JPH1090272A - Measuring antigen - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To reaction-specifically and easily measure anti-supprurative streptococcus antibody by using a highly safe protein having antigenic property in which no hemolytic performance is observed. SOLUTION: Suppurative streptococcus 3-type D58X strain is cultivated at about 37 for 16 hours with a Todd-Hewitt broth 150L, the strain-removed medium is recovered by centrifugal separation and filtration, and successively condensed by an ultrafiltration membrane to provide a condensed solution. This solution is diluted twice with 36m phosphoric acid buffer solution containing 3mM of EDTA.2Na (ethylenediamine disodium tetraacetate dihydrate) and 2mM of sodium azide having a 2-mercaptoethanol concentration, and ion- exchange chromatography is performed by use of a hydroxyapatite column equilibrated with the same solution. The recovered solution is successively concentrated by a hydroxyapatite column equilibrated with the buffer solution. This method using Ω-cephalose FF and hydroxyapatite is repeated to provide 100ml of a protein solution.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、化膿性レンサ球菌
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）感
染症の診断のための新規蛋白質に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel protein for diagnosing Streptococcus pyogenes infection.

【０００２】[0002]

【従来の技術】化膿性レンサ球菌は、扁桃腺、咽頭炎、
皮膚化膿症、猩紅熱や続発症としてリウマチ熱、糸球体
腎炎をはじめとする多くの疾患群を惹起する病原菌であ
る。化膿性レンサ球菌が産生する菌体外産生物質は多種
多様であり、例えば、ストレプトリジンＯ、発赤毒素、
ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、ヒアルロ
ン酸分解酵素、リボ核酸分解酵素、ノイラミン酸分解酵
素等がある（レンサ球菌感染症〔中〕−その基礎と臨床
−、塩川優一・吉岡守正・浜田茂幸編集、３１７〜３５
９、廣川書店（株）、１９９２年６月２５日発行）。BACKGROUND OF THE INVENTION Suppurative streptococci are known as tonsils, pharyngitis,
It is a pathogenic bacterium that causes many disease groups including cutaneous suppuration, scarlet fever and, as a sequela, rheumatic fever and glomerulonephritis. Exogenous substances produced by pyogenic streptococci are diverse and include, for example, streptolysin O, redness toxin,
There are streptokinase, streptodornase, hyaluronan degrading enzyme, ribonuclease, neuraminic acid degrading enzyme, etc. (streptococcal infectious disease [middle]-its basics and clinical practice, edited by Yuichi Shiokawa, Morimasa Yoshioka, Shigeyuki Hamada, 317) ~ 35
9, Hirokawa Shoten Co., Ltd., issued on June 25, 1992).

【０００３】そのうちストレプトリジンＯは、例えばラ
ンスフィールドの血清学的分類（Ｌａｎｃｅｆｉｅｌ
ｄ，Ｒ．Ｃ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、５７、５７１〜
５９５（１９３３））から、化膿性レンサ球菌が産生す
る溶血毒素のひとつである。一般に還元条件下、例えば
メルカプトエタノールの存在下で赤血球の溶血を生じせ
しめる分子量５０,０００〜７０,０００の範囲に含まれ
る蛋白質として知られており、コレステロールに対する
親和性が高く、細胞膜と結合して細胞を溶解せしめる活
性を有し、小動物の心臓に毒性と致死性を示す。しか
し、酸素に不安定であり、溶血活性が不活化してしまう
（レンサ球菌感染症〔上〕−その基礎と臨床−、塩川優
一・吉岡守正・浜田茂幸編集、８８〜９７、廣川書店
（株）、１９９２年６月５日発行）。[0003] Among them, streptolysin O is, for example, a serological classification of Lancefield (Lancefield).
d, R.C. C. J. Exp. Med. , 57, 571-
595 (1933)), which is one of the hemolytic toxins produced by S. pyogenes. It is generally known as a protein having a molecular weight in the range of 50,000 to 70,000 that causes hemolysis of erythrocytes under reducing conditions, for example, in the presence of mercaptoethanol, has a high affinity for cholesterol, and binds to cell membranes. It has the activity of lysing cells, and is toxic and lethal to the heart of small animals. However, it is unstable to oxygen and the hemolytic activity is inactivated (streptococcal infection [1]-its basics and clinical practice), edited by Yuichi Shiokawa, Morimasa Yoshioka, Shigeyuki Hamada, 88-97, Hirokawa Shoten Co., Ltd. ), Issued June 5, 1992).

【０００４】ところで化膿性レンサ球菌に感染した患者
の血清では、ストレプトリジンＯに対する抗ストレプト
リジンＯ抗体の抗体価が上昇することが知られており、
化膿性レンサ球菌感染症の診断のために抗ストレプトリ
ジンＯ抗体の確認およびその抗体価の測定が広く用いら
れている（長田富香、臨床検査、２３（臨時増刊）、１
１７２〜１１７５（１９７９））。[0004] By the way, it is known that the serum titer of an anti-streptolysin O antibody against streptolysin O increases in the serum of a patient infected with pyogenic streptococci,
Confirmation of anti-streptolysin O antibody and measurement of the antibody titer are widely used for the diagnosis of purulent streptococcal infection (Tomika Nagata, Clinical Laboratory, 23 (extra edition),
172-1175 (1979)).

【０００５】抗ストレプトリジンＯ抗体価を測定する方
法としては、ウサギ赤血球、ヒツジ赤血球、またはヒト
Ｏ型赤血球を用いるランツ・ランダール法（Ｒａｎｔ
ｚ，Ｌ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｍｅｄ．、５９、２２〜２５（１９４５））および
その変法であるマイクロタイター法（Ｅｄｗａｒｄｓ，
Ｅ．Ａ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、８７、１２５４
〜１２５５（１９６４））が従来から日常検査に広く用
いられてきた。[0005] As a method for measuring the anti-streptolysin O antibody titer, the Lanz-Randal method (Rant-Randal method) using rabbit erythrocytes, sheep erythrocytes or human O-type erythrocytes is used.
z, L .; A. Proc. Soc. Exp. Bio
l. Med. , 59, 22-25 (1945)) and a variation thereof, the microtiter method (Edwards,
E. FIG. A. J. Bacteriol. , 87, 1254
-1255 (1964)) has been widely used for daily inspection.

【０００６】これらの測定法はいずれもストレプトリジ
ンＯが有する溶血活性を被検液中の抗ストレプトリジン
Ｏ抗体が中和することを原理とした測定法である。スト
レプトリジンＯに特徴的な生物活性である溶血活性を利
用したこれらの測定法では、多数の抗原物質の中でスト
レプトリジンＯに対する特異的な抗体すなわち抗ストレ
プトリジンＯ抗体のみ測定できる（藤本秀江ら、臨床病
理、４０、２１〜２７（１９９２））。[0006] These assays are all based on the principle that the anti-streptolysin O antibody in the test solution neutralizes the hemolytic activity of streptolysin O. In these assays utilizing the hemolytic activity, which is a characteristic biological activity of streptolysin O, only a specific antibody to streptolysin O, that is, an anti-streptolidine O antibody, can be measured among many antigenic substances (Hidee Fujimoto) Et al., Clinical Pathology, 40, 21-27 (1992)).

【０００７】しかしながら、これらの測定法では必然的
に新鮮な赤血球を必要とするため、用いる赤血球の安定
性、ロット差等により影響を受け、測定値のバラツキが
生じやすく、また、操作法も煩雑であり、自動化は極め
て困難であった（特開平６―１８６２３３号公報）。近
年、ストレプトリジンＯを固相化させたラテックス粒子
等の担体を用いた免疫凝集反応を原理とする被検液の抗
ストレプトリジンＯ抗体価の測定法が用いられるように
なり（三浦利彦ら、衛生検査、３６、３６〜４０（１９
８７））、前述のストレプトリジンＯの溶血活性を利用
した測定法に比べ、不安定な赤血球を必要としない点や
自動化分析が可能となった点等で改善されてきている。[0007] However, since these measurement methods necessarily require fresh red blood cells, they are affected by the stability of the red blood cells used, differences in lots, and the like, and are likely to cause variations in measured values, and the operation method is complicated. Thus, automation was extremely difficult (JP-A-6-186233). In recent years, a method of measuring an anti-streptolysin O antibody titer of a test solution based on immunoagglutination reaction using a carrier such as latex particles having streptolysin O immobilized thereon has come to be used (Toshihiko Miura et al. Hygiene inspection, 36, 36-40 (19
87)), compared to the above-described measurement method using the hemolytic activity of streptolysin O, the method has been improved in that unstable red blood cells are not required and that automated analysis has become possible.

【０００８】一方、ラテックス粒子等の担体に固相化さ
せるストレプトリジンＯは、一般には化膿性レンサ球菌
の培養液から調製されるが、ストレプトリジンＯの精製
が困難なことから高純度のストレプトリジンＯを得るこ
とが極めて難しく、通常は、化膿性レンサ球菌の産生す
る多様な抗原物質が同時に担体上に固相化される問題が
ある。このため、測定される抗体価は、ストレプトリジ
ンＯの他に固相化されたすべての抗原物質に対する被検
液中の抗体を総合的に測定したものになる。[0008] On the other hand, streptolysin O to be immobilized on a carrier such as latex particles is generally prepared from a culture solution of Streptococcus pyogenes. However, since it is difficult to purify streptolysin O, high-purity streptolysin is used. It is extremely difficult to obtain O, and usually there is a problem that various antigenic substances produced by Streptococcus pyogenes are simultaneously immobilized on a carrier. Therefore, the antibody titer to be measured is a value obtained by comprehensively measuring antibodies in the test liquid against all immobilized antigen substances in addition to streptolysin O.

【０００９】[0009]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、これらのス
トレプトリジンＯを抗原とした抗ストレプトリジンＯ抗
体価測定法が抱える問題点を解決すべく、ストレプトリ
ジンＯに代わる新規蛋白抗原を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a novel protein antigen that replaces streptolysin O in order to solve the problems encountered in the anti-streptolysin O antibody titer method using streptolysin O as an antigen. That is.

【００１０】[0010]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）培養液中に存在し、ストレプト
リジンＯ感染患者血清と反応し、すなわち抗原性を有
し、さらにストレプトリジンＯの活性能であるウサギ等
由来赤血球に対する溶血活性能を認めない新規で安全性
の高い蛋白質を見い出し、当該蛋白質を単離、精製して
本発明を完成するに至った。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present inventors have conducted intensive studies and found that Streptococcus pyogenes (Streptococcus).
spyogenes) New and safe, which is present in the culture medium and reacts with the serum of a patient infected with streptolysin O, that is, it has antigenicity and does not show any hemolytic activity against erythrocytes derived from rabbits and the like, which is an activity of streptolysin O The present inventors have found a protein having high activity and isolated and purified the protein, thereby completing the present invention.

【００１１】すなわち、本発明は、以下の理化学的性
質、 分子量 ４７０００±５０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。 Ｎ末アミノ酸配列 Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ 紫外線吸収スペクトル λ_max 280 _nm 呈色反応 ニンヒドリン反応 陽性 等電点 ｐＩ８．５±１．０（等電点電気泳動ゲル）を示し、こ
れらの結果から化膿性レンサ球菌由来の新規蛋白質を提
供するものである。That is, the present invention provides the following physicochemical properties, molecular weight 47000 ± 5000 (SDS-PAGE). N-terminal amino acid sequence Val-Ser-Gly-Lys-Glu-Asn-L
ys-Lys-Ser-Asp-Val-Lys-Ty
r-Glu-Thr Ultraviolet absorption spectrum λ _max 280 _nm Color reaction Ninhydrin reaction Positive Isoelectric point pI 8.5 ± 1.0 (isoelectric focusing electrophoresis gel). From these results, a new strain derived from S. pyogenes It provides proteins.

【００１２】以下、本発明につき詳細に説明する。本発
明において用いる該蛋白質生産菌すなわち化膿性レンサ
球菌は、例えば３型菌Ｄ５８Ｘ株（ＡＴＣＣ１２３８
３）が最も有効に使用される菌株の一例であるが、微生
物の一般的性状として菌学上の性質は変異し得るもので
あるから、変種や変異株も含め、該蛋白質を生産する能
力を有する菌株であれば限定するものではない。Hereinafter, the present invention will be described in detail. The protein-producing bacterium used in the present invention, ie, pyogenic streptococcus, is, for example, a type 3 strain D58X (ATCC1238).
3) is an example of a strain that is most effectively used. However, as a general property of microorganisms, the mycological properties can be mutated. Therefore, the ability to produce the protein, including variants and mutants, is required. The strain is not limited as long as it has the strain.

【００１３】本発明の化膿性レンサ球菌の培養には、液
体培養、固体培養いずれも可能であるが嫌気的条件下で
行うのが有利である。培養温度は菌が発育し、該蛋白質
が産生する範囲であれば良く、通常２０℃〜４０℃、好
ましくは３０℃〜３８℃である。培養時間は、培養条件
によって異なるが、該蛋白質が最も産生される時間まで
培養すれば良く、通常１４〜１００時間程度である。The culture of the pyogenic Streptococcus of the present invention can be carried out in either liquid culture or solid culture, but is preferably carried out under anaerobic conditions. The culture temperature may be within a range in which the bacteria grow and the protein is produced, and is usually 20 ° C to 40 ° C, preferably 30 ° C to 38 ° C. The culturing time varies depending on the culturing conditions, but the culturing may be carried out up to the time when the protein is most produced, and is usually about 14 to 100 hours.

【００１４】使用する培地の栄養源としては一般に微生
物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩およびその
他の微量栄養源の他、ストレプトコッカス属に属する微
生物の利用できる栄養源であればすべて使用できる。炭
素源としては、グルコース、フルクトース、サッカロー
ス、キシロース、マルトース、ソルビトール、グリセロ
ール、デキストリン、でんぷん、アミノ酸等の他、脂肪
酸、油脂、有機酸等が単独または組み合わせて用いられ
る。As a nutrient source of the culture medium to be used, in addition to carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and other trace nutrients generally used for culturing microorganisms, any nutrient sources that can be used by microorganisms belonging to the genus Streptococcus can be used. . As the carbon source, glucose, fructose, saccharose, xylose, maltose, sorbitol, glycerol, dextrin, starch, amino acids, etc., as well as fatty acids, oils, organic acids, etc. are used alone or in combination.

【００１５】窒素源としては、無機窒素源、有機窒素源
のいずれも使用可能であり、無機窒素源としては硝酸ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ア
ンモニア、尿素、硝酸ソーダ等が挙げられる。また、有
機窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキ
ス、ペプトン、カゼイン、アミノ酸、また大豆、米、ト
ウモロコシ、小麦の粉等が挙げられる。As the nitrogen source, any of an inorganic nitrogen source and an organic nitrogen source can be used. Examples of the inorganic nitrogen source include ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonia, urea, and sodium nitrate. Examples of organic nitrogen sources include yeast extract, malt extract, meat extract, peptone, casein, amino acids, soybean, rice, corn, wheat flour and the like.

【００１６】無機塩および微量栄養源としては、例えば
リン酸、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリ
ウム、亜鉛、鉄、マンガン等の塩類の他、Ｌ−バリン、
Ｌ−グルタミン酸等のアミノ酸、ビタミン、非イオン性
界面活性剤、消泡剤などの菌の生育や該蛋白質の生産を
促進するものであれば必要に応じ使用できる。該蛋白質
は菌体外に存在するため、培養液を精製すれば良い。精
製法を例示すれば、先ず上記のようにして得られた培養
物から濾過または遠心分離等の手段によって除菌し、粗
製の該蛋白質含有液が得られる。Examples of the inorganic salts and trace nutrients include salts of phosphoric acid, magnesium, calcium, potassium, sodium, zinc, iron, manganese and the like, as well as L-valine,
Amino acids such as L-glutamic acid, vitamins, nonionic surfactants, antifoaming agents, and the like can be used as needed as long as they promote the growth of bacteria and the production of the protein. Since the protein exists outside the cells, the culture solution may be purified. When the purification method is exemplified, the culture obtained as described above is firstly sterilized by means such as filtration or centrifugation to obtain a crude liquid containing the protein.

【００１７】粗該蛋白質含有液から、公知の蛋白質、酵
素等の単離、精製手段を用いることによりさらに精製さ
れた該蛋白質を得ることができる。例えば、粗製の該蛋
白質含有液に硫安、食塩、硫酸ナトリウム、リン酸ナト
リウム等を添加する塩析沈殿法、アセトン、メタノー
ル、エタノール等の有機溶媒による分別沈殿法等の手段
により沈殿物として回収する。A further purified protein can be obtained from the crude protein-containing solution by using known protein and enzyme isolation and purification means. For example, the crude protein-containing solution is recovered as a precipitate by a salting-out precipitation method in which ammonium sulfate, salt, sodium sulfate, sodium phosphate, or the like is added, or a fractional precipitation method using an organic solvent such as acetone, methanol, or ethanol. .

【００１８】さらに、この沈殿物は半透膜を用いる透
析、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、ハイドロフォービッククロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー等により精製する。また、こ
れらの方法を適当に組み合わせて行うことにより該蛋白
質の精製度があがる場合は適宜組み合わせて行うことが
できる。Further, the precipitate is purified by dialysis using a semipermeable membrane, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography or the like. In addition, when the purification degree of the protein is increased by performing an appropriate combination of these methods, the protein can be appropriately combined.

【００１９】これらの方法によって得られる該蛋白質
は、安定化剤として各種の塩類、糖類、蛋白質、脂質、
界面活性剤等を加えあるいは加えることなく、限外濾過
濃縮、凍結乾燥の方法により、液状または固形の該蛋白
質を得ることができる。このようにして得られた該蛋白
質は、次の理化学的性質を有する。 分子量 ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）法を行い、標準蛋白質と比較することにより、分子
量を決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１２．５％ポリア
クリルアミドゲルを用いて、ランムリエ（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ，Ｕ．Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０〜６８
５、（１９７０））の方法に準じて行った。また、標準
蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量スタンダードローレ
ンジ（ホスフォリラーゼＢ：９２５００、ウシ血清アル
ブミン：６６２００、オボアルブミン：４５０００、カ
ルボニックアンヒドラーゼ：３１０００、ソイビーント
リプシンインヒビター：２１５００、リゾチーム：１４
４００）（バイオラッド社製）用いた。泳動後のゲルは
銀染色ＩＩキットワコー（和光純薬工業（株）社製）に
て銀染色を施した。その結果、該蛋白質の分子量は４７
０００±５０００である。 Ｎ末アミノ酸配列 ＰＶＤＦ膜に転写し、島津ＰＱＳ−１型シークエンサー
（島津製作所製）による自動エドマン分解にかけたとこ
ろ、Ｎ末アミノ酸配列は、Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒである。 紫外線吸収スペクトル λ_max 280 _nm（蛋白質濃度；１ｍｇ／ｍｌ蒸留水、ｐＨ
７．０、石英セル（光路長１０ｍｍ）（ＨＥＬＬＭＡ社
製）使用） 呈色反応 ニンヒドリン反応に対して陽性であった。 等電点 ｐＨ３．０〜９．０のキャリアーアンフォライトを含む
ポリアクリルアミドゲル（商品名：ＰｈａｓｔＧｅｌ
ＩＥＦ ３−９）（ファルマシア社製）とＰｈａｓｔ
Ｓｙｓｔｅｍ全自動電気泳動システム（ファルマシア社
製）を用い、電圧２０００Ｖ、電流２．５ｍＡ、電力
３．５Ｗ、泳動時間３０分の条件において電気泳動を行
った。等電点の判定は、標準物質としたｐＩカリブレー
ションキット（アミノグルコシダーゼ：３．５０、大豆
トリプシンインヒビター：４．５５、β−ラクトグロブ
リンＡ：５．２０、ウシカーボニックアンヒドラーゼ
Ｂ：５．８５、ヒトカーボニックアンヒドラーゼＢ：
６．５５、ウマミオグロブリン−酸性側バンド：６．８
５、ウマミオグロブリン−塩基性側バンド：７．３５、
レンチルレクチン−酸性側バンド：８．１５、レンチル
レクチン−中間バンド：８．４５、レンチルレクチン−
塩基性側バンド：８．６５、トリプシノーゲン：９．３
０）（ファルマシア社製）を用いて行った。その結果
は、ｐＩ８．５±１．０であった。The protein obtained by these methods can be used as a stabilizer as various salts, saccharides, proteins, lipids,
The liquid or solid protein can be obtained by ultrafiltration and lyophilization without or with the addition of a surfactant or the like. The protein thus obtained has the following physicochemical properties. Molecular weight SDS polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAG
E) The method was performed, and the molecular weight was determined by comparing with a standard protein. SDS-PAGE was performed using a 12.5% polyacrylamide gel using Laemml (Laemml).
i, U. K. , Nature, 227, 680-68
5, (1970)). Standard proteins were SDS-PAGE molecular weight standard low range (phosphorylase B: 92,500, bovine serum albumin: 66200, ovalbumin: 45000, carbonic anhydrase: 31000, soybean trypsin inhibitor: 21500, lysozyme: 14)
400) (manufactured by Bio-Rad). The gel after electrophoresis was subjected to silver staining using a silver staining II kit Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the molecular weight of the protein was 47
000 ± 5000. N-terminal amino acid sequence When transferred to a PVDF membrane and subjected to automatic Edman degradation using a Shimadzu PQS-1 type sequencer (manufactured by Shimadzu Corporation), the N-terminal amino acid sequence was Val-Ser-Gly-L.
ys-Glu-Asn-Lys-Lys-Ser-As
p-Val-Lys-Tyr-Glu-Thr. UV absorption spectrum λ _max 280 _nm (protein concentration; 1 mg / ml distilled water, pH
7.0, using a quartz cell (optical path length: 10 mm) (manufactured by HELLMA) Coloring reaction Positive for ninhydrin reaction. Polyacrylamide gel containing carrier ampholite having an isoelectric point of pH 3.0 to 9.0 (trade name: PastGel)
IEF 3-9) (Pharmacia) and Past
Using a System fully automatic electrophoresis system (manufactured by Pharmacia), electrophoresis was performed under the conditions of a voltage of 2000 V, a current of 2.5 mA, a power of 3.5 W, and a migration time of 30 minutes. The isoelectric point was determined using a pI calibration kit (aminoglucosidase: 3.50, soybean trypsin inhibitor: 4.55, β-lactoglobulin A: 5.20, bovine carbonic anhydrase B: 5) as a standard substance. .85, human carbonic anhydrase B:
6.55, equine myoglobulin-acidic band: 6.8
5, equine myoglobulin-basic side band: 7.35;
Lentil lectin-acid side band: 8.15, lentil lectin-intermediate band: 8.45, lentil lectin-
Basic side band: 8.65, trypsinogen: 9.3
0) (manufactured by Pharmacia). The result was pI 8.5 ± 1.0.

【００２０】このように、分子量、部分アミノ酸配列等
と照らし合わせた結果、化膿性レンサ球菌由来の該蛋白
質は新規物質であると判断した。次に、該蛋白質を抗原
物質として使用する方法は、抗化膿性レンサ球菌抗体を
取得するための免疫アフィニティークロマトグラフィー
におけるリガンドとして使用でき、例えば、物理的吸着
あるいは化学的結合を利用して該蛋白質を不溶性担体、
例えば、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ＣＮＢｒ−
Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ）（フ
ァルマシア社製）等に常法に従ってリガンドとして結合
させ、これと分離したい抗化膿性レンサ球菌抗体を含有
する溶液を反応させた後、水または適当な緩衝液で該担
体を洗浄して非結合物を分離する。次いで、当業者によ
く知られた抗原抗体複合体の解離剤、例えば、グリシン
塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）、４．５Ｍ塩化マグネシウム
溶液（ｐＨ７．５）、５０％（ｖ／ｖ）エチレングリコ
ール溶液、１Ｍプロピオン酸溶液（ｐＨ２．５）、８Ｍ
尿素溶液（ｐＨ６．０）または、６Ｍ塩酸グアニジン溶
液（ｐＨ３．１）等を反応させることにより、迅速に抗
化膿性レンサ球菌抗体を効率よく取り出すことができ
る。As described above, the protein derived from S. pyogenes was determined to be a novel substance as a result of comparison with the molecular weight, partial amino acid sequence, and the like. Next, the method of using the protein as an antigenic substance can be used as a ligand in immunoaffinity chromatography for obtaining an anti-suppurative streptococcal antibody, for example, by utilizing physical adsorption or chemical bonding to obtain the protein. The insoluble carrier,
For example, CNBr-activated Sepharose 4B (CNBr-
Activated Sepharose 4B) (manufactured by Pharmacia) or the like is bound as a ligand according to a conventional method, and the resultant is reacted with a solution containing an anti-purulent streptococcal antibody to be separated, and then the carrier is washed with water or an appropriate buffer. To separate unbound material. Then, a dissociating agent for antigen-antibody complexes well known to those skilled in the art, for example, glycine hydrochloride buffer (pH 2.5), 4.5 M magnesium chloride solution (pH 7.5), 50% (v / v) ethylene glycol Solution, 1 M propionic acid solution (pH 2.5), 8 M
By reacting with a urea solution (pH 6.0) or a 6M guanidine hydrochloride solution (pH 3.1) or the like, anti-purulent streptococcal antibodies can be quickly and efficiently extracted.

【００２１】さらに、免疫感作用抗原物質として好適に
使用でき、これによって、抗化膿性レンサ球菌血清、抗
化膿性レンサ球菌ポリクローナル抗体の取得、または、
抗化膿性レンサ球菌モノクローナル抗体作製のための抗
化膿性レンサ球菌抗体産生Ｂ細胞を、例えば、免疫感作
した小動物の脾臓等から取得できる。該蛋白質の免疫感
作用抗原物質としての使用方法の例としては、例えば、
ヒツジ、ヤギ、あるいはウサギ等に対して免疫感作を行
う場合には、該蛋白質とフロイント完全アジュバントま
たはフロイント不完全アジュバントのエマルジョンを１
匹あたり該蛋白質の量として通常１０μｇ〜５００μｇ
の範囲で皮下、腹腔、または、筋肉注射投与し、これを
７日〜３０日毎に２〜１０回程度行えばよい。また、例
えば、マウス、ラット、あるいは、ハムスター等に対し
て免疫感作を行う場合には、該蛋白質とフロイント完全
アジュバントまたはフロイント不完全アジュバントのエ
マルジョンを１匹あたり該蛋白質の量として通常１μｇ
〜５０μｇの範囲で皮下、腹腔、または、筋肉注射投与
し、これを７日〜３０日毎に２〜１０回程度行えばよ
い。Furthermore, it can be suitably used as an immunizing antigen substance, thereby obtaining anti-pyogenic streptococcal serum, anti-pyogenic streptococcal polyclonal antibody, or
Anti-suppurative streptococcal antibody-producing B cells for producing anti-suppurative streptococcal monoclonal antibodies can be obtained, for example, from the spleen of an immunized small animal. Examples of the method of using the protein as an immunizing antigen substance include, for example,
When immunizing a sheep, goat, rabbit or the like, an emulsion of the protein and Freund's complete adjuvant or Freund's incomplete adjuvant is used.
Usually 10 μg to 500 μg as the amount of the protein per animal
May be administered subcutaneously, intraperitoneally, or intramuscularly in the range of 2 to 10 times every 7 to 30 days. For example, when immunizing a mouse, a rat, a hamster, or the like, an emulsion of the protein and Freund's complete adjuvant or Freund's incomplete adjuvant is usually used in an amount of 1 μg per animal.
It may be administered subcutaneously, intraperitoneally, or intramuscularly in the range of ５０50 μg, and this may be performed about 2 to 10 times every 7 to 30 days.

【００２２】次に、該蛋白質を用いて被検液中の抗化膿
性レンサ球菌抗体を免疫学的に決定する方法は、抗原抗
体複合体を形成せしめる条件下で、該蛋白質と被検液と
を反応させ、形成された抗原抗体反応の生成物を確認ま
たは定量することにより特徴づけられる。このとき、該
蛋白質を担体に固相化させた状態で被検液と反応させて
もよく、また、遊離させた状態で被検液と反応させても
よい。Next, a method for immunologically determining an anti-suppurative streptococcal antibody in a test solution using the protein is described below. The protein and the test solution are subjected to conditions under which an antigen-antibody complex is formed. And confirming or quantifying the product of the formed antigen-antibody reaction. At this time, the protein may be reacted with a test solution in a state of being immobilized on a carrier, or may be reacted with the test solution in a released state.

【００２３】本発明に係わる被検液とは、抗化膿性レン
サ球菌抗体を含有するものであればよく、例えば、血
清、血漿、唾液、尿等の生体体液、組織抽出液また組織
培養上清等が挙げられ、これらの被検液は、本発明にお
いて用いられる抗化膿性レンサ球菌抗体の決定の原理、
検出感度、測定レンジあるいは他の要因を考慮して、被
検液原液で、あるいは、被検液原液を水または適当な緩
衝液等により適宜希釈して本発明に用いられる。The test solution according to the present invention may be any solution containing an anti-purulent streptococcal antibody, such as a biological fluid such as serum, plasma, saliva, urine, a tissue extract or a tissue culture supernatant. And the like, these test solutions are the principles of determination of the anti-pyogenic streptococcal antibody used in the present invention,
Taking into account the detection sensitivity, the measurement range, and other factors, the undiluted solution of the test solution or the undiluted solution of the test solution is appropriately diluted with water or an appropriate buffer solution and used in the present invention.

【００２４】本発明に使用される緩衝液としては、通常
用いられる緩衝液であれば特に限定されないが、通常ｐ
Ｈ４〜１０、好ましくは、ｐＨ５〜９の範囲である緩衝
液を用いることが望ましく、例えば、リン酸緩衝液、ホ
ウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ベルナール緩
衝液、グッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）緩衝液（例えば、ヘペス
（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、
メス（ＭＥＳ）緩衝液等）等を用いることができ、該蛋
白質の安定化または該蛋白質固相化担体への蛋白質等の
非特異的吸着の防止等を目的として、自体公知の抗原抗
体反応を利用した抗原または抗体の免疫学的決定法にお
いて通常用いられる、例えば、ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）、ゼラチン、スキムミルクまたはミルク由来蛋白
質、植物由来蛋白質等の蛋白質等を、通常０．０１％〜
１％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．１％〜０．５％（ｗ
／ｖ）の濃度範囲で含んでもよい。The buffer used in the present invention is not particularly limited as long as it is a commonly used buffer.
It is desirable to use a buffer having a pH of H4 to 10, preferably in the range of pH 5 to 9. For example, phosphate buffer, borate buffer, carbonate buffer, Tris buffer, Bernal buffer, Good ' s) buffers (e.g., HEPES buffer, PIPES buffer,
A scalpel (MES) buffer solution or the like can be used. For the purpose of stabilizing the protein or preventing nonspecific adsorption of the protein or the like to the protein-immobilized carrier, a known antigen-antibody reaction can be performed. For example, bovine serum albumin (B
SA), gelatin, skim milk or milk-derived proteins, proteins such as plant-derived proteins, etc.
1% (w / v), preferably 0.1% to 0.5% (w / v)
/ V).

【００２５】また、該蛋白質または抗原抗体反応の安定
化、あるいは、免疫凝集反応の促進等の目的で、添加剤
として、例えば、糖、グリセロール、エチレングリコー
ル、キレート剤、還元剤、防腐剤、プロテアーゼインヒ
ビター、ポリエチレングリコール類（例えば、ポリエチ
レングリコール６０００等）等を水または緩衝液中に適
宜添加することは任意である。その濃度範囲等は、自体
公知の蛋白質または抗原抗体反応の安定化、あるいは、
免疫凝集反応の促進等のために通常用いられる濃度範囲
等から適宜選択すれば足りる。For the purpose of stabilizing the protein or antigen-antibody reaction or promoting the immunoagglutination reaction, additives such as sugar, glycerol, ethylene glycol, chelating agent, reducing agent, preservative, protease It is optional to appropriately add an inhibitor, polyethylene glycols (eg, polyethylene glycol 6000, etc.) to water or a buffer. The concentration range, etc., stabilizes the protein or antigen-antibody reaction known per se, or
It suffices to select appropriately from a concentration range ordinarily used for promoting an immunoagglutination reaction and the like.

【００２６】本発明に係わる担体としては、本発明を実
施可能なものであれば、その材質、形状および大きさ等
についてはなんら制限されなく、例えば、ポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリル
ブタジエンスチレン共重合体、ブタジエンスチレン共重
合体、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビ
ニリデン、ポリアミド、ポリメチルメタアクリネート、
ポリメチルペンテン、ポリアセタール、ポリビニルアセ
テート、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラー
ル、ポリイソブチレン、塩化ビニル酢酸ビニル共重合
体、フッ素樹脂（ポリテトラフルオロエチレン、テトラ
フルオロエチレンエチレン共重合体、パーフルオロアル
コキシ共重合体等）、ポリエーテルスルフォン、ポリオ
レフィン、ポリアクリロニトリル、ポルスチレンアクリ
レート、スチレンジビニルベンゼン共重合体、ポリエチ
レンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポ
リウレタン、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラニン樹
脂、フェノール樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、シリカ
ゲル、シリコン、セルロース、ニトロセルロース、セル
ロースアセテート、セルロースアセテートブチレート、
セルロースアセテートプロピオネート、セルロースプロ
ピオネート、エチルセルロース、カルボキシメチルセル
ロースまたはポリビニリデンジフルオリド等の形成され
たポリマー、また、ポリマーにアルキル基、アシル基、
カルボキシル基、ニトリル基、一級アミノ基または二級
アミノ基等の官能基を持たせることを目的として、上記
のポリマー合成時にこれらの官能基を有する物質がさら
に共重合されてなる成形されたポリマー、あるいは、上
記のポリマー成形後に表面処理によってこれらの官能基
が導入されてなる成形されたポリマー、また、成形され
たガラスまたは金属等が使用できる。The material, shape and size of the carrier according to the present invention are not limited as long as the present invention can be carried out. For example, polystyrene, polyethylene, polypropylene, acrylonitrile butadiene styrene copolymer may be used. Coal, butadiene styrene copolymer, polycarbonate, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyamide, polymethyl methacrylate,
Polymethylpentene, polyacetal, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl butyral, polyisobutylene, vinyl chloride vinyl acetate copolymer, fluororesin (polytetrafluoroethylene, tetrafluoroethylene ethylene copolymer, perfluoroalkoxy copolymer, etc.) , Polyethersulfone, polyolefin, polyacrylonitrile, polystyrene acrylate, styrene divinylbenzene copolymer, polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate, polyurethane, urea resin, epoxy resin, melanin resin, phenol resin, unsaturated polyester resin, silica gel, silicon , Cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, cellulose acetate butyrate,
Cellulose acetate propionate, cellulose propionate, ethylcellulose, carboxymethylcellulose or polyvinylidene difluoride and other formed polymers, also polymer alkyl group, acyl group,
For the purpose of having a functional group such as a carboxyl group, a nitrile group, a primary amino group or a secondary amino group, a molded polymer obtained by further copolymerizing a substance having these functional groups during the above-mentioned polymer synthesis, Alternatively, a molded polymer obtained by introducing these functional groups by surface treatment after the above-mentioned polymer molding, or a molded glass or metal can be used.

【００２７】また、本発明において、当業者によく知ら
れた免疫学的決定法において通常使用される材質、形状
および大きさ等を有する、例えばラテックス粒子、ビー
ズ、ボール、マイクロタイタープレート、テストチュー
ブ、またはメンブレン等を担体として使用すると有利で
あるが、粒径が０．０１μｍ〜１００μｍ、より好まし
くは、０．０５μｍ〜１０μｍの範囲であるポリスチレ
ンラテックス粒子を担体として使用すると特に有利であ
る。Further, in the present invention, for example, latex particles, beads, balls, microtiter plates, test tubes having materials, shapes, sizes and the like usually used in immunological determination methods well known to those skilled in the art. Or a membrane or the like as a carrier is advantageous, but it is particularly advantageous to use polystyrene latex particles having a particle size in the range of 0.01 μm to 100 μm, more preferably 0.05 μm to 10 μm.

【００２８】該蛋白質の担体への固相化は、当業者によ
く知られた方法、好ましくは、担体表面に該蛋白質を物
理的に吸着させることによって、あるいは、該蛋白質の
反応性誘導体をこれを反応可能な官能基を有する担体表
面または活性化された担体表面へ化学的に結合させるこ
とによって行うことができるが、簡便には、担体表面上
に該蛋白質を物理的に吸着させることによって行えばよ
い。The solid-phase immobilization of the protein on the carrier is carried out by a method well known to those skilled in the art, preferably by physically adsorbing the protein on the surface of the carrier, or by reacting a reactive derivative of the protein with the carrier. Can be carried out by chemically bonding the protein to the surface of a carrier having a reactive functional group or the surface of an activated carrier, but is conveniently carried out by physically adsorbing the protein on the surface of the carrier. Just do it.

【００２９】該蛋白質を用いて被検液中の抗化膿性レン
サ球菌抗体を免疫学的に決定する方法の実施において、
該蛋白質を固相化した担体の有利な態様としては、該蛋
白質が担体単位面積（ｃｍ²）あたりに通常０．００１
ｐｍｏｌ〜１０ｎｍｏｌ、好ましくは、０．０１ｐｍｏ
ｌ〜１ｎｍｏｌの範囲で結合している担体を挙げること
ができる。In carrying out a method for immunologically determining an anti-suppurative streptococcal antibody in a test solution using the protein,
As an advantageous embodiment of the carrier on which the protein is immobilized, the protein is usually contained in an amount of 0.001 per unit area (cm ² ) of the carrier.
pmol to 10 nmol, preferably 0.01 pmo
Carriers bound in the range of 1 to 1 nmol can be mentioned.

【００３０】次に、該蛋白質を使用して被検液中の抗化
膿性レンサ球菌抗体を免疫学的に決定する具体的方法の
例を示すが、基本的に反応条件等は、該蛋白質の担体へ
の吸着あるいは抗原抗体反応等を阻害せず、かつ、用い
られる試薬類の性質（例えば、標識物質が用いられる場
合においては、標識物質の有する検出可能な性質等）等
を失活させない条件であれば特に限定されず、それぞれ
の決定法の原理、あるいは他の要因を考慮して、最適と
思われる条件をそれぞれの決定法に通常用いられる公知
の反応条件から選択すればよい。Next, an example of a specific method for immunologically determining an anti-suppurative streptococcal antibody in a test solution using the protein will be described. Basically, the reaction conditions and the like are as follows. Conditions that do not inhibit the adsorption to the carrier or the antigen-antibody reaction, etc., and do not deactivate the properties of the reagents used (for example, when a labeling substance is used, the detectable properties of the labeling substance, etc.) The conditions are not particularly limited, and the conditions considered to be optimal may be selected from known reaction conditions usually used for each determination method in consideration of the principle of each determination method or other factors.

【００３１】具体的方法の例としては、例えば、粒径が
０．０１μｍ〜１００μｍの範囲にあるラテックス粒子
を担体として使用する場合には、該蛋白質を蛋白質濃度
として通常０．０５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、好まし
くは０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの範囲で水または
適当な緩衝液に溶解させた溶液に該担体を通常０．１％
〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．５％〜５％（ｗ
／ｖ）の濃度範囲になるように懸濁させ、通常０℃〜６
０℃、好ましくは、４℃〜４０℃の温度範囲で通常１０
分間〜４８時間、好ましくは３０分間〜２４時間の時間
範囲で静置、撹拌あるいは振盪した後、必要に応じて該
担体を、例えば、当業者によく知られた遠心洗浄法また
は膜濾過法等により水または適当な緩衝液で洗浄、該蛋
白固相化ラテックス粒子を得ることができる。As an example of a specific method, for example, when latex particles having a particle size in the range of 0.01 μm to 100 μm are used as a carrier, the protein is usually used in a protein concentration of 0.05 mg / ml to 5 mg. / Ml, preferably 0.1 mg / ml to 2 mg / ml in a solution dissolved in water or an appropriate buffer.
-10% (w / v), preferably 0.5%-5% (w / v)
/ V), usually at 0 ° C to 6 ° C.
0 ° C., preferably 10 ° C. in a temperature range of 4 ° C. to 40 ° C.
After standing, stirring or shaking for a period of time from minutes to 48 hours, preferably from 30 minutes to 24 hours, the carrier is optionally subjected to, for example, a centrifugal washing method or a membrane filtration method well known to those skilled in the art. Washing with water or a suitable buffer solution to obtain the protein-immobilized latex particles.

【００３２】この工程の後、必要に応じて、該担体への
蛋白質等の非特異的吸着の防止を目的として、自体公知
の抗原抗体反応を利用した抗原または抗体の免疫学的決
定法において通常用いられる方法で、例えば、ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、スキムミルク、また
はミルク由来蛋白質、植物由来蛋白質等の蛋白質等で該
担体を処理することは任意である。After this step, if necessary, in order to prevent non-specific adsorption of proteins and the like to the carrier, the immunological determination method for antigens or antibodies using a well-known antigen-antibody reaction is usually used. In the method used, it is optional to treat the carrier with, for example, bovine serum albumin (BSA), gelatin, skim milk, or proteins such as milk-derived proteins and plant-derived proteins.

【００３３】次に、当業者によく知られた免疫学的決定
法、例えば、ラテックス凝集光学的免疫測定（ｌａｔｅ
ｘ ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ）法（櫻林郁之介ら、日本臨床、４８（増刊号（下
巻））、１３５６〜１３６１（１９９０））に準じて該
担体と被検液または希釈された被検液とを混合（このと
き、反応液中の該担体濃度が０．０１％〜１％（ｗ／
ｖ）、好ましくは、０．０５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の
範囲であることが望ましい）し、抗原抗体反応の結果生
じる濁りを光学的に測定、例えば、任意の波長、好適に
は４００ｎｍ〜１８００ｎｍの範囲の適宜な波長にて、
一定時間範囲内の吸光度変化量または一定の吸光度に達
するまでの時間を測定する。Next, immunological determination methods well known to those skilled in the art, for example, latex agglutination optical immunoassay (late)
x photometric immunoassa
y) Mixing the carrier with a test solution or a diluted test solution according to the method (Ikunosuke Sakurabayashi et al., Nihon clinical practice, 48 (extra number: lower volume), 1356-1361 (1990)). At this time, the carrier concentration in the reaction solution was 0.01% to 1% (w /
v), preferably in the range of 0.05% to 0.5% (w / v)), and turbidity resulting from the antigen-antibody reaction is optically measured, for example, at any wavelength, At an appropriate wavelength in the range of 400 nm to 1800 nm,
The amount of change in absorbance within a certain time range or the time until reaching a certain absorbance is measured.

【００３４】さらに、免疫比ろう測定（ｎｅｐｈｅｌｏ
ｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法（山岸安
子、臨床検査、２３（臨時増刊）、１２８６〜１２８９
（１９７９））に準じて、該担体と被検液または希釈さ
れた被検液とを混合することにより生じた抗原抗体複合
体に光（レーザー光線）を照射し、その散乱光の強度の
変化量を測定する方法や、ラテックススライド凝集法
（Ｂａｃｈ，Ｇ．Ｌ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐ
ａｔｈ．、５２、１２６〜１２８（１９６９））に準じ
て、該担体と被検液または希釈された被検液とを判定板
上で混合し、抗原抗体反応によるラテックス粒子の凝集
の有無を目視で確認することによって被検液中の抗化膿
性レンサ球菌抗体を決定する方法、カウンティングイム
ノアッセイ（ｃｏｕｎｔｉｍｇ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ）法（橋本好一ら、検査と技術、２２（５）（増刊
号）、６７〜６８（１９９４））に準じて、該担体と被
検液または希釈された被検液とを混合し、抗原抗体反応
の結果生じる凝集物の大きさおよび数を測定する方法等
を挙げることことができる。[0034] Furthermore, the immunoassay measurement (nephelo)
metric immunoassay method (Yasuko Yamagishi, Clinical Laboratory, 23 (extra number), 1286 to 1289)
(1979)), the antigen-antibody complex produced by mixing the carrier and a test solution or a diluted test solution is irradiated with light (laser beam), and the amount of change in the intensity of the scattered light is irradiated. And the latex slide agglutination method (Bach, GL et al., Amer. J. Clin. P.
ath. , 52, 126-128 (1969)), the carrier and a test solution or a diluted test solution are mixed on a determination plate, and the presence or absence of aggregation of latex particles due to an antigen-antibody reaction is visually checked. For determining an anti-pyogenic streptococcal antibody in a test solution by performing a counting immunoassay (counting immunoassay).
y) According to the method (Yoshiichi Hashimoto et al., Inspection and Technology, 22 (5) (extra number), 67-68 (1994)), the carrier is mixed with a test liquid or a diluted test liquid. And a method for measuring the size and number of aggregates resulting from the antigen-antibody reaction.

【００３５】また、例えば、ウエル内容量が３００μｌ
であるマイクロタイタープレートを担体として使用する
場合には、該蛋白質を蛋白濃度として通常０．１μｇ／
ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１ｍ
ｇ／ｍｌの範囲で水または適当な緩衝液に溶解させた溶
液を該担体のウエルにウエルあたり通常２５μｌ〜３０
０μｌ、好ましくは、５０μｌ〜２００μｌ添加し、通
常０℃〜７０℃、好ましくは、４℃〜４０℃の温度範囲
で、通常１０分〜４８時間、好ましくは、３０分〜２４
時間の時間範囲で静置、撹拌あるいは振盪して反応させ
た後、ウエルを水または適当な緩衝液で洗浄することに
よって該蛋白質を該担体に固相化させる。For example, when the well content is 300 μl
When a microtiter plate is used as a carrier, the protein is usually used at a protein concentration of 0.1 μg /
ml to 10 mg / ml, preferably 1 μg / ml to 1 m
g / ml of a solution dissolved in water or an appropriate buffer is added to the wells of the carrier in an amount of usually 25 μl to 30 μl per well.
0 μl, preferably 50 μl to 200 μl, is added in a temperature range of usually 0 ° C. to 70 ° C., preferably 4 ° C. to 40 ° C., usually for 10 minutes to 48 hours, preferably 30 minutes to 24 hours.
After allowing the reaction to proceed by standing, stirring or shaking within a time range of time, the protein is immobilized on the carrier by washing the wells with water or an appropriate buffer.

【００３６】次に、該担体への蛋白質等の非特異的吸着
の防止を目的として、自体公知の抗原抗体反応を利用し
た抗原または抗体の免疫学的決定法において通常用いら
れる方法で、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
ゼラチン、スキムミルク、またはミルク由来蛋白質、植
物由来蛋白質等の蛋白質等を通常０．０５％〜１０％、
好ましくは、０．５％〜５％の濃度範囲で水または適当
な緩衝液に溶解した液を該担体のウエルにウエルあたり
通常２５μｌ〜３００μｌ、好ましくは、５０μｌ〜２
００μｌ添加し、通常０℃〜７０℃、好ましくは、４℃
〜４０℃の温度範囲で、通常１０分〜４８時間、好まし
くは、３０分〜２４時間の時間範囲で静置、撹拌あるい
は振盪して反応させた後、ウエルを水または適当な緩衝
液で洗浄する。Next, for the purpose of preventing non-specific adsorption of proteins and the like to the carrier, a method generally used in an immunological determination method of an antigen or an antibody utilizing a known antigen-antibody reaction, for example, Bovine serum albumin (BSA),
Gelatin, skim milk, milk-derived protein, plant-derived protein, etc., usually 0.05% to 10%,
Preferably, a solution prepared by dissolving in water or an appropriate buffer in a concentration range of 0.5% to 5% is usually added to the carrier well in an amount of usually 25 μl to 300 μl per well, preferably 50 μl to 2 μl.
0 μl, usually 0 ° C. to 70 ° C., preferably 4 ° C.
After allowing the reaction to proceed by standing, stirring or shaking in a temperature range of usually from 10 minutes to 48 hours, preferably from 30 minutes to 24 hours at a temperature range of ４０40 ° C., the wells are washed with water or an appropriate buffer solution. I do.

【００３７】さらに、当業者によく知られた免疫学的測
定法、例えば、エンザイムイムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍ
ｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法（酵素免疫測定法、石
川榮治・河合 忠・宮井 潔編集、第３版、ｐ３１〜ｐ
５４、医学書院（株）、１９８７年、５月１５日発行）
に準じて、該担体のウエルに被検液または希釈された被
検液を通常２５μｌ〜３００μｌ、好ましくは、５０μ
ｌ〜２００μｌ添加し、通常０℃〜７０℃、好ましく
は、４℃〜４０℃の温度範囲で、通常１０分〜４８時
間、好ましくは、３０分〜２４時間の時間範囲で静置、
撹拌あるいは振盪して反応させた後、ウエルを水または
適当な緩衝液で洗浄する。次いで、標識剤（例えば、エ
ンザイムイムノアッセイ法において通常使用されるすべ
ての酵素から、好ましくは、ペルオキシダーゼ、アルカ
リフォスファターゼ、β―ガラクトシダーゼまたはグル
コースオキシダーゼ等から適宜選択された標識剤）で標
識された、測定対象である被検液中の抗化膿性レンサ球
菌抗体と結合する抗体（例えば、被検液中の抗化膿性レ
ンサ球菌抗体と結合する、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体、または、これらの酵素分解フラグメント
（例えば、Ｆ（ａｂ’） ₂ 、Ｆ（ａｂ）₂ 、Ｆａｂ’、
Ｆａｂ等）等の抗体）を含有する溶液を通常２５μｌ〜
３００μｌ、好ましくは、５０μｌ〜２００μｌ添加
し、通常０℃〜７０℃、好ましくは、４℃〜４０℃の温
度範囲で、通常１０分〜４８時間、好ましくは、３０分
〜２４時間の時間範囲で静置、撹拌あるいは振盪して反
応させた後、ウエルを水または適当な緩衝液で洗浄し、
次いで、抗原抗体複合体を介して該担体に結合した標識
剤の活性を測定することで被検液中の抗化膿性レンサ球
菌抗体を決定する。Further, immunological measurements well known to those skilled in the art
Conventional methods, for example, enzyme immunoassay (Enzym)
e immunoassay method (enzyme immunoassay, stone
Edited by Eiji Kawa, Tadashi Kawai, Kiyoshi Miyai, Third Edition, p31-p
54, Medical Shoin Co., Ltd., published on May 15, 1987)
The test solution or diluted test solution was added to the wells of the carrier according to
The test solution is usually 25 μl to 300 μl, preferably 50 μl.
1 to 200 μl, usually 0 ° C. to 70 ° C., preferably
Is a temperature range of 4 ° C to 40 ° C, usually 10 minutes to 48 hours
For preferably 30 minutes to 24 hours.
After the reaction by stirring or shaking, the wells are
Wash with appropriate buffer. Next, a labeling agent (for example, d)
All commonly used in enzyme immunoassays.
Of all enzymes, preferably peroxidase,
Rephosphatase, β-galactosidase or glu
Labeling agent selected as appropriate from course oxidase, etc.)
Recognized anti-purulent streptococcal spheres in the test solution to be measured
Antibodies that bind to bacterial antibodies (eg, anti-purulent
Polyclonal antibodies, monoclonal antibodies that bind to streptococcal antibodies
Lonal antibodies or their enzymatic degradation fragments
(For example, F (ab ') _Two, F (ab)_Two, Fab ',
Fab)) and the like.
300 μl, preferably 50 μl to 200 μl added
And usually at a temperature of 0 ° C to 70 ° C, preferably 4 ° C to 40 ° C.
Degree, usually 10 minutes to 48 hours, preferably 30 minutes
Let stand, stir or shake for a time range of
After the reaction, the wells are washed with water or a suitable buffer,
Next, a label bound to the carrier via an antigen-antibody complex
Anti-purulent streptococcal spheres in the test solution by measuring the activity of the drug
Determine bacterial antibodies.

【００３８】また、免疫蛍光（ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ）法に準じて、該担体と被検液または希釈
された被検液とを反応させ、次いで、蛍光物質（例え
ば、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、テトラ
メチルローダミンイソチオシアネート（ｔｅｔｒａｍｅ
ｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａ
ｎａｔｅ）等の蛍光物質）で標識された、測定対象であ
る被検液中の抗化膿性レンサ球菌抗体と結合する抗体を
反応させ、次いで、抗原抗体複合体を介して該担体に結
合した蛍光物質の活性を測定し被検液中の抗化膿性レン
サ球菌抗体を決定する方法や、ラジオイムノアッセイ
（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法に準じて、該
担体と被検液または希釈された被検液とを反応させ、次
いで、放射性物質（例えば、ヨード―１２５、ヨード―
１３１、インジウム―１１１、テクネチウム―９９ｍ等
の放射性物質）で標識された、測定対象である被検液中
の抗化膿性レンサ球菌抗体と結合する抗体を反応させ、
次いで、抗原抗体複合体を介して該担体に結合した放射
性物質の線量を測定し被検液中の抗化膿性レンサ球菌抗
体を決定する方法等を挙げることができる。In addition, immunofluorescence (fluoroimmune)
The carrier is allowed to react with a test solution or a diluted test solution according to the method of the present invention, and then a fluorescent substance (for example, fluorescein isothiocyanate (fluore)) is reacted.
scein isothiocyanate, tetramethylrhodamine isothiocyanate (tetrame)
thyl rhodamine isothiocya
The antibody bound to the anti-pyogenic streptococcal antibody in the test solution to be measured, which has been labeled with a fluorescent substance such as a fluorescent substance, and then reacted with the carrier via an antigen-antibody complex, The carrier is reacted with a test solution or a diluted test solution according to a method of measuring the activity of a substance to determine an anti-pyogenic streptococcal antibody in the test solution or a radioimmunoassay method. And then radioactive materials (eg, iodine-125, iodine-
131, indium-111, radioactive substances such as technetium-99m), and reacted with an antibody that binds to an anti-pyogenic streptococcal antibody in a test solution to be measured,
Next, a method of measuring the dose of the radioactive substance bound to the carrier via the antigen-antibody complex and determining the anti-pyogenic streptococcal antibody in the test solution can be mentioned.

【００３９】また、例えば、テストチューブ等の容器を
担体として使用する場合には、該担体の容積、容量およ
びその他の要因を考慮して、マイクロタイタープレート
の方法に準じて行えばよい。また、例えば、ビーズまた
はボール等を担体として使用する場合には、任意の反応
容器中で、該担体の表面積、個数、反応容器等の容量お
よびその他の要因を因を考慮して、マイクロタイタープ
レートの方法に準じて行えばよい。For example, when a container such as a test tube is used as a carrier, it may be performed according to the method of a microtiter plate in consideration of the volume, volume and other factors of the carrier. In addition, for example, when beads or balls are used as a carrier, the microtiter plate may be used in any reaction vessel in consideration of the surface area, the number of the carrier, the volume of the reaction vessel, and other factors. The method may be performed according to the method described above.

【００４０】また、例えば、メンブレン等を担体として
使用する場合には、任意の反応容器中で、該担体の表面
積、枚数、反応容器等の容量およびその他の要因を因を
考慮して、マイクロタイタープレートの方法に準じて行
えばよい。さらに、例えば、当業者によく知られた免疫
比濁測定（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ）法（富山哲雄、臨床病理、３５、８６８〜
８７３（１９８７））に準じて、該蛋白質を通常０．０
１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、０．１ｍ
ｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で含む溶液と被検液また
は希釈された被検液とを反応セル中で混合し、任意の波
長、好適には３００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲の適宜な波
長、最適には３４０ｎｍの波長にて、一定時間範囲内の
吸光度の変化量または一定の吸光度に達するまでの時間
を測定する方法等が挙げられる。For example, when a membrane or the like is used as a carrier, a microtiter is used in an arbitrary reaction vessel in consideration of the surface area and the number of the carrier, the volume of the reaction vessel, and other factors. What is necessary is just to carry out according to the method of a plate. In addition, for example, turbidimetric immunometry well known to those skilled in the art.
assay) method (Tetsuo Toyama, clinical pathology, 35, 868-
873 (1987)).
1 mg / ml to 10 mg / ml, preferably 0.1 m / ml
A solution containing g / ml to 1 mg / ml and a test solution or a diluted test solution are mixed in a reaction cell, and an arbitrary wavelength, preferably an appropriate wavelength in the range of 300 nm to 400 nm, optimal For example, there is a method of measuring the amount of change in absorbance within a certain time range or the time until reaching a certain absorbance at a wavelength of 340 nm.

【００４１】本発明における抗原抗体反応の生成物を認
識または定量する方法は、用手法に限らず、自動分析装
置を利用した方法であってもよい。本発明において、例
えば、ラテックス凝集光学的免疫測定法により、該蛋白
質固相化ラテックス粒子を用いて被検液中の抗化膿性レ
ンサ球菌抗体を決定する場合においては、例えば、被検
液分注、被検液希釈、試薬分注、吸光度測定、データ処
理等を自動システム化した装置である日立７０５、７０
５０、７１５０、７３６、７０７０等の自動分析機が利
用でき、詳しくは、例えば、粒径０．０１μｍ〜１．６
μｍ、好ましくは、０．０５μｍ〜１μｍの該蛋白質固
相化ラテックス粒子を０．０１％〜１％（ｗ／ｖ）、好
ましくは、０．０５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲で含
む溶液と被検液または希釈された被検液とを反応セル中
で混合し、任意の波長、好適には４００ｎｍ〜１６００
ｎｍの範囲の適宜な波長にて、一定時間範囲内の吸光度
の変化量または一定の吸光度に達するまでの時間を測定
することで被検液中の抗化膿性レンサ球菌抗体を決定で
きる。The method for recognizing or quantifying the product of the antigen-antibody reaction in the present invention is not limited to the method used, but may be a method using an automatic analyzer. In the present invention, for example, by the latex agglutination optical immunoassay, when determining the anti-pyogenic streptococcal antibody in the test solution using the protein-immobilized latex particles, for example, dispensing the test solution Hitachi 705, 70, an automated system for dilution of test solution, reagent dispensing, absorbance measurement, data processing, etc.
Automatic analyzers such as 50, 7150, 736, 7070 and the like can be used, and specifically, for example, a particle size of 0.01 μm to 1.6 μm.
μm, preferably 0.05 μm to 1 μm of the protein-immobilized latex particles in an amount of 0.01% to 1% (w / v), preferably 0.05% to 0.5% (w / v). The solution contained in the range and the test liquid or the diluted test liquid are mixed in a reaction cell, and are mixed at an arbitrary wavelength, preferably from 400 nm to 1600.
By measuring the amount of change in absorbance within a certain time range or the time until reaching a certain absorbance at an appropriate wavelength in the range of nm, the anti-suppurative streptococcal antibody in the test solution can be determined.

【００４２】また、例えば、エンザイムイムノアッセイ
法により、該蛋白質固相化マイクロタイタープレートま
たは該蛋白質固相化テストチューブ等を用いて被検液中
の抗化膿性レンサ球菌抗体を決定する場合において、例
えば、被検液分注、被検液希釈、試薬分注、吸光度測
定、データ処理等を自動システム化した装置であるＢＥ
ＣＫＭＡＮ Ｂｉｏｍｅｋ １０００ Ａｕｔｏｍａｔ
ｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ
（ベックマン社製）、ＣＥＬＬ ＡＳＳＡＹ―２０００
ＲＯＢＯＴＩＣ ＡＳＳＡＹ ＳＹＳＴＥＭ（モリテ
ックス（株）社製）等が利用でき、詳しくは、該蛋白質
固相化マイクロタイタープレートまたは該蛋白質固相化
テストチューブに被検液または希釈された被検液、酵素
標識抗体および基質液を洗浄操作をはさんで順次反応さ
せ、必要に応じて酵素反応停止液を反応させた後、標識
酵素と用いた基質との関係による酵素反応での発色を公
知の測定条件から選択された任意の波長にて測定するこ
とで被検液中の抗化膿性レンサ球菌抗体を決定できる。In addition, for example, when an anti-pyogenic streptococcal antibody in a test solution is determined by enzyme immunoassay using the protein-immobilized microtiter plate or the protein-immobilized test tube, etc. BE, which is an automated system for sample dispensing, test solution dilution, reagent dispensing, absorbance measurement, data processing, etc.
CKMAN Biomek 1000 Automat
ed Laboratory Workstation
(Manufactured by Beckman), CELL ASSAY-2000
ROBOTIC ASSAY SYSTEM (manufactured by Moritex Co., Ltd.) or the like can be used. More specifically, a test solution or a test solution diluted in the protein-immobilized microtiter plate or the protein-immobilized test tube, an enzyme-labeled antibody After reacting the substrate solution sequentially with the washing operation, and reacting the enzyme reaction stop solution as necessary, the color development in the enzyme reaction based on the relationship between the labeling enzyme and the substrate used is selected from known measurement conditions. By measuring at any given wavelength, the anti-pyogenic streptococcal antibody in the test solution can be determined.

【００４３】また、例えば、エンザイムイムノアッセイ
法により、該蛋白質固相化ビーズ等を用いて被検液中の
抗化膿性レンサ球菌抗体を決定する場合においては、例
えば、被検液分注、被検液希釈、試薬分注、吸光度測
定、データ処理等を自動システム化した装置であるアロ
カＡＥＣ―２０００（アロカ社製）等が利用でき、詳し
くは、該蛋白質固相化ビーズに被検液または希釈された
被検液、酵素標識抗体および基質液を洗浄操作をはさん
で順次反応させ、必要に応じて酵素反応停止液を反応さ
せた後、標識酵素と用いた基質との関係による酵素反応
での発色を公知の測定条件から選択された任意の波長に
て測定することで被検液中の抗化膿性レンサ球菌抗体を
決定できる。In addition, for example, when the anti-pyogenic streptococcal antibody in the test solution is determined by the enzyme immunoassay using the protein-immobilized beads or the like, for example, dispensing the test solution, Aloka AEC-2000 (manufactured by Aloka), which is an automated system for liquid dilution, reagent dispensing, absorbance measurement, data processing, etc., can be used. The test solution, enzyme-labeled antibody, and substrate solution are reacted sequentially with a washing operation interposed between them.If necessary, an enzyme reaction stop solution is reacted, and then an enzyme reaction is performed based on the relationship between the labeled enzyme and the substrate used. Is measured at an arbitrary wavelength selected from known measurement conditions to determine the anti-pyogenic streptococcal antibody in the test solution.

【００４４】さらに、例えば、免疫比濁測定法により、
抗化膿性レンサ球菌抗体を決定する場合においては、例
えば、被検液分注、被検液希釈、試薬分注、吸光度測
定、データ処理等を自動システム化した装置である日立
７０５、７０５０、７１５０、７３６、７０７０等の自
動分析機が利用でき、詳しくは、例えば、該蛋白質を通
常０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、
０．１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で含む溶液と被
検液または希釈された被検液とを反応セル中で混合し、
任意の波長、好適には３００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲の
適宜な波長、最適には３４０ｎｍの波長にて、一定時間
範囲内の吸光度の変化量または一定の吸光度に達するま
での時間を測定することにより被検液中の抗化膿性レン
サ球菌抗体を決定できる。Further, for example, by an immunoturbidimetric assay,
In the case of determining an anti-suppurative streptococcal antibody, for example, Hitachi 705, 7050, 7150, which is an apparatus in which test solution dispensing, test solution dilution, reagent dispensing, absorbance measurement, data processing, and the like are automatically systemized. , 736, 7070 and the like can be used. Specifically, for example, the protein is usually 0.01 mg / ml to 10 mg / ml, preferably
A solution containing 0.1 mg / ml to 1 mg / ml and a test solution or a diluted test solution are mixed in a reaction cell,
At any wavelength, preferably at an appropriate wavelength in the range of 300 nm to 400 nm, and optimally at a wavelength of 340 nm, the amount of change in absorbance within a certain time range or the time until reaching a certain absorbance is measured. Anti-suppurative streptococcal antibodies in the test solution can be determined.

【００４５】本発明による被検液中の抗化膿性レンサ球
菌抗体を免疫学的に決定する方法は、その実施に必要な
試薬類をキットにしておくと、操作がさらに容易とな
る。また、自動分析装置を使って本発明を実施する場合
においても有利である。上記キットは、該蛋白質固相化
担体または該蛋白質がキット構成試薬の一つとなってい
ると特に有利である。また、当然のことながら、上記の
他に本発明の実施に必要なその他の試薬類（例えば、緩
衝剤、標識抗体、基質、基質溶解剤、反応停止剤等）が
キットの構成試薬として適宜含まれていてもよい。The method for immunologically determining the anti-pyogenic streptococcal antibody in a test solution according to the present invention is further facilitated if reagents necessary for carrying out the method are provided in a kit. It is also advantageous when implementing the present invention using an automatic analyzer. The above kit is particularly advantageous when the protein-immobilized carrier or the protein is one of the reagents constituting the kit. In addition, it goes without saying that, in addition to the above, other reagents necessary for carrying out the present invention (for example, a buffer, a labeled antibody, a substrate, a substrate lysing agent, a reaction terminator, etc.) are appropriately included as constituent reagents of the kit. It may be.

【００４６】[0046]

【発明の実施の形態】以下、実施例をあげて具体的に説
明するが、本発明は、これらによって限定されるもので
はない。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

【００４７】[0047]

【実施例１】トッド―ヘウイトブロス（Ｔｏｄｄ―Ｈｅ
ｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈ：Ｄｉｆｃｏ社製）培地１５０Ｌ
にて化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｙｏｇｅｎｅｓ）３型菌Ｄ５８Ｘ株（ＡＴＣＣ１２３
８３）を３７℃で１６時間培養した後、遠心分離および
濾過にて除菌培養液を回収した。回収した除菌培養液は
続いて限外濾過膜により濃縮し、１５．６Ｌの濃縮液を
得た。[Example 1] Todd-Hewitt broth (Todd-He)
Wit Broth (manufactured by Difco) 150 L of medium
Suppurative streptococci (Streptococcus)
pyogenes) type 3 strain D58X (ATCC123)
83) was cultured at 37 ° C. for 16 hours, and a sterilized culture solution was recovered by centrifugation and filtration. The collected sterilized culture solution was subsequently concentrated by an ultrafiltration membrane to obtain 15.6 L of a concentrated solution.

【００４８】この濃縮液を３ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａ
（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水塩：同仁化
学研究所社製）と２ｍＭの２―メルカプトエタノール
（和光純薬工業（株）社製）と０．０５％（ｗ／ｖ）濃
度のアジ化ナトリウム（和光純薬工業（株）社製）を含
む３６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２倍希釈した
後、同緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタイト（Ｈ
ｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）（ペンタックス社製）カ
ラム（１０×１３ｃｍ）（ファルマシア社製）にてイオ
ン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は、２Ｍの塩
化ナトリウムと３ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａと２ｍＭの２
―メルカプトエタノールと０．０５％アジ化ナトリウム
を含む３６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により行っ
た。This concentrated solution was treated with 3 mM EDTA · 2Na
(Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dihydrate: Dojindo Laboratories), 2 mM 2-mercaptoethanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.05% (w / v) sodium azide After two-fold dilution with 36 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), hydroxyapatite (H
Ion exchange chromatography was carried out on a hydroxypatite (Pentax) column (10 × 13 cm) (Pharmacia). Elution was performed using 2M sodium chloride, 3 mM EDTA · 2Na and 2 mM 2 mM.
-Performed with a 36 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing mercaptoethanol and 0.05% sodium azide.

【００４９】フラクションは５０ｍｌづつ分画し、この
緩衝液で溶出を開始したときをフラクションＮｏ．１と
し、２８０ｎｍにて測定されるピークであるフラクショ
ンＮｏ．１７〜４５を回収した。この回収液に６０％飽
和となるよう硫酸アンモニウム（ナカライテスク社製）
を添加し、４℃で一晩放置後、１５０００ｒｐｍ、４０
分遠心し、沈殿を回収した。The fraction was fractionated in 50 ml portions, and when the elution was started with this buffer, the fraction No. The fraction No. 1 which is a peak measured at 280 nm 17-45 were collected. Ammonium sulfate (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) so that the recovered solution is 60% saturated.
And left at 4 ° C. overnight, 15000 rpm, 40
The precipitate was collected by centrifugation for 10 minutes.

【００５０】この沈殿を４０ｍＭの塩化ナトリウムを含
む５０ｍＭのトリス―塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁
し、同緩衝液に対して一晩透析した後、１５０００ｒｐ
ｍ、４０分の遠心を行い、上清を回収し、３２ｍｌ（４
４０ｍｇ）の精製液を得た。次に、この精製液８．０ｍ
ｌ（１１０ｍｇ）を４０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５
０ｍＭトリス―塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化した
Ｑ―セファロースＦＦカラム（２、５×８ｃｍ）（ファ
ルマシア社製）を用いてイオン交換クロマトグラフィー
を行った。カラムには吸着させず、平衡化に用いた緩衝
液により素通しさせた画分約４００ｍｌを回収した。This precipitate was suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 40 mM sodium chloride, dialyzed against the same buffer overnight, and then subjected to 15000 rpm
After centrifugation for 40 minutes at 40 m, the supernatant was collected and 32 ml (4
(40 mg) was obtained. Next, the purified liquid 8.0m
1 (110 mg) containing 40 mM sodium chloride 5
Ion exchange chromatography was performed using a Q-Sepharose FF column (2, 5 × 8 cm) (Pharmacia) equilibrated with 0 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5). About 400 ml of a fraction which was not adsorbed to the column and passed through with the buffer used for equilibration was collected.

【００５１】続いて、この回収液を同緩衝液で平衡化し
たハイドロキシアパタイト（ペンタックス社製）カラム
（１．０×２４ｃｍ）（ファルマシア社製）を用いて濃
縮した。溶出は、２Ｍの塩化ナトリウムと０．０１％
（ｗ／ｖ）濃度のＥＤＴＡ−２Ｎａを含む３６ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）により行った。フラクションは
５ｍｌづつ分画し、この緩衝液で溶出を開始したときを
フラクションＮｏ．１とし、２８０ｎｍで測定されるピ
ークであるＮｏ．６〜１０を回収し、２５ｍｌ（１４．
３ｍｇ）の精製液を得た。このＱ―セファロースＦＦと
ハイドロキシアパタイトを用いた方法を繰り返し、１０
０ｍｌ（５７ｍｇ）の該蛋白質液を得た。Subsequently, the recovered solution was concentrated using a hydroxyapatite (Pentax) column (1.0 × 24 cm) (Pharmacia) equilibrated with the same buffer. Elution was with 2M sodium chloride and 0.01%
The measurement was performed using a 36 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing (w / v) EDTA-2Na. Fractions were fractionated by 5 ml, and when elution was started with this buffer solution, fraction No. No. 1, which is a peak measured at 280 nm. 6 to 10 were collected and 25 ml (14.
3 mg) was obtained. This method using Q-Sepharose FF and hydroxyapatite was repeated and repeated.
0 ml (57 mg) of the protein solution was obtained.

【００５２】このようにして得られた該蛋白質の理化学
的性質は前述の通りである。The physicochemical properties of the protein thus obtained are as described above.

【００５３】[0053]

【実施例２】 免疫感作試験 （１）免疫感作方法 実施例１により精製した該蛋白質をＰＢＳに４０μｇ／
ｍｌ濃度に調製した溶液２ｍｌとフロイント完全アジュ
バント（ＤＩＦＣＯ社製）２ｍｌを混和し、油中水型エ
マルジョンを作製した。このエマルジョンを０．５ｍｌ
ずつ１ｍｌツベルクリン用注射筒（０．４５×１３ｍｍ
注射針付）（テルモ（株）社製）にとり、雌４週齢のＢ
ａｌｂ／ｃマウス７匹のうち５匹に０．５ｍｌずつ皮下
投与し（初回免疫感作）、残り２匹を対照マウスとし
た。Example 2 Immunization test (1) Immunization method The protein purified in Example 1 was added to PBS at 40 μg /
2 ml of the solution prepared to a concentration of 2 ml and 2 ml of Freund's complete adjuvant (manufactured by DIFCO) were mixed to prepare a water-in-oil emulsion. 0.5 ml of this emulsion
Each 1 ml tuberculin syringe (0.45 x 13 mm
4 weeks old female B (with injection needle) (manufactured by Terumo Corporation)
0.5 ml was subcutaneously administered to 5 out of 7 alb / c mice (first immunization), and the remaining 2 mice were used as control mice.

【００５４】初回免疫感作後７日目に、実施例１により
精製した該蛋白質をＰＢＳに４０μｇ／ｍｌ濃度に調製
した溶液２ｍｌとフロイント完全アジュバント（ＤＩＦ
ＣＯ社製）２ｍｌを混和し、油中水型エマルジョンを作
製し、初回免疫感作時と同様の方法で０．５ｍｌずつ２
回目の免疫感作を行った。さらに７日後、２回目免疫感
作時と同様の方法で３回目の免疫感作を行った。以降、
７日おきに２回目以降と同様の方法で免疫感作を繰り返
し、初回免疫感作から４２日目に眼底採血法により５匹
すべてから血液を採取し、血清を分離した。同時に、免
疫感作を行っていない対照マウス２匹からも同様の方法
で血液を採取し、血清を分離した。 （２）血清中のマウス抗該蛋白質抗体の確認方法 実施例１により精製した該蛋白質をＰＢＳにて２μｇ／
ｍｌになるよう希釈し、これを９６ウェルマイクロタイ
タープレート（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）に、ウエル
あたり５０μｌずつ添加し、３７℃で１時間反応させ
た。ＰＢＳにてウエルを３回洗浄した後、４％（ｗ／
ｖ）濃度のＢＳＡ（ｓｉｇｍａ社製）を含むＰＢＳをウ
エルあたり３００μｌ添加し、３７℃で２時間反応させ
た。Seven days after the first immunization, 2 ml of a solution of the protein purified in Example 1 adjusted to a concentration of 40 μg / ml in PBS and complete Freund's adjuvant (DIF)
(Manufactured by CO Co., Ltd.) to prepare a water-in-oil emulsion, 0.5 ml each in the same manner as in the first immunization.
A second immunization was performed. Seven days later, a third immunization was performed in the same manner as in the second immunization. Or later,
Immunization was repeated every 7 days in the same manner as in the second and subsequent times, and blood was collected from all five animals by eye fundus blood sampling on day 42 after the first immunization, and the serum was separated. At the same time, blood was collected from two non-immunized control mice in the same manner, and serum was separated. (2) Method for Confirming Mouse Anti-Protein Antibody in Serum The protein purified in Example 1 was purified using PBS at 2 μg /
The reaction mixture was diluted to a volume of 50 ml and added to a 96-well microtiter plate (manufactured by Labsystems) at 50 μl / well, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing the wells three times with PBS, 4% (w /
v) 300 μl of PBS containing BSA (manufactured by Sigma) at a concentration was added per well, and reacted at 37 ° C. for 2 hours.

【００５５】反応液を除去し０．０２５％（ｖ／ｖ）濃
度のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレ
ート（和光純薬工業（株）社製）を含むＰＢＳ溶液にて
ウェルを３回洗浄した後、（１）にて得られた各血清を
０．２％（ｗ／ｖ）濃度のＢＳＡを含むＰＢＳにて５０
０倍希釈し、ウエルあたり１００μｌ添加し、３７℃で
１時間反応させた。０．０２５％（ｖ／ｖ）ポリオキシ
エチレン（２０）ソルビタンモノラウレート含有ＰＢＳ
溶液にてウェルを３回洗浄した。The reaction solution was removed, and the wells were washed three times with a PBS solution containing 0.025% (v / v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After washing, each of the sera obtained in (1) was washed with PBS containing 0.2% (w / v) BSA at 50%.
It was diluted 0-fold, added at 100 μl per well, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. PBS containing 0.025% (v / v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate
The wells were washed three times with the solution.

【００５６】その後、酵素標識抗体としてアルカリフォ
スファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’） ₂ 抗マウスＩｇＧ
（ＴＡＧＯ社製）を０．２％（ｗ／ｖ）濃度のＢＳＡを
含むＰＢＳにて６０００倍希釈した溶液をウエルあたり
１００μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。次い
で、０．０２５％（ｖ／ｖ）ポリオキシエチレン（２
０）ソルビタンモノラウレート含有ＰＢＳ溶液にてウエ
ルを３回洗浄した後、基質液としてｐ−ニトロフェニル
リン酸（和光純薬工業（株）社製）を１．０ｍｇ／ｍｌ
濃度となるようにジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．
５）にて溶解した溶液をウエルあたり１５０μｌ添加
し、３７℃で３０分反応させた。次いで、０．５Ｎ水酸
化ナトリウム水溶液をウエルあたり５０μｌ添加して酵
素反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度変化（△Ｅ）を
測定した。 （３）結果 各血清の該蛋白質との反応性を図１に示した。この結果
より、感作したマウス５匹から得られた血清では抗該蛋
白質抗体価上昇していることが確認された。また、免疫
感作期間中において５匹全てのマウスが生存したことか
ら、該蛋白質は免疫感作用抗原として好適であることが
判明した。Thereafter, an alkaline phos- phate was used as the enzyme-labeled antibody.
Sphatase-labeled goat F (ab ') _TwoAnti-mouse IgG
(Manufactured by TAGO) with 0.2% (w / v) BSA
Solution diluted 6000-fold with PBS per well
100 μl was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Next
And 0.025% (v / v) polyoxyethylene (2
0) Use sorbitan monolaurate in PBS solution
Was washed three times, and p-nitrophenyl was used as a substrate solution.
Phosphoric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 1.0 mg / ml
Diethanolamine buffer (pH 9.
Add 150μl of the solution dissolved in 5) per well
And reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Then, 0.5N hydroxyl
Add 50μl of sodium chloride solution per well and incubate
The elementary reaction was stopped, and the change in absorbance at 405 nm (ΔE) was observed.
It was measured. (3) Results The reactivity of each serum with the protein is shown in FIG. As a result
Furthermore, serum obtained from 5 sensitized mice showed no
It was confirmed that the white matter antibody titer was increasing. Also immune
Whether all five mice survived during the sensitization period
Thus, the protein may be suitable as an immunizing antigen.
found.

【００５７】[0057]

【実施例３】 抗化膿性レンサ球菌抗体の決定 （１）該蛋白質固相化ラテックス粒子の作製 粒径０．１２μｍのポリスチレン製ラテックス粒子（積
水化学工業（株）社製）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）にて１％（ｗ／ｖ）懸濁液となるよう調製し、
このラテックス粒子懸濁液１容量に対し、実施例１によ
り調製された該蛋白質液を１０ｍＭリン酸緩衝液にて
０．５ｍｇ／ｍｌ濃度に調製した溶液１容量を添加し、
室温で４時間反応させた。反応後、１６０００回転で２
０分間遠心してラテックス粒子を回収し、１％（ｗ／
ｖ）ラテックス粒子懸濁液となるよう１０ｍＭリン酸緩
衝液に再懸濁した。Example 3 Determination of Anti-Suppurative Streptococcal Antibody (1) Preparation of Protein-Immobilized Latex Particles Polystyrene latex particles having a particle size of 0.12 μm (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) were buffered with 10 mM phosphate buffer. Liquid (pH
7.0) to give a 1% (w / v) suspension,
To 1 volume of this latex particle suspension, 1 volume of a solution prepared by adjusting the protein solution prepared in Example 1 to a concentration of 0.5 mg / ml with 10 mM phosphate buffer was added,
The reaction was performed at room temperature for 4 hours. After the reaction, 2
The latex particles were collected by centrifugation for 0 minutes, and 1% (w /
v) Resuspended in 10 mM phosphate buffer to form a latex particle suspension.

【００５８】次に、このラテックス粒子懸濁液１容量に
対し、４％（ｗ／ｖ）濃度のウシ血清アルブミン（ｓｉ
ｇｍａ社製）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液１容量を添加
し、室温で２時間反応させた。反応後、１６０００回転
で２０分間遠心してラテックス粒子を回収し、１％（ｗ
／ｖ）ラテックス粒子懸濁液となるよう１０ｍＭリン酸
緩衝液に再懸濁し、１６０００回転で２０分間遠心して
ラテックス粒子を洗浄した。回収したラテックス粒子を
０．１５％（ｗ／ｖ）ラテックス粒子懸濁液になるよう
１０ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁し該蛋白質固相化ラテッ
クス粒子を得た。また、抗該蛋白質抗体のラテックス粒
子への非特異的反応の影響を確認するため、対照ラテッ
クス粒子として、該蛋白質と反応させなかったラテック
ス粒子を別途作製した。 （２）被検液中の抗該蛋白質抗体の決定 １０ｍＭリン酸緩衝液１００μｌに血清被検体３μｌを
添加し、３７℃条件下で５分後に（１）により作製した
該蛋白質固相化ラテックス粒子懸濁液、または対照ラテ
ックス粒子懸濁液を１７０μｌ添加した。添加して１分
後と２分後の７００ｎｍにおける吸光度変化（△Ｅ）を
測定した。被検液の血清は、化膿性レンサ球菌感染者に
認められる抗ストレプトリジンＯ抗体価が高い患者血清
と抗体価の低い健常者血清を用いた。 （３）結果 その結果を図２に示した。図２は、該蛋白質固相化ラテ
ックス粒子と固相化させてない対照ラテックス粒子、さ
らに、市販の抗ストレプトリジンＯ抗体測定ラテックス
試薬（商品名；ＡＳＯ−ラテックス「生研」、デンカ生
研（株）社製）の各血清との反応性を示したものであ
る。この結果、該蛋白質を固相化させてない対照ラテッ
クス粒子とは反応せず、該蛋白質固相化ラテックス粒子
と反応することが確認されたことから、該蛋白質が抗原
物質として利用可能であることが判明した。Next, 4% (w / v) concentration of bovine serum albumin (si
1 g of a 10 mM phosphate buffer solution containing the same (manufactured by GMA Co., Ltd.) and reacted at room temperature for 2 hours. After the reaction, latex particles were collected by centrifugation at 16,000 rpm for 20 minutes, and 1% (w
/ V) The suspension was resuspended in 10 mM phosphate buffer so as to form a latex particle suspension, and centrifuged at 16,000 rpm for 20 minutes to wash the latex particles. The recovered latex particles were re-suspended in a 10 mM phosphate buffer so as to form a 0.15% (w / v) latex particle suspension to obtain the protein-immobilized latex particles. In order to confirm the effect of non-specific reaction of the anti-protein antibody on latex particles, latex particles not reacted with the protein were separately prepared as control latex particles. (2) Determination of anti-protein antibody in test solution 3 μl of serum test sample was added to 100 μl of 10 mM phosphate buffer, and after 5 minutes at 37 ° C., the protein-immobilized latex particles prepared by (1) 170 μl of the suspension or control latex particle suspension was added. One minute and two minutes after the addition, the change in absorbance at 700 nm (ΔE) was measured. The serum of the test solution used was serum from a patient with a high anti-streptolidine O antibody titer and serum from a healthy individual with a low antibody titer, which were observed in persons infected with pyogenic streptococci. (3) Results The results are shown in FIG. FIG. 2 shows control latex particles not immobilized with the protein-immobilized latex particles, and a commercially available latex reagent for measuring anti-streptolysin O antibody (trade name: ASO-Latex “Seiken”, Denka Seiken Co., Ltd.) This shows the reactivity with each serum (manufactured by the company). As a result, it was confirmed that the protein did not react with the control latex particles on which the protein was not immobilized and reacted with the protein-immobilized latex particles. Therefore, the protein can be used as an antigen substance. There was found.

【００５９】[0059]

【発明の効果】本発明によれば、化膿性レンサ球菌感染
症の診断のための新規な蛋白質を提供するものであり、
本蛋白質を抗原として用いることにより化膿性レンサ球
菌の感染により体液中に出現する多様な抗体群のなかか
ら抗化膿性レンサ球菌抗体を反応特異的かつ簡便に測定
でき、かつ、自動化が可能な測定法を提供できる。According to the present invention, there is provided a novel protein for diagnosing purulent streptococcal infection.
By using this protein as an antigen, anti-pyogenic streptococcal antibodies can be measured in a reaction-specific and simple manner from a variety of antibody groups that appear in body fluids due to infection with purulent streptococci, and can be automated. Can provide law.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】図１は、実施例２における該蛋白質を免疫感作
したマウスおよび対照マウスから採取された血清の該蛋
白質との反応性を示す。FIG. 1 shows the reactivity of serum collected from a mouse immunized with the protein and a control mouse with the protein in Example 2;

【図２】図２は、実施例３における該蛋白質固相化ラテ
ックス粒子と固相化させてない対照ラテックス粒子、お
よび、市販の抗ストレプトリジンＯ抗体測定ラテックス
試薬を用いた健常者血清と患者血清との反応性の比較を
示す。FIG. 2 shows control latex particles not immobilized with the protein-immobilized latex particles in Example 3 and healthy subject serum and patients using a commercially available anti-streptolysin O antibody measurement latex reagent. 4 shows a comparison of reactivity with serum.

【配列表】配列番号；１ 配列の長さ；１５ 配列の型；アミノ酸 配列の種類；ペプチド 起源；化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｙｏｇｅｎｅｓ） フラグメント型； 配列 Val Ser Gly Lys Glu Asn Lys Lys Ser Asp Val Lys Tyr Glu Thr 1 5 10 15[Sequence Listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length; 15 Sequence type; Amino acid sequence type; Peptide origin; S. pyogenes (Streptococcus)
pyogenes) Fragment type; sequence Val Ser Gly Lys Glu Asn Lys Lys Ser Asp Val Lys Tyr Glu Thr 1 5 10 15

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:46） ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification symbol FI // (C12N 1/20 C12R 1:46) (C12P 21/02 C12R 1:46)

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】下記の理化学的性質を有する化膿性レンサ
球菌由来の蛋白質。 分子量 ４７０００±５０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。 Ｎ末アミノ酸配列 Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ 紫外線吸収スペクトル λ_max 280 _nm 呈色反応 ニンヒドリン反応 陽性 等電点 ｐＩ８．５±１．０（等電点電気泳動ゲル）1. A protein derived from S. pyogenes having the following physicochemical properties. Molecular weight 47000 ± 5000 (SDS-PAGE). N-terminal amino acid sequence Val-Ser-Gly-Lys-Glu-Asn-L
ys-Lys-Ser-Asp-Val-Lys-Ty
r-Glu-Thr UV absorption spectrum λ _max 280 _nm Color reaction Ninhydrin reaction Positive Isoelectric point pI 8.5 ± 1.0 (Isoelectric focusing gel) 【請求項２】請求項１に記載の該蛋白質を抗原物質とし
て使用する方法。2. A method for using the protein according to claim 1 as an antigenic substance. 【請求項３】該蛋白質が、被検液中の抗化膿性レンサ球
菌抗体の免疫学的決定方法における抗原物質として使用
する請求項２に記載の方法。3. The method according to claim 2, wherein said protein is used as an antigenic substance in a method for immunologically determining an anti-pyogenic streptococcal antibody in a test solution.