JPH11101802A - Measurement method utilizing specific bonding - Google Patents
Measurement method utilizing specific bondingInfo
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- JPH11101802A JPH11101802A JP26348197A JP26348197A JPH11101802A JP H11101802 A JPH11101802 A JP H11101802A JP 26348197 A JP26348197 A JP 26348197A JP 26348197 A JP26348197 A JP 26348197A JP H11101802 A JPH11101802 A JP H11101802A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、特異結合を利用す
る測定方法に関するものであり、免疫的結合（抗原と抗
体の特異結合）、核酸の相補的結合（ＤＮＡ及びＲＮＡ
を含む核酸の特異結合）、リガンド結合（リガンドとレ
セプターの特異結合）等、種々の特異結合を利用する新
規な測定法である。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a measurement method utilizing specific binding, and specifically relates to immunological binding (specific binding between an antigen and an antibody) and complementary binding of nucleic acid (DNA and RNA).
This is a novel assay utilizing various specific bindings, such as specific binding of nucleic acids containing) and ligand binding (specific binding between ligand and receptor).
【０００２】[0002]
【従来の技術】免疫測定、核酸プローブ測定、レセプタ
測定等、免疫的結合、核酸の相補的結合或いはリガンド
結合等の特異結合を利用した測定法が広く知られてい
る。これらの測定法は、特異的な結合対を形成する物質
が抗原と抗体であるか、相補的な核酸分子であるか、或
いはリガンドとレセプターであるかの相違のみであり、
基本的な原理は同一である。2. Description of the Related Art There are widely known immunoassays, nucleic acid probe assays, receptor assays, and other assay methods utilizing specific binding such as immunological binding, nucleic acid complementary binding or ligand binding. These assays only differ in whether the substance forming the specific binding pair is an antigen and an antibody, a complementary nucleic acid molecule, or a ligand and a receptor,
The basic principle is the same.
【０００３】以下、測定対象物質が抗原又はハプテンで
ある、免疫的結合を利用する免疫測定を例として述べ
る。[0003] Hereinafter, an immunoassay utilizing immunological binding in which the substance to be measured is an antigen or a hapten will be described as an example.
【０００４】抗原性物質を高感度で検出する免疫測定に
は、例えば抗原性物質の異なるエピトープを認識する２
種類の抗体を用いるサンドイッチ測定法がある。該測定
法では、例えば、一方の抗体を不溶性担体に結合し、他
方を光学的に検出可能な標識物質や光学的に検出可能な
物質を生成する反応を触媒する酵素等の標識物質と結合
してラベル化剤（コンジュゲート）とし、使用する。In an immunoassay for detecting an antigenic substance with high sensitivity, for example, 2
There is a sandwich assay using different types of antibodies. In this measurement method, for example, one antibody is bound to an insoluble carrier, and the other is bound to a labeling substance such as an optically detectable labeling substance or an enzyme that catalyzes a reaction for producing an optically detectable substance. To use as a labeling agent (conjugate).
【０００５】抗原性物質の中でもハプテンと呼ばれる低
分子化合物を検出する免疫測定では、例えば、前記担体
と結合した抗体及び標識物質と結合したハプテンを使用
する、いわゆる競合測定法が知られている。In an immunoassay for detecting a low molecular weight compound called a hapten among antigenic substances, for example, a so-called competitive assay method using an antibody bound to the carrier and a hapten bound to a labeling substance is known.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】前記したサンドイッチ
測定法では、免疫反応が担体の表面付近で生じるため、
反応速度が液体中で生じる反応と比較して遅いという課
題がある。これを解決するために免疫反応に長い時間を
費やすと単位時間当たりの測定実施数が減少してしま
う。反応速度を増すためにラベル化剤量を増加すると、
担体に非特異的に吸着するラベル化剤量も増加し、測定
感度が悪化するという課題を生じかねない。サンドイッ
チ測定法における他の課題として、測定対象物濃度が高
い場合、いわゆるプロゾーン現象（ハイドースフック効
果）が生じるという課題がある。プロゾーン現象の発生
は、高濃度の測定対象物質が存在するにもかかわらず、
低濃度であるという誤った測定結果を生じかねない。プ
ロゾーン減少を避けるにはラベル化剤量を増加すること
が効果的であるが、この場合、前記同様にラベル化剤の
非特異的吸着が増加し、測定感度が悪化するという課題
を生じかねない。In the above-described sandwich assay, an immune reaction occurs near the surface of the carrier.
There is a problem that the reaction rate is slower than the reaction occurring in a liquid. If a long time is spent for an immune reaction to solve this, the number of measurements performed per unit time decreases. Increasing the amount of labeling agent to increase the reaction rate,
The amount of the labeling agent non-specifically adsorbed on the carrier also increases, which may cause a problem that the measurement sensitivity is deteriorated. As another problem in the sandwich measurement method, there is a problem that a so-called prozone phenomenon (a high-dose hook effect) occurs when the concentration of an object to be measured is high. The occurrence of the prozone phenomenon occurs despite the high concentration of the analyte.
This can result in false measurements of low concentrations. It is effective to increase the amount of labeling agent in order to avoid a decrease in prozone, but in this case, non-specific adsorption of the labeling agent increases as described above, which may cause a problem that measurement sensitivity deteriorates. Absent.
【０００７】前記した競合測定法においても、免疫反応
は担体の表面付近で生じるため、サンドイッチ測定法同
様の課題がある。また競合測定法では、測定対象物質の
低濃度領域での測定において、測定対象物質が存在しな
い場合に得られる大きなレベルの信号に対し、信号の小
さな変化を検出しなければならないため、低濃度領域で
の測定精度を上げることが困難であるという課題もあ
る。[0007] Even in the competitive assay described above, since the immune reaction occurs near the surface of the carrier, there is a problem similar to the sandwich assay. Also, in the competitive measurement method, in the measurement in the low concentration region of the target substance, a small change in the signal must be detected with respect to a large level signal obtained when the target substance is not present. There is also a problem that it is difficult to increase the measurement accuracy in the measurement.
【０００８】従って本発明は、これら課題を解決し、迅
速且つ正確に、しかもいわゆるプロゾーン現象が生じた
場合の誤測定を回避できる測定方法を提供することを目
的とするものである。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to solve these problems and to provide a measuring method capable of quickly and accurately avoiding erroneous measurement when a so-called prozone phenomenon occurs.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】本発明者は、前記課題に
鑑みて鋭意検討を行った結果、本発明を完成するに至っ
た。即ち本発明は、異なる蛍光物質で標識された単一の
測定対象物質に特異的かつ同時に結合可能な２種類以上
のラベル剤と該測定対象物質を溶液中で接触、反応させ
て反応液を形成し、反応液中の反応生成物及び／又は未
反応物を１分子ずつ分離した状態で蛍光測定部位におい
て前記ラベル剤から発せられる蛍光を測定し、該測定結
果から該分子を反応生成物及び／又は未反応物に同定、
計数し、かつ、少なくとも一つの同定物についての計数
値から測定対象物質の量及び／又は濃度を決定する、測
定方法である。Means for Solving the Problems The present inventor has made intensive studies in view of the above problems, and as a result, completed the present invention. That is, the present invention provides a reaction solution by contacting and reacting two or more types of labeling agents that can specifically and simultaneously bind to a single measurement target substance labeled with different fluorescent substances with the measurement target substance in a solution. Then, the fluorescence emitted from the labeling agent at the fluorescence measurement site is measured in a state where the reaction products and / or unreacted substances in the reaction solution are separated one by one, and the reaction products and / or Or identified as unreacted,
This is a measurement method of counting and determining the amount and / or concentration of a substance to be measured from the count value of at least one identified substance.
【００１０】また本発明は、蛍光物質で予め標識された
測定対象物質、該蛍光物質とは異なる蛍光物質で標識さ
れた測定対象物質に結合可能なラベル剤及び測定対象物
質を溶液中で接触、反応させて反応液を形成し、反応液
中の反応生成物及び／又は未反応物を１分子ずつ分離し
た状態で蛍光測定部位において前記ラベル剤から発せら
れる蛍光を測定し、該測定結果か該分子を反応生成物及
び／又は未反応物に同定、計数し、かつ、少なくとも一
つの同定物についての計数値から測定対象物質の量及び
／又は濃度を決定する、測定方法である。以下、本発明
を詳細に説明する。[0010] The present invention also relates to a method in which a measurement target substance previously labeled with a fluorescent substance, a labeling agent capable of binding to a measurement target substance labeled with a fluorescent substance different from the fluorescent substance, and a measurement target substance are contacted in a solution. The reaction is carried out to form a reaction solution, and the fluorescence emitted from the labeling agent is measured at the fluorescence measurement site in a state where the reaction products and / or unreacted substances in the reaction solution are separated one by one. This is a measurement method in which a molecule is identified and counted as a reaction product and / or an unreacted product, and the amount and / or concentration of a substance to be measured is determined from a count value of at least one identified product. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
【００１１】本発明では、測定対象物質に特異的に結合
可能なラベル剤を使用する。ここでラベル剤は、蛍光物
質で標識された測定対象物質と特異的に結合可能な物
質、即ち、蛍光物質及び測定対象物質に特異的に結合可
能な物質（以下、特異結合物質と略する）から構成され
る。本発明においては、測定対象物質とラベル剤中の特
異結合物質の組み合わせは任意に選択することが可能で
ある。例えば測定対象物質が抗原や抗体である場合、特
異結合物質として抗体や抗原を用いることで、免疫的結
合を利用する測定法を実施することが可能である。例え
ば測定対象物質がＤＮＡやＲＮＡ等の核酸である場合、
特異結合物質として抗体や相補的核酸（断片）を用いる
ことで、前者であれば免疫的結合を利用する測定法を、
後者であれば核酸の相補的結合を利用する測定法を実施
することが可能である。例えば測定対象物質がリガンド
や該リガンドのレセプターである場合、特異結合物質と
してリガンドレセプターやリガンドを用いることで、リ
ガンド結合を利用する測定法を実施可能である。In the present invention, a labeling agent capable of specifically binding to a substance to be measured is used. Here, the labeling agent is a substance that can specifically bind to the measurement target substance labeled with a fluorescent substance, that is, a substance that can specifically bind to the fluorescent substance and the measurement target substance (hereinafter, abbreviated as a specific binding substance). Consists of In the present invention, the combination of the substance to be measured and the specific binding substance in the labeling agent can be arbitrarily selected. For example, when the substance to be measured is an antigen or an antibody, a measurement method utilizing immunological binding can be performed by using an antibody or an antigen as the specific binding substance. For example, when the substance to be measured is a nucleic acid such as DNA or RNA,
By using an antibody or a complementary nucleic acid (fragment) as a specific binding substance, the former method uses an immunological binding method.
In the latter case, it is possible to carry out a measuring method utilizing complementary binding of nucleic acids. For example, when the substance to be measured is a ligand or a receptor for the ligand, a measurement method utilizing ligand binding can be performed by using a ligand receptor or a ligand as a specific binding substance.
【００１２】なお、ラベル剤を構成する特異結合物質
は、天然に存在する形態であっても良いし、前記結合能
力を保持している限り、人工的に断片化等されていても
良い。例えば抗体を用いる場合、天然型（インタクト
型）はもちろん、Fab'型等の断片化された抗体であって
も良い。通常、測定対象物質との特異的結合に関与する
部分以外を除去した抗体断片等は、天然型のものに比較
して、測定対象物質との結合の際のラベル剤同士の立体
的障害や非特異的結合が小さく、好ましい。更に特異結
合物質は、測定対象物質と直接、特異的に結合するもの
であっても、あるいは測定対象物質と特異的に結合する
物質を介して間接に、特異的に結合するものであって
も、特に制限はない。前者の例としては測定対象物質で
ある抗原に特異的に結合可能な抗体を、後者の例として
は測定対象物質である抗原に特異的に結合可能な抗体に
対して特異的に結合可能な抗体が例示できる。本明細書
において特に断らない限り、特異結合物質には直接測定
対象物質と結合可能なものと、間接的に測定対象物質と
結合可能なものの両者を含む。[0012] The specific binding substance constituting the labeling agent may be in a naturally occurring form, or may be artificially fragmented or the like as long as the binding ability is maintained. For example, when an antibody is used, a fragmented antibody such as a Fab 'type or the like may be used as well as a natural type (intact type). Usually, antibody fragments or the like from which portions other than those involved in specific binding to the target substance are removed are sterically hindered or non-sterile between labeling agents when binding to the target substance, as compared with the natural type. Specific binding is small and preferred. Furthermore, the specific binding substance may be a substance that directly and specifically binds to the measurement target substance, or may be a substance that specifically binds indirectly via a substance that specifically binds to the measurement target substance. There is no particular limitation. An example of the former is an antibody capable of specifically binding to the antigen to be measured, and an example of the latter is an antibody capable of specifically binding to an antibody capable of specifically binding to the antigen to be measured. Can be exemplified. Unless otherwise specified in this specification, the specific binding substance includes both a substance capable of directly binding to a measurement target substance and a substance capable of indirectly binding to a measurement target substance.
【００１３】本発明では、ラベル剤を構成する蛍光物質
として２種以上の蛍光物質を使用する。蛍光物質として
は、例えば蛍光寿命、励起スペクトル、蛍光スペクトル
等により光学的に相互区別可能な標識を使用する。具体
的な蛍光物質として、例えば、ＤＮＡの塩基配列決定の
際に使用される、異なる波長特性を有する蛍光物質から
適宜選択して使用することが例示できる。また他の蛍光
物質の例として、例えば組織の多色染色で使用される、
異なる波長特性を有する蛍光物質であるＦＩＴＣ、テキ
サスレッド、Ｃｙ５等から適宜選択して使用することも
例示できる。なお蛍光物質は、上記光学的特性のいずれ
か一つ以上の特性において区別可能であれば良く、例え
ば２以上の特性を比較してはじめて区別されるものであ
っても良い。測定対象物質が蛋白質である場合、紫外線
の照射により測定対象物質自体が蛍光を発することか
ら、３５０ｎｍ以上の波長で励起される蛍光物質を使用
することが好ましい。なお本発明においては、単一の測
定対象物質に複数の同一の特異結合物質が結合し得る場
合であっても、それを標識する蛍光物質が異なれば、異
なる種類のラベル剤である。In the present invention, two or more fluorescent substances are used as the fluorescent substances constituting the labeling agent. As the fluorescent substance, for example, a label that can be optically distinguished from each other by a fluorescence lifetime, an excitation spectrum, a fluorescence spectrum, or the like is used. Specific examples of the fluorescent substance include, for example, appropriately selecting and using fluorescent substances having different wavelength characteristics used in determining the base sequence of DNA. Also, as examples of other fluorescent substances, for example, used in multicolor staining of tissue,
It is also possible to exemplify the case where the fluorescent substance having different wavelength characteristics is appropriately selected from FITC, Texas Red, Cy5 and the like. It should be noted that the fluorescent substance only needs to be distinguishable in any one or more of the above-mentioned optical characteristics, and may be distinguished only by comparing two or more characteristics, for example. When the substance to be measured is a protein, the substance to be measured itself emits fluorescence when irradiated with ultraviolet light, and thus it is preferable to use a fluorescent substance that is excited at a wavelength of 350 nm or more. In the present invention, even if a plurality of the same specific binding substances can bind to a single substance to be measured, they are different types of labeling agents if the fluorescent substances that label them are different.
【００１４】ラベル剤は、蛍光物質を前記した特異結合
物質と結合することにより調製する。調製方法として
は、二官能性の架橋剤を使用する方法をはじめ、従来か
ら知られている方法を使用することができるが、調製操
作を行った後に例えば液体クロマトグラフィーにより分
離等を行い、未反応蛍光物質やラベル剤同士が凝集した
凝集体を除去する精製を行っておくことが好ましい。The labeling agent is prepared by binding a fluorescent substance to the above-mentioned specific binding substance. As a preparation method, a conventionally known method including a method using a bifunctional cross-linking agent can be used.However, after performing the preparation operation, separation or the like is performed by, for example, liquid chromatography. It is preferable to purify the reaction fluorescent material or the labeling agent to remove aggregates formed by aggregation.
【００１５】その製造方法や精製方法によっては、特異
結合物質に対して１個又はそれ以上の決まった数の蛍光
物質が結合した均一なラベル剤はもとより、特異結合物
質に対して不定数の蛍光物質が結合した不均一なラベル
剤も調製される。前者の均一なラベル剤は、同じ分子種
であればほぼ一定強度の蛍光を得ることができるため、
比較的弱い蛍光信号においても誤って同定されることを
避けることが可能である点で好ましい。また、各分子種
の蛍光強度分布が小さければ、その強度情報を利用して
分子種を同定することも可能になる。更に蛍光物質の分
子数が少なければ、ラベル剤の全体としてのサイズを小
さくすることができ、結果的に測定対象物質への結合時
に立体障害を起こす可能性を低減できる。Depending on the production method or purification method, not only a uniform labeling agent having one or more fixed numbers of fluorescent substances bound to the specific binding substance but also a variable number of fluorescent substances bound to the specific binding substance. A heterogeneous labeling agent to which the substance is attached is also prepared. Since the former uniform labeling agent can obtain fluorescence of almost constant intensity with the same molecular species,
This is preferable in that it is possible to avoid erroneous identification of a relatively weak fluorescent signal. Further, if the fluorescence intensity distribution of each molecular species is small, it is possible to identify the molecular species using the intensity information. Furthermore, if the number of molecules of the fluorescent substance is small, the overall size of the labeling agent can be reduced, and as a result, the possibility of causing steric hindrance upon binding to the substance to be measured can be reduced.
【００１６】一方、後者の不均一なラベル剤は、調製が
容易であり、多数の蛍光物質が結合していることから容
易に強い蛍光信号を得ることができる点で好ましい。本
発明においては、いずれのラベル剤であっても使用可能
である。On the other hand, the latter heterogeneous labeling agent is preferable in that it can be easily prepared and a strong fluorescent signal can be easily obtained because a large number of fluorescent substances are bound thereto. In the present invention, any labeling agent can be used.
【００１７】以下、本発明が提供する第一の測定方法に
ついて、免疫的結合を利用する抗原物質の測定を例に説
明する。この測定方法では、抗原分子に対し、同時に結
合可能な２種類以上のラベル剤を使用するが、抗原分子
が同一のエピトープをラベル剤の種類の数以上有するも
のである場合には、特異結合物質として同一のモノクロ
ーナル抗体をも使用することができる。むろん、ラベル
剤の種類ごとに異なるモノクローナル抗体を使用した
り、モノクローナル抗体ではなく、ポリクローナル抗体
を使用することもできる。Hereinafter, the first measurement method provided by the present invention will be described by taking as an example the measurement of an antigenic substance utilizing immunological binding. In this measurement method, two or more types of labeling agents capable of simultaneously binding to an antigen molecule are used, but when the antigen molecule has the same epitope or more in number of types of labeling agents, a specific binding substance is used. The same monoclonal antibody can also be used. Of course, a different monoclonal antibody may be used for each type of labeling agent, or a polyclonal antibody may be used instead of a monoclonal antibody.
【００１８】使用するラベル剤の種類は、抗原物質のエ
ピトープの数等に応じて適宜選択すれば良く、２種類以
上であれば測定には十分であるが、バックグランドを小
さくしたり、プロゾーン現象を判定するためには３種類
のラベル剤を使用することが特に好ましい。The type of labeling agent to be used may be appropriately selected according to the number of epitopes of the antigenic substance, etc., and two or more types are sufficient for measurement. In order to determine the phenomenon, it is particularly preferable to use three types of labeling agents.
【００１９】まず、免疫反応を生じさせるのに適当な溶
液中で、抗原分子を含有する、例えばヒト血清等の検体
試料と２種以上のラベル剤を接触、反応させて反応液を
形成する。ラベル剤は一度に試料と接触させても良い
し、１種類ずつ、順に接触させても良い。First, a sample containing antigen molecules, such as human serum, is brought into contact with and reacted with two or more labeling agents in a solution suitable for generating an immune reaction to form a reaction solution. The labeling agent may be brought into contact with the sample at once, or may be brought into contact with each other one by one.
【００２０】反応液の形成後、免疫反応が生じるのに適
当な条件下に放置するが、反応温度等は通常の範囲で良
く、また、緩やかな撹拌等を行っても良い。本発明にお
ける免疫反応は液体反応であるため、放置する時間は従
来の担体を使用する方法に比較して短時間で良く、一例
を示せば３〜１０分で良い。After the reaction solution is formed, the reaction solution is left under conditions suitable for generating an immune reaction. The reaction temperature and the like may be in a normal range, and gentle stirring may be performed. Since the immune reaction in the present invention is a liquid reaction, the standing time may be shorter than that of a conventional method using a carrier, and may be, for example, 3 to 10 minutes.
【００２１】上記反応により、反応液中には、測定対象
物質である抗原分子と結合していないラベル剤と（以
下、未反応物と略する）、該抗原分子と結合したラベル
剤（以下、反応生成物と略する）が出現するが、試料中
の抗原分子の量や、接触させるラベル剤の量等との関係
により、反応生成物が出現しない場合や未反応物が残存
しない場合もあり得る。なお、実際の反応液中には、ラ
ベル剤と結合していない抗原分子等やその他の夾雑分子
も存在し得、これらは厳密な意味では未反応物である
が、後の蛍光物質の測定段階で測定されないことから本
発明では未反応物としては特に記載しない。例えば異な
る２種のラベル剤Ａ及びＢを用いた場合、蛍光測定によ
り同定されるのは蛍光物質としてＡのみを含む分子（ラ
ベル剤Ａのみ又は複合体）、Ｂのみを含む分子（ラベル
剤Ｂのみ又は複合体）、そしてＡ及びＢの両方を含む分
子（ラベル剤Ａ及びＢを含む複合体）である。例えば異
なる３種のラベル剤Ａ、Ｂ及びＣを用いた場合、蛍光測
定により同定されるのはＡのみを含む分子（ラベル剤Ａ
のみ又は複合体）、Ｂのみを含む分子（ラベル剤Ｂのみ
又は複合体）、Ｃのみを含む分子（ラベル剤Ｃのみ又は
複合体）、ＡとＢを含む分子（複合体）、ＢとＣを含む
分子（複合体）、ＡとＣを含む分子（複合体）、そして
Ａ、Ｂ及びＣの全てを含む分子（複合体）である。By the above reaction, a labeling agent not bound to an antigen molecule as a substance to be measured (hereinafter abbreviated as an unreacted substance) and a labeling agent bound to the antigen molecule (hereinafter abbreviated as “ Reaction products), but depending on the amount of antigen molecules in the sample, the amount of labeling agent to be brought into contact, etc., there may be no reaction products or no unreacted products remaining. obtain. In the actual reaction solution, antigen molecules and the like and other contaminant molecules which are not bound to the labeling agent may be present. These are unreacted substances in a strict sense, but are used in a subsequent fluorescent substance measurement step. In the present invention, it is not particularly described as an unreacted substance since it is not measured. For example, when two different types of labeling agents A and B are used, only the molecule containing only A as a fluorescent substance (labeling agent A alone or a complex) and the molecule containing only B (labeling agent B) are identified by fluorescence measurement. Only or a complex), and a molecule containing both A and B (a complex containing labeling agents A and B). For example, when three different types of labeling agents A, B, and C are used, only a molecule containing only A (labeling agent A) is identified by fluorescence measurement.
Only or complex), a molecule containing only B (labeling agent B only or complex), a molecule containing only C (labeling agent C only or complex), a molecule containing A and B (complex), B and C , A molecule containing A and C (complex), and a molecule containing all of A, B and C (complex).
【００２２】次に、反応液中の反応生成物及び／又は未
反応物を、１分子ずつ分離した状態で蛍光測定部位にお
いて測定する。本発明において１分子ずつ分離とは、時
間的又は空間的に１分子ずつ測定可能な状態にすること
を意味し、またここで、１分子ずつとは「未反応のラベ
ル剤分子ごと」、「抗原分子等とラベル剤を含む分子
（複合体）ごと」を意味する。Next, the reaction products and / or unreacted products in the reaction solution are measured at the fluorescence measurement site while being separated one by one. In the present invention, “separating one molecule at a time” means to make it possible to measure one molecule at a time or space, and “one molecule at a time” means “every unreacted labeling agent molecule”, “ Each molecule (complex) containing an antigen molecule or the like and a labeling agent ".
【００２３】１分子ずつ分離した状態を実現するには、
例えば、従来のフローサイトメトリー法等で使用されて
いるシースフローを利用することが例示できる。具体的
には、後の図１に例示したように、外管の内側に先端を
切った細管を外管と同心に配置し、細管から反応液を流
すと共に、細管外壁と外管内壁の間にシース液を流せば
良い。細管の先端下流の位置で外管の内径は絞られてお
り、細管の開口での反応液の線速に比較してシース液の
線速が大きくされていることと相まって、反応液はミク
ロンオーダーの太さの中心流をもつ流れ（シースフロ
ー）を形成するのである。シースフローの流速及び中心
流の太さは、細管中での反応液の流速、シース液の流速
そして細管の内外径、外管の内径等に依存するため、こ
れらを調整して蛍光測定部位における蛍光測定対象体積
中に一時に１分子の未反応物や反応生成物が存在し得る
ようにすれば良い。なお、反応生成物等を１分子ずつ分
離した状態で測定するためには、免疫反応等の終了後、
反応液を十分に希釈することが効果的であり、好まし
い。希釈により、２以上の分子が同時に検出部を通過す
る確率を減少することができるからである。In order to realize a state where molecules are separated one by one,
For example, use of a sheath flow used in a conventional flow cytometry method or the like can be exemplified. Specifically, as illustrated in FIG. 1 later, a thin tube having a tip cut inside the outer tube is arranged concentrically with the outer tube, and a reaction solution is caused to flow from the thin tube, and at the same time, between the thin tube outer wall and the outer tube inner wall. What is necessary is just to pour the sheath liquid in. The inner diameter of the outer tube is narrowed at a position downstream of the tip of the thin tube, and the linear velocity of the sheath liquid is higher than the linear velocity of the reaction liquid at the opening of the narrow tube. Thus, a flow (sheath flow) having a central flow having a thickness of 2 mm is formed. The flow rate of the sheath flow and the thickness of the central flow depend on the flow rate of the reaction solution in the thin tube, the flow rate of the sheath solution, and the inner and outer diameters of the thin tube, the inner diameter of the outer tube, and the like. What is necessary is just to allow one molecule of unreacted substance or reaction product to be present in the fluorescence measurement target volume at a time. In addition, in order to measure the reaction products and the like in a state of being separated one by one, after the completion of the immune reaction or the like,
It is effective and preferable to sufficiently dilute the reaction solution. This is because the dilution can reduce the probability that two or more molecules pass through the detection unit at the same time.
【００２４】上記の場合の蛍光測定部位における蛍光測
定対象体積は、蛍光測定に用いる検出器の光源光ビーム
の太さと蛍光検出系の視野の広さに依存するが、１分子
ごとの測定を行うために該体積は小さい方が好ましいた
め、例えばコヒーレンス性の高いレーザ光源を用いてビ
ームウェストでミクロンオーダーのサイズまで絞り込む
ことが好ましい。蛍光測定対象体積を小さくすること
で、溶媒等によるバックグラウンド蛍光や散乱光による
影響を減少することも可能である。蛍光測定部位は、反
応液中の反応生成物又は未反応生成物が１分子ずつ分離
された状態となる部分に配置されれば良い。例えば、前
記したシースフローを形成するための外管の全部又は一
部を光透過性とし、当該部分で蛍光測定を行えば良い。In the above case, the volume of the fluorescence measurement target at the fluorescence measurement site depends on the thickness of the light source light beam of the detector used for the fluorescence measurement and the width of the field of view of the fluorescence detection system. For this reason, it is preferable that the volume is small. Therefore, for example, it is preferable to narrow the beam waist to a size on the order of microns using a laser light source having high coherence. By reducing the volume of the fluorescence measurement object, it is also possible to reduce the influence of background fluorescence or scattered light due to a solvent or the like. The fluorescence measurement site may be located at a portion where the reaction products or unreacted products in the reaction solution are separated one by one. For example, all or a part of the outer tube for forming the above-mentioned sheath flow may be made light-transmissive, and fluorescence measurement may be performed at the part.
【００２５】ラベル剤を構成する蛍光物質によっては、
反応液を粘性の高いマトリクスに埋め込んだり、疎水性
環境のマトリクスに閉じこめたり、或いはシースフロー
を凍らせて分子運動を制限することで蛍光量子収率を高
めることができる。反応液を粘性の高いマトリクスに埋
め込んだり、或いは疎水性環境のマトリクスに閉じこめ
たりするには、測定対象物質とラベル剤との反応後、反
応液に粘性を高める試薬等を混合したり、反応液を細管
に導入する直前でこれら試薬を混合したり、或いはシー
ス液中にこれら試薬を混合しておけば良い。Depending on the fluorescent substance constituting the labeling agent,
The fluorescence quantum yield can be increased by embedding the reaction solution in a highly viscous matrix, confining it in a matrix in a hydrophobic environment, or freezing the sheath flow to limit molecular motion. In order to embed the reaction solution in a highly viscous matrix or to confine it in a matrix in a hydrophobic environment, after reacting the target substance with the labeling agent, mix the reaction solution with a viscosity increasing reagent, etc. These reagents may be mixed immediately before introducing them into the thin tube, or these reagents may be mixed in the sheath liquid.
【００２６】検出器は、例えば図１に例示したように、
光源、励起集光系、測定部、蛍光集光系、検出素子、検
出された信号を増幅するための増幅回路及び判定回路等
から構成することができる。光源は、蛍光物質を蛍光励
起するのに必要な波長の光を、十分な強度で供給できれ
ば、パルス光源や連続光源等、特に制限なく使用でき
る。該波長は、使用するラベル剤中の蛍光物質の全てを
蛍光励起することができれば良いが、一つの波長では蛍
光物質の全てを蛍光励起できない場合には、複数波長の
光を同時に放射可能な光源を用いたり、複数の光源を用
いてそれらの放射光を混合したり、極めて短い時間内に
光源を切り替え、結果的に１分子の反応生成物又は未反
応物が蛍光測定部位を通過する間に全ての蛍光物質の蛍
光を測定し得るように構成する。また光源が不用な波長
の光を含む場合には、例えば回折格子、プリズム又はフ
ィルター等を用いてこれを除去すれば良い。レーザ光源
は、前記した理由に加え、コヒーレンス性の高い励起光
を得られることから、微少部分に強力な光を集中できる
等、特に好ましい光源として例示できる。例えばアルゴ
ンクリプトンレーザーは、前述したＦＩＴＣ、テキサス
レッド及びＣｙ５を励起するのに必要な３種類の波長の
連続光を含んでいる。また、モードロック連続レーザー
光は、通常、５０から８０ＭＨｚの周波数でパルス発振
するため、１分子が蛍光測定部位を通過する時間、例え
ば１ｍｓの間におよそ５×１０４回程度、励起光を分子
に照射することができる。従って、モードロック連続レ
ーザ光を用い、標識として使用した蛍光物質の性質にも
よるが、数％程度の確率で放射された蛍光を検出できれ
ば、十分な精度で蛍光信号を得ることができる。The detector is, for example, as illustrated in FIG.
It can be composed of a light source, an excitation light focusing system, a measurement unit, a fluorescence light focusing system, a detection element, an amplification circuit for amplifying a detected signal, a determination circuit, and the like. As the light source, a pulse light source, a continuous light source, or the like can be used without particular limitation as long as light having a wavelength necessary for exciting the fluorescent substance by fluorescence can be supplied with sufficient intensity. The wavelength may be such that all of the fluorescent substances in the labeling agent to be used can be fluorescently excited, but if all of the fluorescent substances cannot be fluorescently excited by one wavelength, a light source capable of simultaneously emitting light of a plurality of wavelengths Or use a plurality of light sources to mix their emitted light, or switch the light sources in a very short time, resulting in a reaction product or unreacted product of one molecule passing through the fluorescence measurement site. It is configured so that the fluorescence of all fluorescent substances can be measured. When the light source includes light of an unnecessary wavelength, the light may be removed using, for example, a diffraction grating, a prism, a filter, or the like. The laser light source can be exemplified as a particularly preferable light source, for example, because it can obtain excitation light with high coherence and can concentrate strong light on a minute part, in addition to the above-mentioned reason. For example, an argon krypton laser contains continuous light having three wavelengths necessary to excite the aforementioned FITC, Texas Red and Cy5. In addition, since the mode-locked continuous laser light normally oscillates at a frequency of 50 to 80 MHz, the excitation light is applied to the molecule for about 5 × 104 times during the time when one molecule passes through the fluorescence measurement site, for example, 1 ms. Can be irradiated. Accordingly, if mode-locked continuous laser light is used and the emitted fluorescent light can be detected with a probability of about several percent, depending on the properties of the fluorescent substance used as the label, a fluorescent signal can be obtained with sufficient accuracy.
【００２７】検出素子には、高感度な蛍光検出が可能な
フォトマルやチャンネルプレートを利用することが好ま
しく、フォトンカウンティング法と組み合わせて用いる
ことができる。また、例えばストリークカメラやフォト
マルアレイを用いても良い。より具体的には、モードロ
ック連続レーザを光源として用い、フォトマルを高速に
スイッチングすることによって、励起光のレーリー散乱
やラマン散乱に起因するバックグラウンドを低減するこ
とができる。また例えばラベル剤の蛍光寿命を測定する
場合には、モードロックレーザを光源とし、ストリーク
カメラを検出素子とするか、フォトマルにＴＡＣ（Time
to Amplitude Converter ）とＭＣＡ（Multi Channel
Analyzer）を組み合わせて時間分解蛍光測定をすること
が例示できる。また例えばラベル剤のスペクトルを測定
する場合は、回折格子、プリズム又はフィルターと、チ
ャンネルプレートや複数のフォトマル或いはフォトマル
アレイを組み合わせて測定することが例示できる。更に
例えばバックグラウンドを低減するために偏光を利用す
る場合には、偏光子を用いて測定することが例示でき
る。なお、ラベル剤の同定に際しては、例えば異なる波
長の蛍光を測定する等、使用するラベル剤の種類の数と
同数以上の条件の蛍光測定を行なうことで同定が可能で
あるが、同定精度を向上するために、適宜他の蛍光特性
に関する測定等を組み合わせることができる。またラベ
ル剤が均一である場合には、蛍光強度情報を用いること
によって蛍光測定条件の数を減らすこともできる。As the detection element, it is preferable to use a photomultiplier or a channel plate capable of detecting fluorescence with high sensitivity, and it can be used in combination with a photon counting method. Further, for example, a streak camera or a photomultiplier array may be used. More specifically, the background caused by Rayleigh scattering and Raman scattering of the excitation light can be reduced by using a mode-locked continuous laser as a light source and switching the photomultiplier at high speed. For example, when measuring the fluorescence lifetime of a labeling agent, a mode-locked laser is used as a light source, a streak camera is used as a detecting element, or TAC (Time
to Amplitude Converter) and MCA (Multi Channel)
Analyzer) in combination to perform time-resolved fluorescence measurement. Further, for example, in the case of measuring the spectrum of a labeling agent, it can be exemplified to measure the spectrum by combining a diffraction grating, a prism or a filter with a channel plate or a plurality of photomuls or photomul arrays. Further, for example, when using polarized light to reduce the background, measurement using a polarizer can be exemplified. When identifying a labeling agent, it is possible to identify the labeling agent by performing fluorescence measurement under the same number or more conditions as the number of types of labeling agent to be used, for example, by measuring fluorescence of different wavelengths, but improving the identification accuracy. For this purpose, measurements on other fluorescent characteristics and the like can be appropriately combined. When the labeling agent is uniform, the number of fluorescence measurement conditions can be reduced by using the fluorescence intensity information.
【００２８】上記した、本発明を実施するための装置に
ついては、より具体的に、例えば特表平８−５０６６６
４号公報に開示された装置等を例示できるが、ラベル剤
中の蛍光物質の量（数）を増加すれば（例えば１の抗体
や核酸に対して、複数の蛍光物質を結合させる等）、従
来からフローサイトメトリーの分野で使用されているフ
ローサイトメーターを流用することも可能である。ここ
で、蛍光顕微鏡のステージ上にフローサイトメトリー用
の測定セルを載置して、本発明を実施するためのフロー
サイトメーターとして使用することもできる。なお、例
えば１の抗体や核酸に複数の蛍光物質を結合させるに
は、いわゆるクリスマスツリー法等を利用したり、カス
ケードポリマー等を利用すれば良い。The above-described apparatus for carrying out the present invention is described in more detail in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 8-50666.
An example of the device disclosed in Japanese Patent Publication No. 4 (1993) -174, can be exemplified. If the amount (number) of the fluorescent substance in the labeling agent is increased (for example, a plurality of fluorescent substances are bound to one antibody or nucleic acid), It is also possible to divert a flow cytometer conventionally used in the field of flow cytometry. Here, a measurement cell for flow cytometry can be mounted on a stage of a fluorescence microscope, and used as a flow cytometer for carrying out the present invention. For example, in order to bind a plurality of fluorescent substances to one antibody or nucleic acid, a so-called Christmas tree method or the like, or a cascade polymer or the like may be used.
【００２９】上記したフローサイトメーターを使用する
以外に、例えば、蛍光顕微鏡を用いて空間的（二次元
的）に分離した状態で蛍光測定を行うことも例示でき
る。この場合、例えばスライドガラスとカバーガラスの
間に薄いパッキングを挟んで扁平な測定セルを形成し、
ここに形成した反応液を導入して測定することを例示で
きる。かかる測定セルに反応液の入り口と出口を設けれ
ば、フローセルとして蛍光測定を効率化することも容易
である。In addition to the use of the above-mentioned flow cytometer, for example, it is also possible to exemplify the case where the fluorescence is measured in a state of spatial (two-dimensional) separation using a fluorescence microscope. In this case, for example, forming a flat measuring cell with a thin packing sandwiched between a slide glass and a cover glass,
The measurement can be exemplified by introducing the reaction solution formed here. If an inlet and an outlet for the reaction solution are provided in such a measurement cell, it is easy to increase the efficiency of fluorescence measurement as a flow cell.
【００３０】かかる構成の蛍光測定部位を用いる場合に
は、レーザー光を顕微鏡に置かれた前記のような測定セ
ルに収束させ、蛍光の二次元像を観察したり、或いは蛍
光をダイクロックミラーやフィルター等を通過させるこ
とで波長分離してラベルごとに蛍光の二次元像を観察、
測定するのである。蛍光の二次元像をイメージインテン
シファイア付ＣＣＤカメラ等を用いて電気信号に変換
し、コンピューターに取り込めば、通常の画像解析技術
を用いて蛍光ラベルの位置を特定することができる。な
お、広い範囲を観察するためには、顕微鏡のステージを
ステップ的に駆動し、駆動を停止する毎に画像を取り込
む等すれば良い。In the case of using a fluorescence measurement site having such a configuration, the laser light is converged on the above-described measurement cell placed on a microscope, and a two-dimensional image of the fluorescence is observed. Obtain a two-dimensional image of fluorescence for each label by wavelength separation by passing through a filter, etc.
It measures. If the two-dimensional image of the fluorescent light is converted into an electric signal using a CCD camera with an image intensifier or the like, and the converted signal is taken into a computer, the position of the fluorescent label can be specified using an ordinary image analysis technique. In order to observe a wide range, the stage of the microscope may be driven stepwise, and an image may be taken every time the drive is stopped.
【００３１】従来から蛍光ラベルとして使用されている
フルオレッセイン（ＦＩＴＣ、励起波長５００ｎｍ・蛍
光波長５２０ｎｍ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒ
ｅｄ、励起波長５５０ｎｍ・蛍光波長６１５ｎｍ）、Ｃ
ｙ５（励起波長６５０ｎｍ・蛍光波長６７０ｎｍ）を用
い、顕微鏡で蛍光測定を行う場合について具体例を示せ
ば、それぞれの励起波長の混じったアルゴンクリプトン
混合レーザー光を照射し、得られる蛍光をダイクロック
ミラーで３成分に分離し、各成分について５２０、６１
５又は６７０ｎｍのフィルターを通過させて各ラベル物
質の蛍光のみを選択することが例示できる。かかる例の
場合、励起光の波長と蛍光の波長が互いにずれているた
め、同時に３波長を含むレーザー光を照射して蛍光を測
定することが例示できる。Fluorescein (FITC, excitation wavelength 500 nm / fluorescence wavelength 520 nm) and Texas Red (Texas R) conventionally used as fluorescent labels are used.
ed, excitation wavelength 550 nm, fluorescence wavelength 615 nm), C
A specific example of the case of performing fluorescence measurement with a microscope using y5 (excitation wavelength 650 nm / fluorescence wavelength 670 nm) is as follows. Irradiation with argon krypton mixed laser light mixed with each excitation wavelength is performed, and the resulting fluorescence is dichroic mirror. , And each component is separated into 520, 61
It can be exemplified that only the fluorescence of each label substance is selected by passing through a filter of 5 or 670 nm. In the case of such an example, since the wavelength of the excitation light and the wavelength of the fluorescence are shifted from each other, it is possible to exemplify the simultaneous measurement of the fluorescence by irradiating laser light including three wavelengths.
【００３２】なお、使用する複数種の蛍光物質を同時に
励起することが困難な場合には、これらを別個に励起可
能な複数波長の励起光を短時間に切り換えて照射するこ
とも例示できる。より具体的には、複数のモードロック
レーザーを交互に同期して発振させ、それぞれのレーザ
ー光パルスで複数の色素レーザーを励起し、複数の波長
のレーザー光を交互に発振させ、これらをビームミキサ
ーやダイクロイックミラーを用いて混合し、測定部位に
導くことが例示できる。また例えば、一つのモードロッ
クレーザーを励起させ、レーザー光パルスを光偏向素子
で複数の方向に分け、それぞれの方向に配置した色素レ
ーザーを励起し、これらを前記同様にして混合しても良
い。これらの他にも、例えば、複数のフィルターを配置
した円盤を回転する等しても良い。When it is difficult to simultaneously excite a plurality of types of fluorescent substances to be used, it is also possible to exemplify a method in which excitation light of a plurality of wavelengths, which can excite these substances separately, is switched in a short time and irradiated. More specifically, a plurality of mode-locked lasers are alternately synchronized to oscillate, a plurality of dye lasers are excited by respective laser light pulses, and laser lights of a plurality of wavelengths are alternately oscillated. And mixing using a dichroic mirror and leading to a measurement site. Further, for example, one mode-locked laser may be excited, a laser light pulse may be divided into a plurality of directions by an optical deflecting element, and dye lasers arranged in each direction may be excited, and these may be mixed in the same manner as described above. In addition to these, for example, a disk on which a plurality of filters are arranged may be rotated.
【００３３】２種類のラベル剤Ａ及びＢを用いた場合、
同定されるのはＡ又はＢのみを含む分子と（それぞれＡ
群又はＢ群と略する）、Ａ及びＢを含む分子（ＡＢ群と
略する）の３群である。Ａ群には、抗原分子とラベル剤
Ａを含む分子と、未反応のラベル剤Ａ（非特異的結合に
より測定対象物質である抗原分子以外の分子と結合した
分子を含む）が含まれる。Ｂ群には、抗原分子とラベル
剤Ｂを含む分子と、未反応のラベル剤Ｂ（非特異的結合
により測定対象物質である抗原分子以外の分子と結合し
た分子を含む）が含まれる。そしてＡＢ群には、抗原分
子と両ラベル剤を含む分子と、非特異結合による、抗原
分子を含まない分子が含まれる。更に、ＡＢ群にはラベ
ル剤Ａとラベル剤Ｂが結合していないが、両者が同時に
蛍光測定部位に存在したためにＡＢ群と同定された分子
をも含む。ここで、一般にＡＢ群中の、ラベル剤Ａとラ
ベル剤Ｂが抗原分子とは無関係に、非特異的に結合した
分子（複合体）の量は、抗原分子と両ラベル剤を含む分
子（複合体）の量に比べて無視できるようにラベル剤を
調製することが好ましい。また、反応液を十分に希釈す
ることによって、結合していないラベル剤Ａとラベル剤
Ｂが同時に蛍光測定部位に存在する確立を小さくするこ
とができる。従って、ＡＢ群に属する分子の数から直
接、又はＡＢ群に属する分子の数をＡＢ群に属する分子
の数とＡ群に属する分子の数の和で割った値や、ＡＢ群
に属する分子の数をＡＢ群に属する分子の数とＢ群に属
する分子の数の和で割った値を、既知濃度の抗原分子に
ついて同様の操作を行って作成した検量線に適用するこ
とで、測定対象物質である抗原分子の量や濃度を知るこ
とができる。When two types of labeling agents A and B are used,
Only molecules containing A or B were identified (A
Group or B group), and molecules containing A and B (abbreviated as AB group). Group A includes a molecule containing an antigen molecule and a labeling agent A, and an unreacted labeling agent A (including a molecule bound to a molecule other than the antigen molecule which is the substance to be measured by non-specific binding). Group B includes a molecule containing an antigen molecule and a labeling agent B, and an unreacted labeling agent B (including a molecule bound to a molecule other than the antigen molecule, which is a substance to be measured, by non-specific binding). The AB group includes a molecule containing an antigen molecule and both labeling agents, and a molecule containing no antigen molecule due to non-specific binding. Furthermore, although the labeling agent A and the labeling agent B are not bound to the AB group, they also include molecules identified as the AB group because both were present at the fluorescence measurement site at the same time. Here, in general, the amount of a molecule (complex) in which the labeling agent A and the labeling agent B nonspecifically bind to each other regardless of the antigen molecule in the AB group is determined by the amount of the molecule containing the antigen molecule and the labeling agent (complex). It is preferred to prepare the labeling agent so as to be negligible compared to the amount of (body). Further, by sufficiently diluting the reaction solution, it is possible to reduce the probability that unbound labeling agent A and labeling agent B are simultaneously present at the fluorescence measurement site. Therefore, directly from the number of molecules belonging to the AB group, or a value obtained by dividing the number of molecules belonging to the AB group by the sum of the number of molecules belonging to the AB group and the number of molecules belonging to the A group, By applying the value obtained by dividing the number by the sum of the number of molecules belonging to group AB and the number of molecules belonging to group B to a calibration curve prepared by performing the same operation for antigen molecules of known concentration, The amount and concentration of the antigen molecule can be known.
【００３４】これに対して、３種類のラベル剤Ａ、Ｂ及
びＣを用いた場合、同定されるのはＡ、Ｂ又はＣのみを
含む分子（それぞれＡ、Ｂ群又はＣ群と略する）、Ａ及
びＢを含む分子（ＡＢ群と略する）、Ａ及びＣを含む分
子（ＡＣ群と略する）、Ｂ及びＣを含む分子（ＢＣ群と
略する）及びＡ、Ｂ及びＣを含む分子（ＡＢＣ群と略す
る）の７群であり、各群に含まれるものは前記と同様で
ある。ここで、ラベル剤を構成する特異結合物質の性質
からいって、一般に、ＡＢ群、ＢＣ群又はＡＣ群中の非
特異的結合により生じた分子（複合体）の量は、抗原分
子の低濃度領域では、抗原分子の量に比べて必ずしも無
視できるとは限らない。しかし、ＡＢＣ群中の非特異的
結合により生じた分子（複合体）の量は、前記ＡＢ群、
ＢＣ群又はＡＣ群中の非特異的結合により生じた分子
（複合体）の量と比較して微量であり、無視できる程度
のものである。従って、ＡＢＣ群に属する分子の数から
直接、又はＡＢＣ群に属する分子の数をＡを含む全ての
群に属する分子の数の和で割った値や、ＡＢＣ群に属す
る分子の数をＢを含む全ての群に属する分子の数の和で
割った値、更にはＡＢＣ群に属する分子の数をＣを含む
全ての群に属する分子の数の和で割った値等を、既知濃
度の抗原分子について同様の操作を行って作成した検量
線に適用することで、測定対象物質である抗原分子の量
や濃度を知ることができる。On the other hand, when three types of labeling agents A, B and C are used, only the molecules containing only A, B or C are identified (each abbreviated as group A, group B or group C). , A molecule containing A and B (abbreviated as AB group), a molecule containing A and C (abbreviated as AC group), a molecule containing B and C (abbreviated as BC group), and containing A, B and C There are seven groups of molecules (abbreviated as ABC group), each of which is the same as described above. Here, in view of the properties of the specific binding substance constituting the labeling agent, generally, the amount of the molecule (complex) generated by the non-specific binding in the AB group, the BC group or the AC group is determined by the low concentration of the antigen molecule. In the region, it is not always negligible compared to the amount of the antigen molecule. However, the amount of molecules (complexes) generated by non-specific binding in the ABC group depends on the amount of the AB group,
Compared with the amount of the molecule (complex) generated by the non-specific binding in the BC group or the AC group, the amount is small and negligible. Therefore, the value obtained by dividing the number of molecules belonging to the ABC group directly by the number of molecules belonging to the ABC group or the sum of the numbers of molecules belonging to all groups including A, or the number of molecules belonging to the ABC group to B A value obtained by dividing the number of molecules belonging to the ABC group by the sum of the numbers of molecules belonging to all groups including the C group by the sum of the numbers of molecules belonging to all the groups including C, etc. By applying the same to a calibration curve created by performing the same operation on the molecule, the amount and concentration of the antigen molecule, which is the substance to be measured, can be known.
【００３５】３種類（又はそれ以上）のラベル剤を用い
た場合であって、免疫反応においてプロゾーン現象が生
じると、前記のように同定される各群の間では、ＡＢ
群、ＡＣ群及びＢＣ群の量に比較してＡＢＣ群の量が小
さくなる。従って、この関係を用いて免疫的結合を利用
する測定においてはプロゾーン現象が生じたか否かを判
定することも可能になる。また更に、例えプロゾーン現
象が生じた場合でも、例えばＡＢＣ群に属する分子の数
［ＡＢＣ］を分母として、ＡＢ群に属する分子の数［Ａ
Ｂ］、ＡＣ群に属する分子の数［ＡＣ］及びＢＣ群に属
する分子の数［ＢＣ］の和を割ったり、ＡＢ群に属する
分子の数［ＡＢ］とＡＣ群に属する分子の数［ＡＣ］の
和を割ったり、ＡＢ群に属する分子の数［ＡＢ］を割っ
たり、ＡＣ群に属する分子の数［ＡＣ］を割ったり、或
いはＢＣ群に属する分子の数［ＢＣ］を割った値等によ
り、通常の測定域及び高濃度領域における検量線を別個
に作成しておけば、測定対象物質である抗原分子の定量
を行うことができる。In the case where three (or more) types of labeling agents are used and a prozone phenomenon occurs in an immune reaction, AB groups are identified between the groups identified as described above.
The amount of the ABC group is smaller than that of the group, AC group and BC group. Therefore, it is possible to determine whether or not the prozone phenomenon has occurred in the measurement using the immunological binding using this relationship. Furthermore, even when the prozone phenomenon occurs, for example, the number of molecules belonging to the ABC group [A] is set using the number of molecules belonging to the ABC group [ABC] as a denominator.
B], dividing the sum of the number of molecules belonging to the AC group [AC] and the number of molecules belonging to the BC group [BC], or dividing the number of molecules belonging to the AB group [AB] and the number of molecules belonging to the AC group [AC ], The number of molecules belonging to group AB [AB], the number of molecules belonging to group AC [AC], or the number of molecules belonging to group BC [BC]. By separately preparing the calibration curves in the normal measurement region and the high concentration region, for example, it is possible to quantify the antigen molecule as the measurement target substance.
【００３６】なお、例えば（［Ａ］＋［Ｂ］＋［Ｃ］）
／［ＡＢＣ］、［Ａ］／［ＡＢＣ］、［Ｂ］／［ＡＢ
Ｃ］、［Ｃ］／［ＡＢＣ］、（［Ａ］＋［Ｂ］）／［Ａ
ＢＣ］、（［Ｂ］＋［Ｃ］）／［ＡＢＣ］、（［Ａ］＋
［Ｃ］）／［ＡＢＣ］等により上記定量を行うこともで
きる。For example, ([A] + [B] + [C])
/ [ABC], [A] / [ABC], [B] / [AB
C], [C] / [ABC], ([A] + [B]) / [A
BC], ([B] + [C]) / [ABC], ([A] +
[C]) / [ABC] and the like can be used for the above quantification.
【００３７】本発明が提供する第二の測定方法につい
て、以下に免疫的結合を利用する抗原物質の測定を例に
説明する。この測定方法では、蛍光物質で予め標識され
た測定対象物質（ラベル剤）、即ち標識された抗原分子
と、該ラベル剤中の蛍光物質とは異なる蛍光物質で標識
されたラベル剤を使用するものである。ここで、蛍光物
質自体はこれまで説明したようなものを使用することが
できる。また、蛍光物質による抗原分子の標識は、例え
ば競合測定法等で通常実施されるように行えば良い。こ
こで、抗原分子に対するラベル剤は、例えば蛍光物質の
みを含み、蛍光物質が直接抗原分子と化学的に結合して
いても良いし、例えば抗原分子と特異的に結合する物質
を含み、該物質を介して抗原分子と結合していても良
い。The second measurement method provided by the present invention will be described below by taking as an example the measurement of an antigenic substance utilizing immunological binding. In this measurement method, a substance to be measured (labeling agent) which has been labeled with a fluorescent substance in advance, that is, a labeled antigen molecule and a labeling agent labeled with a fluorescent substance different from the fluorescent substance in the labeling agent are used. It is. Here, as the fluorescent substance itself, those described above can be used. The labeling of the antigen molecule with a fluorescent substance may be performed as usually performed by, for example, a competitive measurement method. Here, the labeling agent for the antigen molecule includes, for example, only a fluorescent substance, and the fluorescent substance may be chemically bonded directly to the antigen molecule, or may include, for example, a substance that specifically binds to the antigen molecule. May be bound to the antigen molecule via
【００３８】ラベル剤及び検体試料を接触、反応させて
反応液を形成し、反応液中の反応生成物及び／又は未反
応物を１分子ずつ分離する操作も前記同様に行えば良
い。この場合、同定されるのは、標識された抗原分子で
あるラベル剤をＡ、他のラベル剤をＢとすると、Ａ又は
Ｂのみを含む分子（それぞれＡ群又はＢ群と略する）、
Ａ及びＢを含む分子（ＡＢ群と略する）の３群である。
Ａ群には、未反応のラベル剤Ａが含まれる。Ｂ群には、
抗原分子と結合したラベル剤Ｂと、未反応のラベル剤Ｂ
（非特異的結合により測定対象物質である抗原分子以外
の分子と結合した分子を含む）が含まれる。そしてＡＢ
群には、ラベル剤Ａ、即ち標識された抗原分子とラベル
剤Ｂが結合した分子が含まれる。従って、ＡＢ群に属す
る分子の数、Ａ群に属する分子の数又はＢ群に属する分
子の数から直接、あるいはＡＢ群に属する分子の数をＡ
Ｂ群に属する分子の数とＡ群に属する分子の数の和で割
った値や、ＡＢ群に属する分子の数をＡＢ群に属する分
子とＢ群に属する分子の数の和で割った値等を、既知濃
度の抗原分子について同様の操作を行って作成した検量
線に適用することで、測定対象物質である抗原分子の量
や濃度を知ることができる。The operation of contacting and reacting the labeling agent and the specimen sample to form a reaction solution and separating the reaction products and / or unreacted products in the reaction solution one by one may be performed in the same manner as described above. In this case, when the labeling agent that is a labeled antigen molecule is A and the other labeling agent is B, a molecule containing only A or B (abbreviated as Group A or Group B, respectively) is identified.
These are three groups of molecules containing A and B (abbreviated as AB group).
Group A includes unreacted labeling agent A. In group B,
Labeling agent B bound to antigen molecule and unreacted labeling agent B
(Including molecules bound to molecules other than the antigen molecule, which is the substance to be measured, by non-specific binding). And AB
The group includes a labeling agent A, that is, a molecule in which a labeled antigen molecule and a labeling agent B are bound. Therefore, the number of molecules belonging to the AB group, the number of molecules belonging to the A group or the number of molecules belonging to the B group can be calculated directly from the number of molecules belonging to the AB group, or
A value obtained by dividing the number of molecules belonging to group B and the number of molecules belonging to group A, or a value obtained by dividing the number of molecules belonging to group AB by the sum of the number of molecules belonging to group AB and the number of molecules belonging to group B And the like are applied to a calibration curve prepared by performing the same operation on antigen molecules of a known concentration, whereby the amount and concentration of the antigen molecule as the measurement target substance can be known.
【００３９】[0039]
【発明の実施の形態】以下、本発明を図面に基づき更に
詳細に説明する。図１は、本発明を実施するための装置
の概略を示すものである。図中、１は光源、２はレンズ
（励起光集光系）、３はシースフローを形成するための
内管、４はシースフローを形成するための外管、５は１
分子ずつ分離された反応生成物（未反応生成物）、６は
レンズ（蛍光集光系）、７は蛍光検出器、８は蛍光検出
器の測定結果を増幅するための増幅器、そして９は蛍光
測定結果から反応生成物等を同定等するための判別手段
である。内管３から、好ましくは希釈された反応液が流
出し、内管３と外管４の空隙からはシース液が供給され
る。なお、本例では装置の概略を示したが、例えば励起
光集光系及び／又は蛍光集光系には、必要に応じて光源
や蛍光の波長を選択するためのフィルターや、後述する
ダイクロイックミラー等の光学部品を任意に追加するこ
とができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the drawings. FIG. 1 schematically shows an apparatus for carrying out the present invention. In the figure, 1 is a light source, 2 is a lens (excitation light focusing system), 3 is an inner tube for forming a sheath flow, 4 is an outer tube for forming a sheath flow, and 5 is 1
Reaction products (unreacted products) separated by each molecule, 6 is a lens (fluorescence condensing system), 7 is a fluorescence detector, 8 is an amplifier for amplifying the measurement result of the fluorescence detector, and 9 is fluorescence It is a discriminating means for identifying a reaction product or the like from a measurement result. A reaction liquid, preferably diluted, flows out of the inner tube 3, and a sheath liquid is supplied from a gap between the inner tube 3 and the outer tube 4. In this example, the outline of the apparatus is shown. For example, the excitation light condensing system and / or the fluorescence condensing system may include a filter for selecting a light source and a wavelength of fluorescence as needed, and a dichroic mirror described later. Optical components such as can be arbitrarily added.
【００４０】図２は、ラベル剤Ａとして第一の蛍光物質
と抗体の結合物、ラベル剤Ｂとして第二の蛍光物質と抗
体の結合物を用いる場合の、各ラベル剤中の蛍光物質
（それぞれＡ、Ｂで示す）の一例を示すものである。本
例では、蛍光スペクトルが異なる蛍光物質Ａ及びＢを利
用した例を示してある。このようなラベル剤を用いる場
合、前記図１における蛍光検出器は、例えば各分子から
放射された蛍光を波長により透過率と反射率が異なるダ
イクロイックミラーで分割し、分割された各蛍光をそれ
ぞれフォトマルチプライヤーで検出する等の構成とする
ことが例示できる。 図３は、異なる蛍光物質で標識さ
れた、単一の測定対象抗原Ｄに特異的でかつ同時に結合
可能な２種類の抗体からなるラベル剤Ａ及びＢを用いる
本発明の方法を説明するための図である。これらを溶液
中で一度に又は順次、接触、反応させて得られる反応液
中では、図に示したように、測定対象抗原とラベル剤Ａ
及びＢの三者を含む分子（反応生成物）１、ラベル剤Ａ
のみを含む分子（反応生成物）２、ラベル剤Ｂのみを含
む分子（反応生成物）３及び他の分子（未反応生成物、
４から８、なお６から８は、非特異的反応により分子
（複合体）が形成された場合である）が生じる。未反応
生成物は、ラベル剤Ａ又はＢが遊離状態のまま存在する
分子（４及び５）、ラベル剤Ａ又はＢが測定対象抗原Ｄ
以外の物質と非特異的に結合した分子（６及び７）そし
てラベル剤Ａ及びＢが非特異的に結合した分子８であ
る。FIG. 2 shows a fluorescent substance in each labeling agent when a conjugate of a first fluorescent substance and an antibody is used as labeling agent A and a conjugate of a second fluorescent substance and antibody is used as labeling agent B. A and B). In this example, an example is shown in which fluorescent substances A and B having different fluorescence spectra are used. When such a labeling agent is used, the fluorescence detector in FIG. 1 divides, for example, fluorescence emitted from each molecule by a dichroic mirror having different transmittance and reflectance depending on the wavelength, and separates each of the divided fluorescence into a photo. A configuration in which detection is performed by a multiplier or the like can be exemplified. FIG. 3 is a diagram for illustrating the method of the present invention using two labeling agents A and B, which are labeled with different fluorescent substances and are specific to a single antigen D to be measured and capable of binding simultaneously. FIG. In the reaction solution obtained by contacting and reacting these at once or sequentially in the solution, as shown in the figure, the antigen to be measured and the labeling agent A
(Reaction product) 1 containing the three components (B) and (B), labeling agent A
Molecule containing only labeling agent B (reaction product), molecule containing only labeling agent B (reaction product) 3, and other molecules (unreacted product,
4 to 8, where 6 to 8 are when molecules (complexes) are formed by non-specific reactions). Unreacted products include molecules (4 and 5) in which labeling agent A or B remains in a free state, and labeling agent A or B
The molecules (6 and 7) nonspecifically bound to substances other than the above, and the molecule 8 nonspecifically bound to labeling agents A and B.
【００４１】図４は、図３のような反応液について、ラ
ベル剤Ａ、ラベル剤Ｂ及び抗原Ｄを反応させた場合の生
成物の濃度を抗原Ｄの濃度に対して計算した結果を示す
ものである。計算の条件は以下の（１）と（２）であ
り、反応物の濃度を抗原、抗体（ラベル剤）の濃度の関
数（表１）として表し、ラベル剤の濃度はそれぞれ異な
るとして計算した（ただし、ラベル剤Ａの濃度＜ラベル
剤Ｂの濃度）。なお表１中、ｘは抗原Ｄの濃度、Ａはラ
ベル剤Ａの濃度、Ｂはラベル剤Ｂの濃度、［ＡＢＤ］等
はラベル剤Ａ及びＢを含む反応生成物濃度をそれぞれ示
すが、［Ａ］と［ＡＤ］、［Ｂ］と［ＢＤ］は蛍光測定
の結果からは区別できず、［Ｄ］は蛍光測定によっては
検出できない。FIG. 4 shows the result of calculating the concentration of the product when the labeling agent A, the labeling agent B and the antigen D were reacted with the concentration of the antigen D in the reaction solution as shown in FIG. It is. The calculation conditions are the following (1) and (2). The concentrations of the reactants are expressed as a function of the concentrations of the antigen and the antibody (labeling agent) (Table 1). However, the concentration of the labeling agent A <the concentration of the labeling agent B). In Table 1, x represents the concentration of antigen D, A represents the concentration of labeling agent A, B represents the concentration of labeling agent B, and [ABD] represents the concentration of the reaction product containing labeling agents A and B, respectively. [A] and [AD], [B] and [BD] cannot be distinguished from the results of the fluorescence measurement, and [D] cannot be detected by the fluorescence measurement.
【００４２】[0042]
【表１】 [Table 1]
【００４３】（１）抗原と抗体は１００％結合する。抗
原の量が抗体の量より少ないときは、全ての抗原は抗体
と結合し、余った抗体は未反応である。抗体の量が抗原
の量より少ないときは、全ての抗体は抗原と結合し、余
った抗原は未反応である。なお、この条件は、実際の測
定においても抗原と抗体の親和性が十分に高く、かつ十
分に長い時間反応させれば成立する条件である。(1) The antigen and the antibody bind 100%. When the amount of the antigen is smaller than the amount of the antibody, all of the antigen binds to the antibody, and the surplus antibody is unreacted. When the amount of the antibody is smaller than the amount of the antigen, all the antibodies bind to the antigen, and the surplus antigen is unreacted. These conditions are satisfied even in actual measurement if the affinity between the antigen and the antibody is sufficiently high and the reaction is performed for a sufficiently long time.
【００４４】（２）抗原の複数の抗体結合部位（抗原決
定基）は互いに独立である。特定の抗原結合部位に抗体
が結合することにより、他の結合部位に対する抗体の結
合が影響を受けることはない。この条件は、ある抗体の
結合により他の抗体の結合に際して立体障害が生じた
り、抗体が結合することにより抗原の構造が変化したり
しない限り、成立する。(2) A plurality of antibody binding sites (antigenic determinants) of an antigen are independent of each other. The binding of the antibody to a particular antigen binding site does not affect the binding of the antibody to other binding sites. This condition is satisfied as long as steric hindrance does not occur upon binding of another antibody due to binding of one antibody, and the structure of the antigen is not changed by binding of the antibody.
【００４５】上記のように、ラベル剤Ａと抗原Ｄ、ラベ
ル剤Ｂと抗原Ｄは１００％反応し、それぞれ他方の反応
性に干渉しないと仮定した。即ち、ラベル剤Ａと抗原Ｄ
の反応性は、抗原Ｄにラベル剤Ｂが結合することにより
変化しないとした。またラベル剤Ａの濃度を１．４、ラ
ベル剤Ｂの濃度を２として計算したが、濃度の単位は任
意である。As described above, it was assumed that the labeling agent A and the antigen D and the labeling agent B and the antigen D reacted 100% and did not interfere with the reactivity of the other. That is, label A and antigen D
Is not changed by the binding of the labeling agent B to the antigen D. Further, the calculation was performed with the concentration of the labeling agent A being 1.4 and the concentration of the labeling agent B being 2, but the unit of the concentration is arbitrary.
【００４６】図４中、Ａは、本発明の方法により得られ
る測定結果中、ラベル剤Ａ及びＢを同時に含む分子の濃
度についての結果を示す。また、図の横軸は測定対象抗
原Ｄの濃度、縦軸は測定により得られる濃度をそれぞれ
示す。In FIG. 4, A shows the results of the concentration of molecules containing both labeling agents A and B in the measurement results obtained by the method of the present invention. The horizontal axis of the figure shows the concentration of the antigen D to be measured, and the vertical axis shows the concentration obtained by the measurement.
【００４７】図４に示すように、本発明の方法で従来の
固相を用いたサンドイッチ法と同じ応答曲線を得ること
ができる。本発明の方法では、従来法における担体へ
の、蛍光物質で標識した抗体の非特異的結合が生じない
ため、測定対象抗原Ｄの濃度がゼロの場合、従来法に比
較して低い測定値を得ることが可能になる。なお、本発
明の方法においても、僅かながらラベル剤Ａ及びＢが非
特異的に結合した分子（図３中の８）が生じ、これは必
ずしも無視できないため、測定対象抗原Ｄの濃度がゼロ
の場合に測定値は常にゼロになるとは限らない。なお本
例ではラベル剤Ａ及びＢを含む分子の濃度について示し
たが、他の、例えばラベル剤Ａ及びＢを含む分子の濃度
を、同値にラベル剤Ａのみを含む分子の濃度を加えた値
で割った値等を使用することもできる。As shown in FIG. 4, the same response curve as in the sandwich method using a conventional solid phase can be obtained by the method of the present invention. In the method of the present invention, since non-specific binding of the antibody labeled with the fluorescent substance to the carrier in the conventional method does not occur, when the concentration of the antigen D to be measured is zero, a lower measured value compared to the conventional method is obtained. It is possible to obtain. In the method of the present invention, a slight amount of a molecule (8 in FIG. 3) in which the labeling agents A and B are nonspecifically bound occurs, and this is not necessarily negligible, so that the concentration of the antigen D to be measured is zero. In some cases, the measurements are not always zero. In this example, the concentrations of the molecules containing the labeling agents A and B are shown. However, for example, the concentration of the molecules containing the labeling agents A and B is the same as the value obtained by adding the concentration of the molecule containing only the labeling agent A to the same value It is also possible to use a value divided by.
【００４８】実際の定量に当たっては、既知濃度の測定
対象抗原を含む標準試料について測定を行い、いわゆる
キャリブレーションカーブ（検量線）を作成し、未知試
料についての測定結果を比較すれば良い。In the actual quantification, a standard sample containing a known concentration of the antigen to be measured is measured, a so-called calibration curve (calibration curve) may be prepared, and the measurement results of the unknown sample may be compared.
【００４９】図５は、異なる蛍光物質で標識された、単
一の測定対象抗原Ｄに特異的でかつ同時に結合可能な３
種類の抗体からなるラベル剤Ａ、Ｂ及びＣを用いる本発
明の方法を説明するための図である。これらを溶液中で
一度に又は順次、接触、反応させて得られる反応液中で
は、図に示したように、測定対象抗原Ｄとラベル剤Ａ、
Ｂ及びＣの三者を含む分子（反応生成物）１、測定対象
抗原Ｄとラベル剤Ａ及びＢのみを含む分子（反応生成
物）２、測定対象抗原Ｄとラベル剤Ａ及びＣのみを含む
分子（反応生成物）３、測定対象抗原Ｄとラベル剤Ｂ及
びＣのみを含む分子（反応生成物）４、測定対象抗原Ｄ
とラベル剤Ａのみを含む分子（反応生成物）５、測定対
象抗原Ｄとラベル剤Ｂのみを含む分子（反応生成物）
６、測定対象抗原Ｄとラベル剤Ｃのみを含む分子（反応
生成物）７と、他の分子（未反応生成物、８から１７、
なお１１から１７は、非特異的反応により分子（複合
体）が形成された場合である）が生じる。未反応生成物
は、ラベル剤Ａ、Ｂ又はＣが遊離状態のまま存在する分
子（８から１０）、ラベル剤Ａ、Ｂ又はＣが測定対象抗
原Ｄ以外の物質Ｅ、Ｆ及びＧと非特異的に結合した分子
（１１から１３）、そしてラベル剤Ａ、Ｂ及びＣの２つ
以上が非特異的に結合した分子（１４から１６）であ
る。これ以外にも、例えば、物質Ｅ、Ｆ又はＧと２以上
のラベル剤が非特異的に結合した分子等も生じ得る。FIG. 5 is a diagram showing three antigens D which are labeled with different fluorescent substances and are capable of binding simultaneously to a single antigen D to be measured.
It is a figure for explaining the method of the present invention using labeling agents A, B and C consisting of different kinds of antibodies. In a reaction solution obtained by contacting and reacting these at once or sequentially in a solution, as shown in the figure, the antigen D to be measured and the labeling agent A,
Molecule (reaction product) 1 containing the three components B and C, Molecule 2 containing only the antigen D to be measured and labeling agents A and B (reaction product) 2, contains only the antigen D to be measured and labeling agents A and C Molecule (reaction product) 3, molecule (reaction product) 4 containing only antigen D to be measured and labeling agents B and C, antigen D to be measured
And a molecule containing only labeling agent A (reaction product) 5, a molecule containing only antigen D to be measured and labeling agent B (reaction product)
6, a molecule (reaction product) containing only the antigen D to be measured and the labeling agent C and another molecule (unreacted product, 8 to 17,
11 to 17 are cases where a molecule (complex) is formed by a non-specific reaction). The unreacted product is a molecule (8 to 10) in which the labeling agent A, B or C remains in a free state, and the labeling agent A, B or C is non-specific to substances E, F and G other than the antigen D to be measured. Molecules (11 to 13), and two or more of labeling agents A, B, and C nonspecifically bound (14 to 16). In addition, for example, a molecule in which the substance E, F, or G and two or more labeling agents are nonspecifically bound may be generated.
【００５０】図６は、図５のような反応液について、ラ
ベル剤Ａ、ラベル剤Ｂ、ラベル剤Ｃ及び抗原Ｄを反応さ
せた場合の生成物の濃度、濃度の比を抗原Ｄの濃度に対
して計算した結果を示すものである。計算の条件は以下
の（１）と（２）であり、反応物の濃度を抗原、抗体
（ラベル剤）の濃度の関数（表２）として表し、ラベル
剤の濃度はそれぞれ異なるとして計算した（ただし、ラ
ベル剤Ａの濃度＜ラベル剤Ｂの濃度＜ラベル剤Ｃの濃
度）。なお表２中、ｘは抗原Ｄの濃度、Ａはラベル剤Ａ
の濃度、Ｂはラベル剤Ｂの濃度、Ｃはラベル剤Ｃの濃
度、［ＡＢＤ］等はラベル剤Ａ及びＢを含む反応生成物
濃度をそれぞれ示すが、［Ａ］と［ＡＤ］、［Ｂ］と
［ＢＤ］、［Ｃ］と［ＣＤ］は蛍光測定の結果からは区
別できず、［Ｄ］は蛍光測定によっては検出できない。
またｘ＾ｘはｘのｘ乗を示す。FIG. 6 shows the concentration of the product when the labeling agent A, labeling agent B, labeling agent C and antigen D are reacted with the reaction solution as shown in FIG. It shows the result of the calculation. The conditions of the calculation are the following (1) and (2), the concentration of the reactant is expressed as a function of the concentration of the antigen and the antibody (the labeling agent) (Table 2), and the calculation is performed assuming that the concentrations of the labeling agents are different from each other ( Here, the concentration of the labeling agent A <the concentration of the labeling agent B <the concentration of the labeling agent C). In Table 2, x is the concentration of antigen D, A is labeling agent A
, B represents the concentration of the labeling agent B, C represents the concentration of the labeling agent C, and [ABD] etc. represent the concentrations of the reaction products containing the labeling agents A and B, respectively, [A], [AD], and [B]. ] And [BD], [C] and [CD] cannot be distinguished from the result of the fluorescence measurement, and [D] cannot be detected by the fluorescence measurement.
X ＾ x indicates x to the power of x.
【００５１】[0051]
【表２】 [Table 2]
【００５２】（１）抗原と抗体は１００％結合する。抗
原の量が抗体の量より少ないときは、全ての抗原は抗体
と結合し、余った抗体は未反応である。抗体の量が抗原
の量より少ないときは、全ての抗体は抗原と結合し、余
った抗原は未反応である。なお、この条件は、実際の測
定においても抗原と抗体の親和性が十分に高く、かつ十
分に長い時間反応させれば成立する条件である。(1) The antigen and the antibody bind 100%. When the amount of the antigen is smaller than the amount of the antibody, all of the antigen binds to the antibody, and the surplus antibody is unreacted. When the amount of the antibody is smaller than the amount of the antigen, all the antibodies bind to the antigen, and the surplus antigen is unreacted. These conditions are satisfied even in actual measurement if the affinity between the antigen and the antibody is sufficiently high and the reaction is performed for a sufficiently long time.
【００５３】（２）抗原の複数の抗体結合部位（抗原決
定基）は互いに独立である。特定の抗原結合部位に抗体
が結合することにより、他の結合部位に対する抗体の結
合が影響を受けることはない。この条件は、ある抗体の
結合により他の抗体の結合に際して立体障害が生じた
り、抗体が結合することにより抗原の構造が変化したり
しない限り、成立する。(2) A plurality of antibody binding sites (antigenic determinants) of an antigen are independent of each other. The binding of the antibody to a particular antigen binding site does not affect the binding of the antibody to other binding sites. This condition is satisfied as long as steric hindrance does not occur upon binding of another antibody due to binding of one antibody, and the structure of the antigen is not changed by binding of the antibody.
【００５４】上記のように、ラベル剤Ａと抗原Ｄ、ラベ
ル剤Ｂと抗原Ｄ、ラベル剤Ｃと抗原Ｄは１００％反応
し、それぞれ他方の反応性に干渉しないと仮定した。即
ち、ラベル剤Ａと抗原Ｄの反応性は、抗原Ｄにラベル剤
Ｂが結合することにより変化しないとした。またラベル
剤Ａの濃度を１．４、ラベル剤Ｂの濃度を２、ラベル剤
Ｃの濃度を３として計算したが、濃度の単位は任意であ
る。As described above, it was assumed that the labeling agent A and the antigen D, the labeling agent B and the antigen D, and the labeling agent C and the antigen D reacted 100%, respectively, and did not interfere with the reactivity of the other. That is, the reactivity between the label A and the antigen D was not changed by the binding of the label B to the antigen D. In addition, although the concentration of the label agent A was calculated as 1.4, the concentration of the label agent B as 2, and the concentration of the label agent C as 3, the unit of the concentration is arbitrary.
【００５５】図６は、図５のような反応液について、本
発明の測定を行った場合の結果を示すものである。図
中、Ａは、ラベル剤Ａ、Ｂ及びＣを含む分子についての
濃度測定結果を示すものであり、Ｂは、ラベル剤Ｂ及び
Ｃのみを含む分子の濃度測定結果を、ラベル剤Ａ、Ｂ及
びＣを含む分子についての濃度測定結果で割った値を示
すものであり、Ｃは、ラベル剤Ｂ及びＣのみを含む分子
の濃度測定結果を示すものである。なお、本図には測定
により得られる結果のうちの一部を示したが、例えば図
中のＢについては、ラベル剤Ｂ及びＣのみを含む分子の
濃度測定結果に代えてラベル剤Ａ及びＢのみを含む分子
の濃度測定結果やラベル剤Ａ及びＣのみを含む分子の濃
度測定結果等を用いることもできる。FIG. 6 shows the results obtained when the measurement of the present invention was performed on the reaction solution as shown in FIG. In the figure, A shows the concentration measurement results for molecules containing labeling agents A, B and C, and B shows the concentration measurement results for molecules containing only labeling agents B and C, labeled agents A and B And C represents a value obtained by dividing by a concentration measurement result of a molecule containing C, and C represents a concentration measurement result of a molecule containing only labeling agents B and C. In this figure, a part of the results obtained by the measurement is shown. For example, for B in the figure, labeling agents A and B are used instead of the measurement results of the concentration of molecules containing only labeling agents B and C. The concentration measurement result of a molecule containing only the labeling agent A or the concentration measurement result of a molecule containing only the labeling agent A or C can also be used.
【００５６】実際の定量に当たっては、既知濃度の測定
対象抗原を含む標準試料について測定を行い、いわゆる
キャリブレーションカーブ（検量線）を作成し、未知濃
度の試料についての測定結果を比較すれば良い。In actual quantification, a standard sample containing the antigen to be measured having a known concentration is measured, a so-called calibration curve (calibration curve) is prepared, and the measurement results of the sample having an unknown concentration may be compared.
【００５７】図６に示したように、本発明の方法では、
Ａの値が一定になる測定対象抗原Ｄの濃度領域から、Ｂ
は直線的に立ち上がる。従って、この濃度領域の既知濃
度測定対象抗原Ｄを含む標準試料について測定を行い、
キャリブレーションカーブ（検量線）を作成し、未知濃
度の試料についての結果を比較するに当たってこれら２
つのキャリブレーションカーブ（検量線）を使い分けれ
ば、広い濃度範囲における定量が可能となる。As shown in FIG. 6, in the method of the present invention,
From the concentration range of the antigen D to be measured in which the value of A is constant, B
Rises linearly. Therefore, measurement is performed on a standard sample containing the antigen D to be measured in the known concentration range,
In preparing a calibration curve (calibration curve) and comparing the results for samples of unknown concentration, these two
If two calibration curves (calibration curves) are properly used, quantification in a wide concentration range is possible.
【００５８】図７は、蛍光物質Ａで予め標識された測定
対象物質（ラベル剤）Ａ、該蛍光物質とは異なる蛍光物
質Ｂで標識された測定対象物質に結合可能なラベル剤Ｂ
を用いる本発明の方法を説明するための図である。これ
らを溶液中で一度に又は順次、接触、反応させて得られ
る反応液中では、図に示したように、測定対象抗原Ｄと
ラベル剤Ｂを含む分子（反応生成物）１、ラベル剤Ｂ及
びＡを含む分子（反応生成物）２と、その他の分子（未
反応生成物、３から６、なお６は、非特異的反応により
分子（複合体）が形成された場合である）が生じる。未
反応生成物は、ラベル剤Ａ又はＢが遊離状態のまま存在
する分子（４又は５）、ラベル剤Ｂが測定対象抗原Ｄ以
外の物質Ｅと非特異的に結合した分子（６）である。こ
れ以外にも、測定対象抗原Ｄがラベル剤Ｂと結合せず、
遊離状態で存在している場合もあるが、これは本発明に
おける蛍光測定の対象とはならず、未反応生成物に該当
しない。 図８は、図７のような反応液について、ラベ
ル剤Ａ（抗原を標識したもの）又はラベル剤Ｂ（抗体を
標識したもの）と抗原Ｄを同時に反応させた場合の生成
物の濃度、濃度の比を抗原Ｄの濃度に対して計算した結
果を示すものである。計算の条件は以下の（１）と
（２）であり、反応物の濃度を抗原（ハプテン）の濃度
の関数（表３）として表し、ラベル剤の濃度はそれぞれ
異なるとして計算した （ただし、ラベル剤Ａの濃度＜
ラベル剤Ｂの濃度）。なお表３中、ｘは抗原Ｄの濃度、
Ａはラベル剤Ａの濃度、Ｂはラベル剤Ｂの濃度、［Ａ
Ｂ］等はラベル剤Ａ及びＢを含む反応生成物濃度をそれ
ぞれ示す。またｙ＝Ａ／（Ａ＋ｘ）は、通常の競合法の
Ｌｏｇｉｔ−Ｌｏｇ検量線作成に用いる抗原を含む試料
で得られる信号を、抗原を含まない信号で割った値を意
味する。FIG. 7 shows a measurement target substance (labeling agent) A previously labeled with a fluorescent substance A, and a labeling substance B capable of binding to a measurement target substance labeled with a fluorescent substance B different from the fluorescent substance.
FIG. 3 is a diagram for explaining a method of the present invention using. In the reaction solution obtained by contacting and reacting these at once or sequentially in a solution, as shown in the figure, the molecule (reaction product) 1 containing the antigen D to be measured and the labeling agent B, the labeling agent B (A reaction product) 2 containing A and A and other molecules (unreacted products, 3 to 6, where 6 is a case where a molecule (complex) is formed by a non-specific reaction) . The unreacted product is a molecule (4 or 5) in which the labeling agent A or B exists in a free state, and a molecule (6) in which the labeling agent B nonspecifically binds to a substance E other than the antigen D to be measured. . In addition, the antigen D to be measured does not bind to the labeling agent B,
Although it may exist in a free state, it is not an object of the fluorescence measurement in the present invention and does not correspond to an unreacted product. FIG. 8 shows the concentrations and concentrations of the products obtained when the labeling agent A (labeled with an antigen) or the labeling agent B (labeled with an antibody) and the antigen D are reacted simultaneously with the reaction solution as shown in FIG. 2 shows the result of calculating the ratio of the above to the concentration of antigen D. The calculation conditions were the following (1) and (2), the concentration of the reactant was expressed as a function of the concentration of the antigen (hapten) (Table 3), and the calculation was performed assuming that the concentrations of the labeling agents were different (the label was different). Concentration of agent A <
Concentration of labeling agent B). In Table 3, x is the concentration of antigen D,
A is the concentration of label A, B is the concentration of label B, [A
B] etc. indicate the concentrations of the reaction products containing labeling agents A and B, respectively. Further, y = A / (A + x) means a value obtained by dividing a signal obtained from a sample containing an antigen used for preparation of a Logit-Log calibration curve in a normal competition method by a signal containing no antigen.
【００５９】[0059]
【表３】 [Table 3]
【００６０】（１）抗原と抗体は１００％結合する。抗
原の量が抗体の量より少ないときは、全ての抗原は抗体
と結合し、余った抗体は未反応である。抗体の量が抗原
の量より少ないときは、全ての抗体は抗原と結合し、余
った抗原は未反応である。なお、この条件は、実際の測
定においても抗原と抗体の親和性が十分に高く、かつ十
分に長い時間反応させれば成立する条件である。(1) Antigen and antibody bind 100%. When the amount of the antigen is smaller than the amount of the antibody, all of the antigen binds to the antibody, and the surplus antibody is unreacted. When the amount of the antibody is smaller than the amount of the antigen, all the antibodies bind to the antigen, and the surplus antigen is unreacted. These conditions are satisfied even in actual measurement if the affinity between the antigen and the antibody is sufficiently high and the reaction is performed for a sufficiently long time.
【００６１】（２）抗原と抗体の反応性は、抗原に蛍光
物質等を標識することによって変化しない。この条件
は、標識することにより抗体の結合に際して立体障害が
生じたり、標識することにより抗原の構造が変化しない
限り成立する。(2) The reactivity between the antigen and the antibody is not changed by labeling the antigen with a fluorescent substance or the like. This condition is satisfied as long as the labeling does not cause steric hindrance upon binding of the antibody or the labeling does not change the structure of the antigen.
【００６２】上記のように、ラベル剤Ｂはラベル剤Ａと
抗原Ｄの一方と反応し、ラベル剤Ｂとラベル剤Ａの反応
生成物の濃度と、ラベル剤Ｂと抗原Ｄの反応生成物の濃
度の比はラベル剤Ａとラベル剤Ｂの濃度の比に等しいと
した。またラベル剤Ａの濃度を２、ラベル剤Ｂの濃度を
１．５として計算したが、濃度の単位は任意である。図
８は、図７のような反応液について、本発明の測定を行
った場合の結果を示すものである。図中、Ａはラベル剤
Ａ及びラベル剤Ｂを含む分子の量を示し、Ｃは、ラベル
剤Ａ及びラベル剤Ｂを含む分子とラベル剤Ｂのみを含む
分子の合計量を示し、Ｂは、ＡをＣで割った値を示す。As described above, the labeling agent B reacts with one of the labeling agent A and the antigen D, and the concentration of the reaction product between the labeling agent B and the labeling agent A and the concentration of the reaction product between the labeling agent B and the antigen D are determined. The ratio of the concentrations was set equal to the ratio of the concentrations of label A and label B. Further, the calculation was performed with the concentration of the label agent A being 2 and the concentration of the label agent B being 1.5, but the unit of the concentration is arbitrary. FIG. 8 shows the results obtained when the measurement of the present invention was performed on the reaction solution as shown in FIG. In the figure, A indicates the amount of molecules containing labeling agent A and labeling agent B, C indicates the total amount of molecules containing labeling agent A and labeling agent B and molecules containing only labeling agent B, and B indicates The value obtained by dividing A by C is shown.
【００６３】実際の定量に当たっては、既知濃度の測定
対象抗原を含む標準試料について測定を行い、いわゆる
キャリブレーションカーブ（検量線）を作成し、未知試
料の試料についての測定結果を比較すれば良い。In actual quantification, a standard sample containing a known concentration of the antigen to be measured may be measured, a so-called calibration curve (calibration curve) may be prepared, and the measurement results of the unknown sample may be compared.
【００６４】[0064]
【発明の効果】本発明によれば、担体を利用した従来の
免疫的結合（抗原と抗体の特異結合）、核酸の相補的結
合（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む核酸の特異結合）、リガン
ド結合（リガンドとレセプターの特異結合）等、種々の
特異結合を利用する測定法における、非特異的結合に起
因するＳ／Ｎ比の低下を抑制することが可能である。即
ち、ラベル剤（蛍光物質）の担体への非特異的結合を生
じることがないから、担体を使用する測定法に比較して
非特異的結合に由来するバックグラウンド（ノイズ）を
低減でき、その結果、特に低濃度の測定対象物質につい
て高感度かつ高精度の測定が可能になる。According to the present invention, conventional immunological binding using a carrier (specific binding between an antigen and an antibody), complementary binding of nucleic acids (specific binding of nucleic acids including DNA and RNA), ligand binding (ligand) And specific receptor binding), it is possible to suppress a decrease in the S / N ratio due to non-specific binding in measurement methods utilizing various specific bindings. That is, since non-specific binding of the labeling agent (fluorescent substance) to the carrier does not occur, the background (noise) derived from non-specific binding can be reduced as compared with the measurement method using the carrier, and the As a result, high-sensitivity and high-precision measurement can be performed particularly on a low-concentration substance to be measured.
【００６５】この結果、低濃度の測定対象物質であって
も、より正確に定量等することができる。このように、
非特異的結合を低減することにより、本発明は、測定対
象物質の微量分析を可能とするものである。しかも、測
定対象物質は、担体（担体に結合した、測定対象物質に
特異的に結合可能な物質）と反応するのではなく、液相
中に存在するラベル剤（可溶状態で存在するラベル剤）
と反応することになるため、反応速度を向上することも
可能である。これにより、測定操作に要する時間を短縮
することもできる。更に本発明では、通常の免疫測定等
におけるＢ／Ｆ分離を行なう必要がないため、測定工程
を簡便にすることができると共に、Ｂ／Ｆ分離操作又は
Ｂ／Ｆ分離装置の不具合に起因する測定結果のばらつき
や異常を排除し得、日内再現性及び日差再現性等の向上
も期待できる。As a result, even a low-concentration substance to be measured can be quantified more accurately. in this way,
By reducing non-specific binding, the present invention enables microanalysis of a substance to be measured. In addition, the substance to be measured does not react with the carrier (a substance that can bind specifically to the substance to be measured, which is bound to the carrier), but the labeling agent present in the liquid phase (the labeling agent existing in a soluble state). )
The reaction speed can be improved because the reaction speed is increased. As a result, the time required for the measurement operation can be reduced. Further, in the present invention, it is not necessary to perform B / F separation in a normal immunoassay or the like, so that the measurement process can be simplified and the measurement caused by a failure of the B / F separation operation or the B / F separation device. Variations and abnormalities in the results can be eliminated, and improvement in intra-day reproducibility and inter-day reproducibility can be expected.
【００６６】本発明の第一の測定方法において、特に、
好ましく３種類のラベル剤を用いた場合には、従来の測
定法において課題であったプロゾーン現象が生じたか否
かを知ることも可能であり、しかも、プロゾーン現象が
生じている領域における測定結果からであっても、測定
対象物質の測定が可能である。一方で本発明の方法で
は、従来の測定方法ではラベル剤の非特異的結合が生じ
得るような、大量のラベル剤を反応に供することが可能
となり、液相中で反応を生じさせることに加え、大量の
ラベル剤を使用することで更に測定対象物質との反応速
度を向上させ、結果的に測定操作に要する時間を更に短
縮することができる。従って３種類以上のラベル剤を用
いた場合には、２種類のラベル剤を用いる場合に比べて
更に高感度かつ高精度の測定が可能である。In the first measuring method of the present invention,
When three kinds of labeling agents are preferably used, it is possible to know whether or not the prozone phenomenon which has been a problem in the conventional measurement method has occurred, and furthermore, it is possible to perform measurement in an area where the prozone phenomenon has occurred. Even from the results, the measurement target substance can be measured. On the other hand, in the method of the present invention, a large amount of labeling agent can be subjected to the reaction, which can cause nonspecific binding of the labeling agent in the conventional measurement method. By using a large amount of labeling agent, the reaction speed with the substance to be measured can be further improved, and as a result, the time required for the measurement operation can be further reduced. Therefore, when three or more types of labeling agents are used, higher sensitivity and higher precision measurement can be performed than when two types of labeling agents are used.
【００６７】通常の競合測定方法においては、未知濃度
の測定対象物質を含む試料を用いて測定した蛍光強度を
測定対象物質がゼロ濃度の時の蛍光強度で割った値を測
定対象物質の濃度に対してプロットし、検量線を作成す
る。ここで、未知濃度についての蛍光強度測定と測定対
象物質がゼロ濃度の時の蛍光強度測定を同時に実施する
ことはできないため、別々に実施される。測定毎の測定
値の変動は避けられないため、測定対象物質がゼロ濃度
の時の蛍光強度の推定値には誤差を伴うため、低濃度の
測定対象物質について高精度の測定を行うのは困難であ
る。これに対して本発明の第二の測定方法では、未知濃
度の測定対象物質の蛍光強度に対応する量はＡＢ群に属
する分子の数として、測定対象物質がゼロの時の蛍光強
度に対応する量はＡＢ群とＡ群に属する分子の数の和又
はＡＢ群とＢ群に属する分子の数の和として把握される
ことから、未知濃度の測定対象物質を含む試料について
の蛍光強度に対応する量と測定対象物質がゼロ濃度の時
の蛍光強度に対応する量を同一の測定で求めることが可
能となり、この結果、低濃度の測定対象物質を高精度で
測定可能となる。In the ordinary competitive measurement method, the value obtained by dividing the fluorescence intensity measured using a sample containing an unknown concentration of a substance to be measured by the fluorescence intensity when the substance to be measured is zero concentration is used as the concentration of the substance to be measured. And plot a calibration curve. Here, the fluorescence intensity measurement for the unknown concentration and the fluorescence intensity measurement for the case where the substance to be measured is at zero concentration cannot be performed at the same time, so they are separately performed. It is difficult to perform high-precision measurements on low-concentration analytes because the measured value of each analyte is unavoidable, and the estimated value of the fluorescence intensity when the analyte is at zero concentration involves an error. It is. In contrast, in the second measurement method of the present invention, the amount corresponding to the fluorescence intensity of the unknown concentration of the measurement target substance corresponds to the fluorescence intensity when the measurement target substance is zero, as the number of molecules belonging to the AB group. Since the amount is grasped as the sum of the number of molecules belonging to the AB group and the group A or the sum of the number of molecules belonging to the AB group and the B group, it corresponds to the fluorescence intensity of the sample containing the target substance of unknown concentration. The amount and the amount corresponding to the fluorescence intensity when the substance to be measured has zero concentration can be obtained by the same measurement, and as a result, the low-concentration substance to be measured can be measured with high accuracy.
【図１】図１は、本発明の測定方法を実施するための装
置の概要を示すものである。FIG. 1 shows an outline of an apparatus for carrying out a measuring method of the present invention.
【図２】図２は、ラベル剤に使用する蛍光物質の蛍光ス
ペクトルの一例を示すものである。FIG. 2 shows an example of a fluorescence spectrum of a fluorescent substance used for a labeling agent.
【図３】図３は、２種類のラベル剤を用いる本発明の測
定方法を説明するための図である。FIG. 3 is a diagram for explaining the measurement method of the present invention using two types of labeling agents.
【図４】図４は、２種類のラベル剤を用いる本発明の測
定方法を説明するための図である。FIG. 4 is a diagram for explaining the measurement method of the present invention using two types of labeling agents.
【図５】図５は、３種類のラベル剤を用いる本発明の測
定方法を説明するための図である。FIG. 5 is a diagram for explaining the measurement method of the present invention using three types of labeling agents.
【図６】図６は、３種類のラベル剤を用いる本発明の測
定方法を説明するための図である。FIG. 6 is a diagram for explaining the measurement method of the present invention using three types of labeling agents.
【図７】図７は、２種類のラベル剤を用いる本発明の測
定方法の他の態様を説明するための図である。FIG. 7 is a diagram for explaining another embodiment of the measurement method of the present invention using two types of labeling agents.
【図８】図８は、２種類のラベル剤を用いる本発明の測
定方法の他の態様を説明するための図である。FIG. 8 is a diagram for explaining another embodiment of the measuring method of the present invention using two types of labeling agents.
１ 光源 ２ レンズ（励起光集光系） ３ シースフローを形成するための内管 ４ シースフローを形成するための外管 ５ 分離された分子 ６ レンズ（蛍光集光系） ７ 蛍光検出器 ８ 増幅器 ９ 判別手段 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Light source 2 Lens (excitation light condensing system) 3 Inner tube for forming sheath flow 4 Outer tube for forming sheath flow 5 Separated molecule 6 Lens (fluorescence condensing system) 7 Fluorescence detector 8 Amplifier 9 Discrimination means
Claims (15)
象物質に特異的でかつ同時に結合可能な２種類以上のラ
ベル剤と該測定対象物質を溶液中で接触、反応させて反
応液を形成し、反応液中の反応生成物及び／又は未反応
物を１分子ずつ分離した状態で蛍光測定部位において前
記ラベル剤から発せられる蛍光を測定し、該測定結果か
ら該分子を反応生成物及び／又は未反応物に同定、計数
し、かつ、少なくとも一つの同定物についての計数値か
ら測定対象物質の量及び／又は濃度を決定する、測定方
法。1. A solution in which two or more types of labeling agents which are specific and can simultaneously bind to a single substance to be measured labeled with different fluorescent substances are contacted and reacted with the substance to be measured to form a reaction solution. Formed, the reaction products and / or unreacted products in the reaction solution are separated one by one and the fluorescence emitted from the labeling agent is measured at the fluorescence measurement site, and the reaction products and / or And / or a method for identifying and counting unreacted substances, and determining the amount and / or concentration of the substance to be measured from the count value of at least one identified substance.
ね同心に配置し、細管から反応液を流すと共に細管外壁
と外管内壁の間にシース液を流すことにより反応液中の
反応生成物及び未反応物を１分子ずつ分離し同定を行な
うことを特徴とする請求項１の測定方法。2. A thin tube having a tip cut inside the outer tube is disposed substantially concentrically with the outer tube, and the reaction solution flows from the thin tube and the sheath liquid flows between the outer wall of the thin tube and the inner wall of the outer tube. 2. The method according to claim 1, wherein the reaction product and the unreacted product are separated and identified one by one.
励起スペクトル又は蛍光スペクトルのいずれか１つ以上
の蛍光特性により相互に区別可能な２種類以上の蛍光物
質でそれぞれ標識されていることを特徴とする請求項１
の測定方法。3. The method according to claim 2, wherein the two or more labeling agents have a fluorescence lifetime,
2. The method according to claim 1, wherein the at least one fluorescent substance is labeled with at least two kinds of fluorescent substances that can be distinguished from each other based on at least one fluorescent characteristic of an excitation spectrum or a fluorescent spectrum.
Measurement method.
の測定対象物質に特異的かつ同時に結合可能な２種類の
ラベル剤を用いる請求項１に記載の免疫測定法であっ
て、同定の際に少なくとも該２種類の異なるラベル剤を
同時に含む分子が同定されることを特徴とする請求項１
〜３いずれかの測定法。4. The immunoassay according to claim 1, wherein two types of labeling agents that can specifically and simultaneously bind to a single substance to be measured labeled with two different types of fluorescent substances are used. 2. The method according to claim 1, wherein a molecule containing at least the two different labeling agents at the same time is identified.
Any one of the above-mentioned methods.
の計数値といずれか１種類のラベル剤を含む分子の計数
値の比、及び、測定対象物質の量又は濃度から検量線を
作成し、測定対象物質の量及び／又は濃度を決定するこ
とを特徴とする請求項４の測定法。5. A calibration curve is prepared from the ratio of the count value of a molecule containing two different labeling agents simultaneously to the count value of a molecule containing one of the labeling agents, and the amount or concentration of the substance to be measured. 5. The method according to claim 4, wherein the amount and / or concentration of the substance to be measured is determined.
の測定対象物質に特異的かつ同時に結合可能な３種類の
ラベル剤を用いる請求項１に記載の免疫測定法であっ
て、同定の際に少なくとも該３種類の異なるラベル剤を
同時に含む分子が同定されることを特徴とする請求項１
〜３いずれかの測定法。6. The immunoassay according to claim 1, wherein three types of labeling agents capable of specifically and simultaneously binding to a single substance to be measured labeled with three different fluorescent substances are used. 2. The method according to claim 1, wherein a molecule containing at least the three different labeling agents at the same time is identified.
Any one of the above-mentioned methods.
の計数値と少なくともいずれか２種類のラベル剤を同時
に含む分子の計数値の比、及び、測定対象物質の量又は
濃度から検量線を作成し、測定対象物質の量及び／又は
濃度を決定することを特徴とする請求項６の測定法。7. A calibration curve is obtained from the ratio of the count value of a molecule simultaneously containing three different labeling agents to the count value of a molecule simultaneously containing at least any two labeling agents, and the amount or concentration of the substance to be measured. 7. The measuring method according to claim 6, wherein the amount and / or concentration of the substance to be measured is determined.
の計数値と少なくともいずれかのラベル剤を含む分子の
計数値の比、及び、測定対象物質の量又は濃度から検量
線を作成し、測定対象物質の量及び／又は濃度を決定す
ることを特徴とする請求項６の測定法。8. A calibration curve is created from the ratio of the count value of molecules containing three different labeling agents simultaneously to the count value of molecules containing at least one of the labeling agents, and the amount or concentration of the substance to be measured. 7. The method according to claim 6, wherein the amount and / or concentration of the substance to be measured is determined.
判定することを特徴とする請求項７又は８の測定法。9. The method according to claim 7, wherein it is determined whether a so-called prozone phenomenon has occurred.
子の計数値と少なくともいずれか２種類のラベル剤を含
む分子の計数値の比、及び、測定対象物質の量又は濃度
について検量線を作成し、いわゆるプロゾーン現象が生
じる領域の一部で測定対象物質を定量することを特徴と
する請求項７又は８の測定法。10. A calibration curve is prepared for the ratio of the count value of molecules containing three different labeling agents to the count value of molecules containing at least two types of labeling agents, and the amount or concentration of the substance to be measured. 9. The method according to claim 7, wherein the measurement target substance is quantified in a part of a region where a so-called prozone phenomenon occurs.
（ラベル剤）、該蛍光物質とは異なる蛍光物質で標識さ
れた測定対象物質に結合可能なラベル剤及び測定対象物
質を溶液中で接触、反応させて反応液を形成し、反応液
中の反応生成物及び／又は未反応物を１分子ずつ分離し
た状態で蛍光測定部位において前記ラベル剤から発せら
れる蛍光を測定し、該測定結果から該分子を反応生成物
及び／又は未反応物に同定、計数し、かつ、少なくとも
一つの同定物についての計数値から測定対象物質の量及
び／又は濃度を決定する、測定方法。11. A measuring substance (labeling agent) preliminarily labeled with a fluorescent substance, a labeling substance capable of binding to a measuring substance labeled with a fluorescent substance different from said fluorescent substance, and a measuring substance are brought into contact in solution. Reacting to form a reaction solution, and measuring the fluorescence emitted from the labeling agent at the fluorescence measurement site in a state where the reaction products and / or unreacted substances in the reaction solution are separated one by one, from the measurement result. A measurement method, wherein the molecule is identified and counted as a reaction product and / or an unreacted product, and the amount and / or concentration of the substance to be measured is determined from the count value of at least one identified product.
概ね同心に配置し、細管から反応液を流すと共に細管外
壁と外管内壁の間にシース液を流すことにより反応液中
の反応生成物及び未反応物を１分子ずつ分離することを
特徴とする請求項１１の測定方法。12. A thin tube having a tip cut inside the outer tube is disposed substantially concentrically with the outer tube, and a reaction solution flows from the thin tube and a sheath liquid flows between the outer wall of the thin tube and the inner wall of the outer tube. The method according to claim 11, wherein the reaction product and the unreacted product are separated one by one.
ペクトル又は蛍光スペクトルのいずれか１つ以上の蛍光
特性により相互に区別可能であることを特徴とする請求
項１１の測定方法。13. The method according to claim 11, wherein said labeling agents are distinguishable from each other by one or more fluorescence characteristics of fluorescence lifetime, excitation spectrum or fluorescence spectrum.
て、同定の際に少なくとも該２種類の異なるラベル剤を
同時に含む分子が同定されることを特徴とする請求項１
１〜１４いずれかの測定法。14. The immunoassay according to claim 11, wherein at the time of identification, a molecule containing at least the two different labeling agents at the same time is identified.
Any one of the measurement methods 1 to 14.
子の計数値と少なくともいずれか１種類のラベル剤を含
む分子の計数値の比、及び、測定対象物質の量又は濃度
から検量線を作成し、測定対象物質の量及び／又は濃度
を決定することを特徴とする請求項１４の測定法。15. A calibration curve is prepared from the ratio of the count value of molecules containing two different labeling agents to the count value of molecules containing at least one type of labeling agent, and the amount or concentration of the substance to be measured. The method according to claim 14, wherein the amount and / or concentration of the substance to be measured is determined.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26348197A JPH11101802A (en) | 1997-09-29 | 1997-09-29 | Measurement method utilizing specific bonding |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26348197A JPH11101802A (en) | 1997-09-29 | 1997-09-29 | Measurement method utilizing specific bonding |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11101802A true JPH11101802A (en) | 1999-04-13 |
Family
ID=17390117
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26348197A Pending JPH11101802A (en) | 1997-09-29 | 1997-09-29 | Measurement method utilizing specific bonding |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11101802A (en) |
-
1997
- 1997-09-29 JP JP26348197A patent/JPH11101802A/en active Pending
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