JPH11124399A - Monoclonal antibody for measuring protein c inhibitor-protease complex - Google Patents
Monoclonal antibody for measuring protein c inhibitor-protease complexInfo
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- JPH11124399A JPH11124399A JP28808697A JP28808697A JPH11124399A JP H11124399 A JPH11124399 A JP H11124399A JP 28808697 A JP28808697 A JP 28808697A JP 28808697 A JP28808697 A JP 28808697A JP H11124399 A JPH11124399 A JP H11124399A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明はプロテアーゼインヒビタ
ーとプロテアーゼの複合体測定用モノクローナル抗体、
その測定方法および測定用試薬に関する。The present invention relates to a monoclonal antibody for measuring a complex of a protease inhibitor and a protease,
The present invention relates to a measuring method and a measuring reagent.
【０００２】[0002]
【従来の技術】血液凝固・線溶系はプロテアーゼ前駆体
の活性化とそのインヒビターによって制御されている。
これらの因子、特に活性化されたプロテアーゼを検出す
ることによって、種々の疾患における凝固・線溶系の状
態を知ることができる。しかしながら、活性化プロテア
ーゼは特異性の高いインヒビターによって中和されるた
め、その活性を正確に測定するのは困難である。そこで
通常は活性化プロテアーゼとインヒビターの複合体を測
定する方法が用いられ、臨床検査の現場ではトロンビン
−アンチトロンビンIII複合体(Thrombin-antithrombin
three、ＴＡＴ)およびプラスミン−プラスミンインヒビ
ター複合体(Plasmin-plasmin inhibitor complex、ＰＩ
Ｃ)が測定されている。しかしこれらの複合体の測定に
は、測定サンプル採取後の保存状態に左右され、測定値
の変動が大きいという欠点がある。プロテインＣ(Prote
in C、以下ＰＣ)は、血管内皮細胞に存在するトロンボ
モジュリンに結合したトロンビンによって活性化プロテ
インＣ(Activated proteinC、以下ＡＰＣ)に変換され、
凝固反応の補酵素である活性化第Ｖ因子および活性化第
VIII因子を分解することによって凝固反応を制御してい
る。ＡＰＣは血漿中に存在するプロテインＣインヒビタ
ー(Protein C inhibitor、以下ＰＣＩ)およびα1-アン
チトリプシンによって中和される。ＰＣＩはヘパリン依
存性のセリンプロテアーゼインヒビターでありセルピン
(Serpin)の一種である。ＰＣＩは分子量57,000の一本鎖
糖タンパク質で血漿以外にも尿、精漿、滑液等に存在し
ていることから、血液凝固系の制御のみならず、多彩な
生理機能があると考えられ注目されている。また、ＰＣ
ＩはＡＰＣ以外にも、トロンビン、第Ｘa因子、第XIa因
子、カリクレイン、ウロキナーゼ、組織中プラスミノー
ゲン活性化因子(Tissue plasminogen activator)等も阻
害すると報告されている(Suzuki, K., Methodsin Enzym
ology, 222, 385-399, 1993)。また、ＰＣＩによるＡＰ
Ｃやトロンビンの阻害速度は、ヘパリンや陰性荷電デキ
ストラン硫酸の存在下で著しく促進されることが明らか
になっている(Laurell, M., Carlson, T. H. and Stenf
lo, J., Thrombosis and Haemostasis, 60, 334-339, 1
988)。ＰＣＩのプロテアーゼ阻害機構はＡＰＣを用いて
詳細に解析されており、活性化プロテアーゼとインヒビ
ターが１：１のアシル結合複合体を形成することによ
る。したがって、血液中のＡＰＣとＰＣＩの複合体(Act
ivated protein C−Protein C inhibitor complex、以
下ＣＩＣ)を測定することは、血液凝固系制御能を知る
指標となりうる。また、ＣＩＣの血液凝固・線溶カスケ
ードにおける位置付けからすると、ＴＡＴよりも早期に
出現すると考えられるため、凝固亢進状態の出現を予知
する目的にも使用できる可能性がある。さらに、汎発性
血管内凝固(Disseminated intravascular coagulatio
n、ＤＩＣ)(Espana, F., et al., Thrombosis Res., 5
9, 593-608, 1990)、糖尿病(Gabazza, E. C., et al.,
Diabetologia, 39, 1455-1461, 1996)、深部静脈血栓(D
eep Vein Thrombosis、ＤＶＴ)(Yamada, N., et al., B
lood coagulation and Fibrinolysis, 6, 627-633, 199
5)等の血液凝固・線溶系に障害を示す患者では、血漿中
ＣＩＣは高値を示すと報告されている。従来行われてき
たＣＩＣの測定方法は、ＰＣに対する抗体およびＰＣＩ
に対する抗体を組み合わせて測定するものであるが、測
定サンプルの前処理が必要であったり、測定に長時間か
かる等の欠点があった。また、ローレルらはＰＣＩに対
するモノクローナル抗体を作製し、ＣＩＣを測定する方
法を開示している(Laurel, M., Carlson, T. H. and St
enflo, J., Thrombosis and Haemostasis, 60, 334-33
9, 1988)。しかし、この抗体はＣＩＣだけではなくＰＣ
Ｉも認識するため、正確にＣＩＣ量を測定できるもので
はない。また、ここに開示されている方法では、ＰＣに
対する抗体を固相抗体としているため、この方法を臨床
応用した場合には、ここで測定されるＣＩＣ定量値はＣ
ＩＣそのものの量的変動を捉えているだけでなく、ＰＣ
の量的変動によっても影響を受けると考えられる。この
ように、ＰＣＩとプロテアーゼの複合体を測定する方法
で実用的なものは未だ無く、早急な開発が待たれている
ところである。2. Description of the Related Art The blood coagulation / fibrinolysis system is controlled by the activation of a protease precursor and its inhibitor.
By detecting these factors, particularly activated proteases, the state of the coagulation / fibrinolysis system in various diseases can be known. However, since the activated protease is neutralized by a highly specific inhibitor, it is difficult to accurately measure its activity. Therefore, a method of measuring a complex of an activating protease and an inhibitor is usually used, and in a clinical test site, a thrombin-antithrombin III complex (Thrombin-antithrombin III) is used.
three, TAT) and plasmin-plasmin inhibitor complex, PI
C) has been measured. However, the measurement of these complexes has the disadvantage that the measured values vary greatly depending on the storage condition after the measurement sample is collected. Protein C
in C, hereinafter PC), is converted to activated protein C (Activated protein C, hereinafter APC) by thrombin bound to thrombomodulin present in vascular endothelial cells,
Activated factor V and activated factor co-enzymes
The coagulation reaction is controlled by decomposing factor VIII. APC is neutralized by a protein C inhibitor (hereinafter referred to as PCI) and α 1 -antitrypsin present in plasma. PCI is a heparin-dependent serine protease inhibitor and serpin
(Serpin). PCI is a single-chain glycoprotein with a molecular weight of 57,000 and is present not only in plasma but also in urine, seminal plasma, synovial fluid, etc., and is considered to have various physiological functions in addition to controlling blood coagulation. Have been. Also, PC
I has been reported to inhibit thrombin, factor Xa, factor XIa, kallikrein, urokinase, tissue plasminogen activator, and the like, in addition to APC (Suzuki, K., Methods in Enzym
ology, 222 , 385-399, 1993). AP by PCI
The inhibitory rates of C and thrombin have been shown to be significantly enhanced in the presence of heparin and negatively charged dextran sulfate (Laurell, M., Carlson, TH and Stenf).
lo, J., Thrombosis and Haemostasis, 60 , 334-339, 1
988). The protease inhibitory mechanism of PCI has been analyzed in detail using APC, and the activated protease and inhibitor form a 1: 1 acyl bond complex. Therefore, the complex of APC and PCI in blood (Act
Measuring ivated protein C-Protein C inhibitor complex (hereinafter referred to as CIC) can be an index for knowing the ability to control the blood coagulation system. In addition, since CIC is considered to appear earlier than TAT in the context of the blood coagulation / fibrinolysis cascade, it may be used for the purpose of predicting the appearance of a hypercoagulable state. In addition, disseminated intravascular coagulatio
n, DIC) (Espana, F., et al., Thrombosis Res., 5
9 , 593-608, 1990), diabetes (Gabazza, EC, et al.,
Diabetologia, 39 , 1455-1461, 1996), deep vein thrombosis (D
eep Vein Thrombosis (DVT) (Yamada, N., et al., B
lood coagulation and Fibrinolysis, 6 , 627-633, 199
It has been reported that the plasma CIC shows a high value in patients having impaired blood coagulation / fibrinolysis system such as 5). Conventional methods for measuring CIC include antibodies against PC and PCI.
However, there are drawbacks such as the necessity of pretreatment of a measurement sample and a long time for measurement. Laurel et al. Have disclosed a method for preparing a monoclonal antibody against PCI and measuring CIC (Laurel, M., Carlson, TH and St.
enflo, J., Thrombosis and Haemostasis, 60 , 334-33
9, 1988). However, this antibody is not only CIC but also PC
Since I is also recognized, the CIC amount cannot be measured accurately. Further, in the method disclosed herein, since the antibody against PC is a solid phase antibody, when this method is clinically applied, the CIC quantitative value measured here is C
In addition to capturing the quantitative fluctuations of the IC itself,
Is likely to be affected by quantitative fluctuations in As described above, there is no practical method for measuring the complex of PCI and protease, and rapid development is awaited.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＰＣ
Ｉとプロテアーゼの複合体を短時間で正確、簡便に測定
するモノクローナル抗体、その測定方法および測定試薬
を提供することにある。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a PC
It is an object of the present invention to provide a monoclonal antibody that can accurately and simply measure a complex of I and a protease in a short time, a measuring method thereof, and a measuring reagent.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な背景から鋭意研究を重ねた結果、プロテアーゼとイン
ヒビターの複合体に特異的に反応し、ＰＣ、ＡＰＣ、Ｐ
ＣＩ等とは反応しないモノクローナル抗体の作製に成功
した。さらに、この抗体はＡＰＣ以外の種々のプロテア
ーゼとの複合体をも認識することが明らかとなり、本発
明を完成するに至った。すなわち、本発明はプロテイン
Ｃインヒビターとプロテアーゼの複合体を認識するモノ
クローナル抗体であって、インタクトのプロテインＣイ
ンヒビターは実質的に認識せず、該複合体中のプロテイ
ンＣインヒビターを認識するモノクローナル抗体、該モ
ノクローナル抗体を使用したプロテインＣインヒビター
と活性化プロテアーゼの複合体の測定方法、およびその
測定試薬である。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies from such a background, and as a result, have specifically reacted with a complex of a protease and an inhibitor, and found that PC, APC, P
A monoclonal antibody that does not react with CI or the like was successfully produced. Furthermore, it became clear that this antibody also recognized complexes with various proteases other than APC, and the present invention was completed. That is, the present invention relates to a monoclonal antibody that recognizes a complex of a protein C inhibitor and a protease, wherein the monoclonal antibody does not substantially recognize an intact protein C inhibitor and recognizes a protein C inhibitor in the complex. A method for measuring a complex of a protein C inhibitor and an activated protease using a monoclonal antibody, and a reagent for measuring the complex.
【０００５】[0005]
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明においてインタクトとは、生体内に本来存在する
形であり、その構造や機能に変化を受けていないもので
あることを意味する。本発明に係るプロテインＣインヒ
ビターとプロテアーゼの複合体を認識するモノクローナ
ル抗体の作製は、該複合体を抗原として、通常行われる
免疫学的方法で実施すればよい。免疫に使われる動物は
特に限定されないがマウス、ラット、モルモットなどは
いずれも使用できる。接種は皮下、筋肉内、腹腔内に、
完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュ
バントと混和して行う。投与は２〜５週間ごとに実施す
る。免疫した動物から脾臓またはリンパ節を採取し、脾
臓またはリンパ細胞を腫瘍細胞と融合し、ハイブリドー
マとして単離する。腫瘍細胞は一般に抗体産生細胞と同
一種であることが望ましいが、異種間でも可能な場合も
ある。細胞融合法は一般に行われている方法、たとえば
ケーラーとミルステインの方法(Kohler, G. and Milste
in, C., Nature, 256, 495-497, 1975)で実施すればよ
い。融合促進剤としては、センダイウイルスや平均分子
量1000〜6000のポリエチレングリコールなどが挙げられ
る。通常20〜50％程度の濃度のポリエチレングリコール
を用いて、20〜40℃、好ましくは30〜37℃で、抗体産生
細胞数と腫瘍細胞数の比、１：１〜10：１程度、１〜10
分間程度反応させることによって実施する。ハイブリド
ーマのスクリーニングは、種々の免疫化学的方法で実施
することができる。例えばエライザ法(Enzyme-linked i
mmunosorbent assay、以下ＥＬＩＳＡ)等の酵素標識法
(Enzyme immunoassay、以下ＥＩＡ)、ウェスタンブロッ
ト法、組織染色法などが挙げられる。本発明の場合には
プロテインＣインヒビターとプロテアーゼの複合体に反
応し、インタクトのＰＣＩやプロテアーゼには実質的に
反応しないクローンを選択する。このような方法で抗体
産生を確認した後、例えば、限界希釈法によってクロー
ンを得る。ハイブリドーマの選別、育種は通常ＨＡＴ
(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加し
て、10〜20％のウシ胎児血清を含む動物細胞用培地で行
われる。このようにして得られたクローンは、あらかじ
めプリスタンを投与したBALB/Cマウスの腹腔内に移植
し、10〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹
水を採取し、抗体を精製するための原料とする。また、
該クローンを培養し、培養物を原料とすることもでき
る。モノクローナル抗体の回収は、既知の免疫グロブリ
ン精製法を用いればよく、例えば、硫安分画法、ポリエ
チレングリコール(Polyethylene glycol、ＰＥＧ)分画
法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、アフィ
ニティクロマトグラフ法等により実施することができ
る。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described below in detail.
In the present invention, the term intact means a form originally existing in a living body, and has no change in its structure or function. The preparation of the monoclonal antibody that recognizes the protein C inhibitor-protease complex according to the present invention may be performed by a commonly used immunological method using the complex as an antigen. The animal used for immunization is not particularly limited, but any of mice, rats, guinea pigs and the like can be used. Inoculation is subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal,
Perform by mixing with complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant. Administration is performed every 2 to 5 weeks. The spleen or lymph nodes are collected from the immunized animal, and the spleen or lymph cells are fused with tumor cells and isolated as a hybridoma. Generally, it is desirable that the tumor cells be of the same species as the antibody-producing cells, but it may be possible to use different types of tumor cells. The cell fusion method is a commonly used method such as the Kohler and Milstein method (Kohler, G. and Milste
in, C., Nature, 256 , 495-497, 1975). Examples of the fusion promoter include Sendai virus and polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,000 to 6,000. Usually, using polyethylene glycol at a concentration of about 20 to 50%, at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 37 ° C., the ratio of the number of antibody-producing cells to the number of tumor cells, about 1: 1 to 10: 1, 1 to 1 Ten
The reaction is performed by reacting for about a minute. Hybridoma screening can be performed by various immunochemical methods. For example, the ELISA method (Enzyme-linked i
Enzyme labeling method such as mmunosorbent assay (hereinafter ELISA)
(Enzyme immunoassay, hereinafter EIA), Western blotting, tissue staining and the like. In the case of the present invention, a clone that reacts with the complex of the protein C inhibitor and the protease and does not substantially react with the intact PCI or the protease is selected. After confirming antibody production by such a method, clones are obtained by, for example, the limiting dilution method. Hybridoma selection and breeding are usually HAT
(Hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added and performed in an animal cell culture medium containing 10-20% fetal bovine serum. The clones thus obtained were transplanted intraperitoneally into BALB / C mice to which pristane had been previously administered, and 10 to 14 days later, ascites containing a high concentration of the monoclonal antibody was collected, and a raw material for purifying the antibody was obtained. And Also,
The clone can be cultured, and the culture can be used as a raw material. Monoclonal antibodies may be recovered by a known immunoglobulin purification method, for example, ammonium sulfate fractionation, polyethylene glycol (Polyethylene glycol, PEG) fractionation, ethanol fractionation, use of anion exchanger, affinity chromatography. It can be implemented by a graph method or the like.
【０００６】このようにして得られたＰＣＩとプロテア
ーゼの複合体を認識するモノクローナル抗体を使用し
て、生体試料中のＰＣＩとプロテアーゼの複合体の定性
・定量が可能である。その方法としては、試料の種類に
よって適切な方法を採用すればよく特に限定されない
が、例えば、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、凝集
法、競合法、サンドイッチ法などが挙げられる。免疫組
織染色法は例えば、標識化抗体を使用する直接法、該抗
体に対する標識抗体を用いる間接法により実施できる。
標識物としては蛍光物質、放射性物質、酵素、金属、色
素などを使用することができる。生体試料中のＰＣＩと
プロテアーゼ複合体の測定法の例として、免疫学的サン
ドイッチ法によるＣＩＣ(ＰＣＩとＡＰＣの複合体)の定
量法を以下に説明する。まず、本発明のモノクローナル
抗体を固相化する。固相体としてはマイクロタイターウ
ェル、マイクロ磁気ビーズなどを選択し、常法により固
相化する。該固相化モノクローナル抗体と生体試料とを
反応させ、モノクローナル抗体とＣＩＣを結合させ、免
疫反応物を生成させる。洗浄後、抗ＰＣ抗体もしくは抗
ＡＰＣ抗体(標識第二抗体)と反応させ、さらに洗浄後、
標識第二抗体を定量することにより、生体試料中のＣＩ
Ｃ量を測定することができる。また、ＰＣＩはＡＰＣの
みならず血漿カリクレイン、第Ｘa因子、第XIa因子、ト
ロンビン、ウロキナーゼ、組織中プラスミノーゲン等種
々のプロテアーゼとも反応するため、これらとの複合体
も測定可能である。適用できる生体試料は特に限定され
ず、臓器組織、細胞、血漿、血清、尿、漿液、髄液等い
ずれの生体試料であっても、適切な前処理を行うことに
よって適用可能である。By using the thus obtained monoclonal antibody which recognizes the complex of PCI and protease, it is possible to qualitatively and quantitatively determine the complex of PCI and protease in a biological sample. The method is not particularly limited as long as an appropriate method is adopted depending on the type of the sample, and examples thereof include an immunohistological staining method, an enzyme immunoassay method, an agglutination method, a competitive method, and a sandwich method. The immunohistochemistry can be performed, for example, by a direct method using a labeled antibody or an indirect method using a labeled antibody against the antibody.
As the label, a fluorescent substance, a radioactive substance, an enzyme, a metal, a dye, or the like can be used. As an example of a method for measuring the PCI and protease complex in a biological sample, a method for quantifying CIC (a complex of PCI and APC) by an immunological sandwich method will be described below. First, the monoclonal antibody of the present invention is immobilized. As the solid phase body, a microtiter well, micro magnetic beads, or the like is selected, and the solid phase is immobilized by an ordinary method. The immobilized monoclonal antibody is reacted with a biological sample, and the monoclonal antibody and CIC are bound to generate an immunoreactant. After washing, react with anti-PC antibody or anti-APC antibody (labeled second antibody), and further wash,
By quantifying the labeled second antibody, the CI in the biological sample can be determined.
The amount of C can be measured. In addition, since PCI reacts not only with APC but also with various proteases such as plasma kallikrein, factor Xa, factor XIa, thrombin, urokinase, and plasminogen in tissues, a complex with these can be measured. The biological sample that can be applied is not particularly limited, and any biological sample such as organ tissue, cells, plasma, serum, urine, serum, and cerebrospinal fluid can be applied by appropriate pretreatment.
【０００７】本発明に係る測定試薬は、ＰＣＩとプロテ
アーゼ複合体を認識するモノクローナル抗体を必須構成
成分とし、標識抗体、標準抗原、酵素および基質等を含
むものからなる。該モノクローナル抗体と酵素が同時に
含まれる場合には両者が結合した状態であってもよい。
また、測定の都合により、適切な抗原希釈液、反応希釈
液、基質溶解液、反応停止液等が含まれていてもよい。[0007] The measurement reagent according to the present invention comprises a monoclonal antibody that recognizes a complex of PCI and a protease as an essential component, and includes a labeled antibody, a standard antigen, an enzyme, a substrate and the like. When the monoclonal antibody and the enzyme are contained at the same time, both may be in a state of being bound.
Further, depending on the convenience of measurement, an appropriate antigen diluent, reaction diluent, substrate lysis solution, reaction stop solution, etc. may be included.
【０００８】[0008]
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ 抗ＣＩＣモノクローナル抗体の作製および同
抗体の特異性の検討 1)プロテインＣの精製 操作は全て４℃で実施した。新鮮血漿4.4リットルに、
塩酸ベンズアミジン(10mM；最終濃度、以下同様)、ジイ
ソプロピルフルオロフォスフェイト(Diisopropyl fluor
ophosphate、ＤＦＰ)(1mM)、フェニルメチルスルフォニ
ルフルオライド(Phenylmethylsulfonyl fluoride、ＰＭ
ＳＦ)(1mM)および大豆トリプシンインヒビター(50mg/リ
ットル)を加えた後、1Mの塩化バリウムを350ml滴下し
た。混合液を１時間攪拌後、5000rpm/minで30分間遠心
し、沈殿を採取した。沈殿に5mMの塩酸ベンズアミジン
を含む0.15Mの塩化ナトリウム(pH7.4)を700ml加えて２
回洗浄した。バリウム塩に吸着したタンパク質は、5mM
の塩酸ベンズアミジンおよび0.1mMのＤＦＰを含む0.2M
のＥＤＴＡ(pH7.4)を660ml添加して溶出した。懸濁液を
１時間攪拌後、5000rpm/minで30分間遠心し、沈殿を除
去した。上清を1mMの塩酸ベンズアミジンを含む0.1Mの
リン酸緩衝液(pH6.0)に透析した後、同一の緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥ-Sephacelカラムにかけ、0.1Mから0.7
Mまでの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配、1mMの塩酸ベ
ンズアミジンを含む0.1Mのリン酸緩衝液(pH6.0)で溶出
しＰＣ画分を採取した。採取液を1mMの塩酸ベンズアミ
ジンを含む0.05Mトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に対して透析
した。その後、ＤＦＰおよびＰＭＳＦを、それぞれ1mM
および0.1mMの濃度になるように添加した。1mMの塩酸ベ
ンズアミジンを含む0.05Mのトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で
平衡化したＤＥＡＥ-Sephacelカラムにかけ、0.1Mから
0.5Mまでの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配、1mMの塩
酸ベンズアミジンを含む0.05Mのトリス塩酸緩衝液(pH8.
0)および2mMの塩化カルシウムで溶出し、ＰＣ画分を採
取した。採取液を1mMの塩酸ベンズアミジンを含む0.05M
イミダゾール緩衝液(pH6.0)に対して透析した。透析に
より生じた沈殿を2000rpm/minで10分間遠心分離し、除
去した。上清に塩化カルシウムを1mMになるように加
え、1mMの塩酸ベンズアミジンおよび2mMの塩化カルシウ
ムを含む0.05Mのイミダゾール緩衝液(pH6.0)で平衡化し
たHeparin Sepharoseカラムにかけ、0.0Mから0.8Mまで
の直線的濃度勾配、1mMの塩酸ベンズアミジンを含む0.0
5Mのイミダゾール緩衝液(pH6.0)で溶出し、精製ＰＣ画
分を採取した。回収率は25％であった。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. Example 1 Preparation of Anti-CIC Monoclonal Antibody and Examination of Specificity of the Antibody 1) Purification of Protein C All operations were performed at 4 ° C. 4.4 liters of fresh plasma
Benzamidine hydrochloride (10 mM; final concentration, the same applies hereinafter), diisopropyl fluorophosphate (Diisopropyl fluorate)
ophosphate, DFP) (1mM), Phenylmethylsulfonyl fluoride, PM
After adding SF) (1 mM) and soybean trypsin inhibitor (50 mg / liter), 350 ml of 1M barium chloride was added dropwise. After stirring the mixture for 1 hour, the mixture was centrifuged at 5000 rpm / min for 30 minutes to collect a precipitate. 700 ml of 0.15 M sodium chloride (pH 7.4) containing 5 mM benzamidine hydrochloride was added to the precipitate, followed by adding 2 ml.
Washed twice. 5 mM protein adsorbed on barium salt
0.2M with benzamidine hydrochloride and 0.1mM DFP
Of EDTA (pH 7.4) was added and eluted. After stirring the suspension for 1 hour, the suspension was centrifuged at 5000 rpm / min for 30 minutes to remove the precipitate. The supernatant was dialyzed against 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 1 mM benzamidine hydrochloride, and then applied to a DEAE-Sephacel column equilibrated with the same buffer.
The PC fraction was eluted with a linear concentration gradient of sodium chloride up to M and eluted with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 1 mM benzamidine hydrochloride. The collected liquid was dialyzed against 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 mM benzamidine hydrochloride. Thereafter, DFP and PMSF were each adjusted to 1 mM.
And 0.1 mM. The sample was applied to a DEAE-Sephacel column equilibrated with 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 mM benzamidine hydrochloride, and 0.1 M
Linear concentration gradient of sodium chloride up to 0.5 M, 0.05 M Tris-HCl buffer containing 1 mM benzamidine hydrochloride (pH 8.
Elution was performed with 0) and 2 mM calcium chloride, and the PC fraction was collected. 0.05 M containing 1 mM benzamidine hydrochloride
It was dialyzed against imidazole buffer (pH 6.0). The precipitate formed by the dialysis was removed by centrifugation at 2000 rpm / min for 10 minutes. Calcium chloride was added to the supernatant to 1 mM, applied to a Heparin Sepharose column equilibrated with 0.05 M imidazole buffer (pH 6.0) containing 1 mM benzamidine hydrochloride and 2 mM calcium chloride, and from 0.0 M to 0.8 M Linear gradient, containing 1 mM benzamidine hydrochloride 0.0
Elution was carried out with 5 M imidazole buffer (pH 6.0), and a purified PC fraction was collected. The recovery was 25%.
【０００９】2)プロテインＣインヒビターの精製 操作は全て４℃で実施した。新鮮血漿４リットルに、塩
酸ベンズアミジン(10mM；最終濃度、以下同様)、ＤＦＰ
(1mM)、ＰＭＳＦ(1mM)および大豆トリプシンインヒビタ
ー(50mg/リットル)を加え、1Mの塩化バリウムを320ml滴
下した。混合液を１時間攪拌後、5000rpm/minで30分間
遠心し、上清を採取し、固形ＰＥＧ6000を60g/リットル
になるように加えた。１時間攪拌後、5000rpm/minで30
分間遠心し、沈殿を除去した。上清にはさらに固形ＰＥ
Ｇ6000を60g/リットルになるように加え、１時間攪拌
後、5000rpm/minで30分間遠心して沈殿を採取した。沈
殿に0.1Mの塩化アンモニウム、10mMの塩酸ベンズアミジ
ン、1mMのＤＦＰおよび1mMのＰＭＳＦを含む0.05Mのト
リス塩酸緩衝液(pH7.5)を加えて溶解した。同一の緩衝
液で平衡化したＤＥＡＥ-Sepharose CL-6Bカラムにか
け、素通り画分を採取した。採取液に硫酸アンモニウム
粉末を加えて50％飽和とし、１時間攪拌後、8000rpm/mi
nで15分間遠心し、上清を採取した。さらに硫酸アンモ
ニウム粉末を加えて50％飽和とし、１時間攪拌後8000rp
m/minで15分間遠心し、上清を採取した。沈殿に0.1Mの
塩化ナトリウム、1mMの塩酸ベンズアミジン、0.1mMのＤ
ＦＰおよび0.1mMのＰＭＳＦを含む0.05Mのトリス緩衝液
(pH6.0)を加えて溶解し、同一緩衝液に対して透析し
た。デキストラン硫酸アガロースカラムにかけ、ＰＣＩ
画分に硫酸アンモニウム粉末を加えて80％飽和させた。
10000rpm/minで15分間遠心し沈殿を採取して、溶解可能
な最小液量の0.15Mの塩化ナトリウムを含む0.05Mのトリ
ス塩酸緩衝液(pH7.5)に溶解した後、Ultrogel AcA44カ
ラムにかけ、ＰＣＩ画分を集めて0.05Mのトリス塩酸緩
衝液(pH9.0)に透析した。その後ＤＥＡＥ-Sephacelにか
け精製ＰＣＩを得た。回収率は９％であった。2) Purification of protein C inhibitor All operations were carried out at 4 ° C. In 4 liters of fresh plasma, benzamidine hydrochloride (10 mM; final concentration, the same applies hereinafter), DFP
(1 mM), PMSF (1 mM) and soybean trypsin inhibitor (50 mg / L), and 320 mL of 1M barium chloride was added dropwise. After stirring the mixture for 1 hour, the mixture was centrifuged at 5000 rpm / min for 30 minutes, the supernatant was collected, and solid PEG6000 was added to a concentration of 60 g / liter. After stirring for 1 hour, 30 minutes at 5000 rpm / min
After centrifugation for minutes, the precipitate was removed. The supernatant contains more solid PE
G6000 was added to a concentration of 60 g / liter, stirred for 1 hour, and centrifuged at 5000 rpm / min for 30 minutes to collect a precipitate. The precipitate was dissolved by adding 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.1 M ammonium chloride, 10 mM benzamidine hydrochloride, 1 mM DFP and 1 mM PMSF. The fraction was passed through a DEAE-Sepharose CL-6B column equilibrated with the same buffer, and a flow-through fraction was collected. Ammonium sulfate powder was added to the collected solution to make it 50% saturated, and after stirring for 1 hour, 8000 rpm / mi
The mixture was centrifuged at n for 15 minutes, and the supernatant was collected. Further, ammonium sulfate powder was added to make 50% saturation, and after stirring for 1 hour, 8000 rp
The mixture was centrifuged at m / min for 15 minutes, and the supernatant was collected. 0.1 M sodium chloride, 1 mM benzamidine hydrochloride, 0.1 mM D
0.05 M Tris buffer containing FP and 0.1 mM PMSF
(pH 6.0) and dissolved, and dialyzed against the same buffer. Apply to a dextran sulfate agarose column,
Ammonium sulfate powder was added to the fraction to make it 80% saturated.
The precipitate was collected by centrifugation at 10,000 rpm / min for 15 minutes, and dissolved in a 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing a minimum dissolvable amount of 0.15 M sodium chloride, and then applied to an Ultrogel AcA44 column. The PCI fraction was collected and dialyzed against 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 9.0). Thereafter, the resultant was subjected to DEAE-Sephacel to obtain purified PCI. The recovery rate was 9%.
【００１０】3)ＣＩＣの調製 1mg/mlの精製ＰＣ溶液100μlに100U/mlのトロンビン溶
液50μlを加え、１時間反応させた後、5U/mlのヘパリン
存在下にアンチトロンビンIII(0.1μg/ml)を150μl加え
て反応を停止させた。上記方法で調製したＡＰＣ溶液(5
μg/ml)1mlと精製ＰＣＩ溶液(1mg/ml)15μlを、2mMのＥ
ＤＴＡ、5U/mlのへパリン存在下で混合し、37℃で30分
間インキュベートした。合成基質S-2366(第一化学薬品
社製)を使用してＡＰＣ活性を測定したところ、残存活
性はなかった。3) Preparation of CIC 50 μl of a 100 U / ml thrombin solution was added to 100 μl of a 1 mg / ml purified PC solution and reacted for 1 hour, and then antithrombin III (0.1 μg / ml) was added in the presence of 5 U / ml heparin. ) Was added to stop the reaction. The APC solution (5
μg / ml) and 15 μl of the purified PCI solution (1 mg / ml) were added to 2 mM E
DTA was mixed in the presence of 5 U / ml heparin and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. When the APC activity was measured using the synthetic substrate S-2366 (manufactured by Daiichi Kagaku), there was no residual activity.
【００１１】4)抗ＣＩＣモノクローナル抗体の作製 100μgのＣＩＣを含む溶液を同容量のフロイント完全ア
ジュバントとともに、BALB/cマウスの腹腔内に２週間間
隔で５回投与した。マウスの血清中に抗体が産生してい
ることを確認後、100μgのＣＩＣを含む溶液を尾静脈内
に投与した。３日後に脾臓を摘出し、ケーラーおよびミ
ルステインの方法によって、ポリエチレングリコール15
00を使用して脾臓細胞をミエローマ細胞P3UIと細胞融合
させた。その後、ＰＣ、ＰＣＩおよびＣＩＣを抗原とし
て、ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングを実施した。限界希
釈法によって、ＰＣおよびＰＣＩとは反応せず、ＣＩＣ
のみに対して特異的に反応するモノクローナル抗体を得
た。4) Preparation of Anti-CIC Monoclonal Antibody A solution containing 100 μg of CIC was intraperitoneally administered to BALB / c mice 5 times at an interval of 2 weeks together with an equal volume of Freund's complete adjuvant. After confirming that the antibody was produced in the serum of the mouse, a solution containing 100 μg of CIC was administered into the tail vein. Three days later, the spleen was removed, and polyethylene glycol 15 was removed by the method of Koehler and Milstein.
Spleen cells were cell fused with myeloma cell P3UI using 00. Thereafter, screening was performed by ELISA using PC, PCI and CIC as antigens. No reaction with PC and PCI by limiting dilution method, CIC
A monoclonal antibody that specifically reacts with only one was obtained.
【００１２】5)抗ＣＩＣモノクローナル抗体の反応特異
性 トロンビンとＰＣＩを5U/mlヘパリン存在下でインキュ
ベートし、経時的にサンプリングを行い、ウエスタンブ
ロット法で上記のモノクローナル抗体の反応性を検討し
た。その結果、本抗体はＰＣＩとは実質的に反応せず、
トロンビンとＰＣＩの複合体、およびトロンビンとの反
応の結果生成した修飾型ＰＣＩと反応した(図１)。この
ことから本抗体は、複合体の形成によりＰＣＩに出現す
る新しいエピトープを認識することが予想された。5) Reaction specificity of anti-CIC monoclonal antibody Thrombin and PCI were incubated in the presence of 5 U / ml heparin, sampling was performed with time, and the reactivity of the above monoclonal antibody was examined by Western blotting. As a result, the antibody did not substantially react with PCI,
It reacted with the complex of thrombin and PCI and the modified PCI generated as a result of the reaction with thrombin (FIG. 1). From this, it was expected that this antibody would recognize a new epitope appearing in PCI due to complex formation.
【００１３】実施例２ ＰＣＩ−ウロキナーゼ複合体に
対する抗ＣＩＣモノクローナル抗体の反応性 実施例１と同様の方法で、ＰＣＩ−２本鎖ウロキナーゼ
複合体と抗ＣＩＣモノクローナル抗体の反応性をウェス
タンブロット法で検討した。その結果、ＰＣＩ−ウロキ
ナーゼ複合体のみにバンドが発現し、ＰＣＩ、２本鎖ウ
ロキナーゼではバンドはみられなかった。Example 2 Reactivity of anti-CIC monoclonal antibody to PCI-urokinase complex In the same manner as in Example 1, the reactivity of PCI-double-chain urokinase complex and anti-CIC monoclonal antibody was examined by Western blotting. did. As a result, a band was expressed only in the PCI-urokinase complex, and no band was observed in PCI and double-chain urokinase.
【００１４】実施例３ ＰＣＩ−血漿カリクレイン複合
体に対する抗ＣＩＣモノクローナル抗体の反応性 実施例１と同様の方法で、ＰＣＩ−血漿カリクレイン複
合体と抗ＣＩＣモノクローナル抗体の反応性をウェスタ
ンブロット法で検討した。その結果、ＰＣＩ−血漿カリ
クレイン複合体のみにバンドが発現し、ＰＣＩ、血漿カ
リクレインではバンドはみられなかった。Example 3 Reactivity of anti-CIC monoclonal antibody to PCI-plasma kallikrein complex In the same manner as in Example 1, the reactivity of PCI-plasma kallikrein complex and anti-CIC monoclonal antibody was examined by Western blotting. . As a result, a band was expressed only in the complex of PCI and plasma kallikrein, but no band was observed in PCI and plasma kallikrein.
【００１５】実施例４ 健常人における血漿中ＣＩＣの
測定 1)抗ＰＣモノクローナル抗体の作製 実施例１と同様の方法によって精製した100μgのＰＣを
含む溶液を、同容量のフロイント完全アジュバントとと
もに、BALB/cマウスの腹腔内に２週間間隔で５回投与し
た。血清中の抗ＰＣ抗体を確認した後、100μgのＰＣ溶
液を尾静脈内に投与した。３日後に脾臓を摘出し、ケー
ラーおよびミルステインの方法で、ポリエチレングリコ
ール1500を使用して脾臓細胞をミエローマ細胞P3UIと細
胞融合させた。その後、ＰＣおよびＣＩＣを抗原とし
て、ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングを実施した。限界希
釈法によって、両方の抗原に対して反応するモノクロー
ナル抗体を得た。Example 4 Measurement of CIC in Plasma in Healthy Individuals 1) Preparation of Anti-PC Monoclonal Antibody A solution containing 100 μg of PC purified in the same manner as in Example 1 was mixed with an equal volume of Freund's complete adjuvant together with BALB / c mice were intraperitoneally administered 5 times at 2 week intervals. After confirming the anti-PC antibody in the serum, 100 μg of the PC solution was administered into the tail vein. Three days later, the spleen was excised, and the spleen cell was fused with myeloma cell P3UI using polyethylene glycol 1500 by the method of Kohler and Milstein. Thereafter, screening was performed by ELISA using PC and CIC as antigens. A monoclonal antibody reactive to both antigens was obtained by limiting dilution.
【００１６】2)抗ＣＩＣ抗体固相化ビーズの調製 実施例１で得た精製抗ＣＩＣ抗体を、0.15Mの塩化ナト
リウムを含む0.15Mのリン酸緩衝液(pH7.8)で0.5mg/mlの
濃度になるように調製し、抗体溶液1mlと30mgのDynabea
ds M450 Uncoated(ダイナール社)を混合し、室温で一夜
混和した。１％のＢＳＡおよび0.15Mの塩化ナトリウム
を含む0.15Mのリン酸緩衝液(pH7.8)で洗浄した後、同溶
液に懸濁して保存した。2) Preparation of beads immobilized with anti-CIC antibody The purified anti-CIC antibody obtained in Example 1 was added to a 0.15 M phosphate buffer (pH 7.8) containing 0.15 M sodium chloride at 0.5 mg / ml. 1 ml of antibody solution and 30 mg of Dynabea
ds M450 Uncoated (Dynal) was mixed and mixed overnight at room temperature. After washing with a 0.15 M phosphate buffer (pH 7.8) containing 1% BSA and 0.15 M sodium chloride, the cells were suspended and stored in the same solution.
【００１７】3)標識抗体の作製 標識用の抗体には前記の抗ＰＣ抗体を用いた。抗体を0.
15Mの塩化ナトリウムを含む0.15Mのリン酸緩衝液(pH7.
8)で、2mg/mlの濃度になるように調製した。この抗体溶
液0.5mlとジメチルスルホキサイドに溶解した標識プロ
ーブである、[4-(N-サクシミジルオキシ-カルボニルプ
ロピル)-4'-メチル-2,2'-ビピリジン]ビス(2,2'-ビピリ
ジン)ルテニウム(II)ジヘキサフルオロフォスフェイト
溶液35μlを混合し、室温で30分間攪拌した。2Mのグリ
シン溶液を10μl加え、さらに室温で10分間攪拌し、反
応を停止させた。その後ゲル濾過によって標識抗体を精
製した。3) Preparation of Labeled Antibody The above-mentioned anti-PC antibody was used as a labeling antibody. Antibody 0.
0.15 M phosphate buffer containing 15 M sodium chloride (pH 7.
In step 8), the solution was prepared to have a concentration of 2 mg / ml. [4- (N-succimidyloxy-carbonylpropyl) -4′-methyl-2,2′-bipyridine] bis (2,2) which is a labeled probe dissolved in 0.5 ml of this antibody solution and dimethyl sulfoxide 35 μl of '-bipyridine) ruthenium (II) dihexafluorophosphate solution was mixed and stirred at room temperature for 30 minutes. 10 μl of a 2M glycine solution was added, and the mixture was further stirred at room temperature for 10 minutes to stop the reaction. Thereafter, the labeled antibody was purified by gel filtration.
【００１８】4)測定方法 健常人81例から得た血漿および標準抗原を、それぞれ、
0.15Mの塩化ナトリウム、5mMのＥＤＴＡを含む30mMのリ
ン酸緩衝液(pH6.5)、および7％ウシ血清アルブミンを含
む50mMのリン酸緩衝液(pH6.5)で希釈した。標識抗体は1
0％の正常ウサギ血清を含む50mMのリン酸緩衝液(pH6.5)
で希釈した。抗ＣＩＣ抗体固相化ビーズは反応溶液に懸
濁させた。サンプル溶液200μlにビーズ懸濁液を25μl
を加えて攪拌後、室温で４分間反応させた。さらに同様
の操作を行った後、磁気ラックを用いてビーズを集め、
上清をデカントによって除去し、ビーズを0.15Mの塩化
ナトリウムおよび0.01％のTween20を含む10mMのトリス
塩酸緩衝液(pH7.5)で洗浄した。次に標識抗体溶液200μ
lを加えて攪拌後、室温で４分間反応させた。さらに同
様の操作を行った後、磁気ラックを用いてビーズを集
め、上清をデカントによって除去した。ビーズを洗浄
後、0.05％のTween20および50mMのトリプロピルアミン
を含む0.15Mのリン酸緩衝液(pH7.5)を300μl加えて、ビ
ーズを懸濁し電気化学発光測定法(ＥＣＬ法)で測定し
た。その結果、健常人81例の血漿中ＣＩＣ濃度は1.56±
0.48(平均±標準偏差)ng/mlであった。4) Measurement method Plasma and standard antigens obtained from 81 healthy subjects were
It was diluted with 30 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.15 M sodium chloride, 5 mM EDTA, and 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 7% bovine serum albumin. Labeled antibody is 1
50 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 0% normal rabbit serum
Diluted. The anti-CIC antibody-immobilized beads were suspended in the reaction solution. 25 μl of bead suspension in 200 μl of sample solution
Was added and stirred, and reacted at room temperature for 4 minutes. After performing the same operation, the beads were collected using a magnetic rack,
The supernatant was removed by decanting and the beads were washed with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.15 M sodium chloride and 0.01% Tween20. Next, labeled antibody solution 200μ
After adding l and stirring, the mixture was reacted at room temperature for 4 minutes. After further performing the same operation, the beads were collected using a magnetic rack, and the supernatant was removed by decantation. After washing the beads, 300 μl of 0.15 M phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20 and 50 mM tripropylamine was added, the beads were suspended, and the suspension was measured by an electrochemiluminescence method (ECL method). . As a result, the CIC concentration in the plasma of 81 healthy subjects was 1.56 ±
It was 0.48 (mean ± standard deviation) ng / ml.
【００１９】実施例５ 人工透析患者における血漿中Ｃ
ＩＣの測定 実施例４と同様の方法で、人工透析を受けている患者18
例の血漿中ＣＩＣ濃度を測定した。その結果、血漿中Ｃ
ＩＣ濃度は4.00±2.67(平均±標準偏差)ng/mlであっ
た。また、同時にＥＬＩＳＡ法(特開平２−２３６４５
２)によって、血漿中ＣＩＣ濃度を測定し上記結果と比
較した。その結果、ＥＣＬ法とＥＬＩＳＡ法による測定
値の間には、相関係数0.87と高い相関関係がみられた
(図２)。Example 5 C in Plasma in Patients on Hemodialysis
Measurement of IC In the same manner as in Example 4, patients receiving dialysis 18
The plasma CIC concentration of the examples was measured. As a result, plasma C
The IC concentration was 4.00 ± 2.67 (mean ± standard deviation) ng / ml. At the same time, the ELISA method (Japanese Unexamined Patent Publication No.
According to 2), the CIC concentration in plasma was measured and compared with the above results. As a result, a high correlation with a correlation coefficient of 0.87 was observed between the values measured by the ECL method and the ELISA method.
(FIG. 2).
【００２０】[0020]
【図１】ＰＣＩとトロンビンをインキュベート後、抗Ｃ
ＩＣ抗体に対する反応性をウェスタンブロッティング法
で確認した結果を示した図である。FIG. 1. Incubation of PCI and thrombin with anti-C
FIG. 3 is a view showing the results of confirming the reactivity to an IC antibody by Western blotting.
【図２】ＥＣＬ法とＥＬＩＳＡ法による血漿中ＣＩＣ濃
度の相関関係を示した図である。FIG. 2 is a diagram showing the correlation between the CIC concentration in plasma by the ECL method and the ELISA method.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI G01N 33/577 C12P 21/08 // C12P 21/08 C12N 15/00 C
Claims (8)
の複合体を認識するモノクローナル抗体であって、イン
タクトのプロテインＣインヒビターを実質的に認識せ
ず、該複合体中のプロテインＣインヒビターを認識する
モノクローナル抗体。1. A monoclonal antibody that recognizes a complex of a protein C inhibitor and a protease, wherein the monoclonal antibody does not substantially recognize an intact protein C inhibitor and recognizes a protein C inhibitor in the complex.
カリクレイン、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、トロンビ
ン、ウロキナーゼまたは組織中プラスミノーゲン活性化
因子である請求項１記載のモノクローナル抗体。2. The monoclonal antibody according to claim 1, wherein the protease is activated protein C, plasma kallikrein, factor Xa, factor XIa, thrombin, urokinase or tissue plasminogen activator.
請求項１記載のモノクローナル抗体。3. The monoclonal antibody according to claim 1, wherein the protease is activated protein C.
の複合体を測定する方法であって、（１）生体試料中の
プロテインＣインヒビターとプロテアーゼの複合体と請
求項１記載のモノクローナル抗体を含むものからなる試
薬を混合し、免疫反応物を生成させる工程、（２）上記
免疫反応物を分離した後、複合体中のプロテアーゼを認
識する標識抗体と反応させる工程、（３）複合体に結合
した標識抗体を測定する工程、からなる測定方法。4. A method for measuring a complex of a protein C inhibitor and a protease, comprising: (1) a reagent comprising a complex of a protein C inhibitor and a protease in a biological sample and the monoclonal antibody according to claim 1. (2) separating the immunoreactant and reacting it with a labeled antibody that recognizes a protease in the complex, and (3) reacting the labeled antibody bound to the complex. A measuring method comprising a step of measuring.
り、標識抗体が標識抗活性化プロテインＣ抗体または標
識抗プロテインＣ抗体である請求項４に記載のプロテイ
ンＣインヒビターとプロテアーゼの複合体を測定する方
法。5. The method for measuring a protein C inhibitor-protease complex according to claim 4, wherein the protease is activated protein C and the labeled antibody is a labeled anti-activated protein C antibody or a labeled anti-protein C antibody. .
の複合体を認識するモノクローナル抗体であって、イン
タクトのプロテインＣインヒビターは実質的に認識せ
ず、該複合体中のプロテインＣインヒビターを認識する
モノクローナル抗体を構成成分とするプロテインＣイン
ヒビターとプロテアーゼの複合体の測定試薬。6. A monoclonal antibody recognizing a complex of a protein C inhibitor and a protease, wherein the monoclonal antibody does not substantially recognize an intact protein C inhibitor and recognizes a protein C inhibitor in the complex. A reagent for measuring a complex of a protein C inhibitor and a protease as components.
の複合体を認識するモノクローナル抗体であって、イン
タクトのプロテインＣインヒビターは実質的に認識せ
ず、該複合体中のプロテインＣインヒビターを認識する
モノクローナル抗体と、複合体中のプロテアーゼを認識
する抗体を構成成分とするプロテインＣインヒビターと
プロテアーゼの複合体の測定試薬。7. A monoclonal antibody that recognizes a complex of a protein C inhibitor and a protease, wherein the monoclonal antibody does not substantially recognize an intact protein C inhibitor and recognizes a protein C inhibitor in the complex. A reagent for measuring a complex of a protein C inhibitor and a protease, which comprises an antibody that recognizes the protease in the complex.
の複合体を認識するモノクローナル抗体であって、イン
タクトのプロテインＣインヒビターは実質的に認識せ
ず、該複合体中のプロテインＣインヒビターを認識する
モノクローナル抗体と、抗活性化プロテインＣ抗体また
は抗プロテインＣ抗体を構成成分とするプロテインＣイ
ンヒビターとプロテアーゼの複合体の測定試薬。8. A monoclonal antibody recognizing a complex of a protein C inhibitor and a protease, wherein the monoclonal antibody does not substantially recognize an intact protein C inhibitor and recognizes a protein C inhibitor in the complex. A reagent for measuring a complex of a protein C inhibitor and a protease, comprising an anti-activated protein C antibody or an anti-protein C antibody as a component.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28808697A JPH11124399A (en) | 1997-10-21 | 1997-10-21 | Monoclonal antibody for measuring protein c inhibitor-protease complex |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28808697A JPH11124399A (en) | 1997-10-21 | 1997-10-21 | Monoclonal antibody for measuring protein c inhibitor-protease complex |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11124399A true JPH11124399A (en) | 1999-05-11 |
Family
ID=17725617
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|---|---|---|---|
| JP28808697A Pending JPH11124399A (en) | 1997-10-21 | 1997-10-21 | Monoclonal antibody for measuring protein c inhibitor-protease complex |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11124399A (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000047626A1 (en) * | 1999-02-09 | 2000-08-17 | Protease Ab | Monoclonal antibody |
| WO2004065418A1 (en) * | 2003-01-20 | 2004-08-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-pci neutralizing antibody |
| US7517965B2 (en) | 2002-07-22 | 2009-04-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Non-neutralizing anti-aPC antibodies |
| WO2023163176A1 (en) * | 2022-02-28 | 2023-08-31 | 住友ベークライト株式会社 | Reagent for use in detection or measurement of serine protease |
-
1997
- 1997-10-21 JP JP28808697A patent/JPH11124399A/en active Pending
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