIV-1 and p24 antigens in a sample, a positive sample and a solid sample in which an anti-p24 antibody (Fab ') was insolubilized through two or more proteins were used. The difference in reactivity of the negative samples was examined in the presence and absence of serum components. The details of the purification / preparation of each substance and the experimental procedure are as follows. [Preparation of affinity purified rabbit anti-p24 Fab ′]
Anti-p24 antiserum was prepared by immunizing rabbits with rp24 [Hashida et al., Journal of Clinical Microbiology (supra)]. Subsequently, affinity purification of anti-p24 Fab was performed by a series of operations of purification of IgG by salting out and ion exchange chromatography, digestion of Fc fragment by pepsin, affinity purification by rp24-nonspecific rabbit IgG binding column, and reduction by 2-mercaptoethylamine. [Hashida et al., Journal of Clinical Laboratory Analysis (J.
Clin. Lab. Anal. Vol. 10, p. 302 (1996)].
【００６５】〔ビオチニル−ウシ血清アルブミン−アフ
ィニティー精製ウサギ抗ｐ２４Ｆａｂ’の調製〕Ｎ−サ
クシニミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートを用
いてチオール基を導入したウシ血清アルブミンとＮ−サ
クシニミジル−６−マレイミドヘキサノエートを用いて
マレイミド基を導入したビオシチンを反応させてビオチ
ニル−ウシ血清アルブミンを調製した。さらに、Ｎ−サ
クシニミジル−６−マレイミドヘキサノエートを用いて
マレイミド基を導入したビオチニル−ウシ血清アルブミ
ンとアフィニティー精製抗ｐ２４Ｆａｂ’を反応させて
ビオチニル−ウシ血清アルブミン−アフィニティー精製
抗ｐ２４Ｆａｂ’を調製した。[Preparation of Biotinyl-Bovine Serum Albumin-Affinity Purified Rabbit Anti-p24 Fab '] Bovine serum albumin into which a thiol group was introduced using N-succinimidyl-S-acetylmercaptoacetate and N-succinimidyl-6-maleimidohexanoate Was reacted with biocytin into which a maleimide group was introduced to prepare biotinyl-bovine serum albumin. Further, biotinyl-bovine serum albumin having a maleimide group introduced thereto was reacted with affinity-purified anti-p24Fab 'using N-succinimidyl-6-maleimidohexanoate to prepare biotinyl-bovine serum albumin-affinity-purified anti-p24Fab'.
【００６６】〔β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−マウス抗ｐ
２４モノクローナルＦａｂ’の調製〕マウス抗ｐ２４モ
ノクローナル抗体は、イノジェネティクス社（Ｉｎｎｏ
ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ベルギー）より購入し、上記ポリク
ローナル抗体と同様の操作でＦａｂ’を調製した。続い
て、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドを用いてマ
レイミド基を導入した後、大腸菌由来のβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼと反応させてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗
ｐ２４モノクローナルＦａｂ’を調製した。β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ１分子あたりに結合したＦａｂ’の平均
の数は、１．５個であった。[Β-D-galactosidase-mouse anti-p
Preparation of 24 Monoclonal Fab ′] Mouse anti-p24 monoclonal antibody was obtained from Innogenetics Inc. (Inno
Genetics, Belgium), and Fab 'was prepared in the same manner as the above polyclonal antibody. Subsequently, a maleimide group was introduced using N, N′-o-phenylenedimaleimide, and then reacted with β-D-galactosidase derived from Escherichia coli to prepare β-D-galactosidase-anti-p24 monoclonal Fab ′. The average number of Fab ′ bound per molecule of β-D-galactosidase was 1.5.
【００６７】〔ウサギ抗ｐ２４Ｆａｂ’不溶化ポリスチ
レンビーズの調製〕ビオチニル−ウシ血清アルブミン
（０．１ｍｇ／ｍｌ緩衝液Ａ）を不溶化したポリスチレ
ンビーズにストレプトアビジン（０．１ｍｇ／ｍｌ、１
ｇ／Ｌのアジ化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）を反応させ、さらに
ビオチニル−ウシ血清アルブミン−ウサギ抗ｐ２４Ｆａ
ｂ’（５０〜２００ｆｍｏｌ、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナ
トリウムを含む緩衝液Ａ）を反応させ調製した（図４、
Ｌ）。[Preparation of Rabbit Anti-p24 Fab ′ Insolubilized Polystyrene Beads] Streptavidin (0.1 mg / ml, 1 mg / ml) was added to polystyrene beads in which biotinyl-bovine serum albumin (0.1 mg / ml buffer A) was insolubilized.
g / L sodium azide in 0.1 mol / L sodium phosphate buffer, pH 7.5), and further reacted with biotinyl-bovine serum albumin-rabbit anti-p24Fa.
b ′ (buffer A containing 50 to 200 fmol, 0.1 mol / L sodium chloride) was prepared by reaction (FIG. 4,
L).
【００６８】〔検体中のｐ２４抗原の測定〕０．４ｍｏ
ｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃ中にチューブあた
り５０μｌの正常血清を含む溶液あるいは含まない溶液
をそれぞれ陰性検体とし、それらに各１００ａｍｏｌの
精製ｐ２４抗原を添加したものを陽性検体とした。これ
ら検体中に上記抗Ｆａｂ’不溶化ポリスチレンビーズ１
個を浸し、さらにチューブあたり５０μｇ不活性β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ（Ｍｕｔｅｉｎ）および１０ｆｍｏ
ｌのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−マウス抗ｐ２４Ｆａ
ｂ’を添加して（反応溶液全量１５０μｌ）、室温で一
晩振とうインキュベートした。続いて、ポリスチレンビ
ーズを洗浄した後、固相に結合したβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼの活性を３０℃１時間反応で測定した。測定結果
を表６に示した。[Measurement of p24 antigen in sample] 0.4 mo
A solution containing or not containing 50 μl of normal serum per tube in buffer C containing 1 / L sodium chloride was used as a negative sample, and a solution obtained by adding 100 amol of each purified p24 antigen to each was used as a positive sample. The anti-Fab ′ insolubilized polystyrene beads 1
Immersed in an additional 50 μg per tube of inactive β-D
-Galactosidase (Mutein) and 10 fmo
1 β-D-galactosidase-mouse anti-p24Fa
b ′ was added (total volume of the reaction solution was 150 μl), and the mixture was incubated with shaking at room temperature overnight. Subsequently, after washing the polystyrene beads, the activity of β-D-galactosidase bound to the solid phase was measured at 30 ° C. for 1 hour. Table 6 shows the measurement results.
【００６９】比較例６ 本比較例では、検体中のＨＩＶ−１，ｐ２４抗原の測定
において、抗ｐ２４抗体（ＩｇＧ）を従来の公知の方法
で不溶化した固相を用いて行った。各物質の精製・調製
および実験手順の詳細は下記以外、実施例６に記載の通
りである。〔アフィニティー精製ウサギ抗ｐ２４ＩｇＧ
不溶化ポリスチレンビーズの調製〕アフィニティー精製
ウサギ抗ｐ２４ＩｇＧ（０．１ｍｇ／ｍｌ、１ｇ／Ｌの
アジ化ナトリウムを含むリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
７．５）を反応させて調製した（図４、Ｍ）。Comparative Example 6 In this comparative example, the measurement of HIV-1 and p24 antigen in a sample was performed using a solid phase in which an anti-p24 antibody (IgG) was insolubilized by a conventionally known method. The details of the purification / preparation of each substance and the experimental procedure are as described in Example 6, except for the following. [Affinity purified rabbit anti-p24 IgG
Preparation of Insolubilized Polystyrene Beads] Affinity purified rabbit anti-p24 IgG (a sodium phosphate buffer containing 0.1 mg / ml, 1 g / L sodium azide, pH
7.5) was reacted (FIG. 4, M).
【００７０】〔検体中のｐ２４抗原の測定〕アフィニテ
ィー精製ウサギ抗ｐ２４ＩｇＧ不溶化ポリスチレンビー
ズを用いて、実施例５と同様の測定を行った。結果を表
６に、実施例６の結果と並べて示す。[Measurement of p24 Antigen in Sample] The same measurement as in Example 5 was carried out using affinity-purified rabbit anti-p24 IgG insolubilized polystyrene beads. The results are shown in Table 6 along with the results of Example 6.
【００７１】[0071]
【表６】 [Table 6]
【００７２】実施例７ 本実施例では、免疫複合体転移法を用いたＨＩＶ−１，
ｐ２４抗原の測定において、第１固相として抗ｐ２４抗
体（Ｆａｂ’）を２種類以上の蛋白質を介して不溶化し
た固相を用いて、一定量のＨＩＶ−１，ｐ２４抗原を含
む溶液の反応性の違いを、血清成分共存下、非共存下で
調べた。各物質の調製および実施手順の詳細は以下の通
りである。ただし、特に記載のないものは実施例６の方
法と同じである。 〔ウシ血清アルブミン−ストレプトアビジン固相の調
製〕実施例１と同様の方法により、ビオチニル・ウシ血
清アルブミン（３０μｇ／ｍＬ）、ついでストレプトア
ビジン（３０μｇ／ｍＬ）をマイクロプレート（マキシ
ソープ、ヌンク社）に不溶化した。ウエル当りに用いた
不溶化液は１５０μＬであった。Example 7 In this example, HIV-1,
In the measurement of p24 antigen, the reactivity of a solution containing a certain amount of HIV-1, p24 antigen was determined using a solid phase in which an anti-p24 antibody (Fab ') was insolubilized via two or more proteins as the first solid phase. Was examined in the presence and absence of serum components. The details of the preparation and implementation procedures for each substance are as follows. However, those not particularly described are the same as the method of the sixth embodiment. [Preparation of bovine serum albumin-streptavidin solid phase] In the same manner as in Example 1, biotinyl / bovine serum albumin (30 µg / mL) and then streptavidin (30 µg / mL) were microplated (Maxisorp, Nunc). Insolubilized. The amount of the insolubilized solution used per well was 150 μL.
【００７３】〔ビオチニル・アフィニティー精製抗２，
４−ジニトロフェニル・ウシ血清アルブミンＦａｂ’不
溶化固相の調製〕実施例６と同様の方法により、ビオチ
ニル・アフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル
・ウシ血清アルブミンＦａｂ’をウシ血清アルブミン−
ストレプトアビジン不溶化マイクロプレートに不溶化し
た（図４、Ｌ）。ウエル当たりに用いた不溶化液は２ｐ
ｍｏｌのビオチニルＦａｂ’を含む１５０μＬだった。
続いて、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む緩衝
液Ｃでウエル内を洗浄後、７５ｐｍｏｌのビオシチンを
含む同緩衝液１７０μＬをウエルに加え、室温で２時間
振とう後１時間静置して調製した。[Biotinyl affinity purified anti-2,
Preparation of solid phase insolubilized with 4-dinitrophenyl / bovine serum albumin Fab '] In the same manner as in Example 6, biotinyl affinity purified anti-2,4-dinitrophenyl / bovine serum albumin Fab' was converted into bovine serum albumin-
It was insolubilized in a streptavidin-insoluble microplate (FIG. 4, L). The insolubilizing solution used per well is 2p
It was 150 μL containing mol biotinyl Fab ′.
Subsequently, after washing the inside of the wells with buffer C containing 0.1 mol / L sodium chloride, 170 μL of the same buffer containing 75 pmol of biocytin was added to the wells, shaken at room temperature for 2 hours, and allowed to stand for 1 hour. Prepared.
【００７４】〔ＨＩＶ−１，ｐ２４抗原の測定〕０．４
ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃ５０μＬ、不
活性β−Ｄ−ガラクトシダーゼ５０μｇを含む同緩衝液
１０μＬ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−マウス・モノク
ローナル抗ＨＩＶ−１，ｐ２４Ｆａｂ’１０ｆｍｏｌを
含む同緩衝液１０μＬ、２，４−ジニトロフェニル・ビ
オチニル・ウシ血清アルブミン−アフィニティー精製ウ
サギ抗ＨＩＶ−１，ｐ２４Ｆａｂ’１００ｆｍｏｌを含
む同緩衝液１０μＬ及び非特異ウサギ血清１０μＬを混
合し、混合液（９０μＬ）にヒト正常血清あるいは緩衝
液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝液
Ｃ）５０μＬを加え、さらにＨＩＶ−１，ｐ２４抗原１
００ａｍｏｌを含む上記緩衝液（０．４ｍｏｌ／Ｌ塩化
ナトリウム）１０μＬを添加し、室温にて４時間静置反
応させた。続いて、この溶液に３ｐｍｏｌのビオシチン
を含む脱イオン水１μＬを添加した後、反応液をビオチ
ニル・アフィニティー精製抗２，４−ジニトロフェニル
・ウシ血清アルブミンＦａｂ’不溶化マイクロプレート
ウエルに加えて、室温で１時間振とうして反応させた。
ウエル内を０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む緩衝
液Ｃで洗浄した後、１ｍｍｏｌ／ＬのεＮ−２，４−ジ
ニトロフェニル−Ｌ−リジンを含む同緩衝液１５０μＬ
を加えて、３０分間振とうした。反応後、同溶液をウシ
血清アルブミン−ストレプトアビジン不溶化マイクロプ
レートウエルに移して室温で１時間振とうした。ウエル
内を上記と同様の方法で洗浄後、マイクロプレートウエ
ルに結合したβ−D−ガラクトシダーゼ活性を１時間反
応にて測定した。表７にヒト正常血清を添加したときと
しないときのそれぞれの蛍光強度及び両者の比（％）を
示した。[Measurement of HIV-1, p24 antigen] 0.4
50 μL of a buffer C containing mol / L sodium chloride, 10 μL of the same buffer containing 50 μg of inactive β-D-galactosidase, 10 μL of the same buffer containing 10 fmol of β-D-galactosidase-mouse monoclonal anti-HIV-1, p24Fab ′, 2,4-dinitrophenyl / biotinyl / bovine serum albumin-affinity Purified rabbit anti-HIV-1, 10 μL of the same buffer containing 100 fmol of p24Fab ′ and 10 μL of nonspecific rabbit serum were mixed, and the mixture (90 μL) was mixed with human normal serum or 50 μL of a buffer (buffer C containing 0.15 mol / L sodium chloride) was added, and HIV-1 and p24 antigen 1 were further added.
10 μL of the above buffer solution (0.4 mol / L sodium chloride) containing 00 amol was added, and the mixture was allowed to stand and react at room temperature for 4 hours. Subsequently, after adding 1 μL of deionized water containing 3 pmol of biocytin to this solution, the reaction solution was added to a biotinyl affinity purified anti-2,4-dinitrophenyl / bovine serum albumin Fab ′ insolubilized microplate well, and the mixture was added at room temperature. The reaction was performed by shaking for 1 hour.
After washing the wells with buffer C containing 0.1 mol / L sodium chloride, 150 μL of the same buffer containing 1 mmol / L εN-2,4-dinitrophenyl-L-lysine
Was added and shaken for 30 minutes. After the reaction, the solution was transferred to a microplate well in which bovine serum albumin-streptavidin was insolubilized and shaken at room temperature for 1 hour. After the inside of the well was washed in the same manner as above, the activity of β-D-galactosidase bound to the microplate well was measured for 1 hour. Table 7 shows the fluorescence intensities with and without human normal serum and the ratio (%) between the two.
【００７５】比較例７ 本比較例では、実施例７で用いたビオチニル・アフィニ
ティー精製抗２，４−ジニトロフェニル・ウシ血清アル
ブミンＦａｂ’不溶化マイクロプレートウエル固相の代
わりに、比較例６と同様のアフィニティー精製抗２，４
−ジニトロフェニル・ウシ血清アルブミンＩｇＧ不溶化
マイクロプレートウエル（図４、Ｍ）を用い、免疫複合
体形成反応液中にビオシチンを加えなかった。その他の
試薬、操作は実施例７と同様であった。ヒト正常血清を
添加したときとしないときのそれぞれの蛍光強度及び両
者の比（％）を表７に実施例７の結果と並べて示した。Comparative Example 7 In this comparative example, the biotinyl affinity-purified anti-2,4-dinitrophenyl / bovine serum albumin Fab ′ insolubilized microplate well used in Example 7 was replaced with the solid phase of Comparative Example 6. Affinity purified anti 2,4
-Biocytin was not added to the immune complex formation reaction using a dinitrophenyl / bovine serum albumin IgG-insolubilized microplate well (Fig. 4, M). Other reagents and operations were the same as in Example 7. Table 7 shows the respective fluorescence intensities with and without the addition of human normal serum and the ratio (%) of the two together with the results of Example 7.
【００７６】[0076]
【表７】 [Table 7]
【００７７】実施例８ 本実施例では、検体中のヒト成長ホルモンの測定におい
て、抗ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）抗体（Ｆａｂ’）を
２種以上の蛋白質を介して不溶化した固相を用いて、血
清検体中のヒト成長ホルモンの測定を検体量を変えて行
った。各物質の精製・調製および実験手順の詳細は以下
の通りである。 〔ウサギ抗ヒト成長ホルモンＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）2及
びＦａｂ’の調製〕ウサギ抗ヒト成長ホルモンＩｇＧ、
Ｆ（ａｂ’）2及びＦａｂ’は既報〔橋田ら、エンドク
リノロジカ・ヤポニカ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｊａｐ
ａｎ）、第３５巻、第１７１頁（１９８８）〕及び〔石
川ら、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ（前出）〕の
方法により調製した。 〔ビオチン化ウサギ抗ヒト成長ホルモンＦａｂ’の調
製〕ウサギ抗ヒト成長ホルモンＦａｂ’（２５０μｇ）
と５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、５６０μＬと約１
０ｍｍｏｌ／Ｌの６−マレイミドヘキサノイル−ビオシ
チン、１０μＬを混合し、３０℃で１時間インキュベー
トした後、ゲル濾過法により小分子を除去した。６−マ
レイミドヘキサノイル−ビオシチンは、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドに溶解した４０ｍｍｏｌ／ＬのＮ−サク
シニミジル−６−マレイミドヘキサノエート、２．５μ
Ｌとリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０に溶解した２
７ｍｍｏｌ／Ｌビオシチン、７．５μＬを混合し、３０
℃で１時間インキュベートして調製した。Example 8 In this example, in the measurement of human growth hormone in a sample, an anti-human growth hormone (HGH) antibody (Fab ′) was insolubilized through two or more proteins using a solid phase. The measurement of human growth hormone in serum samples was performed by changing the sample amount. The details of the purification / preparation of each substance and the experimental procedure are as follows. [Preparation of rabbit anti-human growth hormone IgG, F (ab ′) 2 and Fab ′] Rabbit anti-human growth hormone IgG,
F (ab ') 2 and Fab' have already been reported [Hashida et al., Endocrinol. Japonica.
an), 35, 171 (1988)] and [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay (supra)]. [Preparation of biotinylated rabbit anti-human growth hormone Fab ′] Rabbit anti-human growth hormone Fab ′ (250 μg)
And 0.1 mol / L sodium phosphate buffer containing 5 mmol / L EDTA, pH 6.0, 560 μL and about 1
After mixing 10 μL of 0 mmol / L 6-maleimidohexanoyl-biocytin and incubating at 30 ° C. for 1 hour, small molecules were removed by gel filtration. 6-maleimidohexanoyl-biocytin is 40 mmol / L N-succinimidyl-6-maleimidohexanoate dissolved in N, N-dimethylformamide, 2.5 μl.
L and 2 dissolved in sodium phosphate buffer, pH 7.0
After mixing 7 mmol / L biocytin and 7.5 μL, 30
The mixture was prepared by incubating at 1 ° C. for 1 hour.
【００７８】〔ビオチン化ウサギ抗ヒト成長ホルモンＦ
ａｂ’不溶化ポリスチレンビーズの調製〕不溶化する蛋
白質は０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７．５に溶解した。不溶化のためには、
ポリスチレンビーズ（直径３．２ｍｍ、イムノケミカル
社、岡山）を蛋白質溶液に浸し、４℃で一夜静置して反
応させた。２回目以降の不溶化の前には、ポリスチレン
ビーズを同緩衝液で５回洗浄した。ビオチン化Ｆａｂ’
は、０．１％アジ化ナトリウム、１ｍｇ／ｍＬウシ血清
アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム及び０．
１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む０．０１ｍｏｌ／
Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０に溶解し、その
１５０μＬとポリスチレンビーズ１個を４℃にて一夜静
置して不溶化させた（表８及び図５のＮ、Ｏ、Ｐ）。[Biotinylated rabbit anti-human growth hormone F
Preparation of ab 'insolubilized polystyrene beads] The protein to be insolubilized was dissolved in a sodium phosphate buffer containing 0.1% sodium azide, pH 7.5. For insolubilization,
Polystyrene beads (3.2 mm in diameter, Immunochemical, Okayama) were immersed in the protein solution and allowed to stand at 4 ° C. overnight to react. Before the second and subsequent insolubilization, the polystyrene beads were washed five times with the same buffer. Biotinylated Fab '
Are 0.1% sodium azide, 1 mg / mL bovine serum albumin, 1 mmol / L magnesium chloride and 0.1% sodium chloride.
0.01 mol / L containing 1 mol / L sodium chloride
It was dissolved in L sodium phosphate buffer, pH 7.0, and 150 μL thereof and one polystyrene bead were allowed to stand at 4 ° C. overnight to be insolubilized (N, O, P in Table 8 and FIG. 5).
【００７９】[0079]
【表８】 [Table 8]
【００８０】〔モノクローナル・マウス抗ヒト成長ホル
モンＦａｂ’−β−Ｄ−ガラクトシダーゼの調製〕モノ
クローナル・マウス抗ヒト成長ホルモンＦａｂ’−β−
Ｄ−ガラクトシダーゼは、既報〔橋田ら、ジャーナル・
オブ・クリニカル・ラボラトリー・アナリシス（Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．）、第５巻、第３８頁（１
９９１）〕および〔石川ら、ジャーナル・オブ・イムノ
アッセイ（前出）〕の方法に従って調製した。 〔検体中のヒト成長ホルモンのサンドイッチ酵素免疫測
定〕ヒト血清０、２あるいは２０μＬと０．１％アジ化
ナトリウム、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、１ｍｍ
ｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム及び０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化
ナトリウムを含む０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７．０を混合して全容積を１５０μＬと
し、各種ビオチン化ウサギ抗ヒト成長ホルモンＦａｂ’
不溶化ポリスチレンビーズ１個を加えて、室温で２時間
振とうして反応させた。ポリスチレンビーズを同緩衝液
で洗浄後、ビーズに結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
活性を測定した。各種抗ヒト成長ホルモンＦａｂ’不溶
化ポリスチレンビーズを用いて、ヒト血清０、２および
２０μＬについて測定を行ったときのそれぞれの蛍光強
度及び計算値を表９に示した。[Preparation of monoclonal mouse anti-human growth hormone Fab'-β-D-galactosidase] Monoclonal mouse anti-human growth hormone Fab'-β-
D-galactosidase has already been reported [Hashida et al., Journal
Of Clinical Laboratory Analysis (JC)
lin. Lab. Anal. ), Volume 5, Page 38 (1
991)] and [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay (supra)]. [Sandwich Enzyme Immunoassay for Human Growth Hormone in Sample] 0, 2 or 20 μL of human serum and 0.1% sodium azide, 1 mg / mL bovine serum albumin, 1 mm
ol / L magnesium chloride and 0.01 mol / L sodium chloride buffer containing 0.1 mol / L sodium chloride, pH 7.0 to make a total volume of 150 μL, and various biotinylated rabbit anti-human growth hormone Fab ′.
One insolubilized polystyrene bead was added and shaken at room temperature for 2 hours to react. After washing the polystyrene beads with the same buffer, the activity of β-D-galactosidase bound to the beads was measured. Table 9 shows the respective fluorescence intensities and calculated values when measurement was performed on 0, 2, and 20 μL of human serum using various anti-human growth hormone Fab ′ insoluble polystyrene beads.
【００８１】比較例８ 本比較例では、検体中のヒト成長ホルモンの測定を従来
の公知の方法により作製された抗ヒト成長ホルモン抗体
（ＩｇＧ、Ｆａｂ’）不溶化固相を用いて、血清検体中
のヒト成長ホルモンの測定を検体量を変えて行った。各
物質の精製・調製および実験手順の詳細は以下の通りで
ある。 〔ビオチン化ウサギ抗ヒト成長ホルモンＦａｂ’不溶化
ポリスチレンビーズ及びウサギ抗ヒト成長ホルモンＩｇ
Ｇ不溶化ポリスチレンビーズの調製〕ビオチン化ウサギ
抗ヒト成長ホルモンＦａｂ’は、ストレプトアビジン不
溶化ポリスチレンビーズに、実施例８の方法により不溶
化した（表８および図５、Ｑ）。ウサギ抗ヒト成長ホル
モンＩｇＧは、実施例８と同じ方法によりポリスチレン
ビーズに不溶化した（１００μｇ／ｍＬ）（表８および
図５、Ｒ）。 〔検体中のヒト成長ホルモンのサンドイッチ酵素免疫測
定〕実施例８と同様の測定を、固相Ｑ、Ｒを用いて行っ
た。結果を表９に実施例８の結果と並べて示した。Comparative Example 8 In this comparative example, human growth hormone in a sample was measured using an anti-human growth hormone antibody (IgG, Fab ′) insolubilized solid phase prepared by a conventionally known method. Of human growth hormone was measured by changing the sample amount. The details of the purification / preparation of each substance and the experimental procedure are as follows. [Biotinylated rabbit anti-human growth hormone Fab ′ insolubilized polystyrene beads and rabbit anti-human growth hormone Ig
Preparation of G-Insoluble Polystyrene Beads] Biotinylated rabbit anti-human growth hormone Fab ′ was insolubilized in streptavidin-insoluble polystyrene beads by the method of Example 8 (Table 8 and FIG. 5, Q). Rabbit anti-human growth hormone IgG was insolubilized in polystyrene beads by the same method as in Example 8 (100 μg / mL) (Table 8 and FIG. 5, R). [Sandwich Enzyme Immunoassay for Human Growth Hormone in Sample] The same measurement as in Example 8 was performed using solid phases Q and R. The results are shown in Table 9 along with the results of Example 8.
【００８２】[0082]
【表９】 [Table 9]
【００８３】[0083]
【発明の効果】上記実施例１〜８および比較例１〜８に
よって、以下の４点が確認できた。 （１）本願発明法における特異的反応の向上効果 特異的抗体測定系において、抗原を２つ以上の蛋白質を
介して結合させた固相を用いると、従来の技術で作製さ
れた固相を用いる場合に比べ、飛躍的に抗体の反応性が
向上し特異的信号量が高まることが確認された。 （２）本願発明法における血清干渉抑制効果 抗体測定、抗原測定の両測定系において、本願発明法に
より調製した固相を用いると、従来の技術で作製された
固相を用いる場合に比べ、血清干渉による反応性の低下
が顕著に抑制されることが確認された。 （３）ＨＩＶ−１感染の早期検出における抗ｐ１７抗体
測定の有用性 ＨＩＶ−１感染の早期検出において、これまで抗ｐ１７
抗体は、有用なマーカーとは考えられていなかったが、
本願発明法により不溶化した固相を用いることにより、
既存の抗ＨＩＶ抗体測定キットの抗ｐ２４抗体や抗ｇｐ
１６０抗体と同様の早い時期から抗ｐ１７抗体が検出さ
れ、その早期検出における有用性が確認された。 （４）免疫複合体転移法における血清干渉抑制効果 免疫複合体転移法において、第１固相に本願発明法によ
り調製した固相を用いると、従来の技術で作製された固
相を第１固相に用いる場合に比べ、血清干渉による反応
性の低下が抑制されることが確認された。According to Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1 to 8, the following four points were confirmed. (1) Effect of improving specific reaction in the method of the present invention When a solid phase in which an antigen is bound via two or more proteins is used in a specific antibody measurement system, a solid phase produced by a conventional technique is used. Compared with the case, it was confirmed that the reactivity of the antibody was dramatically improved and the specific signal amount was increased. (2) Serum interference suppression effect in the method of the present invention In both measurement systems for antibody measurement and antigen measurement, the use of the solid phase prepared by the method of the present invention is more effective than the case of using the solid phase prepared by the conventional technique. It was confirmed that the decrease in reactivity due to interference was significantly suppressed. (3) Usefulness of anti-p17 antibody measurement in early detection of HIV-1 infection In early detection of HIV-1 infection,
Antibodies were not considered useful markers,
By using the solid phase insolubilized by the method of the present invention,
Anti-p24 antibody and anti-gp of existing anti-HIV antibody measurement kit
The anti-p17 antibody was detected as early as the 160 antibody, confirming its usefulness in early detection. (4) Serum interference suppression effect in immunocomplex transfer method In the immunocomplex transfer method, when the solid phase prepared by the method of the present invention is used as the first solid phase, the solid phase produced by the conventional technique can be used as the first solid phase. It was confirmed that the decrease in reactivity due to serum interference was suppressed as compared with the case where the phase was used.
【００８４】[0084]
【図１】実施例１および比較例１で用いたＨＩＶ−１，
ｒｐ１７抗原不溶化固相の概略図である。FIG. 1 shows HIV-1 used in Example 1 and Comparative Example 1,
It is the schematic of the rp17 antigen insolubilized solid phase.
【図２】実施例４および比較例４で用いたＨＩＶ−１，
ｒｐ２４抗原不溶化固相の概略図である。FIG. 2 shows HIV-1 and HIV-1 used in Example 4 and Comparative Example 4.
It is the schematic of the rp24 antigen insolubilized solid phase.
【図３】実施例５および比較例５で用いた抗ＨＩＶ−
１，ｒＲＴ抗原不溶化固相の概略図である。FIG. 3 shows anti-HIV- used in Example 5 and Comparative Example 5.
FIG. 1 is a schematic view of a 1, rRT antigen insolubilized solid phase.
【図４】は、実施例６、７および比較例６、７で用いた
ＨＩＶ−１，ｐ２４抗体不溶化固相の概略図である。FIG. 4 is a schematic diagram of the HIV-1, p24 antibody insolubilized solid phase used in Examples 6 and 7 and Comparative Examples 6 and 7.
【図５】は、実施例８および比較例８で用いた抗ヒト成
長ホルモン（ＨＧＨ）抗体不溶化固相の概略図である。FIG. 5 is a schematic view of an anti-human growth hormone (HGH) antibody insolubilized solid phase used in Example 8 and Comparative Example 8.
Claims (9)
疫複合体を形成しうる物質（活性成分）が２種または２
分子以上の介在物質を介して間接的に結合されているこ
とを特徴とする免疫測定用固相。1. A solid phase carrier comprising two or two substances (active ingredients) capable of specifically forming an immune complex with a substance to be measured.
A solid phase for immunoassay, wherein the solid phase is indirectly bound via an intermediary substance of at least a molecule.
疫測定用固相。2. The solid phase for immunoassay according to claim 1, wherein the intervening substance is a protein.
請求項２記載の免疫測定用固相。3. The solid phase for immunoassay according to claim 2, wherein the intervening substance is a protein having a molecular weight of 10,000 or more.
の免疫測定用固相。4. The solid phase for immunoassay according to claim 3, wherein the active ingredient is a specific antigen.
の免疫測定用固相。5. The solid phase for immunoassay according to claim 3, wherein the active ingredient is a specific antibody.
１７抗原、ｐ２４抗原または逆転写酵素抗原である請求
項４記載の免疫測定用固相。6. The method according to claim 6, wherein the active ingredient is p of human immunodeficiency virus type I.
The solid phase for immunoassay according to claim 4, which is 17 antigen, p24 antigen or reverse transcriptase antigen.
２４抗原に対する抗体またはヒト成長ホルモンに対する
抗体である請求項５記載の免疫測定用固相。7. The p-type of the human immunodeficiency virus type I as an active ingredient.
The solid phase for immunoassay according to claim 5, which is an antibody against 24 antigens or an antibody against human growth hormone.
体転移法における第１番目の固相として使用することを
特徴とする免疫学的測定法。8. An immunoassay wherein the solid phase for immunoassay according to claim 1 is used as a first solid phase in an immunocomplex transfer method.
ト。9. An immunoassay kit comprising the solid phase according to claim 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35218897A JPH11125634A (en) | 1996-12-06 | 1997-12-04 | Solid phase for immunoassay |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34254396 | 1996-12-06 | ||
| JP8-342543 | 1996-12-06 | ||
| JP35218897A JPH11125634A (en) | 1996-12-06 | 1997-12-04 | Solid phase for immunoassay |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11125634A true JPH11125634A (en) | 1999-05-11 |
Family
ID=26577291
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35218897A Pending JPH11125634A (en) | 1996-12-06 | 1997-12-04 | Solid phase for immunoassay |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11125634A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2001174460A (en) * | 1999-12-17 | 2001-06-29 | Tosoh Corp | Immunity measurement method and reagent therefor |
| JP2004069677A (en) * | 2002-06-13 | 2004-03-04 | Canon Inc | Immunological measuring method, reagent for immunological measurement, and its manufacturing method |
| JP2006512581A (en) * | 2003-01-04 | 2006-04-13 | コリア アドバンスト インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジー | Protein chip for analysis of reaction between protein and its substrate peptide |
| WO2007126101A1 (en) * | 2006-04-28 | 2007-11-08 | Toppan Printing Co., Ltd. | Protein chip |
| JP2020060587A (en) * | 2015-03-31 | 2020-04-16 | シスメックス株式会社 | Immunoassay device |
-
1997
- 1997-12-04 JP JP35218897A patent/JPH11125634A/en active Pending
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| JPWO2007126101A1 (en) * | 2006-04-28 | 2009-09-17 | 凸版印刷株式会社 | Protein chip |
| JP2020060587A (en) * | 2015-03-31 | 2020-04-16 | シスメックス株式会社 | Immunoassay device |
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