JPH1077299A - Human myosin light chain-binding subunit, its gene and diagnostic agent - Google Patents
Human myosin light chain-binding subunit, its gene and diagnostic agentInfo
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- JPH1077299A JPH1077299A JP9061847A JP6184797A JPH1077299A JP H1077299 A JPH1077299 A JP H1077299A JP 9061847 A JP9061847 A JP 9061847A JP 6184797 A JP6184797 A JP 6184797A JP H1077299 A JPH1077299 A JP H1077299A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の背景】発明の分野 本発明は、ヒトミオシン結合サブユニットに関し、更に
詳細には、その遺伝子および診断薬に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to human myosin binding subunits, and more particularly to its genes and diagnostics.
【０００２】背景技術 生体内には、サブユニット構造を有さない分子量２〜３
万の一群の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク
質）が存在している。現在、低分子量Ｇタンパク質のス
ーパーファミリーには酵母から哺乳動物に至るまですで
に５０種類以上のメンバーが見出されている。低分子量
Ｇタンパク質は、アミノ酸配列の類似性からＲａｓ、Ｒ
ｈｏ、Ｒａｂ、その他の４つのファミリーに大別するこ
とができる。この低分子量Ｇタンパク質は種々の細胞機
能を制御していることが明らかになってきており、例え
ば、Ｒａｓタンパク質は細胞の増殖や分化等を、Ｒｈｏ
タンパク質は細胞の形態変化や細胞接着、細胞運動等を
それぞれ制御していると考えられている。2. Description of the Related Art In vivo, a molecular weight of 2 to 3 having no subunit structure
There are a large group of low molecular weight GTP binding proteins (G proteins). At present, more than 50 members have been found in the superfamily of low molecular weight G proteins, from yeast to mammals. The low-molecular-weight G protein has Ras, R
ho, Rab, and other four families. It has been revealed that this low-molecular-weight G protein controls various cell functions. For example, Ras protein regulates cell growth and differentiation by Rho.
Proteins are thought to control morphological changes of cells, cell adhesion, cell motility, and the like, respectively.
【０００３】このうちＲｈｏタンパク質は、ＧＤＰ／Ｇ
ＴＰ結合能および内在性ＧＴＰａｓｅ活性を示し、リゾ
ホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびある種の成長因子等
のような細胞外シグナルに対する細胞骨格応答に関係し
ているとされている。不活性型であるＧＤＰ結合Ｒｈｏ
タンパク質にある刺激が与えられると、Ｓｍｇ ＧＤ
Ｓ、ＤｂｌやＯｓｔのようなＧＤＰ／ＧＴＰ変換タンパ
ク質の働きによって活性型であるＧＴＰ結合Ｒｈｏタン
パク質（以下、「活性型Ｒｈｏタンパク質」という）に
変換される。そして、この活性型Ｒｈｏタンパク質が標
的タンパク質に作用することによってストレス繊維およ
び接着斑が形成され、細胞接着および細胞運動等が誘導
されると考えられている（実験医学 vol.12,No.8,97-10
2(1994) 、Takai, Y. et al. Trends Biochem. Sci., 2
0, 227-231 (1995) ）。一方、Ｒｈｏタンパク質内在性
ＧＴＰａｓｅにより活性型Ｒｈｏタンパク質はＧＤＰ結
合Ｒｈｏタンパク質に変換される。この内在性ＧＴＰａ
ｓｅの活性を亢進するタンパク質はＧＴＰａｓｅ活性化
タンパク質（ＧＡＰ）（Lamarche, N. & Hall,A. eta
l.,TIG, 10, 436-440 (1994)）と呼ばれている。[0003] Among them, Rho protein is GDP / G
It exhibits TP binding capacity and endogenous GTPase activity and has been implicated in the cytoskeletal response to extracellular signals such as lysophosphatidic acid (LPA) and certain growth factors. GDP-bound Rho that is inactive
When a certain stimulus is given to a protein, Smg GD
By the action of a GDP / GTP converting protein such as S, Dbl or Ost, it is converted into an active GTP-binding Rho protein (hereinafter referred to as “active Rho protein”). It is considered that the activated Rho protein acts on the target protein to form stress fibers and adhesion spots, thereby inducing cell adhesion and cell movement (Experimental Medicine vol.12, No.8, 97-10
2 (1994), Takai, Y. et al. Trends Biochem. Sci., 2
0, 227-231 (1995)). On the other hand, the activated Rho protein is converted to a GDP-bound Rho protein by the Rho protein endogenous GTPase. This endogenous GTPa
GTPase activating protein (GAP) (Lamarche, N. & Hall, A. eta)
l., TIG, 10, 436-440 (1994)).
【０００４】ＲｈｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク
質、ＲｈｏＣタンパク質、Ｒａｃ１タンパク質、Ｒａｃ
２タンパク質、Ｃｄｃ４２タンパク質のようなＲｈｏフ
ァミリーのタンパク質のアミノ酸配列は、お互いに５０
％以上の類似性がある。このＲｈｏファミリーのタンパ
ク質は、リゾフォスファチジル酸（ＬＰＡ）や増殖因子
のような細胞外シグナルに応答して、ストレス繊維（st
ress fiber）やフォーカルコンタクト（focal contact
）の形成を引き起こす反応に関与していると考えられ
ている（A. J. Ridley & A. Hall、Cell,70,389-399 (1
992) ,A. J. Ridley& A. Hall, EMBO J.,1353,2600-261
0(1994)）。また、サブファミリーであるＲｈｏタンパ
ク質は、細胞の形態変化（H.F.Parterson et al., J.Ce
ll Biol.,111,1001-1007 (1990) ）、細胞接着（Morii,
N. et al.,J. Biol.Chem. 267, 20921-20926 (1992) 、
T. Tominaga et al.,J.Cell Biol., 120, 1529-1537(19
93) 、Nusrat, A. et al.,Proc, Natl. Acad. Sci. US
A, 92, 10629-10633 (1995)、Landanna, C. et al., Sc
ience 271, 981-983 (1996)）、細胞運動（K. Takaishi
et al.,Oncogene,9,273-279 (1994)）、細胞質***（cy
tokinesis ）（K. Kishiet al.,J. Cell Biol.,120,118
7-1195(1993) 、I. Mabuchi et al.,Zygote,1,325-331
(1993)）のような細胞骨格の再編成をともなった生理機
能にも関連があると考えられている。更に、Ｒｈｏタン
パク質は、平滑筋収縮（K. Hirata et al.,J. Biol. Ch
em.,267,8719-8722(1992) 、M. Noda et al., FEBS Let
t., 367, 246-250 (1995) 、M. Gong et al.,Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 93,1340〜1345(1996)）、フォスフ
ァチジルイノシトール ３−キナーゼ（ＰＩ３−キナー
ゼ）（J. Zhang et al.,J. Biol. Chem.,268,22251-22
254 (1993)）、フォスファチジルイノシトール ４−リ
ン酸 ５−キナーゼ（ＰＩ ４，５−キナーゼ）（L.
D. Chong et al.,Cell,79,507-513(1994)）やｃ−ｆｏ
ｓの発現（C. S. Hillet al.,Cell,81,1159-1170(1995)
）の制御にも関与していることが示唆されている。[0004] RhoA protein, RhoB protein, RhoC protein, Rac1 protein, Rac
The amino acid sequences of Rho family proteins, such as the two proteins, Cdc42 protein, are 50
% Or more similarity. This Rho family of proteins responds to extracellular signals such as lysophosphatidylic acid (LPA) and growth factors to respond to stress fibers (st
ress fiber and focal contact
(AJ Ridley & A. Hall, Cell, 70, 389-399 (1
992), AJ Ridley & A. Hall, EMBO J., 1353,2600-261
0 (1994)). In addition, the subfamily Rho protein is used for morphological changes of cells (HFParterson et al., J. Ce
ll Biol., 111, 1001-1007 (1990)), cell adhesion (Morii,
N. et al., J. Biol. Chem. 267, 20921-20926 (1992),
T. Tominaga et al., J. Cell Biol., 120, 1529-1537 (19
93), Nusrat, A. et al., Proc, Natl. Acad. Sci. US
A, 92, 10629-10633 (1995), Landanna, C. et al., Sc
ience 271, 981-983 (1996)), cell motility (K. Takaishi
et al., Oncogene, 9, 273-279 (1994)), cytokinesis (cy
tokinesis) (K. Kishiet al., J. Cell Biol., 120, 118
7-1195 (1993), I. Mabuchi et al., Zygote, 1,325-331
(1993)) is also considered to be related to physiological functions accompanied by cytoskeletal rearrangement. Furthermore, the Rho protein has been shown to inhibit smooth muscle contraction (K. Hirata et al., J. Biol.
em., 267, 8719-8722 (1992), M. Noda et al., FEBS Let
t., 367, 246-250 (1995), M. Gong et al., Proc. Nat.
l. Acad. Sci. USA, 93, 1340-1345 (1996)), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-kinase) (J. Zhang et al., J. Biol. Chem., 268, 22251-). twenty two
254 (1993)), phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase (PI 4,5-kinase) (L.
D. Chong et al., Cell, 79, 507-513 (1994)) and c-fo
s expression (CS Hill et al., Cell, 81, 1159-1170 (1995)
) Has been suggested to be involved in the control.
【０００５】また、最近では、アミノ酸配列を一部置換
したＲｈｏタンパク質が細胞内に導入されるとＲａｓ依
存的な腫瘍形成が抑制されること等が見出され、Ｒｈｏ
タンパク質がＲａｓによる細胞の形質転換、すなわち腫
瘍形成、において重要な役割を果たしていることが明ら
かにされている（G.C.Prendergast et al.,Oncogene,1
0,2289-2296(1995)、Khosravi-Far,R.,et al.,Mol.Cel
l.Biol.,15,6443-6453(1995)、R.Qiu et al.、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,92,11781-11785(1995) 、およびLebowi
tz,P.et al.,Mol.Cell.Biol.,15,6613-6622(1995) ）。
また、Ｒｈｏタンパク質のＧＤＰ／ＧＴＰ変換タンパク
質が変異すると、細胞が形質転換することが明らかにさ
れている（Collard,J.,Int.J.Oncol.,8,131-138(1996)
）、Hart,M. et al.,J.Biol Chem.,269,62-65 (199
4)、Horii,Y. et al., EMBO J., 13,4776-4786 (1994)
）。更に、Ｒｈｏタンパク質はガン細胞の浸潤、すな
わちガン転移に関与していることが明らかにされている
（Yoshioka,K.et al.,FEBS Lett.,372,25 〜28 (1995)
）。ガン細胞の浸潤には、ガン細胞の細胞接着能の変
化が密接に関連しているが、Ｒｈｏタンパク質は細胞接
着に関与することが明らかにされている（前掲 Morii,
N.et al.(1992)、Tominaga,T. et al.(1993)、Nusrat,
A.et al.(1995) 、Landanna,C.et al.(1996) ）。[0005] Recently, it has been discovered that when a Rho protein partially substituted with an amino acid sequence is introduced into cells, Ras-dependent tumor formation is suppressed.
Proteins have been shown to play an important role in Ras cell transformation, ie, tumorigenesis (GC Prendergast et al., Oncogene, 1).
0,2289-2296 (1995), Khosravi-Far, R., et al., Mol. Cel
l. Biol., 15,6443-6453 (1995), R. Qiu et al., Proc. Nat.
l. Acad. Sci. USA, 92, 11781-11785 (1995), and Lebowi
tz, P. et al., Mol. Cell. Biol., 15, 6613-6622 (1995)).
In addition, it has been shown that cells are transformed when the GDP / GTP conversion protein of the Rho protein is mutated (Collard, J., Int. J. Oncol., 8, 131-138 (1996)).
), Hart, M. et al., J. Biol Chem., 269, 62-65 (199
4), Horii, Y. et al., EMBO J., 13,4776-4786 (1994)
). Furthermore, it has been revealed that the Rho protein is involved in cancer cell invasion, that is, cancer metastasis (Yoshioka, K. et al., FEBS Lett., 372, 25-28 (1995)).
). Changes in cell adhesion of cancer cells are closely related to cancer cell invasion, but Rho protein has been shown to be involved in cell adhesion (see Morii, supra).
N. et al. (1992), Tominaga, T. et al. (1993), Nusrat,
A. et al. (1995), Landanna, C. et al. (1996)).
【０００６】ところで、タイプ１プロテインフォスファ
ターゼ（ＰＰ１）はフォスファターゼの中でも最もよく
研究されているものの一つである。ＰＰ１は触媒サブユ
ニット（ＰＰ１ｃ）と調節サブユニットとの複合体で存
在し、種々の調節サブユニットによりその機能や活性が
制御されていることが最近の研究で明らかになってき
た。[0006] By the way, type 1 protein phosphatase (PP1) is one of the best studied phosphatases. PP1 exists as a complex of a catalytic subunit (PP1c) and a regulatory subunit, and recent studies have revealed that its function and activity are controlled by various regulatory subunits.
【０００７】ＰＰ１は細胞内ではＰＰ１ｃに調節サブユ
ニットが結合したホロ酵素の形で存在している。ＰＰ１
ｃと結合する調節サブユニットの違いによって各種ホロ
酵素に特徴的な基質特異性や活性調節機構が発現されて
いると考えられている。[0007] PP1 exists in cells in the form of a holoenzyme in which a regulatory subunit is bound to PP1c. PP1
It is thought that the substrate specificity and activity regulation mechanism characteristic of various holoenzymes are expressed by the difference in the regulatory subunit that binds to c.
【０００８】ホロ酵素として、ＰＰ１Ｓ、ＰＰ１Ｇ、Ｐ
Ｐ１Ｅ、ＰＰ１Ｍ、ＰＰ１Ｎが知られており、これらは
それぞれ細胞質可溶画分、グリコーゲン顆粒、筋小胞体
膜、筋原繊維、および核に存在している（伊藤正明，市
川和人，中野 赳，細胞工学，16,187-193(1997)）。As holoenzymes, PP1S, PP1G, P
P1E, PP1M, and PP1N are known, which are present in the cytosolic soluble fraction, glycogen granules, sarcoplasmic reticulum membrane, myofibrils, and nucleus, respectively (Masaaki Ito, Kazuto Ichikawa, Takeshi Nakano, Cell Engineering, 16,187-193 (1997)).
【０００９】このうちＰＰ１Ｍはミオシン軽鎖などの脱
リン酸化反応を触媒するＰＰ１ホロ酵素で、ＰＰ１ｃδ
と２つの調節サブユニットとからなる。この２つの調節
サブユニットの電気泳動上の分子量はニワトリ由来で１
３０ｋＤａ（Ｍ１３０）と２０ｋＤａ（Ｍ２０）である
（伊藤正明，中野 赳，生化学，68,147-151(1996)）。Among them, PP1M is a PP1 holoenzyme that catalyzes a dephosphorylation reaction of myosin light chain and the like, and PP1cδ
And two regulatory subunits. The molecular weight of the two regulatory subunits on electrophoresis was 1 from chicken.
They are 30 kDa (M130) and 20 kDa (M20) (Masaaki Ito, Takeshi Nakano, Biochemistry, 68, 147-151 (1996)).
【００１０】ミオシン軽鎖フォスファターゼは、タイプ
１プロテインフォスファターゼ（ＰＰ１）の一種である
ことが知られている。ミオシン軽鎖フォスファターゼは
ミオシン結合サブユニットと触媒サブユニットとからな
り、このミオシン結合サブユニットがリン酸化ミオシン
へ直接結合することによって、フォスファターゼ触媒サ
ブユニットのミオシンに対するフォスファターゼ活性を
増強すると考えられている（Ichikawa,K. et al., Bioc
hemistry,35,6313-6320(1996)）。[0010] Myosin light chain phosphatase is known to be a type of type 1 protein phosphatase (PP1). Myosin light chain phosphatase is composed of a myosin binding subunit and a catalytic subunit, and it is believed that the myosin binding subunit directly binds to phosphorylated myosin, thereby enhancing the phosphatase activity of the phosphatase catalytic subunit for myosin ( Ichikawa, K. et al., Bioc
hemistry, 35, 6313-6320 (1996)).
【００１１】このミオシン結合サブユニットは上記のＭ
１３０に、触媒サブユニットは上記のＰＰ１ｃδにそれ
ぞれ対応すると考えられている（Shimizu, H. et al.,
J. Biol. Chem. 269: 30407-30411(1994); Chen, Y. H.
et al., FEBS Lett. 356:51-55(1994)）。This myosin-binding subunit has the above-mentioned M
At 130, the catalytic subunits are thought to correspond to PP1cδ above (Shimizu, H. et al.,
J. Biol. Chem. 269: 30407-30411 (1994); Chen, YH
et al., FEBS Lett. 356: 51-55 (1994)).
【００１２】このミオシン結合サブユニットのアミノ酸
配列がニワトリおよびラット由来のｃＤＮＡから推定さ
れている（Shimizu,H.et al.,J.Biol.Chem.269,30407-3
0411(1994)、Chen,Y.H.et al.,FEBS Lett.356,51-55 (1
994)）。The amino acid sequence of this myosin-binding subunit has been deduced from chicken and rat-derived cDNAs (Shimizu, H. et al., J. Biol. Chem. 269, 30407-3).
0411 (1994), Chen, YH et al., FEBS Lett. 356, 51-55 (1
994)).
【００１３】しかしながら、ヒト由来のミオシン結合サ
ブユニットは本発明者らが知る限り報告されていない。However, no human-derived myosin-binding subunit has been reported as far as the present inventors know.
【００１４】[0014]
【発明の概要】本発明者らは、今般、ヒトミオシン結合
サブユニット（以下「ＭＢＳ」ということがある）のｃ
ＤＮＡ配列とアミノ酸配列を決定し、ＧＳＴとの組み換
え融合タンパク質を作製した。SUMMARY OF THE INVENTION The present inventors have now investigated the c-unit of human myosin binding subunit (hereinafter sometimes referred to as "MBS").
The DNA sequence and the amino acid sequence were determined, and a recombinant fusion protein with GST was prepared.
【００１５】また、本発明者らは、抗ＭＢＳ抗体による
ウェスタンブロティングおよびｃＤＮＡ断片によるノー
ザンブロティングの結果、ヒトＭＢＳは、ヒト臓器にお
いて遍在的に発現していること、ヒトＭＢＳはミオシン
軽鎖フォスファターゼの触媒サブユニットの調節サブユ
ニットとして働くこと、ヒトＭＢＳは活性型Ｒｈｏタン
パク質と結合することを見いだした。The present inventors have also found that, as a result of Western blotting with an anti-MBS antibody and Northern blotting with a cDNA fragment, human MBS is ubiquitously expressed in human organs, and human MBS is expressed in myosin light. They have been found to act as regulatory subunits of the catalytic subunit of chain phosphatase, and that human MBS binds to the active Rho protein.
【００１６】更に、ヒトＭＢＳ遺伝子はヒト１２番染色
体のｑ１５−２１．２に存在すること、腫瘍等の疾患に
関連すること等をも見いだした。Furthermore, it has been found that the human MBS gene is present at q15-21.2 of human chromosome 12 and is associated with diseases such as tumors.
【００１７】従って、本発明は、ヒトＭＢＳタンパク質
のアミノ酸配列を有するタンパク質およびこれをコード
する塩基配列、該塩基配列を含むベクター、該ベクター
によって形質転換された宿主、該宿主を培養することを
含むヒトＭＢＳタンパク質の製造法、ヒトＭＢＳタンパ
ク質と活性型Ｒｈｏタンパク質との結合を阻害する物質
のスクリーニング法、ミオシン軽鎖フォスファターゼの
触媒サブユニットのフォスファターゼ活性の亢進を阻害
する物質のスクリーニング法、およびヒトＭＢＳタンパ
ク質に対する抗体を提供することをその目的とする。Accordingly, the present invention includes a protein having the amino acid sequence of human MBS protein, a nucleotide sequence encoding the same, a vector containing the nucleotide sequence, a host transformed with the vector, and culturing the host. Method for producing human MBS protein, screening method for substance that inhibits binding between human MBS protein and active Rho protein, method for screening substance that inhibits enhancement of phosphatase activity of catalytic subunit of myosin light chain phosphatase, and human MBS It is an object to provide an antibody against the protein.
【００１８】また、本発明は、前記塩基配列の部分断片
を含むプローブ、および該プローブを含む診断薬の提供
をその目的とする。Another object of the present invention is to provide a probe containing the partial fragment of the nucleotide sequence and a diagnostic agent containing the probe.
【００１９】そして、本発明によるタンパク質は、下記
の性質を有するものである； （１）活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する、（２）
ミオシン軽鎖フォスファターゼの触媒サブユニットのフ
ォスファターゼ活性を亢進する、（３）その遺伝子がヒ
ト染色体１２ｑ１５−２１．２に位置する、（４）分子
量がＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約１３０〜１３５ｋ
Ｄａである。The protein according to the present invention has the following properties: (1) It has an active Rho protein binding ability, (2)
Enhances the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase, (3) its gene is located on human chromosome 12q15-21.2, (4) its molecular weight is about 130-135 k as measured by SDS-PAGE
Da.
【００２０】[0020]
【発明の具体的な説明】定義 本発明において、「アミノ酸」とは、光学異性体、すな
わちＬ体およびＤ体、のいずれをも含む意味で用いられ
るものとする。従って、本発明において「ペプチド」と
は、Ｌ体のアミノ酸のみによって構成されているペプチ
ドだけでなく、Ｄ体のアミノ酸を一部または全部含むペ
プチドをも意味するものとする。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Definitions In the present invention, the term "amino acid" is used to include both optical isomers, that is, both L-form and D-form. Therefore, in the present invention, the term “peptide” means not only a peptide composed of only L-form amino acids but also a peptide containing some or all of D-form amino acids.
【００２１】また、本発明において、「アミノ酸」と
は、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸
のみならず、それら以外のα−アミノ酸、並びにβ−、
γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等を含む意
味で用いられるものとする。従って、下記のようにペプ
チドにおいて置換されるかまたはペプチド中に挿入され
るアミノ酸としては、天然のタンパク質を構成する２０
種のα−アミノ酸だけに限定されることはなく、それら
以外のα−アミノ酸並びにβ−、γ−、δ−アミノ酸お
よび非天然のアミノ酸等であってもよい。このようなβ
−、γ−またはδ−アミノ酸としては、β−アラニン、
γ−アミノ酪酸あるいはオルニチンが挙げられ、また天
然タンパク質を構成するもの以外のアミノ酸あるいは非
天然のアミノ酸としては、３，４−ジヒドロキシフェニ
ルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルグリシ
ン、１，２，３，４−テトラハイドロイソキノリン−３
−カルボン酸あるいはニペコチン酸等が挙げられる。In the present invention, the term "amino acid" means not only 20 kinds of α-amino acids constituting natural proteins, but also other α-amino acids, β-,
γ- and δ-amino acids, unnatural amino acids and the like are used. Thus, amino acids that are substituted in a peptide or inserted into a peptide as described below include the 20
It is not limited only to species α-amino acids, but may be other α-amino acids and β-, γ-, δ-amino acids and unnatural amino acids. Such β
-, Γ- or δ-amino acids, β-alanine,
γ-aminobutyric acid or ornithine; and amino acids other than those constituting natural proteins or unnatural amino acids include 3,4-dihydroxyphenylalanine, phenylglycine, cyclohexylglycine, 1,2,3,4-tetraethyl Hydroisoquinoline-3
-Carboxylic acid or nipecotic acid.
【００２２】また、本明細書において「本発明によるタ
ンパク質」というときは、その誘導体を含む意味で用い
られるものとする。[0022] In the present specification, the term "protein according to the present invention" is used to include its derivatives.
【００２３】更にまた、本明細書において「塩基配列」
とは、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列のいずれをも意味す
るものとする。Furthermore, in the present specification, "base sequence"
Means both the DNA sequence and the RNA sequence.
【００２４】タンパク質 本発明において、「ミオシン軽鎖ホスファターゼの触媒
サブユニット」はＰＰ１ｃδ（実施例１６参照）である
ことができる。 Protein In the present invention, the “catalytic subunit of myosin light chain phosphatase” can be PP1cδ (see Example 16).
【００２５】本発明において、「活性型Ｒｈｏタンパク
質結合能を有するタンパク質」とは、当業者により活性
型Ｒｈｏタンパク質との結合が認められたと評価される
タンパク質をいい、例えば、実施例１１の酵母ツーハイ
ブリッドシステムと同様の条件において実験した場合に
活性型Ｒｈｏタンパク質との結合が認められたと評価さ
れるタンパク質を意味するものとする。In the present invention, the term "protein having the ability to bind to active Rho protein" refers to a protein that is evaluated by those skilled in the art to have binding to active Rho protein. It means a protein that is evaluated to have been found to bind to the active Rho protein when tested under the same conditions as in the hybrid system.
【００２６】ここで、Ｒｈｏタンパク質としては、Ｒｈ
ｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク質、ＲｈｏＣタンパ
ク質、またはＲｈｏＧタンパク質が挙げられる。Here, the Rho protein includes Rh
oA, RhoB, RhoC, or RhoG proteins.
【００２７】また、本明細書においてＲｈｏタンパク質
は、Ｒｈｏタンパク質と本発明によるタンパク質との結
合が実質的に損われないように改変されたＲｈｏタンパ
ク質をも含むものとする。このような改変Ｒｈｏタンパ
ク質としては、１４番目のアミノ酸をバリンで置換した
ＲｈｏＡ変異体（ＲｈｏＡVal14 ）が挙げられる。[0027] In the present specification, the Rho protein also includes a Rho protein modified so that the binding between the Rho protein and the protein according to the present invention is not substantially impaired. Such a modified Rho protein includes a RhoA mutant in which the 14th amino acid is substituted with valine (RhoA Val14 ).
【００２８】本発明によるタンパク質は、Ｒｈｏタンパ
ク質結合領域に加えて、アンキリンリピート構造（配列
番号３の３９〜２９５番のアミノ酸配列）、およびロイ
シンジッパー構造（配列番号３の９３５〜１０３０番の
アミノ酸配列）を有する（実施例１０（２））。The protein according to the present invention comprises, in addition to the Rho protein binding region, an ankyrin repeat structure (amino acids 39 to 295 of SEQ ID NO: 3) and a leucine zipper structure (amino acids 935 to 1030 of SEQ ID NO: 3). (Example 10 (2)).
【００２９】また、本発明によるタンパク質はヒトの臓
器に遍在的（ubiquitous）に発現しているという特徴を
有する（実施例１４および１５）。Further, the protein according to the present invention is characterized in that it is expressed ubiquitously in human organs (Examples 14 and 15).
【００３０】本発明において、「ミオシン軽鎖ホスファ
ターゼの触媒サブユニットのホスファターゼ活性を亢進
するタンパク質」とは、当業者によりミオシン軽鎖ホス
ファターゼの触媒サブユニットのホスファターゼ活性を
亢進することが認められたと評価されるタンパク質をい
い、例えば、実施例１６と同様の条件において実験した
場合にミオシン軽鎖ホスファターゼの触媒サブユニット
のホスファターゼ活性を亢進することが認められたと評
価されるタンパク質を意味するものとする。In the present invention, "a protein that enhances the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase" is defined as a protein that enhances the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase by those skilled in the art. For example, a protein evaluated to have been found to enhance the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase when tested under the same conditions as in Example 16.
【００３１】本発明によれば、また、下記のアミノ酸配
列を含むタンパク質が提供される： （ａ）配列番号３のアミノ酸配列、または（ｂ）１以上
のアミノ酸が付加および／または挿入され、および／ま
たは１以上のアミノ酸が置換および／または欠失された
配列番号３のアミノ酸配列であって、活性型Ｒｈｏタン
パク質結合能を有し、かつミオシン軽鎖ホスファターゼ
の触媒サブユニットのホスファターゼ活性を亢進するア
ミノ酸配列。According to the present invention there is also provided a protein comprising the following amino acid sequence: (a) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or (b) one or more amino acids have been added and / or inserted, and An amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in which one or more amino acids have been substituted and / or deleted, which has an active Rho protein binding ability and enhances the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase. Amino acid sequence.
【００３２】ここにいう付加、挿入 、置換、および欠
失とは、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
のＲｈｏタンパク質結合能およびミオシン軽鎖ホスファ
ターゼの触媒サブユニットのホスファターゼ活性を亢進
する能力を実質的に損なわないようなものをいう。The terms "addition, insertion, substitution and deletion" as used herein refer to the ability of a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 to bind to Rho protein and to enhance the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase. Refers to something that does not impair.
【００３３】配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパ
ク質の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約１３
０〜１３５ｋＤａである。The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 was about 13 as measured by SDS-PAGE.
0 to 135 kDa.
【００３４】本明細書において、「タンパク質の誘導
体」とは、タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ
基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全
部、および／またはペプチドのカルボキシル末端（Ｃ末
端）のカルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカルボ
キシル基の一部もしくは全部、および／または、ペプチ
ドの各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基
以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミド基
等）の一部もしくは全部が、適当な他の置換基によって
修飾を受けたものをいう。適当な他の置換基による修飾
は、例えば、ペプチド中に存在する官能基の保護、安全
性ならびに組織移行性の向上、あるいは活性の増強等を
目的として行われる。As used herein, the term “protein derivative” refers to a part or all of an amino group at the amino terminus (N-terminus) of a protein or a side chain of each amino acid, and / or a carboxyl terminus of a peptide ( A part or all of the carboxyl group at the C-terminus or the side chain of each amino acid and / or a functional group other than the amino group and the carboxyl group of the side chain of each amino acid of the peptide (for example, hydrogen group, thiol group) , An amide group, etc.) are partially or entirely modified with other appropriate substituents. Modification with an appropriate other substituent is performed, for example, for the purpose of protecting a functional group present in the peptide, improving safety and tissue transferability, or enhancing activity.
【００３５】タンパク質の誘導体としては、具体的に
は、（１）タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ
基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全
部の水素原子が、置換または非置換のアルキル基（直
鎖、分岐鎖または環状であってもよい）（例えば、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブ
チル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロプロピル基、
シクロヘキシル基、ベンジル基）、置換または非置換の
アシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基、カプロイ
ル基、シクロヘキシルカルボニル基、ベンゾイル基、フ
タロイル基、トシル基、ニコチノイル基、ピペリジンカ
ルボニル基）、ウレタン型保護基（例えば、ｐ−ニトロ
ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオ
キシカルボニル基、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシ
カルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基）またはウレ
ア型置換基（例えば、メチルアミノカルボニル基、フェ
ニルカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル
基）等によって置換されたもの、並びに（２）タンパク
質のカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基また
は各アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全
部が、エステル型の修飾を受けているもの（例えば、そ
の水素原子がメチル、エチル、イソプロピル、シクロヘ
キシル、フェニル、ベンジル、ｔ−ブチル、４−ピコリ
ルにより置換されたもの）、アミド型の修飾を受けてい
るもの（例えば、非置換アミド、Ｃ１−Ｃ６アルキルア
ミド（例えば、メチルアミド、エチルアミド、イソプロ
ピルアミド）を形成しているもの、並びに（３）タンパ
ク質の各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル
基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミノ
基等）の一部もしくは全部が、上述のアミノ基と同様の
置換基あるいはトリチル基などで修飾されたもの等が挙
げられる。As the protein derivatives, specifically, (1) the amino group at the amino terminus (N-terminus) of the protein or part or all of the hydrogen atoms in the amino group on the side chain of each amino acid is substituted or unsubstituted. Substituted alkyl groups (which may be linear, branched or cyclic) (e.g., methyl, ethyl, propyl, isopropyl, isobutyl, butyl, t-butyl, cyclopropyl,
Cyclohexyl group, benzyl group), substituted or unsubstituted acyl group (for example, formyl group, acetyl group, caproyl group, cyclohexylcarbonyl group, benzoyl group, phthaloyl group, tosyl group, nicotinoyl group, piperidinecarbonyl group), urethane-type protection Group (for example, p-nitrobenzyloxycarbonyl group, p-methoxybenzyloxycarbonyl group, p-biphenylisopropyloxycarbonyl group, t-butoxycarbonyl group) or a urea-type substituent (for example, methylaminocarbonyl group, phenylcarbonyl group) , Cyclohexylaminocarbonyl group), and (2) a carboxyl group at the carboxyl terminal (C-terminal) of the protein or part or all of the carboxyl group at the side chain of each amino acid is an ester type Decorated (e.g., those whose hydrogen atoms have been replaced by methyl, ethyl, isopropyl, cyclohexyl, phenyl, benzyl, t-butyl, 4-picolyl), those which have been modified by amide type (e.g., , Unsubstituted amides, those forming C1-C6 alkylamides (eg, methylamide, ethylamide, isopropylamide), and (3) functional groups other than the amino group and carboxyl group of the side chain of each amino acid of the protein (eg, , A hydrogen group, a thiol group, an amino group, etc.) in which a part or the whole is modified with the same substituent as the above-mentioned amino group or a trityl group.
【００３６】本発明によるタンパク質は、例えば、配列
番号４のｃＤＮＡ配列を宿主において発現させることに
よって得ることができる（実施例１２）。配列番号４の
配列の取得および宿主における発現は後述する。The protein according to the present invention can be obtained, for example, by expressing the cDNA sequence of SEQ ID NO: 4 in a host (Example 12). Acquisition of the sequence of SEQ ID NO: 4 and expression in the host will be described later.
【００３７】本発明によれば、１以上のアミノ酸が付加
および／または挿入され、および／または１以上のアミ
ノ酸が置換および／または欠失された配列番号３のアミ
ノ酸配列であって、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有
するアミノ酸配列を含むタンパク質またはその誘導体が
提供される。According to the present invention, there is provided the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in which one or more amino acids are added and / or inserted, and / or one or more amino acids are substituted and / or deleted, wherein the active form is Rho. A protein comprising an amino acid sequence having protein binding ability or a derivative thereof is provided.
【００３８】ここにいう付加、挿入 、置換、および欠
失とは、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
の活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を実質的に損なわない
ようなものをいう。The terms "addition, insertion, substitution, and deletion" as used herein refer to those which do not substantially impair the ability of the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 to bind to the active Rho protein.
【００３９】欠失されたアミノ酸配列の例としては、配
列番号３の７５４〜１０３０番のアミノ酸配列が挙げら
れる。An example of the deleted amino acid sequence is the amino acid sequence at positions 754 to 1030 of SEQ ID NO: 3.
【００４０】本発明によれば、また、１以上のアミノ酸
が付加および／または挿入され、および／または１以上
のアミノ酸が置換および／または欠失された配列番号３
のアミノ酸配列であって、ミオシン軽鎖ホスファターゼ
の触媒サブユニットのホスファターゼ活性を亢進するア
ミノ酸配列を含むタンパク質またはその誘導体が提供さ
れる。According to the present invention, SEQ ID NO: 3 wherein one or more amino acids have been added and / or inserted and / or one or more amino acids have been substituted and / or deleted
Or a derivative thereof comprising an amino acid sequence that enhances the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase.
【００４１】ここにいう付加、挿入 、置換、および欠
失とは、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
のミオシン軽鎖ホスファターゼの触媒サブユニットのホ
スファターゼ活性を亢進する能力を実質的に損なわない
ようなものをいう。The terms "addition, insertion, substitution and deletion" as used herein do not substantially impair the ability of the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 to enhance the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase. What is it?
【００４２】欠失されたアミノ酸配列の例としては、配
列番号３の１〜６８９番のアミノ酸配列が挙げられる。Examples of the deleted amino acid sequence include the amino acid sequences 1 to 689 of SEQ ID NO: 3.
【００４３】後記するように、本発明によるタンパク質
は、種々の腫瘍に関与することが示された。従って、本
発明によるタンパク質は、これらの疾患の機構解明に有
用である。As described below, the protein according to the present invention has been shown to be involved in various tumors. Therefore, the protein according to the present invention is useful for elucidating the mechanism of these diseases.
【００４４】本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏ
タンパク質結合能とミオシン軽鎖ホスファターゼの触媒
サブユニットのホスファターゼ活性亢進能とを、両方ま
たはいずれか有する。また、Ｒｈｏタンパク質は心筋細
胞の肥大をはじめとして、平滑筋の収縮、腫瘍の形成、
転移、細胞形態、細胞運動、細胞接着、細胞質***等の
細胞の機能発現に密接にかかわっている（Sor,V.P. et
al., J.Biol.Chem.,271,31185-31190(1996),Noda,M. et
al.,FEBS Lett.,367,246-250(1995)、Symons,M.,Curre
nt Opinion in Biotechnology,6,668-674(1995)、Narum
iya,S.,J.Biochem.129,215-228(1996)）。従って、本発
明によるタンパク質は、心筋の肥大、収縮、拡張等の機
構解明にも有用である。The protein according to the present invention is an active Rho
It has both or either protein binding ability and ability to enhance phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase. In addition, Rho protein, including hypertrophy of cardiomyocytes, smooth muscle contraction, tumor formation,
It is closely related to the expression of cell functions such as metastasis, cell morphology, cell motility, cell adhesion, and cytokinesis (Sor, VP et
al., J. Biol. Chem., 271, 31185-31190 (1996), Noda, M. et.
al., FEBS Lett., 367, 246-250 (1995), Symons, M., Curre.
nt Opinion in Biotechnology, 6,668-674 (1995), Narum
iya, S., J. Biochem. 129, 215-228 (1996)). Therefore, the protein according to the present invention is also useful for elucidating the mechanism of myocardial hypertrophy, contraction, expansion and the like.
【００４５】ヒトＭＢＳ遺伝子座 本発明者らは、後記する実施例において、ＦＩＳＨ解析
によりヒトＭＢＳ遺伝子を第１２番染色体の長腕q15-2
1.2にマップした。また、radiation hybrid法によっ
て、ヒトＭＢＳ遺伝子を、q15-21に存在するマーカーCH
LC.GATA65A12より約3.7 cRテロメア寄りにマップした。 Human MBS locus In the examples described below, the present inventors analyzed the human MBS gene by the FISH analysis to convert the long arm q15-2 of chromosome 12.
Mapped to 1.2. In addition, by the radiation hybrid method, the human MBS gene was replaced with the marker CH
The map was closer to the telomere by about 3.7 cR than LC.GATA65A12.
【００４６】ヒト染色体１２番染色体長腕は、様々な種
類（特に平滑筋腫や脂肪腫）の腫瘍で変異または再構成
（増幅、転座、欠失およびこれらが組み合わさった再構
成）が認められる（Heim, S. & Mitelman, F., Recent
Adv. Histopathl., 15,37-66(1992)）。増幅に関して
は、例えばある種の脂肪肉腫（liposarcoma）では12q14
-21の領域（増幅の最小共通領域は12q15）が増幅してい
る（Szymanska, J. etal.Genes Chromosomes Cancer, 1
5, 89-94 (1996)）。また、atypical lipomatous tumer
(ALT)においても12q15-q24の増幅が認められる（Manda
hl, N. et al.,Int. J. Cancer,67,632-635(1996)）。
また、大腸癌の肝転移細胞では、12q15の増加が認めら
れる（Yeatman, T. et al. Clin. Exp. Metastasis,1
4, 246-252(1996)）。再構成としては、子宮平滑筋腫
（leiomyoma）、脂肪腫（lipoma）、唾液腺腫などで12q
15において転座が認められる（Wanschura, S. et al.,
GenesChromosomes Cancer,14, 68-70 (1995)）。ある種
の子宮内膜のポリープ（endometrial polyp）では12q13
-15において転座や欠失を含む複雑な再構成が認められ
る（Wanschura, B. et al., Cancer Genet.Cytogenet,9
0, 88-90(1996)）。The long arm of human chromosome 12 is mutated or rearranged (amplification, translocation, deletion, or a combination thereof) in various types of tumors (particularly leiomyomas and lipomas). (Heim, S. & Mitelman, F., Recent
Adv. Histopathl., 15, 37-66 (1992)). With respect to amplification, for example, 12q14 in certain liposarcomas
Region (the minimum common region of amplification is 12q15) is amplified (Szymanska, J. etal. Genes Chromosomes Cancer, 1
5, 89-94 (1996)). Also, atypical lipomatous tumer
(ALT) also shows 12q15-q24 amplification (Manda
hl, N. et al., Int. J. Cancer, 67, 632-635 (1996)).
In liver metastasis cells of colorectal cancer, an increase of 12q15 is observed (Yeatman, T. et al. Clin. Exp. Metastasis, 1
4, 246-252 (1996)). Reconstruction includes 12q for leiomyoma, lipoma, and salivary adenoma of the uterus.
15, a translocation is observed (Wanschura, S. et al.,
Genes Chromosomes Cancer, 14, 68-70 (1995)). 12q13 in certain endometrial polyps
-15 shows a complex rearrangement including translocations and deletions (Wanschura, B. et al., Cancer Genet. Cytogenet, 9
0, 88-90 (1996)).
【００４７】以上のように、ヒトＭＢＳ遺伝子を含む領
域が種々の腫瘍で変異または再構成されている。As described above, the region containing the human MBS gene is mutated or reconstituted in various tumors.
【００４８】従って、後記の本発明による塩基配列およ
びプローブは、上記疾患の診断に有用である。Accordingly, the nucleotide sequences and probes according to the present invention described below are useful for diagnosis of the above-mentioned diseases.
【００４９】塩基配列 本発明によれば、本発明によるタンパク質をコードする
塩基配列が提供される。この塩基配列の典型的配列は、
配列番号４のＤＮＡ配列の一部または全部を有するもの
である。 Nucleotide Sequence According to the present invention, a nucleotide sequence encoding the protein of the present invention is provided. A typical sequence of this nucleotide sequence is
It has part or all of the DNA sequence of SEQ ID NO: 4.
【００５０】配列番号４のＤＮＡ配列は、ヒト肺由来の
ｃＤＮＡライブラリーから得られたものである。配列番
号４の２４３〜３３３２番の配列は、ＭＢＳのオープン
リーディングフレームに相当する。The DNA sequence of SEQ ID NO: 4 was obtained from a cDNA library derived from human lung. Sequences 243-3332 of SEQ ID NO: 4 correspond to the open reading frame of MBS.
【００５１】本発明によるタンパク質のアミノ酸配列が
与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定ま
り、配列番号３のアミノ酸配列をコードする種々の塩基
配列を選択することができる。従って、本発明によるタ
ンパク質をコードする塩基配列とは、配列番号３のＤＮ
Ａ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコー
ドするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮ
Ａ配列として有する配列をも意味するものとし、更にこ
れらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。Given the amino acid sequence of the protein according to the present invention, the nucleotide sequence encoding it is easily determined, and various nucleotide sequences encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 can be selected. Therefore, the nucleotide sequence encoding the protein according to the present invention is the DN sequence of SEQ ID NO: 3.
A DNA sequence encoding the same amino acid in addition to part or all of the A sequence
A sequence having the A sequence is also meant, and an RNA sequence corresponding thereto is also included.
【００５２】本発明による塩基配列は、天然由来のもの
であっても、全合成したものであってもよい。また、天
然物由来のものの一部を利用して合成を行ったものであ
ってもよい。The base sequence according to the present invention may be of natural origin or may be totally synthesized. In addition, a product synthesized using a part of a product derived from a natural product may be used.
【００５３】塩基配列は、例えば、ヒト由来の市販のｃ
ＤＮＡライブラリーの塩基配列を鋳型とし、オープンリ
ーディングフレームを挟むような適当なプライマーを用
いて特定領域を増幅することによって得ることができ
る。また、染色体ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラ
リーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例え
ば部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なＤ
ＮＡプローブを用いてスクリーニングを行う方法、等に
よって得ることもできる。The nucleotide sequence is, for example, a commercially available c
It can be obtained by amplifying a specific region using a base sequence of a DNA library as a template and appropriate primers sandwiching the open reading frame. Also, a method commonly used in the field of genetic engineering from a chromosome library or a cDNA library, for example, an appropriate D prepared based on partial amino acid sequence information.
It can also be obtained by a screening method using an NA probe, and the like.
【００５４】塩基配列が天然由来のものである場合、そ
の起源は特に限定されず、ヒトを含むホ乳類由来のもの
であっても、それ以外を由来とするものであってもよ
い。When the nucleotide sequence is of natural origin, its origin is not particularly limited, and it may be derived from mammals including humans, or may be derived from other sources.
【００５５】本発明によるタンパク質をコードする塩基
配列の例は、配列番号４の塩基配列および配列番号４の
ＤＮＡ配列の一部（例えば、配列番号４の２４３〜３３
３２番（オープンリーディングフレーム）、２４３〜２
３９０番（１〜６８９番のアミノ酸配列）、および２５
０２〜３３３２番（７５４〜１０３０番のアミノ酸配
列）のＤＮＡ配列）である。Examples of the nucleotide sequence encoding the protein according to the present invention include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and a part of the DNA sequence of SEQ ID NO: 4 (for example, 243 to 33 of SEQ ID NO: 4).
No. 32 (Open reading frame), 243-2
Nos. 390 (amino acid sequence of positions 1 to 689), and 25
Nos. 02 to 3332 (the DNA sequence of amino acids 754 to 1030).
【００５６】ベクターおよび宿主細胞 本発明によれば、前記の本発明による塩基配列を、宿主
細胞内で複製可能でかつその塩基配列がコードするタン
パク質を発現可能な状態で含んでなるベクターが提供さ
れる。更に、本発明によれば、このベクターによって形
質転換された宿主細胞が提供される。この宿主−ベクタ
ー系は特に限定されず、また、他のタンパク質との融合
タンパク質発現系などを用いることができる。融合タン
パク質発現系としては、ＭＢＰ（マルトース結合タンパ
ク質）、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラー
ゼ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ポリヒスチジン、ｍｙ
ｃ、Ｆａｓ等を用いたものが挙げられる。 Vector and Host Cell According to the present invention, there is provided a vector comprising the above-described nucleotide sequence of the present invention in a state capable of replicating in a host cell and expressing a protein encoded by the nucleotide sequence. You. Further, according to the present invention, there is provided a host cell transformed with the vector. The host-vector system is not particularly limited, and a fusion protein expression system with another protein can be used. Examples of fusion protein expression systems include MBP (maltose binding protein), GST (glutathione S transferase), HA (hemagglutinin), polyhistidine, my
c, Fas and the like.
【００５７】ベクターとしては、プラスミドベクター
（例えば、原核細胞、酵母、昆虫細胞動物細胞等での発
現ベクター）、ウイルスベクター（例えば、レトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウ
イルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイ
ウイルスベクター、ＨＩＶベクター、バキュロウイルス
ベクター）、リポソームベクター（例えば、カチオニッ
クリポソームベクター）等が挙げられる。Examples of the vector include a plasmid vector (eg, an expression vector in prokaryotic cells, yeast, insect cells, animal cells, etc.), a viral vector (eg, a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a herpes virus vector, Sendai virus vector, HIV vector, baculovirus vector), liposome vector (eg, cationic liposome vector) and the like.
【００５８】本発明によるベクターは、これを実際に宿
主細胞に導入して所望のタンパク質を発現させるために
は、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を制
御する配列（例えば、プロモーター配列、ターミネータ
ー配列、エンハンサー配列）や宿主細胞を選択するため
の遺伝子マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、
カナマイシン耐性遺伝子）等を含んでいてもよい。ま
た、このベクターは、本発明による塩基配列を反復した
形で（例えば、タンデムで）含んでいてもよい。これら
は常法に従いベクターに存在させてよく、このベクター
による宿主細胞の形質転換の方法も、この分野で慣用さ
れているものを用いることができる。In order to actually introduce the vector into a host cell to express a desired protein, the vector according to the present invention may contain, in addition to the nucleotide sequence according to the present invention, a sequence controlling its expression (for example, a promoter). Sequences, terminator sequences, enhancer sequences) and genetic markers for selecting host cells (eg, neomycin resistance gene,
(A kanamycin resistance gene) and the like. In addition, this vector may contain the nucleotide sequence according to the present invention in a repeated form (for example, in tandem). These may be made to exist in a vector according to a conventional method, and a method of transforming a host cell with this vector may be one commonly used in this field.
【００５９】本発明によるベクター構築の手順および方
法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いる
ことができる。The procedure and method for constructing a vector according to the present invention may be those commonly used in the field of genetic engineering.
【００６０】また、宿主細胞としては、例えば、大腸
菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、
リンパ球、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、腫瘍
細胞等）が挙げられる。As the host cells, for example, E. coli, yeast, insect cells, animal cells (eg, COS cells,
Lymphocytes, fibroblasts, CHO cells, blood cells, tumor cells, etc.).
【００６１】上記形質転換された宿主細胞を適当な培地
で培養し、その培養物から上記した本発明によるタンパ
ク質を得ることができる。従って、本発明の別の態様に
よれば、本発明によるタンパク質の製造法が提供され
る。形質転換された宿主細胞の培養およびその条件は、
使用する細胞についてのそれと本質的に同様であってよ
い。また、培養液からの本発明によるタンパク質の回
収、精製も常法に従って行うことができる。The transformed host cells are cultured in an appropriate medium, and the above-described protein of the present invention can be obtained from the culture. Thus, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a protein according to the present invention. The culture of the transformed host cell and its conditions are as follows:
It may be essentially the same as that for the cells used. The recovery and purification of the protein according to the present invention from the culture solution can also be performed according to a conventional method.
【００６２】プローブおよび診断薬 本発明によれば、（ａ）配列番号４の配列中、連続した
少なくとも２０塩基のＤＮＡ配列を含む塩基配列、およ
びそれに相補的な配列、並びに（ｂ）（ａ）の塩基配列
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基
配列から選択される、塩基配列が提供される。 Probes and Diagnostics According to the present invention, (a) a base sequence containing a continuous DNA sequence of at least 20 bases in the sequence of SEQ ID NO: 4, a sequence complementary thereto, and (b) (a) And a base sequence selected from a base sequence that hybridizes with the base sequence under stringent conditions.
【００６３】上記配列としては、例えば、配列番号４の
７４３〜２３６０番（Ｌ１）、２２７５〜３３２９番
（Ｌ２）、２８９２〜４８５５番（Ｌ３）、２１８３〜
３３４４（Ｌ１−１）番、１〜８９５番（Ｌ１−３）、
３３５６〜３３７７番（実施例１８）、および３５０２
〜３５２３番の塩基配列およびこれに相補的な配列が挙
げられる。As the above sequence, for example, SEQ ID NO: 4 at positions 743 to 2360 (L1), 2275 to 3329 (L2), 2892 to 4855 (L3), 2183 to 2183
3344 (L1-1), 1-895 (L1-3),
Nos. 3356 to 3377 (Example 18), and 3502
The base sequence of No.-3523 and the sequence complementary thereto are listed.
【００６４】配列番号５の塩基配列は配列番号４の塩基
配列の相補鎖である。従って、上記塩基配列の相補鎖と
しては、それぞれ、配列番号５の２４９６〜４１１３
番、１５２７〜２５８１番、１〜１９６４番、１５１２
〜２６７３番、３９６１〜４８５５番、１４７９〜１５
００番、および１３３３〜１３５４番（実施例１８）の
塩基配列が挙げられる。The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 is a complementary strand of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4. Therefore, the complementary strands of the above base sequence are 2496 to 4113 of SEQ ID NO: 5, respectively.
No., 1527 to 2581, 1 to 1964, 1512
-2673, 3961-4855, 1479-15
No. 00 and the nucleotide sequences of Nos. 1333 to 1354 (Example 18).
【００６５】本発明において、ハイブリダイゼーション
における「ストリンジェントな条件」とは、これらの配
列がプローブやプライマーとして用いられるようなサザ
ンハイブリダイゼーション法（実施例１０）、ＰＣＲ法
（実施例１２および１８）、およびＦＩＳＨ法（実施例
１７）のハイブリダイズの条件と定義される。In the present invention, “stringent conditions” in the hybridization refer to the Southern hybridization method (Example 10) and the PCR method (Examples 12 and 18) in which these sequences are used as probes and primers. , And the hybridization conditions of the FISH method (Example 17).
【００６６】本発明によれば、上記塩基配列と検出可能
な標識とを含むプローブが提供される。検出可能な標識
は当業者に周知のものから選択できるが、例えば、相互
作用する物質（例えば、アビジンおよびビオチン）、酵
素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）、
放射性同位元素（例えば、３２Ｐおよび３５Ｓ等）、蛍
光（例えば、ＦＩＴＣ、ユーロピウム）、抗原（例えば
ジゴキシゲニン）等が挙げられる。According to the present invention, there is provided a probe comprising the above base sequence and a detectable label. Detectable labels can be selected from those known to those skilled in the art, for example, interacting substances (eg, avidin and biotin), enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase),
Examples include radioisotopes (eg, 32 P and 35 S, etc.), fluorescence (eg, FITC, europium), antigens (eg, digoxigenin), and the like.
【００６７】塩基配列の標識方法は、標識分子に依存し
て決定されてよく、例えば、ニックトランスレーショ
ン、化学的（または光化学的）架橋、オリゴヌクレオチ
ド化学合成、キレート化等によって行うことができる。The method for labeling the nucleotide sequence may be determined depending on the labeling molecule, and can be performed by, for example, nick translation, chemical (or photochemical) crosslinking, oligonucleotide chemical synthesis, chelation, or the like.
【００６８】標識の検出方法は、標識分子に依存して決
定されてよく、例えば、蛍光、酵素またはフェリチン−
標識化抗体、アビジン−ＦＩＴＣ、β−ガラクトシダー
ゼ、金コロイド等を用いて標識を検出することができ
る。The method of detecting the label may be determined depending on the label molecule, for example, fluorescence, enzyme or ferritin-
The label can be detected using a labeled antibody, avidin-FITC, β-galactosidase, colloidal gold, or the like.
【００６９】前記のように、ＭＢＳ遺伝子が、腫瘍のよ
うな疾患と関連していることが明らかにされた。従っ
て、本発明による塩基配列およびプローブ（以下、単に
「プローブ」ということがある）を用いてこれらの病気
を診断（出生前診断のような前徴候診断を含む）するこ
とができる。As described above, the MBS gene was found to be associated with diseases such as tumors. Therefore, these diseases can be diagnosed (including presymptomatic diagnosis such as prenatal diagnosis) using the nucleotide sequence and the probe according to the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as “probe”).
【００７０】本発明によれば、また、前記プローブを含
む診断薬が提供される。According to the present invention, there is also provided a diagnostic agent comprising the above-mentioned probe.
【００７１】診断は、患者から遺伝子試料（染色体また
はゲノムＤＮＡ等）を取り出し、前記プローブと遺伝子
試料とのハイブリダイゼーションの程度を測定すること
によって行うことができる。このようなハイブリダイゼ
ーションの程度を測定する方法としては、ＦＩＳＨ法、
サザンハイブリダイゼーション法、およびＰＣＲ法が挙
げられる。Diagnosis can be performed by removing a gene sample (chromosome or genomic DNA, etc.) from a patient and measuring the degree of hybridization between the probe and the gene sample. Methods for measuring the degree of such hybridization include the FISH method,
Examples include the Southern hybridization method and the PCR method.
【００７２】（１）ＦＩＳＨ法 ＦＩＳＨ法を用いる場合には、ヒトより単離された細胞
（例えばリンパ球）の染色体を固定した標本と上記プロ
ーブをハイブリダイゼーションさせ、染色体のＭＢＳ遺
伝子をマッピングする。正常人の細胞では、後記実施例
に記載されるように、ＭＢＳ遺伝子は一対の１２番染色
体の長腕のｑ１５−２１．２部位（１２ｑ１５−２１．
２）にマップされる。(1) FISH method When the FISH method is used, the above probe is hybridized with a sample in which chromosomes of cells (for example, lymphocytes) isolated from humans are fixed, and the MBS gene of the chromosomes is mapped. In normal human cells, as described in the Examples below, the MBS gene has the q15-21.2 site (12q15-21.
It is mapped to 2).
【００７３】一方、腫瘍患者の中には、ＭＢＳ遺伝子の
シグナルが検出されない患者（ＭＢＳ遺伝子が欠失して
いる）、ＭＢＳ遺伝子のシグナルが強く検出される患者
（ＭＢＳ遺伝子が増幅している）あるいはＭＢＳ遺伝子
のシグナルが１２ｑ１５−２１．２以外の部位に検出さ
れる患者（ＭＢＳ遺伝子が転座している）が見出され
る。このようなＭＢＳ遺伝子の変異（欠失、増幅または
転座）は、上記のいずれかの疾患に特徴的な変化であ
る。従って、ＦＩＳＨ法によってハイブリダイゼーショ
ンの程度を測定すること、あるいは、ＭＢＳ遺伝子の染
色体上の位置を検出することによって、前記疾患の診断
を行うことができる。On the other hand, among the tumor patients, patients in which the signal of the MBS gene is not detected (the MBS gene is deleted) and patients in which the signal of the MBS gene is strongly detected (the MBS gene is amplified) Alternatively, a patient whose MBS gene signal is detected at a site other than 12q15-21.2 (the MBS gene has been translocated) is found. Such a mutation (deletion, amplification or translocation) of the MBS gene is a change characteristic of any of the above diseases. Therefore, the disease can be diagnosed by measuring the degree of hybridization by the FISH method or by detecting the position of the MBS gene on the chromosome.
【００７４】ＦＩＳＨ法は、例えば実施例１７に記載し
たような条件下で行うことができる。実際には、実験の
目的、プローブやこれをハイブリダイズさせたいＤＮＡ
の種類等に応じて、この条件の範囲内で最適な条件を選
んでハイブリダイゼーションを行う。ＦＩＳＨ法の条件
は、Heng H.H.Q. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,
9509-9513(1992); Heng H.H.Q. & Tsui L.C., In situ
hybridization protocols: Methods in Molecular Biol
ogy. Choo K.H.A.(ed).Humana Press:New Jersey,pp.10
9-122(1994) Choo, K. H. A., ed., Methods in Molecu
lar Biology: In situ hybridization protocoles. (Ch
oo, K. H. A., ed.). pp35-49 (1994) Humana Press, C
lifton, NJ., USAおよび、Gerhard,D.S.et al.,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 78,3755-3759(1981)を参照することが
できる。The FISH method can be carried out, for example, under the conditions described in Example 17. Actually, the purpose of the experiment, the probe and the DNA to be hybridized
Hybridization is performed by selecting the optimal conditions within the range of these conditions according to the type of the above. The conditions of the FISH method are described in Heng HHQ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,
9509-9513 (1992); Heng HHQ & Tsui LC, In situ
hybridization protocols: Methods in Molecular Biol
ogy. Choo KHA (ed) .Humana Press: New Jersey, pp.10
9-122 (1994) Choo, KHA, ed., Methods in Molecu
lar Biology: In situ hybridization protocoles. (Ch
oo, KHA, ed.). pp35-49 (1994) Humana Press, C
lifton, NJ., USA and Gerhard, DSet al., Proc. Na
USA. 78, 3755-3759 (1981).
【００７５】（２）サザンハイブリダイゼーション法 サザンハイブリダイゼーション（J. Sambrook et.al.,
Molecular Cloning 2nd ed. Ch.9 (1989) Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York ）を用いる場合に
は、ヒトより単離された細胞（例えばリンパ球）よりゲ
ノムＤＮＡを単離し、これを適当な制限酵素で消化した
後にゲル電気泳動を行って消化されたＤＮＡ断片を分離
する。その後、分離したＤＮＡ断片をフィルターにトラ
ンスファーし、フィルター上で上記プローブとハイブリ
ダイゼーションさせる。上記患者の中には、健常人に比
べてハイブリダイゼーションが認められない患者や、認
められてもその量が少ない患者（ＭＢＳ遺伝子の全部ま
たは一部が置換等されている）、健常人に比べてハイブ
リダイゼーションの量が多い患者（ＭＢＳ遺伝子が増幅
している）あるいはプローブがハイブリダイゼーション
するＤＮＡ断片のサイズや数が健常人のそれと異なる患
者等が見出される。また、サザンハイブリダイゼーショ
ンをhuman/rodent somatic cell hybrid panelとを組み
合わせることにより、患者のＭＢＳ遺伝子の染色体上の
位置を検出することができる（Macera,M.J.et al.,Geno
mics 13,829-831(1992))。それにより、患者でのＭＢＳ
遺伝子の欠失や転座の有無を検出することができる。(2) Southern hybridization method Southern hybridization (J. Sambrook et. Al.,
Molecular Cloning 2nd ed.Ch. 9 (1989) Cold Spring
When using Harbor Laboratory Press, New York, genomic DNA is isolated from cells (eg, lymphocytes) isolated from humans, digested with appropriate restriction enzymes, and then subjected to gel electrophoresis for digestion. Separated DNA fragments. Thereafter, the separated DNA fragment is transferred to a filter and hybridized with the probe on the filter. Among the above patients, there are patients in which hybridization is not observed as compared with healthy individuals, patients in which the amount of hybridization is observed is small (all or part of the MBS gene is replaced, etc.), and Thus, patients with a large amount of hybridization (the MBS gene is amplified) or patients with different sizes and numbers of DNA fragments to which the probe hybridizes are different from those of healthy individuals. In addition, by combining Southern hybridization with a human / rodent somatic cell hybrid panel, it is possible to detect the chromosomal location of the MBS gene of a patient (Macera, MJ et al., Geno
mics 13,829-831 (1992)). Thereby, MBS in patients
The presence or absence of gene deletion or translocation can be detected.
【００７６】このようなＭＢＳ遺伝子の変異（欠失、増
幅および転座等）は、上記のいずれかの疾患に特徴的な
変化である。従って、サザンハイブリダイゼーションに
よってプローブとハイブリダイズするバンドのパターン
を測定することによって、前記疾患を診断することがで
きる。Such a mutation (deletion, amplification, translocation, etc.) of the MBS gene is a characteristic change in any of the above-mentioned diseases. Therefore, the disease can be diagnosed by measuring the pattern of the band that hybridizes with the probe by Southern hybridization.
【００７７】ＤＮＡ断片をプローブとして用いる場合に
は、２〜６×ＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液、
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液）、６５℃〜７０
℃の条件下でサザンハイブリダイゼーションを行うこと
ができる。When a DNA fragment is used as a probe, 2-6 × SSC (0.15 M sodium chloride solution,
0.015M sodium citrate solution), 65 ° C-70
Southern hybridization can be performed under the condition of ° C.
【００７８】実際には、実験の目的、プローブやこれを
ハイブリダイズさせたいＤＮＡの種類等に応じて、最適
な条件を選んでハイブリダイゼーションを行う。ハイブ
リダイズの条件は高木康敬編著「遺伝子操作マニュア
ル」、講談社、東京、日本（１９８２年）を参照するこ
とができる。In practice, hybridization is carried out under optimal conditions according to the purpose of the experiment, the type of the probe and the DNA to be hybridized with the probe, and the like. The conditions for hybridization can be referred to “Gene manipulation manual” edited by Yasutaka Takagi, Kodansha, Tokyo, Japan (1982).
【００７９】（３）ＰＣＲ法 患者から遺伝子試料（染色体またはゲノムＤＮＡ等）を
取り出し、サザンハイブリダイゼーションの代わりにＰ
ＣＲ法（Saiki, R. K. et. al., Science 239(1988) 48
7-491）を用いて、遺伝子断片の増幅の程度を測定する
ことによって診断を実施することもできる。ＰＣＲ法で
は一対のプライマー（プライマー・ペア）を鋳型となる
ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイゼーションさせ、ポ
リメラーゼを用いてＤＮＡ断片を増幅する。上記プロー
ブは対にしてＰＣＲ用のプライマーとして用いることが
できる。このようなプライマー・ペアを用いて、取り出
された患者の遺伝子試料を鋳型としてＰＣＲを行うこと
により、ＭＢＳ遺伝子の全部または一部を増幅する。増
幅されたＤＮＡを電気泳動または塩基配列分析等により
解析することによって、ＭＢＳ遺伝子の変異（欠失、増
幅、組換え、転座、塩基置換等）の検出が可能である。(3) PCR method A gene sample (chromosome or genomic DNA, etc.) is taken out from a patient, and P is used instead of Southern hybridization.
CR method (Saiki, RK et. Al., Science 239 (1988) 48
7-491), diagnosis can be performed by measuring the degree of amplification of a gene fragment. In the PCR method, a pair of primers (primer pair) is hybridized to DNA or RNA serving as a template, and a DNA fragment is amplified using a polymerase. The above probes can be paired and used as primers for PCR. By using such a primer pair and performing PCR using the extracted patient gene sample as a template, all or part of the MBS gene is amplified. By analyzing the amplified DNA by electrophoresis or nucleotide sequence analysis, mutation (deletion, amplification, recombination, translocation, base substitution, etc.) of the MBS gene can be detected.
【００８０】例えば、ＭＢＳ遺伝子が欠失している患者
の遺伝子試料をＰＣＲ法に適用した場合には特定領域が
増幅されない。従って、増幅断片の有無を調べることに
よってＭＢＳ遺伝子の欠失を検出できる。For example, when a gene sample of a patient lacking the MBS gene is applied to the PCR method, the specific region is not amplified. Therefore, deletion of the MBS gene can be detected by examining the presence or absence of the amplified fragment.
【００８１】また、ＭＢＳ遺伝子が増幅している患者の
遺伝子試料をＰＣＲ法に適用した場合には特定領域が健
常人に比較して多く増幅される。従って、増幅断片の量
を調べることによってＭＢＳ遺伝子の増幅を検出でき
る。When a gene sample of a patient whose MBS gene is amplified is applied to the PCR method, the specific region is amplified more than in a healthy person. Therefore, amplification of the MBS gene can be detected by checking the amount of the amplified fragment.
【００８２】ＰＣＲ法は、例えば、Takara LA taq kit
ver.2 を用いて、95℃15秒、55℃30秒、72℃２分の反応
を30回行うような条件下で行うことができる。実際に
は、実験の目的、プローブやこれの鋳型として用いる遺
伝子試料の種類等に応じて、最適な条件を選んでＰＣＲ
を行う。ＰＣＲ法の条件はSaiki, R. K. et. al., Scie
nce 239 (1988) 487-491を参照する事ができる。The PCR method is described, for example, in Takara LA taq kit
Using ver.2, the reaction can be performed at 95 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes 30 times. In practice, optimal conditions are selected according to the purpose of the experiment, the type of gene sample used as a probe or its template, etc.
I do. PCR conditions are described in Saiki, RK et. Al., Scie
nce 239 (1988) 487-491.
【００８３】ＭＢＳ遺伝子の変異は、前記したように腫
瘍のような疾患に特徴的である。従って、上記診断薬は
これらの疾患の診断薬として用いることができる。[0083] Mutations in the MBS gene are characteristic of diseases such as tumors as described above. Therefore, the above diagnostic agents can be used as diagnostic agents for these diseases.
【００８４】本発明によれば、前記プローブを、ほ乳類
の遺伝子試料とハイブリダイズさせ、そしてハイブリダ
イズの程度を測定することを含む、ＭＢＳ遺伝子の変異
の検出方法が提供される。上記検出方法は、上記診断薬
の使用態様と同様にして実施することができる。According to the present invention, there is provided a method for detecting a mutation in the MBS gene, comprising hybridizing the probe with a mammalian gene sample and measuring the degree of hybridization. The above detection method can be carried out in the same manner as in the use mode of the above diagnostic agent.
【００８５】スクリーニング法 本発明によれば、（１）スクリーニングの対象を、活性
型Ｒｈｏタンパク質と、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能
を有する本発明によるタンパク質とを含むスクリーニン
グ系に存在させ、そして（２）活性型Ｒｈｏタンパク質
と、前記本発明によるタンパク質との結合の阻害の程度
を測定することを含む、活性型Ｒｈｏタンパク質と、活
性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する本発明によるタン
パク質との結合を阻害する物質のスクリーニング法が提
供される。[0085] According to the screening method the present invention, (1) screening of the subject, is present in the screening system comprising an active Rho protein, a protein according to the present invention having the activated Rho protein binding activity, and (2) A substance that inhibits the binding between the active Rho protein and the protein according to the present invention, which has the ability to bind to the active Rho protein, including measuring the degree of inhibition of the binding between the active Rho protein and the protein according to the present invention. Is provided.
【００８６】ここで、「結合の阻害の程度」は、ツー・
ハイブリッド・システム（two hybrid system ）（M.Ka
wabata 実験医学13,2111-2120(1995)、 A.B.Vojetk et
al.Cell 74,205-214(1993) ）による方法、本発明によ
るタンパク質に対する抗体によるイムノブロットを用い
て測定する方法、オーバーレイ・アッセイを用いて測定
する方法（Ishizaki, T. et al., EMBO J., 15, 1885-1
893 (1996)）、インビトロ翻訳させたタンパク質を用い
て測定する方法（Shibata, H. et al., FEBS Lett. 38
5, 221-224 (1996)）、Amano, M., et al., Science 27
1, 648-650 (1996)に記載された無細胞系での結合測定
法等によって測定することができる。Here, the “degree of inhibition of binding” is
Hybrid system (two hybrid system) (M.Ka
wabata Experimental Medicine 13,2111-2120 (1995), ABVojetk et
al. Cell 74, 205-214 (1993)), a method using immunoblotting with an antibody against the protein according to the present invention, and a method using an overlay assay (Ishizaki, T. et al., EMBO J. , 15, 1885-1
893 (1996)), a method of measuring using a protein translated in vitro (Shibata, H. et al., FEBS Lett. 38)
5, 221-224 (1996)), Amano, M., et al., Science 27.
1, 648-650 (1996).
【００８７】本発明において、「結合を阻害する物質」
とは、当業者により結合の阻害が認められたと評価され
る物質をいい、例えば、実施例１１の酵母ツーハイブリ
ッドシステムと同様の条件において実験した場合に活性
型Ｒｈｏタンパク質との結合が認められないと評価され
る場合を意味するものとする。In the present invention, “substance that inhibits binding”
The term refers to a substance evaluated to be inhibited by a person skilled in the art. For example, when an experiment is performed under the same conditions as in the yeast two-hybrid system of Example 11, binding to an active Rho protein is not observed. It means the case where is evaluated.
【００８８】なお、本明細書において「結合の阻害の程
度を測定する」とは結合の有無の測定を含む意味で用い
られるものとする。また、「スクリーニング」とは、ア
ッセイを含む意味で用いられる。[0088] In the present specification, "measuring the degree of inhibition of binding" is used in a sense including the measurement of the presence or absence of binding. The term “screening” is used to include an assay.
【００８９】スクリーニング系は細胞系または無細胞系
のいずれであってもよく、細胞系としては、例えば、酵
母細胞、ＣＯＳ細胞、大腸菌、昆虫細胞、線虫細胞、リ
ンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、およ
び腫瘍細胞が挙げられる。The screening system may be a cell system or a cell-free system. Examples of the cell system include yeast cells, COS cells, Escherichia coli, insect cells, nematode cells, lymph cells, fibroblasts, and CHO cells. Cells, blood cells, and tumor cells.
【００９０】スクリーニングの対象となるものは、特に
限定されないが、例えばペプチド、ペプチドのアナロ
グ、微生物培養液、有機化合物等が挙げられる。[0092] The target of the screening is not particularly limited, but examples include peptides, peptide analogs, microorganism cultures, and organic compounds.
【００９１】本発明によれば、また、（１）スクリーニ
ングの対象を、ミオシン軽鎖ホスファターゼの触媒サブ
ユニットと、ミオシン軽鎖ホスファターゼの触媒サブユ
ニットのホスファターゼ活性を亢進する本発明によるタ
ンパク質とを含むスクリーニング系に存在させ、そして
（２）ミオシン軽鎖ホスファターゼの触媒サブユニット
のフォスファターゼ活性の亢進の程度を測定することを
含む、ミオシン軽鎖ホスファターゼの触媒サブユニット
のフォスファターゼ活性の亢進を阻害する物質のスクリ
ーニング法が提供される。According to the present invention, (1) the objects of screening include the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase and the protein of the present invention which enhances the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase. A substance that inhibits the enhancement of the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase, which is present in the screening system and (2) comprises measuring the degree of enhancement of the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase, A screening method is provided.
【００９２】ここで、「活性の亢進の阻害の程度」は、
リン酸化ミオシン軽鎖の脱リン酸化の程度を指標にする
ことができ、例えば、実施例１６に記載の方法に従って
フォスファターゼ活性の阻害の程度を測定することがで
きる。Here, the “degree of inhibition of enhanced activity”
The degree of dephosphorylation of the phosphorylated myosin light chain can be used as an index. For example, the degree of inhibition of phosphatase activity can be measured according to the method described in Example 16.
【００９３】本発明において、「活性の亢進を阻害する
物質」とは、当業者により活性の亢進の阻害が認められ
たと評価される物質をいい、例えば、実施例１６と同様
の条件において実験した場合にホスファターゼ活性の亢
進の阻害が認められたと評価される場合を意味するもの
とする。In the present invention, the term “substance that inhibits the enhancement of activity” refers to a substance evaluated by those skilled in the art as inhibiting the enhancement of the activity. For example, an experiment was conducted under the same conditions as in Example 16. In this case, it means that it is evaluated that inhibition of the enhancement of phosphatase activity is recognized.
【００９４】上記スクリーニング系はホスファターゼの
基質を含むことができる。このような基質としては、オ
ルトリン酸エステル、ポリリン酸等を含むものが挙げら
れ、特に、リン酸化(monophosphorylated またはdiphos
phorylated) −ミオシン軽鎖やミオシン等が挙げられ
る。リン酸化ミオシン軽鎖およびミオシンは、市販のも
のであってもShimizu, H. et al.,J. Biol. Chem.,269,
30407-30411(1994)の記載に従って調製したものを用い
てもよい。リン酸化は当業者に慣用されている方法を用
いることができる。The screening system can include a phosphatase substrate. Such substrates include those containing orthophosphate, polyphosphoric acid, etc., and in particular, phosphorylation (monophosphorylated or diphosylated).
phorylated) -myosin light chain, myosin and the like. Phosphorylated myosin light chain and myosin are commercially available, Shimizu, H. et al., J. Biol. Chem., 269,
30407-30411 (1994) may be used. For phosphorylation, a method commonly used by those skilled in the art can be used.
【００９５】フォスファターゼの基質は、フォスファタ
ーゼの作用によってそのリン酸エステル結合が加水分解
される。リン酸に例えば３２Ｐのような放射性同位元素
を用いることによって、その脱リン酸化の程度が測定で
きる。The phosphatase substrate has its phosphate ester bond hydrolyzed by the action of phosphatase. By using a radioisotope such as 32 P for phosphoric acid, the degree of dephosphorylation can be measured.
【００９６】上記スクリーニング系には、ＡＴＰおよび
ＡＴＰγＳ等のリン酸基を有する化合物を存在させるこ
とができる。In the above screening system, compounds having a phosphate group such as ATP and ATPγS can be present.
【００９７】ミオシン軽鎖フォスファターゼは、生体
（例えば、ヒト、ニワトリ、ラット、ウシ）から抽出し
た天然由来のものであっても、市販のものであってもよ
く、これらに限定されるものではない。例えば、Shimiz
u, H. et al.,J. Biol. Chem.,269,30407-30411(1994)
やChen,Y. H. et al., FEBS Lett. 356, 51-55(1994)に
記載される方法に従って調製したＰＰ１ｃδを用いるこ
とができる。The myosin light chain phosphatase may be of natural origin extracted from a living body (eg, human, chicken, rat, bovine) or commercially available, but is not limited thereto. . For example, Shimiz
u, H. et al., J. Biol. Chem., 269, 30407-30411 (1994)
And PP1cδ prepared according to the method described in Chen, YH et al., FEBS Lett. 356, 51-55 (1994).
【００９８】スクリーニング系およびスクリーニングの
対象は、前記と同様なものが挙げられる。The screening system and the object of the screening include the same ones as described above.
【００９９】ＭＢＳは、前記のように、腫瘍に密接に関
わっていることが確認されている。従って、上記のスク
リーニング法は、腫瘍を抑制する物質のスクリーニング
法としても用いることができる。As described above, it has been confirmed that MBS is closely related to tumors. Therefore, the above screening method can also be used as a method for screening a substance that suppresses a tumor.
【０１００】抗体 本発明によれば、本発明によるタンパク質に対する抗体
が提供される。本発明において、抗体には、ポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。 Antibodies According to the present invention there are provided antibodies against the proteins according to the present invention. In the present invention, antibodies include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
【０１０１】本発明による抗体は、当業界において通常
用いられる方法によって製造することができる。例え
ば、本発明によるタンパク質を、任意の担体（例えば、
ウシ血清アルブミン）とともに動物体内（例えば、ウサ
ギ、ヤギ、ラット、マウス、ヒツジ）に注射し、一定期
間の後に、その動物の血清を精製することによって得る
ことができる。The antibody according to the present invention can be produced by a method usually used in the art. For example, the protein according to the present invention can be added to any carrier (for example,
It can be obtained by injecting into a body of an animal (for example, rabbit, goat, rat, mouse, sheep) together with bovine serum albumin), and after a certain period of time, purifying the serum of the animal.
【０１０２】本発明による抗体の反応は、本発明による
タンパク質の存在の指標となる。従って、本発明による
抗体は、腫瘍の形成および転移等の機構解明に有用であ
る。本発明による抗体の交差反応は、ＥＬＩＳＡ法、ラ
ジオイムノアッセイ法、ウェスタンブロッティング法、
免疫沈降法、および蛍光抗体法（例えば、単クローン抗
体実験マニュアル、講談社、（１９８７年））等によっ
て検出することができる。The reaction of the antibody according to the invention is an indicator of the presence of the protein according to the invention. Therefore, the antibody according to the present invention is useful for elucidation of mechanisms such as tumor formation and metastasis. The cross-reactivity of the antibody according to the present invention can be performed by ELISA, radioimmunoassay, Western blotting,
It can be detected by an immunoprecipitation method or a fluorescent antibody method (for example, manual for monoclonal antibody experiment, Kodansha, (1987)).
【０１０３】[0103]
【実施例】本発明を以下の実施例によって詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。The present invention will be described in detail with reference to the following Examples, but it should not be construed that the invention is limited thereto.
【０１０４】実施例１ 活性型Ｒｈｏタンパク質結合タ
ンパク質の精製 （１）脳膜抽出液の調製 ウシ脳灰白質（１９０ｇ）を鋏で切って小片にし、３０
０ｍｌのホモジェナイズ用バッファー（２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＥＧＴＡ，１ｍ
Ｍ ジチオスレイトール（ＤＴＴ），１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２，１０μＭ（ρ−アミジノフェニル）−メタンスル
ホニル フルオライド，１μｇ／ｌ ロイペプチン，１
０％ スクロース）に懸濁した。懸濁液をＰｏｔｔｅｒ
−Ｅｌｖｅｈｊｅｍテフロン・グラス・ホモジェナイザ
ーでホモジェナイズし、４層のガーゼで濾過した。ホモ
ジェネートを２０，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心
分離した。沈殿物を３６０ｍｌのホモジェナイズ用バッ
ファーに懸濁し、粗膜画分を得た。この画分の中に含ま
れる蛋白質を等量の、４Ｍ ＮａＣｌを含むホモジェナ
イズ用バッファーを加えて抽出した。４℃で、１時間振
とうした後、膜画分を、２０，０００×ｇ、４℃で１時
間遠心した。上清をバッファーＡ（２０ｍＭＴｒｉｓ／
ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴ
Ｔ，５ｍＭＭｇＣｌ２）に対して、３回透析した。固形
硫安を最終濃度が４０％飽和濃度になるように加えた。
０−４０％の沈殿物は、１６ｍｌのバッファーＡに溶か
し、バッファーＡに対して、３回透析し、膜抽出液とし
て使用した。 Example 1 Activated Rho protein binding protein
Purification of protein (1) Preparation of brain membrane extract Bovine brain gray matter (190 g) was cut into small pieces using scissors,
0 ml of homogenization buffer (25 mM Tr
is / HCl (pH 7.5), 5 mM EGTA, 1 m
M dithiothreitol (DTT), 10 mM MgC
l 2 , 10 μM (ρ-amidinophenyl) -methanesulfonyl fluoride, 1 μg / l leupeptin, 1
0% sucrose). Potter the suspension
-Homogenized with an Elvehjem Teflon glass homogenizer and filtered through four layers of gauze. The homogenate was centrifuged at 20,000 xg for 30 minutes at 4 ° C. The precipitate was suspended in 360 ml of a homogenization buffer to obtain a crude membrane fraction. The protein contained in this fraction was extracted by adding an equal volume of a homogenization buffer containing 4 M NaCl. After shaking at 4 ° C. for 1 hour, the membrane fraction was centrifuged at 20,000 × g at 4 ° C. for 1 hour. The supernatant was buffer A (20 mM Tris /
HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM DT
(T, 5 mM MgCl 2 ) three times. Solid ammonium sulfate was added to a final concentration of 40% saturation.
The 0-40% precipitate was dissolved in 16 ml of buffer A, dialyzed three times against buffer A, and used as a membrane extract.
【０１０５】（２）ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質アフ
ィニティー・カラムの調製 Shimizu, K. et al., J. Biol. Chem. 269, 22917-2292
0 (1994)に記載された方法に従って、ＧＳＴ−Ｒｈｏ
Ａ、ＧＳＴ−ＲｈｏＡＡｌａ３７、ＧＳＴ−Ｒａｃ１、
ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓを、大腸菌より精製し、グアニンヌ
クレオチドを付加した。グアニンヌクレオチド結合型の
ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質の調製は、低分子量Ｇタ
ンパク質（１．５ｎｍｏｌ）を１時間、４℃で、１５μ
Ｍ ＧＤＰまたはＧＴＰγＳと１ｍｌ中の反応液（２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ
Ｌ−α−ジミリストイルホスファチジルコリン，０．
３％ ３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルア
ンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）
中でインキュベートすることにより調製した（Shimizu,
K. et al., J. Biol.Chem. 269, 22917-22920 (199
4)）。Ｒｈｏタンパク質結合タンパク質の結合活性を分
析するためのアフィニティー・カラムを調製するため
に、ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質（各６ｎｍｏｌ）を
０．２５ｍｌのグルタチオン・セファロース４Ｂカラム
（ファルマシア バイオテク社）に固定化し、カラムに
パックした。ペプチドの一次構造決定用Ｒｈｏタンパク
質結合性タンパク質を精製するためのアフィニティー・
カラムを調製するために、ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク
質（各２４ｎｍｏｌ）を１ｍｌのグルタチオン・セファ
ロース４Ｂカラム（ファルマシア バイオテク社）に固
定化し、カラムにパックした。(2) Preparation of GST-low molecular weight G protein affinity column Shimizu, K. et al., J. Biol. Chem. 269, 22917-2292
GST-Rho according to the method described in
A, GST-RhoA Ala37 , GST-Rac1,
GST-H-Ras was purified from E. coli and guanine nucleotide was added. Preparation of guanine nucleotide-linked GST-low molecular weight G protein is performed by adding low molecular weight G protein (1.5 nmol) for 1 hour at 4 ° C. for 15 μm.
M GDP or GTPγS and 1 ml of the reaction solution (20
mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM E
DTA, 1 mM DTT, 5 mM MgCl 2 , 1 mM
L-α-dimyristoyl phosphatidylcholine, 0.
3% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS)
(Shimizu,
K. et al., J. Biol. Chem. 269, 22917-22920 (199
Four)). In order to prepare an affinity column for analyzing the binding activity of Rho protein-binding protein, GST-low molecular weight G protein (6 nmol each) was immobilized on a 0.25 ml glutathione-Sepharose 4B column (Pharmacia Biotech), Packed in columns. Affinity for Purification of Rho Protein Binding Protein for Primary Structure Determination of Peptides
To prepare the column, GST-low molecular weight G protein (24 nmol each) was immobilized on a 1 ml glutathione-Sepharose 4B column (Pharmacia Biotech) and packed into the column.
【０１０６】（３）ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質アフ
ィニティー・カラム・クロマトグラフィー 膜抽出液は、２．５ｍｌのグルタチオン・セファロース
４Ｂカラムに通して、内在性のＧＳＴを取り除いた。１
０分の１のカラム素通り画分を、それぞれのグアニンヌ
クレオチドを付加したＧＳＴ−低分子量Ｇ蛋白質を結合
した、０．２５ｍｌのグルタチオン・セファロース４Ｂ
カラムにのせた。０．２ＭのＮａＣｌを含む０．８２５
ｍｌのバッファーＡで３回洗浄した後、結合していた蛋
白質をそれぞれのＧＳＴ−低分子量Ｇ蛋白質と一緒に、
１０ｍＭ グルタチオンを含む０．８２５ｍｌのバッフ
ァーＡで溶出した。グルタチオン溶出画分の各４０μｌ
をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Laemmli, U.K., Nature 227, 680
-685 (1970) ）にかけ、ゲルを銀染色をして解析した。
結果は図１に示される通りであった。(3) GST-Low Molecular Weight G Protein Affinity Column Chromatography The membrane extract was passed through a 2.5 ml glutathione Sepharose 4B column to remove endogenous GST. 1
0.25 ml of Glutathione Sepharose 4B bound with GST-low molecular weight G protein to which each guanine nucleotide was added was used for the 1/0 column flow-through fraction.
Put on the column. 0.825 with 0.2M NaCl
After washing three times with ml of buffer A, the bound proteins were combined with the respective GST-low molecular weight G proteins,
Elution was carried out with 0.825 ml of buffer A containing 10 mM glutathione. Glutathione eluted fraction 40 μl each
To SDS-PAGE (Laemmli, UK, Nature 227, 680
-685 (1970)), and the gel was stained with silver and analyzed.
The results were as shown in FIG.
【０１０７】その結果、分子量約１３８ｋＤａのタンパ
ク質（ｐ１３８タンパク質）が、分子量約１６４ｋＤａ
および分子量約１２８ｋＤａのタンパク質とともに、Ｇ
ＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡアフィニティー・カラムか
らの溶出画分に検出されたが（レーン３）、ＧＤＰ・Ｇ
ＳＴ−ＲｈｏＡアフィニティー・カラムからの溶出画分
には検出されなかった。このことより、ｐ１３８タンパ
ク質はＧＴＰγＳ結合型のＧＳＴ−ＲｈｏＡに特異的に
結合することが示された。ｐ１３８タンパク質は、エフ
ェクター領域の突然変異体（ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒｈ
ｏＡＡｌａ３７）（レーン４）、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−
Ｈ−Ｒａｓ（レーン６）、ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ
（レーン５）アフィニティー・カラムからは溶出されな
かった。As a result, a protein having a molecular weight of about 138 kDa (p138 protein) was converted into a protein having a molecular weight of about 164 kDa.
And a protein having a molecular weight of about 128 kDa,
It was detected in the fraction eluted from the TPγS · GST-RhoA affinity column (lane 3), but the GDP · G
It was not detected in the fraction eluted from the ST-RhoA affinity column. This indicated that p138 protein specifically binds to GTPγS-bound GST-RhoA. The p138 protein is a mutant of the effector region (GTPγS · GST-Rh
oA Ala37 ) (lane 4), GTPγS · GST-
H-Ras (lane 6), GDP / GST-H-Ras
(Lane 5) It was not eluted from the affinity column.
【０１０８】（４）ｐ１３８タンパク質の精製 ｐ１３８タンパク質を同定するために、下記に記載のと
おり、精製ｐ１３８タンパク質の大量調製を行いペプチ
ドの一次構造を決定した。グルタチオン・セファロース
４Ｂカラムからの素通り画分（１６ｍｌ）を、２４ｎｍ
ｏｌのＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡを付加した１ｍｌ
のグルタチオン・セファロースカラムに通した。蛋白質
は、１０ｍＭ グルタチオンと０．２Ｍ ＮａＣｌとを
含む１０ｍｌのバッファーＡで溶出し、画分を１ｍｌづ
つ集めた。ｐ１３８タンパク質は、画分２−１０に見ら
れた。同一の操作を３回繰り返した。これらの画分を全
て集めてｐ１３８タンパク質精製標品とした。(4) Purification of p138 protein In order to identify the p138 protein, as described below, a large amount of the purified p138 protein was prepared and the primary structure of the peptide was determined. The flow-through fraction (16 ml) from the Glutathione Sepharose 4B column was collected at 24 nm
ol of GTPγS · GST-RhoA
Glutathione Sepharose column. The protein was eluted with 10 ml of buffer A containing 10 mM glutathione and 0.2 M NaCl, and 1 ml fractions were collected. The p138 protein was found in fractions 2-10. The same operation was repeated three times. All of these fractions were collected and used as a purified p138 protein sample.
【０１０９】（５）ｐ１６４の精製 ｐ１６４を精製するために、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒｈ
ｏＡを含むグルタチオン−セファロースアフィニティー
カラムからの溶出画分（画分３〜１０）を同量のバッフ
ァーＡで希釈し、バッファーＡで平衡化したＭｏｎｏ
Ｑ ５／５ カラムにロードした。カラムを１０ｍｌの
バッファーＡで洗浄後、タンパク質を、０〜０．５Ｍの
ＮａＣｌ溶液の直線密度勾配に調整したバッファーＡで
溶出し、溶出画分を０．５ｍｌづつ回収した。(5) Purification of p164 To purify p164, GTPγS.GST-Rh
The eluted fractions (fractions 3 to 10) from the glutathione-Sepharose affinity column containing oA were diluted with the same amount of buffer A, and
Loaded on Q5 / 5 column. After washing the column with 10 ml of buffer A, the protein was eluted with buffer A adjusted to a linear density gradient of 0 to 0.5 M NaCl solution, and 0.5 ml of the eluted fraction was collected.
【０１１０】結果は図２に示される通りであった。ｐ１
６４は、画分１０〜１２にシングルピークとして回収さ
れた（図２上段）。溶出画分（８〜１４）の一部を、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、銀染色したところ、精
製サンプルの純度は約９５％であった（図２下段）。The results were as shown in FIG. p1
64 was recovered as a single peak in fractions 10 to 12 (upper row in FIG. 2). A part of the eluted fraction (8 to 14) was
When DS-PAGE electrophoresis was performed and silver staining was performed, the purity of the purified sample was about 95% (lower part in FIG. 2).
【０１１１】実施例２ ｐ１３８タンパク質の同定 （１）ペプチドの一次構造の決定 ｐ１３８タンパク質を同定するために、アミノ酸配列分
析を実施した。ｐ１３８タンパク質精製標品をＳＤＳ−
ＰＡＧＥにかけ、ポリビニリデン ジフルオライド膜
（プロブロット）（アプライド バイオシステムズ社）
にトランスファーした。ｐ１３８タンパク質に相当する
バンドを、リジン特異的エンドヌクレアーゼであるアク
ロモバクタープロテアーゼＩ（和光純薬工業（株））に
より消化した（Iwamatsu, A., Electrophoresis 13, 14
2-147 (1992)）。生じたペプチドを、Ｃ１８カラム・ク
ロマトグラフィーにより分画し、アミノ酸配列分析にか
け、同定した。その結果、９種のｐ１３８タンパク質由
来のペプチドの一次構造が決定した。それらは、１）Ｒ
ＷＩＧＳＥ、２）ＳＬＬＱＭ、３）ＧＹＴＥＶＬ、４）
ＥＴＬＩＩＥＰＥＫ、５）ＤＥＳＰＡ、６）ＡＹＶＡＰ
ＴＶ、７）ＳＬＱＧＩ、８）ＡＱＬＨＤＴＮＭＡＬ、
９）ＤＥＮＧＡＬＩＲＶＩＳであった。これらの９種の
ペプチド配列は全て、ラット平滑筋タンパク質フォスフ
ァターゼ １Ｍの１１０ｋＤａ調節サブユニット（前掲
Chen, Y.H. et al. ）の配列（配列番号１）の部分配列
とほぼ一致した。このラットタンパク質はニワトリのミ
オシン軽鎖フォスファターゼのミオシン結合サブユニッ
トのラットのカウンターパートである（前掲Shimizu,
H. et al.）上記のタンパク質の相同性検索には、ＢＬ
ＡＳＴプログラムを用いた（Altschul, S.F. et al.,
J. Mol. Biol. 215, 403-410(1990)）。 Example 2 Identification of p138 Protein (1) Determination of Primary Structure of Peptide In order to identify p138 protein, amino acid sequence analysis was performed. The purified p138 protein was purified by SDS-
PAGE, polyvinylidene difluoride membrane (Problot) (Applied Biosystems)
Transferred to. The band corresponding to the p138 protein was digested with Achromobacter protease I (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) which is a lysine-specific endonuclease (Iwamatsu, A., Electrophoresis 13, 14).
2-147 (1992)). The resulting peptide was fractionated by C18 column chromatography and subjected to amino acid sequence analysis for identification. As a result, primary structures of peptides derived from nine kinds of p138 proteins were determined. They are: 1) R
WIGSE, 2) SLLQM, 3) GYTEVL, 4)
ETLIIEPEK, 5) DESPA, 6) AYVAP
TV, 7) SLQGI, 8) AQLHDTNMAL,
9) It was DENGALIRVIS. All of these nine peptide sequences are the 110 kDa regulatory subunit of rat smooth muscle protein phosphatase 1M (supra).
Chen, YH et al.) (SEQ ID NO: 1). This rat protein is the rat counterpart of the myosin-binding subunit of chicken myosin light chain phosphatase (Shimizu, supra).
H. et al.) The homology search for the above proteins was performed using BL
The AST program was used (Altschul, SF et al.,
J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)).
【０１１２】（２）イムノブロット解析 ｐ１３８タンパク質がミオシン軽鎖フォスファターゼの
ミオシン結合サブユニットに相当することをさらに確認
するために、抗ミオシン結合サブユニット抗体を用いた
イムノブロット解析を実施した。ニワトリ由来の１３０
ｋＤａミオシン結合サブユニットに対するウサギポリク
ローナル抗体および２０ｋＤａの調節サブユニットに対
するウサギポリクローナル抗体は、常法に従って、それ
ぞれの組換え型蛋白質を調製し、これを抗原として用い
て作製した。３７ｋＤａタイプ１フォスファターゼ触媒
サブユニットに対するウサギポリクローナル抗体は、サ
ンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社により購入し
た。イムノブロット解析は、Harlow, E. & Lame, D., C
old Spring Habor Laboratory, Cold Spring Harbor, N
Y, 1988 に記載された方法に従って実施した。結果は図
３に示される通りであった。(2) Immunoblot analysis To further confirm that the p138 protein corresponds to the myosin binding subunit of myosin light chain phosphatase, immunoblot analysis using an anti-myosin binding subunit antibody was performed. 130 from chicken
Rabbit polyclonal antibodies against the kDa myosin binding subunit and rabbit polyclonal antibodies against the 20 kDa regulatory subunit were prepared by preparing respective recombinant proteins according to a conventional method and using them as antigens. Rabbit polyclonal antibody against the 37 kDa type 1 phosphatase catalytic subunit was purchased from Santa Cruz Biotechnology. Immunoblot analysis was performed by Harlow, E. & Lame, D., C.
old Spring Habor Laboratory, Cold Spring Harbor, N
Performed according to the method described in Y, 1988. The results were as shown in FIG.
【０１１３】その結果、ｐ１３８タンパク質は、上記の
抗ミオシン結合サブユニット抗体によって認識され、免
疫交差反応が、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡアフィニ
ティー・カラムからのグルタチオン溶出画分（レーン
３）に検出されたが、ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（レー
ン２）、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡＡｌａ３７（レ
ーン４）、ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒａｃ１（レーン５）、Ｇ
ＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒａｃ１（レーン６）、ＧＤＰ・Ｇ
ＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ（レーン７）、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−
Ｈ−Ｒａｓアフィニティー・カラムからの溶出画分（レ
ーン８）には、いずれも検出されなかった。尚、イミュ
ノブロット解析に用いたグルタチオン溶出画分は各４０
μｌであった。As a result, the p138 protein was recognized by the above-mentioned anti-myosin-binding subunit antibody, and immune cross-reactivity was detected in the glutathione-eluted fraction (lane 3) from the GTPγS.GST-RhoA affinity column. , GDP · GST-RhoA (lane 2), GTPγS · GST-RhoA Ala37 (lane 4), GDP · GST-Rac1 (lane 5), G
TPγS · GST-Rac1 (lane 6), GDP · G
ST-H-Ras (lane 7), GTPγS · GST-
None was detected in the eluted fraction from the H-Ras affinity column (lane 8). The glutathione eluted fraction used for the immunoblot analysis was 40 each.
μl.
【０１１４】ニワトリおよびラットのミオシン結合サブ
ユニットの分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで、約１３０ｋＤ
ａと推定されている（前掲Shimizu, H. et al.、Chen,
Y.H.et al. ）。従って、ｐ１３８タンパク質は、ミオ
シン結合サブユニットのウシのカウンターパートである
と結論された。The molecular weight of the chicken and rat myosin binding subunits was approximately 130 kD by SDS-PAGE.
a (see Shimizu, H. et al., Chen, supra).
YHet al.). Therefore, it was concluded that the p138 protein is a bovine counterpart of the myosin binding subunit.
【０１１５】ミオシン軽鎖フォスファターゼは、ミオシ
ン結合サブユニット、３７ｋＤａタイプ１ フォスファ
ターゼ触媒サブユニットおよび２０ｋＤａ調節サブユニ
ットから構成されている（前掲Shimizu, H. et al.、Ch
en, Y.H. et al. ）。そこで、触媒サブユニットがＧＴ
ＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡアフィニティー・カラムに結
合しているかどうかについて、抗触媒サブユニット抗体
を用いたイムノブロット解析により検討した。結果は図
４に示される通りであった。Myosin light chain phosphatase is composed of a myosin binding subunit, a 37 kDa type 1 phosphatase catalytic subunit and a 20 kDa regulatory subunit (Shimizu, H. et al., Supra, Ch.
en, YH et al.). Therefore, the catalyst subunit is GT
Whether or not it bound to the PγS · GST-RhoA affinity column was examined by immunoblot analysis using an anti-catalytic subunit antibody. The results were as shown in FIG.
【０１１６】その結果、免疫交差反応が、ＧＴＰγＳ・
ＧＳＴ−ＲｈｏＡアフィニティー・カラムからの溶出画
分に検出されたが（レーン３）、ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒｈ
ｏＡ（レーン２）、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ
Ａｌａ３７（レーン４）、ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒａｃ１
（レーン５）、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒａｃ１（レーン
６）、ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ（レーン７）、ＧＴ
ＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓアフィニティー・カラムか
らの溶出画分（レーン８）には、いずれも検出されなか
った。一方、２０ｋＤａ調節サブユニットに相当するｉ
ｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅなバンドは検出されなかっ
た（データ省略）。尚、イムノブロット解析に用いたグ
ルタチオン溶出画分は各４０μｌであった。As a result, the immune cross-reactivity was GTPγS.
Although detected in the eluted fraction from the GST-RhoA affinity column (lane 3), GDP · GST-Rh
oA (lane 2), GTPγS · GST-RhoA
Ala37 (lane 4), GDP / GST-Rac1
(Lane 5), GTPγS · GST-Rac1 (lane 6), GDP · GST-H-Ras (lane 7), GT
None was detected in the eluted fraction (lane 8) from the PγS · GST-H-Ras affinity column. On the other hand, i corresponding to the 20 kDa regulatory subunit
No immunoreactive band was detected (data omitted). The glutathione eluted fraction used in the immunoblot analysis was 40 μl each.
【０１１７】（３）タンパク質脱リン酸化酵素活性の測
定 次に、ミオシン軽鎖フォスファターゼ活性が、様々な低
分子量Ｇタンパク質アフィニティー・カラムからの溶出
画分（各２０μｌ）に検出されるかどうかを検討した。
ミオシン軽鎖フォスファターゼ活性は、Ishihara, H. e
t al., Biochem. Biophis. Res. Commun. 159, 871-877
(1989) に記載の方法に従って測定した。その結果、ミ
オシン軽鎖フォスファターゼ活性は、ＧＴＰγＳ・ＧＳ
Ｔ−ＲｈｏＡアフィニティー・カラムからの溶出画分に
特異的に検出された（図５）。(3) Measurement of protein phosphatase activity Next, it was examined whether or not myosin light chain phosphatase activity was detected in elution fractions (20 μl each) from various low-molecular-weight G protein affinity columns. did.
Myosin light chain phosphatase activity was determined by Ishihara, H. e.
t al., Biochem. Biophis. Res.Commun. 159, 871-877
(1989). As a result, the myosin light chain phosphatase activity was GTPγS · GS
It was specifically detected in the fraction eluted from the T-RhoA affinity column (FIG. 5).
【０１１８】定量的なイムノブロット解析の結果、精製
標品では、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡアフィニティ
ー・カラムに結合するミオシン結合サブユニットと触媒
サブユニットのモル比は、約２：１であることが明らか
になった（データ省略）。一方、粗抽出液を用いた実験
では、約９０％のミオシン結合サブユニットがＧＴＰγ
Ｓ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡアフィニティー・カラムに結合す
るが、約１０％の触媒サブユニットしかＧＴＰγＳ・Ｇ
ＳＴ−ＲｈｏＡアフィニティー・カラムに結合しないこ
とがわかった（データ省略）。このことより、ミオシン
軽鎖フォスファターゼのホロ酵素は、ミオシン結合サブ
ユニットを介して活性型Ｒｈｏタンパク質に結合するこ
とが示された。As a result of quantitative immunoblot analysis, it was found that the molar ratio of the myosin-binding subunit and the catalytic subunit bound to the GTPγS.GST-RhoA affinity column was about 2: 1 in the purified sample. (Data omitted). On the other hand, in an experiment using a crude extract, about 90% of myosin-binding subunits were GTPγ.
Binds to S.GST-RhoA affinity column, but only about 10% of the catalytic subunit is GTPγS.G
It was found that it did not bind to the ST-RhoA affinity column (data omitted). This indicated that the holoenzyme of myosin light chain phosphatase binds to the activated Rho protein via the myosin binding subunit.
【０１１９】実施例３ インビトロ・トランスレーショ
ンにより作製したミオシン結合サブユニットとＲｈｏタ
ンパク質との結合試験 組換えミオシン結合サブユニットがＧＴＰγＳ・Ｒｈｏ
Ａと結合するか否かを検討するために、インビトロ・ト
ランスレーションにより組換えミオシン結合サブユニッ
トを調製した。ラットミオシン結合サブユニット（配列
番号１に記載のアミノ酸配列の１〜９７６番）を組み込
んだプラスミドｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社）のイ
ンビトロ・トランスレーションは、ＴＮＴ Ｔ７を結合
した赤芽球ライゼート・システム（プロメガ社）を用い
て、プロメガ社の使用説明書に基づいて実施した。イン
ビトロ・トランスレーションにより得たタンパク質は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて分析した結果、天然の精製ラ
ットミオシン結合サブユニットと同様の移動度を示した
（データ省略）。 Example 3 In Vitro Translation
Myosin-binding subunit and Rhota
Protein binding test Recombinant myosin binding subunit was GTPγS-Rho
To investigate whether it binds to A, a recombinant myosin binding subunit was prepared by in vitro translation. In vitro translation of the plasmid pCRII (Invitrogen) incorporating the rat myosin binding subunit (amino acid sequence Nos. 1-976 of SEQ ID NO: 1) was performed using the erythroid lysate system (Promega, Inc.) bound to TNT T7. ) Was performed based on the instruction manual of Promega. The protein obtained by in vitro translation is
As a result of analysis by SDS-PAGE, it showed the same mobility as that of the natural purified rat myosin binding subunit (data not shown).
【０１２０】ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質（各０．７
５ｎｍｏｌ）を３１μｌのグルタチオン・セファロース
４Ｂビーズに固定化し、３１０μｌ（１０倍量）のバッ
ファーＡで洗浄した。固定化ビーズに４０μｌのインビ
トロ・トランスレーション用反応液を加え、緩やかに混
合しながら１時間、４℃でインキュベートした。その
後、ビーズを３回、１０２μｌ（３．３倍量）のバッフ
ァーＡで洗浄し、１０２μｌ（３．３倍量）の１０ｍＭ
グルタチオンを含むバッファーＡを添加することによ
り、結合したタンパク質をＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク
質とともに溶出した。溶出物各４０μｌをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけ、真空乾燥後オートラジオグラフィーによっ
て分析した。GST-low molecular weight G protein (0.7 G each)
5 nmol) was immobilized on 31 μl of glutathione-Sepharose 4B beads, and washed with 310 μl (10-fold volume) of buffer A. To the immobilized beads, 40 μl of the reaction solution for in vitro translation was added, and incubated at 4 ° C. for 1 hour with gentle mixing. Thereafter, the beads were washed three times with 102 μl (3.3 times) of buffer A and 102 μl (3.3 times) of 10 mM.
By adding buffer A containing glutathione, the bound protein was eluted together with GST-low molecular weight G protein. 40 μl of each eluate was subjected to SDS-PA
It was subjected to GE, dried under vacuum, and analyzed by autoradiography.
【０１２１】その結果、インビトロ・トランスレーショ
ンにより作製した上記ミオシン結合サブユニットは、Ｇ
ＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（レーン３）とともに大量
に溶出されたが、ＧＳＴ（レーン１）、ＧＤＰ・ＧＳＴ
−ＲｈｏＡ（レーン２）またはＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒ
ｈｏＡＡｌａ３７（レーン４）とともには比較的少量し
か溶出されなかった（図６）。このことより、ミオシン
結合サブユニットが活性型ＲｈｏＡと結合することが確
認された。As a result, the myosin-binding subunit produced by in vitro translation was G
It was eluted in large quantities with TPγS • GST-RhoA (lane 3), but GST (lane 1), GDP • GST
-RhoA (lane 2) or GTPγS · GST-R
Only a relatively small amount was eluted with hoA Ala37 (lane 4) (FIG. 6). This confirmed that the myosin binding subunit binds to active RhoA.
【０１２２】実施例４ Ｒｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅ
活性試験 ｐ１２２ Ｒｈｏ ＧＡＰにより刺激されるＲｈｏタン
パク質のＧＴＰａｓｅ活性におけるミオシン軽鎖サブユ
ニットの作用について、下記に記載の方法により検討し
た。 Example 4 Rho protein GTPase
Activity test The effect of the myosin light chain subunit on the GTPase activity of the Rho protein stimulated by p122 Rho GAP was examined by the method described below.
【０１２３】Ｒｈｏタンパク質がミオシン結合サブユニ
ットに直接作用するかどうかを確認するため、ラットミ
オシン結合サブユニットのＮ末端領域（配列番号１に記
載のアミノ酸配列の１〜７０７番）とＣ末端領域（同６
９９〜９７６番）を、常法に従いマルトース結合タンパ
ク質との融合タンパク質として遺伝子工学的に大腸菌に
発現させ、組換えタンパク質（それぞれ、「ＭＢＰ−
Ｎ」、「ＭＢＰ−Ｃ」とする）を調製した。In order to confirm whether the Rho protein directly acts on the myosin-binding subunit, the N-terminal region of the rat myosin-binding subunit (1-707 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) and the C-terminal region ( 6
No. 99-976) was expressed as a fusion protein with a maltose binding protein in Escherichia coli by a conventional method using a genetic engineering technique, and the recombinant protein (MBP-
N "," MBP-C ").
【０１２４】このために使用したプラスミドは下記の方
法で作製した。まず、ラットミオシン結合サブユニトの
Ｎ末端分とＣ末端部分を含むプラスミドｐＭＡＬ−ｃ２
は、以下の方法で作製した。Ｎ末端の上記１−７０７番
のアミノ酸を含む、２．１キロ塩基対のｃＤＮＡ断片
を、５′ＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣ
ＧＧＡＣＧＣＧ３′と５′ＡＡＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＡ
ＴＧＴＴＣＴＧＧＡＡＴＡＣＴＴＴＴＧＣＴＴ３′をプ
ライマーとして用いて、ラット脳クイッククローンｃＤ
ＮＡ（クロンテック社）をＰＣＲ法で増幅して得た。Ｃ
末端の上記６９９−９７６番のアミノ酸を含む８４０塩
基対のｃＤＮＡ断片は、ラットミオシン結合サブユニッ
トｃＤＮＡクローンを、５′ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡ
ＧＣＡＡＡＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴＡＣ３′と
５′ＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＴＴＧＧＡＡＡＧＴ
ＴＴＧＣＴＴＡＴＡＡＣ３′のプライマーを用いて、Ｐ
ＣＲ法で増幅して得た。ｃＤＮＡ断片は、ＢａｍＨＩ部
位で、ｐＭＡＬ−ｃ２に組み込んだ。The plasmid used for this was prepared by the following method. First, plasmid pMAL-c2 containing the N-terminal portion and the C-terminal portion of rat myosin-binding subunit
Was prepared by the following method. A 2.1-kilobase pair cDNA fragment containing the N-terminal amino acid No. 1-707 was ligated to 5 'ATTAGGATCCATGAAGATGCC
GGACCGCG 3 'and 5' AATTGGATCCGTA
Using the TGTTCTGGAACTACTTTGCTT3 'as a primer, rat brain quick clone cD
NA (Clontech) was amplified by PCR and obtained. C
A 840 base pair cDNA fragment containing the above-mentioned amino acids 699-976 was a rat myosin-binding subunit cDNA clone, which was named 5'ATATGGATCCCAA.
GCAAAAGTATTCCAGAACATAC 3 'and 5'ATTTGGATCCTACTTGGAAAGT
Using the primer of TTGCTTTATAAC3 ', P
It was obtained by amplification by the CR method. The cDNA fragment was incorporated into pMAL-c2 at the BamHI site.
【０１２５】ＲｈｏＡタンパク質ＧＴＰａｓｅ活性試験
は、Homma, Y. & Emori, Y., EMBOJ. 14, 286-291 (199
5) に記載の方法に従って実施した。ＲｈｏＡタンパク
質のＧＴＰａｓｅ活性は、［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ・ＧＳ
Ｔ−ＲｈｏＡの放射活性の減少を測定することにより調
べた。この際に用いた［γ−３２Ｐ］ＧＴＰは、アマシ
ャム社より購入した。［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ・ＧＳＴ−
ＲｈｏＡ （１０ｐｍｏｌ）を、種々の量のＭＢＰ、Ｍ
ＢＰ−Ｎ、またはＭＢＰ−ＣとＧＳＴ−ｐ１２２ Ｒｈ
ｏＧＡＰ（５ｐｍｏｌ）の存在下、非存在下で１００μ
ｌの反応液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＧＴＰ，０．０７５％ ＣＨＡ
ＰＳ中で、２５℃、２分間処理した。反応を３ｍｌの氷
冷停止バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ
８．０，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２）を加えて停止し、ニトロセルロースフィルター上
にのせた。フィルターは、同じ氷冷停止バッファーで３
回洗浄した後、結合している放射能活性を、シンチレー
ションカウンターを用いて測定した。結果は図７に示さ
れる通りであった。The RhoA protein GTPase activity test was performed according to Homma, Y. & Emori, Y., EMBOJ. 14, 286-291 (199).
This was performed according to the method described in 5). The GTPase activity of the RhoA protein is [γ- 32 P] GTP · GS
It was determined by measuring the decrease in T-RhoA radioactivity. [Γ- 32 P] GTP used at this time was purchased from Amersham. [Γ- 32 P] GTP · GST-
RhoA (10 pmol) was added to various amounts of MBP, M
BP-N, or MBP-C and GST-p122 Rh
100 μg in the presence and absence of oGAP (5 pmol)
l of the reaction solution (20 mM Tris / HCl (pH 7.
5), 10 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 mM
MgCl 2 , 1 mM GTP, 0.075% CHA
Treated in PS at 25 ° C. for 2 minutes. The reaction was run with 3 ml of ice cold stop buffer (20 mM Tris / HCl pH
8.0, 100 mM NaCl, 25 mM MgC
l 2) was added to stop, loaded onto a nitrocellulose filter. Filters were run in the same ice-cold stop buffer for 3 hours.
After washing twice, the bound radioactivity was measured using a scintillation counter. The results were as shown in FIG.
【０１２６】その結果、Ｒｈｏタンパク質が触媒する
［γ−３２Ｐ］ＧＴＰの加水分解率は、ＭＢＰ−Ｎ、Ｍ
ＢＰ−Ｃによって影響を受けなかった。これとは対照的
に、ｐ１２２ Ｒｈｏ ＧＡＰがＲｈｏタンパク質のＧ
ＴＰａｓｅ活性を刺激する能力は、ＭＢＰ−Ｎ、ＭＢＰ
−Ｃによって、濃度依存的に抑制されうることがわかっ
た。このことより、Ｒｈｏタンパク質はミオシン結合サ
ブユニットのＮ末端とＣ末端の両方に結合しうることが
示唆された。ＭＢＰ−ＮおよびＭＢＰ−ＣはＧＡＰ−刺
激によるＲｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅ活性を、それぞ
れ約１００ｎＭおよび約１５０ｎＭのＩＣ５０で抑制し
た（図７）。As a result, the hydrolysis rate of [γ- 32 P] GTP catalyzed by the Rho protein was determined by MBP-N and M
It was not affected by BP-C. In contrast, p122 Rho GAP is the Rho protein G
The ability to stimulate TPase activity is determined by MBP-N, MBP
It was found that -C could suppress the concentration-dependently. This suggested that the Rho protein could bind to both the N-terminal and C-terminal of the myosin binding subunit. MBP-N and MBP-C suppressed GAP-stimulated Rho protein GTPase activity with IC 50 of about 100 nM and about 150 nM, respectively (FIG. 7).
【０１２７】実施例５ ｐ１６４によるラット・ミオシ
ン結合サブユニットリン酸化試験 ｐ１６４のリン酸化活性を調べるために、以下の実験を
行なった。キナーゼ活性試験は、精製したｐ１６４（１
０ｎｇタンパク質量）を用いて、２μＭ［γ−３２Ｐ］
ＡＴＰ（６００−８００ＭＢｑ／ｍｍｏｌ）を含む５０
μｌのキナーゼバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ
２、０．０６％ ＣＨＡＰＳ）中で、基質（ミオシン結
合サブユニット、Ｓ６ペプチド、または下記の記載の細
胞骨格制御タンパク質、各４０μＭ）の存在下または非
存在下で行った。３０℃で１０分間インキュベート後、
反応溶液をＳＤＳサンプルバッファー中で煮沸して、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供した。放射能標識されたバ
ンドは、オートラジオグラフィーにより検出した。反応
溶液は、キナーゼ活性試験をするためにワットマンｐ８
１ペイパーにスポットした。３２Ｐの基質への取り込み
は、シンチレーションカウンターで計測した。結果は以
下に示される通りであった。尚、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ
は、Ａｍｅｒｓｈａｍ社から購入した。 Example 5 Rat myosi by p164
In order to examine the phosphorylation activity of the p- binding subunit phosphorylation test p164, the following experiment was performed. The kinase activity test was performed using purified p164 (1
0 ng protein amount) and 2 μM [γ- 32 P]
50 containing ATP (600-800 MBq / mmol)
μl of kinase buffer (50 mM Tris / HC
1, pH 7.5, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl
2 , 0.06% CHAPS) in the presence or absence of a substrate (myosin binding subunit, S6 peptide, or cytoskeletal regulatory protein described below, 40 μM each). After incubation at 30 ° C for 10 minutes,
The reaction solution is boiled in SDS sample buffer,
The sample was subjected to DS-PAGE electrophoresis. Radiolabeled bands were detected by autoradiography. The reaction solution was prepared using Whatman p8 for the kinase activity test.
I spotted one payer. The incorporation of 32 P into the substrate was measured with a scintillation counter. The results were as shown below. In addition, [γ- 32 P] ATP
Was purchased from Amersham.
【０１２８】（１）ラット・ミオシン結合サブユニット
を基質として用いた試験 Ｒｈｏタンパク質は細胞骨格の再編成に関係していると
考えられているので、ｐ１６４による細胞骨格制御タン
パク質であるビンキュリン（ｖｉｎｃｕｌｉｎ）、タリ
ン（ｔａｌｉｎ）、メタビンキュリン（ｍｅｔａｖｉｎ
ｃｕｌｉｎ）、カルデスモン（ｃａｌｄｅｓｍｏｎ）、
フィラミン（ｆｉｌａｍｉｎ）、ビメンチン（vimenti
n）、α−アクチニン（E. A. Clark & J.S. Brugge, Sc
ience, 268 , 233-239 (1995)）、ＭＡＰ−４（H. Aiza
wa et al., J. Biol. Chem.、265,13849-13855 (1990)
）、ミオシンフォスファターゼのミオシン結合サブユ
ニット（Y. H. Chen et al., FEBS Lett., 356, 51-55
(1994)）のリン酸化について、上記の条件に準じて検討
した。ただし、ミオシンフォスファターゼのミオシン結
合サブユニットについては、ラットのミオシン結合サブ
ユニットのＣ末端（配列番号１のアミノ酸配列の６９９
〜９７６番）とマルトース結合タンパク質との融合タン
パク質（実施例４参照）を用いた。その結果、ｐ１６４
はＧＳＴ−ＲｈｏＡ非存在下またはＧＤＰ・ＧＳＴ存在
下で、これらの基質をリン酸化した。ビンキュリン、タ
リン、メタビンキュリン、カルデスモン、フィラミン、
ビメンチン、α−アクチニンまたはＭＡＰ−４を基質と
して用いた場合には、ＧＴＰγＳ・ＲｈｏＡ存在下での
リン酸化の亢進の程度は低かった（データ省略）。しか
しながら、ミオシン結合サブユニット（５０ｎＭ）を基
質として用いると、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ存在
下で、リン酸化の程度は著しく亢進した（図８）。ＧＴ
ＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡによるミオシンサブユニット
のリン酸化の亢進の程度は、他のタンパク質を基質とし
て用いた場合と比較して、約１５倍であった。なお、用
いたＧＳＴ−ＲｈｏＡの濃度は各１μＭであった。(1) Test using rat myosin-binding subunit as a substrate Since Rho protein is considered to be involved in cytoskeletal rearrangement, vinculin, a cytoskeletal regulatory protein by p164, is used. , Talin, metavinculin (metavin)
culin), caldesmon,
Filamin, vimentin (vimenti)
n), α-actinin (EA Clark & JS Brugge, Sc
ience, 268, 233-239 (1995)), MAP-4 (H. Aiza
wa et al., J. Biol. Chem., 265,13849-13855 (1990).
), The myosin-binding subunit of myosin phosphatase (YH Chen et al., FEBS Lett., 356, 51-55).
(1994)) was studied according to the above conditions. However, regarding the myosin binding subunit of myosin phosphatase, the C-terminal of rat myosin binding subunit (699 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) was used.
No. 976) and a maltose binding protein (see Example 4). As a result, p164
Phosphorylated these substrates in the absence of GST-RhoA or in the presence of GDP.GST. Vinculin, Tallinn, Metavinculin, Caldesmon, Filamine,
When vimentin, α-actinin or MAP-4 was used as a substrate, the degree of enhancement of phosphorylation in the presence of GTPγS · RhoA was low (data not shown). However, when the myosin-binding subunit (50 nM) was used as a substrate, the degree of phosphorylation was significantly enhanced in the presence of GTPγS.GST-RhoA (FIG. 8). GT
The degree of enhancement of phosphorylation of myosin subunit by PγS.GST-RhoA was about 15-fold as compared with the case where another protein was used as a substrate. The concentrations of GST-RhoA used were 1 μM each.
【０１２９】（２）ＲｈｏＡタンパク質の翻訳後修飾の
影響 H. Horiuchi et al.、 Mol. Cell. Biol. 、 12 、 451
5-4520 (1992) およびT. Itoh 、 et al. 、 J. Biol.
Chem. 、 268、 3025-3028(1993)に記載の方法に準じ
て、翻訳後修飾されたＲｈｏＡタンパク質を作製した。
これを用いて、前述の方法に従って、ｐ１６４キナーゼ
活性への影響を調べた。結果は図９に示される通りであ
った。(2) Effect of post-translational modification of RhoA protein H. Horiuchi et al., Mol. Cell. Biol., 12, 451
5-4520 (1992) and T. Itoh, et al., J. Biol.
According to the method described in Chem., 268, 3025-3028 (1993), a post-translationally modified RhoA protein was prepared.
This was used to examine the effect on p164 kinase activity according to the method described above. The results were as shown in FIG.
【０１３０】翻訳後修飾されたＧＴＰγＳ結合型Ｒｈｏ
Ａタンパク質は、非修飾型よりもＳ６ペプチドのリン酸
化を亢進した。Post-Translationally Modified GTPγS-Binding Rho
The A protein enhanced the phosphorylation of the S6 peptide more than the unmodified form.
【０１３１】実施例６ 酵母ツー・ハイブリッド・シス
テムによるＲｈｏタンパク質とミオシン結合サブユニッ
トとの結合の測定 A.B.Vojetk et al.cell 74,205-214(1993)に記載の方法
に準じて、野生型Ｈ−Ｒａｓ、およびＣ末端のＣｙｓ−
Ａ−Ａ−Ｌｅｕ構造を除去した構成的に活性化された変
異型ＲｈｏＡＶａｌｌ４のｃＤＮＡ断片をｐＢＴＭ１１
６ベクター（前掲A.B.Vojetk et al. ）中に導入するこ
とにより、これらとＬｅｘＡを融合タンパク質として酵
母細胞中で発現させるためのベクター（それぞれ、ｐＢ
ＴＭ１１６−ＲａｓＷＴ、ｐＢＴＭ１１６−Ｒｈｏ
Ｖａｌｌ４とする）を構築し、これらを用いて酵母（Ｌ
４０株）を形質転換した。 Example 6 Yeast two hybrid cis
Rho protein and myosin binding subunit
Determination of binding to wild-type H-Ras and C-terminal Cys- according to the method described in AB Vojetk et al. Cell 74, 205-214 (1993).
The constitutively activated mutant RhoA Val4 cDNA fragment from which the AA-Leu structure was removed was transformed into pBTM11
6 (abVojetk et al., Supra) to express LexA and LexA as fusion proteins in yeast cells (pB, respectively).
TM116-RasWT, pBTM116-Rho
Val4 ), and yeast (L)
(40 strains).
【０１３２】また、配列番号１に記載のアミノ酸配列の
１〜７０７番の配列（ＭＢＳ−Ｎ）および６９９〜９７
６番の配列（ＭＢＳ−Ｃ）のｃＤＮＡをｐＡＣＴベクタ
ー（クロンテック社製、MATCHMAKERライブラリーキッ
ト）のＢａｍＨＩ部位中に導入することにより、これら
とＧＡＬ４を融合タンパク質として酵母細胞中で発現さ
せるためのベクター（それぞれ、ｐＡＣＴＩＩＨＫ−Ｍ
ＢＳ−Ｎ、ｐＡＣＴＩＩＨＫ−ＭＢＳ−Ｃとする）を構
築した。これらのベクターを用いて、ｐＢＴＭ１１６−
ＲａｓＷＴ、ｐＢＴＭ１１６−ＲｈｏＶａｌｌ４で形質
転換した酵母を形質転換した。それぞれの形質転換体は
ヒスチジン要求性で選択した(A.B.Vojetket al.Cell 7
4,205-214(1993))。In addition, the sequence of amino acids 1 to 707 (MBS-N) and 699 to 97 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
A vector for expressing cDNA of sequence 6 (MBS-C) into the BamHI site of a pACT vector (MATCHMAKER library kit manufactured by Clontech) to express GAL4 as a fusion protein in yeast cells. (Respectively, pACTIIHK-M
BS-N, pACTIIHK-MBS-C). Using these vectors, pBTM116-
Yeast transformed with RasWT, pBTM116-Rho Val4 was transformed. Each transformant was selected for histidine requirement (ABVojetk et al. Cell 7
4,205-214 (1993)).
【０１３３】その結果、図１０に示したようにＭＢＳ−
Ｃは変異型ＲｈｏＡＶａｌｌ４と結合するが、ＭＢＳ−
Ｎと変異型ＲｈｏＡＶａｌｌ４との結合はこれより弱い
ことがわかった。As a result, as shown in FIG.
C binds to mutant RhoA Val4 , but binds to MBS-
The binding between N and the mutant RhoA Val4 was found to be weaker.
【０１３４】実施例７ ｐ１６４によるニワトリ・ミオ
シン結合サブユニットのリン酸化とこれによるミオシン
軽鎖フォスファターゼ活性の抑制 （１）ｐ１６４によるニワトリ・ミオシン結合サブユニ
ットリン酸化試験 ｐ１６４はニワトリのミオシン結合サブユニットを用い
た場合でも、これをリン酸化した。ニワトリのミオシン
結合サブユニット（Shimizu, H. et al., J. Biol. Che
m., 269, 30407-30411 (1994) ）のＣ末端側のペプチド
断片（アミノ酸753 〜1004）とマルトース結合タンパク
質との融合タンパク質（ＭＢＳ−Ｃ）を実施例２（３）
に記載の方法に準じて作製し、これを基質として用い
て、実施例２（３）に記載の方法に準じてｐ１６４によ
るリン酸化の程度を測定した（図１１）。その結果、ｐ
１６４によるＭＢＳ−Ｃのリン酸化の程度は、コントロ
ール（ＧＳＴ存在下、レーン１）に比べ、ＧＴＰγＳ・
ＧＳＴ−ＲｈｏＡ存在下で５倍以上亢進した（レーン
３）。対照的に、ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（レーン
２）、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡＡｌａ３７（レー
ン４）、ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒａｃ１（レーン５）、ＧＴ
ＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒａｃ１（レーン６）ではリン酸化の
亢進は認められなかった。 Example 7 Chicken Mio by p164
Phosphorylation of the syn-binding subunit and thus myosin
Inhibition of light chain phosphatase activity (1) Phosphorylation test of chicken myosin binding subunit by p164 p164 phosphorylated chicken myosin binding subunit even when it was used. Chicken myosin binding subunit (Shimizu, H. et al., J. Biol. Che
m., 269, 30407-30411 (1994)) and a fusion protein (MBS-C) of a C-terminal peptide fragment (amino acids 753 to 1004) and a maltose binding protein was prepared in Example 2 (3).
And the degree of phosphorylation by p164 was measured using this as a substrate according to the method described in Example 2 (3) (FIG. 11). As a result, p
The degree of phosphorylation of MBS-C by 164 was higher than that of control (GST in the presence of GST, lane 1).
In the presence of GST-RhoA, the activity was enhanced 5 times or more (lane 3). In contrast, GDP GST-RhoA (lane 2), GTPγS GST-RhoA Ala37 (lane 4), GDP GST-Rac1 (lane 5), GT
No increase in phosphorylation was observed in PγS.GST-Rac1 (lane 6).
【０１３５】また、ニワトリのミオシン結合サブユニッ
ト（Shimizu, H. et al., J. Biol.Chem., 269, 30407-
30411 (1994) ）のＮ末端側のペプチド断片（アミノ酸1
〜721 ）を、ＭＢＳ−Ｃのかわりに基質として用いた
場合は、ｐ１６４はこれをリン酸化しなかった（データ
省略）。The chicken myosin binding subunit (Shimizu, H. et al., J. Biol. Chem., 269, 30407-)
30411 (1994)), an N-terminal peptide fragment (amino acid 1
721721) was used as a substrate instead of MBS-C, p164 did not phosphorylate it (data not shown).
【０１３６】（２）ｐ１６４によるニワトリ・ミオシン
軽鎖フォスファターゼ活性の抑制 ニワトリ砂嚢からの天然のミオシン軽鎖フォスファター
ゼの精製は、Shimizu,H. et al., J. Biol. Chem., 26
9, 30407-30411 (1994) に記載の方法に従って実施し
た。様々な濃度の天然ウシ脳由来のｐ１６４存在下で、
ミオシン軽鎖フォスファターゼのリン酸化を測定した
（実験１）。また、様々な濃度のｐ１６４存在下でリン
酸化したミオシン軽鎖フォスファターゼの酵素活性を測
定した（実験２）。(2) Inhibition of chicken myosin light chain phosphatase activity by p164 Purification of native myosin light chain phosphatase from chicken gizzard was performed according to Shimizu, H. et al., J. Biol. Chem., 26
9, 30407-30411 (1994). In the presence of various concentrations of p164 from natural bovine brain,
Phosphorylation of myosin light chain phosphatase was measured (Experiment 1). In addition, the enzymatic activity of phosphorylated myosin light chain phosphatase in the presence of various concentrations of p164 was measured (Experiment 2).
【０１３７】その結果、ｐ１６４の濃度依存的に、ミオ
シン軽鎖フォスファターゼ中のミオシン結合サブユニッ
トがリン酸化されること、およびｐ１６４によるリン酸
化により、ミオシン軽鎖フォスファターゼの酵素活性が
抑制されることが明かとなった。図１２は、以上の独立
した２つの実験（実験１および実験２）の結果を合わせ
て、ｐ１６４の濃度を横軸に取って示したものである。
尚、実験１および実験２の具体的な方法は下記に示した
とおりである。As a result, the myosin binding subunit in myosin light chain phosphatase is phosphorylated in a p164 concentration-dependent manner, and the enzymatic activity of myosin light chain phosphatase is suppressed by phosphorylation by p164. It became clear. FIG. 12 shows the concentration of p164 on the horizontal axis, combining the results of the above two independent experiments (Experiment 1 and Experiment 2).
The specific methods of Experiment 1 and Experiment 2 are as described below.
【０１３８】ｐ１６４による天然のミオシン軽鎖フォス
ファターゼのリン酸化（実験１）は、種々の量のｐ１６
４存在下、１μＭのＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ存在
下または非存在下で、精製したミオシン軽鎖フォスファ
ターゼ（１．０μｇタンパク量）を含む４０μｌのバッ
ファー（３４ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ， ｐＨ ７．
５、３４ｍＭ ＫＣｌ、４．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．
６２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１．２ｍＭ ＤＴＴ、１．３％
シュクロース、０．３８％ ＣＨＡＰＳ、１０μＭ
［３５Ｓ］ＡＴＰγＳ）中で行なった。３分間インキュ
ベート後、反応混合液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行
なった後、ミオシン結合サブユニットの被リン酸化の程
度をオートラジオグラフィー（Ｆｕｊｉ ＢＡＳ−２０
００）により測定した。Phosphorylation of native myosin light chain phosphatase by p164 (Experiment 1) resulted in varying amounts of p16
4 in the presence or absence of 1 μM GTPγS.GST-RhoA in the presence or absence of 40 μl of a buffer (34 mM Tris / HCl, pH 7.0) containing purified myosin light chain phosphatase (1.0 μg protein).
5, 34 mM KCl, 4.0 mM MgCl 2 , 1.
625 mM EDTA, 1.2 mM DTT, 1.3%
Sucrose, 0.38% CHAPS, 10 μM
[ 35 S] ATPγS). After incubation for 3 minutes, the reaction mixture was subjected to SDS-PAGE electrophoresis, and the degree of phosphorylation of the myosin-binding subunit was determined by autoradiography (Fuji BAS-20).
00).
【０１３９】ミオシン軽鎖フォスファターゼ活性に及ぼ
すリン酸化の影響（実験２）を調べるために、上記と同
様の方法により精製したミオシン軽鎖フォスファターゼ
（１．０μｇタンパク量）を、放射能で標識しない１０
μＭ ＡＴＰγＳの存在下または非存在下、１μＭのＧ
ＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ存在下または非存在下で、
種々の濃度のｐ１６４によりリン酸化した。反応は５μ
ｌの４６ｍＭ ＥＤＴＡを加えて停止した。次に５μｌ
の放射標識したミオシン軽鎖を含む３０ｍＭＴｒｉｓ／
ＨＣｌ，ｐＨ７．５、３０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ
ＤＴＴを加えて、トータル５０μｌの反応混合液（５μ
Ｍ ３２Ｐ−ミオシン軽鎖を含む）として反応を開始し
た。反応は３０℃にて６分間行なった。反応を停止した
後、ミオシン軽鎖に結合した３２Ｐの量をIshihara, H.
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159, 871-8
77 (1989) に記載の方法により測定した。In order to investigate the effect of phosphorylation on myosin light chain phosphatase activity (Experiment 2), myosin light chain phosphatase (1.0 μg protein) purified by the same method as described above was not labeled with radioactivity.
1 μM G in the presence or absence of μM ATPγS
In the presence or absence of TPγS · GST-RhoA,
It was phosphorylated by various concentrations of p164. Reaction is 5μ
Stop by adding 1 l of 46 mM EDTA. Then 5 μl
30 mM Tris / containing the radiolabeled myosin light chain
HCl, pH 7.5, 30 mM KCl, 0.5 mM
Add DTT and add a total of 50 μl of reaction mixture (5 μl
M32P-myosin light chain). The reaction was performed at 30 ° C. for 6 minutes. After stopping the reaction, the amount of 32 P bound to the myosin light chain was determined by Ishihara, H .;
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159, 871-8
77 (1989).
【０１４０】結果は、図１２に示すように、ｐ１６４濃
度依存的に３５Ｓ−チオリン酸がミオシン軽鎖フォスフ
ァターゼに取り込まれた。[0140] The results, as shown in FIG. 12, P164 concentration dependent manner 35 S- thiophosphoric acid was incorporated in myosin light chain phosphatase.
【０１４１】一方、ＡＴＰγＳ存在下では、ｐ１６４濃
度依存的にミオシン軽鎖フォスファターゼ活性の抑制が
見い出されたが、この抑制はＡＴＰγＳ非存在下では見
られなかった。以上の結果より、ｐ１６４によりリン酸
化を受けると、ミオシン軽鎖フォスファターゼの酵素活
性が抑制されることが明かとなった。On the other hand, in the presence of ATPγS, suppression of myosin light chain phosphatase activity was found in a p164 concentration-dependent manner, but this suppression was not observed in the absence of ATPγS. The above results revealed that phosphorylation by p164 suppresses the enzymatic activity of myosin light chain phosphatase.
【０１４２】実施例８ ＮＩＨ／３Ｔ３細胞内でのＲｈ
ｏによるミオシン結合サブユニットおよびミオシン軽鎖
のリン酸化の亢進の測定 下記に記載する様に、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞内で、Ｒｈｏ
によってミオシン結合サブユニットのリン酸化が亢進す
るかどうかについて検討した。製造企業（Stratagene
社）の使用説明書に基づき、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に、ｐ
３’ＳＳおよびｐＯＰＲＳＶＩ−ＨＡ−ＲｈｏＡまたは
ｐＯＰＲＳＶＩ−ＨＡ−ＲｈｏＡＶａｌ１４を安定的に
トランスフェクションした。これらのプラスミドはＩＰ
ＴＧ制御下にヘマグルチニン（ＨＡ）−ＲｈｏＡまたは
ＨＡ−ＲｈｏＡＶａｌ１４を発現させることができる。
３５ｍｍディッシュ中で培養しコンフルエント（conflu
ent）に達したＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（親株、ＮＩＨ／
３Ｔ３−ＲｈｏＡ−５、ＮＩＨ／３Ｔ３−ＲｈｏＡ−２
４、ＮＩＨ／３Ｔ３−ＲｈｏＡＶａｌ１４−７およびＮ
ＩＨ／３Ｔ３−ＲｈｏＡＶａｌ１４−２４）を５ｍＭ
ＩＰＴＧで２４時間処理した。最後の１２時間は、血清
を除去した培養液中で培養し、その後、９．２５ ＭＢ
ｑの［３２Ｐ］−オルトリン酸で２時間標識した。その
後、３２Ｐで標識した細胞を溶解し、ミオシン結合サブ
ユニットを免疫沈降させた。洗浄した免疫沈降物をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにかけ、オートラジオグラフィーした。 Example 8 Rh in NIH / 3T3 cells
Myosin binding subunit and myosin light chain by o
Measurement of enhanced phosphorylation of Rho as described below in NIH / 3T3 cells.
Whether the phosphorylation of the myosin-binding subunit was enhanced by the treatment. Manufacturer (Stratagene
NIH / 3T3 cells according to the manufacturer's instructions
3′SS and pOPRSVI-HA-RhoA or pOPRSVI-HA-RhoA Val14 were stably transfected. These plasmids are IP
Hemagglutinin (HA) -RhoA or HA-RhoA Val14 can be expressed under TG control.
Culture in a 35mm dish and confluent (conflu
ent), the NIH / 3T3 cell line (parent strain, NIH /
3T3-RhoA-5, NIH / 3T3-RhoA-2
4, NIH / 3T3-RhoA Val14-7 and N
IH / 3T3-RhoA Val14-24 ) at 5 mM
Treated with IPTG for 24 hours. For the last 12 hours, the cells were cultured in a serum-free medium, and then 9.25 MB
Labeled with q [ 32 P] -orthophosphoric acid for 2 hours. Thereafter, the cells labeled with 32 P were lysed and the myosin-binding subunit was immunoprecipitated. The washed immunoprecipitate is transferred to SD
S-PAGE and autoradiography.
【０１４３】上記の方法で、ＲｈｏＡまたはＲｈｏＡ
Ｖａｌ１４をＮＩＨ／３Ｔ３細胞中に過剰に発現させた
ところ、過去に記載（A. J. Ridley & A. Hall, Cell 7
0, 389-399 (1992) およびA. J. Ridley & A. Hall, EM
BO J., 13, 2600-2610 (1994)）のごとく、高いレベル
のストレス・ ファイバーおよびフォーカル・コンタクト
形成が観察された。ミオシン結合サブユニットの量は、
親株を含む全てのＮＩＨ／３Ｔ３細胞株でほぼ同程度だ
った（データ省略）が、ＲｈｏＡまたはＲｈｏＡ
Ｖａｌ１４を過剰に発現させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞内の
ミオシン結合サブユニットのリン酸化の程度は、親株の
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞内のミオシン結合サブユニットのリ
ン酸化の程度に比べて顕著に高かった（図１３）。In the method described above, RhoA or RhoA
Val14 was overexpressed in NIH / 3T3 cells and was previously described (AJ Ridley & A. Hall, Cell 7
0, 389-399 (1992) and AJ Ridley & A. Hall, EM
BO J., 13, 2600-2610 (1994)), high levels of stress fiber and focal contact formation were observed. The amount of myosin binding subunit is
RhoA or RhoA was almost the same in all NIH / 3T3 cell lines including the parent strain (data not shown).
The degree of phosphorylation of the myosin-binding subunit in NIH / 3T3 cells overexpressing Val14 was significantly higher than the degree of phosphorylation of the myosin-binding subunit in the parent strain NIH / 3T3 cells (FIG. 13).
【０１４４】次に、親株およびＲｈｏＡまたはＲｈｏＡ
Ｖａｌ１４を過剰に発現させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞内の
ミオシン軽鎖のリン酸化の程度を、下記に記載の方法に
従って測定した。ＩＰＴＧ処理および血清除去操作を１
００ｍｍディッシュ中で行ったＮＩＨ／３Ｔ３細胞株に
１０％ ＴＣＡを添加した。ミオシン軽鎖のリン酸化の
程度を決定するために、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈降
物をグリセロール- ウレア・ゲル電気泳動にかけ、リン
酸化された（monophosphorylated（ＭＬＣＰ）and diph
osphorylated （ＭＬＣＰ２））ミオシン軽鎖とリン酸
化されていないミオシン軽鎖の相対的な量を、イムノ・
ブロット法（D. A. Taylor & J. T. Stull, J. Biol. C
hem. 263, 14456 (1988)）により定量した。この際、細
胞を、０．１μＭのフォスファターゼ阻害剤（calyculi
n-A (CLA) ）で１０分間処理したところ、ミオシン軽鎖
のリン酸化の程度は上昇した（図１４）。ＲｈｏＡまた
はＲｈｏＡＶａｌ１４を過剰に発現させたＮＩＨ／３Ｔ
３細胞内のミオシン軽鎖のリン酸化の程度は、親株のＮ
ＩＨ／３Ｔ３細胞内のミオシン軽鎖のリン酸化の程度に
比べて明かに高かった（図１４）。異なる３株のＲｈｏ
ＡまたはＲｈｏＡＶａｌ１４を過剰に発現させたＮＩＨ
／３Ｔ３細胞を用いて、本質的に同一の結果が得られ
た。Next, the parent strain and RhoA or RhoA
The degree of phosphorylation of myosin light chain in NIH / 3T3 cells overexpressing Val14 was measured according to the method described below. IPTG treatment and serum removal operation
10% TCA was added to the NIH / 3T3 cell line performed in a 00 mm dish. To determine the extent of phosphorylation of the myosin light chain, the trichloroacetic acid (TCA) precipitate was subjected to glycerol-urea gel electrophoresis, and the phosphorylated (monophosphorylated (MLCP) and diph.
osphorylated (MLCP 2 )) The relative amounts of myosin light chain and unphosphorylated myosin light chain were determined by immuno-
Blot method (DA Taylor & JT Stull, J. Biol. C
263, 14456 (1988)). At this time, the cells were replaced with 0.1 μM phosphatase inhibitor (calyculi
nA (CLA)) for 10 minutes increased the degree of phosphorylation of the myosin light chain (FIG. 14). NIH / 3T overexpressing RhoA or RhoA Val14
3 The degree of phosphorylation of the myosin light chain in the cells
It was clearly higher than the degree of phosphorylation of myosin light chain in IH / 3T3 cells (FIG. 14). Three different strains of Rho
NIH overexpressing A or RhoA Val14
Essentially identical results were obtained using / 3T3 cells.
【０１４５】以下の理論に拘束される訳ではないが、以
上の結果は、発現誘導させたＲｈｏＡまたは、ＲｈｏＡ
Ｖａ１１４により、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞内に内因性に存
在するｐ１６４タンパク質が、活性化された結果、ミオ
シン結合サブユニットのリン酸化が亢進し、ミオシン軽
鎖フォスファターゼ活性が阻害され、これによって、ミ
オシン軽鎖の脱リン酸化が抑制されたと解釈される。Without being bound by the following theory, the above results are based on the expression-induced RhoA or RhoA
Activation of the p164 protein endogenously present in NIH / 3T3 cells by Va114 results in enhanced phosphorylation of the myosin-binding subunit and inhibition of myosin light chain phosphatase activity, whereby myosin light chain is inhibited. It is interpreted that the dephosphorylation of was suppressed.
【０１４６】実施例９ ミオシン結合サブユニットの細
胞内分布における活性型Ｒｈｏの効果 ＣＯＳ−７細胞にミオシン結合サブユニット（ＭＢＳ）
を発現させた際のミオシン結合サブユニットの細胞内分
布について検討した。具体的には下記の方法に従って実
験を実施した。 Example 9 Details of Myosin Binding Subunit
Effect of activated Rho on intracellular distribution Myosin binding subunit (MBS) in COS-7 cells
The subcellular distribution of the myosin-binding subunit when was expressed was examined. Specifically, the experiment was performed according to the following method.
【０１４７】Ｍｙｃエピトープ・タグを融合させたＭＢ
Ｓ（Ｍｙｃ−ＭＢＳ）を発現させるために、ラットＭＢ
ＳをｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｍｙｃ（Mizushima, S. & Nagat
a, S., Nucleic. Acids Res., 18, 5322 (1990)）中に
クローニングし、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｍｙｃ−ＭＢＳを得
た。また、ヘマトアグルチニン（ＨＡ）・タグを融合さ
せたＨＡ−ＲｈｏＡおよびＨＡ−ＲｈｏＡ
Ｖａｌ１４（Mukai, H. et al., Biochem. Biopys. Re
s. Commun., 204, 348-356 (1994)）を発現させるため
に、 ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＨＡ−ＲｈｏＡおよびｐＥＦ−
ＢＯＳ−ＨＡ−ＲｈｏＡＶａｌ１４を得た。ｐＥＦ−Ｂ
ＯＳ−Ｍｙｃ中のＭｙｃをＨＡに置換したｐＥＦ−ＢＯ
Ｓ−ＨＡ中にクローニングし、プラスミドｐＥＦ−ＢＯ
Ｓ−Ｍｙｃ−ＭＢＳおよびｐＥＦ−ＢＯＳ−ＨＡ−Ｒｈ
ｏＡまたはｐＥＦ−ＢＯＳ−ＨＡ−ＲｈｏＡＶａｌ１４
を、Ridley, A. et al., Cell 70, 401-410 (1992)に記
載の方法に従って、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクシ
ョンした。４０時間後、細胞を回収し、細胞溶解用バッ
ファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），
１ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ピ
ロリン酸ナトリウム，２．５μｇ／ｍｌ ロイペプチ
ン，０．１５Ｍ ＮａＣｌ）に懸濁し、Dounceホモジェ
ナイザーによってホモジェナイズした。核と細胞の残骸
を、４０００×ｇで５分間遠心分離することによって沈
殿させた。上清を１００，０００×ｇで３０分間遠心分
離することによって、サイトゾル画分および膜（partic
ulate ）画分を得た。サイトゾル画分および膜画分をそ
れぞれ、Ｍｙｃ−エピトープに対する抗体（９Ｅ１０）
を用いたイムノブロット解析にかけた。MB with Myc Epitope Tag Fused
To express S (Myc-MBS), rat MB
S for pEF-BOS-Myc (Mizushima, S. & Nagat
a, S., Nucleic. Acids Res., 18, 5322 (1990)) to obtain pEF-BOS-Myc-MBS. HA-RhoA and HA-RhoA fused with a hematoagglutinin (HA) tag
Val14 (Mukai, H. et al., Biochem. Biopys. Re.
s. Commun., 204, 348-356 (1994)) to express pEF-BOS-HA-RhoA and pEF-.
BOS-HA-RhoA Val14 was obtained. pEF-B
PEF-BO obtained by substituting Myc in OS-Myc with HA
Cloned in S-HA, plasmid pEF-BO
S-Myc-MBS and pEF-BOS-HA-Rh
oA or pEF-BOS-HA-RhoA Val14
Was transfected into COS-7 cells according to the method described in Ridley, A. et al., Cell 70, 401-410 (1992). After 40 hours, the cells were collected, and a cell lysis buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5),
The suspension was suspended in 1 mM EDTA, 5 mM MgCl 2 , 10 mM sodium pyrophosphate, 2.5 μg / ml leupeptin, 0.15 M NaCl) and homogenized with a Dounce homogenizer. Nuclei and cell debris were sedimented by centrifugation at 4000 xg for 5 minutes. The supernatant was centrifuged at 100,000 × g for 30 minutes to remove cytosolic fractions and membranes (partic
ulate) fractions were obtained. The cytosolic fraction and the membrane fraction were each treated with an antibody against Myc-epitope (9E10)
For immunoblot analysis.
【０１４８】結果は図１５に示される通りであった。即
ち、約４０％のミオシン結合サブユニット（Ｍｙｃ−Ｍ
ＢＳ）がサイトゾル画分に、残りの６０％が膜画分に存
在することがわかった。細胞をＲｈｏＡとともにトラン
スフェクションしたところ、サイトゾル画分に存在する
ミオシン結合サブユニットが減少するとともに、膜画分
に存在するミオシン結合サブユニットが増加した。ＨＡ
−ＲｈｏＡに比べてＲｈｏＡＶａｌ１４ではよりこの効
果が高かった。以上のことから、ＲｈｏＡは、ミオシン
結合サブユニットの膜への分布を促進すること、そして
ＲｈｏＡのこの作用は、ＲｈｏＡがミオシン結合サブユ
ニットと複合体を形成することによって現れると考えら
れる。The results were as shown in FIG. That is, about 40% of the myosin binding subunit (Myc-M
BS) was found in the cytosol fraction and the remaining 60% was in the membrane fraction. When cells were transfected with RhoA, the number of myosin-binding subunits present in the cytosolic fraction decreased and the number of myosin-binding subunits present in the membrane fraction increased. HA
-This effect was higher with RhoA Val14 than with RhoA. From the above, it is considered that RhoA promotes the distribution of myosin-binding subunit to the membrane, and that this action of RhoA is manifested by RhoA forming a complex with myosin-binding subunit.
【０１４９】実施例１０ ヒトミオシン結合サブユニッ
トをコードするｃＤＮＡのクローニング （１）ヒト・ミオシン結合サブユニット（ＭＢＳ）をコ
ードするcDNAのクローニング ニワトリミオシン結合サブユニット（MBS)をコードする
cDNAの部分断片Z3(Shimizu. H., et. al., J. Biol. Ch
em., 269, 30407-30411(1994) に記載される）をプロー
ブとして、ラット肺動脈λUni-ZAP XR cDNA ライブラリ
ー（Stratagene社）をスクリーニングし、ラットの肺由
来MBS の部分cDNA（配列番号２の2364〜3364 番）を得
た。これをプローブとして、ヒト肺Uni-ZAP XR cDNA ラ
イブラリー（Stratagene社）をスクリーニングした。そ
の結果、ヒト肺由来のMBS のcDNAクローンを3 つ（L1,
L2, L3) 得た。塩基配列解析の結果、L1は配列番号４の
743〜2360、L2は2275〜3329 、L3は2892〜4855 の塩基
配列をコードすることが解かった（図１６参照）。 Example 10 Human myosin-binding subunit
(1) Cloning of cDNA encoding human myosin binding subunit (MBS) Encoding chicken myosin binding subunit (MBS)
cDNA partial fragment Z3 (Shimizu. H., et.al., J. Biol. Ch.
em., 269, 30407-30411 (1994)) as a probe, a rat pulmonary artery λUni-ZAP XR cDNA library (Stratagene) was screened, and a partial cDNA of rat lung MBS (SEQ ID NO: 2) was screened. 2364-3364). Using this as a probe, a human lung Uni-ZAP XR cDNA library (Stratagene) was screened. As a result, three human lung-derived MBS cDNA clones (L1,
L2, L3) obtained. As a result of the nucleotide sequence analysis, L1 was
It was found that 743-2360, L2 encoded a base sequence of 2275-3329, and L3 encoded a base sequence of 2892-4855 (see FIG. 16).
【０１５０】さらに、L1をプローブとして、ヒトλgt10
cDNAライブラリー（CLONTECH社）（1.0 ×106 プラー
ク）をスクリーニングした。その結果、Ｎ末およびC 末
を含む2 つのクローン（L1-3, L1-1) を得た。塩基配列
解析の結果、L1-3は塩基配列1〜895、L1-1は2183〜3344
の塩基配列をコードしていた（図１６参照）。L1-1とＬ
２の塩基配列を比較したところ、 L1-1 では２６１５番
がＧであるのに対して、Ｌ２ではＣであった（ただしコ
ードされるアミノ酸はいずれもLeu であり変わらない）
（図１６）。この塩基配列のバリエーションはポリモー
フィズムであると考えられる。ヒトMBS cDNAの中央部
分を含む断片Ｃ( 配列番号４の８６５〜２２５６番の塩
基配列）は、Human Brain QUIK-CloneTM cDNA （CLONTE
CH社）を鋳型として、プライマー（5′ CTG CAG GTA CA
G CAC TTC ACG TTG CAG CTG 3′ および 5′ TTT GGG
ATT CAG ACT CTT CAT CCC TAA CAG 3′)を使用して、TA
KARA LA-PCR Kit ( 宝酒造社）を用いてPCR を行い増幅
した（図１６参照）。ヒトMBS cDNAのオープンリーディ
ング フレームをカバーするこれらのクローンを合わせ
て、全長ＭＢＳ ｃＤＮＡをStratagene社pBluscriptII
SK(-)（M.A.Alting-Mees et. al., Nucleic Acids Re
s., 17, 9494 (1989)) にクローン化した（図１６参
照）。Further, using L1 as a probe, human λgt10
A cDNA library (CLONTECH) (1.0 × 10 6 plaques) was screened. As a result, two clones (L1-3, L1-1) containing N-terminal and C-terminal were obtained. As a result of the nucleotide sequence analysis, L1-3 is the nucleotide sequence 1 to 895, L1-1 is 2183 to 3344
(See FIG. 16). L1-1 and L
Comparison of the nucleotide sequences of No. 2 revealed that G was found at position 2615 in L1-1, whereas it was C in L2 (however, the encoded amino acids are Leu and remain the same).
(FIG. 16). This variation of the nucleotide sequence is considered to be polymorphism. Fragment C containing the central portion of human MBS cDNA (nucleotide sequence from 865 to 2256 in SEQ ID NO: 4) was obtained from Human Brain QUIK-Clone ™ cDNA (CLONTE
Using CH as a template, primers (5 'CTG CAG GTA CA
G CAC TTC ACG TTG CAG CTG 3 ′ and 5 ′ TTT GGG
ATT CAG ACT CTT CAT CCC TAA CAG 3 ′)
PCR was performed using KARA LA-PCR Kit (Takara Shuzo) to amplify (see FIG. 16). These clones covering the open reading frame of human MBS cDNA are combined and the full-length MBS cDNA is transformed into Stratagene pBluscriptII.
SK (-) (MAAlting-Mees et. Al., Nucleic Acids Re
s., 17, 9494 (1989)) (see FIG. 16).
【０１５１】上記のスクリーニングは、J. Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual: Cold
Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor,NY(198
9)に従って行った。上記の塩基配列の解析は、Pharmaci
a 社製double-stranded Nested Deletion Kit を使用し
て整列欠失を作成し、ABI 社の 377 DNAシークエンサー
を使って配列を決定した。[0151] The screening described above was performed by J. Sambrook et.
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual: Cold
Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, NY (198
9). The above nucleotide sequence analysis was performed by Pharmaci
Alignment deletions were made using the double-stranded Nested Deletion Kit (a) and sequenced using the ABI 377 DNA sequencer.
【０１５２】また、上記で用いたライブラリー・スクリ
ーニングのためのハイブリダイゼーションの条件は下記
の通りであった。まず、6 ×SSC, 10 ×Denhardt′s so
ln.,1%SDS, 200mg/ml ssDNA 中で、65℃3 時間プレハイ
ブリダイゼーションを行った。次いで、STRATAGENE社 P
rimie-it II RandomPrimer Labeling Kit をもちいてプ
ローブを32P ラベルし、このプローブを加え、65℃で一
晩ハイブリダイゼーションを行った。2 ×SSC, 0.1%SDS
で室温で15分の洗浄を4 回行った。尚、上記に用いた
溶液の組成は、１×ＳＳＣ溶液（0.15M NaCl, 15mM ク
エン酸ナトリウム(pH7.0) ）および１× Denhardt′s s
olution（0.02% フィコール, 0.02%ポリビニルピロリド
ン, 0.02% ウシ血清アルブミン）であった。The hybridization conditions for library screening used above were as follows. First, 6 × SSC, 10 × Denhardt ′s so
Prehybridization was performed at 65 ° C. for 3 hours in ln., 1% SDS, 200 mg / ml ssDNA. Next, STRATAGENE P
The probe was labeled with 32 P using the rimie-it II RandomPrimer Labeling Kit, the probe was added, and hybridization was performed at 65 ° C. overnight. 2 x SSC, 0.1% SDS
Washing was performed four times at room temperature for 15 minutes. The composition of the solution used above was 1 × SSC solution (0.15 M NaCl, 15 mM sodium citrate (pH 7.0)) and 1 × Denhardt'ss
olution (0.02% ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone, 0.02% bovine serum albumin).
【０１５３】（２）配列分析 全長のヒトＭＢＳ ｃＤＮＡの塩基配列およびこれより
推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４および
配列番号３に記載した通りであった。ヒト脳由来のＭＢ
Ｓ ｃＤＮＡの配列は、決定されたヒト肺由来のＭＢＳ
の部分ｃＤＮＡ配列と完全に一致した。ヒトＭＢＳの推
定アミノ酸配列は１０３０アミノ酸残基からなり、推定
分子量は、約１１５ｋＤａであった。ヒトＭＢＳのアミ
ノ酸配列は、ラット（配列番号１）およびニワトリ（Sh
imizu, H. et al., J. Biol. Chem.269, 30407-30411
(1994)）のものと同様に、Ｎ末側にアンキリン リピー
ト、Ｃ末側にロイシン ジッパー様ドメイン（配列番号
３の９３５〜１０３０番のアミノ酸配列）が存在した。
ヒトＭＢＳのアンキリン リピート（配列番号３に３９
〜２９５番のアミノ酸配列）は、ラットＭＢＳのアンキ
リン リピート（配列番号１に記載の３９〜２５３番の
アミノ酸配列）と９９％、ニワトリＭＢＳのアンキリン
リピート（アミノ酸配列３９〜２９５番）（Shimizu,
H. et al., J.Biol. Chem. 269, 30407-30411 (199
4)）と９６％の同一性を示した。そして、全長のヒトＭ
ＢＳのアミノ酸配列（配列番号３に記載の１〜１０３０
番のアミノ酸配列）は、ラットのそれ（配列番号１に記
載の１〜９７６番のアミノ酸配列）と８９％、ニワトリ
それ（１〜９６３番のアミノ酸配列）（Shimizu, H. et
al., J. Biol. Chem. 269, 30407-30411 (1994)）と８
１％の同一性を示した。(2) Sequence Analysis The nucleotide sequence of the full-length human MBS cDNA and the amino acid sequence deduced therefrom were as described in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 3, respectively. MB from human brain
The sequence of the S cDNA was determined to be the MBS from the determined human lung.
Completely matched the partial cDNA sequence. The deduced amino acid sequence of human MBS was composed of 1030 amino acid residues, and the deduced molecular weight was about 115 kDa. The amino acid sequence of human MBS was determined for rat (SEQ ID NO: 1) and chicken (Sh
imizu, H. et al., J. Biol. Chem. 269, 30407-30411
(1994)), an ankyrin repeat was present on the N-terminal side, and a leucine zipper-like domain (amino acid sequence of positions 935 to 1030 of SEQ ID NO: 3) was present on the C-terminal side.
Ankyrin repeat of human MBS (39 in SEQ ID NO: 3)
The amino acid sequence of No. 295 to the amino acid sequence of rat MBS (amino acid sequence of No. 39 to 253 of SEQ ID NO: 1) and 99%, and the ankyrin repeat of chicken MBS (No. 39 to 295 of amino acid sequence) (Shimizu,
H. et al., J. Biol. Chem. 269, 30407-30411 (199
4)) and 96% identity. And full length human M
Amino acid sequence of BS (1-1030 of SEQ ID NO: 3)
No. 1) is 89% of that of rat (amino acid sequence of Nos. 1 to 976 described in SEQ ID NO: 1) and that of chicken (amino acid sequence of Nos. 1 to 963) (Shimizu, H. et al.
al., J. Biol. Chem. 269, 30407-30411 (1994)) and 8
It showed 1% identity.
【０１５４】実施例１１ ツーハイブリッド法をもちい
たヒトＭＢＳと活性型Ｒｈｏタンパク質との結合の検出 ヒトＭＢＳのアミノ酸配列７５４〜１０３０に相当する
ｃＤＮＡ断片を、配列番号４に記載のｃＤＮＡを鋳型と
し、５′−ＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＴＧＧＡＡ
ＡＧＴＴＴＧＣＴＴＡＴＡＡＣＴＣＴＧＡＴＣ−３′、
および５′−ＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＡＴＡＡＡ
ＣＡＡＡＡＧＴＡＣＴＣＣＡＧＡＡＣ−３′をプライマ
ーとしたＰＣＲによって増幅し、プラスミドｐＶＰ１６
（Vojtek,A.B.et. al. Cell ,74,205-214 (1993)）のＮ
ｏｔＩ部位に挿入し、ＶＰ１６−ＭＢＳ融合タンパク質
の酵母発現用ベクター（ｐＶＰ１６−ｈＭＢＳ）を作製
した。またVojtek,A.B.et. al. Cell ,74,205-214 (199
3)に準じて、プラスミドｐＢＴ１１６（Vojtek,A.B.et.
al. Cell ,74,205-214 (1993)）に低分子量Ｇタンパク
質（野生型Ｈ−Ｒａｓ、活性型Ｈ−ＲａｓＶａｌ１２、
野生型Ｒｈｏ、および活性型ＲｈｏＶａｌ１４）のｃＤ
ＮＡを挿入することにより、ＬｅｘＡ−野生型Ｈ−Ｒａ
ｓ融合タンパク質、ＬｅｘＡ−活性型Ｈ−Ｒａｓ
Ｖａｌ１２融合タンパク質、ＬｅｘＡ−野生型Ｒｈｏ融
合タンパク質、ＬｅｘＡ−活性型ＲｈｏＶａｌ１４融合
タンパク質の酵母発現用ベクターを作製した。ＬｉＣｌ
法（Ito, H.et. al. J.Bacteriol., 153,163-168 (198
3) ）により、ｐＶＰ１６−ｈＭＢＳとそれぞれのｐＢ
ＴＭ１１６−低分子量Ｇタンパク質を酵母（S. cerevis
iae ）のＬ４０株（Mat a trp1 leu2 his3 ade2 LYS2::
(LexAop)4-HIS3 URA3::(LexAop)8-LacZ ）に導入し、Ｖ
Ｐ１６−ＭＢＳ融合タンパク質とＬｅｘＡ−野生型Ｈ−
Ｒａｓ融合タンパク質、ＬｅｘＡ−活性型Ｈ−Ｒａｓ
Ｖａｌ１２融合タンパク質、ＬｅｘＡ−野生型Ｒｈｏ融
合タンパク質、またはＬｅｘＡ−活性型Ｒｈｏ
Ｖａｌ１４融合タンパク質を発現させた。選択培地（ロ
イシン、トリプトファン、ヒスチジンを含まない）上で
培養し、ヒスチジン要求性を検討した。その結果、活性
型ＲｈｏＶａｌ１４とＶＰ１６−ＭＢＳ融合蛋白質を共
発現している株でのみ、選択培地上で生存した（データ
省略）。このことから、ヒトのミオシン結合サブユニッ
トのＣ末端側（配列番号３に記載のアミノ酸配列７５４
〜１０３０）は、ラットのミオシン結合サブユニットの
Ｃ末端側（実施例６）と同様に、活性型Ｒｈｏに特異的
に結合することがわかった。 Example 11 Using the two-hybrid method
Of the binding between the human MBS and the activated Rho protein, using a cDNA fragment corresponding to the amino acid sequence of 754 to 1030 of human MBS as a template with the cDNA of SEQ ID NO: 4 as a template, 5'-CTAGCGGCCGCAATTTGGAA
AGTTTGCTTTATAACTCTGATC-3 ',
And 5'-AAAGCGGCCGCTATATAAA
Amplified by PCR using CAAAAGACTCTCGAGAAC-3 'as a primer, plasmid pVP16
(Vojtek, ABet. Al. Cell, 74, 205-214 (1993))
This was inserted into the otI site to prepare a yeast expression vector (pVP16-hMBS) for the VP16-MBS fusion protein. Vojtek, ABet. Al. Cell, 74, 205-214 (199
According to 3), plasmid pBT116 (Vojtek, ABet.
al. Cell, 74, 205-214 (1993)), low-molecular-weight G proteins (wild-type H-Ras, active H-Ras Val12 ,
Wild-type Rho and activated Rho Val14 ) cD
By inserting NA, LexA-wild type H-Ra
s fusion protein, LexA-activated H-Ras
Vectors for yeast expression of Val12 fusion protein, LexA-wild type Rho fusion protein, and LexA-active Rho Val14 fusion protein were prepared. LiCl
Method (Ito, H.et. al. J. Bacteriol., 153, 163-168 (198
3) According to), pVP16-hMBS and each pB
TM116-low molecular weight G protein was converted to yeast (S. cerevis
iae) L40 strain (Mat a trp1 leu2 his3 ade2 LYS2 ::
(LexAop) 4-HIS3 URA3: :( LexAop) 8-LacZ)
P16-MBS fusion protein and LexA-wild type H-
Ras fusion protein, LexA-activated H-Ras
Val12 fusion protein, LexA-wild type Rho fusion protein, or LexA-activated Rho
The Val14 fusion protein was expressed. The cells were cultured on a selective medium (containing no leucine, tryptophan, or histidine), and histidine requirement was examined. As a result, only the strain co-expressing the active Rho Val14 and the VP16-MBS fusion protein survived on the selective medium (data not shown). From this, the C-terminal side of the human myosin binding subunit (the amino acid sequence 754 of SEQ ID NO: 3)
-1030) was found to specifically bind to activated Rho, similarly to the C-terminal side of the rat myosin binding subunit (Example 6).
【０１５５】また、ヒトのミオシン結合サブユニットの
Ｒｈｏ結合領域（配列番号３に記載のアミノ酸配列７５
４〜１０３０）は、ラットのミオシン結合サブユニット
の相当する領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列６９
９〜９７６）またはニワトリのミオシン結合サブユニッ
トの相当する領域（前掲Shimizu, H. et al. (1994)）
に記載のアミノ酸配列７１１〜９６３）と、それぞれ９
２％および７４％の同一性を有していた。The Rho-binding region of the human myosin-binding subunit (amino acid sequence 75 of SEQ ID NO: 3)
4 to 1030) correspond to the corresponding region of the rat myosin-binding subunit (amino acid sequence 69 shown in SEQ ID NO: 1).
9-976) or the corresponding region of the chicken myosin binding subunit (Shimizu, H. et al. (1994) supra).
Amino acid sequences 711 to 963) and 9
It had 2% and 74% identity.
【０１５６】実施例１２ 組換えＭＢＳの大腸菌での発
現と組換えタンパク質の調製 ヒトＭＢＳのＮ末端領域（配列番号３の１〜６８９番の
アミノ酸配列）の組換えタンパク質（rG-hMBS[1-689]）
ならびにヒトＭＢＳのＣ末端領域（配列番号３の858〜1
019番のアミノ酸配列）の組換えタンパク質（rG-hMBS[8
58-1019] ）は、GST （グルタチオン Ｓ−トランスフ
ェラーゼ）融合蛋白質として、それぞれ大腸菌BL21(DE
3)pLys-S ならびにBL21(DE3) で発現させた。具体的に
は、下記の通りである。 Example 12 Generation of recombinant MBS in E. coli
Preparation of present and recombinant protein Recombinant protein (rG-hMBS [1-689]) of N-terminal region of human MBS (amino acid sequence of Nos. 1 to 689 of SEQ ID NO: 3)
And the C-terminal region of human MBS (858-1 of SEQ ID NO: 3)
019 amino acid sequence) recombinant protein (rG-hMBS [8
58-1019]) are GST (glutathione S-transferase) fusion proteins as E. coli BL21 (DE
3) It was expressed in pLys-S and BL21 (DE3). Specifically, it is as follows.
【０１５７】まず、rG-hMBS[1-689]発現用ベクター（pG
EX-hMBS[1-689]）（図１７）を作製するため、pBluescr
iptII にクローニングされているＭＢＳのｃＤＮＡ断片
の目的部位をＰＣＲ法によって増幅後、ゲルより精製
し、組換えＰＣＲ法により再構成して１本のＤＮＡとし
た。このＤＮＡの末端に制限酵素認識部位がプライマー
設計時に挿入してあり、この制限酵素認識部位を用いて
発現用ベクター（ｐＧＥＸ４Ｔ- １）にライゲーション
した。First, an rG-hMBS [1-689] expression vector (pG
EX-hMBS [1-689]) (Fig. 17) to prepare pBluescr
The target site of the MBS cDNA fragment cloned in iptII was amplified by PCR, purified from gel, and reconstituted by recombinant PCR to obtain one piece of DNA. A restriction enzyme recognition site was inserted into the end of this DNA at the time of designing a primer, and the DNA was ligated to an expression vector (pGEX4T-1) using this restriction enzyme recognition site.
【０１５８】具体的には、pBluescriptII 中にクローニ
ングしてある部分ｃＤＮＡ断片（Ｌ１−３：配列番号４
の１〜８９５番の塩基配列）を鋳型としてセンスプライ
マー（５′-ＧＣＧＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＡＴＧＡ
ＡＧＡＴＧ- ３’）と アンチセンスプライマー（５′
-ＧＴＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡ-
３’）を用いてＰＣＲ法にて増幅することにより、〔Ｌ
１−Ｎ〕ＰＣＲ産物を得た。Specifically, a partial cDNA fragment cloned into pBluescriptII (L1-3: SEQ ID NO: 4)
No. 1 to 895) as a template and a sense primer (5′-GCGGCAGGATCCGGGATGA)
AGATG-3 ') and antisense primer (5'
-GTATAGCCTTTAGCAGCTGCA-
By amplifying by PCR using 3 ′), [L
1-N] PCR product was obtained.
【０１５９】ＰＣＲの条件は以下のとおりであった。Th
ermal cyclerとしてPerkin Elmer Cetus PJ2000-Model
480 を用いた。Taq polymeraseとしてTaKaRa LA PCR ki
t (LA Taq)を用いた。ＰＣＲ反応液はトータル５０μｌ
とし、その組成は、鋳型 １μl （約１００ng）、セン
ス・プライマー １μl （最終濃度 0.5μＭ）、アンチ
センス・プライマー １μl （最終濃度 0.5μＭ）、10
× LAPCR Buffer ５μl 、dNTP mixture ４μl （最
終濃度 0.2ｍＭ）、LA Taq 0.5 μl （2.5 Ｕ）、蒸留
水27.5μl であった。ＰＣＲサイクルは、プレＰＣＲを
９４℃で１分間行った。ＰＣＲは９４℃で３０秒間、５
２℃で３０秒間、７２℃で１分間 のサイクルを30サイ
クル行い、その後ファイナルエクステンション（final
extension ）を７２℃で１０分間実施した。ソーキング
（soaking ）は４℃で行った。The conditions for PCR were as follows. Th
Perkin Elmer Cetus PJ2000-Model as ermal cycler
480 was used. TaKaRa LA PCR ki as Taq polymerase
t (LA Taq) was used. PCR reaction solution total 50μl
The composition was as follows: template 1 μl (about 100 ng), sense primer 1 μl (final concentration 0.5 μM), antisense primer 1 μl (final concentration 0.5 μM), 10 μl
× LAPCR Buffer 5 μl, dNTP mixture 4 μl (final concentration 0.2 mM), LA Taq 0.5 μl (2.5 U), and distilled water 27.5 μl. For the PCR cycle, pre-PCR was performed at 94 ° C. for 1 minute. PCR was performed at 94 ° C for 30 seconds, 5
30 cycles of 2 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute are performed, and then the final extension (final extension)
extension) at 72 ° C. for 10 minutes. Soaking was performed at 4 ° C.
【０１６０】上記のＰＣＲ産物を ０. ８％ アガロー
スゲル（FMC Bioproduct, SeaKem GTG 使用）にて電気
泳動し、目的のバンドを切り出し、QIAGEN 社の QIAEX
II gel extraction kit にてＤＮＡを抽出し、アガロー
ス電気泳動にて確認後、「Ｌ１−Ｎ」ＰＣＲ産物とし
た。The above PCR product was electrophoresed on a 0.8% agarose gel (using FMC Bioproduct, SeaKem GTG), the target band was cut out, and QIAGEN's QIAEX
DNA was extracted with II gel extraction kit, and confirmed by agarose electrophoresis, and then used as "L1-N" PCR product.
【０１６１】次に pBluescriptII にクローニングされ
ている部分ｃＤＮＡ断片（Ｌ１：配列番号４の７４３〜
２３６０番の塩基配列を鋳型としセンスプライマー
（５’-ＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＡＣ-
３’）アンチセンスプライマー（５′-ＴＣＴＴＣＴＧ
ＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＴＧＴＣＴ- ３’）を用いて
ＰＣＲ法にて増幅することにより、「Ｌ１−Ｃ」ＰＣＲ
産物を得た。Next, the partial cDNA fragment cloned into pBluescriptII (L1: 743 to SEQ ID NO: 4)
Using the base sequence at position 2360 as a template, a sense primer (5′-TGCAGCTGCTAAAGGCTATAC-
3 ') Antisense primer (5'-TCTCTCTG
AATTCTCATGCTTGTCT-3 ') was used to amplify by the PCR method to obtain "L1-C" PCR.
The product was obtained.
【０１６２】次に上述の「Ｌ１−Ｎ」と「Ｌ１−Ｃ」を
ＰＣＲ法を応用して１本のＤＮＡに再構成した。前述の
センスプライマー（５′-ＧＣＧＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧ
ＧＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧ- ３’）と アンチセンスプラ
イマー（５′-ＴＣＴＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＣ
ＴＴＧＴＣＴ- ３’）を使用した。鋳型として「Ｌ１−
Ｎ」と「Ｌ１−Ｃ」ＰＣＲ産物の両方を用いた。反応液
（トータル４９．５μｌ）の組成は以下のとおりであっ
た：鋳型「Ｌ１−Ｎ」 １μl （約１００ng）、鋳型
「Ｌ１−Ｃ」 １μl （約１００ng）、センスプライマ
ー １μl （最終濃度 0.5μＭ）、アンチセンスプライ
マー １μl （最終濃度 0.5μＭ）、10×LAPCR Buffer
５μl 、dNTP mixture ４μl （最終濃度 0.2ｍ
Ｍ）、蒸留水26.5 μl 。Next, the above-mentioned "L1-N" and "L1-C" were reconstituted into one DNA by applying the PCR method. The aforementioned sense primer (5'-GCGGCAGGATCCCG
GGATGAAGATG-3 ') and antisense primer (5'-TCTTCTGAATTCTCATGC
TTGTCT-3 ') was used. “L1-
Both "N" and "L1-C" PCR products were used. The composition of the reaction solution (49.5 μl total) was as follows: 1 μl (about 100 ng) of template “L1-N”, 1 μl (about 100 ng) of template “L1-C”, 1 μl of sense primer (0.5 μM final concentration) ), Antisense primer 1μl (final concentration 0.5μM), 10 × LAPCR Buffer
5μl, dNTP mixture 4μl (final concentration 0.2m
M), 26.5 μl of distilled water.
【０１６３】上記の反応液をまず９５℃で１０分間イン
キュベートし、終了後すぐに氷上で冷却した。５分間冷
却後、LA Taq を0.5 μl 加えて撹拌し、ミネラルオイ
ルを重層してＰＣＲ cycleを実施した。ＰＣＲの条件は
以下に記載のとおりであった。プレＰＣＲを９４℃で１
分間行い、ＰＣＲは９４℃で１分間、５２℃で１. ５分
間、７２℃で２分間のサイクルを３０サイクル実施し、
その後ファイナルエクステンションを７２℃で１０分間
行った。ソーキングは４℃で実施した。The above reaction solution was first incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and cooled on ice immediately after completion. After cooling for 5 minutes, 0.5 μl of LA Taq was added and stirred, and mineral oil was overlaid to perform a PCR cycle. PCR conditions were as described below. Pre-PCR at 94 ° C for 1
PCR at 94 ° C. for 1 minute, 52 ° C. for 1.5 minutes, and 72 ° C. for 2 minutes for 30 cycles.
After that, final extension was performed at 72 ° C. for 10 minutes. Soaking was performed at 4 ° C.
【０１６４】上記のＰＣＲ産物を １％ アガロースゲ
ル（FMC Bioproduct, SeaKem GTG使用）にて電気泳動
し、目的のバンドを切り出し、QIAGEN 社の QIAEXII g
el extraction kit にてＤＮＡを抽出し、アガロース電
気泳動にて確認後、「ＭＢＳ- Ｎ」ＰＣＲ産物（この状
態でこのＤＮＡのＮ端にＢａｍＨＩ、Ｃ端にＥｃｏＲＩ
の制限酵素切断部位が含まれている）とした。得られた
〔ＭＢＳ−Ｎ〕をＢａｍＨ１およびＥｃｏＲＩを用いて
制限酵素処理後、得られた断片をＢａｍＨ１およびＥｃ
ｏＲＩ処理したｐＧＥＸ ４Ｔ−１（Pharmacia Biotec
h Cat. 27-4580-01）中にライゲーションさせ、rG-hMB
S[1-689]発現用ベクター（pGEX-hMBS[1-689]）（図１
７）を構築した。The above PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel (using FMC Bioproduct, SeaKem GTG), the target band was cut out, and QIAEXII g
The DNA was extracted with an el extraction kit, and confirmed by agarose electrophoresis. The “MBS-N” PCR product (in this state, BamHI at the N-terminus of the DNA and EcoRI at the C-terminus)
Restriction site is included). After treating the obtained [MBS-N] with restriction enzymes using BamH1 and EcoRI, the obtained fragment was ligated with BamH1 and EcR.
pGEX 4T-1 treated with oRI (Pharmacia Biotec
h Cat. 27-4580-01) and rG-hMB
S [1-689] expression vector (pGEX-hMBS [1-689]) (Fig. 1)
7) was constructed.
【０１６５】上記pGEX-hMBS[1-689]で大腸菌を形質転換
し、50 mg/mlのABPCを含むLBでOD600＝0.8 〜1.0 とな
るまで37℃で培養後、0.1 mM IPTG を加え、さらに4 時
間培養した。その後6500rpm ×10分にて遠心し沈澱をPB
S ( 約30 ml)で洗浄後した。沈澱をホモジェナイズバッ
ファー[30 mM Tris/HCl (pH 7.5)、50 mM EDTA、1 mMEG
TA 、10% スクロース、10 mg/ml ロイペプチン、10mM
(p-アミジノフェニル）メタンスルフォニルフルオライ
ド(aPMSF) 、1 mM DTT] 20 ml に溶解後 triton X-100
を200 ml 加えソニケーターで破砕した。50000 rpm ×
30分超遠心し、上清を30 mM Tris/HCl (pH 7.5) 、30 m
M KCl 、0.2 mM DTTにて透析した。次に、SP Sepharose
カラム（サイズ1.6 ×11 cm ）にかけ、0 〜0.5M NaCl
濃度勾配により抽出した。目的とする蛋白を含む分画を
集め30mM Tris/HCl (pH 7.5)、30mM KCl 、0.2 mM DTT
にて透析後、Mono Q HR5/5カラムにて精製した。rG-hMB
S[1-689]は、さらにSuperdex 200 HR 10/30 にてゲル濾
過し精製した。精製した組換えタンパク質は、30 mM Tr
is/HCl (pH 7.5) 、30 mM KCl 、0.2 mM DTTにて透析
後、-80 ℃で保存した。Escherichia coli was transformed with the above pGEX-hMBS [1-689], cultured in LB containing 50 mg / ml ABPC at 37 ° C. until OD600 = 0.8 to 1.0, and 0.1 mM IPTG was added. Incubated for 4 hours. After that, centrifuge at 6500 rpm × 10 minutes to precipitate PB
After washing with S (about 30 ml). The precipitate was washed with a homogenizing buffer [30 mM Tris / HCl (pH 7.5), 50 mM EDTA, 1 mM EG
TA, 10% sucrose, 10 mg / ml leupeptin, 10 mM
(p-amidinophenyl) methanesulfonyl fluoride (aPMSF), 1 mM DTT] dissolved in 20 ml and triton X-100
Was added and crushed with a sonicator. 50000 rpm ×
Ultracentrifuge for 30 minutes, and wash the supernatant with 30 mM Tris / HCl (pH 7.5), 30 m
It was dialyzed against M KCl and 0.2 mM DTT. Next, SP Sepharose
Apply to column (size 1.6 x 11 cm), 0-0.5M NaCl
Extracted by concentration gradient. Collect fractions containing the target protein, 30 mM Tris / HCl (pH 7.5), 30 mM KCl, 0.2 mM DTT
After dialysis with, the product was purified with a Mono Q HR5 / 5 column. rG-hMB
S [1-689] was further purified by gel filtration using Superdex 200 HR 10/30. The purified recombinant protein is 30 mM Tr
It was dialyzed against is / HCl (pH 7.5), 30 mM KCl and 0.2 mM DTT, and stored at -80 ° C.
【０１６６】ヒトＭＢＳのＣ末端領域（アミノ酸８５８
〜１０１９）の組換えタンパク質（rG-hMBS[858-1019]
）を得るために、Ｌ２を鋳型とし、センスプライマー
(5′-GGAGTTGAATTCTGGACACAAGATAGT-3′)およびアンチ
センスプライマー(5′-TCTGATGAATTCCCCATTTTCATCCTT-
3′) を用いて前述の条件でPCR を実施し、目的のcDNA
を増幅した。EcoRI (TaKaRa)にて制限酵素処理後、pGEX
4T-1に組み込み、BL21(DE3) に形質転換させた。その
後、rG-hMBS[1-689]と同様に発現、精製し、保存した。The C-terminal region of human MBS (amino acid 858)
To 1019) recombinant protein (rG-hMBS [858-1019]
) To obtain a sense primer
(5'-GGAGTTGAATTCTGGACACAAGATAGT-3 ') and antisense primer (5'-TCTGATGAATTCCCCATTTTCATCCTT-
Perform PCR under the conditions described above using 3 ') to obtain the desired cDNA.
Was amplified. After restriction enzyme treatment with EcoRI (TaKaRa), pGEX
It was incorporated into 4T-1 and transformed into BL21 (DE3). Thereafter, it was expressed, purified and stored in the same manner as rG-hMBS [1-689].
【０１６７】実施例１３ 抗ヒトＭＢＳ抗体の作製 ヒトＭＢＳのＣ末端領域（アミノ酸８５８〜１０１９）
とGST との組換え融合タンパク質（rG-hMBS[858-1019]
）を抗原としてウサギに免疫し、抗ヒトＭＢＳ抗血清
を調製した。具体的には下記に記載した方法に従って実
施した。 Example 13 Preparation of Anti-Human MBS Antibody C-terminal Region of Human MBS (amino acids 858 to 1019)
Fusion protein of GST and GST (rG-hMBS [858-1019]
) Was used as an antigen to immunize rabbits to prepare anti-human MBS antiserum. Specifically, it was carried out according to the method described below.
【０１６８】初回免疫は、上記抗原50 mg と完全アジュ
バント(FCA) [DIFCO 製] 1ml を混合し乳濁液となるま
で撹拌し、ニュージーランドホワイト雌の背中に約 0.1
mlずつ皮下注射した。２回目の免疫は、初回免疫３週
間後に初回免疫と同様に注射した。３回目以降の免疫
は、抗原50 mg と不完全アジュバント (FIA) [DIFCO
製]1 ml を混合し乳濁液となるまで撹拌し、ニュージー
ランドホワイト雌の背中に約0.1 ml ずつ皮下注射し
た。以後、2 週間毎に同様の注射を更に2 回繰り返し
た。For the first immunization, 50 mg of the above antigen and 1 ml of complete adjuvant (FCA) [manufactured by DIFCO] were mixed and stirred until an emulsion was obtained.
Each ml was injected subcutaneously. The second immunization was injected 3 weeks after the first immunization in the same manner as the first immunization. For the third and subsequent immunizations, 50 mg of antigen and incomplete adjuvant (FIA) [DIFCO
1 ml), stirred until an emulsion was obtained, and injected about 0.1 ml subcutaneously into the back of a New Zealand white female. Thereafter, the same injection was repeated twice every two weeks.
【０１６９】最後の注射より1 週間後に耳の動脈より約
50 ml 採血し、24 時間4 ℃にて保存後、3000 rpm、 5
分にて遠心分離し血清を採取し、0.45 μｍフィルタ
ーで濾過滅菌した。抗体のアフィニティー精製は、抗原
（rG-hMBS[858-1019] ）1 mgをCNBr-activated Sepharo
se 4B (Pharmacia Biotech) 0.3 g にカップリングさせ
たカラムを用いて行った( カップリング率は45%)。同様
に、GST (1 mg)のアフィニティーカラムも作成した (こ
の場合のカップリング率は100%) 。抗血清10 ml を、ま
ずGST アフィニティーカラムと反応させ、抗GST 抗体を
除去した血清を、上記rG-hMBS[858-1019] をカップリン
グさせたアフィニティーカラムと反応させた（24時間 4
℃にて転倒混和）。次に10 ml TBS 、次いで30 ml の洗
浄バッファー (20 mM Tris/HCl pH7.5, 1 M NaCl, 1% t
riton X-100) 、更に30 ml のトリス緩衝生理食塩水
（TBS ）で洗浄後、溶出バッファー（0.1M glycin/HCl
pH2.5 ）1.5 mlにて抗体を溶出した。この溶出を4 回繰
り返した。溶出した抗体は2MTris/HCl pH 8.0 にて中
和した。One week after the last injection,
Collect 50 ml of blood and store at 4 ° C for 24 hours.
The serum was collected by centrifugation for 1 minute and sterilized by filtration through a 0.45 μm filter. For antibody affinity purification, 1 mg of antigen (rG-hMBS [858-1019]) was added to CNBr-activated Sepharo
This was performed using a column coupled to 0.3 g of se 4B (Pharmacia Biotech) (coupling ratio: 45%). Similarly, an affinity column of GST (1 mg) was prepared (in this case, the coupling ratio was 100%). First, 10 ml of the antiserum was reacted with the GST affinity column, and the serum from which the anti-GST antibody had been removed was reacted with the affinity column to which rG-hMBS [858-1019] was coupled (4 hours for 24 hours).
Invert at ℃). Then 10 ml TBS, then 30 ml wash buffer (20 mM Tris / HCl pH 7.5, 1 M NaCl, 1% t
riton X-100), and further washed with 30 ml of Tris-buffered saline (TBS), followed by elution buffer (0.1 M glycin / HCl).
The antibody was eluted with 1.5 ml of pH 2.5). This elution was repeated four times. The eluted antibody was neutralized with 2M Tris / HCl pH 8.0.
【０１７０】実施例１４ ウェスタンブロッティング法
によるＭＢＳ発現の組織分布の検討 どの組織にヒトＭＢＳが発現しているかどうかを検討す
るために、実施例１３で調製した抗ヒトＭＢＳ抗体を用
いたウェスタンブロッティングを実施した。具体的には
下記に記載した方法に従って実施した。 Example 14 Western blotting method
Examination of tissue distribution of MBS expression by using Western blotting using the anti-human MBS antibody prepared in Example 13 was performed to examine which tissues expressed human MBS. Specifically, it was carried out according to the method described below.
【０１７１】ヒト脳、肺、心臓、大動脈（それぞれ剖検
標本）、ニワトリ砂嚢をそれぞれ3〜4gをホモジェナイ
ズバッファー[500 mM NaCl、20 mM Tris/HCl (pH 7.5)
、1mM EDTA 、1 mM EGTA 、1mM ベンザミジン、10 mg/
ml ロイペプチン、10 mM (p- アミジノフェニル）メタ
ンスルフォニルフルオライド(aPMSF) 、0.1 mM ジイソ
プロピルフルオロフォスフェート] 3 mlを加えホモゲナ
イズし、20000xg 、30分超遠心し上清をBCA 法（PIERCE
社製）にて濃度を測定した。これをSDS 化し7.5%アクリ
ルアミドゲルにそれぞれ100 μｇずつかけた。電気泳動
後ニトロセルロース膜にトランスファーし、1 次抗体と
して抗ヒトＭＢＳ抗体を反応させた。2次抗体との反応
後ECL 法（PIERCE社製）にて検出した。3-4 g of each of human brain, lung, heart, aorta (necropsy specimen) and chicken gizzard were mixed with homogenizing buffer [500 mM NaCl, 20 mM Tris / HCl (pH 7.5)
, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM benzamidine, 10 mg /
3 ml of leupeptin, 10 mM (p-amidinophenyl) methanesulfonyl fluoride (aPMSF), 0.1 mM diisopropylfluorophosphate], homogenize, ultracentrifuge at 20,000 xg for 30 minutes, and centrifuge the supernatant using BCA method (PIERCE
Concentration) was measured. This was converted to SDS and applied to a 7.5% acrylamide gel at 100 μg each. After the electrophoresis, the cells were transferred to a nitrocellulose membrane, and reacted with an anti-human MBS antibody as a primary antibody. After the reaction with the secondary antibody, detection was performed by the ECL method (manufactured by PIERCE).
【０１７２】結果は図１８に示した通りであった。ヒト
脳、肺および大動脈で、抗MBS 抗体と交差反応が認めら
れる１３０ｋＤａおよび１３５ｋＤａのバンドが検出さ
れた。これらのバンドはヒトＭＢＳに相当すると考えら
れる。一方、ヒト心臓には抗MBS 抗体と交差反応を示す
バンドは認められなかった。また、抗ヒトＭＢＳ抗体
は、血管平滑筋に富むニワトリ砂嚢の１３０ｋＤａのバ
ンド（ニワトリのＭＢＳに相当）とも交差した。The results were as shown in FIG. 130 kDa and 135 kDa bands cross-reactive with anti-MBS antibody were detected in human brain, lung and aorta. These bands are considered to correspond to human MBS. On the other hand, no band showing cross-reactivity with the anti-MBS antibody was observed in the human heart. The anti-human MBS antibody also crossed a 130 kDa band (corresponding to chicken MBS) in the chicken gizzard, which is rich in vascular smooth muscle.
【０１７３】実施例１５ ノーザンブロット解析による
ヒトＭＢＳ発現の組織分布の検討 ヒトＭＢＳ ｃＤＮＡ部分断片（配列番号４の２２７５
〜３３２９番の塩基配列）をプローブとして、CLONTECH
社のHuman Multiple Tissue Northern Blot を使い解析
した。DNA 断片をSTRATAGENE社 Primie-it II RandomPr
imer LabelingKit をもちいてプローブを32P でラベル
し、このプローブを使って、50％ホルムアミド、5 ×SS
C 、10×Denhardt′s solution 、1 ％SDS 、200mg/m
l、50mMリン酸緩衝液中で42℃、一晩ハイブリダイゼー
ションを行った。2 ×SSC 、0.1 ％SDS 、を使い室温で
1 回洗浄し、2 ×SSC 、0.1 ％SDS を使い42℃で2 回、
0.2×SSC 、0.1 ％SDS を使い42℃で2 回洗浄した。解
析は、Fuji Bio-image Analyzer を用いて行った。 Example 15 By Northern blot analysis
Examination of tissue distribution of human MBS expression A partial fragment of human MBS cDNA (2275 of SEQ ID NO: 4)
~ 3329 base sequence) as a probe with CLONTECH
Analysis was performed using the Human Multiple Tissue Northern Blot of the company. DNA fragments were obtained from STRATAGENE Primie-it II RandomPr
Label the probe with 32 P using the imer Labeling Kit, and use this probe for 50% formamide, 5 × SS
C, 10 × Denhardt's solution, 1% SDS, 200mg / m
l, hybridization was carried out in a 50 mM phosphate buffer at 42 ° C overnight. 2 x SSC, 0.1% SDS, at room temperature
Wash once, use 2xSSC, 0.1% SDS twice at 42 ° C,
Washing was performed twice at 42 ° C. using 0.2 × SSC and 0.1% SDS. The analysis was performed using Fuji Bio-image Analyzer.
【０１７４】結果は図１９に示した通りであった。約5k
b のバンドが、心臓、脳、胎盤、骨格筋、膵臓で認めら
れた。The results were as shown in FIG. About 5k
b band was observed in heart, brain, placenta, skeletal muscle, and pancreas.
【０１７５】実施例１６ PP1 触媒サブユニット（PP1c
δ）とヒトＭＢＳ再構築におけるホスファターゼ活性の
検出 ミオシン軽鎖ホスファターゼのホロ酵素は、触媒サブユ
ニット（ＰＰ１ｃδ）、１３０ｋＤａの調節サブユニッ
ト（Ｍ１３０）および２０ｋＤａの調節サブユニット
（Ｍ２０）という３種類のサブユニットから成る。この
内、１３０ｋＤａの調節サブユニット（Ｍ１３０）はミ
オシン結合サブユニット(MBS) または平滑筋プロテイン
・ホスファターゼ１Ｍの調節サブユニットと同義である
（Shimizu,H. et al., J. Biol. Chem., 269, 30407-30
411(1994)およびChen, Y. H. et al., FEBS Lett., 35
6,51-55(1994) ）。 Example 16 PP1 catalytic subunit (PP1c
[delta]) and the host scan Fataze activity in human MBS rebuild
The holoenzyme for detection myosin light chain phosphatase consists of three subunits: a catalytic subunit (PP1cδ), a 130 kDa regulatory subunit (M130), and a 20 kDa regulatory subunit (M20). Of these, the 130 kDa regulatory subunit (M130) is synonymous with the myosin binding subunit (MBS) or the smooth muscle protein phosphatase 1M regulatory subunit (Shimizu, H. et al., J. Biol. Chem., 269, 30407-30
411 (1994) and Chen, YH et al., FEBS Lett., 35
6, 51-55 (1994)).
【０１７６】本発明者らは、ＭＢＳがＰＰ１ｃδと混合
した際に、ミオシン軽鎖ホスファターゼ活性を上昇させ
るかどうかについて検討した。ホスファターゼ・アッセ
イはIchikawa K. et al., Biochemistry, 35, 6313-632
0(1996) に基づき、下記に記載のように実施した。全量
４０μｌの反応バッファー（37.5 mM Tris/HCl (pH7.5)
、125 mM KCl、0.25 mg/ml BSA）中で、PP1cδ(1.38 n
g) とrG-hMBS[1-689]（PP1cδに対してモル比で5 倍ま
で）を混合し、30℃、10分間プレインキュベーションし
た。これに10mM ATPと10mM MgCl2 の混合溶液５μｌ
（最終濃度1 mMATP、1 mM MgCl2 ）を加え、さらに32P-
LC20 (5 mM) を加えトータル50μｌとした。反応液を、
30℃、5 分間インキュベーションした後、ホスファター
ゼ活性を測定した（Ichikawa K. et al., Biochemistr
y, 35, 6313-6320(1996)）。反応は、25% TCA を５０μ
ｌ加え反応を停止した。5000 rpm、5 分間遠心し、その
上清をチェレンコフ法にて計測した。PP1cδ、および32
P-LC20は、ニワトリ砂嚢平滑筋より精製したもの（Shim
izu, H., et al., J. Biol. Chem., 269, 30407-30411
(1994) ）を用いた。The present inventors examined whether MBS increases myosin light chain phosphatase activity when mixed with PP1cδ. The phosphatase assay is described in Ichikawa K. et al., Biochemistry, 35, 6313-632.
0 (1996) and performed as described below. A total of 40 μl reaction buffer (37.5 mM Tris / HCl (pH7.5)
, 125 mM KCl, 0.25 mg / ml BSA) in PP1cδ (1.38 n
g) and rG-hMBS [1-689] (up to 5 times the molar ratio with respect to PP1cδ) were mixed and preincubated at 30 ° C. for 10 minutes. 5 μl of a mixed solution of 10 mM ATP and 10 mM MgCl 2
(Final concentration 1 mM ATP, 1 mM MgCl 2 ) and add 32 P-
LC20 (5 mM) was added to make a total of 50 μl. The reaction solution is
After incubation at 30 ° C. for 5 minutes, phosphatase activity was measured (Ichikawa K. et al., Biochemistr.
y, 35, 6313-6320 (1996)). Reaction was performed with 50% of 25% TCA.
l was added to stop the reaction. The mixture was centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was measured by the Cherenkov method. PP1cδ, and 32
P-LC20 was purified from chicken gizzard smooth muscle (Shim
izu, H., et al., J. Biol. Chem., 269, 30407-30411
(1994)).
【０１７７】その結果、ヒトＭＢＳのＮ端とＧＳＴとの
融合タンパク質（rG-hMBS[1-689]）（実施例１２）は、
PP1cδのミオシン軽鎖ホスファターゼ活性を上昇させ
た。その活性化の程度は８〜９倍であった（図２０）。As a result, a fusion protein of the N-terminus of human MBS and GST (rG-hMBS [1-689]) (Example 12)
Myosin light chain phosphatase activity of PP1cδ was increased. Its degree of activation was 8 to 9 times (FIG. 20).
【０１７８】実施例１７ ＦＩＳＨ法によるヒトＭＢＳ
遺伝子の染色体上の位置の決定 ヒトＭＢＳ遺伝子の12番染色体上の詳細な位置を知るた
めに、FISH解析を行った。ヒト血液から単離したリンパ
球を10% 胎児牛血清、フィトヘマグルチニン（phytohem
aggulutinin ：PHA ）を添加したα- 最小必須培地(ME
M) 中、37℃で、68〜72時間培養した。培養したリンパ
球は、BrdU (0.18mg/ml Sigma 社）で処理し同調させ
た。同調させたリンパ球は、無血端培地で3 回洗い、チ
ミジン(2.5mg/ml Sigma 社）を含むα-MEMで37℃で6 時
間培養した。細胞を集めスライドを作製した。１６１８
ｂｐのヒトＭＢＳ部分ｃＤＮＡクローン（配列番号４の
７４３〜２３６０番の塩基配列に相当）を、 Heng, H.
H.Q. らの方法（Heng, H.H.Q. et al.,Pro. Nati. Aca
d. Sci. USA, 89, 9509-9513(1992)に従って、BRL BioN
ick labeling kitを使用してビオチン化した。FISHの検
出方法は、Heng, H.H.Q. et al., Pro. Nati. Acad. Sc
i. USA, 89, 9509-9513(1992) およびHeng, H.H.Q.& Tu
ji, L.-C., . Chromosoma., 102, 325-332(1993) に従
って実施した。スライドは55℃で1 時間熱処理した。RN
ase 処理後、スライドは、70％フォルムアミドを含む2X
SSC で2 分間変成し、70℃でエタノールにより脱水し
た。プローブは、75℃で5 分間ハイブリダイゼーション
液（50％フォルムアミド、10％デキストラン サルフェ
ート）中で変成した。プローブを変成した染色体スライ
ドにのせ、37℃で一晩置いた。スライドを50％ホルムア
ミド、2 ×SSC で3 分間、3 回洗浄した後、2 ×SSC 、
43℃、3 分間、3 回洗浄し、シグナルを検出した。FISH
のシグナルとDAPI バンド パターンは別々に写真を撮
り、重ね合わせることによって、染色体上の位置を決定
した（Heng, H.H.Q. & Tuji, L.-C., (1994) FISHdetec
tion on DAPI banded chromosome. In: Choo K.H.A., e
d.) Methods in Molecular Biology: In situ hybridiz
ation protocols. (Choo,K.H.A.ed.) pp.35-49 (1994)
Humana Press, Clifton, NJ. ）。 Example 17 Human MBS by FISH method
Determination of chromosome location of gene FISH analysis was performed to know the detailed location of human MBS gene on chromosome 12. Lymphocytes isolated from human blood were converted to 10% fetal bovine serum, phytohemagglutinin
aggulutinin: PHA) supplemented with α-minimal essential medium (ME
M) at 37 ° C for 68 to 72 hours. The cultured lymphocytes were treated with BrdU (0.18 mg / ml Sigma) and synchronized. The synchronized lymphocytes were washed three times with a bloodless end medium, and cultured in α-MEM containing thymidine (2.5 mg / ml Sigma) at 37 ° C. for 6 hours. The cells were collected to prepare a slide. 1618
bp human MBS partial cDNA clone (corresponding to the nucleotide sequence of positions 743 to 2360 of SEQ ID NO: 4) was obtained from Heng, H .;
HQ et al. (Heng, HHQ et al., Pro. Nati. Aca
d. BRL BioN according to Sci. USA, 89, 9509-9513 (1992).
Biotinylated using ick labeling kit. A method for detecting FISH is described in Heng, HHQ et al., Pro. Nati. Acad. Sc.
i. USA, 89, 9509-9513 (1992) and Heng, HHQ & Tu
ji, L.-C.,. Chromosoma., 102, 325-332 (1993). Slides were heat treated at 55 ° C. for 1 hour. RN
After ase treatment, slides are 2X containing 70% formamide.
The cells were denatured with SSC for 2 minutes and dehydrated with ethanol at 70 ° C. Probes were denatured in hybridization solution (50% formamide, 10% dextran sulfate) at 75 ° C. for 5 minutes. The probe was placed on a denatured chromosome slide and placed at 37 ° C. overnight. After the slides were washed three times with 50% formamide and 2 × SSC for 3 minutes, 2 × SSC,
After washing three times at 43 ° C for 3 minutes, a signal was detected. FISH
Signal and DAPI band pattern were separately photographed and superimposed to determine their location on the chromosome (Heng, HHQ & Tuji, L.-C., (1994) FISHdetec
tion on DAPI banded chromosome.In: Choo KHA, e
d.) Methods in Molecular Biology: In situ hybridiz
ation protocols. (Choo, KHAed.) pp.35-49 (1994)
Humana Press, Clifton, NJ.).
【０１７９】FISH解析の結果、***している100 細胞の
染色体のうち、81細胞の染色体で、一組の染色体上にシ
グナルが検出された。DAPI バンドをもとに、シグナル
が12番染色体の長腕（１２ｑ１５−２１．２）にあるこ
とが解かった。詳細な染色体上の位置は、10枚の写真の
結果を総合して決定した（図２１）。As a result of FISH analysis, signals were detected on a set of chromosomes in chromosomes of 81 cells out of 100 chromosomes of dividing cells. Based on the DAPI band, it was found that the signal was on the long arm of chromosome 12 (12q15-21.2). Detailed chromosomal positions were determined by combining the results of the ten photographs (FIG. 21).
【０１８０】実施例１８ Radiation Hybrid法によるヒ
トＭＢＳ遺伝子の染色体上の位置の決定 Radiation Hybrid法を用いて、ヒトＭＢＳ遺伝子の染色
体上の位置をさらに狭い領域に特定した。BIOS社 Monoc
hromosomal Hybrid Paneal PCRable DNAs 100ng を鋳型
として、ヒトＭＢＳに特異的なプライマー、ATG GAA TT
G CAC ATA TTAGTA A （配列番号４の3356〜3377 番の塩
基配列）とACC AAC AAC AAC AAA AAC ACC C （配列番号
５の1333〜1354番の塩基配列）を用いて、PCR を行い決
定した。PCR は、Takara LA PCR kit Ver.2 を用いて、
98℃15秒、55℃30秒、72℃2 分を30回繰り返した。反応
液を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動した結果、12
番染色体を含むDNA を鋳型にしたものだけが、168bp の
ヒトＭＢＳ特異的なDNA断片が増幅されていた。この結
果から、ヒトＭＢＳ遺伝子は12番染色体上に位置するこ
とが確かめられた。 Example 18 [0180] Heat by Radiation Hybrid Method
Determination of Chromosome Position of Tobacco MBS Gene Using the Radiation Hybrid method, the chromosome position of the human MBS gene was specified in a narrower region. BIOS Monoc
Using 100ng of hromosomal Hybrid Paneal PCRable DNAs as a template, primer specific to human MBS, ATG GAA TT
PCR was performed using G CAC ATA TTAGTA A (the nucleotide sequence of Nos. 3356 to 3377 of SEQ ID NO: 4) and ACC AAC AAC AAC AAA AAC ACC C (the nucleotide sequence of Nos. 1333 to 1354 of SEQ ID NO: 5) to determine. PCR was performed using Takara LA PCR kit Ver.2.
98 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes were repeated 30 times. The reaction solution was subjected to 8% polyacrylamide gel electrophoresis.
Only a DNA fragment containing chromosome No. as a template amplified a human MBS-specific DNA fragment of 168 bp. From this result, it was confirmed that the human MBS gene was located on chromosome 12.
【０１８１】さらに、MBS の近傍にある物理マーカーを
同定するために、Research Genetics 社のGeneBridge 4
Radiation Hybrid Panel を使用して、解析を行った。
PCR反応は、上記と同じ条件で行った。解析は、WI/MIT
Radiation Hybrid Mapper (http: //www- genome. wi.
mit. edu/ cgi- bin/ contig/ rhmapper. pl#instructi
ons) を使って行った。その結果、ＭＢＳ遺伝子はCHLC.
GATA65A12から3.77cRテロメア側の位置にあることが解
かった。Further, in order to identify a physical marker near MBS, GeneBridge 4 of Research Genetics was used.
Analysis was performed using the Radiation Hybrid Panel.
The PCR reaction was performed under the same conditions as above. Analysis is WI / MIT
Radiation Hybrid Mapper (http: // www- genome.wi.
mit.edu/ cgi-bin / contig / rhmapper.pl # instructi
ons). As a result, the MBS gene was CHLC.
GATA65A12 was found to be located on the 3.77cR telomere side.
【０１８２】[0182]
配列番号：１ 配列の長さ：９７６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ラット 配列 Met Lys Met Ala Asp Ala Lys Gln Lys Arg Asn Glu Gln Leu Lys Arg 1 5 10 15 Trp Ile Gly Ser Glu Thr Asp Leu Glu Pro Pro Val Val Lys Arg Gln 20 25 30 Lys Thr Lys Val Lys Phe Asp Asp Gly Ala Val Phe Leu Ala Ala Cys 35 40 45 Ser Ser Gly Asp Thr Asp Glu Val Leu Lys Leu Leu His Arg Gly Ala 50 55 60 Asp Ile Asn Tyr Ala Asn Val Asp Gly Leu Thr Ala Leu His Gln Ala 65 70 75 80 Cys Ile Asp Asp Asn Val Asp Met Val Lys Phe Leu Val Glu Asn Gly 85 90 95 Ala Asn Ile Asn Gln Pro Asp AsnGlu Gly Trp Ile Pro Leu His Ala 100 105 110 Ala Ala Ser Cys Gly Tyr Leu Asp Ile Ala Glu Phe Leu Ile Gly Gln 115 120 125 Gly Ala His Val Gly Ala Val Asn Ser Glu Gly Asp Thr Pro Leu Asp 130 135 140 Ile Ala Glu Glu Glu Ala Met Glu Glu Leu Leu Gln Asn Glu Val Asn 145 150 155 160 Arg Gln Gly Val Asp Ile Glu Ala Ala Arg Lys Glu Glu Glu Arg Ile 165 170 175 Met Leu Arg Asp Ala Arg Gln Trp Leu Asn Ser Gly His Ile Ser Asp 180 185 190 Val Arg His Ala Lys Ser Gly Gly Thr Ala Leu His Val Ala Ala Ala 195 200 205 Lys Gly Tyr Thr Glu Val Leu Lys Leu Leu Ile Gln Ala Gly Tyr Asp 210 215 220 Val Asn Ile Lys Asp Tyr Asp Gly Trp Thr Pro Leu His Ala Ala Ala 225 230 235 240 His Trp Gly Lys Glu Glu Ala Cys Arg Ile Leu Val Asp Asn Leu Cys 245 250 255 Asp Met Glu Thr Val Asn Lys Val Gly Gln Thr Ala Phe Asp Val Ala 260 265 270 Asp Glu Asp Ile Leu Gly Tyr Leu Glu Glu Leu Gln Lys Lys Gln Asn 275 280 285 Leu Leu His Ser Glu Lys Arg Asp Lys Lys Ser Pro Leu Ile Glu Ser 290 295 300 Thr Ala Asn Met Glu Asn Asn Gln Pro Gln Lys Thr Phe Lys Asn Lys 305 310 315 320 Glu Thr Leu Ile Ile Glu Pro Glu Lys Asn Ala Ser Arg Ile Glu Ser 325 330 335 Leu Glu Gln Glu Lys Ala Asp Glu Glu Glu Glu Gly Lys Lys Asp Glu 340 345 350 Ser Ser Cys Ser Ser Glu Glu Asp Glu Glu Asp Asp Ser Glu Ser Glu 355 360 365 Ala Glu Thr Asp Lys Thr Lys Pro Met Ala Ser Val Thr Asn Ala His 370 375 380 Thr Ala Ser Thr Gln Ala Ala Pro Ala Ala Val Thr Thr Pro Thr Leu 385 390 395 400 Ser Ser Asn Gln Gly Thr Pro Thr Ser Pro Val Lys Lys Phe Pro Thr 405 410 415 Ser Thr Thr Lys Ile Ser Pro Lys Glu Glu Glu Arg Lys Asp Glu Ser 420 425 430 Pro Ala Ser Trp Arg Leu Gly Leu Arg Lys Thr Gly Ser Tyr Gly Ala 435 440 445 Leu Ala Glu Ile Thr Ala Ser Lys Glu Ala Gln Lys Glu Lys Asp Thr 450 455 460 Ala Gly Val Ile Arg Ser Ala Ser Ser Pro Arg Leu Ser Ser Ser Leu 465 470 475 480 Asp Asn Lys Glu Lys Glu Lys Asp Asn Lys Gly Thr Arg Leu Ala Tyr 485 490 495 Val Ala Pro Thr Ile Pro Arg Arg Leu Gly Ser Thr Ser Asp Ile Glu 500 505 510 Glu Lys Glu Asn Arg Glu Ser Ser Asn Leu Arg Thr Ser Ser Ser Tyr 515 520 525 Thr Arg Arg Lys Trp Glu Asp Asp Leu Lys Lys Asn Ser Ser Ile Asn 530 535 540 Glu Gly Ser Thr Tyr His Arg Ser Thr Ser Asn Arg Leu Trp Ala Glu 545 550 555 560 Asp Ser Thr Glu Lys Glu Lys Asp Ser Ala Pro Thr Ala Ala Thr Ile 565 570 575 Leu Val Ala Pro Thr Val Val Ser Ala Ala Ala Ser Ser Thr Thr Ala 580 585 590 Leu Thr Thr Thr Thr Ala Gly Thr Leu Ser Ser Thr Ser Glu Val Arg 595 600 605 Glu Arg Arg Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Val Arg Asp Glu Glu Ser Glu 610 615 620 Ser Gln Arg Lys Ala Arg Ser Arg Gln Ala Arg Gln Ser Arg Arg Ser 625 630 635 640 Thr Gln Gly Val Thr Leu Thr Asp Leu Gln Glu Ala Glu Lys Thr Ile 645 650 655 Gly Arg Ser Arg Ser Thr Arg Thr Arg Glu Gln Glu Asn Glu Glu Lys 660 665 670 Asp Lys Glu Glu Lys Glu Lys Gln Asp Lys Glu Lys Gln Glu Glu Lys 675 680 685 Lys Glu Ser Glu Val Ser Arg Glu Asp Glu Tyr Lys Gln Lys Tyr Ser 690 695 700 Arg Thr Tyr Asp Glu Thr Tyr Ala Arg Tyr Arg Pro Val Ser Thr Ser 705 710 715 720 Ser Ser Ser Thr Pro Ser Ser Ser Ser Leu Ser Thr Leu Gly Ser Ser 725 730 735 Leu Tyr Ala Ser Ser Gln Leu Asn Arg Pro Asn Ser Leu Val Gly Ile 740 745 750 Thr Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Leu Thr Lys Asp Asn Glu Arg Glu Gly 755 760 765 Glu Lys Lys Glu Glu Glu Lys Glu Gly Glu Asp Lys Ser Gln Pro Lys 770 775 780 Ser Ile Arg Glu Arg Arg Arg Pro Arg Glu Lys Arg Arg Ser Thr Gly 785 790 795 800 Val Ser Phe Trp Thr Gln Asp Ser Asp Glu Asn Glu Gln Glu Arg Gln 805 810 815 Ser Asp Thr Glu Asp Gly Ser Ser Lys Arg Asp Thr Gln Thr Asp Ser 820 825 830 Val Ser Arg Tyr Asp Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Asp Arg Tyr Asp 835 840 845 Ser Leu Leu Gly Arg Ser Ala Ser Tyr Ser Tyr Leu Glu Glu Arg Lys 850 855 860 Pro Tyr Gly Ser Arg Leu Glu Lys Asp Asp Ser Thr Asp Phe Lys Lys 865 870 875 880 Leu Tyr Glu Gln Ile Leu Ala Glu Asn Glu Lys Leu Lys Ala Gln Leu 885 890 895 His Asp Thr Asn Met Glu Leu Thr Asp Leu Lys Leu Gln Leu Glu Lys 900 905 910 Ala Thr Gln Arg Gln Glu Arg Phe Ala Asp Arg Ser Leu Leu Glu Met 915 920 925 Glu Lys Arg Glu Arg Arg Ala Leu Glu Arg Arg Ile Ser Glu Met Glu 930 935 940 Glu Glu Leu Lys Met Leu Pro Asp Leu Lys Ala Asp Asn Gln Arg Leu 945 950 955 960 Lys Asp Glu Asn Gly Ala Leu Ile Arg Val Ile Ser Lys Leu Ser Lys 965 970 975 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 976 Sequence type: amino acid Number of chains: single chain Topology: linear Sequence type: protein Origin: Biological name: rat Sequence Met Lys Met Ala Asp Ala Lys Gln Lys Arg Asn Glu Gln Leu Lys Arg 1 5 10 15 Trp Ile Gly Ser Glu 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【０１８３】配列番号：２ 配列の長さ：３３００ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ 起源： 生物名：ラット 配列 CGGTCGCACA CCCCCCGGTG TCCCCTCGCC TCCCTCGCCG CCGCCCCCTT CCCCCGCTCG 60 CGATAAGAAG AGCCGGCGGC AGGAGAGGGG ATG AAG ATG GCG GAC GCG AAG CAG 114 Met Lys Met Ala Asp Ala Lys Gln 1 5 AAG CGG AAC GAG CAG CTG AAG CGC TGG ATC GGC TCC GAG ACG GAC CTC 162 Lys Arg Asn Glu Gln Leu Lys Arg Trp Ile Gly Ser Glu Thr Asp Leu 10 15 20 GAG CCT CCC GTG GTG AAG CGC CAG AAG ACC AAG GTG AAG TTC GAC GAT 210 Glu Pro Pro Val Val Lys Arg Gln Lys Thr Lys Val Lys Phe Asp Asp 25 30 35 40 GGC GCC GTC TTC CTC GCC GCC TGC TCC AGC GGC GAC ACG GAC GAG GTC 258 Gly Ala Val Phe Leu Ala Ala Cys Ser Ser Gly Asp Thr Asp Glu Val 45 50 55 CTC AAG CTG CTG CAC CGC GGC GCC GAC ATC AAT TAC GCC AAT GTG GAC 306 Leu Lys Leu Leu His Arg Gly Ala Asp Ile Asn Tyr Ala Asn Val Asp 60 65 70 GGA CTC ACC GCC CTG CAC CAG GCT TGC ATT GAT GAC AAT GTT GAT ATG 354 Gly Leu Thr Ala Leu His Gln Ala Cys Ile Asp Asp Asn Val Asp Met 75 80 85 GTG AAG TTT CTG GTA GAA AAT GGA GCA AAT 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Ser Ser Ser Leu Asp Asn Lys Glu Lys Glu Lys Asp 475 480 485 AAT AAA GGA ACA AGA CTT GCA TAT GTC GCC CCT ACA ATC CCA AGG CGA 1602 Asn Lys Gly Thr Arg Leu Ala Tyr Val Ala Pro Thr Ile Pro Arg Arg 490 495 500 CTA GGC AGT ACG TCT GAC ATT GAA GAG AAG GAA AAC AGA GAG TCT TCA 1650 Leu Gly Ser Thr Ser Asp Ile Glu Glu Lys Glu Asn Arg Glu Ser Ser 505 510 515 520 AAT TTG CGA ACA AGT AGT TCT TAC ACA AGA AGA AAA TGG GAA GAT GAT 1698 Asn Leu Arg Thr Ser Ser Ser Tyr Thr Arg Arg Lys Trp Glu Asp Asp 525 530 535 CTT AAA AAA AAT AGT TCA ATC AAT GAA GGA TCT ACT TAC CAT AGA AGT 1746 Leu Lys Lys Asn Ser Ser Ile Asn Glu Gly Ser Thr Tyr His Arg Ser 540 545 550 ACC TCA AAT CGT TTG TGG GCT GAG GAT AGT ACT GAG AAA GAG AAG GAC 1794 Thr Ser Asn Arg Leu Trp Ala Glu Asp Ser Thr Glu Lys Glu Lys Asp 555 560 565 AGT GCT CCT ACC GCA GCG ACC ATT CTT GTT GCT CCA ACT GTT GTA AGT 1842 Ser Ala Pro Thr Ala Ala Thr Ile Leu Val Ala Pro Thr Val Val Ser 570 575 575 580 GCT GCA GCT TCT TCT ACC ACA GCC CTG ACC ACA ACT ACT GCT GGC ACT 1890 Ala Ala Ala Ser Ser Thr Thr Ala Leu Thr Thr Thr Thr Ala Gly Thr 585 590 595 600 600 CTT TCC TCC ACA TCA GAG GTC AGG GAG AGA CGC AGG TCA TAC CTC ACT 1938 Leu Ser Ser Thr Ser Glu Val Arg Glu Arg Arg Arg Ser Tyr Leu Thr 605 610 615 CCT GTT AGG GAT GAA GAG TCT GAA TCC CAA AGG AAA GCA AGA TCT AGA 1986 Pro Val Arg Asp Glu Glu Ser Glu Ser Gln A rg Lys Ala Arg Ser Arg 620 625 630 CAA GCA AGA CAG TCT AGA CGG TCA ACA CAG GGG GTG ACA CTG ACT GAC 2034 Gln Ala Arg Gln Ser Arg Arg Ser Thr Gln Gly Val Thr Leu Thr Asp 635 640 645 CTC CAG GAA GCC GAA AAG ACA ATA GGA AGA AGC CGT TCT ACG AGA ACC 2086 Leu Gln Glu Ala Glu Lys Thr Ile Gly Arg Ser Arg Ser Thr Arg Thr 650 655 660 AGA GAA CAA GAA AAC GAA GAA AAA GAC AAA GAA GAA AAG GAA AAG CAG 2130 Arg Glu Gln Glu Asn Glu Glu Lys Asp Lys Glu Glu Lys Glu Lys Gln 665 670 675 680 GAT AAA GAG AAA CAA GAA GAA AAG AAG GAG TCA GAA GTA TCT AGA GAA 2178 Asp Lys Glu Lys Gln Glu Glu Lys Lys Glu Ser Glu Val Ser Arg Glu 685 690 695 GAT GAA TAT AAG CAA AAG TAT TCC AGA ACA TAC GAT GAG ACT TAT GCA 2226 Asp Glu Tyr Lys Gln Lys Tyr Ser Arg Thr Tyr Asp Glu Thr Tyr Ala 700 705 710 CGT TAC AGA CCA GTG TCA ACT TCA AGT TCA AGC ACT CCG TCG TCC TCC 2274 Arg Tyr Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Ser Ser Thr Pro Ser Ser Ser 715 720 725 TCA CTT TCT ACT CTA GGC AGT TCA CTC TAT GCC TCA AGT CAG CTC AAC 2322 Ser Leu Ser Thr Leu Gl y Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Gln Leu Asn 730 735 740 AGG CCA AAC AGC CTT GTA GGT ATA ACC TCT GCC TAC TCC CGG GGA TTA 2370 Arg Pro Asn Ser Leu Val Gly Ile Thr Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Leu 745 750 755 760 ACC AAA GAC AAT GAA AGA GAG GGA GAG AAA AAA GAA GAG GAA AAA GAA 2418 Thr Lys Asp Asn Glu Arg Glu Gly Glu Lys Lys Glu Glu Glu Lys Glu 765 770 775 775 GGG GAA GAT AAG TCA CAA CCT AAA TCA ATC AGA GAA CGA CGG CGA CCA 2466 Gly Glu Asp Lys Ser Gln Pro Lys Ser Ile Arg Glu Arg Arg Arg Pro 780 785 790 AGA GAA AAA CGG AGG TCT ACT GGA GTC TCC TTC TGG ACA CAA GAT AGT 2514 Arg Glu Lys Arg Arg Ser Thr Gly Val Ser Phe Trp Thr Gln Asp Ser 795 800 805 GAT GAA AAT GAG CAA GAG CGG CAG TCA GAC ACC GAG GAT GGC TCC AGC 2562 Asp Glu Asn Glu Gln Glu Arg Gln Ser Asp Thr Glu Asp Gly Ser Ser 810 815 820 AAG AGG GAC ACT CAG ACG GAT TCT GTT TCC AGG TAT GAC AGC AGT TCC 2610 Lys Arg Asp Thr Gln Thr Asp Ser Val Ser Arg Tyr Asp Ser Ser Ser 825 830 835 840 ACG TCA TCA AGC GAT CGG TAT GAC TCC TTG CTG GGT CGT TCT GCC TCA 265 8 Thr Ser Ser Ser Asp Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Gly Arg Ser Ala Ser 845 850 855 TAC AGT TAC TTA GAA GAA AGG AAA CCA TAT GGT AGC CGA CTA GAA AAG 2706 Tyr Ser Tyr Leu Glu Glu Arg Lys Pro Tyr Gly Ser Arg Leu Glu Lys 860 865 870 GAT GAC TCA ACT GAC TTC AAA AAG CTT TAT GAA CAA ATC TTA GCT GAA 2754 Asp Asp Ser Thr Asp Phe Lys Lys Leu Tyr Glu Gln Ile Leu Ala Glu 875 880 885 AAT GAA AAA CTA AAG GCA CAG CTA CAT GAC ACA AAT ATG GAA CTA ACG 2802 Asn Glu Lys Leu Lys Ala Gln Leu His Asp Thr Asn Met Glu Leu Thr 890 895 900 GAT CTA AAG TTG CAG TTG GAA AAA GCT ACC CAG AGA CAA GAA CGA TTT 2850 Asp Leu Lys Leu Gln Leu Glu Lys Ala Thr Gln Arg Gln Glu Arg Phe 905 910 915 920 GCT GAC AGG TCA CTA TTG GAG ATG GAA AAA AGG GAA CGA AGA GCT CTA 2898 Ala Asp Arg Ser Leu Leu Glu Met Glu Lys Arg Glu Arg Arg Ala Leu 925 935 GAA AGA AGA ATA TCT GAG ATG GAA GAG GAG CTC AAA ATG TTA CCA GAC 2946 Glu Arg Arg Ile Ser Glu Met Glu Glu Glu Leu Lys Met Leu Pro Asp 940 945 950 950 TTA AAA GCA GAC AAC CAG AGG CTA AAG GAT GAA AAT GGG GCC TTG ATC 2994 Leu Lys Ala Asp Asn Gln Arg Leu Lys Asp Glu Asn Gly Ala Leu Ile 955 960 965 AGA GTT ATA AGC AAA CTT TCC AAG TAGGACAGAA AACACACAAG CGAAGCAGCG 3048 Arg Val Ile Ser Lys Leu ACT ACT ACT GG CTGGACGCCA GAAAGAACCC 3108 CTGGAGACTG TCATTTTCCG ATATCCTGCC AAACGCCCTC TTATCTAGGA GTTTTGTTTC 3168 GTTTAATCTT CTGCCCCACC CCCTTGGTTA TCAAGACCAT TGTTTCATGT TAAAGCCGCT 3228 GCTGAGAAGA TTTTTTTTCA ATGACTGAGA AAACTTGTTT ACAGCTCCAG CAAATAAAGA 3288 AAGTGTTCAA GG 3300
【０１８４】配列番号：３ 配列の長さ：１０３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ヒト 配列 Met Lys Met Ala Asp Ala Lys Gln Lys Arg Asn Glu Gln Leu Lys Arg 1 5 10 15 Trp Ile Gly Ser Glu Thr Asp Leu Glu Pro Pro Val Val Lys Arg Gln 20 25 30 Lys Thr Lys Val Lys Phe Asp Asp Gly Ala Val Phe Leu Ala Ala Cys 35 40 45 Ser Ser Gly Asp Thr Asp Glu Val Leu Lys Leu Leu His Arg Gly Ala 50 55 60 Asp Ile Asn Tyr Ala Asn Val Asp Gly Leu Thr Ala Leu His Gln Ala 65 70 75 80 Cys Ile Asp Asp Asn Val Asp Met Val Lys Phe Leu Val Glu Asn Gly 85 90 95 Ala Asn Ile Asn Gln Pro Asp Asn Glu Gly Trp Ile Pro Leu His Ala 100 105 110 Ala Ala Ser Cys Gly Tyr Leu Asp Ile Ala Glu Phe Leu Ile Gly Gln 115 120 125 Gly Ala His Val Gly Ala Val Asn Ser Glu Gly Asp Thr Pro Leu Asp 130 135 140 Ile Ala Glu Glu Glu Ala Met Glu Glu Leu Leu Gln Asn Glu Val Asn 145 150 155 160 Arg Gln Gly Val Asp Ile Glu Ala Ala Arg Lys Glu Glu Glu Arg Ile 165 170 175 Met Leu Arg Asp Ala Arg Gln Trp Leu Asn Ser Gly His Ile Asn Asp 180 185 190 Val Arg His Ala Lys Ser Gly Gly Thr Ala Leu His Val Ala Ala Ala 195 200 205 Lys Gly Tyr Thr Glu Val Leu Lys Leu Leu Ile Gln Ala Gly Tyr Asp 210 215 220 Val Asn Ile Lys Asp Tyr Asp Gly Trp Thr Pro Leu His Ala Ala Ala 225 230 235 240 His Trp Gly Lys Glu Glu Ala Cys Arg Ile Leu Val Asp Asn Leu Cys 245 250 255 Asp Met Glu Met Val Asn Lys Val Gly Gln Thr Ala Phe Asp Val Ala 260 265 270 Asp Glu Asp Ile Leu Gly Tyr Leu Glu Glu Leu Gln Lys Lys Gln Asn 275 280 285 Leu Leu His Ser Glu Lys Arg Asp Lys Lys Ser Pro Leu Ile Glu Ser 290 295 300 Thr Ala Asn Met Asp Asn Asn Gln Ser Gln Lys Thr Phe Lys Asn Lys 305 310 315 320 Glu Thr Leu Ile Ile Glu Pro Glu Lys Asn Ala Ser Arg Ile Glu Ser 325 330 335 Leu Glu Gln Glu Lys Val Asp Glu Glu Glu Glu Gly Lys Lys Asp Glu 340 345 350 Ser Ser Cys Ser Ser Glu Glu Asp Glu Glu Asp Asp Ser Glu Ser Glu 355 360 365 Ala Glu Thr Asp Lys Thr Lys Pro Leu Ala Ser Val Thr Asn Ala Asn 370 375 380 Thr Ser Ser Thr Gln Ala Ala Pro Val Ala Val Thr Thr Pro Thr Val 385 390 395 400 Ser Ser Gly Gln Ala 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Glu Lys Arg Glu Glu Glu Lys Glu Gly Glu 820 825 830 Asp Lys Ser Gln Pro Lys Ser Ile Arg Glu Arg Arg Arg Pro Arg Glu 835 840 845 Lys Arg Arg Ser Thr Gly Val Ser Phe Trp Thr Gln Asp Ser Asp Glu 850 855 860 Asn Glu Gln Glu Gln Gln Ser Asp Thr Glu Glu Gly Ser Asn Lys Lys 865 870 875 880 Glu Thr Gln Thr Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Glu Thr Ser Ser Thr Ser 885 890 895 Ala Gly Asp Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Gly Arg Ser Gly Ser Tyr Ser 900 905 910 Tyr Leu Glu Glu Arg Lys Pro Tyr Ser Ser Arg Leu Glu Lys Asp Asp 915 920 925 Ser Thr Asp Phe Lys Lys Leu Tyr Glu Gln Ile Leu Ala Glu Asn Glu 930 935 940 Lys Leu Lys Ala Gln Leu His Asp Thr Asn Met Glu Leu Thr Asp Leu 945 950 955 960 Lys Leu Gln Leu Glu Lys Ala Thr Gln Arg Gln Glu Arg Phe Ala Asp 965 970 975 Arg Ser Leu Leu Glu Met Glu Lys Arg Glu Arg Arg Ala Leu Glu Arg 980 985 990 Arg Ile Ser Glu Met Glu Glu Glu Leu Lys Met Leu Pro Asp Leu Lys 995 1000 1005 Ala Asp Asn Gln Arg Leu Lys Asp Glu Asn Gly Ala Leu Ile Arg Val 1010 1015 1020 Ile Ser Lys Leu Ser Lys 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175 Met Leu Arg Asp Ala Arg Gln Trp Leu Asn Ser Gly His Ile Asn Asp 180 185 190 Val Arg His Ala Lys Ser Gly Gly Thr Ala Leu His Val Ala Ala Ala 195 200 205 Lys Gly Tyr Thr Glu Val Leu Lys Leu Leu Ile Gln Ala Gly Tyr Asp 210 215 220 Val Asn Ile Lys Asp Tyr Asp Gly Trp Thr Pro Leu His Ala Ala Ala 225 230 235 240 His Trp Gly Lys Glu Glu Ala Cys Arg Ile Leu Val Asp Asn Leu Cys 245 250 255 Asp Met Glu Met Val Asn Lys Val Gly Gln Thr Ala Phe Asp Val Ala 260 265 270 Asp Glu Asp Ile Leu Gly Tyr Leu Glu Glu Leu Gln Lys Lys Gln Asn 275 280 285 Leu Leu His Ser Glu Lys Arg Asp Lys Lys Ser Pro Leu Ile Glu Ser 290 295 300 Thr Ala Asn Met Asp Asn Asn Gln Ser Gln Lys Thr Phe Lys Asn Lys 305 310 315 320 Glu Thr Leu Ile Ile Glu Pro Glu Lys Asn Ala Ser Arg Ile Glu Ser 325 330 335 Leu Glu Gln Glu Lys Val Asp Glu Glu Glu Glu Gly Lys Lys Asp Glu 340 345 350 Ser Ser Cys Ser Ser Glu Glu Asp Glu Glu Asp Asp Ser Glu Ser Glu 355 360 365 Ala Glu Thr Asp Lys Thr Lys Pro Leu A la Ser Val Thr Asn Ala Asn 370 375 380 Thr Ser Ser Thr Gln Ala Ala Pro Val Ala Val Thr Thr Pro Thr Val 385 390 395 400 Ser Ser Gly Gln Ala Thr Pro Thr Ser Pro Ile Lys Lys Phe Pro Thr 405 410 415 Thr Ala Thr Lys Ile Ser Pro Lys Glu Glu Glu Arg Lys Asp Glu Ser 420 425 430 Pro Ala Thr Trp Arg Leu Gly Leu Arg Lys Thr Gly Ser Tyr Gly Ala 435 440 445 445 Leu Ala Glu Ile Thr Ala Ser Lys Glu Gly Gln Lys Glu Lys Asp Thr 450 455 460 Ala Gly Val Thr Arg Ser Ala Ser Ser Pro Arg Leu Ser Ser Ser Leu 465 470 475 480 Asp Asn Lys Glu Lys Glu Lys Asp Ser Lys Gly Thr Arg Leu Ala Tyr 485 490 490 495 Val Ala Pro Thr Ile Pro Arg Arg Leu Ala Ser Thr Ser Asp Ile Glu 500 505 510 Glu Lys Glu Asn Arg Asp Ser Ser Ser Leu Arg Thr Ser Ser Ser Tyr 515 520 525 Thr Arg Arg Lys Trp Glu Asp Asp Leu Lys Lys Asn Ser Ser Val Asn 530 535 540 Glu Gly Ser Thr Tyr His Lys Ser Cys Ser Phe Gly Arg Arg Gln Asp 545 550 555 560 Asp Leu Ile Ser Ser Ser Val Pro Ser Thr Thr Ser Thr Pro Thr Val 565 570 575 Thr Ser Ala Ala Gly Leu Gln Lys SerLeu Leu Ser Ser Thr Ser Thr 580 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Pro 785 790 795 800 Asn Ser Leu Val Gly Ile Thr Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Ile Thr Lys 805 810 815 Glu Asn Glu Arg Glu Gly Glu Lys Arg Glu Glu Glu Lys Glu Gly Glu 820 825 830 Asp Lys Ser Gln Pro Lys Ser Ile Arg Glu Arg Arg Arg Pro Arg Glu 835 840 845 Lys Arg Arg Ser Thr Gly Val Ser Phe Trp Thr Gln Asp Ser Asp Glu 850 855 860 Asn Glu Gln Glu Gln Gln Ser Asp Thr Glu Glu Gly Ser Asn Lys Lys 865 870 875 880 Glu Thr Gln Thr Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Glu Thr Ser Ser Thr Ser 885 890 895 Ala Gly Asp Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Gly Arg Ser Gly Ser Tyr Ser 900 905 910 Tyr Leu Glu Glu Arg Lys Pro Tyr Ser Ser Arg Leu Glu Lys Asp Asp 915 920 925 925 Ser Thr Asp Phe Lys Lys Leu Tyr Glu Gln Ile Leu Ala Glu Asn Glu 930 935 940 Lys Leu Lys Ala Gln Leu His Asp Thr Asn Met Glu Leu Thr Asp Leu 945 950 955 960 Lys Leu Gln Leu Glu Lys Ala Thr Gln Arg Gln Glu Arg Phe Ala Asp 965 970 975 Arg Ser Leu Leu Glu Met Glu Lys Arg Glu Arg Arg Ala Leu Glu Arg 980 985 990 Arg Ile Ser Glu Met Glu Glu Glu Leu Lys Met Leu Pro Asp Leu Lys 995 1000 1005 Ala Asp Asn Gln Arg Leu Lys Asp Glu Asn Gly Ala Leu Ile Arg Val 1010 1015 1020 Ile Ser Lys Leu Ser Lys 1025 1030
【０１８５】配列番号：４ 配列の長さ：４８５５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２４３．．３３３２ 配列 GGGAACTTCT GTGGGGCTTT AGAAGCAGGG AGGGCCCACC TGGAAGGGAG GTCCGCTCGG 60 CCGGGTGCGC CGCCCCAGTG CTCTGTGGGA TACTGGAAGT CTCGAGCGTC GGCTCCGGGT 120 TCCCAGCCCT CCTCTGGCCC GCACTCATAG AAACATTCAC ACACCCCCTG CCTCCCCTCT 180 CTTCCCTCTC CGCCTCCCCC TTCCCCCCCT CGCGATAAGA AGACCCGGCG GCAGGAGAGG 240 GG ATG AAG ATG GCG GAC GCG AAG CAG AAG CGG AAC GAG CAG CTG AAA 287 Met Lys Met Ala Asp Ala Lys Gln Lys Arg Asn Glu Gln Leu Lys 1 5 10 15 CGC TGG ATC GGC TCC GAG ACG GAC CTC GAG CCT CCG GTG GTG AAG CGC 335 Arg Trp Ile Gly Ser Glu Thr Asp Leu Glu Pro Pro Val Val Lys Arg 20 25 30 CAG AAG ACC AAG GTG AAG TTC GAC GAT GGC GCC GTC TTC CTG GCT GCT 383 Gln Lys Thr Lys Val Lys Phe Asp Asp Gly Ala Val Phe Leu Ala Ala 35 40 45 TGC TCC AGC GGC GAC ACG GAC GAG GTC CTC AAG CTG CTG CAC CGC GGC 431 Cys Ser Ser Gly Asp Thr Asp Glu Val Leu Lys Leu Leu His Arg Gly 50 55 60 GCC GAC ATC AAT TAC GCC AAT GTG GAC GGA CTC ACT GCC CTG CAC CAG 479 Ala Asp Ile Asn Tyr Ala Asn Val Asp Gly Leu Thr Ala Leu His Gln 65 70 75 GCT TGC ATT GAT GAC AAT GTT GAT ATG GTG AAG TTT CTG GTA GAA AAT 527 Ala Cys Ile Asp Asp Asn Val Asp Met Val Lys Phe Leu Val Glu Asn 80 85 90 95 GGA GCA AAT ATT AAT CAA CCT GAT AAT GAA GGC TGG ATA CCA CTA CAT 575 Gly Ala Asn Ile Asn Gln Pro Asp Asn Glu Gly Trp Ile Pro Leu His 100 105 110 GCA GCA GCT TCC TGT GGA TAT CTT GAT ATT GCA GAG TTT TTG ATT GGT 623 Ala Ala Ala Ser Cys Gly Tyr Leu Asp Ile Ala Glu Phe Leu Ile Gly 115 120 125 CAA GGA GCA CAT GTA GGG GCT GTC AAC AGT GAA GGA GAT ACA CCT TTA 671 Gln Gly Ala His Val Gly Ala Val Asn Ser Glu Gly Asp Thr Pro Leu 130 135 140 GAT ATT GCG GAG GAG GAG GCA ATG GAA GAG CTA CTT CAA AAT GAA GTT 719 Asp Ile Ala Glu Glu Glu Ala Met Glu Glu Leu Leu Gln Asn Glu Val 145 150 155 AAT CGG CAA GGG GTT GAT ATA GAA GCA GCT CGA AAG GAA GAA GAA CGG 767 Asn Arg Gln Gly Val Asp Ile Glu Ala Ala Arg Lys Glu Glu Glu Arg 160 165 170 175 ATC ATG CTT AGA GAT GCC AGG CAG TGG CTA AAT AGT GGT CAT ATA AAT 815 Ile Met Leu Arg Asp Ala Arg Gln Trp Leu Asn Ser Gly His Ile Asn 180 185 190 GAT GTC CGG CAT GCA AAA TCT GGA GGT ACA GCA CTT CAC GTT GCA GCT 863 Asp Val Arg His Ala Lys Ser Gly Gly Thr Ala Leu His Val Ala Ala 195 200 205 GCT AAA GGC TAT ACG GAA GTT TTA AAA CTT TTA ATA CAG GCA GGC TAT 911 Ala Lys Gly Tyr Thr Glu Val Leu Lys Leu Leu Ile Gln Ala Gly Tyr 210 215 220 GAT GTT AAT ATT AAA GAC TAT GAT GGC TGG ACA CCT CTT CAT GCT GCA 959 Asp Val Asn Ile Lys Asp Tyr Asp Gly Trp Thr Pro Leu His Ala Ala 225 230 235 GCT CAT TGG GGT AAA GAA GAA GCA TGT CGA ATT TTA GTG GAC AAT CTG 1007 Ala His Trp Gly Lys Glu Glu Ala Cys Arg Ile Leu Val Asp Asn Leu 240 245 250 255 TGT GAT ATG GAG ATG GTC AAC AAA GTG GGC CAA ACA GCC TTT GAT GTA 1055 Cys Asp Met Glu Met Val Asn Lys Val Gly Gln Thr Ala Phe Asp Val 260 265 270 GCA GAT GAA GAC ATT TTA GGA TAT TTA GAA GAG TTG CAA AAG AAA CAA 1103 Ala Asp Glu Asp Ile Leu Gly Tyr Leu Glu Glu Leu Gln Lys Lys Gln 275 280 285 AAT CTG CTC CAT AGT GAA AAA CGG GAC AAG AAA TCT CCA CTA ATT GAA 1151 Asn Leu Leu His Ser Glu Lys Arg Asp Lys Lys Ser Pro Leu Ile Glu 290 295 300 TCA ACA GCA AAT ATG GAC AAT AAT CAG TCA CAG AAG ACC TTT AAA AAC 1199 Ser Thr Ala Asn Met Asp Asn Asn Gln Ser Gln Lys Thr Phe Lys Asn 305 310 315 AAA GAG ACG TTG ATT ATT GAA CCA GAG AAA AAT GCA TCC CGT ATT GAA 1247 Lys Glu Thr Leu Ile Ile Glu Pro Glu Lys Asn Ala Ser Arg Ile Glu 320 325 330 335 TCT CTG GAA CAA GAA AAG GTT GAT GAA GAA GAA GAA GGA AAG AAG GAT 1295 Ser Leu Glu Gln Glu Lys Val Asp Glu Glu Glu Glu Gly Lys Lys Asp 340 345 350 GAG TCT AGC TGC TCT AGT GAA GAA GAT GAG GAA GAT GAC TCG GAA TCA 1343 Glu Ser Ser Cys Ser Ser Glu Glu Asp Glu Glu Asp Asp Ser Glu Ser 355 360 365 GAA GCT GAA ACA GAT AAG ACA AAA CCC CTG GCT TCT GTA ACT AAT GCC 1391 Glu Ala Glu Thr Asp Lys Thr Lys Pro Leu Ala Ser Val Thr Asn Ala 370 375 380 AAC ACT TCT AGT ACA CAA GCA GCT CCT GTA GCT GTT ACA ACA CCT ACT 1439 Asn Thr Ser Ser Thr Gln Ala Ala Pro Val Ala Val Thr Thr Pro Thr 385 390 395 GTG TCA TCA GGT CAA GCA ACA CCT ACA TCA CCT ATT AAA AAG TTT CCA 1487 Val Ser Ser Gly Gln Ala Thr Pro Thr Ser Pro Ile Lys Lys Phe Pro 400 405 410 415 ACC ACA GCT ACA AAA ATT TCT CCC AAA GAA GAA GAG AGA AAA GAT GAG 1535 Thr Thr Ala Thr Lys Ile Ser Pro Lys Glu Glu Glu Arg Lys Asp Glu 420 425 430 TCT CCT GCA ACT TGG AGG TTA GGA CTT AGA AAG ACG GGC AGC TAT GGT 1583 Ser Pro Ala Thr Trp Arg Leu Gly Leu Arg Lys Thr Gly Ser Tyr Gly 435 440 445 GCA CTT GCT GAA ATC ACA GCA TCT AAA GAG GGT CAG AAA GAA AAA GAT 1631 Ala Leu Ala Glu Ile Thr Ala Ser Lys Glu Gly Gln Lys Glu Lys Asp 450 455 460 ACT GCA GGT GTT ACA CGT TCA GCT TCA AGT CCC AGA CTT TCC TCC TCT 1679 Thr Ala Gly Val Thr Arg Ser Ala Ser Ser Pro Arg Leu Ser Ser Ser 465 470 475 TTG GAT AAT AAA GAA AAG GAG AAA GAT AGT AAA GGA ACT AGG CTT GCA 1727 Leu Asp Asn Lys Glu Lys Glu Lys Asp Ser Lys Gly Thr Arg Leu Ala 480 485 490 495 ＴＡＴ ＧＴＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ＡＣＡ ＡＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＧＡ
ＣＴＡ ＧＣＣ ＡＧＴ ＡＣＡ ＴＣＴ ＧＡＣ ＡＴＴ １７７５ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ ５００
５０５ ５１０ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＡＣ ＡＧＡ ＧＡＴ ＴＣＴ ＴＣＡ
ＡＧＴ ＴＴＧ ＣＧＡ ＡＣＡ ＡＧＴ ＡＧＴ ＴＣＡ １８２３ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ５１５ ５２０
５２５ ＴＡＴ ＡＣＡ ＡＧＧ ＡＧＡ ＡＡＡ ＴＧＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＡＴ
ＣＴＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＴ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＴＴ １８７１ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ ５３０ ５３５
５４０ ＡＡＴ ＧＡＡ ＧＧＡ ＴＣＡ ＡＣＧ ＴＡＴ ＣＡＴ ＡＡＡ ＡＧＴ
ＴＧＣ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＧＴ ＡＧＡ ＡＧＡ ＣＡＡ １９１９ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｎ ５４５ ５５０
５５５ ＧＡＴ ＧＡＴ ＴＴＧ ＡＴＴ ＡＧＴ ＴＣＴ ＡＧＴ ＧＴＴ ＣＣＡ
ＡＧＣ ＡＣＣ ＡＣＡ ＴＣＡ ＡＣＡ ＣＣＡ ＡＣＡ １９６７ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ ５６０ ５６５
５７０ ５７５ ＧＴＴ ＡＣＣ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＧＧ ＣＴＴ ＣＡＧ ＡＡＡ
ＡＧＣ ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＣＡ ＡＧＣ ２０１５ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ５８０
５８５ ５９０ ＡＣＴ ＡＣＴ ＡＣＡ ＡＡＧ ＡＴＴ ＡＣＡ ＡＣＧ ＧＧＴ ＴＣＴ
ＴＣＣ ＴＣＡ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＣＡ ＣＡＡ ＡＧＣ ２０６３ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ ５９５ ６００
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ＧＡＴ ＡＧＴ ＡＣＴ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＡＧ ２１１１ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ ６１０ ６１５
６２０ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＴＴ ＣＣＴ ＡＣＧ ＧＣＡ ＧＴＧ ＡＣＣ ＡＴＴ
ＣＣＴ ＧＴＴ ＧＣＴ ＣＣＡ ＡＣＴ ＧＴＴ ＧＴＡ ２１５９ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｖａｌ ６２５ ６３０
６３５ AAT GCT GCA GCT TCT ACC ACA ACC CTG ACT ACA ACT ACT GCT GGC ACT 2207 Asn Ala Ala Ala Ser Thr Thr Thr Leu Thr Thr Thr Thr Ala Gly Thr 640 645 650 655 GTC TCC TCC ACA ACA GAG GTC AGG GAG AGA CGC AGA TCA TAC CTC ACT 2255 Val Ser Ser Thr Thr Glu Val Arg Glu Arg Arg Arg Ser Tyr Leu Thr 660 665 670 CCT GTT AGG GAT GAA GAG TCT GAA TCC CAA AGA AAA GCA AGA TCT AGA 2303 Pro Val Arg Asp Glu Glu Ser Glu Ser Gln Arg Lys Ala Arg Ser Arg 675 680 685 CAA GCA AGA CAA TCT AGA AGA TCA ACA CAG GGA GTG ACA TTA ACT GAT 2351 Gln Ala Arg Gln Ser Arg Arg Ser Thr Gln Gly Val Thr Leu Thr Asp 690 695 700 CTT CAA GAA GCT GAG AAA ACA ATA GGA AGA AGT CGT TCT ACC CGA ACC 2399 Leu Gln Glu Ala Glu Lys Thr Ile Gly Arg Ser Arg Ser Thr Arg Thr 705 710 715 AGA GAA CAA GAA AAT GAA GAA AAA GAA AAA GAG GAA AAA GAG AAA CAA 2447 Arg Glu Gln Glu Asn Glu Glu Lys Glu Lys Glu Glu Lys Glu Lys Gln 720 725 730 735 GAT AAA GAG AAA CAA GAA GAA AAG AAG GAG TCA GAA ACA TCT AGA GAA 2495 Asp Lys Glu Lys Gln Glu Glu Lys Lys Glu Ser Glu 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AGC ACC ACA TCA ACA CCA ACA 1967 Asp Asp Leu Ile Ser Ser Ser Val Pro
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AGC CTG CTT TCC AGC ACA AGC 2015 Val Thr Ser Ala Ala Gly Leu Gln Lys
Ser Leu Leu Ser Ser Thr Thr Ser 580
585 590 ACT ACT ACA AAG ATT ACA ACG GGT TCT
TCC TCA GCA GGC ACA CAA AGC 2063 Thr Thr Thr Lys Ile Thr Thr Gly Ser
Ser Ser Ala Gly Thr Gln Ser 595 600
605 AGT ACC TCA AAT CGT TTG TGG GCT GAG
GAT AGT ACT GAG AAA GAA AAG 2111 Ser Thr Ser Asn Arg Leu Trp Ala Glu
Asp Ser Thr Glu Lys Glu Lys 610 615
620 GAC AGT GTT CCT ACG GCA GTG ACC ATT
CCT GTT GCT CCA ACT GTT GTA 2159 Asp Ser Val Pro Thr Ala Val Thr Ile
Pro Val Ala Pro Thr Val Val 625 630
635 AAT GCT GCA GCT TCT ACC ACA ACC CTG ACT ACA ACT ACT GCT GGC ACT 2207 Asn Ala Ala Ala Ser Thr Thr Thr Leu Thr Thr Thr Thr Ala Gly Thr 640 645 650 655 GTC TCC TCC ACA ACA GAG GTC AGG GAG AGA CGC AGA TCA TAC CTC ACT 2255 Val Ser Ser Thr Thr Glu Val Arg Glu Arg Arg Arg Ser Tyr Leu Thr 660 665 670 CCT GTT AGG GAT GAA GAG TCT GAA TCC CAA AGA AAA GCA AGA TCT AGA 2303 Pro Val Arg Asp Glu Glu Ser Glu Ser Gln Arg Lys Ala Arg Ser Arg 675 680 685 CAA GCA AGA CAA TCT AGA AGA TCA ACA CAG GGA GTG ACA TTA ACT GAT 2351 Gln Ala Arg Gln Ser Arg Arg Ser Thr Gln Gly Val Thr Leu Thr Asp 690 695 700 CTT CAA GAA GCT GAG AAA ACA ATA GGA AGA AGT CGT TCT ACC CGA ACC 2399 Leu Gln Glu Ala Glu Lys Thr Ile Gly Arg Ser Arg Ser Thr Arg Thr 705 710 715 AGA GAA CAA GAA AAT GAA GAA AAA GAA AAA GAG GAA AAA GAG AAA CAA 2447 Arg Glu Gln Glu Asn Glu Glu Lys Glu Lys Glu Glu Lys Glu Lys Gln 720 725 730 735 GAT AAA GAG AAA CAA GAA GAA AAG AAG GAG TCA GAA ACA TCT AGA GAA 2495 Asp Lys Glu Lys Gln Glu Glu Lys Lys Glu Ser Glu Thr Ser Arg Glu 740 745 750 GAT GAA TAT AAA CAA AAG TAC TCC AGA ACG TAT GAT GAG ACT TAC CAG 2543 Asp Glu Tyr Lys Gln Lys Tyr Ser Arg Thr Tyr Asp Glu Thr Tyr Gln 755 760 765 CGT TAT AGG CCA GTA TCA ACT TCA AGT TCA ACC ACT CCA TCC TCT TCA 2591 Arg Tyr Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Ser Thr Thr Pro Ser Ser Ser 770 775 780 CTT TCT ACT ATG AGC AGT TCA CTG TAT GCT TCA AGT CAA CTA AAC AGG 2639 Leu Ser Thr Met Ser Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Gln Leu Asn Arg 785 790 795 CCA AAT AGT CTT GTA GGC ATA ACT TCT GCT TAC TCC AGA GGA ATA ACA 2687 Pro Asn Ser Leu Val Gly Ile Thr Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Ile Thr 800 805 810 815 AAA GAA AAT GAA AGA GAG GGA GAA AAA AGA GAA GAG GAG AAA GAA GGA 2735 Lys Glu Asn Glu Arg Glu Gly Glu Lys Arg Glu Glu Glu Lys Glu Gly 820 825 830 830 GAA GAT AAA TCA CAA CCT AAA TCA ATC AGA GAA CGA CGA CGA CCA AGA 2783 Glu Asp Lys Ser Gln Pro Lys Ser Ile Arg Glu Arg Arg Arg Pro Arg 835 840 845 GAG AAA AGA AGA TCT ACA GGA GTT TCA TTT TGG ACA CAA GAT AGT GAT 2831 Glu Lys Arg Arg Ser Thr Gly Val Ser Phe Trp Thr Gln Asp Ser Asp 850 855 860 GAA AAT GAA CAA GAA CAA CAA TCA GAC ACA GAA GAG GGA TCC AAT AAG 2879 Glu Asn Glu Gln Glu Gln Gln Ser Asp Thr Glu Glu Gly Ser Asn Lys 865 870 870 875 AAA GAA ACT CAG ACG GAT TCC ATT TCT AGA TAT GAA ACC AGT TCT ACA 2927 Lys Glu Thr Gln Thr Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Glu Thr Ser Ser Thr 880 885 890 890 895 TCA GCT GGT GAT CGA TAT GAT TCC TTG CTG GGT CGC TCT GGA TCA TAC 2975 Ser Ala Gly Asp Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Gly Arg Ser Gly Ser Tyr 900 905 910 AGT TAC TTA GAA GAA AGA AAA CCT TAC AGC AGC AGG CTA GAA AAG GAT 3023 Ser Tyr Leu Glu Glu Arg Lys Pro Tyr Ser Ser Arg Leu Glu Lys Asp 915 920 925 GAC TCA ACT GAC TTT AAA AAG CTT TAT GAA CAA ATT CTA GCT GAA AAT 3071 Asp Ser Thr Asp Phe Lys Lys Leu Tyr Glu Gln Ile Leu Ala Glu Asn 930 935 940 940 GAA AAG CTG AAG GCAG CTA CAT GAT ACA AAT ATG GAA CTA ACA GAT 3119 Glu Lys Leu Lys Ala Gln Leu His Asp Thr Asn Met Glu Leu Thr Asp 945 950 955 CTT AAA TTA CAG TTG GAA AAG GCC ACC CAG AGA CAA GAA AGA TTT GCT 3167 Leu L ys Leu Gln Leu Glu Lys Ala Thr Gln Arg Gln Glu Arg Phe Ala 960 965 970 975 GAT AGA TCA CTG TTG GAA ATG GAA AAA AGG GAA CGA AGA GCT CTA GAA 3215 Asp Arg Ser Leu Leu Glu Met Glu Lys Arg Glu Arg Arg Ala Leu Glu 980 985 990 AGA AGA ATA TCT GAA ATG GAA GAA GAG CTC AAA ATG TTA CCA GAC CTA 3263 Arg Arg Ile Ser Glu Met Glu Glu Glu Leu Lys Met Leu Pro Asp Leu 995 1000 1005 AAA GCA GAC AAC CAG AGG CTA AAG GAT GAA AAT GGG GCC TTG ATC AGA 3311 Lys Ala Asp Asn Gln Arg Leu Lys Asp Glu Asn Gly Ala Leu Ile Arg 1010 1015 1020 GTT ATA AGC AAA CTT TCC AAA TAAAAAAAAA AAAAAGCAGCAA GTAATGGAAT 3362 Val Ile Ser Lys Leu Ser LyCCATGATTAG10ATTAGG TTGGCAGTCA CTGGAAGTCT GGGAAGAATC 3422 CTTGGAGACT GTCATTTTCG GATATCCTGC CAAATGCCCT CTTATCTAGA ATTTTTGTTT 3482 CATTTTGTTT AATTTTCTGG GGTGTTTTTG TTGTTGTTGG TTTGTTTTTT GTTTTTTTTT 3542 TTAATCAAGA CCATTGTTTC ATGTTAATGC AGCTGCTGAG AAGATTTTTT TTTAATGACT 3602 GAGAAAACTT GTTTACAGCT CCAGCATATA AGGAAAGTGT TCAAGGCCAG ATATGCCTCA 3662 GATATTTAAC CAGTAAGCCT TAGT TGTACA TAAATACTTT TGTGTCAACA AAAACTTTCA 3722 GCTCTCACAG AAGACAGTTA CTCAACATTT TTTGATGTGC CACAGTTTCG AGTTTTTCGA 3782 TATTTAAATT TTTTGGCTTT TCATCTAAGT TTGGGTTTGT ATTTTTTCCT TCTAAACTCT 3842 TCATGTGGCA GAGTCTTCTA TGTTTTCACG GCTTTTTCAT TACAGAAAAG AACACTTGCT 3902 CTTCTGTGAT TATTGTCATG TATTAGGCTA ATGCTGTGTT GTCTCCCACC TGGAACTGAA 3962 TTGCTTGGTG GAACATATGC TTTCACTGTT TGTGCAATAT GCATTTATTT CTTATATGAA 4022 TGCTTTAAAG TCATTTGAGG TTAGATCTTT TAATTCCTAT TTTCTGCTTC ATTGGTCACT 4082 TTTTTTTTAT TGTAGTATAA GATGTTAGAT TCTGTAATCT TCACATTCAT TTTAGCAGGT 4142 ACTGAGTGAT GCTGTATATA CAAATAAGTG TATTGTTTTG ATTTTTAGAC CACCACATGG 4202 CATGCTTGAC TATTTCTTAT TTCAAATGTC TGCTAATGCA GAGTAGGCTA CTCCATGATA 4262 GTGTTAAAAA ACAAAATTTG CTAACAATGT GATATAAAGA CTTTAAAAGT TACACATTAT 4322 GTGGAGCCCT ATCTTTACAA AAGTTTCCTA CTGTAAAGTG CTTTTATTTT CAGTTTTCAT 4382 TTGATAGTAC TCAACCATAA TTAAAGTTGC ATAAGATAAT TGCTTTACAT TTCACATACC 4442 TATATTTATC TGAGTGCTGT CTAAAACTGT TGTGCTAGCC AAAGTAATGC TATGAAATCA 4502 TTTGCAGAAT TAACCCGTGA GTTAATGTTA AATGCACTGT TATTGCCATG TGAAGAGGCA 4562 TCGACTTTGA TACCACCATC ATGTTCAGAC CATTTTATAC ATTTCAGTGG CCTTTTTTTT 4622 TTTAAGGAAA AAAAAGCGCA AAACCAAGTA CATAGTGACG ATGGCTTTTA TTTGGACAAA 4682 TAGCTTTTAT ATTTTCATTA AACCATGCAA AAAATACTAC ATCTTTCTGG CACATAACTG 4742 TCTCCTTAAC CACTGGAACA GTTCAGCCAT TTGAATAAAT TGTACATTGT AAAGCTTATA 4802 GTAGCTGATT GTATTATTGA TTGTATTGTA TACTATATTA AATGTGAATT TGT 4855
【０１８６】配列番号５ 配列の長さ：４８５５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：ＹＥＳ 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴 他の情報：配列番号４の配列のマイナス鎖 配列 ACAAATTCAC ATTTAATATA GTATACAATA CAATCAATAA TACAATCAGC TACTATAAGC 60 TTTACAATGT ACAATTTATT CAAATGGCTG AACTGTTCCA GTGGTTAAGG AGACAGTTAT 120 GTGCCAGAAA GATGTAGTAT TTTTTGCATG GTTTAATGAA AATATAAAAG CTATTTGTCC 180 AAATAAAAGC CATCGTCACT ATGTACTTGG TTTTGCGCTT TTTTTTCCTT AAAAAAAAAA 240 AGGCCACTGA AATGTATAAA ATGGTCTGAA CATGATGGTG GTATCAAAGT CGATGCCTCT 300 TCACATGGCA ATAACAGTGC ATTTAACATT AACTCACGGG TTAATTCTGC AAATGATTTC 360 ATAGCATTAC TTTGGCTAGC ACAACAGTTT TAGACAGCAC TCAGATAAAT ATAGGTATGT 420 GAAATGTAAA GCAATTATCT TATGCAACTT TAATTATGGT TGAGTACTAT CAAATGAAAA 480 CTGAAAATAA AAGCACTTTA CAGTAGGAAA CTTTTGTAAA GATAGGGCTC CACATAATGT 540 GTAACTTTTA AAGTCTTTAT ATCACATTGT TAGCAAATTT TGTTTTTTAA CACTATCATG 600 GAGTAGCCTA CTCTGCATTA GCAGACATTT GAAATAAGAA ATAGTCAAGC ATGCCATGTG 660 GTGGTCTAAA AATCAAAACA ATACACTTAT TTGTATATAC AGCATCACTC AGTACCTGCT 720 AAAATGAATG TGAAGATTAC AGAATCTAAC ATCTTATACT ACAATAAAAA AAAAGTGACC 780 AATGAAGCAG AAAATAGGAA TTAAAAGATC TAACCTCAAA TGACTTTAAA GCATTCATAT 840 AAGAAATAAA TGCATATTGC ACAAACAGTG AAAGCATATG TTCCACCAAG CAATTCAGTT 900 CCAGGTGGGA GACAACACAG CATTAGCCTA ATACATGACA ATAATCACAG AAGAGCAAGT 960 GTTCTTTTCT GTAATGAAAA AGCCGTGAAA ACATAGAAGA CTCTGCCACA TGAAGAGTTT 1020 AGAAGGAAAA AATACAAACC CAAACTTAGA TGAAAAGCCA AAAAATTTAA ATATCGAAAA 1080 ACTCGAAACT GTGGCACATC AAAAAATGTT GAGTAACTGT CTTCTGTGAG AGCTGAAAGT 1140 TTTTGTTGAC ACAAAAGTAT TTATGTACAA CTAAGGCTTA CTGGTTAAAT ATCTGAGGCA 1200 TATCTGGCCT TGAACACTTT CCTTATATGC TGGAGCTGTA AACAAGTTTT CTCAGTCATT 1260 AAAAAAAAAT CTTCTCAGCA GCTGCATTAA CATGAAACAA TGGTCTTGAT TAAAAAAAAA 1320 AACAAAAAAC AAACCAACAA CAACAAAAAC ACCCCAGAAA ATTAAACAAA ATGAAACAAA 1380 AATTCTAGAT AAGAGGGCAT TTGGCAGGAT ATCCGAAAAT GACAGTCTCC AAGGATTCTT 1440 CCCAGACTTC CAGTGACTGC CAATTATGGT CCACTGGGTT ACTAATATGT GCAATTCCAT 1500 TACTTGCTGC TTTTTTTTTT TTATTTGGAA AGTTTGCTTA TAACTCTGAT CAAGGCCCCA 1560 TTTTCATCCT TTAGCCTCTG GTTGTCTGCT TTTAGGTCTG GTAACATTTT GAGCTCTTCT 1620 TCCATTTCAG ATATTCTTCT TTCTAGAGCT CTTCGTTCCC TTTTTTCCAT TTCCAACAGT 1680 GATCTATCAG CAAATCTTTC TTGTCTCTGG GTGGCCTTTT CCAACTGTAA TTTAAGATCT 1740 GTTAGTTCCA TATTTGTATC ATGTAGCTGT GCCTTCAGCT TTTCATTTTC AGCTAGAATT 1800 TGTTCATAAA GCTTTTTAAA GTCAGTTGAG TCATCCTTTT CTAGCCTGCT GCTGTAAGGT 1860 TTTCTTTCTT CTAAGTAACT GTATGATCCA GAGCGACCCA GCAAGGAATC ATATCGATCA 1920 CCAGCTGATG TAGAACTGGT TTCATATCTA GAAATGGAAT CCGTCTGAGT TTCTTTCTTA 1980 TTGGATCCCT CTTCTGTGTC TGATTGTTGT TCTTGTTCAT TTTCATCACT ATCTTGTGTC 2040 CAAAATGAAA CTCCTGTAGA TCTTCTTTTC TCTCTTGGTC GTCGTCGTTC TCTGATTGAT 2100 TTAGGTTGTG ATTTATCTTC TCCTTCTTTC TCCTCTTCTC TTTTTTCTCC CTCTCTTTCA 2160 TTTTCTTTTG TTATTCCTCT GGAGTAAGCA GAAGTTATGC CTACAAGACT ATTTGGCCTG 2220 TTTAGTTGAC TTGAAGCATA CAGTGAACTG CTCATAGTAG AAAGTGAAGA GGATGGAGTG 2280 GTTGAACTTG AAGTTGATAC TGGCCTATAA CGCTGGTAAG TCTCATCATA CGTTCTGGAG 2340 TACTTTTGTT TATATTCATC TTCTCTAGAT GTTTCTGACT CCTTCTTTTC TTCTTGTTTC 2400 TCTTTATCTT GTTTCTCTTT TTCCTCTTTT TCTTTTTCTT CATTTTCTTG TTCTCTGGTT 2460 CGGGTAGAAC GACTTCTTCC TATTGTTTTC TCAGCTTCTT GAAGATCAGT TAATGTCACT 2520 CCCTGTGTTG ATCTTCTAGA TTGTCTTGCT TGTCTAGATC TTGCTTTTCT TTGGGATTCA 2580 GACTCTTCAT CCCTAACAGG AGTGAGGTAT GATCTGCGTC TCTCCCTGAC CTCTGTTGTG 2640 GAGGAGACAG TGCCAGCAGT AGTTGTAGTC AGGGTTGTGG TAGAAGCTGC AGCATTTACA 2700 ACAGTTGGAG CAACAGGAAT GGTCACTGCC GTAGGAACAC TGTCCTTTTC TTTCTCAGTA 2760 CTATCCTCAG CCCACAAACG ATTTGAGGTA CTGCTTTGTG TGCCTGCTGA GGAAGAACCC 2820 GTTGTAATCT TTGTAGTAGT GCTTGTGCTG GAAAGCAGGC TTTTCTGAAG CCCAGCTGCA 2880 GAGGTAACTG TTGGTGTTGA TGTGGTGCTT GGAACACTAG AACTAATCAA ATCATCTTGT 2940 CTTCTACCAA AGGAGCAACT TTTATGATAC GTTGATCCTT CATTAACTGA GCTATTTTTT 3000 TTAAGATCAT CTTCCCATTT TCTCCTTGTA TATGAACTAC TTGTTCGCAA ACTTGAAGAA 3060 TCTCTGTTTT CTTTCTCTTC AATGTCAGAT GTACTGGCTA GTCGTCTTGG TATTGTAGGT 3120 GCAACATATG CAAGCCTAGT TCCTTTACTA TCTTTCTCCT TTTCTTTATT ATCCAAAGAG 3180 GAGGAAAGTC TGGGACTTGA AGCTGAACGT GTAACACCTG CAGTATCTTT TTCTTTCTGA 3240 CCCTCTTTAG ATGCTGTGAT TTCAGCAAGT GCACCATAGC TGCCCGTCTT TCTAAGTCCT 3300 AACCTCCAAG TTGCAGGAGA CTCATCTTTT CTCTCTTCTT CTTTGGGAGA AATTTTTGTA 3360 GCTGTGGTTG GAAACTTTTT AATAGGTGAT GTAGGTGTTG CTTGACCTGA TGACACAGTA 3420 GGTGTTGTAA CAGCTACAGG AGCTGCTTGT GTACTAGAAG TGTTGGCATT AGTTACAGAA 3480 GCCAGGGGTT TTGTCTTATC TGTTTCAGCT TCTGATTCCG AGTCATCTTC CTCATCTTCT 3540 TCACTAGAGC AGCTAGACTC ATCCTTCTTT CCTTCTTCTT CTTCATCAAC CTTTTCTTGT 3600 TCCAGAGATT CAATACGGGA TGCATTTTTC TCTGGTTCAA TAATCAACGT CTCTTTGTTT 3660 TTAAAGGTCT TCTGTGACTG ATTATTGTCC ATATTTGCTG TTGATTCAAT TAGTGGAGAT 3720 TTCTTGTCCC GTTTTTCACT ATGGAGCAGA TTTTGTTTCT TTTGCAACTC TTCTAAATAT 3780 CCTAAAATGT CTTCATCTGC TACATCAAAG GCTGTTTGGC CCACTTTGTT GACCATCTCC 3840 ATATCACACA GATTGTCCAC TAAAATTCGA CATGCTTCTT CTTTACCCCA ATGAGCTGCA 3900 GCATGAAGAG GTGTCCAGCC ATCATAGTCT TTAATATTAA CATCATAGCC TGCCTGTATT 3960 AAAAGTTTTA AAACTTCCGT ATAGCCTTTA GCAGCTGCAA CGTGAAGTGC TGTACCTCCA 4020 GATTTTGCAT GCCGGACATC ATTTATATGA CCACTATTTA GCCACTGCCT GGCATCTCTA 4080 AGCATGATCC GTTCTTCTTC CTTTCGAGCT GCTTCTATAT CAACCCCTTG CCGATTAACT 4140 TCATTTTGAA GTAGCTCTTC CATTGCCTCC TCCTCCGCAA TATCTAAAGG TGTATCTCCT 4200 TCACTGTTGA CAGCCCCTAC ATGTGCTCCT TGACCAATCA AAAACTCTGC AATATCAAGA 4260 TATCCACAGG AAGCTGCTGC ATGTAGTGGT ATCCAGCCTT CATTATCAGG TTGATTAATA 4320 TTTGCTCCAT TTTCTACCAG AAACTTCACC ATATCAACAT TGTCATCAAT GCAAGCCTGG 4380 TGCAGGGCAG TGAGTCCGTC CACATTGGCG TAATTGATGT CGGCGCCGCG GTGCAGCAGC 4440 TTGAGGACCT CGTCCGTGTC GCCGCTGGAG CAAGCAGCCA GGAAGACGGC GCCATCGTCG 4500 AACTTCACCT TGGTCTTCTG GCGCTTCACC ACCGGAGGCT CGAGGTCCGT CTCGGAGCCG 4560 ATCCAGCGTT TCAGCTGCTC GTTCCGCTTC TGCTTCGCGT CCGCCATCTT CATCCCCTCT 4620 CCTGCCGCCG GGTCTTCTTA TCGCGAGGGG GGGAAGGGGG AGGCGGAGAG GGAAGAGAGG 4680 GGAGGCAGGG GGTGTGTGAA TGTTTCTATG AGTGCGGGCC AGAGGAGGGC TGGGAACCCG 4740 GAGCCGACGC TCGAGACTTC CAGTATCCCA CAGAGCACTG GGGCGGCGCA CCCGGCCGAG 4800 CGGACCTCCC TTCCAGGTGG GCCCTCCCTG CTTCTAAAGC CCCACAGAAG TTCCC 4855SEQ ID NO: 5 Sequence length: 4855 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Antisense: YES Sequence type: cDNA to mRNA Sequence characteristics Other information: SEQ ID NO: 4 minus strand sequence ACAAATTCAC ATTTAATATA GTATACAATA CAATCAATAA TACAATCAGC TACTATAAGC 60 of SEQ TTTACAATGT ACAATTTATT CAAATGGCTG AACTGTTCCA GTGGTTAAGG AGACAGTTAT 120 GTGCCAGAAA GATGTAGTAT TTTTTGCATG GTTTAATGAA AATATAAAAG CTATTTGTCC 180 AAATAAAAGC CATCGTCACT ATGTACTTGG TTTTGCGCTT TTTTTTCCTT AAAAAAAAAA 240 AGGCCACTGA AATGTATAAA ATGGTCTGAA CATGATGGTG GTATCAAAGT CGATGCCTCT 300 TCACATGGCA ATAACAGTGC ATTTAACATT AACTCACGGG TTAATTCTGC AAATGATTTC 360 ATAGCATTAC TTTGGCTAGC ACAACAGTTT TAGACAGCAC TCAGATAAAT ATAGGTATGT 420 GAAATGTAAA GCAATTATCT TATGCAACTT TAATTATGGT TGAGTACTAT CAAATGAAAA 480 CTGAAAATAA AAGCACTTTA CAGTAGGAAA CTTTTGTAAA GATAGGGCTC CACATATAGTGT 540 GTAACTTTTA AAGTCTTCAT TTAG TATTCATTCATTAG AGTAGCCTA CTCTGCATTA GCAGACATTT GAAATAAGAA ATAGTCAAGC ATGCCATGTG 660 GTGGTCTAAA AATCAAAACA ATACACTTAT TTGTATATAC AGCATCACTC AGTACCTGCT 720 AAAATGAATG TGAAGATTAC AGAATCTAAC ATCTTATACT ACAATAAAAA AAAAGTGACC 780 AATGAAGCAG AAAATAGGAA TTAAAAGATC TAACCTCAAA TGACTTTAAA GCATTCATAT 840 AAGAAATAAA TGCATATTGC ACAAACAGTG AAAGCATATG TTCCACCAAG CAATTCAGTT 900 CCAGGTGGGA GACAACACAG CATTAGCCTA ATACATGACA ATAATCACAG AAGAGCAAGT 960 GTTCTTTTCT GTAATGAAAA AGCCGTGAAA ACATAGAAGA CTCTGCCACA TGAAGAGTTT 1020 AGAAGGAAAA AATACAAACC CAAACTTAGA TGAAAAGCCA AAAAATTTAA ATATCGAAAA 1080 ACTCGAAACT GTGGCACATC AAAAAATGTT GAGTAACTGT CTTCTGTGAG AGCTGAAAGT 1140 TTTTGTTGAC ACAAAAGTAT TTATGTACAA CTAAGGCTTA CTGGTTAAAT ATCTGAGGCA 1200 TATCTGGCCT TGAACACTTT CCTTATATGC TGGAGCTGTA AACAAGTTTT CTCAGTCATT 1260 AAAAAAAAAT CTTCTCAGCA GCTGCATTAA CATGAAACAA TGGTCTTGAT TAAAAAAAAA 1320 AACAAAAAAC AAACCAACAA CAACAAAAAC ACCCCAGAAA ATTAAACAAA ATGAAACAAA 1380 AATTCTAGAT AAGAGGGCAT TTGGCAGGAT ATCCGAAAAT GACAGTCTCC AAGGATTCTT 1440 CCCAGACTTC CA GTGACTGC CAATTATGGT CCACTGGGTT ACTAATATGT GCAATTCCAT 1500 TACTTGCTGC TTTTTTTTTT TTATTTGGAA AGTTTGCTTA TAACTCTGAT CAAGGCCCCA 1560 TTTTCATCCT TTAGCCTCTG GTTGTCTGCT TTTAGGTCTG GTAACATTTT GAGCTCTTCT 1620 TCCATTTCAG ATATTCTTCT TTCTAGAGCT CTTCGTTCCC TTTTTTCCAT TTCCAACAGT 1680 GATCTATCAG CAAATCTTTC TTGTCTCTGG GTGGCCTTTT CCAACTGTAA TTTAAGATCT 1740 GTTAGTTCCA TATTTGTATC ATGTAGCTGT GCCTTCAGCT TTTCATTTTC AGCTAGAATT 1800 TGTTCATAAA GCTTTTTAAA GTCAGTTGAG TCATCCTTTT CTAGCCTGCT GCTGTAAGGT 1860 TTTCTTTCTT CTAAGTAACT GTATGATCCA GAGCGACCCA GCAAGGAATC ATATCGATCA 1920 CCAGCTGATG TAGAACTGGT TTCATATCTA GAAATGGAAT CCGTCTGAGT TTCTTTCTTA 1980 TTGGATCCCT CTTCTGTGTC TGATTGTTGT TCTTGTTCAT TTTCATCACT ATCTTGTGTC 2040 CAAAATGAAA CTCCTGTAGA TCTTCTTTTC TCTCTTGGTC GTCGTCGTTC TCTGATTGAT 2100 TTAGGTTGTG ATTTATCTTC TCCTTCTTTC TCCTCTTCTC TTTTTTCTCC CTCTCTTTCA 2160 TTTTCTTTTG TTATTCCTCT GGAGTAAGCA GAAGTTATGC CTACAAGACT ATTTGGCCTG 2220 TTTAGTTGAC TTGAAGCATA CAGTGAACTG CTCATAGTAG AAAGTGAAGA GGATGGAGTG 2280 GTTGAACTTG AAGTTGAT AC TGGCCTATAA CGCTGGTAAG TCTCATCATA CGTTCTGGAG 2340 TACTTTTGTT TATATTCATC TTCTCTAGAT GTTTCTGACT CCTTCTTTTC TTCTTGTTTC 2400 TCTTTATCTT GTTTCTCTTT TTCCTCTTTT TCTTTTTCTT CATTTTCTTG TTCTCTGGTT 2460 CGGGTAGAAC GACTTCTTCC TATTGTTTTC TCAGCTTCTT GAAGATCAGT TAATGTCACT 2520 CCCTGTGTTG ATCTTCTAGA TTGTCTTGCT TGTCTAGATC TTGCTTTTCT TTGGGATTCA 2580 GACTCTTCAT CCCTAACAGG AGTGAGGTAT GATCTGCGTC TCTCCCTGAC CTCTGTTGTG 2640 GAGGAGACAG TGCCAGCAGT AGTTGTAGTC AGGGTTGTGG TAGAAGCTGC AGCATTTACA 2700 ACAGTTGGAG CAACAGGAAT GGTCACTGCC GTAGGAACAC TGTCCTTTTC TTTCTCAGTA 2760 CTATCCTCAG CCCACAAACG ATTTGAGGTA CTGCTTTGTG TGCCTGCTGA GGAAGAACCC 2820 GTTGTAATCT TTGTAGTAGT GCTTGTGCTG GAAAGCAGGC TTTTCTGAAG CCCAGCTGCA 2880 GAGGTAACTG TTGGTGTTGA TGTGGTGCTT GGAACACTAG AACTAATCAA ATCATCTTGT 2940 CTTCTACCAA AGGAGCAACT TTTATGATAC GTTGATCCTT CATTAACTGA GCTATTTTTT 3000 TTAAGATCAT CTTCCCATTT TCTCCTTGTA TATGAACTAC TTGTTCGCAA ACTTGAAGAA 3060 TCTCTGTTTT CTTTCTCTTC AATGTCAGAT GTACTGGCTA GTCGTCTTGG TATTGTAGGT 3120 GCAACATATG CAAGCCTAGT TCC TTTACTA TCTTTCTCCT TTTCTTTATT ATCCAAAGAG 3180 GAGGAAAGTC TGGGACTTGA AGCTGAACGT GTAACACCTG CAGTATCTTT TTCTTTCTGA 3240 CCCTCTTTAG ATGCTGTGAT TTCAGCAAGT GCACCATAGC TGCCCGTCTT TCTAAGTCCT 3300 AACCTCCAAG TTGCAGGAGA CTCATCTTTT CTCTCTTCTT CTTTGGGAGA AATTTTTGTA 3360 GCTGTGGTTG GAAACTTTTT AATAGGTGAT GTAGGTGTTG CTTGACCTGA TGACACAGTA 3420 GGTGTTGTAA CAGCTACAGG AGCTGCTTGT GTACTAGAAG TGTTGGCATT AGTTACAGAA 3480 GCCAGGGGTT TTGTCTTATC TGTTTCAGCT TCTGATTCCG AGTCATCTTC CTCATCTTCT 3540 TCACTAGAGC AGCTAGACTC ATCCTTCTTT CCTTCTTCTT CTTCATCAAC CTTTTCTTGT 3600 TCCAGAGATT CAATACGGGA TGCATTTTTC TCTGGTTCAA TAATCAACGT CTCTTTGTTT 3660 TTAAAGGTCT TCTGTGACTG ATTATTGTCC ATATTTGCTG TTGATTCAAT TAGTGGAGAT 3720 TTCTTGTCCC GTTTTTCACT ATGGAGCAGA TTTTGTTTCT TTTGCAACTC TTCTAAATAT 3780 CCTAAAATGT CTTCATCTGC TACATCAAAG GCTGTTTGGC CCACTTTGTT GACCATCTCC 3840 ATATCACACA GATTGTCCAC TAAAATTCGA CATGCTTCTT CTTTACCCCA ATGAGCTGCA 3900 GCATGAAGAG GTGTCCAGCC ATCATAGTCT TTAATATTAA CATCATAGCC TGCCTGTATT 3960 AAAAGTTTTA AAACTTCCGT ATAGCCTTT A GCAGCTGCAA CGTGAAGTGC TGTACCTCCA 4020 GATTTTGCAT GCCGGACATC ATTTATATGA CCACTATTTA GCCACTGCCT GGCATCTCTA 4080 AGCATGATCC GTTCTTCTTC CTTTCGAGCT GCTTCTATAT CAACCCCTTG CCGATTAACT 4140 TCATTTTGAA GTAGCTCTTC CATTGCCTCC TCCTCCGCAA TATCTAAAGG TGTATCTCCT 4200 TCACTGTTGA CAGCCCCTAC ATGTGCTCCT TGACCAATCA AAAACTCTGC AATATCAAGA 4260 TATCCACAGG AAGCTGCTGC ATGTAGTGGT ATCCAGCCTT CATTATCAGG TTGATTAATA 4320 TTTGCTCCAT TTTCTACCAG AAACTTCACC ATATCAACAT TGTCATCAAT GCAAGCCTGG 4380 TGCAGGGCAG TGAGTCCGTC CACATTGGCG TAATTGATGT CGGCGCCGCG GTGCAGCAGC 4440 TTGAGGACCT CGTCCGTGTC GCCGCTGGAG CAAGCAGCCA GGAAGACGGC GCCATCGTCG 4500 AACTTCACCT TGGTCTTCTG GCGCTTCACC ACCGGAGGCT CGAGGTCCGT CTCGGAGCCG 4560 ATCCAGCGTT TCAGCTGCTC GTTCCGCTTC TGCTTCGCGT CCGCCATCTT CATCCCCTCT 4620 CCTGCCGCCG GGTCTTCTTA TCGCGAGGGG GGGAAGGGGG AGGCGGAGAG GGAAGAGAGG 4680 GGAGGCAGGG GGTGTGTGAA TGTTTCTATG AGTGCGGGCC AGAGGAGGGC TGGGAACCCG 4740 GAGCCGACGC TCGAGACTTC CAGTATCCCA CAGAGCACTG GGGCGGCGCA CCCGGCCGAG 4800 CGGACCTCCC TTCCAGGTGG GCCCTCCCTG CTTC TAAAGC CCCACAGAAG TTCCC 4855
【図１】Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク質の精製結果
を示した図である。結果は、３回の独立した実験の代表
例である。レーン１：ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・ＧＳ
Ｔ−Ｒｈｏ、レーン３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒｈｏ、
レーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡｌａ３７、レ
ーン５：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、レーン６：ＧＴ
ＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ。FIG. 1 is a view showing the results of purification of a Rho protein-binding protein. Results are representative of three independent experiments. Lane 1: GST, Lane 2: GDP / GS
T-Rho, lane 3: GTPγS · GST-Rho,
Lane 4: GTPγS · GST-Rho Ala37 , Lane 5: GDP · GST-H-Ras, Lane 6: GT
PγS-GST-H-Ras.
【図２】Ｍｏｎｏ Ｑ カラム・クロマグラフィーによ
るｐ１６４の精製の結果を示した図である。ＣＨＡＰＳ
溶出画分をＭｏｎｏ Ｑ カラムにかけ、ｐ１６４をＮ
ａＣｌ直線勾配で溶出した。結果は３回の独立した実験
の代表例である。FIG. 2 shows the results of purification of p164 by Mono Q column chromatography. CHAPS
The eluted fraction was applied to a Mono Q column, and p164 was
Elution was performed with a linear aCl gradient. The results are representative of three independent experiments.
【図３】アフィニティーカラムクロマトグラフィーから
溶出された画分を抗ミオシン結合サブユニット抗体でイ
ムノブロットした結果を示した図である。結果は、３回
の独立した実験の代表例である。レーン１：ＧＳＴ、レ
ーン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン３：ＧＴＰ
γＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳ
Ｔ−ＲｈｏＡＡｌａ３７、レーン５：ＧＤＰ・ＧＳＴ−
Ｒａｃ１、レーン６：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒａｃ１、
レーン７：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、レーン８：Ｇ
ＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ。FIG. 3 is a diagram showing the results of immunoblotting of a fraction eluted from affinity column chromatography with an anti-myosin-binding subunit antibody. Results are representative of three independent experiments. Lane 1: GST, Lane 2: GDP / GST-RhoA, Lane 3: GTP
γS · GST-RhoA, lane 4: GTPγS · GS
T-RhoA Ala37 , lane 5: GDP · GST-
Rac1, lane 6: GTPγS.GST-Rac1,
Lane 7: GDP · GST-H-Ras, Lane 8: G
TPγS · GST-H-Ras.
【図４】アフィニティーカラムクロマトグラフィーから
溶出された画分を抗触媒サブユニット抗体でイムノブロ
ットした結果を示した図である。結果は、３回の独立し
た実験の代表例である。レーン１：ＧＳＴ、レーン２：
ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン３：ＧＴＰγＳ・Ｇ
ＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒｈ
ｏＡＡｌａ３７、レーン５：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒａｃ
１、レーン６：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒａｃ１、レーン
７：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、レーン８：ＧＴＰγ
Ｓ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ。FIG. 4 is a diagram showing the results of immunoblotting of a fraction eluted from affinity column chromatography with an anti-catalytic subunit antibody. Results are representative of three independent experiments. Lane 1: GST, Lane 2:
GDP · GST-RhoA, lane 3: GTPγS · G
ST-RhoA, lane 4: GTPγS · GST-Rh
oA Ala37 , lane 5: GDP · GST-Rac
1, lane 6: GTPγS · GST-Rac1, lane 7: GDP · GST-H-Ras, lane 8: GTPγ
S · GST-H-Ras.
【図５】アフィニティーカラムクロマトグラフィーから
溶出された画分によるウシ・ミオシン軽鎖フォスファタ
ーゼ活性を示した図である。結果は、３回の独立した実
験の代表例である。FIG. 5 is a diagram showing bovine myosin light chain phosphatase activity by fractions eluted from affinity column chromatography. Results are representative of three independent experiments.
【図６】インビトロ・トランスレーションによって作製
したラット・ミオシン結合サブユニットと活性型Ｒｈｏ
タンパク質との結合を測定した結果を示した図である。
レーン１：ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒｈｏ
Ａ、レーン３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン
４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡＡｌａ３７。FIG. 6. Rat myosin binding subunit produced by in vitro translation and activated Rho.
FIG. 3 is a view showing the result of measuring the binding to a protein.
Lane 1: GST, Lane 2: GDP-GST-Rho
A, Lane 3: GTPγS.GST -RhoA, Lane 4: GTPγS.GST -RhoA Ala37 .
【図７】組換えラット・ミオシン結合サブユニットが、
ｐ１２２ＲｈｏＧＡＰのＲｈｏＧＴＰａｓｅ活性化能力
に与える影響を示した図である。結果は、３回の独立し
た実験の代表例である。丸印はＭＢＰの存在下、四角形
はＭＢＰ−Ｎの存在下、三角形はＭＢＰ−Ｃの存在下で
の結果を示す。また、黒塗りの印はｐ１２２ＲｈｏＧＡ
Ｐの存在下、白塗りの印はｐ１２２ＲｈｏＧＡＰの非存
在下での結果を示す。FIG. 7: Recombinant rat myosin binding subunit
It is a figure showing the influence of p122RhoGAP on the RhoGTPase activating ability. Results are representative of three independent experiments. The circles indicate the results in the presence of MBP, the squares indicate the results in the presence of MBP-N, and the triangles indicate the results in the presence of MBP-C. The black mark is p122RhoGA
In the presence of P, open symbols indicate results in the absence of p122RhoGAP.
【図８】ｐ１６４によるラットのミオシン結合サブユニ
ットのリン酸化を、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡが促
進することを示した図である。レーン１：ＧＳＴ、レー
ン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン３：ＧＴＰγ
Ｓ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ。矢印は、ミオシン結合サブユニ
ットのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動上の位置を示す。FIG. 8 shows that GTPγS.GST-RhoA promotes phosphorylation of rat myosin binding subunit by p164. Lane 1: GST, Lane 2: GDP-GST-RhoA, Lane 3: GTPγ
S.GST-RhoA. Arrows indicate the position of myosin binding subunit on SDS-PAGE electrophoresis.
【図９】ｐ１６４によるＳ６ペプチドのリン酸化を示し
た図である。黒四角形：ＧＴＰγＳ・ＲｈｏＡ（翻訳後
修飾型）、白四角形：ＧＤＰ・ＲｈｏＡ（翻訳後修飾
型）、黒丸：ＧＴＰγＳ−ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（非翻訳後
修飾型）、白丸：ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（非翻訳後
修飾型）。FIG. 9 shows the phosphorylation of S6 peptide by p164. Solid square: GTPγS-RhoA (post-translationally modified), open square: GDP ・ RhoA (post-translationally modified), solid circle: GTPγS-GST-RhoA (non-translationally modified), open circle: GDP ・ GST-RhoA (non-translated) Post-translationally modified).
【図１０】酵母ツー・ハイブリッド・システム(two hyb
rid system) によるミオシン結合サブユニットとＲｈｏ
Ａタンパク質との結合を示した図である。FIG. 10. Yeast two hybrid system (two hyb)
rid system) and myocin binding subunit and Rho
FIG. 3 is a view showing binding to an A protein.
【図１１】ｐ１６４によるニワトリのミオシン結合サブ
ユニットのリン酸化をＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡが
促進することを示した図である。レーン１：ＧＳＴ、レ
ーン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン３：ＧＴＰ
γＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳ
Ｔ−ＲｈｏＡＡｌａ３７、レーン５：ＧＤＰ・ＧＳＴ−
Ｒａｃ１、レーン６：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒａｃ１。
レーンの上の数字は、リン酸化の程度を、ＧＳＴ（レー
ン１）の場合を１．０としたときの相対値で表してい
る。FIG. 11 shows that GTPγS.GST-RhoA promotes phosphorylation of chicken myosin binding subunit by p164. Lane 1: GST, Lane 2: GDP / GST-RhoA, Lane 3: GTP
γS · GST-RhoA, lane 4: GTPγS · GS
T-RhoA Ala37 , lane 5: GDP · GST-
Rac1, lane 6: GTPγS.GST-Rac1.
The numbers above the lanes indicate the degree of phosphorylation as a relative value when GST (lane 1) is 1.0.
【図１２】ｐ１６４濃度依存的なニワトリ・ミオシン結
合サブユニットのチオリン酸化とミオシン軽鎖フォスフ
ァターゼ活性の阻害を示した図である。黒丸および白丸
は、それぞれＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ存在または
非存在下でのミオシン結合サブユニットへの３５Ｓーチ
オリン酸の取り込みを示す。黒四角形および白四角形
は、それぞれＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ存在下また
は非存在下、ＡＴＰγＳの存在下でリン酸化したｐ１６
４を用いた場合でのミオシン軽鎖フォスファターゼの酵
素活性を示す。菱形はＡＴＰγＳの非存在下（即ちリン
酸化していないｐ１６４を用いた場合での）ミオシン軽
鎖フォスファターゼの酵素活性を示す。FIG. 12 is a diagram showing p164 concentration-dependent thiophosphorylation of chicken myosin binding subunit and inhibition of myosin light chain phosphatase activity. Solid and open circles indicate incorporation of 35 S-thiophosphate into myosin-binding subunit in the presence or absence of GTPγS.GST-RhoA, respectively. Solid squares and open squares indicate p16 phosphorylated in the presence or absence of ATPγS in the presence or absence of GTPγS.GST-RhoA, respectively.
4 shows the enzymatic activity of myosin light chain phosphatase when No. 4 was used. Diamonds indicate the enzymatic activity of myosin light chain phosphatase in the absence of ATPγS (ie, using unphosphorylated p164).
【図１３】ＲｈｏＡまたはＲｈｏＡＶａｌ１４を過剰に
発現させた各ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株内でのミオシン結合
サブユニットのリン酸化の程度を示した図である。FIG. 13 shows the degree of phosphorylation of the myosin-binding subunit in each NIH / 3T3 cell line overexpressing RhoA or RhoA Val14 .
【図１４】ＲｈｏＡまたはＲｈｏＡＶａｌ１４を過剰に
発現させた各ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株内でのミオシン軽鎖
のリン酸化の程度を示した図である。FIG. 14 shows the degree of phosphorylation of myosin light chain in each NIH / 3T3 cell line overexpressing RhoA or RhoA Val14 .
【図１５】ＲｈｏＡによって誘導されたミオシン結合サ
ブユニット（ＭＢＳ）の細胞内分布の変化を示した図で
ある。ＣＯＳ７細胞に、Ｍｙｃ−ＭＢＳおよびＨＡ−Ｒ
ｈｏＡまたはＨＡ−ＲｈｏＡＶａｌ１４をトランスフェ
クトした。その後、細胞抽出液よりサイトゾル画分およ
び膜（particulate ）画分を調製し、イムノブロットす
ることによってＭＢＳ量を測定した。結果は、３回の独
立した実験からの代表例である。FIG. 15 shows changes in the intracellular distribution of myosin binding subunit (MBS) induced by RhoA. Myc-MBS and HA-R in COS7 cells
hoA or HA-RhoA Val14 were transfected. Thereafter, a cytosolic fraction and a membrane fraction were prepared from the cell extract, and the amount of MBS was measured by immunoblot. Results are representative of three independent experiments.
【図１６】ヒト部分ｃＤＮＡ断片を概略した図である。
開始コドン（ＡＴＧ）を２４３〜２４５としてナンバリ
ングしている。FIG. 16 is a diagram schematically showing a human partial cDNA fragment.
Initiation codons (ATG) are numbered as 243-245.
【図１７】ヒトＭＢＳ（配列番号３の１〜６８９番のア
ミノ酸配列）とＧＳＴとの融合タンパク質を大腸菌中に
発現・生産させるためのベクター（pGEX-hMBS[1-689]）
の構造を示した図である。プラスミドｐＧＥＸ４Ｔ−１
のＧＳＴコード領域下流のＢａｍＨ１部位およびＥｃｏ
ＲＩ部位を利用して、ヒトＭＢＳ（アミノ酸１〜６８
９）コード領域がインフレームで挿入されている。FIG. 17 is a vector (pGEX-hMBS [1-689]) for expressing and producing a fusion protein of human MBS (amino acid sequence of Nos. 1 to 689 of SEQ ID NO: 3) and GST in Escherichia coli.
FIG. 2 is a diagram showing the structure of FIG. Plasmid pGEX4T-1
BamH1 site downstream of GST coding region and Eco
Utilizing the RI site, human MBS (amino acids 1-68)
9) The code region is inserted in-frame.
【図１８】抗ヒトＭＢＳ抗体を用いたウェスタンブロッ
ティング解析の結果を示した電気泳動写真である。ヒト
ＭＢＳに相当する位置が写真の右に横線で示されてい
る。Brain ：ヒト脳、Lung：ヒト肺、Heart ：ヒト心
臓、Aorta ：ヒト大動脈、ＭＢＰ：ニワトリ砂嚢。写真
の左には分子量マーカーが示されている。FIG. 18 is an electrophoretic photograph showing the results of Western blot analysis using an anti-human MBS antibody. The position corresponding to human MBS is indicated by a horizontal line to the right of the photograph. Brain: human brain, Lung: human lung, Heart: human heart, Aorta: human aorta, MBP: chicken gizzard. A molecular weight marker is shown on the left of the photograph.
【図１９】ヒトＭＢＳ ｃＤＮＡ断片を用いたノーザン
・ブロッティング解析の結果を示した電気泳動写真であ
る。heart ：心臓、brain ：脳、placenta：胎盤、lun
g：肺、liver ：肝臓、skeletal muscle ：骨格筋、kid
ney：腎臓、pancreas：膵臓。写真の左には分子量マー
カーが示されている。FIG. 19 is an electrophoretic photograph showing the results of Northern blotting analysis using a human MBS cDNA fragment. heart: heart, brain: brain, placenta: placenta, lun
g: lung, liver: liver, skeletal muscle: skeletal muscle, kid
ney: kidney, pancreas: pancreas. A molecular weight marker is shown on the left of the photograph.
【図２０】ヒトＭＢＳによるＰＰ１ｃδのホスファター
ゼ活性の亢進を示した図である。□：rG-hMBS[1-689]。FIG. 20 shows enhancement of phosphatase activity of PP1cδ by human MBS. □: rG-hMBS [1-689].
【図２１】ＦＩＳＨ法により、ヒトＭＢＳ遺伝子の染色
体上の位置（１２ｑ１５−ｑ２１．２）を示した写真で
ある。FIG. 21 is a photograph showing the position (12q15-q21.2) of the human MBS gene on the chromosome by the FISH method.
─────────────────────────────────────────────────────
────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成９年５月２１日[Submission date] May 21, 1997
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】図１[Correction target item name] Fig. 1
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図１】Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク質の精製結果
を示した電気泳動写真である。結果は、３回の独立した
実験の代表例である。レーン１：ＧＳＴ、レーン２：Ｇ
ＤＰ・ＧＳＴ−Ｒｈｏ、レーン３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ
−Ｒｈｏ、レーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒｈｏ
Ａｌａ３７、レーン５：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ、
レーン６：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓｏ FIG. 1 is an electrophoretic photograph showing the results of purification of a Rho protein-binding protein. Results are representative of three independent experiments. Lane 1: GST, Lane 2: G
DP · GST-Rho, Lane 3: GTPγS · GST
-Rho, lane 4: GTPγS · GST-Rho
Ala37 , lane 5: GDP · GST-H-Ras,
Lane 6: GTPγS · GST-H- Ras o
【手続補正２】[Procedure amendment 2]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】図６[Correction target item name] Fig. 6
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図６】インビトロ・トランスレーションによって作製
したラット・ミオシン結合サブユニットと活性型Ｒｈｏ
タンパク質との結合を測定した結果を示した電気泳動写
真である。レーン１：ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・ＧＳ
Ｔ−ＲｈｏＡ、レーン３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒｈｏ
Ａ、レーン４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒｈ
ｏＡｌａ３７。FIG. 6. Rat myosin binding subunit produced by in vitro translation and activated Rho.
4 is an electrophoretic photograph showing the result of measuring the binding to a protein. Lane 1: GST, Lane 2: GDP / GS
T-RhoA, lane 3: GTPγS · GST-Rho
A, lane 4: GTPγS · GST-Rh
o Ala37 .
【手続補正３】[Procedure amendment 3]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】図１０[Correction target item name] FIG.
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図１０】酵母ツー・ハイブリッド・システム（ｔｗｏ
ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）によるミオシン結合サ
ブユニットとＲｈｏＡタンパク質との結合を示した顕微
鏡写真である。FIG. 10. Yeast two hybrid system (two
5 is a photomicrograph showing the binding of a myosin binding subunit to a RhoA protein by a hybrid system.
【手続補正４】[Procedure amendment 4]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】図１１[Correction target item name] FIG.
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図１１】ｐ１６４によるニワトリのミオシン結合サブ
ユニットのリン酸化をＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡが
促進することを示した電気泳動写真である。レーン１：
ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン
３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン４：ＧＴＰ
γＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡＡｌａ３７、レーン５：ＧＤＰ
・ＧＳＴ−Ｒａｃ１、レーン６：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−
Ｒａｃ１。レーンの上の数字は、リン酸化の程度を、Ｇ
ＳＴ（レーン１）の場合を１．０としたときの相対値で
表している。FIG. 11 is an electrophoretogram showing that GTPγS.GST-RhoA promotes phosphorylation of chicken myosin binding subunit by p164. Lane 1:
GST, lane 2: GDP · GST-RhoA, lane 3: GTPγS · GST-RhoA, lane 4: GTP
γS · GST-RhoA Ala37 , lane 5: GDP
GST-Rac1, lane 6: GTPγS GST-
Rac1. The numbers above the lanes indicate the degree of phosphorylation, G
It is represented by a relative value when ST (lane 1) is set to 1.0.
【手続補正５】[Procedure amendment 5]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】図１３[Correction target item name] FIG.
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図１３】ＲｈｏＡまたはＲｈｏＡＶａｌ１４を過剰に
発現させた各ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株内でのミオシン結合
サブユニットのリン酸化の程度を示した電気泳動写真で
ある。FIG. 13 is an electrophoretic photograph showing the degree of phosphorylation of a myosin-binding subunit in each NIH / 3T3 cell line overexpressing RhoA or RhoA Val14 .
【手続補正６】[Procedure amendment 6]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】図２１[Correction target item name] FIG.
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図２１】ＦＩＳＨ法により、ヒトＭＢＳ遺伝子の染色
体上の位置（１２ｑ１５−ｑ２１．２）を示した顕微鏡
写真である。FIG. 21 is a photomicrograph showing the position (12q15-q21.2) of the human MBS gene on the chromosome by the FISH method.
【手続補正７】[Procedure amendment 7]
【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing
【補正対象項目名】図１[Correction target item name] Fig. 1
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図１】 FIG.
【手続補正８】[Procedure amendment 8]
【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing
【補正対象項目名】図３[Correction target item name] Figure 3
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図３】 FIG. 3
【手続補正９】[Procedure amendment 9]
【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing
【補正対象項目名】図４[Correction target item name] Fig. 4
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図４】 FIG. 4
【手続補正１０】[Procedure amendment 10]
【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing
【補正対象項目名】図６[Correction target item name] Fig. 6
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図６】 FIG. 6
【手続補正１１】[Procedure amendment 11]
【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing
【補正対象項目名】図１０[Correction target item name] FIG.
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図１０】 FIG. 10
【手続補正１２】[Procedure amendment 12]
【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing
【補正対象項目名】図１１[Correction target item name] FIG.
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図１１】 FIG. 11
【手続補正１３】[Procedure amendment 13]
【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing
【補正対象項目名】図１３[Correction target item name] FIG.
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図１３】 FIG. 13
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 9452−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/42 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/42 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/566 9282−4Ｂ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） ──────────────────────────────────────────────────の Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Agency reference number FI Technical indication location C07K 19/00 C12P 21/02 C C12N 5/10 9452-4B C12Q 1/42 15/09 G01N 33 / 53 D C12P 21/02 33/566 C12Q 1/42 A61K 37/02 ADS // G01N 33/53 C12N 5/00 B 33/566 9282-4B 15/00 A (C12P 21/02 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1: 865)
Claims (25)
誘導体： （１）活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する、（２）
ミオシン軽鎖フォスファターゼの触媒サブユニットのフ
ォスファターゼ活性を亢進する、（３）その遺伝子がヒ
ト染色体１２ｑ１５−２１．２に位置する、（４）分子
量がＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約１３０〜１３５ｋ
Ｄａである。1. A protein or a derivative thereof having the following properties: (1) having an active Rho protein binding ability;
Enhances the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase, (3) its gene is located on human chromosome 12q15-21.2, (4) its molecular weight is about 130-135 k as measured by SDS-PAGE
Da.
はその誘導体： （ａ）配列番号３のアミノ酸配列、または（ｂ）１以上
のアミノ酸が付加および／または挿入され、および／ま
たは１以上のアミノ酸が置換および／または欠失された
配列番号３のアミノ酸配列であって、活性型Ｒｈｏタン
パク質結合能を有し、かつミオシン軽鎖ホスファターゼ
の触媒サブユニットのホスファターゼ活性を亢進するア
ミノ酸配列。2. A protein comprising the following amino acid sequence or a derivative thereof: (a) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or (b) one or more amino acids are added and / or inserted, and / or one or more amino acids are added. 3. A substituted and / or deleted amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, which has an ability to bind to active Rho protein and enhances the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase.
入され、および／または１以上のアミノ酸が置換および
／または欠失された配列番号３のアミノ酸配列を含むタ
ンパク質であって、前記アミノ酸配列が活性型Ｒｈｏタ
ンパク質結合能を有するタンパク質またはその誘導体。3. A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 wherein one or more amino acids are added and / or inserted, and / or one or more amino acids are substituted and / or deleted, wherein the amino acid sequence is A protein having an active Rho protein binding ability or a derivative thereof.
酸配列を有するタンパク質である、請求項３に記載のタ
ンパク質。4. The protein according to claim 3, which is a protein having the amino acid sequence of positions 754 to 1030 of SEQ ID NO: 3.
入され、および／または１以上のアミノ酸が置換および
／または欠失された配列番号３のアミノ酸配列を含むタ
ンパク質であって、前記アミノ酸配列がミオシン軽鎖ホ
スファターゼの触媒サブユニットのホスファターゼ活性
を亢進するタンパク質またはその誘導体。5. A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 wherein one or more amino acids are added and / or inserted, and / or one or more amino acids are substituted and / or deleted, wherein the amino acid sequence is A protein or derivative thereof that enhances the phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase.
を有するタンパク質である、請求項５に記載のタンパク
質。6. The protein according to claim 5, which is a protein having the amino acid sequence of positions 1 to 689 of SEQ ID NO: 3.
パク質をコードする塩基配列。7. A nucleotide sequence encoding the protein according to any one of claims 1 to 6.
ベクター。8. A nucleic acid comprising the nucleotide sequence according to claim 7,
vector.
およびリポソームベクターからなる群から選択される、
請求項８に記載のベクター。9. A plasmid vector, a virus vector,
And a liposome vector.
A vector according to claim 8.
って形質転換された、宿主細胞（ただし、ヒト細胞にあ
ってはヒトから単離された細胞に限る）。10. A host cell transformed with the vector according to claim 8 or 9 (however, in the case of a human cell, it is limited to a cell isolated from a human).
リンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、お
よび腫瘍細胞からなる群から選択されるものである、請
求項１０に記載の宿主細胞。11. Escherichia coli, yeast, insect cells, COS cells,
The host cell according to claim 10, which is selected from the group consisting of lymph cells, fibroblasts, CHO cells, blood cells, and tumor cells.
を培養し、そしてその培養物から請求項１〜６のいずれ
か一項に記載のタンパク質またはそれらの誘導体を単離
することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の
タンパク質またはそれらの誘導体の製造法。12. A method comprising culturing the host cell according to claim 10 or 11, and isolating the protein according to any one of claims 1 to 6 or a derivative thereof from the culture. A method for producing the protein according to any one of claims 1 to 6 or a derivative thereof.
基のＤＮＡ配列を含む塩基配列、およびそれに相補的な
配列、並びに（ｂ）（ａ）の塩基配列とストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズする塩基配列。13. A base sequence selected from the following: (a) a base sequence containing a continuous DNA sequence of at least 20 bases in the sequence of SEQ ID NO: 4, a sequence complementary thereto, and (b) (a) A) a base sequence which hybridizes with the base sequence under stringent conditions.
７５〜３３２９番、２８９２〜４８５５番、２１８３〜
３３４４番、１〜８９５番、３３５６〜３３７７番、お
よび３５０２〜３５２３番の塩基配列、並びに配列番号
５の２４９６〜４１１３番、１５２７〜２５８１番、１
〜１９６４番、１５１２〜２６７３番、３９６１〜４８
５５番、１４７９〜１５００番、および１３３３〜１３
５４番の塩基配列からなる群から選択される、請求項１
３に記載の塩基配列。[14] SEQ ID NO: 4 at positions 743 to 2360, 22
75-3329, 2892-4855, 2183-
The nucleotide sequences of Nos. 3344, 1 to 895, 3356 to 3377, and 3502 to 3523, and 2496 to 4113, 1527 to 2581, and 1 of SEQ ID NO: 5
-1964, 1512-2673, 396-48
No. 55, 1479-1500, and 1333-13
2. The method according to claim 1, which is selected from the group consisting of the 54th nucleotide sequence.
3. The nucleotide sequence according to 3.
と検出可能な標識とを含む、プローブ。15. A probe comprising the nucleotide sequence according to claim 13 and a detectable label.
素、蛍光、および抗原からなる群から選択される、請求
項１５に記載のプローブ。16. The probe of claim 15, wherein the detectable label is selected from the group consisting of an enzyme, a radioisotope, fluorescence, and an antigen.
または請求項１５または１６に記載のプローブを含む、
診断薬。(17) a probe comprising the nucleotide sequence according to (13) or (14) or the probe according to (15) or (16);
Diagnostics.
記載の診断薬。18. The diagnostic agent according to claim 17, which is used for diagnosing a tumor.
を、活性型Ｒｈｏタンパク質と請求項１〜４のいずれか
一項に記載のタンパク質とを含むスクリーニング系に存
在させ、そして（２）活性型Ｒｈｏタンパク質と請求項
１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質との結合の阻
害の程度を測定することを含んでなる、活性型Ｒｈｏタ
ンパク質と請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパ
ク質との結合を阻害する物質のスクリーニング法。(19) A substance to be screened is present in a screening system containing an active Rho protein and the protein according to any one of (1) to (4), and (2) an active Rho protein. The active Rho protein and any one of claims 1 to 4, comprising measuring the degree of inhibition of binding between the Rho protein and the protein according to any one of claims 1 to 4. A method for screening for a substance that inhibits binding to a protein.
ブリッド・システムである、請求項１９に記載のスクリ
ーニング法。20. The screening method according to claim 19, wherein the screening system is a yeast two-hybrid system.
ン軽鎖ホスファターゼの触媒サブユニットと、請求項
１、２、５、および６のいずれか一項に記載のタンパク
質とを含むスクリーニング系に存在させ、そして（２）
ミオシン軽鎖ホスファターゼの触媒サブユニットのフォ
スファターゼ活性の亢進の程度を測定することを含む、
ミオシン軽鎖ホスファターゼの触媒サブユニットのフォ
スファターゼ活性の亢進を阻害する物質のスクリーニン
グ法。(1) A screening target is present in a screening system containing the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase and the protein according to any one of claims 1, 2, 5, and 6. And (2)
Including measuring the degree of enhancement of phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase,
A method for screening a substance that inhibits the enhancement of phosphatase activity of the catalytic subunit of myosin light chain phosphatase.
質を含む、請求項２１に記載のスクリーニング法。22. The screening method according to claim 21, wherein the screening system comprises a phosphatase substrate.
シン軽鎖である、請求項２２に記載のスクリーニング
法。23. The screening method according to claim 22, wherein the phosphatase substrate is a phosphorylated-myosin light chain.
対する抗体。24. An antibody against the protein according to claim 1 or 2.
に記載の抗体。25. The method according to claim 24, which is a polyclonal antibody.
The antibody according to 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9061847A JPH1077299A (en) | 1996-07-11 | 1997-02-28 | Human myosin light chain-binding subunit, its gene and diagnostic agent |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-201325 | 1996-07-11 | ||
| JP08201325 | 1996-07-11 | ||
| JP9061847A JPH1077299A (en) | 1996-07-11 | 1997-02-28 | Human myosin light chain-binding subunit, its gene and diagnostic agent |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1077299A true JPH1077299A (en) | 1998-03-24 |
Family
ID=26402931
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9061847A Pending JPH1077299A (en) | 1996-07-11 | 1997-02-28 | Human myosin light chain-binding subunit, its gene and diagnostic agent |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1077299A (en) |
-
1997
- 1997-02-28 JP JP9061847A patent/JPH1077299A/en active Pending
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