JPH1059863A - Separation and purification of antithrombin iii - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a process for separating monodisperse ultrafine particles suspended in a medium (including grafted ultrafine particles produced by introducing a terminal-functional oligomer) in high separation efficiency. SOLUTION: An aqueous dispersion medium containing suspending ultrafine particles having sodium carboxylate group (COONa) is incorporated with a water-soluble polyvalent metal salt at a molar ratio [M<n+> ]/[COONa] of 0.1-10,000 (M is a polyvalent metal; (n) is an integer of 2-4), the pH of the reaction system is adjusted to 5-13, the temperature of the system is maintained within the range of 0-90 deg.C to effect the crosslinking of the sodium carboxylate groups (COONa) of the ultrafine particles with the polyvalent metal and the produced coagulum of the ultrafine particles is separated from the system.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、血管内凝固症候群
（ＤＩＣ）・肝硬変・避妊薬投与などを原因とする各種
血栓性疾患の治療薬として、その製剤化への期待が高ま
っている血液中の生理的凝固素子物質として最も重要な
ものであるアンチトロンビンIII の分離精製方法に関す
る。TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a therapeutic agent for various thrombotic diseases caused by intravascular coagulation syndrome (DIC), cirrhosis and contraceptives, which is expected to be formulated into blood. The present invention relates to a method for separating and purifying antithrombin III, which is the most important as a physiological coagulation element substance.

【０００２】[0002]

【従来の技術】血液や血漿などのアンチトロンビンIII
（以下、単にＡＴIII ともいう）を含む溶液中から目的
物であるＡＴIII を分離精製する方法としては、（１）
硫酸アンモニウムなどの中性塩添加、ポリエチレングリ
コールなどの水溶性高分子の添加による分別沈殿法、
（２）分子の荷電を利用したイオン交換クロマトグラフ
ィー法、（３）分子の大きさを利用した分子篩クロマト
グラフィー法、（４）分子の当電点の差を利用する電気
泳動法、（５）ヘパリンなどの特定リガンドとの親和力
を利用するアフィニティクロマトグラフィー法、などが
知られている。2. Description of the Related Art Antithrombin III in blood and plasma
(Hereinafter, also simply referred to as ATIII), a method for separating and purifying ATIII as a target substance from a solution containing (1)
Separation precipitation method by addition of neutral salt such as ammonium sulfate, addition of water-soluble polymer such as polyethylene glycol,
(2) ion-exchange chromatography using the charge of the molecule, (3) molecular sieve chromatography using the size of the molecule, (4) electrophoresis using the difference in the equivalent point of the molecule, (5) Affinity chromatography using affinity for a specific ligand such as heparin is known.

【０００３】しかしながら、上記（５）のアフィニティ
クロマトグラフィー法を除く他の方法（これらを組み合
わせた方法を含む）では、夾雑タンパク質の分離除去が
難しく、何回も操作を繰り返さなければならないことか
ら、回収量が少なく操作が繁雑であるといった欠点があ
る。これに対して上記（５）のアフィニティクロマトグ
ラフィー法では、ＡＴIII の持つリガンドとの特異的な
親和力を利用して分離することから精製操作が簡単であ
り、夾雑物の分離が良く、活性回収率もよい利点をもつ
ものである。[0003] However, in the other methods (including the method combining them) except the affinity chromatography method (5), it is difficult to separate and remove contaminating proteins, and the operation must be repeated many times. There is a disadvantage that the amount of recovery is small and the operation is complicated. On the other hand, in the affinity chromatography method of the above (5), since the separation is carried out by utilizing the specific affinity with the ligand of ATIII, the purification operation is simple, the separation of impurities is good, and the activity recovery rate is high. It also has good advantages.

【０００４】上記（５）のアフィニティクロマトグラフ
ィー法によるＡＴIII の分離精製方法としては、特公昭
５９−７６９４号公報や特開昭６０−４８９３０号公報
などに開示されている方法が知られている。As a method for separating and purifying ATIII by the affinity chromatography method of the above (5), there are known methods disclosed in Japanese Patent Publication No. 59-7694 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-48930.

【０００５】上記公報に記載のＡＴIII の分離精製方法
は、親水性担体にアンヒドロトロンビン等の特定リガン
ドを固定化した吸着剤に、緩衝剤、中性塩溶液および血
漿タンパク質混合液を含むｐＨ６〜８かつイオン強度０
〜１の溶離液を接触させることにより、ＡＴIII を特異
的に吸着せしめ、ｐＨ４．０〜５．５の中性塩溶液ある
いは基質類似物（ここでいう基質類似物とは、トロンビ
ンの競合阻害剤をさす）により溶出することを特徴とす
るものである。詳しくは、実施例によれば、カラム法を
用いる場合は、血漿を６０℃に３分間加熱後、４℃で３
０分間、１５０００ｇで遠心分離し、上澄みを集め０．
２μｍのポアサイズを有するフィルターを用いてろ過す
ることでフィブリノーゲンを除去した血漿を得、該血漿
（４ｍｌ）を不活化トロンビンセファローズカラム（ゲ
ル床容積４ｍｌ）に通液し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）につづいて０．１Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝
液で洗浄後、１ＭＮａＣｌを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．５）で吸着タンパク質を溶出している。これによ
り、極少量の夾雑タンパク質のみを含む純度の高いＡＴ
III が得られている。これをさらに陰イオン交換樹脂カ
ラムクロマトグラフィーにより除去して、高純度のＡＴ
III を得ている。The method for separating and purifying ATIII described in the above-mentioned publication is based on the method of pH 6 to 5 containing a buffer, a neutral salt solution and a plasma protein mixture in an adsorbent in which a specific ligand such as anhydrothrombin is immobilized on a hydrophilic carrier. 8 and ionic strength 0
1 to contact the eluent to specifically adsorb ATIII. The neutral salt solution or the substrate analog having a pH of 4.0 to 5.5 (the substrate analog is a thrombin competitive inhibitor) ). Specifically, according to the examples, when the column method is used, the plasma is heated to 60 ° C. for 3 minutes, and then heated at 4 ° C. for 3 minutes.
Centrifuge at 15000 g for 0 min and collect the supernatant.
Filtration was performed using a filter having a pore size of 2 μm to obtain plasma from which fibrinogen had been removed, and the plasma (4 ml) was passed through an inactivated thrombin Sepharose column (gel bed volume: 4 ml) to give a 50 mM Tris buffer (p
H7.5) followed by washing with the same buffer containing 0.1 M NaCl, then adding 1 M NaCl to 50 mM acetate buffer (pH
The adsorbed protein is eluted in 5.5). As a result, highly pure AT containing only a small amount of contaminating proteins can be obtained.
III has been obtained. This was further removed by anion exchange resin column chromatography to obtain high-purity AT.
III.

【０００６】しかしながら、上記カラム法を工業規模で
行う場合には、該カラム内で、吸着、洗浄、溶出の各操
作をすべて行う必要があり、さらに高純度のＡＴIII を
回収するに陰イオン交換樹脂カラムを用いて処理する必
要があり、最終的にＡＴIIIを分離精製するまでには極
めて長い時間を要するため工業生産性が低く実用的でな
い。However, when the above-mentioned column method is carried out on an industrial scale, it is necessary to carry out all of the operations of adsorption, washing and elution in the column. It is necessary to perform treatment using a column, and it takes an extremely long time to finally separate and purify ATIII. Therefore, the industrial productivity is low and it is not practical.

【０００７】また、回分法を用いる場合には、上記カラ
ム法と同様な操作で加熱によりフィブリノーゲンを除去
した血漿（１００ｍｌ）にアンヒドロトロンビンゲル
（５０ｍｌ）を加え、４℃で３時間撹拌し、グラスフィ
ルター上で吸引しながらアンヒドロトロンビンゲルを回
収し、さらに２５０ｍｌの０．１Ｍ ＮａＣｌを含む５
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、１００ｍ
ｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）でＡＴIII 分画
を溶出している。When the batch method is used, anhydrothrombin gel (50 ml) is added to plasma (100 ml) from which fibrinogen has been removed by heating in the same manner as in the column method, and the mixture is stirred at 4 ° C. for 3 hours. The anhydrothrombin gel is collected while suctioning on a glass filter, and further containing 250 ml of 0.1 M NaCl.
After washing with 0 mM Tris buffer (pH 7.5),
The ATIII fraction was eluted with 1 l of 50 mM acetate buffer (pH 5.5).

【０００８】しかしながら、上記公報に記載の方法で
は、一般に市販されている粒径１０〜１００μｍのアガ
ロースゲル等の親和性の担体を用い、該ゲル担体中の孔
（１００ｎｍ程度）内部に０．０１μｍ以下の糖タンパ
ク質（ＡＴIII ）粒子を取り込み、該孔内に固定化され
たリガンドに特異的に吸着させるものである。However, in the method described in the above-mentioned publication, a commercially available affinity carrier such as agarose gel having a particle size of 10 to 100 μm is used, and 0.01 μm inside the pores (about 100 nm) in the gel carrier. The following glycoprotein (ATIII) particles are taken in and specifically adsorbed to the ligand immobilized in the pores.

【０００９】しかしながら、こうしたアガロースゲル等
の親和性の担体を用いる場合には、孔内部の官能基にリ
カンドを高濃度に固定化するのは難しく、さらに孔内部
のリガンドに目的物のタンパク質を吸着させる際やその
後に目的物分画を溶出し回収する際にも該孔内部の複雑
な経路に阻まれ、孔内部の官能基密度に比して実際に有
効に活用し得る官能基の割合は低く、十分な回収効率が
得られない問題点があった。However, when such an affinity carrier such as agarose gel is used, it is difficult to immobilize the liquid at a high concentration on the functional group inside the pore, and further, the target protein is adsorbed on the ligand inside the pore. When performing and subsequent elution and collection of the target fraction, the ratio of the functional group that can be effectively utilized compared to the functional group density inside the hole is hindered by the complicated route inside the hole. There was a problem that the recovery efficiency was low and sufficient recovery efficiency could not be obtained.

【００１０】上記問題点に対し本発明者らは、機械的強
度および化学的安定性に優れ、広いｐＨ領域で適用可能
な高吸着容量の吸着体とすることのできる有効な表面官
能基を高濃度に持つポリアクリルアミド系超微粒子を特
開平７−１７９５０４号公報においてすでに開示してい
る。さらに、該ポリアクリルアミド系超微粒子に末端官
能性オリゴマーを導入してなるグラフト化超微粒子を特
願平７−８９５６２号および特願平８−１６２２０４号
に提案している。In response to the above problems, the present inventors have developed an effective surface functional group which is excellent in mechanical strength and chemical stability and can be used as an adsorbent having a high adsorption capacity applicable in a wide pH range. A polyacrylamide-based ultrafine particle having a high concentration has already been disclosed in JP-A-7-179504. Further, grafted ultrafine particles obtained by introducing a terminal functional oligomer into the polyacrylamide-based ultrafine particles are proposed in Japanese Patent Application Nos. 7-89562 and 8-162204.

【００１１】上記ポリアクリルアミド系超微粒子では、
これを支持体とし、さらに必要に応じて末端官能性オリ
ゴマーのスペーサを導入したものに、ＡＴIII に対する
特定リガンド、例えば、アンヒドロトロンビンなどを固
定化した超微粒子（親和性吸着体）をＡＴIII の精製分
離用のアフィニティクロマトグラフィーに利用した場
合、単分散性の親和性吸着体表面に固定化された特定リ
ガンドを血液または血漿（媒体）に混合することで、血
液または血漿媒体中の目的物のＡＴIII を特異的に吸着
させることができる。しかしながら、用いる超微粒子
は、その比重が極めて小さいため、目的物のＡＴIII を
吸着しても分散した状態で浮遊している。そのため、そ
の後に目的物のＡＴIII を分離精製するためには該媒体
中より親和性吸着体を分離する必要があるが、単に静置
するだけでは親和性吸着体と媒体との比重差が小さく該
親和性吸着体を完全に沈降分離することができない。In the above-mentioned polyacrylamide-based ultrafine particles,
Ultrafine particles (affinity adsorbent) in which a specific ligand to ATIII, for example, anhydrothrombin, etc. is immobilized on a substrate obtained by using this as a support and further introducing a spacer of a terminal functional oligomer as necessary, and purifying ATIII When used for affinity chromatography for separation, a specific ligand immobilized on the surface of a monodisperse affinity adsorbent is mixed with blood or plasma (vehicle) to obtain ATIII of the target substance in blood or plasma medium. Can be specifically adsorbed. However, since the ultrafine particles used have an extremely small specific gravity, they float in a dispersed state even when the target ATIII is adsorbed. Therefore, in order to subsequently separate and purify the target product ATIII, it is necessary to separate the affinity adsorbent from the medium, but simply standing still has a small specific gravity difference between the affinity adsorbent and the medium. The affinity adsorbent cannot be completely separated by sedimentation.

【００１２】こうした超微粒子からなる該親和性吸着体
を分離する方法としては、カラムクロマトグラフィーに
よる分離精製方法が可能であるが、この場合には一回の
クロマト操作にも極めて長時間を要し、精製を終えるま
でには極めて長い時間を要するため、工業化を図る上
で、その管理などが難しく実用的でない。また、遠心分
離法により該親和性吸着体を分離する場合には、該親和
性吸着体と媒体との密度差が小さく、１万Ｇ以上の回転
数を加えても分離が容易でなく、大きな遠心力を加える
ため血球成分を含む溶液では溶血現象を起こすため血漿
を用いる必要があるが、それでも１万Ｇ以上の回転数を
精製を終えるまでに何度も加えることにより該親和性吸
着体表面に吸着した目的物が損傷を受けたり、親和性吸
着体表面から脱離するなどの問題があり、現在までに超
微粒子による親和性吸着体を簡便な方法を用いて効率的
に分離精製することができないのが現状である。As a method for separating the affinity adsorbent composed of such ultrafine particles, a separation and purification method by column chromatography is possible, but in this case, a single chromatographic operation requires an extremely long time. However, since it takes an extremely long time to complete the refining, it is difficult to manage it for industrialization and it is not practical. When the affinity adsorbent is separated by centrifugation, the difference in density between the affinity adsorbent and the medium is small, and separation is not easy even when a rotation speed of 10,000 G or more is applied, and the separation is large. In the case of a solution containing blood cell components to apply centrifugal force, it is necessary to use plasma to cause a hemolysis phenomenon. Nevertheless, by applying a rotation speed of 10,000 G or more many times before finishing purification, the surface of the affinity adsorbent can be obtained. There is a problem that the target substance adsorbed on the surface is damaged or desorbed from the surface of the affinity adsorbent. To date, it is necessary to efficiently separate and purify the affinity adsorbent using ultrafine particles using a simple method. It is not possible at present.

【００１３】[0013]

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、媒体中のＡＴIII を特異的に吸着してもなお浮
遊分散する単分散性の超微粒子（末端官能性オリゴマー
を導入してなるグラフト化超微粒子を含む）を使った親
和性吸着体を効率よく分離することができるＡＴIII の
分離精製方法を提供するものである。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to provide a monodisperse ultrafine particle (graft obtained by introducing a terminal functional oligomer) which is still suspended and dispersed even when ATIII in a medium is specifically adsorbed. The present invention provides a method for separating and purifying ATIII, which can efficiently separate an affinity adsorbent using an ultra-fine particle.

【００１４】さらに、本発明の他の目的は、媒体中より
分離された親和性吸着体凝集物からＡＴIII を溶出し回
収した後の該親和性吸着体凝集物を再分散することがで
きるＡＴIII の分離精製方法を提供するものである。Further, another object of the present invention is to provide an ATIII which can re-disperse the affinity adsorbate aggregate after eluting and recovering the ATIII from the affinity adsorbate aggregate separated from the medium. It is intended to provide a separation and purification method.

【００１５】[0015]

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成するために、媒体中のＡＴIII を特異的に吸着して
もなお浮遊分散する単分散性の超微粒子（末端官能性オ
リゴマーを導入してなるグラフト化超微粒子を含む）を
使った親和性吸着体の簡便な凝集分離方法について鋭意
研究した結果、支持体となる単分散性の超微粒子は、そ
の表面上に極めて多くの官能基としての側鎖（スペーサ
を導入してなる側鎖を含む）を有しているため、これに
リガンドを固定化してもなおその表面上に官能性の側鎖
が残っており、これをカルボン酸ナトリウム基（−ＣＯ
ＯＮａ）に置換しておく。こうして得られた親和性吸着
体を使って回分法によるアフィニティクロマトグラフィ
ーによりＡＴIII を吸着させた後、多価金属塩を添加し
て特定の条件下（温度、ｐＨなど）におくことにより、
図１に示すように、該多価金属が支持体の超微粒子側鎖
のカルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）間を架橋し
て親和性吸着体凝集物を形成することにより、個々の親
和性吸着体に比して該凝集物の比重が激増し、血液や血
漿などの媒体と大きなな比重差を生じさせることができ
ることを見出だし、これにより短時間放置ないし緩やか
な遠心分離によって簡単に親和性吸着体を分離すること
ができることを知り、この知見に基づき本発明を完成す
るに至ったものである。Means for Solving the Problems To achieve the above object, the present inventors have developed monodisperse ultrafine particles (terminal-functional oligomers) which are still suspended and dispersed even when ATIII in a medium is specifically adsorbed. As a result of diligent research on a simple method for agglomeration and separation of affinity adsorbents (including grafted ultrafine particles introduced), monodisperse ultrafine particles serving as a support have extremely many functional groups on the surface. Since it has a side chain (including a side chain obtained by introducing a spacer) as a group, even if a ligand is immobilized on the side chain, a functional side chain still remains on its surface. Acid sodium group (-CO
ONa). After the ATIII is adsorbed by affinity chromatography by a batch method using the affinity adsorbent thus obtained, a polyvalent metal salt is added thereto, and the mixture is placed under specific conditions (temperature, pH, etc.).
As shown in FIG. 1, the polyvalent metal crosslinks between sodium carboxylate groups (—COONa) on the side chains of the ultrafine particles of the support to form an affinity adsorbent aggregate, whereby individual affinity adsorption is achieved. It has been found that the specific gravity of the aggregate is drastically increased as compared to the body, and that a large specific gravity difference can be caused between the aggregate and a medium such as blood or plasma. The inventors have found that the adsorbent can be separated, and have completed the present invention based on this finding.

【００１６】さらに、本発明者等は、こうした親和性吸
着体凝集物をバイオアフィニテー技術に利用して目的の
ＡＴIII を分離精製する上での技術的な課題は解決でき
たものの、ＡＴIII を分離精製した後の該凝集物は、そ
のままでは血液や血漿等の媒体中に浮遊分散しないた
め、これを再度目的のＡＴIII の吸着などに使用して
も、吸着収効率が極めて低くなり実用的でなくなること
から、１回きりの使い捨てとなるので経済的でないとす
る、実用上の新たな課題を見出だし、この点についても
鋭意検討した結果、ＡＴIII を分離精製した後の親和性
吸着体凝集物を特定の条件下で酸処理することにより、
図２に示すように、該多価金属がはずれてカルボキシル
基の側鎖を有する単分散性の親和性吸着体として再分散
し得ることを知り、この知見に基づきさらなる発明を完
成するに至ったものである。Furthermore, the present inventors have solved the technical problem of separating and purifying the target ATIII by utilizing the affinity adsorbent aggregate for bioaffinity technology, Since the aggregate after purification does not float and disperse in a medium such as blood or plasma as it is, even if it is used again for adsorption of the target ATIII, the adsorption and collection efficiency becomes extremely low and becomes impractical. From this fact, a new practical problem was found that was not economical because it was disposable once, and as a result of intensive studies on this point as well, the affinity adsorbent aggregate after separating and purifying ATIII was identified. By acid treatment under specific conditions,
As shown in FIG. 2, it was found that the polyvalent metal could be removed and redispersed as a monodisperse affinity adsorbent having a carboxyl group side chain, and based on this finding, a further invention was completed. Things.

【００１７】すなわち、本発明の目的は、（１） アン
チトロンビンIII を含む溶液中から該アンチトロンビン
III を親和性吸着体に特異的に吸着させて分離抽出し、
その後該親和性吸着体より該アンチトロンビンIII を溶
出させて回収精製するバイオアフィニティクロマトグラ
フィーによるアンチトロンビンIII の分離精製方法にお
いて、前記アンチトロンビンIII を含む溶液中から該ア
ンチトロンビンIII を分離抽出する手段が、アンチトロ
ンビンIII を含む溶液中にカルボン酸ナトリウム基（−
ＣＯＯＮａ）を有する超微粒子を支持体とする親和性吸
着体を添加して該親和性吸着体表面に固定化されたリガ
ンドにアンチトロンビンIII を特異的に吸着させた後、
該溶液中に水溶性多価金属塩を［Ｍⁿ⁺］／［−ＣＯＯＮ
ａ］（モル比）＝０．１〜１００００（ただし、Ｍは多
価金属であり、ｎは２〜４の整数である）の範囲で添加
し、反応系のｐＨを５〜１３に調製し、反応系内の温度
を０〜９０℃の範囲に保持して親和性吸着体の凝集物を
形成し、該凝集物を分離抽出することを特徴とするアン
チトロンビンIII の分離精製方法により達成される。That is, the object of the present invention is to provide (1) an antithrombin III from a solution containing antithrombin III
III is specifically adsorbed to the affinity adsorbent, separated and extracted,
Then, in a method for separating and purifying antithrombin III by bioaffinity chromatography, in which the antithrombin III is eluted from the affinity adsorbent to recover and purify the antithrombin III, means for separating and extracting the antithrombin III from a solution containing the antithrombin III Is a sodium carboxylate group (−) in a solution containing antithrombin III.
After adding an affinity adsorbent using ultrafine particles having COONa) as a support to specifically adsorb antithrombin III to the ligand immobilized on the surface of the affinity adsorbent,
[ ^{Mn +} ] / [-COON]
a] (molar ratio) = 0.1 to 10,000 (where M is a polyvalent metal and n is an integer of 2 to 4), and the pH of the reaction system is adjusted to 5 to 13. A method for separating and purifying antithrombin III, comprising forming an aggregate of affinity adsorbent while maintaining the temperature in the reaction system in the range of 0 to 90 ° C., and separating and extracting the aggregate. You.

【００１８】また、本発明の目的は、（２） 前記アン
チトロンビンIII を含む溶液が、前記アンチトロンビン
III の分離抽出手段を行ってアンチトロンビンIII を分
離抽出した後の上清であることを特徴とする上記（１）
に示すアンチトロンビンIIIの分離精製方法によっても
達成される。It is another object of the present invention to provide (2) a method in which the solution containing the antithrombin III is
(1) wherein the supernatant is obtained by separating and extracting antithrombin III by the means for separating and extracting III.
The method can also be achieved by the method for separating and purifying antithrombin III shown in (1).

【００１９】なお、本発明の他の目的は、（３） 上記
（１）および／または（２）で分離抽出した多価金属に
より架橋された親和性吸着体凝集物よりアンチトロンビ
ンIII を上清中に溶出させて回収精製した後の沈殿凝集
物を再生する手段が、ｐＨ１〜１０の水系分散媒体中に
該凝集物を添加し、さらに酸を添加して系内を酸性域と
して、温度０〜９０℃の範囲に保持することを特徴とす
るアンチトロンビンIII の分離精製方法により達成され
る。Another object of the present invention is to provide (3) antithrombin III supernatant from the affinity adsorbent aggregate cross-linked by the polyvalent metal separated and extracted in (1) and / or (2) above. Means for regenerating the precipitate aggregate after elution and recovery in the medium is to add the aggregate to an aqueous dispersion medium having a pH of 1 to 10 and further add an acid to make the inside of the system an acidic region, thereby reducing the temperature to 0 ° C. This is achieved by a method for separating and purifying antithrombin III, which is characterized by maintaining the temperature in the range of up to 90 ° C.

【００２０】[0020]

【発明の実施の形態】以下、本発明を実施の形態に基づ
き、より詳細に説明する。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on embodiments.

【００２１】本発明に係るＡＴIII の分離精製方法にお
ける１つの実施の形態として、ＡＴIII を含む溶液中か
ら該ＡＴIII を親和性吸着体に特異的に吸着させて分離
抽出し、その後該親和性吸着体より該ＡＴIII を溶出さ
せて回収精製する回分式のバイオアフィニティクロマト
グラフィー法による一連の工程手順を表した工程図を図
３に示す。In one embodiment of the method for separating and purifying ATIII according to the present invention, the ATIII is specifically adsorbed on an affinity adsorbent from a solution containing ATIII, separated and extracted, and then the affinity adsorbent is extracted. FIG. 3 is a flow chart showing a series of steps by a batch type bioaffinity chromatography method for eluting and collecting and purifying the ATIII.

【００２２】まず最初に、図３の(1) 〜(3) に示すＡＴ
III を含む溶液中から該ＡＴIII を分離抽出する手段と
しては、まず最初にＡＴIII を含む溶液中への親和性吸
着体の混合工程(1) において、ＡＴIII を含む溶液中に
カルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）を有する超微
粒子の支持体を使った親和性吸着体を添加して該親和性
吸着体表面に固定化されているリガンドにＡＴIII を特
異的に吸着させる。続いて、親和性吸着体の凝集工程
（１次）(2) において、該溶液中に水溶性多価金属塩を
［Ｍⁿ⁺］／［−ＣＯＯＮａ］（モル比）＝０．１〜１０
０００（ただし、Ｍは多価金属であり、ｎは２〜４の整
数である）の範囲で添加し、反応系のｐＨを５〜１３に
調製し、反応系内の温度を０〜９０℃の範囲に保持して
親和性吸着体の凝集物を形成する。最後に分離工程(3)
において、該凝集物を自然沈降または緩やかな遠心分離
によって分離抽出するものである。First, the AT shown in FIG. 3 (1) to (3)
As a means for separating and extracting the ATIII from the solution containing the III, first, in the step (1) of mixing the affinity adsorbent into the solution containing the ATIII, the sodium carboxylate group (- An affinity adsorbent using a support of ultrafine particles having COONa) is added to specifically adsorb ATIII to a ligand immobilized on the surface of the affinity adsorbent. Subsequently, in the aggregating step (primary) (2) of the affinity adsorbent, a water-soluble polyvalent metal salt is added to the solution in a ratio of [ ^{Mn +} ] / [-COONa] (molar ratio) = 0.1 to 10%.
000 (where M is a polyvalent metal and n is an integer of 2 to 4), the pH of the reaction system is adjusted to 5 to 13, and the temperature in the reaction system is set to 0 to 90 ° C. To form aggregates of the affinity adsorbent. Finally, the separation process (3)
Wherein the aggregate is separated and extracted by natural sedimentation or gentle centrifugation.

【００２３】本発明の特徴的な構成要件の１つである上
記(1) 〜(3) に示すＡＴIII を含む溶液中から該ＡＴII
I を分離抽出する手段により、該超微粒子の支持体表面
のカルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）間を多価金
属で架橋して親和性吸着体の凝集物を速やかに形成で
き、さらに、こうして親和性吸着体を凝集させることで
分散媒体である血液や血漿等と比重差を生み、これによ
って自然沈降や緩やかな遠心操作により容易に分離する
ことができるものである。The ATII is prepared from a solution containing ATIII shown in the above (1) to (3), which is one of the characteristic constituents of the present invention.
By means of separating and extracting I, the sodium carboxylate groups (-COONa) on the surface of the support of the ultrafine particles can be cross-linked with a polyvalent metal to rapidly form an aggregate of the affinity adsorbent, and further, the affinity By aggregating the hydrophilic adsorbent, a specific gravity difference is generated from blood, plasma, or the like, which is a dispersion medium, so that it can be easily separated by natural sedimentation or gentle centrifugation.

【００２４】上記ＡＴIII の分離抽出手段に用いられる
親和性吸着体を構成する支持体に用いることのできる超
微粒子としては、例えば、本発明者らが既に開示ないし
提案した特開平７−１７９５０４号公報、特願平７−８
９５６２号および特願平８−１６２２０４号に記載され
ているポリアクリルアミド系超微粒子ないし該超微粒子
に末端官能性オリゴマーを導入してなるグラフト化超微
粒子を用いることができる。該超微粒子を製造する方法
に関しても上記公報等に開示ないし提案されている手段
を利用することにより得ることができる。これにより、
親水性を有し、化学的に不活性で、活性化可能な官能基
を（オリゴマーの側鎖のようなスペーサーを介して）高
濃度に有し、機械的強度および化学的安定性に優れ、広
いｐＨ領域で適用でき、疎で強固な多孔性の構造を持つ
球状ゲルで、サイズが均一で高吸着容量の親和性吸着体
とすることができる強固な単分散の超微粒子を得ること
ができる。Ultrafine particles which can be used as a support constituting an affinity adsorbent used in the above-mentioned means for separating and extracting ATIII include, for example, JP-A-7-179504, which has already been disclosed or proposed by the present inventors. , Japanese Patent Application 7-8
It is possible to use polyacrylamide-based ultrafine particles described in Japanese Patent Application No. 9562 and Japanese Patent Application No. 8-162204 or grafted ultrafine particles obtained by introducing a terminal functional oligomer into the ultrafine particles. The method for producing the ultrafine particles can also be obtained by utilizing the means disclosed or proposed in the above-mentioned publications. This allows
It has a hydrophilic, chemically inert, and activatable functional group at a high concentration (via a spacer such as a side chain of an oligomer), and has excellent mechanical strength and chemical stability. It is a spherical gel with a sparse and strong porous structure that can be applied in a wide pH range, and can provide strong monodisperse ultrafine particles that are uniform in size and can be used as an affinity adsorbent with a high adsorption capacity. .

【００２５】これらをより具体的に説明すれば、本発明
の親和性吸着体の支持体として使用することのできる超
微粒子を製造する方法としては、アルコール類の有機溶
媒中にエチレン系不飽和アミドを含む単量体混合物と、
前記単量体混合物と架橋剤との混合物を１００重量％と
して、２５〜５０重量％の範囲とする架橋剤とを溶解さ
せた混合溶液を温度３０〜９５℃に保持し、過酸化物系
開始剤およびアゾ系開始剤よりなる群から選ばれた少な
くとも１種の開始剤を１×１０^-5〜８×１０^-2モル／リ
ットルとなる範囲で添加して重合を行なうことを特徴と
するものであればよい。また、上記超微粒子の製造方法
として好ましくは、分散剤を添加することなく重合を行
なうことを特徴とするものである。さらに、上記超微粒
子の製造方法として好ましくは、前記有機溶媒に水を、
全溶媒１００重量％に対して３０重量％以下の範囲とな
るように添加してなることを特徴とするものである。More specifically, as a method for producing ultrafine particles that can be used as a support for the affinity adsorbent of the present invention, an ethylenically unsaturated amide is dissolved in an organic solvent such as an alcohol. A monomer mixture comprising:
Assuming that the mixture of the monomer mixture and the crosslinking agent is 100% by weight, a mixed solution in which a crosslinking agent in a range of 25 to 50% by weight is dissolved is maintained at a temperature of 30 to 95 ° C. Characterized in that at least one initiator selected from the group consisting of an initiator and an azo-based initiator is added in a range of 1 × 10 ^-5 to 8 × 10 ^-2 mol / l to carry out polymerization. Should be fine. Preferably, the method for producing the ultrafine particles is characterized in that polymerization is carried out without adding a dispersant. Further, as the method for producing the ultrafine particles, preferably, water in the organic solvent,
It is characterized by being added in a range of 30% by weight or less based on 100% by weight of the total solvent.

【００２６】また、上記超微粒子としては、上述の超微
粒子の製造方法によって得られた超微粒子であって、該
超微粒子の吸湿率が１０〜４００％であり、ゲル化率が
４０〜９８％であることを特徴とするものであればよ
い。また、上記超微粒子として好ましくは、前記超微粒
子の粒子径が０．０５〜０．５μｍの範囲であることを
特徴とするものである。The ultrafine particles are ultrafine particles obtained by the above-mentioned method for producing ultrafine particles, wherein the ultrafine particles have a moisture absorption of 10 to 400% and a gelation ratio of 40 to 98%. Any characteristic may be used. Preferably, the ultrafine particles have a particle diameter in the range of 0.05 to 0.5 μm.

【００２７】さらに、本発明の親和性吸着体の超微粒子
の支持体の１種として使用することのできるグラフト化
超微粒子の製造方法としては、溶媒中に表面官能基を有
する粒径０．０５〜０．５μｍのポリアクリルアミド系
超微粒子および末端官能性オリゴマーを添加し、混合撹
拌して該ポリアクリルアミド系超微粒子を分散させると
共に末端官能性オリゴマーを溶解させ、(i) その後に該
溶媒中に縮合剤を添加し反応温度０〜５０℃として（低
温法）、あるいは(ii)その後に反応温度５０〜１００℃
として（高温法）グラフト化反応させることにより、該
ポリアクリルアミド系超微粒子に該末端官能性オリゴマ
ーを導入することを特徴とするものである。ここで、前
記表面官能基は、アミド基、カルボキシル基およびアミ
ノ基のよりなる群から選ばれてなる少なくとも１種であ
ることが望ましく、また前記末端官能性オリゴマーが、
Ｈ₂ Ｎ（ＣＨ₂ ）_n ＣＯＯＨ、Ｈ₂ Ｎ（ＣＨ₂ ）_n ＮＨ
₂、Ｈ₂ Ｎ（ＣＨ₂ ）_n ＳＨおよびＨ₂ Ｎ（ＣＨ₂ ）_n
ＯＨ、ＨＯＯＣ（ＣＨ₂ ）_n ＣＯＯＨ（式中のｎは７以
下の整数である）のいずれか１種であることが望まし
く、さらに、前記ポリアクリルアミド系超微粒子が温度
０〜４０℃で、比重０．３〜１．２であることがより望
ましいものである。Further, as a method for producing grafted ultrafine particles which can be used as one kind of a support for the ultrafine particles of the affinity adsorbent of the present invention, a solvent having a particle diameter of 0.05 having a surface functional group in a solvent is used. ~ 0.5 μm of polyacrylamide-based ultrafine particles and a terminal functional oligomer are added and mixed and stirred to disperse the polyacrylamide-based ultrafine particles and dissolve the terminal-functional oligomer. A condensing agent is added to make the reaction temperature 0 to 50 ° C (low temperature method), or (ii) the reaction temperature is then 50 to 100 ° C.
(High-temperature method) to introduce the terminal-functional oligomer into the polyacrylamide-based ultrafine particles by a grafting reaction. Here, the surface functional group is desirably at least one selected from the group consisting of an amide group, a carboxyl group, and an amino group.
H ₂ N (CH ₂ ) _n COOH, H ₂ N (CH ₂ ) _n NH
₂ , H ₂ N (CH ₂ ) _n SH and H ₂ N (CH ₂ ) _n
OH, HOOC (CH ₂ ) _n COOH (wherein n is an integer of 7 or less), and the polyacrylamide-based ultrafine particles have a specific gravity at a temperature of 0 to 40 ° C. More preferably, it is 0.3 to 1.2.

【００２８】また、上記グラフト化超微粒子としては、
上記製法によって得られたグラフト化超微粒子であっ
て、該グラフト化超微粒子１ｇ当たりの官能基濃度が
０．００１ｍｇ当量以上であることを特徴とするもので
あればよく、主として該超微粒子の表面に末端官能性オ
リゴマーが導入されていることがより好ましいものであ
る。Further, the above-mentioned grafted ultrafine particles include:
The grafted ultrafine particles obtained by the above-mentioned production method may be any as long as the functional group concentration per gram of the grafted ultrafine particles is not less than 0.001 mg equivalent. It is more preferable that a terminal functional oligomer is introduced into the polymer.

【００２９】また、上記ＡＴIII の分離抽出手段に係る
親和性吸着体は、上記超微粒子の支持体に、さらに特定
リガンドが固定化されてなるものである。The affinity adsorbent according to the means for separating and extracting ATIII is obtained by further immobilizing a specific ligand on the support of the ultrafine particles.

【００３０】上記超微粒子に固定化される特定リガンド
としては、他のタンパク質とは結合せず、ＡＴIII のみ
を特異的に吸着し得る性質を有するものが要求される。
こうしたリガンドには、ヘパリンおよびそのアセチル化
誘導体よりＡＴIII 結合部構造を選択的に分取したも
の、アンヒドロトロンビン、トロンビンの不活性化物お
よびアンヒドロトリプシン、アンヒドロキモトリプシン
などを挙げることができる。こうしたリガンドを得る方
法としては、特に制限されるものでなく、従来公知の方
法を適宜利用することができる。ヘパリンおよびそのア
セチル化誘導体よりＡＴIII 結合部構造を選択的に分取
してなるリガンドの場合、例えば、ヘパリンおよびその
アセチル化誘導体を、ヘパリナーゼ等の特異酵素による
消化、あるいは亜硝酸ナトリウム、亜硝酸シソアミル等
による脱アミノ化分解などの方法により分解せしめ、得
られたオリゴ糖をＡＴIII セファローズ、リジンセファ
ローズ等のアフィニティクロマトグラフィー、分子篩ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の
方法により精製することにより得られる。また、アンヒ
ドロトロンビンをリガンドに用いる場合、例えば、精製
トロンビンをｐＨ８．０、イオン強度０．０５のトリス
塩酸緩衝液中で、フェニルメタンスルホニルフルオリド
と反応させ、活性中心セリン残基とエステル結合を形成
し、トロンビン活性を失わせる。その後ｐＨ９．０に調
整し、低温に保ち、エステル結合を解離させると共にセ
リン残基をデヒドロアラニン残基に変換する。次に、上
記支持体を用い、アフィニティクロマトグラフィーを行
い、親和性を示す分画を採取し、アンヒドロトロンビン
として用いるものである。なお、上記精製トロンビン
は、低温エタノール法により得られたコーンペーストII
I 分画より、ポリエチレングリコール沈殿およびＢａＣ
ｌ₂ 沈殿によりプロトロンビン複合体を精製し、牛脳よ
り抽出したトロンボプラスチンにより活性化し、その後
にＤＥＡＥセファデックスカラムクロマトグラフィーお
よびベンズアミンセファロースカラムクロマトグラフィ
ーにより精製したトロンビン等を用いることができる。The specific ligand immobilized on the ultrafine particles is required to have a property capable of specifically adsorbing only ATIII without binding to other proteins.
Examples of such ligands include those obtained by selectively fractionating the structure of the ATIII binding site from heparin and acetylated derivatives thereof, anhydrothrombin, inactivated thrombin, anhydrotrypsin, and anhydrochymotrypsin. The method for obtaining such a ligand is not particularly limited, and a conventionally known method can be appropriately used. In the case of a ligand obtained by selectively fractionating the ATIII binding site structure from heparin or its acetylated derivative, for example, heparin or its acetylated derivative may be digested with a specific enzyme such as heparinase, or sodium nitrite, peroxoamyl nitrite. By deamination by a method such as deamination and the like, and purifying the resulting oligosaccharide by a method such as affinity chromatography such as ATIII Sepharose and Lysine Sepharose, molecular sieve chromatography, and ion exchange chromatography. . When anhydrothrombin is used as a ligand, for example, purified thrombin is reacted with phenylmethanesulfonyl fluoride in a Tris-HCl buffer having a pH of 8.0 and an ionic strength of 0.05 to form an active center serine residue and an ester bond. To cause loss of thrombin activity. Thereafter, the pH is adjusted to 9.0, the temperature is kept low, the ester bond is dissociated, and the serine residue is converted to a dehydroalanine residue. Next, affinity chromatography is performed using the above support, and fractions showing affinity are collected and used as anhydrothrombin. The purified thrombin was obtained from corn paste II obtained by a low-temperature ethanol method.
From fraction I, polyethylene glycol precipitation and BaC
Purification of the prothrombin complex by l ₂ precipitation, activated by thromboplastin extracted from bovine brain can be used subsequently to DEAE Sephadex column chromatography and thrombin was purified by benz amine Sepharose column chromatography and the like.

【００３１】また、上記リガンドを支持体に固定化して
親和性吸着体を得る方法としては、特に制限されるもの
でなく、従来公知の固定化技術を適宜利用することがで
きる。上記ヘパリンおよびそのアセチル化誘導体よりＡ
ＴIII 結合部構造を選択的に分取してなるリガンドを上
記支持体に強固に固定化する結合法としては、例えば、
(i) 水溶性カルボジイミド存在下における該リガンドの
カルボキシル基と上記支持体のアミノ基（あるいは、ヒ
ドラジド基、チオール基）との脱水反応による方法、(i
i)該リガンド還元末端のアルデヒド基と上記支持体のア
ミノ基とで形成するシッフ塩基を還元アルキル化する方
法、(iii) エポキシ活性化した支持体と該リガンドの水
酸基とを結合させる方法、(iv)ハロゲン化トリアジン等
の架橋試薬を用いる方法等を用いることができる。な
お、該リガンドにアミノ基が存在し、結合反応において
該リガンド相互間の結合が予想される場合には、無水酢
酸によりアミノ基を不活性化しておくことが望ましい。
また、アンヒドロトロンビンを固定する場合には、本発
明者らが既に開示した特開平７−１７９５０４号公報あ
るいは特願平７−８９５６２号および特願平８−１６２
２０４号に記載されているポリアクリルアミド系超微粒
子あるいはポリアクリルアミド系超微粒子に末端官能性
オリゴマーを導入してなるグラフト化超微粒子をもとに
して特定リガンドの固定化に適当な官能基としてカルボ
キシレート、アミノ酸を高濃度に置換導入し固定化する
ことができる。The method for obtaining the affinity adsorbent by immobilizing the ligand on a support is not particularly limited, and a conventionally known immobilization technique can be appropriately used. From the above heparin and its acetylated derivative, A
Examples of a binding method for firmly immobilizing a ligand obtained by selectively fractionating the TIII binding site structure on the support include:
(i) a method comprising a dehydration reaction between a carboxyl group of the ligand and an amino group (or hydrazide group or thiol group) of the support in the presence of a water-soluble carbodiimide,
i) a method of reductively alkylating a Schiff base formed by an aldehyde group at the ligand reducing end and an amino group of the support, (iii) a method of bonding an epoxy-activated support to a hydroxyl group of the ligand, iv) A method using a crosslinking reagent such as a halogenated triazine or the like can be used. When an amino group is present in the ligand and a bond between the ligands is expected in a binding reaction, it is preferable to inactivate the amino group with acetic anhydride.
Further, when anhydrothrombin is immobilized, Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-179504 or Japanese Patent Application Nos. 7-89562 and 8-162 previously disclosed by the present inventors.
No. 204, a polyacrylamide-based ultrafine particle or a grafted ultrafine particle obtained by introducing a terminal functional oligomer into a polyacrylamide-based ultrafine particle, a carboxylate as a functional group suitable for immobilizing a specific ligand. In addition, amino acids can be substituted at a high concentration and immobilized.

【００３２】上記固定化したリガンドに対する適正ｐＨ
は、通常５〜１４、好ましくは６〜１２、より好ましく
は７〜１０の範囲である。すなわち、例えば、アンヒド
ロトロンビンなどでは、中性から弱アルカリ性の範囲で
あれば、安定な活性部位としてＡＴIII を特異的に吸着
し得るものである。一方、アンヒドロトリプシンなどで
は、一般にｐＨ３〜７の酸性範囲で安定な活性部位とし
てＡＴIII を特異的に吸着し得るものであるが、一旦吸
着してしまえば、その後、系内を中性もしくはアルカリ
性に変えて架橋・凝集反応を行った場合であっても、リ
ガンドであるアンヒドロトリプシンに吸着したＡＴIII
は安定に保持される。Appropriate pH for the immobilized ligand
Is usually in the range of 5 to 14, preferably 6 to 12, and more preferably 7 to 10. That is, for example, anhydrothrombin can specifically adsorb ATIII as a stable active site in a neutral to weakly alkaline range. On the other hand, anhydrotrypsin and the like are generally capable of specifically adsorbing ATIII as a stable active site in an acidic range of pH 3 to 7, but once adsorbed, the system is then neutralized or alkaline. ATIII adsorbed on the ligand anhydrotrypsin even when the crosslinking / aggregation reaction was performed instead of
Is kept stable.

【００３３】なお、支持体の超微粒子表面にカルボン酸
ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）を持たせるには、上記超
微粒子の表面アミド基をｐＨ１０．５以上のアルカリ状
態を保つように、例えば、Ｎａ₂ ＣＯ₃ を濃度０．０４
〜２モル／ｌ、温度４０〜８０℃で２〜８時間反応させ
ることにより、カルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮ
ａ）へ交換した超微粒子（以下、マトリックスないし単
にＣＭとも記す）とすることができる。なお、グラフト
化超微粒子は、カルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮ
ａ）へ交換したマトリックスに、末端官能性オリゴマー
であるスペーサ（以下、単にＳとも記す）がグラフト化
反応により導入されたマトリックス（以下、単にＣＭ−
Ｓとも記す）であり、カルボン酸ナトリウム基（−ＣＯ
ＯＮａ）を有する超微粒子支持体（若しくは親和性吸着
体）の１種であるといえる。In order to provide a sodium carboxylate group (—COONa) on the surface of the ultrafine particles of the support, the surface amide groups of the ultrafine particles may be maintained in an alkaline state at pH 10.5 or more, for example, with Na _2. CO ₃ concentration 0.04
By reacting at a temperature of 40 to 80 ° C. for 2 to 8 hours, a sodium carboxylate group (—COON
Ultrafine particles (hereinafter also referred to as a matrix or simply CM) exchanged for a) can be used. In addition, the grafted ultrafine particles are composed of a sodium carboxylate group (—COON).
a) a matrix (hereinafter simply referred to as CM-) in which a spacer which is a terminal functional oligomer (hereinafter, also simply referred to as S) is introduced by a grafting reaction into the matrix exchanged into a).
S) and a sodium carboxylate group (—CO
It can be said that it is one type of an ultrafine particle support (or an affinity adsorbent) having ONa).

【００３４】また、上記ＡＴIII の分離抽出手段の上記
混合工程(1) において用いられるＡＴIII を含む溶液と
しては、水またはアルコール類の有機媒体に血液または
血漿を加えた混合溶液に、さらに緩衝液および中性塩を
共存させたものである。さらに、撹拌混合により親和性
吸着体にＡＴIII を吸着するには、上記緩衝液として
は、ｐＨが通常６〜８、好ましくは６．５〜７．５で、
かつイオン強度が通常０〜１．０、好ましくは０．０２
〜０．５である。上記緩衝液としては、ｐＨ６〜８域を
示す緩衝液を任意に選ぶことができるが、特にトリス緩
衝液、リン酸緩衝液が好ましく、中性塩としても、任意
に選ぶことができるが、特にＮａＣｌ、ＫＣｌである。
また、上記ＡＴIII 含有溶液に用いられるアルコール類
の有機媒体としては、例えば、メタノール、エタノー
ル、プロパノール、イソプロパノール、１−ブタノー
ル、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、１−ペン
タノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、ｔ−
ペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノ
ール、３−ヘキサノールなどの１価アルコール、エチレ
ングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレング
リコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコ
ール、１，３−ブチレングリコール、ネオペンチルグリ
コール、ペンタメチレングリコール、ヘキサメチレング
リコールなどの２価アルコール、グリセロールなどの３
価アルコール、エチレングリコールモノメチルエーテ
ル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレン
グリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモ
ノイソブチルエーテルなど炭素数１〜６のアルコール類
のほか、分子量６０００以下、好ましくは４０００以下
のポリエチレングリコールなどが挙げられる。これらの
有機媒体は、単独で用いることもできるが、２種以上を
混合して用いることも可能である。The ATIII-containing solution used in the mixing step (1) of the above-mentioned ATIII separation / extraction means may be a mixed solution obtained by adding blood or plasma to water or an organic medium of alcohols, a buffer solution and Neutral salt coexists. Further, in order to adsorb ATIII to the affinity adsorbent by stirring and mixing, the pH of the buffer is usually 6 to 8, preferably 6.5 to 7.5.
And an ionic strength of usually 0 to 1.0, preferably 0.02
０．５0.5. As the buffer, a buffer exhibiting a pH range of 6 to 8 can be arbitrarily selected. In particular, Tris buffer and phosphate buffer are preferable, and neutral salts can also be arbitrarily selected. NaCl and KCl.
Examples of the organic medium of alcohols used in the ATIII-containing solution include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, 1-butanol, 2-butanol, t-butyl alcohol, 1-pentanol, 2-pentanol, and the like. 3-pentanol, t-
Monohydric alcohols such as pentyl alcohol, 1-hexanol, 2-hexanol and 3-hexanol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, neopentyl glycol, pentamethylene glycol , Dihydric alcohols such as hexamethylene glycol, and 3 such as glycerol
In addition to alcohols having 1 to 6 carbon atoms such as polyhydric alcohols, ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethyl ether, ethylene glycol monobutyl ether, and ethylene glycol monoisobutyl ether, polyethylene glycol having a molecular weight of 6000 or less, preferably 4000 or less, and the like. Can be These organic media can be used alone or in combination of two or more.

【００３５】さらに上記アルコール類の有機媒体には、
例えば、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコー
ル、ポリビニルアルコール、ポリビニルカルバゾール等
の有機高分子系の分散媒体を用いてもよい。Further, the organic medium of the alcohols includes:
For example, an organic polymer-based dispersion medium such as polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, and polyvinyl carbazole may be used.

【００３６】なお、血漿タンパク質の１つにフィブリノ
ーゲンがある。血液が体外にでると凝固するが、これは
フィブリノーゲンがフィブリンとなって血栓を作ること
が原因となっている。したがって、アフィニティクロマ
トグラフィー（上記(1) 〜(3) のＡＴIII の分離抽出工
程）においてもフィブリンが析出し、支持体に付着す
る。この現象を防ぐため、フィブリンを除く前処理を行
うことが望ましい。[0036] One of the plasma proteins is fibrinogen. When blood leaves the body, it clots, which is caused by fibrinogen becoming fibrin and forming a thrombus. Therefore, fibrin also precipitates in the affinity chromatography (the above (1) to (3) steps of separating and extracting ATIII) and adheres to the support. In order to prevent this phenomenon, it is desirable to perform a pretreatment excluding fibrin.

【００３７】また、上記溶液中のＡＴIII 含有量は、通
常１９０〜３５０ｍｇ／ｌ、好ましくは２００〜３００
ｍｇ／ｌの範囲で含有されているものを用いることが望
ましい。該含有量が１９０ｍｇ／ｌ未満の場合には、親
和性吸着体にＡＴIII を接触させ特異的に吸着させるの
に接触頻度が低く長時間を要する。一方、３５０ｍｇ／
ｌを越える場合には、こうした高含有量の溶液を準備す
るのに濃縮処理等多くの前処理を要するため経済的でな
い。The ATIII content in the above solution is usually 190 to 350 mg / l, preferably 200 to 300 mg / l.
It is desirable to use those contained in the range of mg / l. When the content is less than 190 mg / l, the contact frequency is low and a long time is required for contacting ATIII with the affinity adsorbent for specific adsorption. On the other hand, 350 mg /
When the amount exceeds 1, it is not economical because many pretreatments such as a concentration treatment are required to prepare such a high-content solution.

【００３８】また、上記ＡＴIII を含む溶液中への親和
性吸着体の添加量としては、特に制限されるものでない
が、ＡＴIII の処理量に応じて変化させることができる
が、ＡＴIII 含有溶液１００ｍｌに対し通常１０ｍｇ〜
５０ｇ、好ましくは３０ｍｇ〜３０ｇ、より好ましくは
５０ｍｇ〜１０ｇの範囲である。上記親和性吸着体の添
加量が、１０ｍｇ未満の場合には、表面官能基濃度が低
いため、リガンドとＡＴIII の結合量も少なくなり、目
的物を効率よく吸着できず、また、５０ｇを越える場合
には、粒子濃度が高くなりすぎ、分散状態が不安定とな
るので好ましくない。The amount of the affinity adsorbent to be added to the above-mentioned ATIII-containing solution is not particularly limited, but can be changed according to the treatment amount of ATIII. Usually 10mg ~
The range is 50 g, preferably 30 mg to 30 g, more preferably 50 mg to 10 g. When the addition amount of the affinity adsorbent is less than 10 mg, the concentration of the surface functional group is low, so that the amount of binding between the ligand and ATIII is also small, and the target substance cannot be efficiently adsorbed. However, it is not preferable because the particle concentration becomes too high and the dispersion state becomes unstable.

【００３９】上記混合工程(1) では、上述した各種原材
料などを用いて、ＡＴIII を含む溶液中にカルボン酸ナ
トリウム基（−ＣＯＯＮａ）を有する超微粒子の支持体
を使った親和性吸着体を添加して、該溶液を撹拌し混合
するバイオアフィニティクロマトグラフィーの回分法を
用いることで、該親和性吸着体にＡＴIII 含有溶液を接
触させ、これにより該親和性吸着体表面に固定化されて
いるリガンドにＡＴIII を特異的に吸着させる。かかる
溶液の撹拌混合条件としては、０〜４℃の比較的低温で
比較的緩やかな撹拌力により２時間以上混合を行う。In the mixing step (1), an affinity adsorbent using a support of ultrafine particles having a sodium carboxylate group (—COONa) is added to a solution containing ATIII using the above-mentioned various raw materials. Then, by using the batch method of bioaffinity chromatography in which the solution is stirred and mixed, the affinity adsorbent is brought into contact with an ATIII-containing solution, whereby the ligand immobilized on the surface of the affinity adsorbent is Specifically adsorbs ATIII. As a condition of stirring and mixing such a solution, mixing is performed at a relatively low temperature of 0 to 4 ° C. and a relatively gentle stirring force for 2 hours or more.

【００４０】上記ＡＴIII の分離抽出手段では、続い
て、上記凝集工程(2) を行うが、ここで用いられる水溶
性多価金属塩中の多価金属の種類としては、例えば、カ
ルシウム、マグネシウムなどの２価のアルカリ土類金
属、銅、アルミニウム、鉄などの２〜４価の遷移金属が
挙げられるが、バイオアフィニテーに利用する場合に
は、生体毒性のないカルシウムおよびマグネシウムなど
の２価のアルカリ土類金属が好ましい。また、多価金属
塩としては、多価金属の塩化物、硫化物、炭酸化合物、
水酸化化合物およびそれらの錯塩（錯合体）などを挙げ
ることができる。In the above-mentioned means for separating and extracting ATIII, the above-mentioned aggregation step (2) is performed. The kind of polyvalent metal in the water-soluble polyvalent metal salt used here is, for example, calcium, magnesium, etc. Divalent alkaline earth metals, and bivalent to tetravalent transition metals such as copper, aluminum and iron. When used for bioaffinity, divalent alkali metals such as calcium and magnesium having no biotoxicity are used. Alkaline earth metals are preferred. Further, as the polyvalent metal salt, chloride, sulfide, carbonate compound of the polyvalent metal,
Examples include a hydroxyl compound and a complex salt (complex) thereof.

【００４１】該多価金属の添加量としては、［Ｍⁿ⁺］／
［−ＣＯＯＮａ］（モル比）＝０．１〜１００００、好
ましくは０．５〜７０００、より好ましくは１．０〜５
０００（ただし、Ｍは多価金属であり、ｎは２〜４の整
数である）の範囲である。該添加量が［Ｍⁿ⁺］／［−Ｃ
ＯＯＮａ］（モル比）＜０．１となる場合には、多価金
属が不足するため、親和性吸着体の凝集化が不十分で、
沈降せずになお浮遊分散した状態の親和性吸着体が多く
残るなど、分離が十分に行えないため好ましくなく、
［Ｍⁿ⁺］／［−ＣＯＯＮａ］（モル比）＞１００００と
なる場合には、架橋により親和性吸着体の凝集物が形成
し完全に沈降分離することができるが、添加によるさら
なる作用・効果は発現できず、過剰な多価金属が媒体中
に残されることになるだけで経済的でない。The amount of the polyvalent metal added is [M ^{n +} ] /
[-COONa] (molar ratio) = 0.1 to 10,000, preferably 0.5 to 7000, more preferably 1.0 to 5
000 (where M is a polyvalent metal and n is an integer of 2 to 4). When the amount added is [ ^{Mn +} ] / [-C
[ONa] (molar ratio) <0.1, the polyvalent metal is insufficient, and the agglomeration of the affinity adsorbent is insufficient.
It is not preferable because separation can not be performed sufficiently, such as remaining a lot of affinity adsorbents in a suspended and dispersed state without sedimentation,
When [ ^{Mn +} ] / [-COONa] (molar ratio)> 10000, the aggregates of the affinity adsorbents can be formed by crosslinking to completely settle and separate, but the additional action and effect of the addition are It is not economical because it cannot be expressed and only excess polyvalent metal is left in the medium.

【００４２】また、上記凝集工程(2) では、上記溶液中
に水溶性多価金属塩を添加し、反応系のｐＨを通常５〜
１３、好ましくは６〜１２、より好ましくは６．５〜１
１に調製し、反応系の温度を０〜９０℃、好ましくは４
〜７０℃、より好ましくは１０〜５０℃の範囲に保持保
持することにより、図１に示すように、親和性吸着体
（超微粒子）表面の側鎖のカルボン酸ナトリウム基（−
ＣＯＯＮａ）間に多価金属イオン（Ｍⁿ⁺）が結合架橋し
て親和性吸着体凝集物を形成する。これにより、後述す
る分離工程(3) で、例えば、３時間程度放置することに
より、または１５００Ｇ×１５分間の緩やかな遠心分離
により、溶液中の該親和性吸着体凝集物を容易に沈降さ
せることができるものである。なお、上記反応系のｐＨ
が５未満の場合には、多価金属イオンによる架橋反応が
起こりにくく、また、リガンドが変性などによりその機
能発現ができなくなり、ｐＨが１３を越える場合には、
多価金属イオンによる架橋反応が同様に起こりにくく、
また、リガンドが変性などによりその機能発現ができな
くなり好ましくない。該ｐＨの調製には、例えば、塩
酸、硫酸、燐酸などの無機塩およびそのアルカリ塩、酢
酸、マレイン酸、クエン酸、アスコルビン酸などの有機
酸およびそのアルカリ塩、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カル
シウムなどを用いることができる。In the aggregating step (2), a water-soluble polyvalent metal salt is added to the solution, and the pH of the reaction system is usually adjusted to 5 to 5.
13, preferably 6-12, more preferably 6.5-1
1 and the temperature of the reaction system is 0 to 90 ° C, preferably 4 ° C.
By maintaining and maintaining the temperature in the range of -70 ° C, more preferably in the range of 10-50 ° C, as shown in FIG. 1, the sodium carboxylate group (-
COONa), the polyvalent metal ion (M ^{n +} ) binds and crosslinks to form an affinity adsorbent aggregate. Thus, in the separation step (3) described later, for example, the affinity adsorbent aggregates in the solution can be easily settled by leaving the mixture for about 3 hours or by gentle centrifugation at 1500 G × 15 minutes. Can be done. The pH of the above reaction system
Is less than 5, a cross-linking reaction by polyvalent metal ions is unlikely to occur, and the function cannot be exhibited due to denaturation of the ligand.
Cross-linking reaction by polyvalent metal ions is also unlikely to occur,
Further, it is not preferable because the function cannot be expressed due to denaturation of the ligand. For adjusting the pH, for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, inorganic salts such as phosphoric acid and alkali salts thereof, acetic acid, maleic acid, citric acid, organic acids such as ascorbic acid and alkali salts thereof, sodium hydroxide, potassium hydroxide, Calcium hydroxide, sodium carbonate, calcium carbonate and the like can be used.

【００４３】また、上記反応系の温度が０℃未満の場合
には、架橋・凝集反応しにくくなるほか、場合によって
は溶液が凝固するおそれがあるなど好ましくない。また
９０℃を越える場合には、導入スペーサーの分解や、リ
ガンドの変性が起こる可能性があり好ましくない。If the temperature of the above reaction system is lower than 0 ° C., it is not preferable because the crosslinking / agglutination reaction becomes difficult and the solution may be solidified in some cases. If the temperature exceeds 90 ° C., decomposition of the introduced spacer and denaturation of the ligand may occur, which is not preferable.

【００４４】次に、上記ＡＴIII の分離抽出手段では、
最後に上記分離工程(3) を行う。該分離工程(3) では、
上記凝集工程(2) で得られた親和性吸着体凝集物を自然
沈降または緩やかな遠心分離によって分離抽出するもの
である。自然沈降による分離では、上記凝集工程(2) の
反応系を０〜４℃の比較的低温下で３時間程度放置する
ことにより、溶液中の該親和性吸着体凝集物を容易に自
然沈降させることができ、このうち上清部分を廃棄・除
去することにより該親和性吸着体凝集物を簡便に分離抽
出することができる。一方、緩やかな遠心操作による分
離では、上記反応系の溶液を遠心分離器にかけて、０〜
４℃の比較的低温下で、１５００〜３０００Ｇ×５〜３
０分間遠心分離することで、溶液中の該親和性吸着体凝
集物を容易に沈降分離させることができ、このうち上清
部分を廃棄・除去することにより該親和性吸着体凝集物
を簡便に分離抽出することができる。Next, in the above-mentioned ATIII separation and extraction means,
Finally, the separation step (3) is performed. In the separation step (3),
The affinity adsorbent aggregate obtained in the aggregation step (2) is separated and extracted by natural sedimentation or gentle centrifugation. In the separation by spontaneous sedimentation, the affinity adsorbate aggregates in the solution are easily spontaneously sedimented by leaving the reaction system in the aggregating step (2) at a relatively low temperature of 0 to 4 ° C. for about 3 hours. The affinity adsorbate aggregate can be easily separated and extracted by discarding and removing the supernatant portion. On the other hand, in the separation by gentle centrifugation, the solution of the reaction system is centrifuged,
Under relatively low temperature of 4 ° C, 1500-3000G × 5-3
By centrifuging for 0 minutes, the affinity adsorbent aggregate in the solution can be easily settled and separated, and the affinity adsorbate aggregate can be easily separated by discarding and removing the supernatant. Can be separated and extracted.

【００４５】上記分離工程(3) により、沈殿した親和性
吸着体凝集物(4) と上清に分離される。このうち上清に
ついては、ＡＴIII を含む上清中から該ＡＴIII を分離
抽出する一連の工程（手段）、すなわち、図３に示すよ
うに、上清への親和性吸着体の混合工程(5) から、親和
性吸着体の凝集工程（２次）を経て分離工程(7) に至る
一連の工程に付される。まず、ＡＴIII を含む上清中へ
の親和性吸着体の混合工程(5) では、ＡＴIII を含む上
清中にカルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）を有す
る超微粒子の支持体を使った親和性吸着体を添加して該
親和性吸着体表面に固定化されているリガンドにＡＴII
I を特異的に吸着させる。続いて、親和性吸着体の凝集
工程（２次）(6) では、該溶液中に水溶性多価金属塩を
［Ｍⁿ⁺］／［−ＣＯＯＮａ］（モル比）＝０．１〜１０
０００（ただし、Ｍは多価金属であり、ｎは２〜４の整
数である）の範囲で添加し、反応系のｐＨを５〜１３に
調製し、反応系内の温度を０〜９０℃の範囲に保持して
親和性吸着体の凝集物を形成する。最後に分離工程(7)
では、該凝集物を自然沈降または緩やかな遠心分離によ
って分離抽出するものである。In the separation step (3), the precipitated affinity adsorbent aggregate (4) and the supernatant are separated. Among them, for the supernatant, a series of steps (means) for separating and extracting the ATIII from the supernatant containing ATIII, that is, as shown in FIG. 3, a step of mixing the affinity adsorbent with the supernatant (5) Is subjected to a series of steps from an agglutination step (secondary) of the affinity adsorbent to a separation step (7). First, in the step (5) of mixing the affinity adsorbent into the supernatant containing ATIII, the affinity adsorption using an ultrafine particle having a sodium carboxylate group (-COONa) in the supernatant containing ATIII using a support is used. To the ligand immobilized on the surface of the affinity adsorbent by adding ATII
Adsorb I specifically. Subsequently, in the affinity adsorbent aggregating step (secondary) (6), a water-soluble polyvalent metal salt is added to the solution in the ratio [ ^{Mn +} ] / [-COONa] (molar ratio) = 0.1 to 10%.
000 (where M is a polyvalent metal and n is an integer of 2 to 4), the pH of the reaction system is adjusted to 5 to 13, and the temperature in the reaction system is set to 0 to 90 ° C. To form aggregates of the affinity adsorbent. Finally, the separation process (7)
In this method, the aggregate is separated and extracted by natural sedimentation or gentle centrifugation.

【００４６】これらの工程(5) 〜(7) に示す、本発明の
特徴的な構成要件の１つであるＡＴIII を含む上清中か
ら該ＡＴIII を分離抽出する手段により、該超微粒子の
支持体表面のカルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）
間を多価金属で架橋して親和性吸着体の凝集物を速やか
に形成でき、さらに、こうして親和性吸着体を凝集させ
ることで分散媒体である上清と比重差を生み、これによ
って自然沈降や緩やかな遠心操作により容易に分離する
ことができるものである。The ultrafine particles are supported by means for separating and extracting the ATIII from the supernatant containing ATIII, which is one of the characteristic components of the present invention, as shown in these steps (5) to (7). Sodium carboxylate group on body surface (-COONa)
Agglomerates of the affinity adsorbent can be quickly formed by bridging the space with a polyvalent metal, and further, by agglomerating the affinity adsorbent in this way, a specific gravity difference is generated with the supernatant, which is the dispersion medium, thereby causing natural sedimentation. It can be easily separated by gentle centrifugation.

【００４７】上記工程(5) 〜(7) に示す一連の分離抽出
操作（手段）は、先述した工程(1)〜(3) の一連の分離
抽出操作（手段）におけるＡＴIII を含む血液や血漿な
どの溶液に代えてＡＴIII を含む上清を用いる以外は、
先述した工程(1) 〜(3) の一連の分離抽出操作（手段）
と同様のものを用いて同様の操作にて行うことができ
る。The series of separation / extraction operations (means) shown in the above steps (5) to (7) are the same as those described above in the series of separation / extraction operations (means) of steps (1) to (3). Except that the supernatant containing ATIII is used instead of the solution such as
A series of separation and extraction operations (means) of the above-mentioned steps (1) to (3)
The same operation can be performed using the same one as described above.

【００４８】上記分離工程(7) により、沈殿した親和性
吸着体凝集物(8) と上清とに分離される。このうち上清
については、図３の工程図に示すように、上清廃棄(12)
処分に付される。一方、分離工程(7) で得られた親和性
吸着体凝集物(8) と、先の分離工程(3) で得られた親和
性吸着体凝集物(4) とは、合せる(9) 操作により、一つ
にまとめられる。In the separation step (7), the separated affinity adsorbent aggregate (8) and the supernatant are separated. The supernatant was discarded as shown in the process diagram of FIG.
Subjected to disposal. On the other hand, the affinity adsorbate aggregate (8) obtained in the separation step (7) and the affinity adsorbate aggregate (4) obtained in the previous separation step (3) are combined (9) Are combined into one.

【００４９】１つにまとめられるた親和性吸着体凝集物
は、１次洗浄(10)される。該洗浄方法としては、特に制
限されるものでなく、従来公知の洗浄方法を適宜選択し
て使用することができる。１例を挙げれば、１つにまと
められるた親和性吸着体凝集物に５０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、４℃
下で十分に撹拌し洗浄を行うものである。The combined affinity adsorbent aggregates are first washed (10). The washing method is not particularly limited, and a conventionally known washing method can be appropriately selected and used. In one example, 50 mM Tris-HCl buffer (0.1 M NaCl, pH 7.5) is added to the combined affinity adsorbent aggregates at 4 ° C.
The washing is carried out with sufficient stirring below.

【００５０】その後、凝集物を沈降（自然沈降または緩
やかな遠心）(11)される。該沈降（自然沈降または緩や
かな遠心）(11)では、親和性吸着体が凝集物の形態をと
るため、自然に放置することで約２〜３時間程度で完全
に沈降させることができ、または１５００〜３０００Ｇ
で５〜３０分の緩やかな遠心により完全に沈降させるこ
とができる。Thereafter, the aggregate is sedimented (natural sedimentation or gentle centrifugation) (11). In the sedimentation (natural sedimentation or gentle centrifugation) (11), since the affinity adsorbent takes the form of aggregates, it can be completely sedimented in about 2 to 3 hours by allowing it to stand naturally, or 1500-3000G
And complete sedimentation by gentle centrifugation for 5 to 30 minutes.

【００５１】続いて、上記沈降（自然沈降または緩やか
な遠心）(11)により生じた上清を図３に示すように、上
清廃棄(12)により処理する。Subsequently, the supernatant generated by the sedimentation (natural sedimentation or gentle centrifugation) (11) is treated by discarding the supernatant (12) as shown in FIG.

【００５２】一方、沈殿した凝集物に対してさらに２次
洗浄(13)を行う。該洗浄方法としては、特に制限される
ものでなく、従来公知の洗浄方法を適宜選択して使用す
ることができる。１例を挙げれば、先述の１次洗浄と同
様に、沈殿した親和性吸着体凝集物に５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、
４℃下で十分に撹拌し洗浄を行うものである。On the other hand, the precipitated aggregate is further subjected to a secondary washing (13). The washing method is not particularly limited, and a conventionally known washing method can be appropriately selected and used. In one example, similar to the primary washing described above, 50 mM Tris-HCl buffer (0.1 M NaCl, pH 7.5) was added to the precipitated affinity adsorbent aggregate,
The washing is carried out by sufficiently stirring at 4 ° C.

【００５３】その後、凝集物を沈降（自然沈降または緩
やかな遠心）(14)される。該沈降（自然沈降または緩や
かな遠心）(14)では、親和性吸着体が凝集物の形態をと
るため、自然に放置することで約２〜３時間程度で完全
に沈降させることができ、または１５００〜３０００Ｇ
で５〜３０分間の緩やかな遠心により完全に沈降させる
ことができる。Thereafter, the aggregate is sedimented (natural sedimentation or gentle centrifugation) (14). In the sedimentation (natural sedimentation or gentle centrifugation) (14), since the affinity adsorbent takes the form of aggregates, it can be completely sedimented in about 2 to 3 hours by allowing it to stand naturally, or 1500-3000G
And complete centrifugation by gentle centrifugation for 5 to 30 minutes.

【００５４】続いて、上記沈降（自然沈降または緩やか
な遠心）(14)により生じた上清を図３に示すように、上
清廃棄(12)により処理する。Subsequently, the supernatant generated by the sedimentation (natural sedimentation or gentle centrifugation) (14) is treated by discarding the supernatant (12) as shown in FIG.

【００５５】一方、洗浄された凝集物(15)は、ＡＴIII
の分離工程(16)に付される。該ＡＴIII の分離工程(16)
では、回分式のアフィニティークロマトグラフィー法に
より、ＡＴIII の活性を安定に保存するために、低温下
で、例えば、０〜４℃の範囲内で、溶出液中に凝集物(1
5)を添加し、撹拌混合して凝集物(15)に吸着しているＡ
ＴIII を液中に溶出させる。On the other hand, the washed aggregate (15)
In the separation step (16). ATIII separation step (16)
In order to preserve the activity of ATIII stably by batch-type affinity chromatography at low temperature, for example, in the range of 0 to 4 ° C, the aggregate (1
5) is added, and the mixture is stirred and mixed.
TIII is eluted in the solution.

【００５６】前記溶出液としては、特に制限されるもの
でなく、従来公知のＡＴIII の溶出液を用いることがで
き、例えば、ｐＨ５．０〜５．５で、イオン強度１〜４
の緩衝液と中性塩溶液からなる溶出液、またはｐＨ４．
０〜５．５の基質類似物を用いてなる溶出液を用いるこ
とができる。The eluate is not particularly limited, and a conventionally known eluate of ATIII can be used. For example, pH 5.0 to 5.5, ionic strength 1 to 4
Eluate consisting of a buffer solution and a neutral salt solution, or pH 4.
An eluate using 0 to 5.5 substrate analogs can be used.

【００５７】このうち上記緩衝液としては、ｐＨ４．０
〜５．５のｐＨ域を示す緩衝液を任意に選ぶことができ
るが、特に酢酸緩衝液が良く、前記中性塩溶液として
は、通常用いられる中性塩溶液から任意に選ぶことがで
きるが、ＮａＣｌの水溶液が好ましい。また前記基質類
似物としては、ベンズアミジン、ニトロベンズアミジ
ン、アミノベンズアミジンを挙げることができる。基質
類似物を用いてなる溶出液としては、０．１Ｎ ＮａＣ
ｌを用いてｐＨ４．０〜５．５に調整したものを用いる
ことができる。Among them, the buffer solution has a pH of 4.0.
A buffer having a pH range of from 5.5 to 5.5 can be arbitrarily selected, and an acetate buffer is particularly preferable, and the neutral salt solution can be arbitrarily selected from commonly used neutral salt solutions. , NaCl is preferred. In addition, examples of the substrate analog include benzamidine, nitrobenzamidine, and aminobenzamidine. The eluate using the substrate analog is 0.1 N NaC
What adjusted pH to 4.0-5.5 using 1 can be used.

【００５８】また、撹拌混合して凝集物(15)に吸着して
いるＡＴIII を液中に溶出させるには、撹拌の度合い、
あるいは容器の形状等により異なるが、撹拌混合を通常
２時間以上行うことが望ましい。ただし、本発明では、
親和性吸着体に超微粒子支持体を使用し、該超微粒子表
面にリガンドを固定化し、該リガンドにＡＴIII を特異
的に吸着しているため、従来のように比較的大きな支持
体の孔内の官能基にリガンドを固定化し、該リガンドに
ＡＴIII を吸着している場合に比して、溶出液との接触
が容易でかつ支持体の孔内経路を経ることなく溶出させ
ることができる。したがって、従来の回分式のアフィニ
テークロマトグラフィー法による溶出操作に比して極め
て短時間で溶出することができる。なお、溶出液と凝集
物との量的関係は、処理量にみあって変化させることが
できる。In order to elute ATIII adsorbed on the aggregate (15) into the liquid by stirring and mixing, the degree of stirring,
Alternatively, although it depends on the shape of the container and the like, it is preferable that the stirring and mixing is usually performed for 2 hours or more. However, in the present invention,
Since an ultrafine particle support is used as the affinity adsorbent, a ligand is immobilized on the surface of the ultrafine particles, and ATIII is specifically adsorbed on the ligand, the conventional method allows the use of a fine pore in the pore of a relatively large support. Compared to the case where a ligand is immobilized on a functional group and ATIII is adsorbed on the ligand, the contact with the eluate is easier and the elution can be carried out without passing through the pore of the support. Therefore, elution can be performed in an extremely short time as compared with a conventional batch-type affinity chromatography-based elution operation. In addition, the quantitative relationship between the eluate and the aggregate can be changed according to the treatment amount.

【００５９】次に、上記ＡＴIII の分離工程(16)におい
て撹拌混合を行った後、沈降（自然沈降または緩やかな
遠心）(17)を行う。該沈降（自然沈降または緩やかな遠
心）(17)では、親和性吸着体が凝集物の形態をとるた
め、自然に放置することで約２〜３時間程度で完全に沈
降させることができ、または１５００〜３０００Ｇで５
〜３０分間の緩やかな遠心により完全に沈降させること
ができ、ＡＴIII を上清中に溶出させることができる。Next, after stirring and mixing in the ATIII separation step (16), sedimentation (natural sedimentation or gentle centrifugation) (17) is performed. In the sedimentation (natural sedimentation or gentle centrifugation) (17), since the affinity adsorbent takes the form of aggregates, it can be completely sedimented in about 2 to 3 hours by allowing it to stand naturally, or 5 at 1500-3000G
A gentle centrifugation for ３０30 minutes allows complete sedimentation and ATIII can be eluted into the supernatant.

【００６０】続いて、図３に示すように、工程(18)で
は、上記沈降（自然沈降または緩やかな遠心）(17)によ
り生じた上清を回収することにより、上清中に精製ＡＴ
III を含有させた状態で得ることができる。Subsequently, as shown in FIG. 3, in step (18), the supernatant generated by the sedimentation (natural sedimentation or gentle centrifugation) (17) is collected, so that the purified AT
III can be obtained.

【００６１】一方、ＡＴIII を溶出した後の沈殿した親
和性吸着体凝集物(19)は、再分散工程(20)に付され、再
生される。On the other hand, the precipitated affinity adsorbent aggregate (19) after elution of ATIII is subjected to a redispersion step (20) to be regenerated.

【００６２】親和性吸着体凝集物(19)の再分散工程(20)
の一つの実施の形態（手段）として、まず、酸添加系
再生法としては、該親和性吸着体凝集物(19)が添加され
てなるｐＨ１〜１０の水系分散媒体中に、酸を添加して
系内を酸性域として、温度０〜９０℃の範囲に保持する
ことを特徴とするものである。これにより、図２に示す
ように、該親和性吸着体凝集物(19)の架橋構造部位を形
成する多価金属をはずしてカルボキシル基（−ＣＯＯ
Ｈ）を有する単分散性の親和性吸着体として、最初の混
合工程(1) に再利用することができる。Redispersion Step (20) of Affinity Adsorbent Aggregate (19)
As one embodiment (means) of the present invention, first, as an acid-added regeneration method, an acid is added to an aqueous dispersion medium having a pH of 1 to 10 to which the affinity adsorbent aggregate (19) is added. The temperature inside the system is kept in the range of 0 to 90 ° C. in an acidic region. As a result, as shown in FIG. 2, the polyvalent metal forming the crosslinked structure site of the affinity adsorbent aggregate (19) was removed to remove the carboxyl group (—COO).
The monodisperse affinity adsorbent having H) can be reused in the first mixing step (1).

【００６３】上記親和性吸着体凝集物(19)の酸添加系
再生法による再分散工程(20)に用いられる水系分散媒体
としては、水またはアルコール類の有機媒体等を用いる
ことができる。このうちアルコール類の有機媒体として
は、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、
イソプロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、
ｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタ
ノール、３−ペンタノール、ｔ−ペンチルアルコール、
１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノー
ルなどの１価アルコール、エチレングリコール、ジエチ
レングリコール、トリエチレングリコール、プロピレン
グリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレ
ングリコール、ネオペンチルグリコール、ペンタメチレ
ングリコール、ヘキサメチレングリコールなどの２価ア
ルコール、グリセロールなどの３価アルコール、エチレ
ングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコール
モノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエ
ーテル、エチレングリコールモノイソブチルエーテルな
ど炭素数１〜６のアルコール類のほか、分子量６０００
以下、好ましくは４０００以下のポリエチレングリコー
ルなどが挙げられる。これらの分散媒体は、単独で用い
ることもできるが、２種以上を混合して用いることも可
能である。As the aqueous dispersion medium used in the redispersion step (20) of the affinity adsorbent aggregate (19) by the acid-added regeneration method, an organic medium such as water or alcohols can be used. Among these, as the organic medium of alcohols, for example, methanol, ethanol, propanol,
Isopropanol, 1-butanol, 2-butanol,
t-butyl alcohol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol, t-pentyl alcohol,
Monohydric alcohols such as 1-hexanol, 2-hexanol and 3-hexanol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, neopentyl glycol, pentamethylene glycol, hexamethylene C1-6 alcohols such as dihydric alcohols such as glycol, trihydric alcohols such as glycerol, ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethyl ether, ethylene glycol monobutyl ether and ethylene glycol monoisobutyl ether, and a molecular weight of 6000
Below, preferably 4000 or less polyethylene glycol etc. are mentioned. These dispersing media can be used alone or in combination of two or more.

【００６４】さらに上記水系分散媒体には、例えば、ポ
リビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビ
ニルアルコール、ポリビニルカルバゾールなどの等の有
機高分子系の分散媒体を用いてもよい。Further, as the aqueous dispersion medium, an organic polymer dispersion medium such as polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol and polyvinyl carbazole may be used.

【００６５】上記再分散方法における水系分散媒体のｐ
Ｈは、通常１〜１０、好ましくは１．５〜５の範囲に調
製したものである。該ｐＨが上記範囲をはずれる場合に
は、凝集した粒子の再分離を行うことができないため好
ましくない。In the above redispersion method, p of the aqueous dispersion medium
H is usually prepared in the range of 1 to 10, preferably 1.5 to 5. If the pH is out of the above range, the aggregated particles cannot be re-separated, which is not preferable.

【００６６】上記酸添加系再生法による再分散工程(2
0)において、添加される酸としては、例えば、塩酸、硫
酸、燐酸などの無機酸および酢酸、マレイン酸、クエン
酸、アスコルビン酸などの有機酸などを用いることがで
きる。これらの酸を添加することにより、系内を酸性
域、好ましくはｐＨ１．５〜５とすることが望ましい。The redispersion step (2
In 0), examples of the acid to be added include inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, and phosphoric acid, and organic acids such as acetic acid, maleic acid, citric acid, and ascorbic acid. By adding these acids, it is desirable to adjust the inside of the system to an acidic range, preferably pH 1.5 to 5.

【００６７】上記酸添加系再生法による再分散工程(2
0)における反応系の温度は、通常０〜９０℃、好ましく
は４〜７０℃、より好ましくは１０〜５０℃の範囲であ
る。該温度が０℃未満の場合には、水系分散媒体が凝固
するおそれがあり好ましくない。また、９０℃を越える
場合には、導入スペーサーおよびリガンドの分解や変性
が起こる可能性があり好ましくない。The redispersion step (2
The temperature of the reaction system in 0) is usually in the range of 0 to 90 ° C, preferably 4 to 70 ° C, more preferably 10 to 50 ° C. If the temperature is lower than 0 ° C., the aqueous dispersion medium may be coagulated, which is not preferable. If the temperature exceeds 90 ° C., the introduced spacer and the ligand may be decomposed or denatured, which is not preferable.

【００６８】上記酸添加系再生法による再分散工程(2
0)においては、上記条件（構成要件）下におくことで、
図２に示すように多価金属で架橋された凝集物間の当該
多価金属がはずれて、単分散性の親和性吸着体を再生し
得るものである。これにより、最初の混合工程(1) に再
利用することができるため経済性に優れる。The redispersion step (2
In (0), by placing under the above conditions (component requirements),
As shown in FIG. 2, the polyvalent metal between the aggregates cross-linked by the polyvalent metal is released, and the monodisperse affinity adsorbent can be regenerated. As a result, it can be reused in the first mixing step (1), so that it is economical.

【００６９】[0069]

【実施例】以下、本発明の実施例について述べる。Embodiments of the present invention will be described below.

【００７０】まず、実施例に用いる親和性吸着体の製造
方法を説明する。First, a method for producing an affinity adsorbent used in Examples will be described.

【００７１】窒素雰囲気下で、エタノール１０００ｍｌ
にアクリルアミド２５ｇ、架橋剤であるＮ，Ｎ′−メチ
レンビスアクリルアミド２０．５ｇ（単量体混合物と架
橋剤との混合物を１００重量％として、架橋剤４５．１
重量％）を撹拌しながら溶解させ、同時に溶存酸素を十
分取り除いた。続いて温度７０℃で開始剤として２，
２′−アゾビスイソブチルニトリル０．８２１ｇ（開始
剤濃度５×１０^-3モル／リットル）を添加し、ｐＨ６．
５として３時間重合を行ない、反応終了後、氷浴で重合
容器ごと急冷し、ラジカル重合を停止させ、単分散球形
の超微粒子を得た。Under a nitrogen atmosphere, ethanol 1000 ml
25 g of acrylamide and 20.5 g of N, N'-methylenebisacrylamide as a cross-linking agent (45.1% of a cross-linking agent with a mixture of a monomer mixture and a cross-linking agent being 100% by weight).
% By weight) was dissolved with stirring, and at the same time, dissolved oxygen was sufficiently removed. Subsequently, at a temperature of 70 ° C.,
0.82 g of 2'-azobisisobutylnitrile (initiator concentration 5 × 10 ^-3 mol / l) was added, and the pH was adjusted to 6.0.
Polymerization was performed for 3 hours as 5, and after the reaction was completed, the entire polymerization vessel was quenched in an ice bath to stop radical polymerization, and monodispersed spherical ultrafine particles were obtained.

【００７２】次に、生成したポリアクリルアミド系超微
粒子を遠心分離機で分別し、上澄み液を取り除いた。こ
こに新たにエタノール１０００ｍｌを加え、１時間激し
く撹拌し、その後遠心分離機で分別した。同様の操作を
３回行ない、ガラスフィルターで濾過後、５０℃、減圧
下で真空乾燥した。Next, the produced polyacrylamide-based ultrafine particles were separated by a centrifuge, and the supernatant was removed. Here, 1000 ml of ethanol was newly added, and the mixture was vigorously stirred for 1 hour, and then separated by a centrifuge. The same operation was performed three times, followed by filtration through a glass filter, followed by vacuum drying at 50 ° C. under reduced pressure.

【００７３】得られた超微粒子を、溶媒として精製水を
用いて５重量％ポリマー溶媒とし、これに沈殿剤として
２０倍量のアセトンを加え、良く撹拌しながら再沈殿さ
せた。その後、遠心分離機で分別し、上澄み液を取り除
いた。同様の操作を２回行ない、ガラスフィルターで濾
過後、５０℃、減圧下で真空乾燥し精製を終了した。The obtained ultrafine particles were converted to a 5% by weight polymer solvent using purified water as a solvent, and 20 times as much acetone as a precipitant was added thereto, followed by reprecipitation with good stirring. Thereafter, the mixture was separated by a centrifuge, and the supernatant was removed. The same operation was performed twice, and the mixture was filtered through a glass filter and dried under reduced pressure at 50 ° C. under reduced pressure to complete the purification.

【００７４】上記超微粒子の表面アミド基をｐＨ１０．
５以上のアルカリ状態を保つように、Ｎａ₂ ＣＯ₃ 濃度
０．０４モル／ｌ、６０℃で３時間反応させ、カルボキ
シル基へ交換したマトリックス（以下、単にＣＭとも記
す）として２．０ｇを精製水１２０ｍｌを加え、２４時
間撹拌し、十分に分散させた。導入する末端官能性オリ
ゴマーをスペーサ（以下、単にＳとも記す）としてエチ
レンジアミンを０．５４ｍｌ（０．０１モル）を溶媒と
して精製水２５ｍｌで希釈したものを反応フラスコに入
れ、１０％ＨＣｌ７ｍｌでｐＨ４．５〜５．５に調整
し、マトリックスおよびスペーサが完全に分散、溶解す
るまで撹拌を行った。The amide groups on the surface of the ultrafine particles were adjusted to pH10.
The reaction was carried out at 60 ° C. for 3 hours at a Na ₂ CO ₃ concentration of 0.04 mol / l so as to maintain an alkali state of 5 or more, and 2.0 g of a matrix converted to carboxyl groups (hereinafter, also simply referred to as CM) was purified. 120 ml of water was added and stirred for 24 hours to sufficiently disperse. The terminal-functional oligomer to be introduced is used as a spacer (hereinafter, also simply referred to as S) and diluted with 25 ml of purified water using 0.54 ml (0.01 mol) of ethylenediamine as a solvent. The mixture was adjusted to 5 to 5.5 and stirred until the matrix and the spacer were completely dispersed and dissolved.

【００７５】次に縮合剤としてＣＭＣ１．６１０ｇ（縮
合剤濃度０．０２５Ｍ）を反応フラスコに加え、この時
を反応開始時刻として引き続き２３℃（室温）で撹拌を
行い、４８時間で反応を終了した。Next, 1.610 g of CMC (condensing agent concentration: 0.025 M) as a condensing agent was added to the reaction flask, and the reaction was started at this time, followed by stirring at 23 ° C. (room temperature), and the reaction was completed in 48 hours. .

【００７６】次に分離精製工程として反応終了後のスペ
ーサがグラフト導入されたマトリックス（以下、単にＣ
Ｍ−Ｓとも記す）を遠心分離機で１４５００ｒｐｍで１
５分間の条件で分別し、上澄液を取り除いた。ここに新
たに精製水１００ｍｌを加え、５０℃で２時間、２００
ｒｐｍで撹拌を行い、遠心分離機で１４５００ｒｐｍで
２０分間遠心分離を行った。同様の操作を５回行った
後、凍結乾燥を行い精製を終了し、本実施例に用いる超
微粒子支持体を得た。Next, as a separation and purification step, a matrix (hereinafter simply referred to as C
M-S) in a centrifuge at 14500 rpm for 1
Separation was performed for 5 minutes, and the supernatant was removed. 100 ml of purified water is added thereto at 200 ° C. for 2 hours at 50 ° C.
The mixture was stirred at rpm, and centrifuged at 14,500 rpm for 20 minutes using a centrifuge. After the same operation was performed five times, freeze-drying was performed to complete the purification, and an ultrafine particle support used in this example was obtained.

【００７７】本実施例で用いる特定リガンドには、アン
ヒドロトロンビンを用いた。かかるアンヒドロトロンビ
ンは、人トロンビンから次に示す方法により調製した。
精製したヒトα−トロンビン（７１００００単位、３０
０ｍｇ）を５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解
し、２１℃で１０００倍量のフェニルメタンスルホニル
フルオライドを加え３０分間放置し、トロンビン活性を
消失させた。トロンビンのエステラーゼ活性を測定した
ところ９９．９５％が失われていることが確認された。
その後、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化
した脱塩カラムで脱塩を行い、そのまま４℃で１昼夜放
置した。この分画を５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
５）で平衡化したベンズアミジナガロースカラム（ゲル
床容積３０ｍｌ）に通液し、同緩衝液で洗浄した。該カ
ラムに０．２Ｍベンズアミジン（ｐＨ７．５）を通液し
て不活化トロンビンを溶出させ、１Ｍ ＮａＣｌを含む
５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で透析し、ベンズ
アミジンを除去し、アンヒドロトロンビンとしたものを
用いた。Anhydrothrombin was used as the specific ligand used in this example. Such anhydrothrombin was prepared from human thrombin by the following method.
Purified human α-thrombin (710000 units, 30
0 mg) was dissolved in 50 mM Tris buffer (pH 8.0), and a 1000-fold amount of phenylmethanesulfonyl fluoride was added at 21 ° C. and left for 30 minutes to eliminate thrombin activity. When the esterase activity of thrombin was measured, it was confirmed that 99.95% was lost.
Thereafter, desalting was performed using a desalting column equilibrated with a 50 mM Tris buffer (pH 9.0), and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours. This fraction was treated with 50 mM Tris buffer (pH 7.0).
The solution was passed through a benzamidinagarose column (gel bed volume 30 ml) equilibrated in 5) and washed with the same buffer. Inactivated thrombin is eluted by passing 0.2 M benzamidine (pH 7.5) through the column, and dialyzed against 50 mM Tris buffer (pH 7.5) containing 1 M NaCl to remove benzamidine and to remove anhydrothrombin. What was done was used.

【００７８】次に、上記で得られたアンヒドロトロンビ
ンを０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ （ｐＨ８．３）で透析し、
上記で得られた超微粒し支持体（ＣＭ−Ｓ）と混合する
ことにより、特定リガンドとしてアンヒドロトロンビン
を固定化した親和性吸着体を得た。これを本実施例１に
用いる親和性吸着体とした。Next, the anhydrothrombin obtained above was dialyzed against 0.1 M NaHCO ₃ (pH 8.3),
The ultrafine particles obtained above were mixed with a support (CM-S) to obtain an affinity adsorbent on which anhydrothrombin was immobilized as a specific ligand. This was used as the affinity adsorbent used in Example 1.

【００７９】実施例１ 本実施例１では、図３に示す工程(1) 〜(20)にしたがっ
て、ＡＴIII の分離精製方法を実行した。Example 1 In Example 1, a method for separating and purifying ATIII was carried out according to the steps (1) to (20) shown in FIG.

【００８０】まず、血漿中への親和性吸着体の混合工程
(1) では、ＡＴIII を１９０〜３５０μｇ／ｍｌの割合
で含有する血漿１０００ｍｌが入れられた撹拌装置付き
四ツ口フラスコ容器中に上記親和性吸着体８００ｍｇを
添加し、血漿に対する親和性吸着体濃度を８０ｍｇ／１
００ｍｌに調製し、４℃で２時間撹拌混合し、ＡＴIII
を親和性吸着体に吸着させた。上記血漿を６０℃に３分
間加熱後、４℃の低温にて、３０００Ｇ×３０分間遠心
分離し、上澄みを集め０．２μｍのポアサイズを有する
フィルターを用いて濾過したものを用いた。First, the step of mixing the affinity adsorbent into the plasma
In (1), 800 mg of the affinity adsorbent was added to a four-necked flask equipped with a stirrer containing 1000 ml of plasma containing ATIII at a rate of 190 to 350 μg / ml. 80 mg / 1
00 ml and stirred and mixed at 4 ° C for 2 hours.
Was adsorbed on the affinity adsorbent. The above-mentioned plasma was heated at 60 ° C. for 3 minutes, centrifuged at a low temperature of 4 ° C. at 3000 G × 30 minutes, and the supernatant was collected and filtered using a filter having a pore size of 0.2 μm.

【００８１】次に、親和性吸着体の１次凝集工程(2) で
は、上記四ツ口フラスコ容器中に、多価金属塩として塩
化カルシウムを、［Ｃａ²⁺］／［−ＣＯＯＮａ］（モル
比）＝１０００となるように４．４ｇ添加し、さらに反
応系のｐＨを０．０１Ｎ ＮａＯＨを用いて８．５に調
製し、反応系の温度を２０℃に保持しながら撹拌混合を
続けることにより、該親和性吸着体のカルボン酸ナトリ
ウム基（−ＣＯＯＮａ）を多価金属で架橋して該超微粒
子の凝集体を形成させた。Next, in the primary agglomeration step (2) of the affinity adsorbent, calcium chloride as a polyvalent metal salt was added to the above four-necked flask in the form of [Ca ²⁺ ] / [-COONa] (mol Ratio) = 1000, further adjust the pH of the reaction system to 8.5 using 0.01N NaOH, and continue stirring and mixing while maintaining the temperature of the reaction system at 20 ° C. Thus, the sodium carboxylate group (—COONa) of the affinity adsorbent was cross-linked with a polyvalent metal to form an aggregate of the ultrafine particles.

【００８２】次に、分離工程(3) では、撹拌を停止し、
該凝集体を自然放置することにより３時間以内に簡単に
沈降でき、これにより容易に分離できることを確認し
た。Next, in the separation step (3), the stirring is stopped,
It was confirmed that the aggregate could be easily sedimented within 3 hours by leaving the aggregate to stand naturally, thereby easily separating.

【００８３】上記分離工程(3) で凝集物を自然沈降させ
た後、吸引装置を使って上清約１リットルと沈殿した凝
集物(4) 約１ｇとに分離した。After the aggregates were spontaneously settled in the separation step (3), about 1 liter of the supernatant was separated into about 1 g of the precipitated aggregates (4) using a suction device.

【００８４】このうち。上清約１リットルについては、
さらに上記(1) 〜(3) と同様の操作を繰り返すことによ
り、上清中に残存するＡＴIII の親和性吸着体による混
合(5) 、２次凝集(6) 、分離(7) の工程操作を行った。[0084] Among them. For about 1 liter of supernatant,
Further, by repeating the above operations (1) to (3), the steps of mixing (5), secondary aggregation (6), and separation (7) with the affinity adsorbent of ATIII remaining in the supernatant are performed. Was done.

【００８５】上記分離工程(7) で凝集物を自然沈降させ
た後、吸引装置を使って上清約１リットルと沈殿した凝
集物(8) 約１ｇとに分離した。このうち上清について
は、図３に示すように、操作(12)として、上清廃棄を行
った。After the aggregates were spontaneously settled in the separation step (7), about 1 liter of the supernatant and about 1 g of the precipitated aggregates (8) were separated using a suction device. As shown in FIG. 3, the supernatant was discarded as operation (12).

【００８６】一方、工程(9) では、先に得られた凝集物
(4) 約１ｇと凝集物(8) 約１ｇと合わせて、１つにまと
めた。On the other hand, in the step (9), the aggregate
(4) Approximately 1 g was combined with approximately 1 g of aggregates (8) to form a single unit.

【００８７】次に、１次洗浄工程(10)では、１つにまと
められた凝集物を、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（０．１
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）ｍｌが入れられた撹拌装置
付きの四ツ口フラスコ容器中に加えて、４℃で２時間撹
拌を行った。Next, in the primary washing step (10), the aggregates collected into one are removed from a 50 mM Tris-HCl buffer solution (0.1
M NaCl, pH 7.5) was added to a four-necked flask equipped with a stirrer and stirred at 4 ° C. for 2 hours.

【００８８】その後、沈降(11)では、撹拌操作を停止し
て、３時間、自然放置して、凝集物を沈降させた。Thereafter, in the sedimentation (11), the stirring operation was stopped, and the mixture was allowed to stand for 3 hours to settle the aggregates.

【００８９】次に、上記四ツ口フラスコ容器より、上清
を廃棄する操作(12)を行って処分する一方、沈殿した凝
集物に、上記１次洗浄と同様にして、２次洗浄(13)を行
い、さらに沈降(14)、上清廃棄操作(12)を行うことで、
沈殿した凝集物(15)を得た。Next, the supernatant is discarded from the four-necked flask by performing the operation (12) of discarding the supernatant, and the precipitated aggregate is subjected to the secondary washing (13) in the same manner as the primary washing. ), Sedimentation (14), and supernatant discarding operation (12)
A precipitated aggregate (15) was obtained.

【００９０】次に、ＡＴIII の分離工程(16)では、得ら
れた凝集物(15)を、１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．５）が入れられた撹拌装置付きの四ツ
口フラスコ容器中に加えて、４℃で２時間撹拌を行って
ＡＴIII の溶出を行った。Next, in the ATIII separation step (16), the obtained aggregate (15) was mixed with a 50 mM acetate buffer (pH 5.5) containing 1M NaCl and equipped with a four-necked flask equipped with a stirrer. ATIII was eluted by stirring the mixture in a container at 4 ° C. for 2 hours.

【００９１】その後、沈降(17)では、撹拌操作を停止し
て、３時間、自然放置して、凝集物を沈降させた。Thereafter, in the sedimentation (17), the stirring operation was stopped, and the mixture was allowed to stand for 3 hours to settle the aggregates.

【００９２】次に、上記四ツ口フラスコ容器より、精製
ＡＴIII を含有する上清(18)１００ｍｌを陰イオン交換
クロマトグラフィー（ＤＥＡＥセファロースカラム）で
精製抽出して、該上清中に精製ＡＴIII 約３００ｍｇを
含有する形で回収する一方、沈殿した凝集物(19)約２ｇ
は、これを再生すべく、以下の再分散工程(20)にまわし
た。Next, 100 ml of the supernatant (18) containing the purified ATIII was purified and extracted by anion exchange chromatography (DEAE Sepharose column) from the four-necked flask, and the purified ATIII was added to the supernatant. While collecting in a form containing 300 mg, about 2 g of precipitated aggregate (19)
Went to the following redispersion step (20) to regenerate this.

【００９３】再分散工程(20)では、上記凝集物(19)約２
ｇを、ｐＨ７．５の水系分散媒体である精製水が５００
ｍｌ入れられた撹拌装置付きの三ツ口フラスコ容器中に
添加し、さらにこの中に酸として０．１Ｎ塩酸を添加し
て反応系のｐＨを３．０と酸性域にして、温度２０℃に
保持して撹拌混合することにより、３時間以内に該凝集
物の多価金属であるＣａがはずれてカルボンキシル基
（−ＣＯＯＨ）を有する単分散性の親和性吸着体を再生
できることが確認できた。In the re-dispersion step (20), about 2
g of purified water as an aqueous dispersion medium having a pH of 7.5.
of the reaction system was added to a three-necked flask equipped with a stirrer, and 0.1N hydrochloric acid was further added thereto as an acid to adjust the pH of the reaction system to an acidic range of 3.0 and maintained at a temperature of 20 ° C. By stirring and mixing, it was confirmed that Ca, which is a polyvalent metal of the aggregate, was removed within 3 hours and a monodisperse affinity adsorbent having a carboxyl group (—COOH) could be regenerated.

【００９４】実施例２ 実施例１中の分離工程(3) の自然沈降を２０００Ｇで１
５分間の遠心分離に代え、また沈降(11)の自然沈降を２
０００Ｇで１５分間の遠心分離に代え、また沈降(14)の
自然沈降を２０００Ｇで１５分間の遠心分離に代え、さ
らに沈降(17)の自然沈降を２０００Ｇで１５分間の遠心
分離に代えた以外は、実施例１と同様に行い、実施例１
と同様の結果が得られることが確認できた。さらに、実
施例１と同様に再分散工程(20)を行い、単分散性の親和
性吸着体を再生することができることを確認した。Example 2 The natural sedimentation in the separation step (3) in Example 1 was
Instead of 5 minutes of centrifugation, settle (11)
Except that the centrifugation at 2,000 G for 15 minutes was replaced by the centrifugation of sedimentation (14) at 2,000 G for 15 minutes, and the centrifugation at sedimentation (17) was replaced by centrifugation at 2,000 G for 15 minutes. In the same manner as in Example 1,
It was confirmed that the same result as that described above was obtained. Further, the redispersion step (20) was performed in the same manner as in Example 1, and it was confirmed that the monodisperse affinity adsorbent could be regenerated.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 本発明に係る親和性吸着体の混合、凝集、さ
らに分離の一連の工程の一つの実施の形態（手段）とし
て、親和性吸着体のカルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯ
Ｎａ）間を多価金属で架橋して該親和性吸着体凝集物を
形成する様子をモデル化した反応概略図である。FIG. 1 shows one embodiment (means) of a series of steps for mixing, aggregating, and further separating an affinity adsorbent according to the present invention.
FIG. 3 is a schematic reaction diagram that models the formation of the affinity adsorbent aggregate by crosslinking between Na) with a polyvalent metal.

【図２】 本発明に係る親和性吸着体凝集物の再分散工
程の一つの実施の形態（手段）として、親和性吸着体凝
集物が、酸添加系再生法による酸処理によって該親和性
吸着体凝集物の多価金属がはずれてカルボンキシル基
（−ＣＯＯＨ）を有する単分散性の親和性吸着体を形成
する様子をモデル化した反応概略図である。FIG. 2 shows one embodiment (means) of the step of redispersing the affinity adsorbate aggregate according to the present invention, in which the affinity adsorbate aggregate is subjected to acid treatment by an acid addition-based regeneration method. FIG. 3 is a schematic reaction diagram modeling the manner in which a polyvalent metal in a body aggregate is removed to form a monodisperse affinity adsorbent having a carboxyl group (—COOH).

【図３】 本発明に係るＡＴIII の分離精製方法におけ
る１つの実施の形態として、ＡＴIII を含む溶液中から
該ＡＴIII を親和性吸着体に特異的に吸着させて分離抽
出し、その後該親和性吸着体より該ＡＴIII を溶出させ
て回収精製する回分式のバイオアフィニティクロマトグ
ラフィー法による一連の工程手順を表した工程図を示
す。FIG. 3 shows one embodiment of the method for separating and purifying ATIII according to the present invention, in which ATIII is specifically adsorbed to an affinity adsorbent from a solution containing ATIII, separated and extracted, and then the affinity adsorption is performed. FIG. 2 is a process chart showing a series of process procedures by a batch-type bioaffinity chromatography method in which the ATIII is eluted from the body and recovered and purified.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

１…超微粒子支持体、 ２…リガンド、 ３…ＡＴIII 、 Ｍ…多価金属。 1 ... ultra fine particle support, 2 ... ligand, 3 ... ATIII, M ... polyvalent metal.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 永田 政令 東京都中央区日本橋馬喰町１丁目４番16号 藤森工業株式会社研究開発本部内 ────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (72) Inventor Masanori Nagata 1-4-16 Nimagashi-cho, Nihonbashi, Chuo-ku, Tokyo Inside Fujimori Industry Co., Ltd.

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 アンチトロンビンIII を含む溶液中から
該アンチトロンビンIII を親和性吸着体に特異的に吸着
させて分離抽出し、その後該親和性吸着体より該アンチ
トロンビンIII を溶出させて回収精製するバイオアフィ
ニティクロマトグラフィーによるアンチトロンビンIII
の分離精製方法において、 前記アンチトロンビンIII を含む溶液中から該アンチト
ロンビンIII を分離抽出する手段が、アンチトロンビン
III を含む溶液中にカルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯ
Ｎａ）を有する超微粒子を支持体とする親和性吸着体を
添加して該親和性吸着体表面に固定化されたリガンドに
アンチトロンビンIII を特異的に吸着させた後、該溶液
中に水溶性多価金属塩を［Ｍⁿ⁺］／［−ＣＯＯＮａ］
（モル比）＝０．１〜１００００（ただし、Ｍは多価金
属であり、ｎは２〜４の整数である）の範囲で添加し、
反応系のｐＨを５〜１３に調製し、反応系内の温度を０
〜９０℃の範囲に保持して親和性吸着体の凝集物を形成
し、該凝集物を分離抽出することを特徴とするアンチト
ロンビンIII の分離精製方法。1. An anti-thrombin III is specifically adsorbed to an affinity adsorbent from a solution containing the anti-thrombin III and separated and extracted, and then the anti-thrombin III is eluted from the affinity adsorbent to be recovered and purified. Antithrombin III by evolving bioaffinity chromatography
Wherein the means for separating and extracting the antithrombin III from a solution containing the antithrombin III comprises:
III in a solution containing sodium carboxylate (-COO
After adding an affinity adsorbent having ultrafine particles having Na) as a support to specifically adsorb antithrombin III to the ligand immobilized on the surface of the affinity adsorbent, the solution is dissolved in the aqueous solution. [ ^{Mn +} ] / [-COONa]
(Molar ratio) = 0.1 to 10,000 (where M is a polyvalent metal and n is an integer of 2 to 4),
The pH of the reaction system was adjusted to 5 to 13 and the temperature in the reaction system was set to 0.
A method for separating and purifying antithrombin III, comprising forming an aggregate of an affinity adsorbent while maintaining the temperature in the range of -90 ° C and separating and extracting the aggregate. 【請求項２】 前記アンチトロンビンIII を含む溶液
が、前記アンチトロンビンIII の分離抽出手段を行って
アンチトロンビンIII を分離抽出した後の上清であるこ
とを特徴とする請求項１に記載のアンチトロンビンIII
の分離精製方法。2. The anti-thrombin III-containing solution according to claim 1, wherein the anti-thrombin III-containing solution is the supernatant obtained after the anti-thrombin III is separated and extracted by the anti-thrombin III-extraction means. Thrombin III
Separation and purification method. 【請求項３】 請求項１および／または請求項２で分離
抽出した多価金属により架橋された親和性吸着体凝集物
よりアンチトロンビンIII を上清中に溶出させて回収精
製した後の沈殿凝集物を再生する手段が、ｐＨ１〜１０
の水系分散媒体中に該凝集物を添加し、さらに酸を添加
して系内を酸性域として、温度０〜９０℃の範囲に保持
することを特徴とするアンチトロンビンIII の分離精製
方法。3. Precipitation aggregation after eluting and purifying antithrombin III from the affinity adsorbent aggregate cross-linked by the polyvalent metal separated and extracted in claim 1 and / or 2, followed by recovery and purification. The means for regenerating the material is pH 1-10
A method for separating and purifying antithrombin III, comprising adding the aggregate to an aqueous dispersion medium of (1), further adding an acid to keep the inside of the system in an acidic range, and keeping the temperature within a range of 0 to 90 ° C.