JPH1080277A - Variant human growth hormone and its use - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject protein which has a specific amino acid sequence, acts on its receptor as an antagonist of the normal type growth hormone to inhibit a variety of troubles and excessive growth accompanied by excessive excretion and is useful for treatment of gigantism. SOLUTION: This modified human growth hormone has the amino acid sequence of the formula, shows high affinity to the growth hormone receptor protein and has low growth hormone activity. The cells transformed with an expression plasmid in which deoxyrihonucleotide coding for this amino acid sequence is arranged to the downstream of the promoter are cultured to produce the modified human growth hormone, which is useful as a therapeutic agent for gigantism and hyperpituitarism.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、成長遅延の小児から分
離された生物学的不活性の成長ホルモン（変異型成長ホ
ルモン）遺伝子、該変異遺伝子を遺伝子工学的に発現さ
せた蛋白質に関し、それらは巨人症や末端肥大症の治療
に利用される。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a biologically inactive growth hormone (mutant growth hormone) gene isolated from a child with growth retardation, and a protein obtained by genetically expressing the mutant gene. Is used to treat gigantism and acromegaly.

【０００２】本発明の生物学的不活性型成長ホルモン
は、その受容体に正常型成長ホルモンのアンタゴニスト
として作用して過剰分泌に伴う種々の障害や過剰成長を
阻害し、且つ安全性に優れた巨人症や末端肥大症の治療
薬に利用される。成長ホルモンの遺伝子疾患としては、
その欠損による成長遅延とそれの過剰発現による巨人症
及び末端肥大症が知られている。欠損症に対しては成長
ホルモンの補充療法が広く行われているが、巨人症や末
端肥大症に対して今日まで有効な薬剤は開発されていな
い。The biologically inactive growth hormone of the present invention acts on its receptor as an antagonist of normal growth hormone to inhibit various disorders associated with hypersecretion and overgrowth, and is excellent in safety. It is used for the treatment of gigantism and acromegaly. Growth hormone genetic disorders include:
Growth deficiency due to the defect and giantosis and acromegaly due to its overexpression are known. Growth hormone replacement therapy is widely used for deficiency, but no effective drug has been developed to date for giant disease and acromegaly.

【０００３】[0003]

【従来の技術】コワルスキー等は、1978年に最初に生物
学的不活性型の成長ホルモン（変異型成長ホルモン）の
存在を報告している(Kowarski AA., et al, J Clin End
ocrinol Metab, 47: 461, 1978 )。しかしながら、小人
症の子供の血液中に異常な成長ホルモンの多量体が認め
られたとの報告はあるが(Valena LJ et al, N Engl J M
ed., 312: 214, 1985)、変異型成長ホルモンに関する分
子レベルでの理解は今日まで明らかにされていない。BACKGROUND OF THE INVENTION Kowalski et al. First reported the existence of a biologically inactive growth hormone (mutant growth hormone) in 1978 (Kowarski AA., Et al, J Clin End
ocrinol Metab, 47: 461, 1978). However, there have been reports of abnormal growth hormone multimers found in the blood of children with dwarfism (Valena LJ et al, N Engl JM
ed., 312: 214, 1985), a molecular understanding of mutant growth hormone has not been elucidated to date.

【０００４】循環血液中に生物学的不活性型の成長ホル
モンを認める小児は、血液中に高濃度の変異型成長ホル
モンが認められるものの、インスリン様成長因子１(IGF
-1)濃度は低く、それ故、成長の遅延を導く。しかし、
投与した正常型成長ホルモンによく応答することを特徴
としている(Hayek A., et al, Pediatr Res., 12: 413,
1978、Rudman D., et al, N Engl J Med., 305: 123,
1981、Plotnick LP., et al, Pediatrics 71: 324, 198
3、 Bright GM., et al, 71: 576, 1983)。[0004] In children who have biologically inactive growth hormone in the circulating blood, insulin-like growth factor 1 (IGF), although high levels of mutant growth hormone are found in the blood.
-1) The concentration is low, thus leading to slow growth. But,
It responds well to administered normal growth hormone (Hayek A., et al, Pediatr Res., 12: 413,
1978, Rudman D., et al, N Engl J Med., 305: 123,
1981, Plotnick LP., Et al, Pediatrics 71: 324, 198
3, Bright GM., Et al, 71: 576, 1983).

【０００５】近年、蛋白質工学及び遺伝子工学の進歩に
伴い、ホルモンとその受容体の結合及び活性発現に関与
する構造研究が可能となり、その結果として多数の遺伝
子疾患の原因が明らかにされて来ている。In recent years, with the advance of protein engineering and genetic engineering, structural studies relating to the binding of hormones and their receptors and the expression of activities have become possible, and as a result, the causes of many genetic diseases have been elucidated. I have.

【０００６】カニングハム等は蛋白質工学的手法を用い
て多数のヒト成長ホルモン変換体を作製して、成長ホル
モンレセプターへの結合部位を検討し、成長ホルモンの
レセプター結合に関与する領域が、アミノ- 末端側の 2
-19 番目のアミノ酸残基からなる領域、54-74 番目のア
ミノ酸残基領域、カルボキシ- 末端側の167-191 番目の
アミノ酸残基からなる領域であることを特定している(C
unningham BC., et al, Science 243 : 1330, 1989)。[0006] Cunningham et al. Prepared a large number of human growth hormone converters using protein engineering techniques, examined the binding site to the growth hormone receptor, and found that the region involved in the growth hormone receptor binding had an amino-terminal region. Side 2
It has been identified that the region consists of the -19th amino acid residue, the 54th to 74th amino acid residue, and the carboxy-terminal 167-191st amino acid residue (C
unningham BC., et al, Science 243: 1330, 1989).

【０００７】さらに、内田等はアミノ酸残基を種々交換
した成長ホルモン変換体を作製して、3T3-F 442A細胞に
対する分化活性を測定し、アミノ酸配列62-67の領域が
生物活性発現に重要であることを示唆した(Uchida E et
al., Biochem Biophys ResCommun. 172: 357, 1990)。Further, Uchida et al. Prepared a growth hormone converter in which various amino acid residues were exchanged and measured the differentiation activity against 3T3-F442A cells. The region of amino acid sequence 62-67 was important for the expression of biological activity. (Uchida E et
al., Biochem Biophys ResCommun. 172: 357, 1990).

【０００８】最近、結晶構造解析によりヒト成長ホルモ
ンとその結合蛋白質(受容体蛋白質の一部)との結合様式
に注目すべき知見が得られた(De Vos AM, et al, Scien
ce255: 306, 1992)。成長ホルモンは逐次的に成長ホル
モン受容体に結合する。初めに、成長ホルモンの部位１
で第一の成長ホルモン受容体に結合し、次に成長ホルモ
ンの部位 2で第二番目の成長ホルモン受容体と結合し、
結果として成長ホルモン受容体の二量体を形成し、成長
ホルモンのシグナルが細胞内に伝達されると推察されて
いる。Recently, crystal structure analysis has yielded remarkable findings on the mode of binding between human growth hormone and its binding protein (part of the receptor protein) (De Vos AM, et al, Scien
ce255: 306, 1992). Growth hormone sequentially binds to growth hormone receptors. First, growth hormone site 1
Binds to the first growth hormone receptor at, then binds to the second growth hormone receptor at site 2 of the growth hormone,
As a result, it is presumed that a dimer of growth hormone receptor is formed, and a signal of growth hormone is transmitted into cells.

【０００９】興味深いことは、ヒト成長ホルモンの部位
１及び部位２のアミノ酸残基は異なるが、受容体蛋白質
の結合部位のアミノ酸残基は共通していることである。
蛋白質工学的に作製した成長ホルモン変換体が、その受
容体に競合的に結合することも認められている(Fuh
G., et al, Science, 256:1677, 1992)。Interestingly, the amino acid residues at site 1 and site 2 of human growth hormone are different, but the amino acid residues at the binding site of the receptor protein are common.
It has also been observed that protein-engineered growth hormone converters competitively bind to its receptor (Fuh
G., et al, Science, 256: 1677, 1992).

【００１０】一方、遺伝子解析の進展により、多数の遺
伝病の異常遺伝子が突き止められてきている。小人症の
原因である成長ホルモン遺伝子についても同様である。
成長ホルモンは、生理活性発現に当たって細胞膜の受容
体を介するために、成長ホルモンに関する遺伝子異常
は、受容体遺伝子の異常と成長ホルモン遺伝子自体の異
常に大きく二分される。[0010] On the other hand, with the progress of genetic analysis, abnormal genes of many genetic diseases have been identified. The same applies to the growth hormone gene that causes dwarfism.
Since growth hormone mediates the expression of physiological activity through a receptor on the cell membrane, gene abnormalities relating to growth hormone are largely divided into abnormalities in the receptor gene and abnormalities in the growth hormone gene itself.

【００１１】また、成長ホルモン遺伝子は常染色体上に
あることから、その異常は劣性遺伝の形態をとることが
知られている。それ故、異常の出現には、両親の対立遺
伝子に同時に異常をき たすことが必要である。Since the growth hormone gene is on an autosomal chromosome, it is known that the abnormality takes the form of recessive inheritance. Therefore, the emergence of an abnormality requires simultaneous abnormalities in the parent's alleles.

【００１２】これまで、両親の成長ホルモン遺伝子の全
欠失、部分的欠損や塩基の置換等の変異が重複して、成
長遅延を起こした例が多数報告されている。 また、片
親が正常な場合に、変異型成長ホルモンが細胞内分泌顆
粒内に留まることも認められている。[0012] There have been reported many cases in which mutations such as total deletion, partial deletion, and substitution of bases in the growth hormone gene of parents are duplicated to cause growth delay. It has also been observed that mutant growth hormone remains in endocrine granules when one parent is normal.

【００１３】[0013]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、生体内
での遺伝子ミスセンス変異により生じた変異型成長ホル
モンの、分子レベルでの分析やそれの生体内での役割に
かんする詳細な研究は行われていない。また成長ホルモ
ンの過度の作用を抑制する有効な方法も知られていな
い。However, the analysis of the mutant growth hormone caused by a gene missense mutation in a living body at the molecular level and the detailed research on its role in the living body have not been conducted. . There is no known effective method for suppressing the excessive action of growth hormone.

【００１４】[0014]

【課題を解決するための手段】本発明は、小人症で遅延
した骨年齢を持つ５才の少年で、成長ホルモンの高いレ
ベルの血清濃度を示し、且つ惹起試験に顕著な成長ホル
モンの上昇を示しながら、低いIGF-1 レベルが発見され
たことが発端になって、その後の研究により完成された
ものである。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is directed to a five-year-old boy with dwarfism and a delayed bone age, showing high serum levels of growth hormone and a marked increase in growth hormone in induction tests. The discovery of low IGF-1 levels was the starting point and was completed by subsequent studies.

【００１５】これらの内分泌学的発見は成長ホルモン非
感受性症候群にみられる現象と矛盾しないと思われた(R
osenbloom AL., Acta Pediatr Scand(Suppl), 383:117,
1992)。These endocrinological findings seemed to be consistent with the phenomenon seen in growth hormone insensitive syndrome (R
osenbloom AL., Acta Pediatr Scand (Suppl), 383: 117,
1992).

【００１６】しかし、成長ホルモンを連続投与すること
で、有意な成長の改善が認められ、ラロン型症候群の可
能性も除外された。ラロン型小人症は成長ホルモン受容
体の疾患に由来する。[0016] However, continuous administration of growth hormone significantly improved the growth and ruled out the possibility of Laron-type syndrome. Laron dwarfism results from growth hormone receptor disease.

【００１７】本発明者は、この種の疾患を持つ子供の血
清の成長ホルモンが、正常な子供に比較して不活性型の
成長ホルモンであることをNb2 バイオアッセイで発見
し、等電点電気泳動法を用いて変異型成長ホルモンであ
ることを明らかにした。The present inventors have found that serum growth hormone in children with this type of disease is an inactive form of growth hormone compared to normal children by Nb2 bioassay, It was clarified that it was a mutant growth hormone by electrophoresis.

【００１８】この変異型成長ホルモンでは、成長ホルモ
ンの77番目のコドンでアルギニン残基がシステイン残基
(R→C)に置換を起こしていた（図１）。この置換部位は
成長ホルモンの二番目のα- ヘリックスに位置し、受容
体への結合部位１の背後に当たる(Cunningham BC., et
al, Science, 254:821, 1991)。置換したシステインが
新しいジスルフィド結合を形成し、分子の荷電を変え、
そしてこれらのことでコンフォメーショナルな変化を起
こし、ホルモン活性の減じた変異型成長ホルモンを生成
したと推察される。In this mutant growth hormone, an arginine residue is replaced with a cysteine residue at the 77th codon of growth hormone.
(R → C) was substituted (FIG. 1). This substitution site is located in the second α-helix of growth hormone and is behind binding site 1 to the receptor (Cunningham BC., Et al.
al, Science, 254: 821, 1991). The substituted cysteine forms a new disulfide bond, changing the charge of the molecule,
It is presumed that these resulted in a conformational change, producing mutant growth hormone with reduced hormonal activity.

【００１９】成長ホルモンの細胞内へのシグナル伝達に
おいて、リガンド結合による受容体の二量体化とその蛋
白質のチロシン残基の燐酸化が極めて重要とされている
(Argetsinger LS., et al, Cell, 74: 237, 1993、Sil
va CM., et al, J Biol Chem., 269: 27532, 1994)。In the signal transduction of growth hormone into cells, dimerization of receptor by ligand binding and phosphorylation of tyrosine residue of the protein are extremely important.
(Argetsinger LS., Et al, Cell, 74: 237, 1993, Sil
va CM., et al, J Biol Chem., 269: 27532, 1994).

【００２０】成長ホルモン結合蛋白質は、受容体の細胞
外ドメインに位置し、また in vivoで血清中で成長ホル
モン貯蔵体として働いている(Herington AC, et al, Ac
ta endocrinol (Copenh), 124: 14, 1991)。[0020] Growth hormone binding proteins are located in the extracellular domain of the receptor and also serve as growth hormone stores in serum in vivo (Herington AC, et al, Ac.
ta endocrinol (Copenh), 124: 14, 1991).

【００２１】成長ホルモン受容体への変異型成長ホルモ
ンの親和性は、野性型に比較して約６倍強くなっている
（図７、８）。変異型成長ホルモンの部位１と部位２は
受容体にたいして野性型と異なる親和性を示すことが示
唆された。変異型成長ホルモンの生物学的な特徴は、受
容体蛋白質に強い親和性を示すにもかかわらず、受容体
燐酸化による細胞へのシグナルトランスダクションの活
性は顕著に低いことである。The affinity of the mutant growth hormone for the growth hormone receptor is about six times stronger than that of the wild type (FIGS. 7 and 8). It was suggested that sites 1 and 2 of the mutant growth hormone show different affinities for the receptor from the wild type. The biological characteristic of mutant growth hormone is that despite its strong affinity for receptor proteins, the activity of signal transduction into cells by receptor phosphorylation is significantly lower.

【００２２】この様な患者に対する３日間の野性型成長
ホルモンの連続投与で、IGF-1 の顕著な応答は認められ
なかったが、長期投与では、内在的な変異型成長ホルモ
ンの分泌や受容体への結合をアンタゴニスト的に抑制す
ることで、血漿でのIGF-1 の増加と成長の改善に効果的
であった。それで、成長ホルモンが過剰分泌される巨人
症や末端肥大症の患者に変異型成長ホルモンを投与すれ
ば、アンタゴニスト的に働き、過剰成長を抑制すると考
えられる。[0022] In such patients, continuous administration of wild-type growth hormone for 3 days did not show a remarkable response to IGF-1, but long-term administration resulted in secretion of endogenous mutant growth hormone and receptor. Antagonistic inhibition of binding to was effective in increasing IGF-1 in plasma and improving growth. Therefore, if mutant growth hormone is administered to a patient with giant disease or acromegaly in which growth hormone is oversecreted, it will act as an antagonist and suppress excessive growth.

【００２３】本発明は上記の新しい知見に基づくもの
で、図１のアミノ酸配列を有する変異型ヒト成長ホルモ
ン蛋白質、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を有す
るデオキシリボヌクレオチド、該 アミノ酸配列に成長
ホルモン受容体への高い親和性を示し且つ低いホルモン
活性を保持する特徴を失わない範囲においてアミノ酸残
基の部分に部分的な置換、挿入または欠失を施したアミ
ノ酸配列を有する蛋白質、およびその用途に関する。The present invention is based on the above-mentioned new findings, and includes a mutant human growth hormone protein having the amino acid sequence shown in FIG. 1, a deoxyribonucleotide having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence, The present invention relates to a protein having an amino acid sequence in which amino acid residues are partially substituted, inserted or deleted within a range that shows high affinity for the protein and retains the characteristic of retaining low hormone activity, and uses thereof.

【００２４】本発明の変異型成長ホルモンはその内在性
の故に生体に副作用を示さず、単に成長遅延を導くこと
から、まだ治療薬の開発されていない巨人症及び末端肥
大症に効果的な治療剤としても用いることができる。そ
れは野性型に比較して約６倍強い受容体親和性を持つた
めに、現在、小人症治療に用いられている投与量の同等
及びそれ以下で、巨人症の治療薬として有用である。Since the mutant growth hormone of the present invention has no intrinsic side effects due to its intrinsic properties and merely leads to growth retardation, it is an effective treatment for giantosis and acromegaly, for which therapeutic agents have not yet been developed. It can also be used as an agent. Since it has about 6 times stronger receptor affinity than the wild type, it is useful as a therapeutic agent for gigantism at the same or lower dose as that currently used for the treatment of dwarfism.

【００２５】本発明の新規な変異型成長ホルモンのDNA
に、部分的なヌクレオチドの欠失、挿入、置換を行って
受容体親和性の強く且つ実質的にホルモン活性を示さな
い変換体を作製することは公知技術によって容易に行う
ことができる。その例としては図２、図３に示す配列が
挙げられる。さらに、蛋白工学的手法を用いて、変異型
成長ホルモンの受容体への結合部位を同定し、結合部位
ペプチドを遺伝子工学的に作製し、巨人症治薬剤及び末
端肥大症の治療薬剤として利用することもできる。The novel mutant growth hormone DNA of the present invention
Then, partial deletion, insertion, and substitution of nucleotides to produce a transformant having strong receptor affinity and substantially no hormonal activity can be easily performed by a known technique. Examples thereof include the arrays shown in FIGS. Furthermore, using a protein engineering technique, the binding site of the mutant growth hormone to the receptor is identified, and the binding site peptide is genetically engineered and used as a therapeutic agent for giant disease and a therapeutic agent for acromegaly. You can also.

【００２６】本発明の新規な変異型成長ホルモンをコー
ドしているDNAを複製可能なプラスミドに結合し、この
プラスミドを用いて細胞を形質転換して、これらの宿主
細胞を培養して物質を生産することができる。宿主細胞
は、細菌、酵母及び動物細胞を含む。The DNA encoding the novel mutant growth hormone of the present invention is ligated to a replicable plasmid, cells are transformed with this plasmid, and these host cells are cultured to produce a substance. can do. Host cells include bacteria, yeast and animal cells.

【００２７】細菌などの原核生物がデオキシリボヌクレ
オチドのクローニングに適している。例えば、E.coliに
由来するpBR322のプラスミドはアンピシリンやテトラサ
イクリン抵抗性の遺伝子を含有し、変換細胞を同定する
容易な手段を与える。さらに、細菌のプラスミドは、そ
れ自体の蛋白質の発現に用いられるプロモーターを含有
する。Prokaryotes such as bacteria are suitable for cloning deoxyribonucleotides. For example, the pBR322 plasmid from E. coli contains genes for ampicillin and tetracycline resistance, providing an easy means of identifying transformed cells. In addition, bacterial plasmids contain a promoter that is used to express the protein itself.

【００２８】原核生物に加えて、酵母などの真核生物も
役立つ、特に、酵母菌のサッカロミセス（saccharomyce
s)での発現にはプラスミド YRp7 が共通に用いられる(S
tinchcomb et al., Nature, 282:39,1979)。動物細胞も
宿主として利用される。細胞系として AtT-20、ヒーラ
細胞（HelaCells）、ＣＨＯ細胞（ Chinese Hamster Ov
ary）(CHO) 、COSM6 、COS-7 などが挙げられる。ま
た、細胞系の発現プラスミドの制御機能として用いられ
るのが、ポリオーマ（Polyoma）ウイルス、アデノウイ
ルス（Adenovirus 2）、シトメガロウイルス（Cytomega
lo-virus、シミアンウイルス（ Simian virus） 40の
プロモーターである。動物細胞の発現系で利用性の高い
プラスミドはpCMVである(Thomsen et al., PNAS, 81:65
9, 1984)。In addition to prokaryotes, eukaryotes such as yeast are also useful, particularly the yeast saccharomyce.
Plasmid YRp7 is commonly used for expression in (s) (S
tinchcomb et al., Nature, 282: 39, 1979). Animal cells are also used as hosts. Cell line AtT-20, HeLa cells (HelaCells), CHO cells (Chinese Hamster Ov)
ary) (CHO), COSM6, COS-7 and the like. In addition, polyoma virus (Adenovirus 2), cytomegalovirus (Cytomegalovirus) (Cytomegalovirus)
lo-virus, Simian virus 40 promoter. A highly available plasmid in animal cell expression systems is pCMV (Thomsen et al., PNAS, 81:65.
9, 1984).

【００２９】変異型成長ホルモンやその変換型成長ホル
モンを動物に免疫して抗体を得ることができる。また、
周知技術を用いて、動物を免疫することで、特異的な抗
体を分泌する細胞からモノクローナル抗体を調製でき
る。An antibody can be obtained by immunizing an animal with the mutant growth hormone or its converted growth hormone. Also,
By immunizing animals using well-known techniques, monoclonal antibodies can be prepared from cells secreting specific antibodies.

【００３０】変異型成長ホルモン及びその変換体を大量
に調製することが容易になり、それの分子的レベルのよ
りよい理解で、成長ホルモン蛋白質の関連する疾患の治
療薬や診断薬を開発できる。また、本質的な治療法であ
る遺伝子治療薬の作製も含まれる。[0030] It becomes easy to prepare a large amount of mutant growth hormone and its transformant, and a better understanding of its molecular level enables development of a therapeutic or diagnostic agent for a disease associated with a growth hormone protein. It also includes the creation of gene therapy, an essential therapy.

【００３１】変異型ホルモンのヌクレオチドやその結合
部位のペプチドのヌクレオチドを、レトロウイルスやア
デノウイルス等のウイルスベクターを含む適当なベクタ
ーに組み込むことで、巨人症及び末端肥大症の遺伝子治
療剤として使用する可能性がある。The nucleotides of the mutant hormone and the nucleotides of the peptide at the binding site thereof are incorporated into appropriate vectors including viral vectors such as retroviruses and adenoviruses to be used as gene therapy for giantosis and acromegaly. there is a possibility.

【００３２】[0032]

【実施例】【Example】

実施例１ 前記の小人症で遅延した骨年齢を持つ５才の小年の血液
について以下の検討を行った。ホルモンの分析方法 血清中の成長ホルモンの濃度を、ファルマシヤ製の免疫
放射性分析キットで分析した。成長ホルモンの生物活性
は、Nb2 ヌードラットのリンパ腫細胞を用い、以前に述
べられ ている田中等(Tanaka T., et al., J.Clin.End
ocrinol.Metab., 51: 1058, 1980)の方法 を若干修正
して測定した。 Nb2バイオアッセイ法で、ヒトプロラク
チン(hPRL)に対する兎坑血清(NIDDK-anti-hPRL-IC5;NI
H)がヒトプロラクチンの成長促進作用を中和阻害するた
めに10万倍希釈で加えられた。成長遅延患者の血清成長
ホルモンが測定され、また対照として正常人の血清成長
ホルモンを分析した。Example 1 The following examination was performed on blood of a 5 year old child with a bone age delayed by dwarfism. Hormone analysis method The concentration of growth hormone in serum was analyzed using an immunoradioactive analysis kit manufactured by Pharmacia. The biological activity of growth hormone was determined using lymphoma cells from Nb2 nude rats, as previously described by Tanaka T., et al., J. Clin.
ocrinol.Metab., 51: 1058, 1980). Rabbit antiserum against human prolactin (hPRL) (NIDDK-anti-hPRL-IC5; NI
H) was added at a 100,000-fold dilution to neutralize and inhibit the growth promoting effect of human prolactin. Serum growth hormone in growth retarded patients was measured, and serum growth hormone in normal individuals was analyzed as a control.

【００３３】等電点電気泳動 等電点電気泳動にTsvetnitsky等(Tsvetnitsky V., et a
l., Biochem J, 307:239, 1995) の方法を用いた。pH勾
配が pH 3.5-8.0 で、1%HPMC（ヒドロキシプロピルメチ
ルセルロース）−４％アンフォライン緩衝液で 血清を
泳動分離し、各フラクションが集められ、免疫的に活性
な成長ホルモンを分析した。 10人の正常人のプール血
清を対照として用いた。The isoelectric focusing isoelectric focusing in Tsvetnitsky, etc. (Tsvetnitsky V., et a
l., Biochem J, 307: 239, 1995). Serum was electrophoretically separated in 1% HPMC (hydroxypropyl methylcellulose) -4% ampholine buffer with a pH gradient of 3.5-8.0, and fractions were collected and analyzed for immunologically active growth hormone. Pooled sera from 10 normals were used as controls.

【００３４】変異型成長ホルモン遺伝子の単離と遺伝子
分析 ゲノムDNAを末梢血の白血球から分離した(Gross-Bellar
d M., et al, Eur.J.Biochem., 36: 32, 1973)。さら
に、PCR法によりDNAを増幅した（図４）。オリゴヌクレ
オチド プライマーとして(F3 ; 5'TATGAATTCCTCTGCCTGC
CCTGCCTCAAGAG3' 、GAD ; 5'CTAACACAGTCTCTCAAAGT3'、
GSD ; 5'ACTTTGAGAGACTGTGTTAG3'、GAE ; 5'TGGAGTGGCA
ACTTCCAGGG3'、GHS1 ; 5'CTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACCTA
GCTGCA3'をゲノムDNAの増幅に用いた。 Isolation of Mutant Growth Hormone Gene and Gene
Analytical genomic DNA was isolated from peripheral blood leukocytes (Gross-Bellar
d M., et al, Eur. J. Biochem., 36: 32, 1973). Further, the DNA was amplified by the PCR method (FIG. 4). As an oligonucleotide primer (F3; 5 'TATGAATTCCTCTGCCTGC
CCTGCCTCAAGAG3 ', GAD; 5'CTAACACAGTCTCTCAAAGT3',
GSD; 5'ACTTTGAGAGACTGTGTTAG3 ', GAE; 5'TGGAGTGGCA
ACTTCCAGGG3 ', GHS1; 5'CTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACCTA
GCTGCA3 'was used for genomic DNA amplification.

【００３５】PCR法による増幅を以下の様に行った。 F3
-GADとGHS1-GADに対して、92℃で3 分の最初の変性を行
い、92℃で1 分、60℃で2 分、72℃で2 分のサイクルを
35回繰り返し、最後の72℃での処理を7 分間とした。 G
SD-GAEに対して、92℃で 1分、68℃で 1分、72℃で 1分
のサイクルを35回繰り返し、最後の72℃処理を 7分間と
した。The amplification by the PCR method was performed as follows. F3
Initial denaturation of -GAD and GHS1-GAD at 92 ° C for 3 minutes, followed by 1 minute at 92 ° C, 2 minutes at 60 ° C, and 2 minutes at 72 ° C.
The procedure was repeated 35 times, and the final treatment at 72 ° C. was performed for 7 minutes. G
For SD-GAE, a cycle of 92 ° C for 1 minute, 68 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute was repeated 35 times, and the final 72 ° C treatment was performed for 7 minutes.

【００３６】これらの増幅生成物を抽出し、pBS SK(+)
(STRATAGENE、USA)またはpT7blue(Novagen 、USA)でサ
ブクーロンして、そして373A DNAシークエンサー(Perki
n Elmer 、USA)を用いて配列を決定した。さらに、患者
のDNA変異部位(Arg→Cys)を同定した後に、PCR 反応で
のミス反応の可能性を排除するために、二重鎖DNA サイ
クルシークエンシング キット(GIBCOBRL、USA)を用い
て、直接的に PCR産物のDNA配列を決定した。These amplification products were extracted and pBS SK (+)
(STRATAGENE, USA) or pT7blue (Novagen, USA) and subsequence and 373A DNA sequencer (Perki
n Elmer, USA). Furthermore, after identifying the DNA mutation site (Arg → Cys) in the patient, in order to eliminate the possibility of a miss-reaction in the PCR reaction, the DNA was directly analyzed using a double-stranded DNA cycle sequencing kit (GIBCOBRL, USA). The DNA sequence of the PCR product was determined.

【００３７】その結果、患者のDNA は、77位のアルギニ
ン残基がシステイン残基に置換していることを発見した
（図１）。As a result, it was found that the arginine residue at position 77 was substituted with a cysteine residue in the patient's DNA (FIG. 1).

【００３８】RNA 分析 リンパ球を MPRM Ficoll-Hypaque(Flow Lab 、USA)を用
いて分離して、そして全RNA 含量を常法的手段で単離し
た(Maniates T., et al, Cold Spring HarborLaborator
y Press, 1982) 。得られたRNA 1ug から cDNA を合成
した(MartynoffG.,et al, Biochem Biophys Res Commn,
93:645,1980)。合成したcDNAをPCR 反応に用いて、成
長ホルモンcDNAを増幅する。 PCR反応に用いるオリゴヌ
クレオチド プライマーは GHS2; 5'TGGACAGCTCACCTAGCT
GCA3'、GHAS1; 5'GGATTTCTGTTGTGTTTCCT3' 、GHS3; 5'T
TGACACCTACCAGGAGTTT3'、GHAS3; 5'CTAGAAGCCACAGCTGCC
CT3'とし、PCR による増幅を次の条件で行った。 RNA Analysis Lymphocytes were separated using MPRM Ficoll-Hypaque (Flow Lab, USA) and total RNA content was isolated by conventional means (Maniates T., et al, Cold Spring Harbor Laborator).
y Press, 1982). CDNA was synthesized from 1 ug of the obtained RNA (Martynoff G., et al, Biochem Biophys Res Commn,
93: 645, 1980). The synthesized cDNA is used in a PCR reaction to amplify the growth hormone cDNA. Oligonucleotide primer used for PCR reaction is GHS2; 5'TGGACAGCTCACCTAGCT
GCA3 ', GHAS1; 5' GGATTTCTGTTGTGTTTCCT3 ', GHS3; 5'T
TGACACCTACCAGGAGTTT3 ', GHAS3; 5'CTAGAAGCCACAGCTGCC
CT3 'was used, and amplification by PCR was performed under the following conditions.

【００３９】GHS2-GHAS1に対しては、最初の92℃で 3分
の変性を行い、92℃で 1分、68℃で1.5 分、72℃で 1.5
分のサイクルを40回繰り返し、最後に72℃で 7分間の伸
長を行った。GHS2-GHAS1 was first denatured at 92 ° C. for 3 minutes, and then denatured at 92 ° C. for 1 minute, 68 ° C. for 1.5 minutes, and 72 ° C. for 1.5 minutes.
The 40 minute cycle was repeated 40 times, and a final extension at 72 ° C. for 7 minutes was performed.

【００４０】GHS3-GHAS3に対しては、変性の後に、92℃
で1分、60℃で1分、72℃で1.5分の 40回のサイクルが行
われた。増幅した生成物の塩基配列を決定した。For GHS3-GHAS3, after denaturation, 92 ° C.
For 1 minute, 1 minute at 60 ° C., and 1.5 minutes at 72 ° C. The nucleotide sequence of the amplified product was determined.

【００４１】野性型（正常）ヒト成長ホルモンと変異型
ヒト成長ホルモンの cDNA の構築 ヒト成長ホルモン（野性型及び変異型）のcDNAをPCR に
より増幅した。成長ホルモンを分泌する下垂体腺腫細胞
(Clontech)から得られた cDNA ライブラリーを用い、そ
れの正確性はDNA配列のシークエンシングで確認した。 Wild type (normal) human growth hormone and mutant type
Construction of cDNA for human growth hormone cDNA for human growth hormone (wild type and mutant type) was amplified by PCR. Pituitary adenoma cells secreting growth hormone
A cDNA library obtained from (Clontech) was used and its accuracy was confirmed by DNA sequence sequencing.

【００４２】PCR に用いたオリゴヌクレオチド プライ
マーは、センスプライマーとしてGHS1、アンチセンスプ
ライマーとして 5'TAAGAATTCGAGGGGTCACAGGGATGCCACCCC
3'を用いた。The oligonucleotide primers used in the PCR were GHS1 as a sense primer and 5'TAAGAATTCGAGGGGTCACAGGGATGCCACCCC as an antisense primer.
3 'was used.

【００４３】PCRの反応条件は、92℃で 3分の最初の変
性を行い、92℃で 1分、48℃で1.5分、72℃で1.5 分の
サイクルを35回繰り返し、最終の伸長に72℃で7分間処
理を行う。The PCR reaction conditions were as follows: a first denaturation at 92 ° C. for 3 minutes, a cycle at 92 ° C. for 1 minute, 48 ° C. for 1.5 minutes, and 72 ° C. for 1.5 minutes repeated 35 times, and a final extension of 72 minutes. Treat at 7 ° C for 7 minutes.

【００４４】変異型成長ホルモンのcDNAをTransformerM
T(Clontech)を用いて構築した。成長ホルモンのcDNAの
シグナル配列を除くために、人工的に加えたBamH1 部位
を含むセンスプライマー(5'GCGGATCCTTCCCAACCATTCCCTT
ATC3')とアンチセンスプライマーとして GHAS1を用いて
PCRによる増幅を行った。得られたcDNAについて、直接
塩基配列決定法により、塩基配列を決定し、変異を確認
した（図１）。Mutant growth hormone cDNA was transformed into TransformerM
Constructed using T (Clontech). In order to remove the growth hormone cDNA signal sequence, a sense primer containing an artificially added BamH1 site (5'GCGGATCCTTCCCAACCATTCCCTT
ATC3 ') and GHAS1 as antisense primer
Amplification by PCR was performed. The nucleotide sequence of the obtained cDNA was determined by the direct nucleotide sequencing method, and the mutation was confirmed (FIG. 1).

【００４５】野性型（正常）ヒト成長ホルモンと変異型
ヒト成長ホルモンの発現と機能分析 野性型成長ホルモンと変異型成長ホルモンの製造用の発
現ベクターは、λバクテリオファージ由来のプロモータ
ーオペレーターPLOLを含むDNA配列と、宿主細胞により
産生される抗転写終結因子N-蛋白質を結合するN-利用部
位と野性型成長ホルモン遺伝子及び変異型成長ホルモン
遺伝子のmRNAを 宿主細胞内のリボソームに結合せしめ
得るリボゾーム結合部位を含むDNA 配列と、ATG 開始コ
ドンと、ATG 開始コドンと位相を合わせて所望の遺伝子
をベクター内に挿入するための制限酵素部位を含んでい
る（特公平6-87780 ）。 Wild type (normal) human growth hormone and mutant type
Expression and function analysis of human growth hormone Expression vectors for the production of wild-type growth hormone and mutant growth hormone are a DNA sequence containing a promoter operator PLOL derived from a λ bacteriophage, and an anti-transcription termination factor N produced by a host cell. -A DNA sequence containing an N-utilizing site that binds proteins and a ribosome binding site capable of binding the mRNA of the wild-type growth hormone gene and the mutant growth hormone gene to ribosomes in the host cell, an ATG start codon, and an ATG start codon And a restriction enzyme site for inserting a desired gene into a vector in phase with that of Japanese Patent Publication No. 6-87780.

【００４６】発現ベクターは非耐熱性リプレッサーC1を
含む適当な宿主細胞、例えば E.coliに導入され、宿主
細胞がリプレッサー破壊温度までに加熱されたときに野
性型成長ホルモン及び変異型成長ホルモンを発現させ
た。この様な発現生成物は開始コドンに由来するメチオ
ニン残基をアミノ末端に保持するために、特異的アミノ
ペプチダーゼで除去して、成熟した野性型ヒト成長ホル
モン及びヒト変異型成長ホルモンを得ることができる
（特公開昭62-500003 ）。The expression vector is introduced into a suitable host cell containing the non-thermostable repressor C1, such as E. coli, and when the host cell is heated to the repressor disruption temperature, wild-type and mutant growth hormones are obtained. Was expressed. Such expression products can be removed with a specific aminopeptidase to retain the methionine residue from the initiation codon at the amino terminus, yielding mature wild-type and human mutant growth hormone. Yes (Special Publication No. 62-500003).

【００４７】形質転換細胞を発酵させ、細胞懸濁液を遠
心分離や濾過処理して細胞を集め、物理的、化学的手法
で細胞を溶解して変異型成長ホルモンを単離する。The transformed cells are fermented, and the cell suspension is centrifuged or filtered to collect the cells, and the cells are lysed by physical or chemical means to isolate the mutant growth hormone.

【００４８】精製方法としては、硫酸アンモニウムなど
の分別法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、抗体をもちいたアフィニティークロ
マトグラフィー、順相または逆相高速クロマトグラフィ
ーなどの既知の方法の組み合わせで行われる。The purification method is a combination of known methods such as fractionation methods such as ammonium sulfate and the like, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography using an antibody, normal phase or reverse phase high performance chromatography. .

【００４９】また、試験用に用いる少量の試料調製に、
野性型成長ホルモンcDNAと変異型成長ホルモンcDNAをプ
ラスミド(pGEXKG)のBamHI-EcoRI部位にクローン化し、D
H5α細胞に組み込んだ。発現生成物はファルマシヤ製の
グルタチオン-S- トランスフェラーゼ遺伝子融合系でも
調製した。In addition, for preparing a small amount of sample used for testing,
Wild-type growth hormone cDNA and mutant growth hormone cDNA were cloned into the BamHI-EcoRI site of the plasmid (pGEXKG), and D
Incorporated into H5α cells. The expression product was also prepared with a glutathione-S-transferase gene fusion system manufactured by Pharmacia.

【００５０】この様にして得られた組換え体変異型成長
ホルモンの分子内でのシステイン間の架橋に、正常型(5
3-165)及び変異型（ 53-77）と変異型（77-165）のジス
ルフィド結合の3通りの存在が示唆された。そこで、患
者リンパ球より調製したcDNAを（図５）に示した手法で
置換改変し、53位または 165位のシステインをアラニン
残基に改変したcDNAを作製した。また、53位または165
位のシスティンをセリン残基に改変したcDNAを作製して
もよい。The crosslinks between cysteines in the molecule of the recombinant mutant growth hormone obtained in this manner were replaced with the normal type (5
3-165) and three types of disulfide bonds of the mutant (53-77) and the mutant (77-165) were suggested. Therefore, cDNA prepared from the patient's lymphocytes was substituted and modified by the method shown in FIG. 5 to prepare a cDNA in which the cysteine at position 53 or 165 was changed to an alanine residue. Also, 53rd or 165
A cDNA in which the cysteine at the position is modified to a serine residue may be prepared.

【００５１】これらを大腸菌内で発現させて、77位と16
5 位（図２）、53位と77位（図３）のシステインが架橋
した二種の変異型成長ホルモン蛋白質が得られた。These were expressed in E. coli, and
Two types of mutant growth hormone proteins in which cysteines at positions 5 (FIG. 2), 53 and 77 (FIG. 3) were crosslinked were obtained.

【００５２】野性型成長ホルモンと変異型成長ホルモン
の生物学的活性は、IRMAとNb2 のバイオアッセイ系で測
定した。 Nb2バイオアッセイを、成長ホルモン及びプロ
ラクチンの検出されない患者の血清の有無の条件で行っ
た。組換え体ヒト成長ホルモン結合蛋白質（rhGHBP）
を、最終濃度 0.1、0.5 、または 1 nM になるように加
えられた。The biological activities of wild type growth hormone and mutant growth hormone were measured using an IRMA and Nb2 bioassay system. The Nb2 bioassay was performed in the presence or absence of serum from patients where growth hormone and prolactin were not detected. Recombinant human growth hormone binding protein (rhGHBP)
Was added to a final concentration of 0.1, 0.5, or 1 nM.

【００５３】一段階レセプター分析法で、成長ホルモン
受容体を発現するヒトリンパ芽球 IM-9細胞で競争的結
合を調べた(Lesniak MA., et al, J Biol Chem., 249:1
661,1974)。Competitive binding was examined in human lymphoblastic IM-9 cells expressing the growth hormone receptor by a one-step receptor assay (Lesniak MA., Et al, J Biol Chem., 249: 1).
661,1974).

【００５４】野性型成長ホルモンと変異型成長ホルモン
へのrhGHBPの直接的な結合を免疫沈澱法を用いて検討し
た。The direct binding of rhGHBP to wild-type and mutant growth hormone was examined by immunoprecipitation.

【００５５】IM-9細胞での成長ホルモン依存性のチロシ
ン燐酸化は、シルバ等(Silva CM.,et al, Endocrinolog
y, 132:101, 1993)の方法で検出した。抗燐酸チロシン
モノクローナル抗体 (RC20:Transduction Laboratorie
s, USA)を、免疫沈澱及びウエスタンブロッティングに
用いた。抗体の結合をAmersham社のECLキットを用いて
視覚化した。Growth hormone-dependent tyrosine phosphorylation in IM-9 cells was determined by the method of Silva et al. (Silva CM., Et al, Endocrinolog
y, 132: 101, 1993). Anti-phosphotyrosine monoclonal antibody (RC20: Transduction Laboratorie
s, USA) were used for immunoprecipitation and Western blotting. Antibody binding was visualized using an Amersham ECL kit.

【００５６】等電点電気泳動で発端者（患者）の血清中
で既知の野性型（正常）成長ホルモンに加えて、変異型
成長ホルモンの存在が確認された（図６）。Isoelectric focusing confirmed the presence of mutant growth hormone in addition to the known wild-type (normal) growth hormone in the serum of the proband (patient) (FIG. 6).

【００５７】変異型成長ホルモン遺伝子が、生物学的不
活性であるかどうかを見積もるために、λファージ由来
のプロモーターオペレーターを持つ発現ベクターでの形
質変換細胞で変異型成長ホルモンと野性型成長ホルモン
を発現し、生成物を得た。同じく、GST 融合蛋白質系で
も発現させて生成物が得られた。To estimate whether the mutant growth hormone gene is biologically inactive, mutant growth hormone and wild-type growth hormone were transformed in transformed cells with an expression vector having a phage lambda-derived promoter operator. Expressed to give the product. Similarly, the GST fusion protein system was also expressed to yield the product.

【００５８】変異型成長ホルモンも野性型成長ホルモン
もIRMA細胞による検定で同等な免疫活性であった。プロ
ラクチン受容体を介する生物活性も Nb2バイオアッセイ
により測定した。Both mutant and wild type growth hormones showed comparable immunoreactivity in assays with IRMA cells. Prolactin receptor-mediated biological activity was also measured by the Nb2 bioassay.

【００５９】血清が除去された培地での Nb2バイオアッ
セイで両物質は類似した生物活性を示すにもかかわら
ず、患者の血清培地で、野性型成長ホルモンに比較して
変異型成長ホルモンの活性が半分以下に減少した。 Nb2
バイオアッセイ系への成長ホルモン結合蛋白質による阻
害の可能性を予想して、組換え体の成長ホルモン結合蛋
白質を分析培地に加えた。Despite the similar biological activity of both substances in Nb2 bioassay in serum-depleted medium, the activity of mutant growth hormone in the serum medium of patients is higher than that of wild-type growth hormone. Decreased by less than half. Nb2
Recombinant growth hormone binding protein was added to the assay medium in anticipation of potential growth hormone binding protein inhibition of the bioassay system.

【００６０】変異型成長ホルモンの生物学的活性の免疫
学的活性に対する比は、組換え体成長ホルモン結合蛋白
質の 0.5 nM と1 nMの存在下で 0.45 ±0.05(p＜0.05)
と0.22±0.08(p＜0.05) まで著しく減少した。これらの
濃度は末梢血の実際の生理的な結合蛋白質の濃度に相当
する。The ratio of the biological activity of the mutant growth hormone to the immunological activity was 0.45 ± 0.05 (p <0.05) in the presence of 0.5 nM and 1 nM of the recombinant growth hormone binding protein.
And 0.22 ± 0.08 (p <0.05). These concentrations correspond to the actual physiological binding protein concentrations in peripheral blood.

【００６１】IM-9細胞でのヒト成長ホルモン受容体への
［¹²⁵I］ヒト成長ホルモンの結合は、濃度に依存して野
性型と変異型成長ホルモンに置き変わる。 変異型成長
ホルモンによる置換は蛋白質濃度の10-¹¹ から10-⁹ Mの
範囲でショルダーを示した。これらのIC₅₀値はほとんど
同じ値で、それぞれ 0.84 ±0.30nMと 0.86 ±0.41nMを
示した。The binding of [ ¹²⁵ I] human growth hormone to the human growth hormone receptor in IM-9 cells is replaced by wild-type and mutant growth hormone in a concentration-dependent manner. Substituted by the mutant growth hormone showed a shoulder in the range of 10 ⁹ M from protein concentration of 10- ^11. These IC ₅₀ values were almost the same, showing 0.84 ± 0.30 nM and 0.86 ± 0.41 nM, respectively.

【００６２】しかしながら変異体による置換は10-¹¹-10
-⁹M でなめらかでない（図７）。また、ヒト組換え体成
長ホルモン結合蛋白質への［¹²⁵I］ヒト成長ホルモンの
結合もまた濃度依存性に従い変異型成長ホルモンや野性
型成長ホルモンに置換する。[0062] However, substitution by mutant 10- ¹¹ -10
-It is not smooth at ⁹ M (Fig. 7). In addition, the binding of [ ¹²⁵ I] human growth hormone to the human recombinant growth hormone binding protein also substitutes for mutant growth hormone or wild type growth hormone in a concentration-dependent manner.

【００６３】変異型成長ホルモンのIC₅₀は 0.12 ±0.02
nM（平均値±SEM 、3 回）であり、野性型成長ホルモン
の値 0.68 ±0.08nMより著しく低い値をしめし、変異型
成長ホルモンの親和性が野性型より約 6倍高い値を示し
た（図７）。The mutant growth hormone has an IC ₅₀ of 0.12 ± 0.02
nM (mean ± SEM, 3 times), significantly lower than the wild-type growth hormone value of 0.68 ± 0.08 nM, and the affinity of the mutant growth hormone was about 6 times higher than that of the wild-type growth hormone ( (FIG. 7).

【００６４】IM-9細胞を用いた成長ホルモン受容体での
成長ホルモン依存性のチロシン燐酸化を、ウエスタンブ
ロッティングを利用して野性型と変異型で比較した。The growth hormone-dependent tyrosine phosphorylation at the growth hormone receptor using IM-9 cells was compared between wild type and mutant type using Western blotting.

【００６５】ヒト組換え体成長ホルモンと野性型成長ホ
ルモン、つまり正常型の成長ホルモンのチロシン燐酸化
の促進に比較して、対照的に、変異型成長ホルモンはそ
れ自体でチロシン燐酸化に作用しないのみならず、野性
型成長ホルモンで誘導される燐酸化を著しく阻害した。
チロシン燐酸化の阻害が、変異体が野性型成長ホルモン
の 1/10量を同時に加えたときでさえ認められた（図
８）。In contrast to the enhancement of tyrosine phosphorylation of human recombinant growth hormone and wild-type growth hormone, ie, normal growth hormone, in contrast, mutant growth hormone by itself does not affect tyrosine phosphorylation. Not only did it significantly inhibit wild-type growth hormone-induced phosphorylation.
Inhibition of tyrosine phosphorylation was observed even when the mutants were simultaneously added to 1/10 the amount of wild type growth hormone (FIG. 8).

【００６６】[0066]

【発明の効果】本発明の変異型ヒト成長ホルモンの生物
学的性質は、その受容体蛋白質に高い親和性を示し、且
つ本来のホルモン活性を実質的に喪失していることを特
徴し、この変異蛋白質のデオキシリボヌクレオチドを用
いて公知の遺伝子工学技術により変異型成長ホルモンを
量産することができる。この様な変異型ヒト成長ホルモ
ン蛋白質は、それの特徴的な性質から、これまで治療薬
の開発されていない巨人症の治療に役立ち、また本来生
体内でのミスセンス変異により生成した内在性の変異型
成長ホルモンで、人為的な操作による蛋白質工学で得ら
れた種々の成長ホルモン変換体と異なり、抗原性などの
副作用の少ない安全な物質である。The biological properties of the mutant human growth hormone of the present invention are characterized by showing high affinity for its receptor protein and substantially losing the original hormone activity. Mutant growth hormone can be mass-produced by known genetic engineering techniques using the deoxyribonucleotide of the mutant protein. Due to its characteristic properties, such mutant human growth hormone protein is useful for the treatment of giantosis, for which no therapeutic agent has been developed, and the endogenous mutation originally generated by a missense mutation in vivo. It is a type of growth hormone, which is a safe substance with few side effects such as antigenicity, unlike various growth hormone converters obtained by protein engineering by artificial manipulation.

【００６７】[0067]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】実施例で得られた変異型成長ホルモン(77 位、
R →C)のアミノ酸配列とその蛋白質をコードする塩基配
列を示す。FIG. 1 shows the mutant growth hormone (position 77,
1 shows the amino acid sequence (R → C) and the nucleotide sequence encoding the protein.

【図２】実施例で得られた組換え変換(53 位、C →A)に
よる変異型成長ホルモンのアミノ酸配列とその蛋白質を
コードする塩基配列を示す。FIG. 2 shows the amino acid sequence of mutant growth hormone obtained by recombination conversion (position 53, C → A) and the nucleotide sequence encoding the protein obtained in the examples.

【図３】実施例で得られた組換え変換（165 位、C →A
）による変異型成長ホルモンのアミノ酸配列とその蛋
白質をコードする塩基配列を示す。FIG. 3 shows the recombinant transformations obtained in the examples (position 165, C → A
2) shows the amino acid sequence of the mutant growth hormone and the nucleotide sequence encoding the protein.

【図４】a: 変異型成長ホルモンの遺伝子構造とPCR 増
幅用のプライマーのデザイン；5箇所のエクソン部位を
ボックスで示し、そしてPCR プライマーを矢印で示し
た。77番目の変異アミノ酸（アルギニン→システイン置
換）を示している。 b: 変異型成長ホルモン遺伝子のDNA配列を示す電気泳動
のパターン；77番目のコドンでアルギニンのシステイン
への変異を示した。この変異はPCR を用いてゲノムDNA
とRNA の配列を直接分析して決定した。FIG. 4 a: Gene structure of mutant growth hormone and design of primers for PCR amplification; 5 exon sites are indicated by boxes, and PCR primers are indicated by arrows. The 77th mutant amino acid (arginine → cysteine substitution) is shown. b: Electrophoresis pattern showing DNA sequence of mutant growth hormone gene; mutation of arginine to cysteine at codon 77 was shown. This mutation is made using genomic DNA
And RNA sequences were determined by direct analysis.

【図５】53位または 165位のシステインをアラニンに改
変するためのcDNA作成フローシート。プライマーとして
は以下の配列のオリゴヌクレオチドを用いた。 f1; 5'ACAGAAACAGGTGGGGGCAA3' R2; 5'AATAGACTCTGAGAAAGCGGG3' R3; 5'GTCCATGTCCTTCCTGAAGGCGTAGAG3' 53 位（C →A ）の置換については、f1とR2、165 位（C
→A ）の置換については、f1とR3のプライマーを用い
てPCR 増幅を行った。別に、正常型成長ホルモンのcDNA
をそれぞれ、制限酵素 HinfI及びNlaIIIで消化した断片
の下流側を調製し、PCR 産物とリガーゼを用いて結合さ
せた。FIG. 5 is a flow sheet for preparing cDNA for modifying cysteine at position 53 or position 165 to alanine. Oligonucleotides having the following sequences were used as primers. f1; 5'ACAGAAACAGGTGGGGGCAA3 'R2;5'AATAGACTCTGAGAAAGCGGG3'R3;5'GTCCATGTCCTTCCTGAAGGCGTAGAG3'For substitution at position 53 (C → A), f1 and R2, position 165 (C
→ Regarding the substitution of A), PCR amplification was performed using primers f1 and R3. Separately, normal growth hormone cDNA
Were prepared on the downstream side of the fragment digested with the restriction enzymes HinfI and NlaIII, respectively, and ligated to the PCR product using ligase.

【図６】血清の中での変異型成長ホルモンと野性型成長
ホルモンの等電点電気泳動(IEF) の結果をしめすグラ
フ。血清(150-300 ul)を、1% HPMC- 4% Ampholine (pH
3.5-8.0)で、等電点電気泳動処理した。試料フラクショ
ンが分離、プールされ、そして成長ホルモンに対する免
疫活性を測定した（□）。 IEFで形成されたpH勾配は
（◆）でしめした。成長ホルモン蛋白質でのアルギニン
からシステインの変異は、等電的にpH 0.16 の低下を起
こすと見込まれる。野性型成長ホルモンと変異型成長ホ
ルモンのピークは白矢印と黒矢印でそれぞれ示した。 a: 発端者（患者：小児） b: 父親FIG. 6 is a graph showing the results of isoelectric focusing (IEF) of mutant growth hormone and wild-type growth hormone in serum. Serum (150-300 ul) was diluted with 1% HPMC-4% Ampholine (pH
3.5-8.0) for isoelectric focusing. Sample fractions were separated and pooled, and immunoreactivity against growth hormone was measured (□). The pH gradient formed by IEF was indicated by (◆). Mutation of arginine to cysteine in the growth hormone protein is expected to cause a pH 0.16 drop isoelectrically. The peaks of wild-type and mutant growth hormone are indicated by white and black arrows, respectively. a: Proband (patient: child) b: Father

【図７】a: 野性型成長ホルモンと変異型成長ホルモン
による、IM-9細胞への［¹²⁵I］ラベルヒト成長ホルモン
の結合阻害を示すグラフ。細胞(IM-9)を1-3x10⁷/mlの最
終濃度で、野性型成長ホルモンと変異型成長ホルモンの
添加濃度依存性に増加させて培養した。 0.8 ng/mlの［
¹²⁵I］ヒト成長ホルモン(DU POINT 、USA)(0.33 uCi/m
l) 、全溶液 250 ul 、30℃。 4時間培養の後に、細胞
を集めて洗い、細胞に結合している放射性活性を測定し
た。 b: 成長ホルモン結合蛋白質への［¹²⁵I］ヒト成長ホル
モンの結合阻害を示すグラフ。［¹²⁵I］ヒト成長ホルモ
ン(0.6uCi/ml)、組換え体ヒト成長ホルモン結合蛋白質
（0.6nM ）、抗成長ホルモン受容体マウスモノクローナ
ル抗体(Mab 263; AGEN、Australia)(1:100000)を、野性
型成長ホルモンと変異型成長ホルモンのそれぞれの濃度
を増加させて４℃，16時間培養した。それから、10% 抗
マウス IgG (goat) 抗体(50ul)、1%正常マウス血清(50u
l)、そして5%PEG(300ul)を加えた。反応液をさらに 4
℃、 4時間培養し、遠心分離して、そして沈澱物（pell
ets ）の放射活性をγ- カウンターで測定した。値は、
3回実験の平均値である。FIG. 7a: Graph showing inhibition of [ ¹²⁵ I] -labeled human growth hormone binding to IM-9 cells by wild-type growth hormone and mutant growth hormone. Cells (IM-9) were cultured at a final concentration of 1-3 × 10 ⁷ / ml in an increasing concentration-dependent manner with wild-type and mutant growth hormone. 0.8 ng / ml [
¹²⁵ I] Human growth hormone (DU POINT, USA) (0.33 uCi / m
l), 250 ul total solution, 30 ° C. After culturing for 4 hours, the cells were collected and washed, and the radioactivity bound to the cells was measured. b: Graph showing inhibition of [ ¹²⁵ I] human growth hormone binding to growth hormone binding protein. [ ¹²⁵ I] human growth hormone (0.6 uCi / ml), recombinant human growth hormone binding protein (0.6 nM), anti-growth hormone receptor mouse monoclonal antibody (Mab 263; AGEN, Australia) (1: 100000) The cells were cultured at 4 ° C. for 16 hours with increasing concentrations of wild-type growth hormone and mutant growth hormone. Then, 10% anti-mouse IgG (goat) antibody (50ul), 1% normal mouse serum (50u
l) and 5% PEG (300ul) was added. Add 4 more reaction
Incubate at 4 ° C for 4 hours, centrifuge, and precipitate (pell
ets) was measured with a γ-counter. value is,
The average of three experiments.

【図８】a: IM-9細胞での野性型成長ホルモンと変異型
成長ホルモン依存性のチロシンの燐酸化を示す電気泳動
の写真。IM-9細胞を 100ng/ml のヒト成長ホルモンの有
無で処理した（レーン1 、2)。野性型成長ホルモン( レ
ーン 3; 10ng/ml 、レーン 4; 100ng/ml) 、変異型成長
ホルモン( レーン 5; 10ng/ml 、レーン 6; 100ng/ml)
、変異型成長ホルモン 10ng/mlを一定にして野性型成
長ホルモン濃度を増加する( レーン 7;10ng/ml、レーン
8; 25ng/ml 、レーン 9; 50ng/ml 、レーン 10; 100ng
/ml)、37℃で15分間処理した。これらの細胞の介面活性
剤による溶解物を燐酸化チロシン特異的抗体で免疫沈澱
して、パーオキシダーゼ結合した同じ抗体でウエスタン
ブロッティングして分析した。分子量はキロダルトンの
単位で左側に示した。矢印は成長ホルモンにより生じた
チロシンの燐酸化蛋白質バンドを示している。 b: p120の抗燐酸チロシン免疫ブロットのデンシトメト
リー分析を示す棒グラフである。p120のチロシン燐酸化
（IM-9細胞でJAK2と報告されている）の量をデンシトメ
トリーで定量した。デンシトメトリーの強度は対照とし
ての成長ホルモンの無い時に相対的に表現されている。
3回の独立した実験での平均値（±SEM ）を示し、統計
分析を Student's-t test で行った。FIG. 8: a: Photographs of electrophoresis showing phosphorylation of tyrosine dependent on wild type growth hormone and mutant growth hormone in IM-9 cells. IM-9 cells were treated with and without 100 ng / ml human growth hormone (lanes 1, 2). Wild-type growth hormone (lane 3; 10 ng / ml, lane 4; 100 ng / ml), mutant growth hormone (lane 5; 10 ng / ml, lane 6; 100 ng / ml)
Increase the wild-type growth hormone concentration by keeping the mutant growth hormone constant at 10 ng / ml (lane 7; 10 ng / ml, lane
8; 25 ng / ml, lane 9; 50 ng / ml, lane 10; 100 ng
/ ml) at 37 ° C for 15 minutes. Surfactant lysates of these cells were immunoprecipitated with a phosphorylated tyrosine-specific antibody and analyzed by Western blotting with the same peroxidase-conjugated antibody. Molecular weights are given on the left in kilodaltons. Arrows indicate tyrosine phosphorylated protein bands produced by growth hormone. b: Bar graph showing densitometric analysis of anti-phosphate tyrosine immunoblot of p120. The amount of tyrosine phosphorylation of p120 (reported as JAK2 in IM-9 cells) was quantified by densitometry. Densitometric intensity is expressed relative to the absence of growth hormone as a control.
Mean values (± SEM) from three independent experiments are shown, and statistical analysis was performed with Student's-t test.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ // Ａ６１Ｋ 39/395 37/36 ＡＥＥ ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Agency reference number FI Technical indication location C12N 1/21 C12P 21/02 H C12P 21/02 21/08 21/08 A61K 39/395 N / / A61K 39/395 37/36 AEE

Claims (14)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 下記のアミノ酸配列を有する変異型ヒト
成長ホルモン蛋白質。 【図１】1. A mutant human growth hormone protein having the following amino acid sequence: FIG. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列をコードする塩
基配列が下記の式で表されるデオキシリボヌクレオチ
ド。 【図１】2. A deoxyribonucleotide whose base sequence encoding the amino acid sequence of claim 1 is represented by the following formula: FIG. 【請求項３】 成長ホルモン受容体蛋白質に高い親和性
を示し且つ低い成長ホルモン活性を保持することを特徴
とする請求項１に記載の変異型ヒト成長ホルモン蛋白
質。3. The mutant human growth hormone protein according to claim 1, which has a high affinity for a growth hormone receptor protein and retains a low growth hormone activity. 【請求項４】 請求項１のアミノ酸配列に成長ホルモン
受容体への高い親和性を示し且つ低いホルモン活性を保
持する特徴を失わない範囲においてアミノ酸残基の部分
に部分的な置換、挿入または欠失を施したアミノ酸配列
を有する蛋白質。4. A partial substitution, insertion or deletion of an amino acid residue within the amino acid sequence of claim 1 as long as the amino acid sequence exhibits high affinity for a growth hormone receptor and retains the characteristic of retaining low hormone activity. A protein having a lost amino acid sequence. 【請求項５】 アミノ酸配列とそれをコードするデオキ
シリボヌクレオチドが下記の式で表される蛋白質。 【図２】5. A protein having an amino acid sequence and a deoxyribonucleotide encoding the same represented by the following formula: FIG. 2 【請求項６】 アミノ酸配列とそれをコードするデオキ
シリボヌクレオチドが下記の式で表される蛋白質。 【図３】6. A protein having an amino acid sequence and a deoxyribonucleotide encoding the same represented by the following formula: FIG. 3 【請求項７】 請求項１に記載の蛋白質において、その
受容体蛋白質への結合部位であるペプチド及びそのペプ
チドのアミノ酸配列をコードするデオキシリボヌクレオ
チド。7. The protein according to claim 1, wherein the peptide is a binding site to the receptor protein, and deoxyribonucleotides encoding the amino acid sequence of the peptide. 【請求項８】 請求項４に記載される蛋白質のアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有するデオキシリボヌクレ
オチド。8. A deoxyribonucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of the protein according to claim 4. 【請求項９】 請求項２、５、６、７又は８に記載のデ
オキシリボヌクレオチドを、それぞれプロモーターの下
流に置いた発現プラスミド。9. An expression plasmid in which the deoxyribonucleotide according to claim 2, 5, 6, 7 or 8 is located downstream of a promoter. 【請求項１０】 請求項９に記載のプラスミドで形質転
換された生物細胞から発現した生成物。10. A product expressed from a biological cell transformed with the plasmid according to claim 9. 【請求項１１】 請求項１、４、５又は６に記載の変異
型ヒト成長ホルモン蛋白質と相互作用する抗体。An antibody that interacts with the mutant human growth hormone protein according to claim 1, 4, 5, or 6. 【請求項１２】 モノクローナル抗体である請求項１１
に記載の抗体。12. The monoclonal antibody according to claim 11, which is a monoclonal antibody.
The antibody according to 1. 【請求項１３】 請求項１、４、５、６又は７に記載の
蛋白質及びペプチドを有効成分とする巨人症治療剤又は
末端肥大症治療剤。A therapeutic agent for giantosis or acromegaly comprising the protein and peptide according to claim 1, 4, 5, 6 or 7 as an active ingredient. 【請求項１４】 請求項２、５、６、７又は８のデオキ
シリボヌクレオチドを利用した遺伝子治療剤。14. A gene therapy agent using the deoxyribonucleotide of claim 2, 5, 6, 7, or 8.