JPH1075788A - トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 - Google Patents
トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法Info
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- JPH1075788A JPH1075788A JP8232724A JP23272496A JPH1075788A JP H1075788 A JPH1075788 A JP H1075788A JP 8232724 A JP8232724 A JP 8232724A JP 23272496 A JP23272496 A JP 23272496A JP H1075788 A JPH1075788 A JP H1075788A
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を用いて、より
工業的に有利にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンを製造するための方法を提供することにある。 【解決手段】 ２−ケトグルタル酸および２価鉄イオン
の存在下、遊離のＬ−プロリンに作用して、トランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する、Ｌ−プロリ
ン４位水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片をベクターに組み込んで得られる組
換え体ＤＮＡを保有し、且つ、Ｌ−プロリンの生合成系
の活性の強化された形質転換体、を培養し、該培養物、
菌体または菌体処理物を酵素源として、２−ケトグルタ
ル酸および２価鉄イオンの存在下、培養液または水性媒
体中で、を生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンを該培養物または該水性媒体より採取する。
工業的に有利にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンを製造するための方法を提供することにある。 【解決手段】 ２−ケトグルタル酸および２価鉄イオン
の存在下、遊離のＬ−プロリンに作用して、トランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する、Ｌ−プロリ
ン４位水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片をベクターに組み込んで得られる組
換え体ＤＮＡを保有し、且つ、Ｌ−プロリンの生合成系
の活性の強化された形質転換体、を培養し、該培養物、
菌体または菌体処理物を酵素源として、２−ケトグルタ
ル酸および２価鉄イオンの存在下、培養液または水性媒
体中で、を生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンを該培養物または該水性媒体より採取する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、消炎剤として利用
されているＮ−アセチルヒドロキシプロリン，カルバペ
ネム系抗生物質等の医薬品の合成原料または食品添加物
として有用なトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
を工業的に製造する方法、該方法に有用なＬ−プロリン
４位水酸化酵素遺伝子を含有し、かつ、プロリン合成系
の活性の強化された形質転換体に関する。
されているＮ−アセチルヒドロキシプロリン，カルバペ
ネム系抗生物質等の医薬品の合成原料または食品添加物
として有用なトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
を工業的に製造する方法、該方法に有用なＬ−プロリン
４位水酸化酵素遺伝子を含有し、かつ、プロリン合成系
の活性の強化された形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物を用いトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを製造する方法としては、 １）エッシェリヒア属に属する微生物を用い、４−ヒド
ロキシ−２−オキソグルタル酸からトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法（特開平３−２６
６９９５）、 ２）細菌やかび類を用い直接発酵生産する方法(Europea
n Patent ApplicationEP 0 547 898 A2 、特開平５−２
３６９８０、特開平６−２４５７８２) 、 ３）ストレプトミセス属に属する微生物を用い、Ｌ−プ
ロリンから製造する方法〔ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５４巻、
６６８４〜６６９０ページ（１９７９年）、バイオケミ
カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーション（Biochem. Biophys. Res.Comm. ）、１２０
巻，４５〜５１ページ（１９８４年）、テトラヘドロン
・レターズ（Tetrahedron Letters ），３４巻，７４８
９〜７４９２ページ( １９９３年) 、テトラヘドロン・
レターズ（Tetrahedron Letters ）、３５巻，４６４９
〜４６５２ページ（１９９４年）〕が知られている。
−Ｌ−プロリンを製造する方法としては、 １）エッシェリヒア属に属する微生物を用い、４−ヒド
ロキシ−２−オキソグルタル酸からトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法（特開平３−２６
６９９５）、 ２）細菌やかび類を用い直接発酵生産する方法(Europea
n Patent ApplicationEP 0 547 898 A2 、特開平５−２
３６９８０、特開平６−２４５７８２) 、 ３）ストレプトミセス属に属する微生物を用い、Ｌ−プ
ロリンから製造する方法〔ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、２５４巻、
６６８４〜６６９０ページ（１９７９年）、バイオケミ
カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーション（Biochem. Biophys. Res.Comm. ）、１２０
巻，４５〜５１ページ（１９８４年）、テトラヘドロン
・レターズ（Tetrahedron Letters ），３４巻，７４８
９〜７４９２ページ( １９９３年) 、テトラヘドロン・
レターズ（Tetrahedron Letters ）、３５巻，４６４９
〜４６５２ページ（１９９４年）〕が知られている。
【０００３】従来のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンの製造方法は、１）４−ヒドロキシ−２−オキソ
グルタル酸等のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンを製造するための基質が高価で入手困難である、２）
トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産性が低
い、３）トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製
造に関与する酵素の活性が極めて微弱である、等の理由
から、工業化は困難である。 トランス−４−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンの製造に関与する酵素については、Ｌ
−プロリン４位水酸化酵素をダクチロスポランジウム．
エスピー．ＲＨ１（Dactylosporangium sp．RH1 ）より
精製したとの報告（特開平７−３２２８８５）、および
前述のストレプトマイセス属に属する微生物より精製し
たとの報告［バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．）、３１３巻、１８５−１９１ページ、（１
９６６年）］がある。また、２−ケトグルタル酸および
２価鉄イオンの存在下において、遊離のＬ−プロリンを
トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させる
活性を有する、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素をコードす
る遺伝子を前述のダクチロスポランジウム．エスピー．
ＲＨ１（Dactylosporangium sp．RH1 ）よりクローニン
グし、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含むプラス
ミドｐＲＨ７１を取得し、さらにトリプトファンタンデ
ムプロモーター支配下でＬ−プロリン４位水酸化酵素遺
伝子を発現させるプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨを構築
し、大腸菌で活性を発現させたという報告（日本農芸化
学会１９９６年度大会、講演要旨集２５７ページ）があ
る。
ロリンの製造方法は、１）４−ヒドロキシ−２−オキソ
グルタル酸等のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンを製造するための基質が高価で入手困難である、２）
トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産性が低
い、３）トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製
造に関与する酵素の活性が極めて微弱である、等の理由
から、工業化は困難である。 トランス−４−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンの製造に関与する酵素については、Ｌ
−プロリン４位水酸化酵素をダクチロスポランジウム．
エスピー．ＲＨ１（Dactylosporangium sp．RH1 ）より
精製したとの報告（特開平７−３２２８８５）、および
前述のストレプトマイセス属に属する微生物より精製し
たとの報告［バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．）、３１３巻、１８５−１９１ページ、（１
９６６年）］がある。また、２−ケトグルタル酸および
２価鉄イオンの存在下において、遊離のＬ−プロリンを
トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させる
活性を有する、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素をコードす
る遺伝子を前述のダクチロスポランジウム．エスピー．
ＲＨ１（Dactylosporangium sp．RH1 ）よりクローニン
グし、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含むプラス
ミドｐＲＨ７１を取得し、さらにトリプトファンタンデ
ムプロモーター支配下でＬ−プロリン４位水酸化酵素遺
伝子を発現させるプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨを構築
し、大腸菌で活性を発現させたという報告（日本農芸化
学会１９９６年度大会、講演要旨集２５７ページ）があ
る。
【０００４】活性の高いＬ−プロリン４位水酸化酵素を
用い、工業的に有利にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを製造する方法が求められている。一方、プロ
リン生合成経路に関する酵素およびその遺伝子は大腸菌
などですでに明らかになっている［ジャーナル・オブ・
ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．）、１１８巻、２８７−２９３ページ
（１９８０年）、およびバイオキミカ・バイオフィジカ
・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ）、１０４巻、３９７〜４０４ページ（１９６５
年）］。また、プロリン生合成は例えば大腸菌などでは
生合成経路の第一酵素であるガンマ−グルタミル キナ
ーゼ（ＧＫ）が、生成物であるプロリンのフィードバッ
ク阻害を受けることにより調節されている事が知られて
いる［バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、１９２巻、４
６２〜４６７ページ（１９６９年）］。
用い、工業的に有利にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを製造する方法が求められている。一方、プロ
リン生合成経路に関する酵素およびその遺伝子は大腸菌
などですでに明らかになっている［ジャーナル・オブ・
ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．）、１１８巻、２８７−２９３ページ
（１９８０年）、およびバイオキミカ・バイオフィジカ
・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ）、１０４巻、３９７〜４０４ページ（１９６５
年）］。また、プロリン生合成は例えば大腸菌などでは
生合成経路の第一酵素であるガンマ−グルタミル キナ
ーゼ（ＧＫ）が、生成物であるプロリンのフィードバッ
ク阻害を受けることにより調節されている事が知られて
いる［バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、１９２巻、４
６２〜４６７ページ（１９６９年）］。
【０００５】更に、ＧＫをコードする遺伝子ｐｒｏＢに
変異を生じさせることにより、プロリンのフィードバッ
ク阻害を著しく減少させたＧＫを生成させ、プロリン高
生産株を造成できることが知られている［モレキュラー
・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．）、１８２巻、８２−８６ページ（１９８１
年）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．）、１５６巻、１２４９−１２６２ペ
ージ（１９８３年）、およびジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１６４巻、
１０８８−１０９３ページ（１９８５年）］。該ｐｒｏ
Ｂに変異を起こさせた遺伝子としてｐｒｏＢ７４が知ら
れており、ｐｒｏＢ７４の変異点はｐｒｏＢのコーディ
ングリージョンの５’末端から３１９番目のＧがＡに置
換することにより、ｐｒｏＢ蛋白のＮ末端から１０７番
目のアスパラギン酸がアスパラギンに変化していること
が知られている［ジーン（Ｇｅｎｅ）、６４巻、１９９
−２０５ページ（１９８８年）］。
変異を生じさせることにより、プロリンのフィードバッ
ク阻害を著しく減少させたＧＫを生成させ、プロリン高
生産株を造成できることが知られている［モレキュラー
・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．）、１８２巻、８２−８６ページ（１９８１
年）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．）、１５６巻、１２４９−１２６２ペ
ージ（１９８３年）、およびジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１６４巻、
１０８８−１０９３ページ（１９８５年）］。該ｐｒｏ
Ｂに変異を起こさせた遺伝子としてｐｒｏＢ７４が知ら
れており、ｐｒｏＢ７４の変異点はｐｒｏＢのコーディ
ングリージョンの５’末端から３１９番目のＧがＡに置
換することにより、ｐｒｏＢ蛋白のＮ末端から１０７番
目のアスパラギン酸がアスパラギンに変化していること
が知られている［ジーン（Ｇｅｎｅ）、６４巻、１９９
−２０５ページ（１９８８年）］。
【０００６】プロリン分解に関する酵素系、それをコー
ドする遺伝子、遺伝子系の制御についても、大腸菌、サ
ルモネラ菌などで研究が進んでおりよく知られている
［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．）、１４６巻、８９５−９０１ページ（１
９８１年）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー （Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１４８巻、２１
−４４ページ（１９８１年）］。
ドする遺伝子、遺伝子系の制御についても、大腸菌、サ
ルモネラ菌などで研究が進んでおりよく知られている
［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．）、１４６巻、８９５−９０１ページ（１
９８１年）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー （Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１４８巻、２１
−４４ページ（１９８１年）］。
【０００７】プロリンの生合成系の活性の強化された株
を用いたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製
造法は知られていない。
を用いたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製
造法は知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、Ｌ−
プロリン４位水酸化酵素を用いて、効率的にトランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法におい
て、より工業的に有利にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンを製造するために、Ｌ−プロリン４位水酸化
酵素遺伝子を含有し、これを高効率で発現させる組換え
体ＤＮＡを保持し、かつ、プロリン生合成系の活性の強
化された形質転換体を提供し、該形質転換体を用いてト
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に安価
に製造する方法を提供することにある。
プロリン４位水酸化酵素を用いて、効率的にトランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法におい
て、より工業的に有利にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンを製造するために、Ｌ−プロリン４位水酸化
酵素遺伝子を含有し、これを高効率で発現させる組換え
体ＤＮＡを保持し、かつ、プロリン生合成系の活性の強
化された形質転換体を提供し、該形質転換体を用いてト
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に安価
に製造する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、２−ケトグル
タル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離のＬ−プロリ
ンに作用して、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンを生成する、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性を有す
る蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクタ
ーに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有し、且
つ、Ｌ−プロリンの生合成系の活性の強化された形質転
換体、および該形質転換体を培養し、該培養物、菌体ま
たはそれらの処理物を酵素源として、２−ケトグルタル
酸および２価鉄イオンの存在下、水性媒体中で、Ｌ−プ
ロリンをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変
換させ、生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンを該水性媒体より採取することを特徴とするトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法に関する。
タル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離のＬ−プロリ
ンに作用して、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンを生成する、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性を有す
る蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクタ
ーに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有し、且
つ、Ｌ−プロリンの生合成系の活性の強化された形質転
換体、および該形質転換体を培養し、該培養物、菌体ま
たはそれらの処理物を酵素源として、２−ケトグルタル
酸および２価鉄イオンの存在下、水性媒体中で、Ｌ−プ
ロリンをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変
換させ、生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンを該水性媒体より採取することを特徴とするトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明にかかわるＬ−プロリン４位水酸化酵素は、２−
ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下において、
遊離のＬ−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリンを生成する酵素である。
本発明にかかわるＬ−プロリン４位水酸化酵素は、２−
ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下において、
遊離のＬ−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリンを生成する酵素である。
【００１１】本発明のＬ−プロリン４位水酸化酵素をコ
ードするＤＮＡを含むプラスミッドとしては、例えばｐ
ＲＨ７１があげられる。ｐＲＨ７１を含む大腸菌である
Escherichia coli SOLR/pRH71 は、平成７年３月２日付
けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県
つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）にＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５０２５として寄託されている。
ードするＤＮＡを含むプラスミッドとしては、例えばｐ
ＲＨ７１があげられる。ｐＲＨ７１を含む大腸菌である
Escherichia coli SOLR/pRH71 は、平成７年３月２日付
けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県
つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）にＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５０２５として寄託されている。
【００１２】Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を宿主
中で発現させるためには、まず、Ｌ−プロリン４位水酸
化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素類あるいは
ＤＮＡ分解酵素類で、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝
子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベク
ター中プロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡ
を挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿
主中に導入する。宿主としては、目的とする遺伝子を発
現できるものは全て用いることができる。例えば、エッ
シェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブ
レビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、
等に属する微生物菌株の他、酵母菌株や動物細胞宿主等
をあげることができる。
中で発現させるためには、まず、Ｌ−プロリン４位水酸
化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素類あるいは
ＤＮＡ分解酵素類で、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝
子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベク
ター中プロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡ
を挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿
主中に導入する。宿主としては、目的とする遺伝子を発
現できるものは全て用いることができる。例えば、エッ
シェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブ
レビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、
等に属する微生物菌株の他、酵母菌株や動物細胞宿主等
をあげることができる。
【００１３】発現ベクターとしては、上記宿主において
自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、Ｌ
−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を転写できる位置にプ
ロモーターを含有しているものが用いられる。大腸菌等
の微生物を宿主として用いる場合は、Ｌ−プロリン４位
水酸化酵素発現ベクターは微生物中で自立複製可能であ
ると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、Ｌ−
プロリン４位水酸化酵素遺伝子、転写終結配列、より構
成されていることが好ましい。プロモーターを制御する
遺伝子が含まれていてもよい。
自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、Ｌ
−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を転写できる位置にプ
ロモーターを含有しているものが用いられる。大腸菌等
の微生物を宿主として用いる場合は、Ｌ−プロリン４位
水酸化酵素発現ベクターは微生物中で自立複製可能であ
ると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、Ｌ−
プロリン４位水酸化酵素遺伝子、転写終結配列、より構
成されていることが好ましい。プロモーターを制御する
遺伝子が含まれていてもよい。
【００１４】発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒ
ｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリン
ガーマンハイム社より市販）、ｐＫＹＰ１０( 特開昭５
８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔アグリカルチャ
ラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agric. Biol. Ch
em.), ４８巻, ６６９〜６７５ページ（１９８４
年)〕、ｐＬＳＡ１〔アグリカルチャラル・バイオロジ
カル・ケミストリー(Agric.Biol. Chem.)，５３巻，２
７７ページ（１９８９年）〕、ｐＧＥＬ１〔プロシーデ
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス(Proc. Natl.Acad. Sci., USA) ，８２巻，４
３０６ページ( １９８５年）〕、pBluescript（STRATAG
ENE社）、ｐＴｒｓ３０〔エシェリヒア・コリ JM109/pT
rS30 （ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕および
ｐＴｒｓ３２〔エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32 （Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕等を例示すること
ができる。
ｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリン
ガーマンハイム社より市販）、ｐＫＹＰ１０( 特開昭５
８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔アグリカルチャ
ラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agric. Biol. Ch
em.), ４８巻, ６６９〜６７５ページ（１９８４
年)〕、ｐＬＳＡ１〔アグリカルチャラル・バイオロジ
カル・ケミストリー(Agric.Biol. Chem.)，５３巻，２
７７ページ（１９８９年）〕、ｐＧＥＬ１〔プロシーデ
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス(Proc. Natl.Acad. Sci., USA) ，８２巻，４
３０６ページ( １９８５年）〕、pBluescript（STRATAG
ENE社）、ｐＴｒｓ３０〔エシェリヒア・コリ JM109/pT
rS30 （ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕および
ｐＴｒｓ３２〔エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32 （Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕等を例示すること
ができる。
【００１５】プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中
で発現できるものであればいかなるものでもよい。例え
ば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐl
ac）、ＰL プロモーターＰR プロモーターなどの、大腸
菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることが
できる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐt
rpｘ２）、tacプロモーターのように人為的に設計改変
されたプロモーター等も用いることができる。
で発現できるものであればいかなるものでもよい。例え
ば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐl
ac）、ＰL プロモーターＰR プロモーターなどの、大腸
菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることが
できる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐt
rpｘ２）、tacプロモーターのように人為的に設計改変
されたプロモーター等も用いることができる。
【００１６】リボソーム結合配列としては、大腸菌等の
宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい
が、リボソーム結合配列と開始コドンとの間を適当な距
離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミッドを用
いることが好ましい。Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝
子はＬ−プロリン４位水酸化酵素をコードする遺伝子で
あればいずれも用いることができるが、該遺伝子のＤＮ
Ａ配列を宿主微生物での発現に最適なコドンとなるよう
に、塩基を置換して用いることにより高発現化が達成で
きる。大腸菌を宿主として、発現に最適なコドンとなる
ように塩基を置換したＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝
子の具体例として、配列番号１で示される塩基配列等を
あげることができる。
宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい
が、リボソーム結合配列と開始コドンとの間を適当な距
離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミッドを用
いることが好ましい。Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝
子はＬ−プロリン４位水酸化酵素をコードする遺伝子で
あればいずれも用いることができるが、該遺伝子のＤＮ
Ａ配列を宿主微生物での発現に最適なコドンとなるよう
に、塩基を置換して用いることにより高発現化が達成で
きる。大腸菌を宿主として、発現に最適なコドンとなる
ように塩基を置換したＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝
子の具体例として、配列番号１で示される塩基配列等を
あげることができる。
【００１７】本遺伝子の発現には転写終結配列は必ずし
も必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結
配列を配置することが望ましい。宿主としては、Escher
ichia coli XL1-Blue 、Escherichia coli XL2-Blue、
Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000 、 E
scherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Es
cherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Esch
erichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escher
ichia coli NY49、Bacillus subtilis 、Bacillus amyl
oliquefacines、Brevibacterium immariophilum ATCC14
068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Bre
vibacterium flavum ATCC14067 、Brevibacterium lact
ofermentum ATCC13869 、Corynebacterium glutamicum
ATCC13032、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13
870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354等をあ
げることができる。
も必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結
配列を配置することが望ましい。宿主としては、Escher
ichia coli XL1-Blue 、Escherichia coli XL2-Blue、
Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000 、 E
scherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Es
cherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Esch
erichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escher
ichia coli NY49、Bacillus subtilis 、Bacillus amyl
oliquefacines、Brevibacterium immariophilum ATCC14
068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Bre
vibacterium flavum ATCC14067 、Brevibacterium lact
ofermentum ATCC13869 、Corynebacterium glutamicum
ATCC13032、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13
870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354等をあ
げることができる。
【００１８】酵母菌株を宿主として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115
）、ＹＥｐ２４（ATCC37051 ）、ＹＣｐ５０（ATCC374
19 ）等を例示することができる。プロモーターとして
は、酵母菌株の宿主中で発現できるものであればいかな
るものでもよい。例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖
系の遺伝子のプロモーター、gal 1 プロモーター、gal
10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、
MFα1 プロモーター、CUP 1 プロモーター等のプロモー
ターをあげることができる。
現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115
）、ＹＥｐ２４（ATCC37051 ）、ＹＣｐ５０（ATCC374
19 ）等を例示することができる。プロモーターとして
は、酵母菌株の宿主中で発現できるものであればいかな
るものでもよい。例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖
系の遺伝子のプロモーター、gal 1 プロモーター、gal
10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、
MFα1 プロモーター、CUP 1 プロモーター等のプロモー
ターをあげることができる。
【００１９】宿主としては、Saccharomyces cerevisae
、Schizosaccharomyces pombe 、Kluyveromyces lacti
s、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius
等をあげることができる。 動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターと
して、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、
ｐｃＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）等を例示す
ることができる。プロモーターとしては、動物細胞の宿
主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、ヒトＣＭＶのIE(immediate early)遺伝子のプ
ロモーター等のプロモーターをあげることができる。ま
た、ヒトＣＭＶのIE遺伝子のエンハンサーをプロモータ
ーと共に用いてもよい。宿主としては、ナマルバ細胞、
ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ＣＯＳ細胞、
ＣＨＯ細胞等をあげることができる。
、Schizosaccharomyces pombe 、Kluyveromyces lacti
s、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius
等をあげることができる。 動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターと
して、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、
ｐｃＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）等を例示す
ることができる。プロモーターとしては、動物細胞の宿
主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、ヒトＣＭＶのIE(immediate early)遺伝子のプ
ロモーター等のプロモーターをあげることができる。ま
た、ヒトＣＭＶのIE遺伝子のエンハンサーをプロモータ
ーと共に用いてもよい。宿主としては、ナマルバ細胞、
ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ＣＯＳ細胞、
ＣＨＯ細胞等をあげることができる。
【００２０】動物細胞へのＤＮＡの導入法としては、動
物細胞にＤＮＡを導入することができればいかなる方法
も用いることができる。例えば、エレクトロポーレーシ
ョン法〔Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotechnolog
y), 3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-22
7075）、リポフェクション法〔フィリップ・エル・フェ
ルグナー（Philip L. Felgner)ら：プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
(Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 84, 7413(1987)〕等
を用いることができる。形質転換株の取得および培養
は、特開平2-227075あるいは特開平2-257891に記載され
ている方法に準じて行なうことができる。
物細胞にＤＮＡを導入することができればいかなる方法
も用いることができる。例えば、エレクトロポーレーシ
ョン法〔Miyajiら：サイトテクノロジー(Cytotechnolog
y), 3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-22
7075）、リポフェクション法〔フィリップ・エル・フェ
ルグナー（Philip L. Felgner)ら：プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
(Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 84, 7413(1987)〕等
を用いることができる。形質転換株の取得および培養
は、特開平2-227075あるいは特開平2-257891に記載され
ている方法に準じて行なうことができる。
【００２１】宿主をプロリン生合成系の活性の強化され
たものにするためには、１）宿主中のプロリン合成系遺
伝子のコピー数を増加させる、２）プロリンによってフ
ィードバック阻害を受けるプロリン合成系の酵素をコー
ドする遺伝子に変異を生ぜしめ、プロリンによるフィー
ドバック阻害が著しく減少した酵素をコードする遺伝子
を宿主に導入する、３）プロリンの分解活性を欠失させ
る、または４）これらを組み合わせることにより達成す
ることができる。
たものにするためには、１）宿主中のプロリン合成系遺
伝子のコピー数を増加させる、２）プロリンによってフ
ィードバック阻害を受けるプロリン合成系の酵素をコー
ドする遺伝子に変異を生ぜしめ、プロリンによるフィー
ドバック阻害が著しく減少した酵素をコードする遺伝子
を宿主に導入する、３）プロリンの分解活性を欠失させ
る、または４）これらを組み合わせることにより達成す
ることができる。
【００２２】プロリン合成系遺伝子またはプロリンによ
るフィードバック阻害が著しく減少したプロリン合成系
酵素をコードする遺伝子は宿主の染色体上に存在しても
良いし、またプラスミドなどの宿主中のベクター上に存
在してもよい。プロリンによるフィードバック阻害が著
しく減少したプロリン合成系酵素をコードする遺伝子と
しては、 ｐｒｏＢ７４遺伝子、ＤＨＰ rｐｒｏＢ遺伝
子［ジーン（ｇｅｎｅ）、３９巻、１０９−１１２ペー
ジ、（１９８４年）］等、プロリンによるフィードバッ
ク阻害が著しく減少したプロリン合成系酵素をコードす
る遺伝子をあげることができる。
るフィードバック阻害が著しく減少したプロリン合成系
酵素をコードする遺伝子は宿主の染色体上に存在しても
良いし、またプラスミドなどの宿主中のベクター上に存
在してもよい。プロリンによるフィードバック阻害が著
しく減少したプロリン合成系酵素をコードする遺伝子と
しては、 ｐｒｏＢ７４遺伝子、ＤＨＰ rｐｒｏＢ遺伝
子［ジーン（ｇｅｎｅ）、３９巻、１０９−１１２ペー
ジ、（１９８４年）］等、プロリンによるフィードバッ
ク阻害が著しく減少したプロリン合成系酵素をコードす
る遺伝子をあげることができる。
【００２３】また、プロリン合成系遺伝子またはプロリ
ンによるフィードバック阻害が著しく減少したプロリン
合成系酵素をコードする遺伝子をプロリン４位水酸化酵
素遺伝子と共にプラスミドなどの宿主中のベクター上に
存在させる場合は、両遺伝子が一つのプラスミド上に存
在していてもよいし、別の共存可能なプラスミド上に存
在していてもよい。
ンによるフィードバック阻害が著しく減少したプロリン
合成系酵素をコードする遺伝子をプロリン４位水酸化酵
素遺伝子と共にプラスミドなどの宿主中のベクター上に
存在させる場合は、両遺伝子が一つのプラスミド上に存
在していてもよいし、別の共存可能なプラスミド上に存
在していてもよい。
【００２４】共存可能なプラスミドとしては、例えば、
大腸菌においては、コリシンＥ１系のプラスミド（例、
ｐＢＲ３２２）とｐＡＣＹＣ系のプラスミド、コリシン
Ｅ１系のプラスミドとＦ因子系のプラスミド、コリシン
Ｅ１系のプラスミドとＲ因子系のプラスミド等をあげる
ことができる。プロリン生合成系遺伝子を宿主中で発現
させるためには、前述のＬ−プロリン４位水酸化酵素遺
伝子での発現と同様の方法を用いることができる。
大腸菌においては、コリシンＥ１系のプラスミド（例、
ｐＢＲ３２２）とｐＡＣＹＣ系のプラスミド、コリシン
Ｅ１系のプラスミドとＦ因子系のプラスミド、コリシン
Ｅ１系のプラスミドとＲ因子系のプラスミド等をあげる
ことができる。プロリン生合成系遺伝子を宿主中で発現
させるためには、前述のＬ−プロリン４位水酸化酵素遺
伝子での発現と同様の方法を用いることができる。
【００２５】宿主のプロリン分解活性を欠失させるに
は、変異剤で宿主を処理した後、例えば細菌などではＰ
ｒｏ−ＴＴＣプレート［アプライド・アンド・エンバイ
ロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ
ｉｒｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，）、３３巻、４３４−
４４４ページ、（１９７７年）］上で白色のコロニーを
形成するものを選択することで取得できる。
は、変異剤で宿主を処理した後、例えば細菌などではＰ
ｒｏ−ＴＴＣプレート［アプライド・アンド・エンバイ
ロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ
ｉｒｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，）、３３巻、４３４−
４４４ページ、（１９７７年）］上で白色のコロニーを
形成するものを選択することで取得できる。
【００２６】更に、大腸菌等ではｐｕｔ遺伝子の適当な
位置にトランスポゾンが挿入されることでプロリンの資
化性が失われることがわかっている［ジェネティクス
（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、９２巻、７４１−７４７ページ
（１９７９年）］ので、トランスポゾンを挿入した後、
薬剤耐性と前述したＰｒｏ−ＴＴＣプレートにより、プ
ロリン分解活性欠失株を取得することもできる。
位置にトランスポゾンが挿入されることでプロリンの資
化性が失われることがわかっている［ジェネティクス
（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、９２巻、７４１−７４７ページ
（１９７９年）］ので、トランスポゾンを挿入した後、
薬剤耐性と前述したＰｒｏ−ＴＴＣプレートにより、プ
ロリン分解活性欠失株を取得することもできる。
【００２７】また、トランスポゾンによりプロリン分解
活性が欠失した株より、Ｐ１トランスダクション［A Sh
ort Course In Bacterial Genetics, A Laboratory Man
ualand Handbook for Esherichia coli and Related Ba
cteria, J. H. Miller, Cold Spring Harbor Laborator
y Press, 1922, Laboratory Manual, pp.263 ］により
別の菌株にプロリン分解活性欠失という形質を移すこと
もできる。
活性が欠失した株より、Ｐ１トランスダクション［A Sh
ort Course In Bacterial Genetics, A Laboratory Man
ualand Handbook for Esherichia coli and Related Ba
cteria, J. H. Miller, Cold Spring Harbor Laborator
y Press, 1922, Laboratory Manual, pp.263 ］により
別の菌株にプロリン分解活性欠失という形質を移すこと
もできる。
【００２８】上記のようにしてプロリン生合成系の活性
の強化された宿主を用いて得られた形質転換体の培養
は、通常の培養方法に従って行うことができる。大腸菌
や酵母菌等の微生物を宿主として用いた形質転換体を培
養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無
機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える
培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
の強化された宿主を用いて得られた形質転換体の培養
は、通常の培養方法に従って行うことができる。大腸菌
や酵母菌等の微生物を宿主として用いた形質転換体を培
養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無
機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える
培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００２９】炭素源としては、それぞれの微生物が資化
し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、
スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいは
デンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸
等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコー
ル類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
りん酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモ
ニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン
加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵
菌体およびその消化物等が用いられる。
し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、
スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいは
デンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸
等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコー
ル類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
りん酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモ
ニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン
加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵
菌体およびその消化物等が用いられる。
【００３０】無機物としては、りん酸第一カリウム、り
ん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。培養は、振盪培
養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６
〜１００時間である。培養中ｐＨは、３. ０〜９. ０に
保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アル
カリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用
いて行う。
ん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。培養は、振盪培
養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６
〜１００時間である。培養中ｐＨは、３. ０〜９. ０に
保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アル
カリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用
いて行う。
【００３１】また培養中必要に応じて、アンピシリンや
テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで
形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、tr
pプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微
生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡ
Ａ）等を培地に添加してもよい。
テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで
形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、tr
pプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微
生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡ
Ａ）等を培地に添加してもよい。
【００３２】動物細胞を宿主として用いた形質転換体を
培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４
０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地またはこれら培地に牛
胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、５
％ＣＯ2 存在下等の条件下で行う。培養温度は３５〜３
７℃がよく、培養時間は、通常３〜７日間である。
培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４
０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地またはこれら培地に牛
胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、５
％ＣＯ2 存在下等の条件下で行う。培養温度は３５〜３
７℃がよく、培養時間は、通常３〜７日間である。
【００３３】また培養中必要に応じて、カナマイシン、
ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。この
ように培養して得た形質転換体中には、遺伝子源として
用いた微生物菌株、例えばダクチロスポランジウム・エ
スピーＲＨ１等およびｐＴｒ２−４ＯＨを保有する組換
え大腸菌と比較してＬ−プロリン４位水酸化酵素が著量
生成蓄積しており、プロリン生合成活性も強く、トラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン製造を、遺伝子源と
して用いた微生物菌株、例えばダクチロスポランジウム
・エスピーＲＨ１等およびｐＴｒ２−４ＯＨを保有する
組換え大腸菌を用いた場合と比較して、はるかに効率的
に行うことができる。
ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。この
ように培養して得た形質転換体中には、遺伝子源として
用いた微生物菌株、例えばダクチロスポランジウム・エ
スピーＲＨ１等およびｐＴｒ２−４ＯＨを保有する組換
え大腸菌と比較してＬ−プロリン４位水酸化酵素が著量
生成蓄積しており、プロリン生合成活性も強く、トラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン製造を、遺伝子源と
して用いた微生物菌株、例えばダクチロスポランジウム
・エスピーＲＨ１等およびｐＴｒ２−４ＯＨを保有する
組換え大腸菌を用いた場合と比較して、はるかに効率的
に行うことができる。
【００３４】該形質転換体中にＬ−プロリン４位水酸化
酵素が生成していることは、培養物、菌体またはそれら
の処理物を、酵素反応に適した水性媒体中に、Ｌ−プロ
リン、二価鉄イオン、２−ケトグルタル酸とともに加
え、また必要に応じて界面活性剤や有機溶剤を添加する
ことにより、生成するトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを検出することにより知ることができる。生成
されたＬ−プロリン４位水酸化酵素の活性は、下記測定
条件下、１分間に１nmolのトランス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンを生成する活性を１単位（Ｕ）として表示
する。なお、ここでは、微生物菌体に加え、動物細胞を
含めて菌体と呼ぶ。
酵素が生成していることは、培養物、菌体またはそれら
の処理物を、酵素反応に適した水性媒体中に、Ｌ−プロ
リン、二価鉄イオン、２−ケトグルタル酸とともに加
え、また必要に応じて界面活性剤や有機溶剤を添加する
ことにより、生成するトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを検出することにより知ることができる。生成
されたＬ−プロリン４位水酸化酵素の活性は、下記測定
条件下、１分間に１nmolのトランス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンを生成する活性を１単位（Ｕ）として表示
する。なお、ここでは、微生物菌体に加え、動物細胞を
含めて菌体と呼ぶ。
【００３５】Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性の測定：
１２ｍＭ Ｌ−プロリン、２４ｍＭ ２−ケトグルタル
酸、４ｍＭ 硫酸第一鉄および８ｍＭ Ｌ−アスコルビ
ン酸を含有する２４０ｍＭのＭＥＳ〔２−（Ｎ−モルホ
リノ）エタンスルホン酸〕緩衝液（ｐＨ６. ５）に菌
体、菌体処理物または酵素標品等を添加して合計２５０
μｌとし、３５℃、１０分間反応する。反応液を１００
℃、２分間加熱して反応を停止した後に、反応液中に生
成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを高速
液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）
を用いて定量する。
１２ｍＭ Ｌ−プロリン、２４ｍＭ ２−ケトグルタル
酸、４ｍＭ 硫酸第一鉄および８ｍＭ Ｌ−アスコルビ
ン酸を含有する２４０ｍＭのＭＥＳ〔２−（Ｎ−モルホ
リノ）エタンスルホン酸〕緩衝液（ｐＨ６. ５）に菌
体、菌体処理物または酵素標品等を添加して合計２５０
μｌとし、３５℃、１０分間反応する。反応液を１００
℃、２分間加熱して反応を停止した後に、反応液中に生
成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを高速
液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）
を用いて定量する。
【００３６】定量にはトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを定量できる方法であればどのような方法を用
いてもよいが、例えば、反応液中のトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを配位子交換クロマトグラフィー
カラム、例えば、株式会社住化分析センター製SUMICHIR
AL OA5000 等を用いてＨＰＬＣで分離溶出後、７−クロ
ロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−
ル（以下、ＮＢＤと略記する）によってポストカラム誘
導体化し検出する方法( ポストカラム誘導体化法) 、あ
るいは反応液中の目的化合物をあらかじめＮＢＤ誘導体
化しておき、これをＨＰＬＣを用いた逆相クロマトグラ
フィーにかけてＮＢＤ誘導体化物を分離後検出する方法
〔William J. Lindblad and Robert F. Diegelmann, ア
ナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Bioch
emistry ）、１３８巻、３９０〜３９５ページ、１９８
４年〕（プレカラム誘導体化法）等があげられる。ＮＢ
Ｄ誘導体化物の検出は、いずれもその蛍光( 励起波長５
０３ｎｍ、蛍光波長５４１ｎｍ) 測定によって行われ
る。
プロリンを定量できる方法であればどのような方法を用
いてもよいが、例えば、反応液中のトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを配位子交換クロマトグラフィー
カラム、例えば、株式会社住化分析センター製SUMICHIR
AL OA5000 等を用いてＨＰＬＣで分離溶出後、７−クロ
ロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−
ル（以下、ＮＢＤと略記する）によってポストカラム誘
導体化し検出する方法( ポストカラム誘導体化法) 、あ
るいは反応液中の目的化合物をあらかじめＮＢＤ誘導体
化しておき、これをＨＰＬＣを用いた逆相クロマトグラ
フィーにかけてＮＢＤ誘導体化物を分離後検出する方法
〔William J. Lindblad and Robert F. Diegelmann, ア
ナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Bioch
emistry ）、１３８巻、３９０〜３９５ページ、１９８
４年〕（プレカラム誘導体化法）等があげられる。ＮＢ
Ｄ誘導体化物の検出は、いずれもその蛍光( 励起波長５
０３ｎｍ、蛍光波長５４１ｎｍ) 測定によって行われ
る。
【００３７】上記のようにして培養菌体中にＬ−プロリ
ン４位水酸化酵素の生成が確認された形質転換体を、前
述の形質転換体の培養条件と同様の条件で培養し、トラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成蓄積させ、
該培養物よりトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
を採取することにより、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンを製造することができる。
ン４位水酸化酵素の生成が確認された形質転換体を、前
述の形質転換体の培養条件と同様の条件で培養し、トラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成蓄積させ、
該培養物よりトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
を採取することにより、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンを製造することができる。
【００３８】該培養において、必要に応じて２−ケトグ
ルタル酸および２価鉄イオンを培養液中に添加してもよ
い。本発明により製造されたトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンは、前述のポストカラム誘導体化法やプ
レカラム誘導体化法によって、定量分析することができ
る。
ルタル酸および２価鉄イオンを培養液中に添加してもよ
い。本発明により製造されたトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンは、前述のポストカラム誘導体化法やプ
レカラム誘導体化法によって、定量分析することができ
る。
【００３９】
実施例１ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素高発現プラスミ
ッドの構築 配列番号２記載のＤＮＡと配列番号３記載のＤＮＡをア
プライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社
製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。該合成Ｄ
ＮＡの３’末端２５ｂｐは互いに相補的な配列となるよ
うに設計されている。さらに、該合成ＤＮＡには、Dact
ylosporangium sp. RH1 由来のＬ−プロリン４位水酸化
酵素蛋白のＮ末端部分をコードする塩基配列が含有され
ているが、該塩基配列には、Dactylosporangium sp. RH
1 由来の塩基配列を、大腸菌での発現に最適なコドンと
なるように部位特異的な塩基置換がほどこされている。
ッドの構築 配列番号２記載のＤＮＡと配列番号３記載のＤＮＡをア
プライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社
製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。該合成Ｄ
ＮＡの３’末端２５ｂｐは互いに相補的な配列となるよ
うに設計されている。さらに、該合成ＤＮＡには、Dact
ylosporangium sp. RH1 由来のＬ−プロリン４位水酸化
酵素蛋白のＮ末端部分をコードする塩基配列が含有され
ているが、該塩基配列には、Dactylosporangium sp. RH
1 由来の塩基配列を、大腸菌での発現に最適なコドンと
なるように部位特異的な塩基置換がほどこされている。
【００４０】該合成ＤＮＡをプライマーかつ鋳型として
ＰＣＲを行った。ＰＣＲはPfu ＤＮＡポリメラーゼ（ST
RATAGENE社製）０．５Ｕ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ用×
１０緩衝液（STRATAGENE社製）２μｌ、ＤＭＳＯ ２μ
ｌ、各２．５ｍＭｄＮＴＰ液１μｌ、配列番号２記載の
合成ＤＮＡと配列番号３記載の合成ＤＮＡ各２μＭを含
む反応液２０μｌを用い、９６℃、５分間のインキュベ
ーションの後、９６℃−２分間、５０℃−１分間、７５
℃−１分間のインキュベーション工程を３５回繰り返す
条件で行った。
ＰＣＲを行った。ＰＣＲはPfu ＤＮＡポリメラーゼ（ST
RATAGENE社製）０．５Ｕ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ用×
１０緩衝液（STRATAGENE社製）２μｌ、ＤＭＳＯ ２μ
ｌ、各２．５ｍＭｄＮＴＰ液１μｌ、配列番号２記載の
合成ＤＮＡと配列番号３記載の合成ＤＮＡ各２μＭを含
む反応液２０μｌを用い、９６℃、５分間のインキュベ
ーションの後、９６℃−２分間、５０℃−１分間、７５
℃−１分間のインキュベーション工程を３５回繰り返す
条件で行った。
【００４１】反応終了後、該反応液を、１５％ポリアク
リルアミドゲル（アトー株式会社製、パジェルNPU-15L
）電気泳動にかけ、１０７ｂｐの増幅断片の生成を確
認した。該１０７ｂｐの増幅断片を日本エイドー株式会
社製のダヴィンチくん（ペンタッチリカバリーＮＢ−７
０００型）を用いて回収後、該１０７ｂｐのＤＮＡ断片
の両末端をHind IIIおよびSal I で切断した。
リルアミドゲル（アトー株式会社製、パジェルNPU-15L
）電気泳動にかけ、１０７ｂｐの増幅断片の生成を確
認した。該１０７ｂｐの増幅断片を日本エイドー株式会
社製のダヴィンチくん（ペンタッチリカバリーＮＢ−７
０００型）を用いて回収後、該１０７ｂｐのＤＮＡ断片
の両末端をHind IIIおよびSal I で切断した。
【００４２】該Hind III−Sal I 切断断片をBio, Inc.
製 MERmaid Kitを用いて回収した。回収液量は１６μｌ
となった。参考例１に記載の方法に従って作成したプラ
スミドｐＴｒ２−４ＯＨＤＮＡをBam HIおよびPvu IIで
切断後、反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、２つ
の断片が生成していることを確認した。該断片の内、Ｌ
−プロリン水酸化酵素の構造遺伝子を含む長い断片をバ
イオラッド社製のPrep-A-gene を用いて回収し、宝酒造
社製のブランティングキットを用いて末端を平滑化した
後、宝酒造社製のライゲーションキットを用いて連結環
状化した。
製 MERmaid Kitを用いて回収した。回収液量は１６μｌ
となった。参考例１に記載の方法に従って作成したプラ
スミドｐＴｒ２−４ＯＨＤＮＡをBam HIおよびPvu IIで
切断後、反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、２つ
の断片が生成していることを確認した。該断片の内、Ｌ
−プロリン水酸化酵素の構造遺伝子を含む長い断片をバ
イオラッド社製のPrep-A-gene を用いて回収し、宝酒造
社製のブランティングキットを用いて末端を平滑化した
後、宝酒造社製のライゲーションキットを用いて連結環
状化した。
【００４３】該連結環状化したプラスミドを用い、E. c
oli JM109 株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に
塗布後、３７℃で１晩培養した。生育してきた形質転換
体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、そ
の構造を制限酵素消化により確認した。
oli JM109 株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に
塗布後、３７℃で１晩培養した。生育してきた形質転換
体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、そ
の構造を制限酵素消化により確認した。
【００４４】以上の結果、ｐＴｒ２−４ＯＨの一部の配
列を削除したプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨΔ（図１）を
得た。取得したプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨΔＤＮＡを
Hind IIIおよびSal I で切断後、該切断部位に、Hind I
IIおよびSal I 処理した上記ＰＣＲ増幅断片を、宝酒造
社製のライゲーションキットを用いて、挿入した。
列を削除したプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨΔ（図１）を
得た。取得したプラスミドｐＴｒ２−４ＯＨΔＤＮＡを
Hind IIIおよびSal I で切断後、該切断部位に、Hind I
IIおよびSal I 処理した上記ＰＣＲ増幅断片を、宝酒造
社製のライゲーションキットを用いて、挿入した。
【００４５】得られたプラスミドを用い、E. coli XL1-
Blue MRF' 株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に
塗布後、３７℃で１晩培養した。生育してきた形質転換
体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、プ
ラスミドｐＷＦＨ１（図２）を取得した。
Blue MRF' 株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に
塗布後、３７℃で１晩培養した。生育してきた形質転換
体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、プ
ラスミドｐＷＦＨ１（図２）を取得した。
【００４６】該プラスミドの構造を制限酵素消化により
確認した。ＰＣＲ増幅断片挿入部分についてはアプライ
ドバイオシステムズ社製の塩基配列決定キット（Taq Dy
eDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit）を用い
て、塩基配列を決定した。該塩基配列を配列番号１に示
す。該プラスミドは、構造遺伝子の５’末端からSal I
部位においてDactylosporangium sp. RH1 由来の塩基配
列と一部異なる以外は、Dactylosporangium sp. RH1 由
来のＬ−プロリン４位水酸化酵素とまったく同じアミノ
酸配列をコードする構造遺伝子ＤＮＡ断片が、Ｐtrp×
２の転写方向と同方向に挿入された構造を有していた
（図２）。
確認した。ＰＣＲ増幅断片挿入部分についてはアプライ
ドバイオシステムズ社製の塩基配列決定キット（Taq Dy
eDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit）を用い
て、塩基配列を決定した。該塩基配列を配列番号１に示
す。該プラスミドは、構造遺伝子の５’末端からSal I
部位においてDactylosporangium sp. RH1 由来の塩基配
列と一部異なる以外は、Dactylosporangium sp. RH1 由
来のＬ−プロリン４位水酸化酵素とまったく同じアミノ
酸配列をコードする構造遺伝子ＤＮＡ断片が、Ｐtrp×
２の転写方向と同方向に挿入された構造を有していた
（図２）。
【００４７】第１表に示したように、ｐＷＦＨ１を保有
する形質転換体は、遺伝子源として用いたダクチロスポ
ランジウムエスピーＲＨ１株と比較して１４００倍、ｐ
Ｔｒ２−４ＯＨを保有する形質転換体と比較して約５．
４倍のＬ−プロリン水酸化酵素を生産していた。
する形質転換体は、遺伝子源として用いたダクチロスポ
ランジウムエスピーＲＨ１株と比較して１４００倍、ｐ
Ｔｒ２−４ＯＨを保有する形質転換体と比較して約５．
４倍のＬ−プロリン水酸化酵素を生産していた。
【００４８】
【表１】
【００４９】実施例２ プロリン分解系欠損株の造成E . coli ATCC12435 のプロリン分解に関与する遺伝子pu
tAを以下の方法で破壊し、プロリン分解系欠損株を造成
した。国立遺伝学研究所保存菌株であるE. coli ME8395
株［Ｆ- ：pyrD34 trp-45 his-68 thyA25 thi deoR33
galK35 xyl-7 mtl-2 malA1 rpsL118 λR ( λ) - appA1
putA::Tn5 (Mu+) ］を３５μg/ｍｌのカナマイシンを
含有するＬＢ培地に植菌し、終夜培養した。
tAを以下の方法で破壊し、プロリン分解系欠損株を造成
した。国立遺伝学研究所保存菌株であるE. coli ME8395
株［Ｆ- ：pyrD34 trp-45 his-68 thyA25 thi deoR33
galK35 xyl-7 mtl-2 malA1 rpsL118 λR ( λ) - appA1
putA::Tn5 (Mu+) ］を３５μg/ｍｌのカナマイシンを
含有するＬＢ培地に植菌し、終夜培養した。
【００５０】該培養液１００μｌにＰ１ファージ液１０
０μｌを添加・混合し、５分間放置した。
０μｌを添加・混合し、５分間放置した。
【００５１】該放置液を１０ｍＭ ＣａＣｌ2 を含む３
ｍｌのＬＢ軟寒天培地と混合し、１０ｍＭＣａＣｌ2 を
含むＬＢ寒天培地上に重層後、３７℃で７時間培養し
た。培養後、得られた寒天培地表面のライゼートを１０
ｍＭＣａＣｌ2 を含む２ｍｌのＬＢ培地中に回収した。
該回収液に０．５ｍｌのクロロホルムを添加し、ボルテ
ックスミキサーを用いて混合後、３０００ｒｐｍで１５
分間遠心し、得られた上清をＰ１ファージライゼートと
して用いた。
ｍｌのＬＢ軟寒天培地と混合し、１０ｍＭＣａＣｌ2 を
含むＬＢ寒天培地上に重層後、３７℃で７時間培養し
た。培養後、得られた寒天培地表面のライゼートを１０
ｍＭＣａＣｌ2 を含む２ｍｌのＬＢ培地中に回収した。
該回収液に０．５ｍｌのクロロホルムを添加し、ボルテ
ックスミキサーを用いて混合後、３０００ｒｐｍで１５
分間遠心し、得られた上清をＰ１ファージライゼートと
して用いた。
【００５２】該Ｐ１ファージライゼート液５０μｌと１
０ｍＭ ＣａＣｌ2 を含むＬＢ培地で培養したE. coli
ATCC12435 培養液１００μｌとを混合し、３７℃で２０
分間静置した。該静置液をエフ・トップ・サイトレイト
（F-top-citrate ：ＮａＣｌ ８. ５ｇ/ ｌ、クエン酸
２ナトリウム１００ｍＭ、寒天０. ７％）３ｍｌと混合
し、３５μg/ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培
地上に塗布後、３７℃で１日培養した。
０ｍＭ ＣａＣｌ2 を含むＬＢ培地で培養したE. coli
ATCC12435 培養液１００μｌとを混合し、３７℃で２０
分間静置した。該静置液をエフ・トップ・サイトレイト
（F-top-citrate ：ＮａＣｌ ８. ５ｇ/ ｌ、クエン酸
２ナトリウム１００ｍＭ、寒天０. ７％）３ｍｌと混合
し、３５μg/ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培
地上に塗布後、３７℃で１日培養した。
【００５３】該培養により生育してきたカナマイシン耐
性株を０．８５％のＮａＣｌに懸濁した後、Ｐｒｏ−Ｔ
ＴＣプレート（Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ/ ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ３
ｇ/ｌ、ＭｇＳＯ4 ０. １ｇ/ ｌ、プロテオースペプト
ン２ｇ/ ｌ、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロラ
イド０. ０２５ｇ/ ｌ、Ｌ- Ｐｒｏ ２ｇ/ ｌ、寒天１
５ｇ/ ｌ、ｐＨ７. ２) に塗布し、３７℃で１〜２日間
培養した。
性株を０．８５％のＮａＣｌに懸濁した後、Ｐｒｏ−Ｔ
ＴＣプレート（Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ/ ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ３
ｇ/ｌ、ＭｇＳＯ4 ０. １ｇ/ ｌ、プロテオースペプト
ン２ｇ/ ｌ、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロラ
イド０. ０２５ｇ/ ｌ、Ｌ- Ｐｒｏ ２ｇ/ ｌ、寒天１
５ｇ/ ｌ、ｐＨ７. ２) に塗布し、３７℃で１〜２日間
培養した。
【００５４】該培養によりＰｒｏ−ＴＴＣプレート上に
白色のコロニーを形成した株を、プロリンを分解資化す
る能力の失われた株として選択し、プロリン分解活性欠
損株E. coliＷＴ１株を取得した。該菌株は平成８年８
月７日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本
国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）
にＦＥＲＭ ＢＰ−５６１８として寄託されている。
白色のコロニーを形成した株を、プロリンを分解資化す
る能力の失われた株として選択し、プロリン分解活性欠
損株E. coliＷＴ１株を取得した。該菌株は平成８年８
月７日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本
国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）
にＦＥＲＭ ＢＰ−５６１８として寄託されている。
【００５５】実施例３ プロリン生合成系遺伝子proB74
およびproA発現プラスミドの構築 大腸菌由来のγ-glutamyl kinaseをコードするproB遺伝
子をプロリンによるフィードバック阻害に対して脱感作
された変異型遺伝子に変換したproB74遺伝子および大腸
菌由来のγ-glutamyl phosphate reductase をコードす
るproA遺伝子の発現プラスミドｐＰＦ１を以下の方法に
より構築した。
およびproA発現プラスミドの構築 大腸菌由来のγ-glutamyl kinaseをコードするproB遺伝
子をプロリンによるフィードバック阻害に対して脱感作
された変異型遺伝子に変換したproB74遺伝子および大腸
菌由来のγ-glutamyl phosphate reductase をコードす
るproA遺伝子の発現プラスミドｐＰＦ１を以下の方法に
より構築した。
【００５６】大腸菌由来のproBおよびproA遺伝子を含む
プラスミドｐＰＲＯ−１［大腸菌Ｋ８３株（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−２８０７）より取得］をEco RVで消化し、アガロー
スゲル電気泳動後、Prep-A-gene DNA Purification Sys
tem (BIO-RAD社製）でproB遺伝子の一部を含む約１ｋｂ
のＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をｐＵＣ１９
（宝酒造社製）のSma I 消化物と連結し、プラスミドｐ
ＢＡＢ５１を得た（図３）該プラスミド中のproB遺伝子
を、以下の方法により、公知[A. M. Dandekar and S.
L. Uratsu, J. Bacteriol. 170, 5943 (1988)] のプロ
リンによるフィードバック阻害に対して脱感作された変
異型遺伝子proB74に変換した。
プラスミドｐＰＲＯ−１［大腸菌Ｋ８３株（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−２８０７）より取得］をEco RVで消化し、アガロー
スゲル電気泳動後、Prep-A-gene DNA Purification Sys
tem (BIO-RAD社製）でproB遺伝子の一部を含む約１ｋｂ
のＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をｐＵＣ１９
（宝酒造社製）のSma I 消化物と連結し、プラスミドｐ
ＢＡＢ５１を得た（図３）該プラスミド中のproB遺伝子
を、以下の方法により、公知[A. M. Dandekar and S.
L. Uratsu, J. Bacteriol. 170, 5943 (1988)] のプロ
リンによるフィードバック阻害に対して脱感作された変
異型遺伝子proB74に変換した。
【００５７】配列番号４に示したオリゴヌクレオチドＡ
１および配列番号５に示したオリゴヌクレオチドＡ２を
アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社
製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。オリゴヌ
クレオチドＡ１とＭ１３プライマーＭ３（宝酒造社製、
カタログＮｏ．３８３１）を一組のプライマーとして、
ｐＢＡＢ５１を鋳型として用い、ＰＣＲ法により変異型
proB遺伝子であるproB74遺伝子の部分配列を増幅した。
１および配列番号５に示したオリゴヌクレオチドＡ２を
アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社
製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。オリゴヌ
クレオチドＡ１とＭ１３プライマーＭ３（宝酒造社製、
カタログＮｏ．３８３１）を一組のプライマーとして、
ｐＢＡＢ５１を鋳型として用い、ＰＣＲ法により変異型
proB遺伝子であるproB74遺伝子の部分配列を増幅した。
【００５８】ＰＣＲは、ｐＢＡＢ５１を０．１μｇ、オ
リゴヌクレオチドＡ１とＭ１３プライマーＭ３を各２μ
Ｍ、Taq DNA ポリメラーゼ（宝酒造社製）を１Ｕ、ｄＮ
ＴＰミクスチャー（宝酒造社製、カタログＮｏ．４０３
０）を１．６μｌ、添付バッファー２μｌを含む反応液
２０μｌを用い、９４℃−３０秒間、５２℃−３０秒
間、７２℃−１分間のインキュベーション工程を３０回
繰り返し、最後に７２℃−５分間インキュベーションす
ることにより行った。
リゴヌクレオチドＡ１とＭ１３プライマーＭ３を各２μ
Ｍ、Taq DNA ポリメラーゼ（宝酒造社製）を１Ｕ、ｄＮ
ＴＰミクスチャー（宝酒造社製、カタログＮｏ．４０３
０）を１．６μｌ、添付バッファー２μｌを含む反応液
２０μｌを用い、９４℃−３０秒間、５２℃−３０秒
間、７２℃−１分間のインキュベーション工程を３０回
繰り返し、最後に７２℃−５分間インキュベーションす
ることにより行った。
【００５９】同様の方法で、オリゴヌクレオチドＡ２と
Ｍ１３プライマーＲＶ（宝酒造社製、カタログＮｏ．３
８３０Ａ）を一組のプライマーとして、ｐＢＡＢ５１を
鋳型として用い、ＰＣＲ法により変異型proB遺伝子の部
分配列を増幅した。ＰＣＲ法により増幅された該２種類
のＤＮＡをそれぞれアガロースゲル電気泳動にかけた
後、Prep-A-gene DNA Purification System (BIO-RAD社
製）を用いて精製した。
Ｍ１３プライマーＲＶ（宝酒造社製、カタログＮｏ．３
８３０Ａ）を一組のプライマーとして、ｐＢＡＢ５１を
鋳型として用い、ＰＣＲ法により変異型proB遺伝子の部
分配列を増幅した。ＰＣＲ法により増幅された該２種類
のＤＮＡをそれぞれアガロースゲル電気泳動にかけた
後、Prep-A-gene DNA Purification System (BIO-RAD社
製）を用いて精製した。
【００６０】該２種の精製ＤＮＡ断片を混合したものを
鋳型とし、Ｍ１３プライマーＭ３およびＭ１３プライマ
ーＲＶをプライマーとして用い、上記と同様の方法によ
り、ＰＣＲおよび精製を行い、proB74遺伝子の塩基配列
を含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片
をEco O65IおよびSac IIで消化し、Eco O65I−Sac II消
化断片を取得した。
鋳型とし、Ｍ１３プライマーＭ３およびＭ１３プライマ
ーＲＶをプライマーとして用い、上記と同様の方法によ
り、ＰＣＲおよび精製を行い、proB74遺伝子の塩基配列
を含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片
をEco O65IおよびSac IIで消化し、Eco O65I−Sac II消
化断片を取得した。
【００６１】該消化断片と、ｐＰＲＯ−１のEco O65I−
Sac II消化ＤＮＡ断片（約６．８ｋｂｐ）とを連結し、
ｐＰＲＯ−１のproB遺伝子を脱感作型proB74遺伝子に変
換したプラスミドｐＰＲＯ７４を作製した（図４）。配
列番号６に示したオリゴヌクレオチドｐ１および配列番
号７に示したオリゴヌクレオチドｐ２をアプライド・バ
イオシステムズ(Applied Biosystems)社製３８０Ａ・Ｄ
ＮＡ合成機を用いて合成した。
Sac II消化ＤＮＡ断片（約６．８ｋｂｐ）とを連結し、
ｐＰＲＯ−１のproB遺伝子を脱感作型proB74遺伝子に変
換したプラスミドｐＰＲＯ７４を作製した（図４）。配
列番号６に示したオリゴヌクレオチドｐ１および配列番
号７に示したオリゴヌクレオチドｐ２をアプライド・バ
イオシステムズ(Applied Biosystems)社製３８０Ａ・Ｄ
ＮＡ合成機を用いて合成した。
【００６２】該ｐ１、ｐ２をプライマーとして、プラス
ミドｐＰＲＯ７４を鋳型として用い、ＰＣＲ法によりpr
oB74およびproA遺伝子を増幅した。ＰＣＲは、ｐＰＲＯ
７４を０．１μｇ、ｐ１、ｐ２を各２μＭ、タカラ・イ
ーエックス・タック（TaKaRa Ex Taq ：宝酒造社製、コ
ードRR001Q）１Ｕ、ｄＮＴＰミクスチャー（宝酒造社
製、カタログＮｏ．4030）を１．６μｌ含む反応液２０
μｌを用い、９４℃−１分間、４２℃−２分間、７２℃
−３分間のインキュベーション工程を３０回繰り返すこ
とにより行った。
ミドｐＰＲＯ７４を鋳型として用い、ＰＣＲ法によりpr
oB74およびproA遺伝子を増幅した。ＰＣＲは、ｐＰＲＯ
７４を０．１μｇ、ｐ１、ｐ２を各２μＭ、タカラ・イ
ーエックス・タック（TaKaRa Ex Taq ：宝酒造社製、コ
ードRR001Q）１Ｕ、ｄＮＴＰミクスチャー（宝酒造社
製、カタログＮｏ．4030）を１．６μｌ含む反応液２０
μｌを用い、９４℃−１分間、４２℃−２分間、７２℃
−３分間のインキュベーション工程を３０回繰り返すこ
とにより行った。
【００６３】該反応液をアガロースゲル電気泳動にか
け、proB74およびproAを含む２３７０ｂｐの増幅断片を
常法により抽出し、GENECLEAN II KIT（BIO 101, INC.
製）を用いて該ＤＮＡ断片を回収した。回収した２３７
０ｂｐのＤＮＡ断片をHind IIIおよびBam HIで切断後、
エタノール沈殿法によりエタノール沈殿を得た。該エタ
ノール沈殿を５μｌのＴＥに溶解し、proB74およびproA
断片として用いた。
け、proB74およびproAを含む２３７０ｂｐの増幅断片を
常法により抽出し、GENECLEAN II KIT（BIO 101, INC.
製）を用いて該ＤＮＡ断片を回収した。回収した２３７
０ｂｐのＤＮＡ断片をHind IIIおよびBam HIで切断後、
エタノール沈殿法によりエタノール沈殿を得た。該エタ
ノール沈殿を５μｌのＴＥに溶解し、proB74およびproA
断片として用いた。
【００６４】該proB74およびproA断片と、プラスミドｐ
ＳＴＶ２９（宝酒造社製）のHind III−Bam HI消化ＤＮ
Ａ断片とを宝酒造社製のＤＮＡライゲーションキットを
用いて連結し、proB74およびproA断片の挿入されたプラ
スミドを構築した。該プラスミドをE. coli JM109 株に
常法に従って形質転換後、３０μｇ／ｍｌのクロラムフ
ェニコール、０．１ｍＭＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍｌのＸ
−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培
養した。
ＳＴＶ２９（宝酒造社製）のHind III−Bam HI消化ＤＮ
Ａ断片とを宝酒造社製のＤＮＡライゲーションキットを
用いて連結し、proB74およびproA断片の挿入されたプラ
スミドを構築した。該プラスミドをE. coli JM109 株に
常法に従って形質転換後、３０μｇ／ｍｌのクロラムフ
ェニコール、０．１ｍＭＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍｌのＸ
−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培
養した。
【００６５】該培養により白色コロニーを形成した株よ
り常法に従ってプラスミドを抽出し、該プラスミドの構
造を制限酵素消化により確認した。上記の方法により、
脱感作型γ-glutamyl kinaseのＮ末端にβ−ガラクトシ
ダーゼのαフラグメントのＮ末端８アミノ酸残基（lac
Z.Nterm）が結合した融合蛋白をコードする遺伝子およ
びproA遺伝子がＰlac支配下に存在するプラスミドｐＰ
Ｆ１を取得した（図５）。
り常法に従ってプラスミドを抽出し、該プラスミドの構
造を制限酵素消化により確認した。上記の方法により、
脱感作型γ-glutamyl kinaseのＮ末端にβ−ガラクトシ
ダーゼのαフラグメントのＮ末端８アミノ酸残基（lac
Z.Nterm）が結合した融合蛋白をコードする遺伝子およ
びproA遺伝子がＰlac支配下に存在するプラスミドｐＰ
Ｆ１を取得した（図５）。
【００６６】該融合蛋白の構造遺伝子（lacZ.Nterm-pro
B74 ）の塩基配列とアミノ酸配列を配列番号８に示す。 実施例４ プロリン生合成系遺伝子発現プラスミドを含
む形質転換体によるトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンの生産 実施例３で構築したプラスミドｐＰＦ１を用いて、実施
例２で取得したE. coli WT1 株を形質転換し、形質転換
株E. coli WT1/pPF1を取得した。
B74 ）の塩基配列とアミノ酸配列を配列番号８に示す。 実施例４ プロリン生合成系遺伝子発現プラスミドを含
む形質転換体によるトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンの生産 実施例３で構築したプラスミドｐＰＦ１を用いて、実施
例２で取得したE. coli WT1 株を形質転換し、形質転換
株E. coli WT1/pPF1を取得した。
【００６７】実施例１で構築したプロリン４位水酸化酵
素発現プラスミドｐＷＦＨ１で、実施例２で取得したＷ
Ｔ１株を形質転換しE. coli WT1/pWFH1 を取得した。該
形質転換株E. coli WT1/pWFH1 より塩化カルシウム法に
てコンピテントセルを作製し、実施例３で作製したプラ
スミドｐＰＦ１を導入し、両プラスミドを保有する形質
転換株E. coli WT1/pWFH1/pPF1を３０μｇ/ ｍｌのクロ
ラムフェニコールと５０μｇ/ ｍｌのアンピシリンを含
むＬＢ培地に生育してくるコロニーを選択することによ
り取得した。
素発現プラスミドｐＷＦＨ１で、実施例２で取得したＷ
Ｔ１株を形質転換しE. coli WT1/pWFH1 を取得した。該
形質転換株E. coli WT1/pWFH1 より塩化カルシウム法に
てコンピテントセルを作製し、実施例３で作製したプラ
スミドｐＰＦ１を導入し、両プラスミドを保有する形質
転換株E. coli WT1/pWFH1/pPF1を３０μｇ/ ｍｌのクロ
ラムフェニコールと５０μｇ/ ｍｌのアンピシリンを含
むＬＢ培地に生育してくるコロニーを選択することによ
り取得した。
【００６８】WT1 、WT1/pPF1、WT1/pWFH1 およびWT1/pW
FH1/pPF1をそれぞれカナマイシン３７．５μｇ/ ｍｌ、
アンピシリン１００μｇ/ ｍｌ、クロラムフェニコール
３０μｇ/ ｍｌ、そしてアンピシリン１００μｇ/ ｍｌ
およびクロラムフェニコール３０μｇ/ ｍｌを含むＬＢ
培地で３７℃で１６時間培養した。該培養液それぞれ１
００μｌを、２％（Ｗ/ Ｖ）の炭酸カルシウムを含む１
０ｍｌのＭｅｄ７培地（グルコース２％、硫酸アンモニ
ウム１％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％、ＮａＣｌ ０. ２
％、ＭｇＳＯ4 ０. ０５％、ＦｅＳＯ4 ０. ０２７８
％、ＣａＣｌ2 ０. ００１５％、ペプトン０. ８％）を
いれた太型試験管（φ２０×２００ｍｍ）に植菌し、３
０℃で２４時間培養した。
FH1/pPF1をそれぞれカナマイシン３７．５μｇ/ ｍｌ、
アンピシリン１００μｇ/ ｍｌ、クロラムフェニコール
３０μｇ/ ｍｌ、そしてアンピシリン１００μｇ/ ｍｌ
およびクロラムフェニコール３０μｇ/ ｍｌを含むＬＢ
培地で３７℃で１６時間培養した。該培養液それぞれ１
００μｌを、２％（Ｗ/ Ｖ）の炭酸カルシウムを含む１
０ｍｌのＭｅｄ７培地（グルコース２％、硫酸アンモニ
ウム１％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％、ＮａＣｌ ０. ２
％、ＭｇＳＯ4 ０. ０５％、ＦｅＳＯ4 ０. ０２７８
％、ＣａＣｌ2 ０. ００１５％、ペプトン０. ８％）を
いれた太型試験管（φ２０×２００ｍｍ）に植菌し、３
０℃で２４時間培養した。
【００６９】該培養上清中のＬ−プロリンおよびトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン含量を第２表に示し
た。
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン含量を第２表に示し
た。
【００７０】
【表２】
【００７１】プロリン生合成系遺伝子発現プラスミドｐ
ＰＦ１保有菌株においてはＬ−プロリンの生成が著しく
増加し、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素発現プラスミドｐ
ＷＦＨ１およびプロリン生合成系遺伝子発現プラスミド
ｐＰＦ１の共存する形質転換体においてはＬ−プロリン
４位水酸化酵素発現プラスミドを単独で保持する形質転
換体に比べてトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
の生成量が顕著に増加することが確認できた。
ＰＦ１保有菌株においてはＬ−プロリンの生成が著しく
増加し、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素発現プラスミドｐ
ＷＦＨ１およびプロリン生合成系遺伝子発現プラスミド
ｐＰＦ１の共存する形質転換体においてはＬ−プロリン
４位水酸化酵素発現プラスミドを単独で保持する形質転
換体に比べてトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
の生成量が顕著に増加することが確認できた。
【００７２】実施例５ L ―プロリン４位水酸化酵素と
プロリン生合成系遺伝子proB74およびproA発現プラスミ
ドの構築Dactylosporangium sp. RH1 由来のＬ−プロリン4 位水
酸化酵素遺伝子、プロリン生合成系遺伝子proB74および
proAの全ての遺伝子を単一のプラスミド上に保持し、こ
れを発現させるような発現プラスミドｐＷＦＰ１を以下
の方法により構築した。
プロリン生合成系遺伝子proB74およびproA発現プラスミ
ドの構築Dactylosporangium sp. RH1 由来のＬ−プロリン4 位水
酸化酵素遺伝子、プロリン生合成系遺伝子proB74および
proAの全ての遺伝子を単一のプラスミド上に保持し、こ
れを発現させるような発現プラスミドｐＷＦＰ１を以下
の方法により構築した。
【００７３】実施例１で作成したｐＷＦＨ１をテンプレ
ートとし、ＰＣＲ法にてＬ−プロリン４位水酸化酵素の
構造遺伝子を増幅した。ＰＣＲはｐＷＦＨ１プラスミド
０．１μg 、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ（stratagene社
製）0.5 Ｕ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液
（STRATAGENE社製）２μｌ、ＤＭＳＯ ２μｌ、各２．
５ｍＭｄＮＴＰ液１μｌ、配列番号９記載の合成ＤＮＡ
と配列番号１０記載の合成ＤＮＡ各２μＭを含む反応液
２０μｌを用い、９６℃、５分間のインキュベーション
の後、９６℃−２分間、５８℃−１分間、７５℃−３分
間のインキュベーション工程を３０回繰り返す条件で行
った。
ートとし、ＰＣＲ法にてＬ−プロリン４位水酸化酵素の
構造遺伝子を増幅した。ＰＣＲはｐＷＦＨ１プラスミド
０．１μg 、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ（stratagene社
製）0.5 Ｕ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液
（STRATAGENE社製）２μｌ、ＤＭＳＯ ２μｌ、各２．
５ｍＭｄＮＴＰ液１μｌ、配列番号９記載の合成ＤＮＡ
と配列番号１０記載の合成ＤＮＡ各２μＭを含む反応液
２０μｌを用い、９６℃、５分間のインキュベーション
の後、９６℃−２分間、５８℃−１分間、７５℃−３分
間のインキュベーション工程を３０回繰り返す条件で行
った。
【００７４】反応終了後、該反応液をアガロースゲル電
気泳動にかけ、Ｌ−プロリン4 位水酸化酵素遺伝子を含
む約８００ｂｐの増幅断片を常法により抽出し、GENECL
EANII KIT（BIO 101, INC. 製）を用いて該ＤＮＡ断片
を回収した。該回収ＤＮＡ断片をHind IIIおよびEco RI
で切断後、アガロースゲル電気泳動にかけ、GENECLEAN
II KIT（BIO 101, INC. 製）を用いてＬ−プロリン4 位
水酸化酵素遺伝子を有する該Hind III−Eco RI切断ＤＮ
Ａ断片を回収した。
気泳動にかけ、Ｌ−プロリン4 位水酸化酵素遺伝子を含
む約８００ｂｐの増幅断片を常法により抽出し、GENECL
EANII KIT（BIO 101, INC. 製）を用いて該ＤＮＡ断片
を回収した。該回収ＤＮＡ断片をHind IIIおよびEco RI
で切断後、アガロースゲル電気泳動にかけ、GENECLEAN
II KIT（BIO 101, INC. 製）を用いてＬ−プロリン4 位
水酸化酵素遺伝子を有する該Hind III−Eco RI切断ＤＮ
Ａ断片を回収した。
【００７５】該Ｌ−プロリン4 位水酸化酵素遺伝子断片
と、プラスミドpBluescriptII KS(+)（stratagene社
製）のHind III―Eco RI消化ＤＮＡ断片とを宝酒造社製
のＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、Ｌ−プ
ロリン４位水酸化酵素断片の挿入されたプラスミドｐＢ
ＩＩ―４ＯＨを構築した（図６）。実施例３で作成した
ｐＰＲＯ７４をテンプレートとしＰＣＲ法にてproB74お
よびproA遺伝子を増幅した。
と、プラスミドpBluescriptII KS(+)（stratagene社
製）のHind III―Eco RI消化ＤＮＡ断片とを宝酒造社製
のＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、Ｌ−プ
ロリン４位水酸化酵素断片の挿入されたプラスミドｐＢ
ＩＩ―４ＯＨを構築した（図６）。実施例３で作成した
ｐＰＲＯ７４をテンプレートとしＰＣＲ法にてproB74お
よびproA遺伝子を増幅した。
【００７６】ＰＣＲはｐＰＲＯ７４プラスミド0.1 μg
、タカラ・イーエックス・タック（TaKaRa Ex Taq ：
宝酒造社製、コードRR001Q）１Ｕ、タカラ・イーエック
ス・タック用×１０緩衝液（宝酒造社製）２μｌ、各
２．５ｍＭｄＮＴＰ液１．６μｌ、配列番号１１記載の
合成ＤＮＡと配列番号１２記載の合成ＤＮＡ各２μＭを
含む反応液２０μｌを用い、９４℃−１分間、４２℃−
２分間、７５℃−３分間のインキュベーション工程を３
０回繰り返す条件で行った。
、タカラ・イーエックス・タック（TaKaRa Ex Taq ：
宝酒造社製、コードRR001Q）１Ｕ、タカラ・イーエック
ス・タック用×１０緩衝液（宝酒造社製）２μｌ、各
２．５ｍＭｄＮＴＰ液１．６μｌ、配列番号１１記載の
合成ＤＮＡと配列番号１２記載の合成ＤＮＡ各２μＭを
含む反応液２０μｌを用い、９４℃−１分間、４２℃−
２分間、７５℃−３分間のインキュベーション工程を３
０回繰り返す条件で行った。
【００７７】反応終了後、該反応液をアガロースゲル電
気泳動にかけ、proB74およびproA遺伝子を含む約２．３
ｋｂｐの増幅断片を常法により抽出し、GENECLEAN II K
IT（BIO 101, INC. 製）を用いて該ＤＮＡ断片を回収し
た。回収したＤＮＡ断片をBam HIおよびEco RIで切断
後、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿を
行い、該ＤＮＡ断片を回収した。このproB74およびproA
遺伝子を含むＤＮＡ断片と、上記プラスミドｐＢＩＩ―
４ＯＨのHind III―Eco RI消化ＤＮＡ断片とを宝酒造社
製のＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、Ｌ−
プロリン４位水酸化酵素遺伝子、proB74およびproAを含
むプラスミドｐＢＩＩ―４ＯＨＢＡを構築した（図
７）。
気泳動にかけ、proB74およびproA遺伝子を含む約２．３
ｋｂｐの増幅断片を常法により抽出し、GENECLEAN II K
IT（BIO 101, INC. 製）を用いて該ＤＮＡ断片を回収し
た。回収したＤＮＡ断片をBam HIおよびEco RIで切断
後、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿を
行い、該ＤＮＡ断片を回収した。このproB74およびproA
遺伝子を含むＤＮＡ断片と、上記プラスミドｐＢＩＩ―
４ＯＨのHind III―Eco RI消化ＤＮＡ断片とを宝酒造社
製のＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、Ｌ−
プロリン４位水酸化酵素遺伝子、proB74およびproAを含
むプラスミドｐＢＩＩ―４ＯＨＢＡを構築した（図
７）。
【００７８】プラスミドｐＢＩＩ―４ＯＨＢＡをHind I
IIおよびBam HIで消化し、アガロースゲル電気泳動にか
け、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子、proB74および
proAを含む約３．１６ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。
また、実施例１で作成したｐＷＦＨ１をHind IIIおよび
Bam HIで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｌ−
プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含まず、複製開始点を
含む方の約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。取得
した２つのＤＮＡ断片を宝酒造社製のＤＮＡライゲーシ
ョンキットを用いて連結し、トリプトファンタンデムプ
ロモーター下でＬ−プロリン４位水酸化酵素、proB74タ
ンパク、proAタンパクを発現させうるプラスミドｐＷＦ
Ｐ１を構築した（図８）。
IIおよびBam HIで消化し、アガロースゲル電気泳動にか
け、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子、proB74および
proAを含む約３．１６ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。
また、実施例１で作成したｐＷＦＨ１をHind IIIおよび
Bam HIで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｌ−
プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含まず、複製開始点を
含む方の約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。取得
した２つのＤＮＡ断片を宝酒造社製のＤＮＡライゲーシ
ョンキットを用いて連結し、トリプトファンタンデムプ
ロモーター下でＬ−プロリン４位水酸化酵素、proB74タ
ンパク、proAタンパクを発現させうるプラスミドｐＷＦ
Ｐ１を構築した（図８）。
【００７９】実施例６ 形質転換体E. coli WT1/pWFH1/
pPF1およびE. coli WT1/pWFP1 を用いたトランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産 形質転換株WT1/pWFH1/pPF1株をアンピシリン１００μｇ
／ｍｌおよびクロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌを含
む５０ｍｌ Ｍｅｄ４Ｇ培地［グルコース ２％、ポリ
ペプトン（日本製薬社製） １％、イーストエキストラ
クト（Ｄｉｆｃｏ社製） ０．５％、ＮａＣｌ １％、
炭酸カルシウム ２％、ｐＨ７．０］に、形質転換株WT
1/pWFP1 株をアンピシリン１００μｇ/ ｍｌを含む５０
ｍｌ Ｍｅｄ４Ｇ培地に、それぞれ植菌した後、３０℃
で１６時間振とう培養した。
pPF1およびE. coli WT1/pWFP1 を用いたトランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産 形質転換株WT1/pWFH1/pPF1株をアンピシリン１００μｇ
／ｍｌおよびクロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌを含
む５０ｍｌ Ｍｅｄ４Ｇ培地［グルコース ２％、ポリ
ペプトン（日本製薬社製） １％、イーストエキストラ
クト（Ｄｉｆｃｏ社製） ０．５％、ＮａＣｌ １％、
炭酸カルシウム ２％、ｐＨ７．０］に、形質転換株WT
1/pWFP1 株をアンピシリン１００μｇ/ ｍｌを含む５０
ｍｌ Ｍｅｄ４Ｇ培地に、それぞれ植菌した後、３０℃
で１６時間振とう培養した。
【００８０】該培養液を種培養液とし、２リッターのＭ
ｅｄ７培地を入れた５リッタージャーファーメンターに
それぞれ植菌し、WT1/pWFH1/pPF1株の培養においては、
アンピシリン１００μｇ/ ｍｌおよびクロラムフェニコ
ール３０μｇ/ ｍｌを、WT1/pWFP1 株の培養において
は、アンピシリン１００μｇ/ ｍｌを更に添加し、培養
温度３０℃、撹拌数４００回転／分、通気量１リッター
／培養液１リッター／分の条件で培養した。
ｅｄ７培地を入れた５リッタージャーファーメンターに
それぞれ植菌し、WT1/pWFH1/pPF1株の培養においては、
アンピシリン１００μｇ/ ｍｌおよびクロラムフェニコ
ール３０μｇ/ ｍｌを、WT1/pWFP1 株の培養において
は、アンピシリン１００μｇ/ ｍｌを更に添加し、培養
温度３０℃、撹拌数４００回転／分、通気量１リッター
／培養液１リッター／分の条件で培養した。
【００８１】また、WT1/pWFH1/pPF1の培養においては、
培養８時間目に、ＩＰＴＧを０. ２ｍＭとなるように添
加した。更に、両菌株とも、培養２４時間目に、培養開
始時と同種、同濃度の抗生物質を添加した。培養中、グ
ルコースをほぼ１％の濃度となるように適時培養液に添
加し、ＮＨ 4ＯＨを用いてｐＨ６. ５に下限コントロー
ルした。また、培養５時間以降に、撹拌数を２５０〜７
００ｒｐｍに変化させることにより、培養液の溶存酸素
濃度が培養開始時点の１／１５となるようにコントロー
ルした。
培養８時間目に、ＩＰＴＧを０. ２ｍＭとなるように添
加した。更に、両菌株とも、培養２４時間目に、培養開
始時と同種、同濃度の抗生物質を添加した。培養中、グ
ルコースをほぼ１％の濃度となるように適時培養液に添
加し、ＮＨ 4ＯＨを用いてｐＨ６. ５に下限コントロー
ルした。また、培養５時間以降に、撹拌数を２５０〜７
００ｒｐｍに変化させることにより、培養液の溶存酸素
濃度が培養開始時点の１／１５となるようにコントロー
ルした。
【００８２】９９時間培養後、該培養液を遠心分離し、
得られた上清中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リン含量を定量した結果、WT1/pWFH1/pPF1株において１
５６ｍＭ（２０．５ｇ/ ｌ）、WT1/pWFP1 株において１
９１ｍＭ（２５．０ｇ/ ｌ）のトランス−４−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンの生成蓄積が認められた。
得られた上清中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リン含量を定量した結果、WT1/pWFH1/pPF1株において１
５６ｍＭ（２０．５ｇ/ ｌ）、WT1/pWFP1 株において１
９１ｍＭ（２５．０ｇ/ ｌ）のトランス−４−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンの生成蓄積が認められた。
【００８３】実施例７ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺
伝子およびプロリン生合成系遺伝子発現プラスミドを含
む形質転換体によるトランスー４―ヒドロキシーＬ−プ
ロリンの生産 実施例５で構築したプラスミドｐＷＦＰ１を用いて、実
施例２で取得したE. coli WT1株を形質転換し、形質転換
株E. coli WT1/pWFP1 を取得した。
伝子およびプロリン生合成系遺伝子発現プラスミドを含
む形質転換体によるトランスー４―ヒドロキシーＬ−プ
ロリンの生産 実施例５で構築したプラスミドｐＷＦＰ１を用いて、実
施例２で取得したE. coli WT1株を形質転換し、形質転換
株E. coli WT1/pWFP1 を取得した。
【００８４】WT1/pWFP1 をアンピシリン１００μｇ／ｍ
ｌを含むＬＢ培地で３７℃で１６時間培養した。該培養
液１００μｌを、２％（Ｗ/ Ｖ）の炭酸カルシウムを含
む１０ｍｌのＭｅｄ７培地を入れた太型試験管（φ２０
×２００ｍｍ）に植菌し、３０℃で２４時間培養した。
該培養上清中のＬ−プロリンは０．５６ｇ／Ｌであり、
トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは２．４ｇ／
Ｌであった。
ｌを含むＬＢ培地で３７℃で１６時間培養した。該培養
液１００μｌを、２％（Ｗ/ Ｖ）の炭酸カルシウムを含
む１０ｍｌのＭｅｄ７培地を入れた太型試験管（φ２０
×２００ｍｍ）に植菌し、３０℃で２４時間培養した。
該培養上清中のＬ−プロリンは０．５６ｇ／Ｌであり、
トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは２．４ｇ／
Ｌであった。
【００８５】実施例８ 形質転換体の菌体を用いたトラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産 形質転換体E. coli ATCC12435/pTr2-4OHを５０μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含む３ｍｌＬＢ培地に植菌し３０
℃、一晩振とう培養後、該培養液を遠心分離し、E. col
i ATCC12435/pTr2-4OHの湿菌体を取得した。
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産 形質転換体E. coli ATCC12435/pTr2-4OHを５０μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含む３ｍｌＬＢ培地に植菌し３０
℃、一晩振とう培養後、該培養液を遠心分離し、E. col
i ATCC12435/pTr2-4OHの湿菌体を取得した。
【００８６】形質転換体E. coli ATCC12435/pWFH1 をア
ンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌ Ｍｅｄ
４培地〔ポリペプトン（日本製薬）１％、イーストエキ
ストラクト（Ｄｉｆｃｏ）０．５％、ＮａＣｌ１％〕に
植菌し、３０℃で１６時間振とう培養した。該培養液
を、２リッターのＭｅｄ７培地（グルコース２％、硫酸
アンモニウム１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％、ＮａＣｌ
０．２％、ＭｇＳＯ4 ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ０．０
２７８％、ＣａＣｌ2 ０．００１５％、ペプトン ０．
４％）を入れた５リッタージャーファーメンターに植菌
後、Ｌ−Ｐｒｏを２００ｍＭ添加し、培養温度３３℃、
通気量１リッター／培養液１リッター／分という条件で
４８時間培養した。
ンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌ Ｍｅｄ
４培地〔ポリペプトン（日本製薬）１％、イーストエキ
ストラクト（Ｄｉｆｃｏ）０．５％、ＮａＣｌ１％〕に
植菌し、３０℃で１６時間振とう培養した。該培養液
を、２リッターのＭｅｄ７培地（グルコース２％、硫酸
アンモニウム１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％、ＮａＣｌ
０．２％、ＭｇＳＯ4 ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ０．０
２７８％、ＣａＣｌ2 ０．００１５％、ペプトン ０．
４％）を入れた５リッタージャーファーメンターに植菌
後、Ｌ−Ｐｒｏを２００ｍＭ添加し、培養温度３３℃、
通気量１リッター／培養液１リッター／分という条件で
４８時間培養した。
【００８７】溶存酸素濃度が初期値の１５分の１に達し
た時点で、撹拌数４００回転／分を基準とし、７００回
転／分を上限として攪拌数を変化させることにより、溶
存酸素濃度を初期値の１５分の１となるようにコントロ
ールした。培養中、グルコースは無くならぬように、Ｌ
−プロリンは約５０ｍＭとなるように適時添加し、ＮＨ
4ＯＨを用いて、ｐＨ６．５に下限コントロールした。
た時点で、撹拌数４００回転／分を基準とし、７００回
転／分を上限として攪拌数を変化させることにより、溶
存酸素濃度を初期値の１５分の１となるようにコントロ
ールした。培養中、グルコースは無くならぬように、Ｌ
−プロリンは約５０ｍＭとなるように適時添加し、ＮＨ
4ＯＨを用いて、ｐＨ６．５に下限コントロールした。
【００８８】該培養により得られた培養液を遠心分離
し、E. coli ATCC12435/pWFH1 の湿菌体を取得した。該
両菌株の湿菌体は必要に応じて−２０℃で凍結保存する
ことが可能で、使用時に解凍し用いることができる。反
応液〔２４０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６. ５）中に、
１２ｍＭ Ｌ−プロリン、２４ｍＭ ２−ケトグルタル
酸、４ｍＭ 硫酸第一鉄および８ｍＭ Ｌ−アスコルビ
ン酸を含有する〕２５０μｌに湿菌体量として４％（ｗ
／ｖ）となるように加え、３５℃で１０分間反応した。
反応液を１００℃、２分間加熱することにより反応を停
止した。
し、E. coli ATCC12435/pWFH1 の湿菌体を取得した。該
両菌株の湿菌体は必要に応じて−２０℃で凍結保存する
ことが可能で、使用時に解凍し用いることができる。反
応液〔２４０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６. ５）中に、
１２ｍＭ Ｌ−プロリン、２４ｍＭ ２−ケトグルタル
酸、４ｍＭ 硫酸第一鉄および８ｍＭ Ｌ−アスコルビ
ン酸を含有する〕２５０μｌに湿菌体量として４％（ｗ
／ｖ）となるように加え、３５℃で１０分間反応した。
反応液を１００℃、２分間加熱することにより反応を停
止した。
【００８９】該反応停止液を遠心分離し、得られた上清
中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン含量を定
量した結果、E. coli ATCC12435/pTr2-4OH株において３
ｍｍｏｌ／ｌ、E. coli ATCC12435/pWFH1 株において１
６ｍｍｏｌ／ｌのトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンの生産が認められた。Ｌ−プロリン４位水酸化酵素
に対する菌体活性はそれぞれ、７．５および４０U/mg・
wet cells であった。
中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン含量を定
量した結果、E. coli ATCC12435/pTr2-4OH株において３
ｍｍｏｌ／ｌ、E. coli ATCC12435/pWFH1 株において１
６ｍｍｏｌ／ｌのトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンの生産が認められた。Ｌ−プロリン４位水酸化酵素
に対する菌体活性はそれぞれ、７．５および４０U/mg・
wet cells であった。
【００９０】参考例１ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素発
現プラスミッドの構築 配列番号１３記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列
番号１４に記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーをア
プライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社
製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。該合成Ｄ
ＮＡをプライマーとして、ｐＲＨ７１［該プラスミドを
含有するEscherichia coli SOLR/pRH71（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５０２５）より定法により取得］を鋳型としてＰＣ
Ｒを行った。
現プラスミッドの構築 配列番号１３記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列
番号１４に記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーをア
プライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社
製３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。該合成Ｄ
ＮＡをプライマーとして、ｐＲＨ７１［該プラスミドを
含有するEscherichia coli SOLR/pRH71（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５０２５）より定法により取得］を鋳型としてＰＣ
Ｒを行った。
【００９１】ＰＣＲは、ｐＲＨ７１を０. １μｇ、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖ＤＮＡプライマー各２μＭ、
Pfu ＤＮＡポリメラーゼ（STRATAGENE社製）０. １２５
Ｕ／μｌ、ＤＭＳＯ１０％、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
８. ２）２０ｍＭ、ＫＣｌ１０ｍＭ、硫酸アンモニウム
６ｍＭ、塩化マグネシウム２ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１
０００. １％、Bovine Serum Albumine １０ｎｇ／μｌ
を含む反応液２０μｌを用い、９６℃、５分間のインキ
ュベーション後、９６℃−２分間、５８℃−１分間、７
５℃−１分間のインキュベーション工程を３０回繰り返
す条件で行った。
ス鎖およびアンチセンス鎖ＤＮＡプライマー各２μＭ、
Pfu ＤＮＡポリメラーゼ（STRATAGENE社製）０. １２５
Ｕ／μｌ、ＤＭＳＯ１０％、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
８. ２）２０ｍＭ、ＫＣｌ１０ｍＭ、硫酸アンモニウム
６ｍＭ、塩化マグネシウム２ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１
０００. １％、Bovine Serum Albumine １０ｎｇ／μｌ
を含む反応液２０μｌを用い、９６℃、５分間のインキ
ュベーション後、９６℃−２分間、５８℃−１分間、７
５℃−１分間のインキュベーション工程を３０回繰り返
す条件で行った。
【００９２】反応終了後、該反応液をアガロースゲル電
気泳動にかけ、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝
子をコードする８４４ｂｐの増幅断片が生成されている
ことを確認した。該８４４ｂｐの増幅断片をアガロース
ゲルより常法により抽出し、バイオラッド社製のPrep-A
-gene を用いて断片を回収した。回収した８４４ｂｐの
ＤＮＡ断片の両末端をHind IIIおよびBam HIで切断後、
エタノール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該エ
タノール沈殿を５μｌのＴＥに溶解した。
気泳動にかけ、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝
子をコードする８４４ｂｐの増幅断片が生成されている
ことを確認した。該８４４ｂｐの増幅断片をアガロース
ゲルより常法により抽出し、バイオラッド社製のPrep-A
-gene を用いて断片を回収した。回収した８４４ｂｐの
ＤＮＡ断片の両末端をHind IIIおよびBam HIで切断後、
エタノール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該エ
タノール沈殿を５μｌのＴＥに溶解した。
【００９３】ｐＢＲ３２２を基本とし、Ｐtrpを２つ直
列させたプロモーターＰtrp×２を持つプラスミドｐＫ
ＹＰ２００〔アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケ
ミストリー(Agric. Biol. Chem.), ４８巻, ６６９〜６
７５ページ（１９８４年) 〕と合成リンカーを組み合わ
せて作製されたＡＴＧベクターｐＴｒＳ３２〔エシェリ
ヒア・コリ JM109/pTrS32 （ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０
８）より調製〕をHind IIIおよびBam HIで切断した。該
切断部位に、Hind IIIおよびBam HIで切断処理した上記
のＬ−プロリン４位水酸化酵素構造遺伝子断片を、宝酒
造社製のライゲーションキットを用いて、挿入した。
列させたプロモーターＰtrp×２を持つプラスミドｐＫ
ＹＰ２００〔アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケ
ミストリー(Agric. Biol. Chem.), ４８巻, ６６９〜６
７５ページ（１９８４年) 〕と合成リンカーを組み合わ
せて作製されたＡＴＧベクターｐＴｒＳ３２〔エシェリ
ヒア・コリ JM109/pTrS32 （ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０
８）より調製〕をHind IIIおよびBam HIで切断した。該
切断部位に、Hind IIIおよびBam HIで切断処理した上記
のＬ−プロリン４位水酸化酵素構造遺伝子断片を、宝酒
造社製のライゲーションキットを用いて、挿入した。
【００９４】得られたプラスミドを用い、E. coli XL1-
Blue MRF' 株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に
塗布後、３７℃で１晩培養した。生育してきた形質転換
体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、そ
の構造を制限酵素消化により確認した。構造遺伝子部分
についてはアプライドバイオシステムズ社製の塩基配列
決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator CycleSequenc
ing Kit）を用いて、塩基配列を決定し、配列番号１５
で示した塩基配列であることを確認した。
Blue MRF' 株を常法に従って形質転換し、該形質転換体
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に
塗布後、３７℃で１晩培養した。生育してきた形質転換
体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、そ
の構造を制限酵素消化により確認した。構造遺伝子部分
についてはアプライドバイオシステムズ社製の塩基配列
決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator CycleSequenc
ing Kit）を用いて、塩基配列を決定し、配列番号１５
で示した塩基配列であることを確認した。
【００９５】該方法により、Ｐtrp×２の転写方向と同
方向にＬ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコー
ドするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＴｒ２−４
ＯＨ（図９）を得た。
方向にＬ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコー
ドするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＴｒ２−４
ＯＨ（図９）を得た。
【００９６】参考例２ ダクチロスポランジウム・エス
ピーの菌体を用いたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンの生産 ＳＲ３培地（グルコース１．０％、可溶性澱粉１．０
％、酵母エキス０．５％、トリプトン０．５％、肉エキ
ス０．３％およびリン酸マグネシウム０．０５％を含
み、６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整した培地）を試
験管に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌し
た。この培地に、ＨＴ寒天平板培地に生育したダクチロ
スポランジウム・エスピー（Dactylosporangium sp.）R
H1 を一白金耳植菌し、２８℃、２日間振盪培養し、種
培養液として用いた。
ピーの菌体を用いたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンの生産 ＳＲ３培地（グルコース１．０％、可溶性澱粉１．０
％、酵母エキス０．５％、トリプトン０．５％、肉エキ
ス０．３％およびリン酸マグネシウム０．０５％を含
み、６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整した培地）を試
験管に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌し
た。この培地に、ＨＴ寒天平板培地に生育したダクチロ
スポランジウム・エスピー（Dactylosporangium sp.）R
H1 を一白金耳植菌し、２８℃、２日間振盪培養し、種
培養液として用いた。
【００９７】Ｄｆ１培地（可溶性澱粉５％、ソイビーン
ミール１．５％、リン酸１カリウム０．０５％、硫酸マ
グネシウム７水塩０．０５％および炭酸カルシウム０．
５％を含み、６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した培
地）を試験管に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分
間殺菌した。この培地に、上記種培養液１ｍｌを無菌的
に接種し、２８℃、２日間振盪培養した。
ミール１．５％、リン酸１カリウム０．０５％、硫酸マ
グネシウム７水塩０．０５％および炭酸カルシウム０．
５％を含み、６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した培
地）を試験管に１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分
間殺菌した。この培地に、上記種培養液１ｍｌを無菌的
に接種し、２８℃、２日間振盪培養した。
【００９８】得られた培養液を８０００ｒｐｍ、１０分
間、４℃で遠心分離し、菌体を取得した。該菌体を８０
ｍＭＴＥＳ［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−
２−アミノエタンスルホン酸］緩衝液（ｐＨ７. ５）で
洗浄後、遠心分離し、湿菌体を取得した。
間、４℃で遠心分離し、菌体を取得した。該菌体を８０
ｍＭＴＥＳ［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−
２−アミノエタンスルホン酸］緩衝液（ｐＨ７. ５）で
洗浄後、遠心分離し、湿菌体を取得した。
【００９９】該湿菌体１５０ｍｇを、１. ５ｍｌの反応
液［４ｍＭ Ｌ−プロリン、８ｍＭα−ケト−グルタル
酸、４ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、２ｍＭ 硫酸第一
鉄、を含有する８０ｍＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ５）に
ナイミーン溶液（ナイミーンＳ−２１５（日本油脂株式
会社製）４ｇをキシレン１０ｍｌに溶解）を１. ４％(
ｖ／ｖ) 添加］に懸濁し、３０℃、３０分間反応を行っ
た。
液［４ｍＭ Ｌ−プロリン、８ｍＭα−ケト−グルタル
酸、４ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、２ｍＭ 硫酸第一
鉄、を含有する８０ｍＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ５）に
ナイミーン溶液（ナイミーンＳ−２１５（日本油脂株式
会社製）４ｇをキシレン１０ｍｌに溶解）を１. ４％(
ｖ／ｖ) 添加］に懸濁し、３０℃、３０分間反応を行っ
た。
【０１００】反応終了後、該反応液を遠心分離し、得ら
れた上清中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
含量を定量した結果、８４μｍｏｌ／ｌトランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産が認められた。該菌株
における、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素にたいする菌体
活性は０．０２８U/mg・ wet cells であった。
れた上清中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
含量を定量した結果、８４μｍｏｌ／ｌトランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産が認められた。該菌株
における、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素にたいする菌体
活性は０．０２８U/mg・ wet cells であった。
【０１０１】
【発明の効果】本発明によれば、医薬品の合成原料また
は食品添加物として有用なトランス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンを工業的に製造する方法、該方法に有用な
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含有し、かつ、プ
ロリン合成系の活性の強化された形質転換体を提供する
ことができる。
は食品添加物として有用なトランス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンを工業的に製造する方法、該方法に有用な
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含有し、かつ、プ
ロリン合成系の活性の強化された形質転換体を提供する
ことができる。
【０１０２】
配列番号：１ 配列の長さ：８１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 ATG CTG ACC CCG ACC GAA CTG AAA CAG TAT CGT GAA GCG GGC TAT CTG 48 Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu 1 5 10 15 CTG ATT GAA GAT GGC CTG GGC CCG CGT GAA GTC GAC TGC CTG CGC CGG 96 Leu Ile Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Glu Val Asp Cys Leu Arg Arg 20 25 30 GCG GCG GCG GCC CTC TAC GCG CAG GAC TCG CCG GAC CGC ACG CTG GAG 144 Ala Ala Ala Ala Leu Tyr Ala Gln Asp Ser Pro Asp Arg Thr Leu Glu 35 40 45 AAG GAC GGC CGC ACC GTG CGC GCG GTC CAC GGC TGC CAC CGG CGC GAC 192 Lys Asp Gly Arg Thr Val Arg Ala Val His Gly Cys His Arg Arg Asp 50 55 60 CCG GTC TGC CGC GAC CTG GTC CGC CAC CCG CGC CTG CTG GGC CCG GCG 240 Pro Val Cys Arg Asp Leu Val Arg His Pro Arg Leu Leu Gly Pro Ala 65 70 75 80 ATG CAG ATC CTG TCC GGC GAC GTG TAC GTC CAC CAG TTC AAG ATC AAC 288 Met Gln Ile Leu Ser Gly Asp Val Tyr Val His Gln Phe Lys Ile Asn 85 90 95 GCG AAG GCC CCG ATG ACC GGC GAT GTC TGG CCG TGG CAC CAG GAC TAC 336 Ala Lys Ala Pro Met Thr Gly Asp Val Trp Pro Trp His Gln Asp Tyr 100 105 110 ATC TTC TGG GCC CGA GAG GAC GGC ATG GAC CGT CCG CAC GTG GTC AAC 384 Ile Phe Trp Ala Arg Glu Asp Gly Met Asp Arg Pro His Val Val Asn 115 120 125 GTC GCG GTC CTG CTC GAC GAG GCC ACC CAC CTC AAC GGG CCG CTG TTG 432 Val Ala Val Leu Leu Asp Glu Ala Thr His Leu Asn Gly Pro Leu Leu 130 135 140 TTC GTG CCG GGC ACC CAC GAG CTG GGC CTC ATC GAC GTG GAG CGC CGC 480 Phe Val Pro Gly Thr His Glu Leu Gly Leu Ile Asp Val Glu Arg Arg 145 150 155 160 GCG CCG GCC GGC GAC GGC GAC GCG CAG TGG CTG CCG CAG CTC AGCGCC 528 Ala Pro Ala Gly Asp Gly Asp Ala Gln Trp Leu Pro Gln Leu Ser Ala 165 170 175 GAC CTC GAC TAC GCC ATC GAC GCC GAC CTG CTG GCC CGG CTG ACG GCC 576 Asp Leu Asp Tyr Ala Ile Asp Ala Asp Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ala 180 185 190 GGG CGG GGC ATC GAG TCG GCC ACC GGC CCG GCG GGC TCG ATC CTG CTG 624 Gly Arg Gly Ile Glu Ser Ala Thr Gly Pro Ala Gly Ser Ile Leu Leu 195 200 205 TTC GAC TCC CGG ATC GTG CAC GGC TCG GGC ACG AAC ATG TCG CCG CAC 672 Phe Asp Ser Arg Ile Val His Gly Ser Gly Thr Asn Met Ser Pro His 210 215 220 CCG CGC GGC GTC GTC CTG GTC ACC TAC AAC CGC ACC GAC AAC GCC CTG 720 Pro Arg Gly Val Val Leu Val Thr Tyr Asn Arg Thr Asp Asn Ala Leu 225 230 235 240 CCG GCG CAG GCC GCT CCG CGC CCG GAG TTC CTG GCC GCC CGC GAC GCC 768 Pro Ala Gln Ala Ala Pro Arg Pro Glu Phe Leu Ala Ala Arg Asp Ala 245 250 255 ACC CCG CTG GTG CCG CTG CCC GCG GGC TTC GCG CTG GCC CAG CCC GTC 816 Thr Pro Leu Val Pro Leu Pro Ala Gly Phe Ala Leu Ala Gln Pro Val 260 265 270
【０１０３】配列番号：２ 配列の長さ：６４ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列： TGAGGAAAGC TTATGCTGAC CCCGACCGAA CTGAAACAGT ATCGTGAAGC 50 GGGCTATCTG CTGA 64
【０１０４】配列番号：３ 配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列： CCGGAATTCG TCGACTTCAC GCGGGCCCAG GCCATCTTCA ATCAGCAGAT 50 AGCCCGCTTC ACGATA 66
【０１０５】配列番号：４ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成 DNA 配列： GACCCGTGCT AATATGGAAG AC 12
【０１０６】配列番号：５ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成 DNA 配列： GTCTTCCATA TTAGCACGGG TC 12
【０１０７】配列番号：６ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成 DNA 配列： GGCAAAGCTT CATGAGTGAC AGCCAGACGC TGG 33
【０１０８】配列番号：７ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成 DNA 配列： TTTGCAGGAT CCGGTTTTAT TTACGCACGA ATG 32
【０１０９】配列番号：８ 配列の長さ：１１２５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTC ATG AGT GAC AGC CAG ACG CTG GTG 48 Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Phe Met Ser Asp Ser Gln Thr Leu Val 1 5 10 15 GTA AAA CTC GGC ACC AGT GTG CTA ACA GGC GGA TCG CGC CGT CTG AAC 96 Val Lys Leu Gly Thr Ser Val Leu Thr Gly Gly Ser Arg Arg Leu Asn 20 25 30 CGT GCC CAT ATC GTT GAA CTT GTT CGC CAG TGC GCG CAG TTA CAT GCC 144 Arg Ala His Ile Val Glu Leu Val Arg Gln Cys Ala Gln Leu His Ala 35 40 45 GCC GGG CAT CGG ATT GTT ATT GTG ACG TCG GGC GCG ATC GCC GCC GGA 192 Ala Gly His Arg Ile Val Ile Val Thr Ser Gly Ala Ile Ala Ala Gly 50 55 60 CGT GAG CAC CTG GGT TAC CCG GAA CTG CCA GCG ACC ATC GCC TCG AAA 240 Arg Glu His Leu Gly Tyr Pro Glu Leu Pro Ala Thr Ile Ala Ser Lys 65 70 75 80 CAA CTG CTG GCG GCG GTA GGG CAG AGT CGA CTG ATT CAA CTG TGG GAA 288 Gln Leu Leu Ala Ala Val Gly Gln Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Glu 85 90 95 CAG CTG TTT TCG ATT TAT GGC ATT CAC GTC GGG CAA ATG CTG CTG ACC 336 Gln Leu Phe Ser Ile Tyr Gly Ile His Val Gly Gln Met Leu Leu Thr 100 105 110 CGT GCT AAT ATG GAA GAC CGT GAA CGC TTC CTG AAC GCC CGC GAC ACC 384 Arg Ala Asn Met Glu Asp Arg Glu Arg Phe Leu Asn Ala Arg Asp Thr 115 120 125 CTG CGA GCG TTG CTC GAT AAC AAT ATC GTT CCG GTA ATC AAT GAG AAC 432 Leu Arg Ala Leu Leu Asp Asn Asn Ile Val Pro Val Ile Asn Glu Asn 130 135 140 GAT GCT GTC GCT ACG GCA GCG ATT AAG GTC GGC GAT AAC GAT AAC CTT 480 Asp Ala Val Ala Thr Ala Ala Ile Lys Val Gly Asp Asn Asp Asn Leu 145 150 155 160 TCT GCG CTG GCG GCG ATT CTT GCG GGT GCC GAT AAA CTG TTG CTG CTG 528 Ser Ala Leu Ala Ala Ile Leu Ala Gly Ala Asp Lys Leu Leu Leu Leu 165 170 175 ACC GAT CAA AAA GGT TTG TAT ACC GCT GAC CCG CGC AGC AAT CCG CAG 576 Thr Asp Gln Lys Gly Leu Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ser Asn Pro Gln 180 185 190 GCA GAA CTG ATT AAA GAT GTT TAC GGC ATT GAT GAC GCA CTG CGC GCG 624 Ala Glu Leu Ile Lys Asp Val Tyr Gly Ile Asp Asp Ala Leu Arg Ala 195 200 205 ATT GCC GGT GAC AGC GTT TCA GGC CTC GGA ACT GGC GGC ATG AGT ACC 672 Ile Ala Gly Asp Ser Val Ser Gly Leu Gly Thr Gly Gly Met Ser Thr 210 215 220 AAA TTG CAG GCC GCT GAC GTG GCT TGC CGT GCG GGT ATC GAC ACC ATT 720 Lys Leu Gln Ala Ala Asp Val Ala Cys Arg Ala Gly Ile Asp Thr Ile 225 230 235 240 ATT GCC GCG GGC AGC AAG CCG GGC GTT ATT GGT GAT GTG ATG GAA GGC 768 Ile Ala Ala Gly Ser Lys Pro Gly Val Ile Gly Asp Val Met Glu Gly 245 250 255 ATT TCC GTC GGT ACG CTG TTC CAT GCC CAG GCG ACT CCG CTT GAA AAC 816 Ile Ser Val Gly Thr Leu Phe His Ala Gln Ala Thr Pro Leu Glu Asn 260 265 270 CGT AAA CGC TGG ATT TTC GGT GCG CCG CCG GCG GGT GAA ATC ACG GTA 864 Arg Lys Arg Trp Ile Phe Gly Ala Pro Pro Ala Gly Glu Ile Thr Val 275 280 285 GAT GAA GGG GCA ACT GCC GCC ATT CTG GAA CGC GGC AGC TCC CTG TTG 912 Asp Glu Gly Ala Thr Ala Ala Ile Leu Glu Arg Gly Ser Ser Leu Leu 290 295 300 CCG AAA GGC ATT AAA AGC GTG ACT GGC AAT TTC TCG CGT GGT GAA GTC 960 Pro Lys Gly Ile Lys Ser Val Thr Gly Asn Phe Ser Arg Gly Glu Val 305 310 315 320 ATC CGC ATT TGC AAC CTC GAA GGC CGC GAT ATC GCC CAC GGC GTC AGT 1008 Ile Arg Ile Cys Asn Leu Glu Gly Arg Asp Ile Ala His Gly Val Ser 325 330 335 CGT TAC AAC AGC GAT GCA TTA CGC CGT ATT GCC GGA CAC CAC TCG CAA 1056 Arg Tyr Asn Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Ala Gly His His Ser Gln 340 345 350 GAA ATT GAT GCA ATA CTG GGA TAT GAA TAC GGC CCG GTT GCC GTT CAC 1104 Glu Ile Asp Ala Ile Leu Gly Tyr Glu Tyr Gly Pro Val Ala Val His 355 360 365 CGT GAT GAC ATG ATT ACC CGT 1125 Arg Asp Asp Met Ile Thr Arg 370 375
【０１１０】配列番号：９ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列： TATCGATAAG CTTATGCTGA CCCCGACCGA ACTGAAA 37
【０１１１】配列番号：１０ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列： GGCAGAATTC TAGACGGGCT GGGCCAGCGC GAA 33
【０１１２】配列番号：１１ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列： AAAATTGAAT TCCAGAGAAT CATGAGTGAC AGCCAGAC 38
【０１１３】配列番号１２ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列： ACCCGGATCC ATTTACGCAC GAATGGTGTA ATCACC 36
【０１１４】配列番号：１３ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成 DNA 配列： GTGAGGAAAG CTTATGCTGA CCCCGACGGA GCTCAAG 37
【０１１５】配列番号：１４ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成 DNA 配列： GCCTGCGGGA TCCTAGACGG GCTGGGCCAG CGCGAA 36
【０１１６】配列番号：１５ 配列の長さ：８１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Dactylosporangium sp. 株名：RH1 特徴を決定した方法：E 配列： ATGCTGACCC CGACGGAGCT CAAGCAGTAC CGCGAGGCGG GCTATCTGCT CATCGAGGAC 60 GGCCTCGGCC CGCGGGAGGT CGACTGCCTG CGCCGGGCGG CGGCGGCCCT CTACGCGCAG 120 GACTCGCCGG ACCGCACGCT GGAGAAGGAC GGCCGCACCG TGCGCGCGGT CCACGGCTGC 180 CACCGGCGCG ACCCGGTCTG CCGCGACCTG GTCCGCCACC CGCGCCTGCT GGGCCCGGCG 240 ATGCAGATCC TGTCCGGCGA CGTGTACGTC CACCAGTTCA AGATCAACGC GAAGGCCCCG 300 ATGACCGGCG ATGTCTGGCC GTGGCACCAG GACTACATCT TCTGGGCCCG AGAGGACGGC 360 ATGGACCGTC CGCACGTGGT CAACGTCGCG GTCCTGCTCG ACGAGGCCAC CCACCTCAAC 420 GGGCCGCTGT TGTTCGTGCC GGGCACCCAC GAGCTGGGCC TCATCGACGT GGAGCGCCGC 480 GCGCCGGCCG GCGACGGCGA CGCGCAGTGG CTGCCGCAGC TCAGCGCCGA CCTCGACTAC 540 GCCATCGACG CCGACCTGCT GGCCCGGCTG ACGGCCGGGC GGGGCATCGA GTCGGCCACC 600 GGCCCGGCGG GCTCGATCCT GCTGTTCGAC TCCCGGATCG TGCACGGCTC GGGCACGAAC 660 ATGTCGCCGC ACCCGCGCGG CGTCGTCCTG GTCACCTACA ACCGCACCGA CAACGCCCTG 720 CCGGCGCAGG CCGCTCCGCG CCCGGAGTTC CTGGCCGCCC GCGACGCCAC CCCGCTGGTG 780 CCGCTGCCCG CGGGCTTCGC GCTGGCCCAG CCCGTC 816
【図１】図１は、プラスミドｐＴｒ２−４ＯＨΔの造成
工程を示す図である。図中、黒塗の太線で示した部分
が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示
す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子
を、Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファンオペロン
のプロモーターを２つ直列させたプロモーター（タンデ
ムトリプトファンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子
の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミ
ドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
工程を示す図である。図中、黒塗の太線で示した部分
が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示
す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子
を、Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファンオペロン
のプロモーターを２つ直列させたプロモーター（タンデ
ムトリプトファンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子
の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミ
ドの造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図２】図２は、プラスミドｐＷＦＨ１の造成工程を示
す図である。図中、網掛けの太線で示した部分が、Hind
IIIおよびSal I 処理したＰＣＲ増幅断片の挿入部分を
示す。黒塗の太線で示した部分が、Dactylosporangium
sp.RH1 由来のＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含
む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン
耐性遺伝子を、Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファ
ンオペロンのプロモーターを２つ直列させたプロモータ
ー（タンデムトリプトファンプロモーター）を示す。矢
印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中に
はプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示し
てある。
す図である。図中、網掛けの太線で示した部分が、Hind
IIIおよびSal I 処理したＰＣＲ増幅断片の挿入部分を
示す。黒塗の太線で示した部分が、Dactylosporangium
sp.RH1 由来のＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含
む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン
耐性遺伝子を、Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファ
ンオペロンのプロモーターを２つ直列させたプロモータ
ー（タンデムトリプトファンプロモーター）を示す。矢
印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中に
はプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示し
てある。
【図３】図３は、プラスミドｐＢＡＢ５１の造成工程を
示す図である。図中、黒の網掛けで示した部分が、プロ
リン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含
む部分である。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン
耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラ
グメント構造遺伝子を示す。ＴｃはｐＢＲ３２２由来の
テトラサイクリン耐性遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転
写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの
造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
示す図である。図中、黒の網掛けで示した部分が、プロ
リン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含
む部分である。ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン
耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラ
グメント構造遺伝子を示す。ＴｃはｐＢＲ３２２由来の
テトラサイクリン耐性遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転
写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの
造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
【図４】図４は、プラスミドｐＰＲＯ７４の造成工程を
示す図である。図中、黒の網掛けで示した部分が、プロ
リン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含
む部分である。黒塗りの部分はｐｒｏＢ７４とｐｒｏＢ
で唯一異なる塩基対を含むｐｒｏＢ７４遺伝子の一部分
を示す。ＴｃはｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐
性遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向
を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限
酵素部位のみを示してある。
示す図である。図中、黒の網掛けで示した部分が、プロ
リン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含
む部分である。黒塗りの部分はｐｒｏＢ７４とｐｒｏＢ
で唯一異なる塩基対を含むｐｒｏＢ７４遺伝子の一部分
を示す。ＴｃはｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐
性遺伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向
を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限
酵素部位のみを示してある。
【図５】図５は、プラスミドｐＰＦ１の造成工程を示す
図である。図中、黒塗の太線で示した部分が、プロリン
合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含む部
分を示す。ＣｍｒはＴｎ９由来のクロラムフェニコール
耐性遺伝子を含む部分を示す。ｐＡＣＹＣ．ｏｒｉはｐ
ＡＣＹＣ１８４由来の複製開始基点を、Ｐlacはlacプロ
モーターを、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグ
メント構造遺伝子を示す。ｌａｃＺ．Ｎｔｅｒｍ- ｐｒ
ｏＢ７４はβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺
伝子のＮ末端部分とｐｒｏＢ７４遺伝子との融合した遺
伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示
す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素
部位のみを示してある。
図である。図中、黒塗の太線で示した部分が、プロリン
合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およびｐｒｏＡを含む部
分を示す。ＣｍｒはＴｎ９由来のクロラムフェニコール
耐性遺伝子を含む部分を示す。ｐＡＣＹＣ．ｏｒｉはｐ
ＡＣＹＣ１８４由来の複製開始基点を、Ｐlacはlacプロ
モーターを、ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグ
メント構造遺伝子を示す。ｌａｃＺ．Ｎｔｅｒｍ- ｐｒ
ｏＢ７４はβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺
伝子のＮ末端部分とｐｒｏＢ７４遺伝子との融合した遺
伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示
す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素
部位のみを示してある。
【図６】図６は、プラスミドｐＢＩＩ−４ＯＨの造成工
程を示す図である。図中、黒塗の太線で示した部分が、
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。
ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、
ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺
伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示
す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素
部位のみを示してある。
程を示す図である。図中、黒塗の太線で示した部分が、
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。
ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、
ｌａｃＺはβ- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺
伝子を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示
す。なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素
部位のみを示してある。
【図７】図７は、プラスミドｐＢＩＩ−４ＯＨＢＡの造
成工程を示す図である。図中、黒塗の太線で示した部分
が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示
す。黒の網掛け部分はプロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏ
Ｂ７４およびｐｒｏＡを含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ
３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ
- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。
矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中
にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示
してある。
成工程を示す図である。図中、黒塗の太線で示した部分
が、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示
す。黒の網掛け部分はプロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏ
Ｂ７４およびｐｒｏＡを含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ
３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ
- ガラクトシダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。
矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中
にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位のみを示
してある。
【図８】図８は、プラスミドｐＷＦＰ１の造成工程を示
す図である。図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プ
ロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。黒の網
掛け部分はプロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およ
びｐｒｏＡを含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来
のアンピシリン耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ- ガラクト
シダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。Ｐtrp×２
は大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプロモーター
を２つ直列させたプロモーター（タンデムトリプトファ
ンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻
訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係
する制限酵素部位のみを示してある。
す図である。図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プ
ロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。黒の網
掛け部分はプロリン合成系酵素遺伝子ｐｒｏＢ７４およ
びｐｒｏＡを含む部分を示す。ＡｐはｐＢＲ３２２由来
のアンピシリン耐性遺伝子を、ｌａｃＺはβ- ガラクト
シダーゼαフラグメント構造遺伝子を示す。Ｐtrp×２
は大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプロモーター
を２つ直列させたプロモーター（タンデムトリプトファ
ンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻
訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係
する制限酵素部位のみを示してある。
【図９】図９は、プラスミドｐＴｒ２−４ＯＨの造成工
程を示す図である。図中、黒塗の太線で示した部分が、
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。
ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、
Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプ
ロモーターを２つ直列させたプロモーター（タンデムト
リプトファンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転
写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの
造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
程を示す図である。図中、黒塗の太線で示した部分が、
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。
ＡｐはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を、
Ｐtrp×２は大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプ
ロモーターを２つ直列させたプロモーター（タンデムト
リプトファンプロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転
写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミドの
造成に関係する制限酵素部位のみを示してある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (8)
- 【請求項１】 ２−ケトグルタル酸および２価鉄イオン
の存在下、遊離のＬ−プロリンに作用して、トランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する、Ｌ−プロリ
ン４位水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片をベクターに組み込んで得られる組
換え体ＤＮＡを保有し、且つ、Ｌ−プロリンの生合成系
の活性の強化された形質転換体。 - 【請求項２】 Ｌ−プロリン生合成系の活性の強化が、
宿主中のプロリン合成系遺伝子のコピー数を増加させ
る、プロリンによってフィードバック阻害を受けるプロ
リン合成系酵素遺伝子に変異を生ぜしめ、プロリンによ
るフィードバック阻害が著しく減少した酵素をコードす
る遺伝子を宿主に導入する、プロリンの分解活性を欠失
させる、またはこれらを組み合わせることにより達成さ
れることを特徴とする、請求項１記載の形質転換体。 - 【請求項３】 Ｌ−プロリン生合成系の活性の強化が、
Ｌ−プロリンの生合成に係わる酵素をコードする遺伝子
の導入により達成されることを特徴とする、請求項１記
載の形質転換体。 - 【請求項４】 遺伝子が、大腸菌由来のｐｒｏＢまたは
ｐｒｏＡ遺伝子である、請求項３記載の形質転換体。 - 【請求項５】 遺伝子が、Ｌ−プロリンによるフィード
バック阻害の低減したプロリン生合成に係わる酵素をコ
ードする遺伝子である、請求項３記載の形質転換体。 - 【請求項６】 遺伝子が、大腸菌由来のｐｒｏＢ７４遺
伝子である、請求項５記載の形質転換体。 - 【請求項７】 請求項１、２、３、４、５または６記載
の形質転換体を培地に培養して得られる培養物、菌体ま
たはそれらの処理物を酵素源として、２−ケトグルタル
酸および２価鉄イオンの存在下、水性媒体中で、Ｌ−プ
ロリンをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変
換させ、生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンを該水性媒体より採取することを特徴とするトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。 - 【請求項８】 水性媒体が培養液であることを特徴とす
る、請求項７記載の製造法。
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| CN107805621A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-03-16 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种利用大肠杆菌合成反式‑4‑羟基‑l‑脯氨酸的方法 |
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