JPH10510814A

JPH10510814A - ベタイドを製造するためのアミノ酸並びにベタイドライブラリーのスクリーニング方法及び製造方法

Info

Publication number: JPH10510814A
Application number: JP8519243A
Authority: JP
Inventors: ジーンイーエフリヴィア; ジョンエスポーター
Original assignee: ザソルクインスティテュートフォアバイオロジカルスタディース
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1995-12-15
Publication date: 1998-10-20
Also published as: IL116340A0; US5807986A; AU700904B2; DE69516169D1; AU4469396A; EP0794959B1; DE69516169T2; EP0794959A1; CA2206258A1; ATE191484T1; IL116340A; US5681928A; WO1996018642A1

Abstract

(57)【要約】 “ベタイド”と称される化合物はペプチドを模倣し、アミノグリシン、Ｃα−アミノアラニン、アミノサルコシン等の一つ以上の残基を含み、その側鎖アミノ基がアシル化されており、また必要によりアルキル化されていてもよい。一般に、ベタイドは式：Ｘ_N−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｘ_m−Ｘ₄−Ｘ₅−Ｘ₆−Ｘ_cで表される（式中、Ｘ_Nはアシル基もしくはその他のＮ末端基またはこのような基を有する長さ約50アミノ酸までのペプチドであり、Ｘ_cはOH、NH₂もしくはその他のＣ末端基またはこのような基を有する長さ約50アミノ酸までのペプチドであり、かつＸ₁〜Ｘ₆は夫々独立にベタイドアミノ酸もしくはα−アミノ酸またはdes-Xであり、かつＸ_mは約50アミノ酸までのペプチドまたはdes-Xであるが、但し、Ｘ₁〜Ｘ₆の少なくとも一つが式(I)で表されるベタイドアミノ酸残基であることを条件とし、式中、Ｒ₀はＨまたはCH₃であり、Ｒ及びＲ₂はＨまたは低級アルキルであり、かつＲ₃はアシル基、イソシアネート基またはイソチオシアネート基、スルホニル基等である）。ベタイドをつくるために、アミノグリシン残基は、それがペプチド中間体にカップリングされた後に、側鎖アシル化、そしてまた必要によりアルキル化を受ける。ペプチド鎖中の一つ以上の位置に多種の置換基を有するベタイドを合成することにより、特別な位置に複数の異なる天然アミノ酸置換基または非天然アミノ酸置換基、及び必要によりそのＤ−異性体及びＬ−異性体の両方を有するぺプチドを模倣するベタイドの有効なスクリーニングが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】ベタイドを製造するためのアミノ酸並びにベタイドライブラリーのスクリーニング方法及び製造方法本発明は助成金番号HD-13527、DK 26741、並びに国立健康協会により授与された契約NO1-HD-3-3171及びNO1-HD-0-2906のもとに政府の支持によりなされた。政府は本発明に或る種の権利を有する。本件出願は1994年12月16日に出願された本発明者らの先の特許出願第08/358,1 84号の一部継続出願である。本発明は一般にベタイドアミノ酸(betidamino acid)と称される特異なアミノ酸、ベタイド(betide)と称されるこのようなアミノ酸を含むペプチド及びそれらの製造方法、特にモジュラー要素としてこのような特異なアミノ酸を使用するベタイドのライブラリーの製造方法に関する。また、本発明は、既知のバイオポテンシー(biopotency)のペプチド中の特別な位置におけるこのような特異なアミノ酸の置換（それらの特異な側鎖による）が不十分な性質、均等な性質または改善された性質を有するペプチドをもたらすことを試験するためのスクリーニング方法に関する。また、このような側鎖修飾の効果のこのようなスクリーニングから得られる情報がこのような側鎖を含むその他のアミノ酸及び研究されているペプチドの同様の類似体の設計において研究者らを案内するのにその後使用される。発明の背景ペプチド化学者は、相当する天然ペプチドよりも、少なくとも一面において、優れている改良されたペプチドを提供するために、数十年にわたって努力してきた。一般に、この研究は古典的な液相ペプチド合成による面倒な合成または固相ペプチド合成(SPPS)を使用する更に有効な合成を伴い、この場合、天然または非天然のその他のＬ−異性体アミノ酸またはＤ−異性体アミノ酸が天然ペプチドまたはその早期に開発された類似体中の特別な位置に現れるアミノ酸に代えて一度に置換される。例えば、当業者がペプチド配列中の或る位置にある、例えば、５つの異なるアミノ酸のいずれか一つを置換することの実施可能性を試験したい場合、５つの異なるペプチド合成を行って試験のための５ペプチドを得ることが従来必要であった。可能な置換基が容易に入手し得る天然アミノ酸等である場合にこれが実施可能であるが、しばしばペプチドの性質を改善しようと努力して、ペプチド化学者は一般に市販されていない新規なアミノ酸を使用するようになった。これは幾つかの困難な追加の工程（即ち、新規なアミノ酸の合成、その解明及び合成のための誘導体化）を頻繁に必要とし、５つ以上の工程を掛け合わせる時、それは極めて面倒になる。こうして、バイオポテンシー試験のために多種ペプチド類似体を合成する現行方法は非効率的であり、コストがかかるものと考えられる。また、現行の学術的かつ医薬の研究は新しい生物活性リードの発見のための化学多様性（ペプチドライブラリーまたはペプチド擬態ライブラリー）を生じるための方法の開発に集中していた。これに関して、現在ペプチドライブラリーと称されているものを合成することが有効であり得ることが示された。このアプローチは一般に固相合成のための化学方法の自動化及び新規な足場の同定に依存する。ペプチド主鎖を擬似する幾つかのモノマー構築ブロックが提案されており、ペプトイド、アゾール、２−イソキサゾリン、オリゴカーバメート、オリゴスルホン及びオリゴスルホキシド、ピロリノン、ビニローグ主鎖、β−メチルアミノ酸並びに擬似ペプチド結合を有する更に古典的なオリゴマーが挙げられる。一例として、多種の選択された天然アミノ酸が成長ペプチド鎖に沿って一つまたは幾つかの前もって選択された位置でカップリングされて多様な組成の多種ペプチドを生じてもよい。ペプチドをベースとする薬剤を設計する際に当業者により直面される困難に加えて、このような者は分解及び不溶性に関する関心を処理するようにしいられていた。ペプチド合成の最終ゴールは種々の疾患、例えば、ホルモン欠乏疾患の治療用の治療組成物であるので、このようなペプチドを設計し、合成する者は治療薬の投与の方法及び人体中のその後のその安定性の両方を考慮する必要がある。増大された親水性を有するペプチドは或る種の特有の利点を有する。何となれば、それらは生物学的溶液中で一層可溶性であり、それらの投与を一層容易にするからである。しばしばこのようなペプチドはそれらの長期の投与を実施可能にするために狭い範囲内で適合するそれらの親水性プロフィールを有する必要があるであろう。同様に、酵素分解に対する減少された感受性を有するペプチドがしばしば非常に好ましい。何となれば、それらが長期にわたって人体中で有効に残留するからである。また、増大された安定性を有するペプチドを提供しようとする試みがなされており、或る種の非天然アミノ酸がペプチドに酵素安定性を与えることが当業者に公知である。例えば、増大された安定性を有するペプチドの一つのグループが“ ジェミナルペプチド”と称され、この場合、ペプチドアミド基の一つ以上が反転され、即ち、CHRCONHがCHRNHCOに変更される（例えば、Katritzkyら，J.Org.Che m.55;2206-2214(1990)を参照のこと）。増大された安定性を有するペプチドの別のグループとして、“ペプトイド”と称される上記のものが挙げられる。ペプトイドは、α−アミノ酸の通常の側鎖基がα−炭素原子ではなくα−アミノ基の窒素原子に配置されるペプチドである（例えば、Simonら，P.N.A.S．89:9367-9371 (1992)を参照のこと）。しかしながら、上記ペプチドのいずれもが通常の誘導体化アミノ酸（天然及び非天然）を含むペプチドよりも効率良く合成し得ない。研究がバイオポテンシーを増大し、またはペプチドのその他の性質を改善する新しいアミノ酸について続いていた。更に、一層有効かつ経済的な方法が新規なペプチド、特に、新規な活性、増大されたバイオポテンシーまたはその他の好ましい性質についてスクリーニングするのに有益な多数のペプチドを生成するために探究され続けている。発明の要約本発明は、モノアシル化アミノグリシン誘導体（その側鎖は天然アミノ酸側鎖に似ている）であり、かつ一般にβ−炭素原子に低級アルキル（例えば、メチル）置換を有し、または有しないでα−アミノ酸を擬似するベタイドアミノ酸を提供する。また、主鎖中のα−アミノ基は必要によりアルキル化し得る。このようなベタイドアミノ酸は本明細書中“ベタイド”と称されるペプチドにとり込まれ、これらは匹敵する天然ペプチド及び／または非ベタイドアミノ酸のみの残基からつくられたペプチドに対し改良され、かつ／または特有の性質を有する。非常に重要なことに、このようなベタイドを使用するスクリーニングは非ベタイドアミノ酸のみを含む新規なペプチドを設計する際に有益な情報を与えるだけでなく、有益なベタイドを発見するのに利用し得る。ベタイドは通常の鎖延長方法でビス−保護α−アミノ−グリシン（またはα− アミノアラニンもしくはα−アミノサルコシン）の形態の構築ブロックを使用することにより合成でき、その構築ブロックはまたビス−メチル化されていてもよい。主鎖の一部ではないアミノ官能基はβ−部位アミノ基と称され、それは主鎖にとり込まれ、次いで選択的に脱保護された後にアシル化されることが好ましい。アシル化は混合され、もしくは対称の、カルボン酸（カップリング剤と一緒に）、活性エステルもしくは酸無水物、または塩化アシルを用いて行われる。また、反応（本明細書中、アシル化と広く称される）はイソシアネート、イソチオシアネート、または塩化スルホニルを用いて行われてβ−部位アミノ側鎖に同様の置換を行い得る。β−部位アミノ基が二置換される場合、その他の置換基はアルキル部分（これは本明細書中で置換アルキル基を含むものと定義される）であることが好ましい。ベタイドアミノ酸及び／またはベタイドは一般に、例えば、このような天然残基のみを含む天然アミノ酸及びペプチドと比較して三つの特有かつ所望の性質を有する。それらは、ベタイドがそれらの相当するペプチドよりもRP-HPLCで先に溶離するという事実により証明されるように、相当する天然アミノ酸またはその位置で相当する天然アミノ酸をとり込むペプチドと比較して通常の生理pHで増大された溶解性を有する。ベタイド中に、三次元側鎖配向の特有の優位（拘束）があり、これは主鎖中の同じ位置の相当する天然アミノ酸の残基の配向と較べて全く制限されているが、一方向的に非常に合成し難いＣβ−メチルアミノ酸により占有された空間に非常に似ていることが知られている。この性質は高度に特異性のペプチド、即ち、幾つかのサブタイプが存在することが知られている時に一つのレセプターサブタイプのみに結合する類似体の設計を容易にするのに特に有益である。つくられる新規なベタイドアミノ酸及びベタイドの数は既存のアシル化剤の数（何千とある）のみにより制限され、それによりこのような新規な化合物の設計に殆ど制限されない融通性を可能にする。グリシン以外の天然アミノ酸の構造に似ている側鎖を有するベタイドアミノ酸が特に重要である。一般に、これらのベタイドアミノ酸は保護された既知α−アミノ酸と同じ方法で鎖延長合成によりつくられるペプチドにとり込まれる。しかしながら、或る場合には、ペプチド鎖中または樹脂に結合され、または溶液中にあるペプチド中間体中に所望のベタイドアミノ酸を生成することが有利であり得る。スクリーニング用の個々のベタイドの調製が有益と考えられるが、ビス−保護アミノグリシン等がペプチド鎖中の所望の位置にとり込まれ、次いで複数の異なる修飾（アルキル化、アシル化等）がペプチド鎖中のこの特別の位置で残基に行われて、活性、バイオポテンシー及びその他の性質についてのその後のスクリーニングのための多種ベタイドを調製するという合成戦略がまた使用し得る。例えば、鎖中の所望の位置に保護アミノグリシンを有する特別な前駆体ペプチドが合成される。次いでこの残基のβ−部位アミノ基が選択的に脱保護され、多種のアシル化剤を使用してアシル化される。このような操作はバイオポテンシーまたはその他の望ましいペプチド特性についてスクリーニングするためのベタイドの完全アレイを独立または同時に調製することを可能にし、このような個々のベタイドは使用される多種のアシル化剤のためにアミノグリシン残基に異なる置換基を有する。その他にまた、β−部位アミノ基は多種のアルキル化剤を使用してアルキル化されてもよい。単一主鎖中に複数のアミノグリシン残基を使用することにより、夫々が２もしくは３またはそれ以上のベタイドアミノ酸を有する更に多数の異なるベタイドを生じることができる。このようなことは個々のウエルもしくはプレートまたはピンを使用して、または樹脂ビーズの床を使用して固相合成(SPPS)により行われることが好ましい。例えば、固相合成中に、樹脂の床が10の異なる部分に分けられ、次いでこれらがビーズを合わせ、それらを混合し、次いで別の保護されたアミノグシシン残基を添加し、または既に鎖中の別のアミノグシシン残基を脱保護することにより10種の異なるアシル化剤と反応させられる場合、そのグループを10 の部分に再度分けた後にそのアシル化方法が反復し得る。再度10種の異なるアシル化剤とのこのような別々の反応は100種の異なる化合物を生成するであろう。何となれば、10種の最初の中間体の夫々が10の異なる方法でその後修飾されて100 種の異なる中間体を生じるからである。第三アミノグリシン残基を鎖にカップリングすることにより、または鎖に先にとり込まれた第三アミノグリシン残基を逐次脱保護し、次いでそれを再度10の部分に分け、10種の異なるアシル化剤と反応させることにより、ビーズの組み合わされたグループを処理することによりその順序を３回繰り返すことにより、100種の中間体が1,000種の異なるベタイド中間体に変換される。こうして、本発明は多大な多様性の有益なライブラリーを生じる好ましい方法を提供する。このようなライブラリーはそれ自体が薬理学上直接有益であり、または薬剤発見に良好なリードを与える化合物の同定を可能にする。好ましい実施態様の詳細な説明本明細書に使用される用語は本発明の分野では通常であり、こうして一般に当業者に知られているように定義される。ペプチド配列は最初にアミノ末端を命名し、最後にカルボキシル末端を命名する慣例に従って記載される。本発明はベタイドアミノ酸を提供し、これらはアミノグリシン(Agl)もしくは α−アミノアラニン(Aal)またはα−アミノサルコシン(Asa)或いはビス−メチル化ジアミノグリシン(Mdg)もしくはビス−メチル化ジアミノアラニン(Mda)のモノ −アシル化変種であり、Ｎ−またはα−アミノ部位が残基のペプチド鎖の主鎖の一部になるような運命にあり、Ｎ’−またはβ−アミノ部位は天然α−アミノ酸側鎖に似ているアシル基によるように置換され、その結果、ベタイドアミノ酸は一般にα−アミノ酸を模倣する。AglまたはAalのアミノ官能基の一方または両方は必要によりアシル化の前にアルキル化し得る。好適なカルボン酸官能基による β−アミノ部位のアシル化は主鎖中のペプチド結合を開裂しないで選択的に開裂し得ない好適なアミド結合を生じる。記載の便宜のために、アシル化という用語が一般に本明細書中に使用されるが、同様に安定な結合を生じるその他の反応性試薬がその代わりに使用し得ることが理解されるべきである。例えば、β −部位アミノ基はまたイソシアネート、イソチオシアネート、塩化スルホニル等により置換されてもよい。本明細書に使用される“ベタイド”という用語は一つ以上のベタイドアミノ酸残基を含むペプチドを表し、これらは上記のようにモノ −アシル化残基であり、これらは非アルキル化、モノ−アルキル化またはジ−アルキル化でき、β−部位のアシル（またはその他の）置換は上記のように合成条件下で安定である。例えば、アミノ基の両方がメチル化されていてもよく、またそのいずれもがメチル化されていなくてもよい。ベタイドをつくるのに有益である置換α−アミノグリシンのサブクラスは本明細書中略号b-Xaaを与えられ、Xaaは既知アミノ酸、特に天然α−アミノ酸の一つに関する３文字略号である。適当なアシル化剤がとり込まれて、既知アミノ酸（側鎖を欠いているグリシンを除く）の側鎖に近似する側鎖を生じ、或る場合には低級アルキル基（例えば、メチルまたはエチル）がβ−部位アミノ基に置換される。全てのこれらのベタイドアミノ酸中、側鎖アミド結合(HN-C=O)は定義により天然アミノ酸中のβCH₂(メチレン)に相当する。しかしながら、或る場合には、アミド結合は、特別なベタイドアミノ酸が一般に相同α−アミノ酸（例えば、ベタイド−バリン及びイソロイシン）と等配電子であるような効果を有し得る。或る場合にはまた、Ｃβメチル−置換α−アミノ酸に立体的近似性があり得る。b- hXaa中のような“h”は、側鎖が指摘された天然α−アミノ酸の側鎖と比較して一つの付加的な炭素原子を有する同族体であることを示す。しかしながら、或る観点から、それは相当する天然アミノ酸側鎖の構造に更に近似し得る。例えば、 b-hCysは構造：を有し、γ−（チオールメチル）アミドグリシンと命名し得る。接頭辞“n”は、その近似が天然α−アミノ酸の“nor”変種、即ち、一つのメチレン基だけ短縮された変種に近いことを示す。特定の側鎖は相当する天然α−アミノ酸の側鎖に構造上似ているが、ベタイド中のこれらの残基の或るものの配置は、先に説明されたように、Ｃβ−メチル天然アミノ酸の三次元配置に更に近似し、この理由のためにそれらを特に貴重かつ有益にし得る。以下は、夫々の側鎖が左側の欄のベタイド命名に含まれる天然またはその他の公知のα−アミノ酸の側鎖を模倣するように設計されたベタイドアミノ酸（置換 α−アミノグリシン）のリストである。 b-Ala＝H₂NCH(NHC(O)H)COOH＝アミドグリシンまたはホルミル−アミドグリシンb -hAla＝H₂NCH(NHC(O)CH₃)COOH＝γ−メチルアミドグリシンまたはアセチル−アミドグリシン b-Leu＝H₂NCH(NHC(O)CH(CH₃)₂)COOH＝γ−イソプロピルアミドグリシン b-Val＝H₂NCH(NCH₃C(O)CH₃)COOH＝β，γ−ジメチルアミドグリシン；またIleイソステアを構成するものと考えられる b-Ilel＝H₂NCH(NCH₃C(O)CH₂CH₃)COOH b-hSer＝H₂NCH(NHC(O)CH₂OH)COOH＝γ−（ヒドロキシメチル）アミドグリシン b-hThr＝H₂NCH(N(CH₃)C(O)CH₂OH)COOH＝γ−メチル（ヒドロキシメチル）アミドグリシン b-hCys＝H₂NCH(NHC(O)CH₂SH)COOH＝γ−（チオールメチル）アミドグリシン b-Met＝H₂NCH(NHC(O)CH₂SCH₃)COOH＝γ−メチルチオメチルアミドグリシン b-Phe＝H₂NCH(NHC(O)C₆H₅)COOH＝γ−フェニルアミドグリシン b-Tyr＝H₂NCH(NHC(O)C₆H₄OH)COOH＝γ−（４−ヒドロキシ）フェニルアミドグリシン b-Trp＝H₂NCH(NHC(O)C₈H₅NH)COOH＝γ−インドリルアミドグリシン b-Lys＝H₂NCH(NHC(O)CH₂CH₂CH₂NH₂)COOH；またhomoLysイソステアを構成するものと考えられる b-nArg＝H₂NCH(NHC(O)CH₂NHC(=NH)NH₂)COOH＝γ−メチルグアニジノアミドグリシン；またArgイソステアを構成するものと考えられる b-Arg＝H₂NCH(NHC(O)CH₂CH₂NHC(=NH)NH₂)COOH＝γ−エチルグアニジノアミドグリシン b-His＝H₂NCH(NHC(O)C₃N₂H₃)COOH＝γ−イミダゾリルアミドグリシン b-Asp＝H₂NCH(NHC(O)COOH)COOH＝γ−カルボキシアミドグリシン；またGluイソステアを構成するものと考えられる b-Asn＝H₂NCH(NHC(O)CONH₂)COOH＝γ−アミドアミドグリシン；またGlnイソステアを構成するものと考えられる b-Glu＝H₂NCH(NHC(O)CH₂COOH)COOH＝γ−（カルボキシメチル）アミドグリシン；またhomoGluイソステアを構成するものと考えられる b-Gln＝H₂NCH(NHC(O)CH₂CONH₂)COOH＝γ−（カルボキサミドメチル）アミドグリシン；またhomoGlnイソステアを構成するものと考えられるイソステアは、その他と同じ立体配置を有し、その結果、それが同じ三次元空間を占有する分子である。この新規な方法はまたhomo-Xaa、homo-homo-Xaa等の如き延長された側鎖を有するα−アミノ酸に対し均等なアミノ酸への容易なアクセスを与えることがわかる。 “天然アミノ酸グループ”という用語は16種のアミノ酸の以下のグループを表すために本明細書に使用される。アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu) 、イソロイシン(Ile)、リシン(Lys)、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)、プロリン(Pro)、フェニルアラニン(Phe)、チロシン(Tyr)、トリプトファン(Trp)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、アスパラギン酸(Asn)、グルタミン( Gln)及びメチオニン(Met)--これらから、グリシン(Gly)、セリン(Ser)、スレオニン(Thr)及びシステイン(Cys)が除外された。本明細書に使用される“非天然アミノ酸”という用語は天然α−アミノ酸ではない全てのα−アミノ酸を表す。これは、例えば、上記ベタイドアミノ酸、β− メチルα−アミノ酸並びに天然アミノ酸のその他の誘導体及び同族体、例えば、オルニチン(Orn)、ノルロイシン(Nle)、ピリジルアラニン(PAL)、γ−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン(β-D-2NAL)、Ｎε−５’−（３’−アミノ−１Ｈ−１ ’，２’，４’−トリアゾリル）リシン(Lys(atz))等を含む。これらの非天然α −アミノ酸のベタイドアミノ酸形態として、以下のものが挙げられる。 b-Abu＝H₂NCH(NCH₃C(O)H)COOH＝β−メチルアミドグリシン；またValイソステアを構成するものと考えられる b-Nle＝H₂NCH(NHC(O)CH₂CH₂CH₃)COOH＝γ−プロピル−アミドグリシン、 b-Orn＝H₂NCH(NHC(O)CH₂CH₂NH₂)COOH＝γ−（２−アミノエチル）アミドグリシン；またLysイソステアを構成するものと考えられる b-PAL＝H₂NCH(NHC(O)C₅NH₄)COOH＝γ−ピリジル−アミドグリシン、 b-NAL＝H₂NCH(NHC(O)C₁₀H₇)COOH＝γ−ナフチル−アミドグリシン、 b-Cpa＝H₂NCH(NHC(O)C₆H₄Cl)COOH＝γ−４−クロロフェニル−アミドグリシン、及び b-Fpa＝H₂NCH(NHC(O)C₆H₄F)COOH＝γ−４−フルオロフェニル−アミドグリシン本明細書に使用される“ベタイドライブラリー”という用語は生物活性ペプチドまたはその他の特有の性質を有するペプチドの多数の異なる類似体を含むつくられたアレイを表し、そのアレイ中の夫々の類似体化合物中の少なくとも一つの残基がベタイドアミノ酸であり、かつ種々の異なるベタイドアミノ酸がアレイ中に存在する。このようなベタイドライブラリーを生成するための一種以上の中間体ペプチドまたはペプチド樹脂が合成され、次いで、例えば、原液または原ペプチド樹脂として維持されてもよく、これから多種のこのような異なる類似体が研究を集中している類似体中のこのような一つ以上の位置にある特に重要な側鎖を有する一つ以上の残基をとり込むことの結果としてバイオポテンシーまたは或る種のその他の活性もしくは性質に対するこのような置換の効果を測定するためのスクリーニングに使用し得る。一つのこのような中間体はアミノグリシン残基を含んでもよく、一方その他の中間体は同じ位置にAal残基もしくはAsa残基または Mdg残基或いはMda残基を含んでもよい。一つの局面において、本発明は“ベタイドアミノ酸”と称される非天然アミノ酸を提供し、これらはＬ−異性体もしくはＤ−異性体またはＤ／Ｌ混合物であってもよく、これらは一般式：（式中、Ｒ₁は不安定なα−アミノ−保護基であり、Ｒ及びＲ₂は独立に水素または置換もしくは未置換低級アルキル(好ましくはC₁-C₄)であり、そのアルキル置換基は、例えば、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ等であってもよく、かつＲ₃はアミノ反応性試薬の残部、例えば、アシル基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、スルホニル基等である）により表される。更に広い局面において、本発明はこのようなベタイドアミノ酸を提供し、これらはＬ−異性体もしくはＤ−異性体またはＤ／Ｌ混合物であってもよく、これらは一般式：（式中、Ｒ₀はＨまたはCH₃であり、Ｒ，Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は先に定義されたとおりであり、かつＲ₆はカルボキシ官能基の不安定な保護基またはブロッキング基である）により表される。ＲがCH₃である残基を含むベタイドは、例えば、α−アミノサルコシン(Asa)誘導体を使用することにより合成し得る。ベタイドにとり込み得る何千ものアシル基等があり、その例として、置換または未置換の、直鎖または分岐鎖のカルボン酸もしくは複素環カルボン酸またはそれらの夫々のアシルハライド、活性エステル、酸無水物等との反応の生成物が挙げられる。置換はクロロ、ブロモ、フルオロ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ等の如き基によるものであってもよい。ベタイドアミノ酸の一つの好ましいサブクラスとして、Ｒ₃が天然アミノ酸の側鎖に似ているアシル基であり、Ｒ₂がＨまたはCH₃であるものが挙げられ、このようなアシル基の例として、が挙げられる。ペプチド類似体を合成するのに一般に有益であると考えられる別の好ましいサブクラスは、Ｒ₂または一緒にＲ₂とＲ₃が普通のアミノ酸誘導体または同族体にかなり似ているように選ばれるベタイドアミノ酸を含む。Ｒ₂はＨ、CH₃CH₂R₇またはCH₂CH₃であり、R₇はOH、OMe、Cl、F、Br、Ｉ、NH₂、COOH、SHまたは均等物である。Ｒ₃は以下の基から選ばれる。別の局面において、本発明は少なくとも一つのベタイドアミノ酸（先に定義されたとおり）を有するベタイドを提供し、このようなベタイドは式：Ｘ_N−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｘ_m−Ｘ₄−Ｘ₅−Ｘ₆−Ｘ_c で表される（式中、Ｘ_Nはアシル基もしくはその他のＮ末端基またはこのようなＮ末端基を有する長さ約50アミノ酸までのペプチドであり、Ｘ_cはOH、NH₂もしくはその他のＣ末端基またはこのようなＣ末端基を有する長さ約50アミノ酸までのペプチドであり、Ｘ_mはdes-Xまたは約50アミノ酸までのペプチドであり、かつＸ₁〜Ｘ₆は夫々独立にdes-X、ベタイドアミノ酸、天然α−アミノ酸または非天然α−アミノ酸であるが、但し、Ｘ₁〜Ｘ₆の少なくとも一つが式：のベタイドアミノ酸の残基であること、及びＸ₁〜Ｘ₆のその他が式：の異なるベタイドアミノ酸の残基またはα−アミノ酸（式中、Ｒ₀、Ｒ、Ｒ₂及びＲ₃は先に定義されたとおりである）であることを条件とし、更にベタイドアミノ酸の付加的な残基が必要によりＸ_n、Ｘ_m及びＸ_c中に含まれてもよいことを条件とする）。更に別の局面において、本発明はベタイドの合成方法を提供し、その方法は a)Ｎ末端に遊離α−アミノ基を有するアミノ酸残基を有するペプチド中間体を供給し、 b)式：（式中、Ｒ₁及びＲ₅はその他の基の除去を生じない条件下で独立に除去できる不安定なアミノ保護基である）で表される保護されたベタイドアミノ酸前駆体を供給し、 c)前記前駆体を前記中間体のＮ末端にカップリングしてその長さを一つの残基だけ延長し、 d)Ｒ₁を除去し、少なくとも一つのα−アミノ保護アミノ酸またはペプチドをそれにカップリングし、またはＲにアルキル基を導入し、次いで少なくとも一つのα−アミノ保護アミノ酸またはペプチドをそれにカップリングし、 e)Ｒ₅を前記中間体から除去してアミノ基を脱保護し、そして f)必要により脱保護されたアミノ基をアルキル化剤で修飾してＲ₂に低級アルキル部分を導入し、アミノ反応性試薬、例えば、カルボン酸、活性エステルもしくは酸無水物、アシルハライド、イソシアネートまたはイソチオイソシアネート、塩化スルホニル等との反応を行って付加反応をＲ₅の除去の部位で起こらせることを特徴とする。更に別の局面において、本発明はベタイドの合成方法を提供し、その方法は a)式：（式中、Ｒ₀はＨまたはCH₃であり、Ｒ，及びＲ₅はその他の基の除去を生じない条件下で独立に除去可能な不安定なアミノ保護基であり、Ｒ及びＲ₂はＨまたは低級アルキルであり、かつＲ₆はカルボキシ官能基の不安定な保護基またはブロッキング基である）で表される保護されたベタイドアミノ酸前駆体を供給し、 b)Ｒ₁またはＲ₆を除去し、少なくとも一種の適当に保護されたアミノ酸またはペプチドをそれにカップリングしてペプチド中間体を生じ、 c)Ｒ₅を前記中間体から除去してアミノ基を脱保護し、そして d)必要により脱保護されたアミノ基をアルキル化剤で修飾してＲ₂に低級アルキル部分を導入し、次いでアミノ反応性試薬、例えば、カルボン酸、活性エステルもしくは酸無水物、アシルハライド、イソシアネートまたはイソチオイソシアネート、塩化スルホニル等との反応を行って付加反応をＲ₅の除去の部位で起こらせることを特徴とする。α−カルボキシル基は古典的溶液合成の技術で公知であるように好適なエステル、例えば、ベンジルエステル及びアルキルエステルにより保護でき、または所望のベタイドのＣ末端にある時にアミド化によるようにブロックし得る。本発明は鎖延長プロトコルによる所望のベタイドの別の製造方法を提供し、その方法は a)樹脂またはN末端に遊離α−アミノ基を有するアミノ酸残基を有するペプチド中間体を供給する工程、 b)式：（式中、Ｒ₀はＨまたはCH₃であり、ＲはＨまたは低級アルキルであり、Ｒ₁は不安定なα−アミノ保護基であり、かつＲ₅は不安定なアミノ保護基であり、Ｒ₁及びＲ₅はその他の基の除去を生じない条件下で夫々除去可能である）で表される非天然α−アミノ酸を供給する工程、 c)前記の非天然アミノ酸を前記樹脂または前記中間体の前記Ｎ末端にカップリングする工程、 d)Ｒ₁を除去し、少なくとも一種のα−アミノ保護されたアミノ酸またはペプチドをそれにカップリングする工程、 e)Ｒ₅を前記中間体から除去する工程、及び f)アミノ反応性試薬、例えば、カルボン酸、活性エステルまたは酸無水物、アシルハライド、イソシアネートまたはイソチオシアネート、塩化スルホニル等を供給し、付加反応をＲ₅の除去の部位で起こらせる工程を含む。現在好ましいベタイドは、天然産ペプチドの類似体であるベタイドである。例示のみとして、これらのベタイドは、上記の少なくとも一種のベタイドアミノ酸を含む、ソマトスタチン、バソプレシン、アンギオテンシン、チロトロピン放出ホルモン(TRH)、成長ホルモン放出ホルモン(GRF)、成長ホルモン放出ペプチド(G RP)、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)、ブラジキニン、物質Ｐ、ボンベシン、α-MSH、オピオイドペプチド、及びコルチコトロピン放出因子(CRF)の類似体であってもよく、これらのベタイドは相当する天然ペプチド等と比較して改良されたバイオポテンシーを有し、または或る物理的／化学的局面において改良されている。その他の好ましいベタイドは、アスパーテーム(aspartame)(ペプチドをベースとする糖代替物)の如き小さい活性分子の類似体であるベタイドである。更に別の局面において、本発明は医薬上許される賦形剤と組み合わせて本発明の一種以上のベタイドを含む医薬組成物を提供する。更に別の局面において、本発明はベタイド類似体をバイオポテンシーまたはその他の所望の活性もしくは性質についてスクリーニングするのに使用するためのベタイドライブラリーを容易かつ経済的に合成する方法を提供する。このようなスクリーニングはベタイドアミノ酸の使用から得られる望ましい構造を同定するのに有益であり、これはその後に所望により更に改良された性質を有し得るペプチドのその後の合成のために同様の望ましい構造を非天然非ベタイドアミノ酸にとり込ませる。更に、本発明はベタイドのライブラリー及び上記鎖延長プロトコルを使用するこのようなライブラリーの生成方法（このような式で表されるこのようなα−アミノ酸の１個もしくは２個またはそれ以上の残基が鎖中に含まれる）を提供する。複数のアミノグリシン残基を単一主鎖中に使用することにより、夫々がベタイドアミノ酸の２個もしくは３個またはそれ以上の残基を有する多数の異なるベタイドがつくられる。例えば、固相合成中に、樹脂のビーズが10の異なる部分に分けられてもよく、一つのアミノグリシン残基の側鎖アミノ基が10種の異なるアシル化剤と反応させられ、次いで、ビーズを再度組み合わせ、それらを混合し、次いで別の保護されたアミノグリシン残基を添加し、または鎖中の別のアミノグリシン残基を別々に脱保護し、再度そのグループを10の部分に分けた後にアシル化方法を10種の異なるアシル化剤を用いて繰り返すと、100種の異なる中間体を生成するであろう。何となれば、10種の最初の中間体の夫々が10種の新しい中間体に変換されるからである。第三のアミノグリシン残基を鎖にカップリングすることにより、または鎖中に先にとり込まれた第三のアミノグリシン残基を適当に逐次脱保護し、次いで再度組み合わされたグループを10の部分に再度分けて、10種の異なるアシル化剤と反応させることにより、その順序を３回繰り返すことにより、100種の中間体が1,000種の異なるベタイドに変換される。こうして、本発明は多大な多様性の有益なライブラリーを生成する別法を提供する。以上の一例として、２種または３種のこのような非天然アミノ酸が鎖にカップリングされ、これらの夫々が異なる不安定なＲ₅保護基を有し、即ち、一つが塩基不安定であってもよく、その他がチオ不安定であってもよく、第三の基がヒドラジン不安定であってもよい。このような場合、保護基が組み合わされたペプチド樹脂から逐次除去され、例えば、最初に塩基不安定基を除去し、樹脂ビーズが等しい部分に分けられ、次いで夫々の部分が反応させられてＲ₅の部位でアシル化または同様の付加反応を行う。次いで樹脂ビーズが再度組み合わされ、混合され、第二Ｒ₅保護基、例えば、チオ不安定基が分割の前に除去され、反応が再度行われる。続いて、再組み合わせ及びヒドラジン不安定保護基の除去後に、最終の分割及び反応が行われる。このようなプロトコルが使用される場合、夫々のビードは正確に同じ中間体配列を含むであろう。それ故、特別なビードからベタイドを部分的に開裂し、脱保護し、それを生物学的性質について試験することにより、それが有利な性質を有することが判明する場合、有益であることが示されたライブラリーのこの員の特別な配列を決定するように樹脂のビードに残っているベタイドを配列決定することが可能である。このような部分的開裂は、当業界で知られているような直交分断し得る２種の異なるリンカー、例えば、強酸不安定リンカーと光不安定リンカーを使用してＣ末端残基を樹脂に結合することにより促進される。また、３種のこのようなジアミノ酸をこのような側鎖反応の最初の前に鎖にカップリングすることに代えて、一つの反応が、例えば、塩基不安定Ｒ₅保護基を最初に除去することにより、単一のこのような残基のみを含む中間体を用いて行い得る。その後、樹脂ビーズの部分が再度組み合わされ、その後に、鎖延長プロトコルが続けられて塩基不安定である保護基を有する第二のこのようなジアミノ残基を鎖に再度カップリングする。再度、保護基の除去及び分割後に、反応が脱保護された側鎖アミノ基の部位で行われる。その後、ビーズが再度組み合わされ、更なる鎖延長が所望により更に別のこのようなジアミノアミノ酸のカップリング、次いで以上の側鎖反応工程を再度繰り返すことを含み得る方法で行われる。この戦略を使用して、３種以上のこのようなベタイドアミノ酸が所望により単一鎖中に含まれ、こうして最終のライブラリー中に存在するベタイドの数を増加し得ることがわかる。樹脂ビーズを使用する代わりに、SPPSに適した樹脂を含むプレートもしくはピンまたはウェルが使用でき、その場合、個々の反応が夫々の工程で夫々のこのようなピンまたはウェル等を用いて行われる。結果は、例えば、96ウェルミクロタイタプレート等を使用して96種の異なるベタイドの自動化された合成を与える。その戦略は、夫々のウェルがアミノ反応性試薬の異なる順列で処理されること以外は先に説明されたのと殆ど同じ方法で行われ、その結果、合成の完結時に、96 種の異なるベタイドがウェルの夫々中で１種ずつつくられたであろう。アミノ反応性試薬のどんな順序が夫々のウェル中でベタイド合成に使用されたかについて知られていたので、夫々のウェル中の特別なベタイドの組成が知られ、その結果、その後の試験が特別なベタイドを特にバイオポテントであることを示す場合に、残りのベタイドを配列決定することが必要ではないであろう。何となれば、その特別なベタイド鎖を構成する残基の配列の記録があるからである。ベタイドアミノ酸は、文献に記載されており、一般に当業者に知られている方法を使用して調製し得る。例えば、一つのアミノ基に保護基（Ｒ₁）を有し、所望の側鎖ＮＲ₂Ｒ₃を有する上記式の特別なベタイドアミノ酸が調製でき、このような保護されたベタイドアミノ酸が通常の鎖延長ペプチド合成において成長しているペプチド鎖にカップリングし得る。また好ましくは、適当に保護されたアミノグリシンまたはα−アミノアラニンが合成中にペプチド鎖中の所望の位置で付加し得る。続いて、側鎖アミノ基が脱保護され、必要によりアルキル化され、次いでアシル化される。脱保護、アルキル化及びアシル化は古典的溶液合成のように溶液中で、またはSPPSのように樹脂に付着された間にペプチド中間体または成熟ペプチドについて行い得る。アシル化またはその他の付加反応は、脱保護されたアミノ基をアミノ反応性試薬、即ち、カルボン酸、活性エステルまたは酸無水物、アシルハライド、例えば、塩化物、イソシアネートまたはチオイソシアネート、塩化スルホニル等と反応させることにより行われる。カルボン酸が使用される場合、通常のカップリング剤がこの分野で公知のように含まれる。所望の側鎖の構造に似ているアシル化剤が使用されることが好ましい。例えば、脱保護されたα−アミノグリシン残基を適当な反応条件下で塩化ベンゾイルと反応させると、Pheの側鎖に似ている側鎖を有するベタイドの生成をもたらし、また最初にメチル化される場合、その残基は一般にＣβ−メチルーフェニルアラニンの性質を模倣する性質を示すであろう。適当に保護されたアミノグリシン(Agl)はBrockら，J.Org.Chem．51:3718(1986 )により記載された方法またはQasmiら，Tetrahedron Letters 34(24):3861(1993 )により最近記載された方法に従って合成し得る。後の文献に、BocまたはFmoc戦略を使用する固相ペプチド合成(SPPS)によるペプチドへのとり込みに特に適した差別的に保護されたアミノグリシンをつくるための戦略が記載されている。差別的に保護されたα−アミノグリシン及びそれらのペプチド誘導体を調製するための別の合成がSchmidt,U.ら，Synthesis，94，890-892（1994年９月）に開示されている。差別的に保護されたα−アミノアランン及びα−アミノサルコシンがこれらの方法またはSimonらの上記文献に開示された方法によりつくられてもよい。保護されたα−アミノグリシンを調製し、それをペプチド鎖にとり込む際に、アミノ基の一つが時折直交に保護されると称される、別のアミノ基に使用された保護とは異なる方法で保護されることが好ましく、その結果、両方の基が他の基に影響しないで選択的に脱保護し得る。単一のBoc基のみが（ビス-Boc）Aglから除去される別法が以下に記載される。完全なα−アミノグリシンを含むペプチド鎖の完結（またはその所望の中間の長さで、Aglをカップリングした直後を含む）後に、α−アミノグリシン残基の側鎖アミノ基は脱保護され、Aglが挿入されたペプチド鎖中の位置で一つ以上の所望の側鎖基をつくるように選択的に反応させられる。以下に詳しく説明されるように、ベタイドを調製するこの方法は“ベタイドライブラリー”の合成に特に適しており、この場合、多種のアシル化剤が多種の異なるベタイドを独立に、または同時に生じるのに使用される。必要により、多種のアルキル化剤がまた使用されてもよい。アミノグリシンをペプチド足場にとり込む代わりに、Aal、Asa、MdgまたはMdaが使用し得る。ペプチド中間体へのビス保護されたアミノグリシンのカップリング後に側鎖を直ちにつくることが所望される場合、合成のこの時点で、鎖延長方法がこれらの二つの基のいずれか一つから起こり得るために、夫々のアミノ基の二つの保護基のいずれかが除去し得る。例えば、普通使用されるBoc戦略において、Boc保護がアミノ基の一つについて使用され、好適なその他の保護基が別のアミノ基について使用され、その結果、その他のアミノ保護基はBocを除去するのに使用される温和な酸性条件下で除去されないであろう。その他の保護基は塩基不安定である保護基、例えば、Fmoc、チオール不安定である保護基、ヒドラジン不安定である保護基、光不安定である保護基、還元により開裂される保護基等であってもよい。このような場合、Boc基が最初に除去されてもよく、次いで鎖が延長でき、またはアルキル化反応及び／またはアシル化反応が行われて所望の側鎖を生じることができる。例えば、ベタイドアミノ酸中のＲまたはＲ₂置換基がメチル置換基であることが所望される場合、Boc基の除去により生じた一級アミノ基は、トリエチルアミンの存在下の酸感受性の４，４’−ジメトキシベンズヒドリルクロリドとの反応によるように、除去可能な基で一時的にアルキル化されてもよい。Ｒ₂が望ましくはメチルであると仮定すると、この得られる二級アミノ基はその後に過剰のシアノホウ水素化物の存在下でＮ−メチルピロリドン(NMP)を含む30容量％の溶液としての36重量％の水性ホルムアルデヒドによる処理によりメチル化し得る。その後、DCM中60％のTFAで処理してジメトキシベンズヒドリル基を除去し、二級アミノ基を生じる。次いで所望のアシル化剤による処理により反応が行われて二置換側鎖アミノ基を生じる。次いでFmoc保護基が除去されて鎖延長を続ける。また、簡単なアシル化またはその他のアミノ反応性試薬、例えば、イソシアネートを使用する反応がβ−アミノ部位で行われている場合、Fmoc保護が最初に除去されて一級アミノ基を与えることができ、これが直ちに反応させられて所望の側鎖を生じる。このような場合、Boc保護は続いて除去されて鎖延長を進行する。ベタイドは古典的溶液合成により、または好ましくは固相技術により合成し得る。古典的液相合成において、この分野で公知のように、付加が成長している鎖のＮ末端またはＣ末端になされてもよい。SPPSが使用される場合、延長はＮ末端で行われることが好ましい。特にＣ末端が遊離酸である場合、クロロメチル化樹脂またはヒドロキシメチル化樹脂が使用されてもよい。しかしながら、関係するペプチドがアミド化Ｃ末端を有する場合、開裂後にＣ末端アミドまたは置換アミドを直接得るために、メチルベンズヒドリルアミン(MBHA)樹脂、ベンズヒドリルアミン(BHA)樹脂または当業界で知られている或る種のその他の好適な樹脂が使用されることが好ましい。例えば、Ｃ末端に置換アミドを有するペプチドは1986 年２月11日に発行された米国特許第4,569,967号に教示されるようにＮ−アルキルアミノメチル樹脂を使用して有効に合成し得る。固相合成またはその他の鎖延長合成は米国特許第4,211,693号に詳しく示された方法で成長している鎖へのアミノ酸の段階的付加により行われる。側鎖保護基は当業界で公知であり、特に反応性の側鎖を有するアミノ酸の一部、例えば、トシルにより保護されたHis及びb-Hisとして含まれることが好ましい。それらは必要によりTrp及びb-Trpの如き或る種のその他のアミノ酸の場合に含まれる。全てのアミノ酸（アミノグリシン誘導体を含む）が樹脂上でつくられている鎖中で一緒にカップリングされた場合、充分に保護された中間体ペプチド樹脂が得られ、次いでこれはβ−アミノ官能基を選択的に脱ブロックし、β−部位アミノ基をアシル化して合成安定なアシル基またはその他の基を付加することによりベタイド樹脂に変換し得る。アミノグリシン(Agl)残基はこの時点で修飾されてベタイドを生じることでき、または修飾が完全長より小さい中間体ペプチド樹脂に対し早期段階で、例えば、Aglをカップリングした直後でかつ次のアミノ酸を鎖に付加する前に行い得る。２位にベタイドアミノ酸残基を有するゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)のベタイド類似体をつくるための中間体の一例が式：X¹-AA₁(X²)-Agl(X³)-AA₃(X²)-S er(X⁴)-AA₅(X⁵)-D-AA₆-AA₇(X²またはX⁵)-AA₈(X⁶またはX⁷)-Pro-X⁸により表され、α−位の残基はベタイドアミノ酸の足場を与え、AA₁、AA₃、AA₅、D-AA₆、AA₇ 及びAA₈はこれらの夫々の位置で有効であることがわかった既知アミノ酸残基である。例えば、このようなベタイド類似体がベースとし得る種々のGnRHアゴニスト及びアンタゴニストが米国特許第5,296,468号に記載されている。 X¹はポリペプチドの段階的合成において当業界で有益であることが知られている型のα−アミノ保護基またはブロッキング基である。α−アミノ保護基のクラスの中に、(1)芳香族ウレタン型保護基、例えば、ベンジルオキシカルボニル(Z) 、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)及び置換ベンジルオキシカルボニル、例えば、p-クロロベンジルオキシ−カルボニル(Clz)、p-ニトロベンジルオキシカルボニル、p-ブロモベンジルオキシカルボニル及びp-メトキシベンジルオキシカルボニル、(2)脂肪族ウレタン保護基、例えば、tertブチルオキシカルボニル(Boc)、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル及びアリルオキシカルボニル、(3)シクロアルキルウレタン型保護基、例えば、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル及びシクロヘキシルオキシカルボニル、(4)チオウレタン型保護基、例えば、フェニルチオカルボニル、(5)アルキル型保護基、例えば、アリル(Aly) 、トリフェニルメチル（トリチル）及びベンジル(Bzl)、(6)トリアルキルシラン基、例えば、トリメチルシランがある。好ましいα−アミノ保護基はBoc及びFmo cである。また、所望のベタイドのＮ末端の残基について使用し得るα−アミノブロッキング基のクラスの中に、アシル型基、例えば、アセチル(Ac)、ホルミル (For)、トリフルオロアセチル、アクリリル(Acr)、クロロアセチル等があり、Acが好ましい。 X²は水素またはTrpのインドール窒素の保護基、例えば、Bz、AcまたはForである。多くの合成において、Trpを保護する必要はないが、保護が所望される場合には、ホルミルが好ましい。 X³はα−アミノ保護基が除去される時に除去されないAglまたはAal等の側鎖アミノ基の保護基である。例示の例として、(1)塩基不安定基、例えば、Fmoc、または或る種のその他の弱塩基安定、芳香族ウレタン型保護基、(2)チオール不安定基、例えば、ジチアスクシノイル(Dts)(これはチオール分解により除去または開裂し得る)、(3)ヒドラジン不安定基、例えば、フタロイル(Pht)(これはヒドラジン分解により開裂される)、(4)求核試薬不安定基、例えば、o-ニトロフェニルースルフェニル(Nps)等（これらはチオアセトアミドまたは弱酸もしくはそれらの塩により開裂される）、(5)光不安定基（これらは光分解により開裂される）、及び(6)還元により選択的に除去可能な基、例えば、Dtsが挙げられる。Fmocが Boc SPPS戦略に好ましい。また、X³は所望のベタイドアミノ酸の最終の側鎖を構成するアシル基であってもよい。アシル基の性質に応じて、付加的な保護がこの基について必要とされるかもしれない。 X⁴は水素またはSerのヒドロキシル側鎖の保護基、例えば、Ac、Bz、トリチル、DCBまたはベンジルエーテル(Bzl)であり、Bzlであることが好ましい。 X⁵は水素またはテトラヒドロピラニル、tert-ブチル、トリチル、ベンジル、Ｚ、２−ブロモベンジルオキシカルボニル(2BrZ)及び２，６−ジクロロベンジル (DCB)からなる群から選ばれたTyrのフェノール性ヒドロキシル基の保護基である。2BrZが好ましい。 X⁶はArgまたはHar中の側鎖グアニジノ基の保護基、例えば、Boc、ニトロ、Tos 、トリチル、アダマンチルオキシカルボニル、Ｚ及び２，４−ジニトロフェノール(Dnp)であり、またはX⁶は水素であってもよく、これは側鎖基原子に保護がないことを意味する。Tosが一般に好ましい。 X⁷は一級または二級アミノ側鎖基の保護基、例えば、Ｚまたは2ClZである。 X⁸はGly-NH-［樹脂担体］、D-Ala-NH［樹脂担体］またはN(A)-［樹脂担体］であってもよい。また、X⁸はGlyもしくはD-Alaのアミド、またはPro、 NHNHCONH₂等に直接付着された置換アミドであってもよい。 X⁸基がGly-NH-［樹脂担体］またはD-Ala-NH［樹脂担体］である場合、アミド結合がGlyまたはD-AlaをBHA樹脂またはMBHA樹脂に連結する。X⁸基がN(A)-［樹脂担体］である場合、置換アミド結合がProをＮ−アルキルアミノメチル(NAAM)樹脂に連結する。X⁸がAzaGly-NH₂である場合、ペプチドが米国特許第4,234,571号に開示されているように古典的溶液合成によりつくられることが好ましい。好適な保護基の選択は、本発明が関係する当業者の技能内にある。好適な保護基の選択に関する更なる情報がBarany,G.; Kneib-Cordonier,N.; Mullen,D.G.“ Solid-phase peptide synthesis: a Silver Anniversary report”，Intl.J.Pro t.Pep.Res．1987，30，705-739、並びにBarany,G．及びMerrifield,R.B.“Solid -phase peptide synthesis”，The Peptides，Analysis，Synthesis，Bi-ology; Gross,E.，Meienhofer,J.編集，Academic Press，New York，1980; V.2,ppl-28 4において入手し得る。 X²-X⁷について側鎖保護基の或るものを選択するための基準は、保護基が合成の夫々の工程でα−アミノ保護基(好ましくはBoc)を除去するのに選ばれた反応条件下で試薬に対し安定であるべきことである。これらの保護基は一般にカップリング条件下で開裂されるべきではないが、ペプチド鎖を変化させない反応条件下で所望のアミノ配列の合成の完結後に除去可能であるべきである。Agl残基に使用されるその他の保護基（これはまたGnRHアンタゴニスト中の或る種の５位及び／または６位の残基に使用されてもよい）は、これらの位置で所望の最終残基をつくるのに行われるその後の反応を可能にするために、以下に説明されるように、樹脂からの開裂の前に除去される。こうして、例えば、一つのかなり特別な局面において、本発明はまた式：Ac- β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-AA₃-Ser-Aph(Ac)-D-Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂（式中、AA₃は先に示されたベタイドアミノ酸の残基である）で表されるGnRHアンタゴニストの製造方法を提供し、その方法は(a)式：X¹-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-A gl(X³)-Ser(X⁴)-Aph(Ac)-D-Aph(Ac)-Leu-ILys(X⁷)-Pro-D-Ala-NH-［樹脂担体］（式中、X¹は水素またはα−アミノ保護基であり、X³はその他の保護基を除去しないで除去可能であるアミノ保護基であり、X⁴はSerのヒドロキシル基の保護基であり、かつX⁷はアミノ側鎖の保護基である）で表される中間体ペプチドを生成し、(b)X¹を除去し、Ｎ末端をアシル化し、(c)X³をAglから除去し、前記中間体ペプチド中のその側鎖アミノ基を脱保護し、(d)前記脱保護された側鎖アミノ基を反応させてこの残基を所望のβ−部位修飾を有するものにつくり、そして(e)残りの保護基を開裂し、かつ／またはX⁸中に含まれる樹脂担体から開裂することを特徴とする。ベタイドの精製は、当業界で知られており、またJ.Riverら，J.Chromatogra-p hy，288(1984)303-328に詳しく示されているように、既知の操作、例えば、CMC カラムによるイオン交換クロマトグラフィー、続いてセファデックスG-25を充填されたカラムで好適な溶離系、例えば、ｎ−ブタノール:0.1N酢酸(1:1の容積比) を使用する分配クロマトグラフィーにより、かつ／またはHPLCを使用することにより行われる。これらの如きGnRHアンタゴニストは、雌ラットの***を防止するために発情前期の日の正午あたりに皮下投与された時に、体重１kg当たり100μg 未満のレベルで有効である。***の延長された抑制のために、毎日体重１kg当たり約0.001mgから約2.5mg以上までの範囲の投薬量レベルを使用することが必要であるかもしれない。このようなGnRHアンタゴニストはまた正規の基準で雄の哺乳類に投与された時に***形成を停止するのに有効であり、こうして雄の避妊薬として使用し得る。これらの化合物はテストステロンレベルを低下するので（正常な性的に活発な雄中で望ましくない結果）、GnRHアンタゴニストと一緒にテストステロンの置換投薬量を投与することが望ましいかもしれない。また、これらのアンタゴニストはこの業界で一般に知られているようなその他の目的のためのゴナドトロピン及び性ステロイドの産生を調節するのに使用し得る。本発明により提供されたベタイドは、相当する非ベタイドペプチドに対し、生理pHで特に可溶性である。こうして、本発明のベタイドは投与、特に皮下注射のために比較的濃縮された溶液として調製し得る。これらのベタイドは皮下投与された時に生体中で良く寛容され、相対品の非ベタイドペプチドよりも注射の時点でゲル化し、残存する傾向が少ないことを示す。一般に、このようなベタイド及び好適な医薬上許される賦形剤を含む医薬組成物は毎日体重１kg当たり約0.001m g〜約2.5mgのレベルでiv、ip、皮下等に投与し得る。適当に保護されたベタイドアミノ酸が合成され、次いで鎖延長ペプチド合成に使用し得るが、関係する特別な位置でとり込まれたα−アミノグリシンを有する潜在的にバイオポテントなペプチドの類似体の合成が使用されることが好ましい。更に、このような戦略は、選択された位置にある残基の側鎖以外は同じであるこのような類似体の“ライブラリー”をつくることによりペプチド中の或る位置で多種の異なる置換基で置換されたペプチド類似体の有望なバイオポテンシーを測定する際の最初の工程として有利に使用される。この戦略は、前記方法の一つを使用して、α−アミノグリシン残基の脱保護された側鎖アミノ基を関係する所望の側鎖を有する多種のベタイドを生じる多種の反応体であり得るものと反応させることにより行われる。固相合成を使用してライブラリーを調製する一つの好ましい方法が行われ、ペプチド足場が確立され、１個、２個、３個またはそれ以上のアミノグリシン残基または均等残基がペプチド鎖の主鎖中にとり込まれる。次いでこれらの残基は個々に選択的に脱保護され、前記戦略の一つを使用して、樹脂ビーズを単一反応体との別々の反応のために個々の部分に分け、次いでビーズを再度組み合わせ、それらを混合し、選択的脱保護及び反応工程を繰り返して、または別個のピン、プレートもしくはウェルを使用し、連続反応をプログラムして、反応が行われる。このようなビード戦略を使用して、一つが毎回10種の反応体と反応し、こうして連続に反応させられる３種の残基がある場合、一つは10x10x10、即ち1000の異なるベタイド生成物を得る。最も重要なことに、単一樹脂ビードのベタイドの夫々は同じ配列を有し、その結果、ベタイドが試験された時に有利な性質を有することが判明される場合、その正確な式が残りの物質の配列分析により決定し得る。個々のピンまたはウェルが使用される場合、夫々のウェル中の特別なベタイドの配列が知られる。別の戦略は前記アシル化剤の混合物を使用してアシル化反応を行うことである。この戦略は一つの位置にある種々のアミノ酸残基置換のバイオポテンシーに関する効果を試験するためのベタイド混合物を同時に合成することを可能にする。試験結果は、多種の置換の一つを有する混合物中のベタイドが改善されたバイオポテンシーを有するか否かを示すであろう。混合物を試験する時に改善されたバイオポテンシーが発見される場合、その原因の特別な一つ以上の側鎖が排除の方法により後に測定される。 GnRHアンタゴニストに関する下記の式の多くにおいて、５位及び６位に見られる残基が側鎖アミノ基を有する最初のアミノ酸残基、例えば、p-アミノフェニルアラニン(Aph)＋パラ−アミノ基に対する修飾（これは付随の括弧中に示される）に関して時々特定される。Agl残基がしばしば同様に表される。最初の未修飾残基、例えば、Aphまたはその夫々のＤ−異性体もしくはD/L Aglが主ペプチド鎖中にとり込まれることが好ましく、樹脂に未だ付着されているペプチド鎖の一部である間に後に修飾される。Aph等のこのような修飾はAgl等の修飾と適当に協調される。それはベタイドを生じるための修飾の前または後に別々に起こってもよく、または同じ修飾、例えば、アシル化が全てのこのような残基になされている場合にはそれと同時に起こってもよい。しかしながら、適当に保護されたベタイドアミノ酸は、所望により、通常の鎖延長方法の一部として成長しているペプチド鎖に別途付加し得る。本発明が以下の実施例により更に説明される。しかしながら、このような実施例は本発明の精神または範囲を何ら限定しないものと見なされるべきである。下記の実施例の幾つかは本発明の種々の特徴を具体化するGnRHアンタゴニストベタイド及びソマトスタチンアゴニストベタイドを説明する。これらの特別なベタイドの全てが少なくとも一種のＤ−異性体アミノ酸残基を含む。実施例１式：Ac-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-Aph(Ac)D-Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D -Ala-NH₂で表されるペプチドはGnRHアンタゴニストとして非常に良好な生物学的性質を示すことがわかり、一般にアシリンと称される。それ故、その配列中に一つ以上のベタイドアミノ酸を有するこのデカペプチドの後にパターン化されたベタイドをつくることが望ましい。下記のデカベタイド［Ac-β-D-2NAL¹，(4Cl)D-Phe²，D/L Agl(ニコチノイル)³ ，Aph(Ac)⁵，D-Aph(Ac)⁶，ILys⁸，D-Ala¹⁰］-GnRH(ベタイドNo.1)を固相合成により合成する。このベタイドは下記の式：Ac-β-D-2NAL-(4Cl)D/L-Phe-γ-(3-ピリジル)アミドGly-Ser-Aph(アセチル)-D-Aph(アセチル)-Leu-Lys(イソプロピル)-P ro-D-Ala-NH₂で表される。 MBHA樹脂約３g（0.76mM/g）を最初に使用し、約５ミリモルのBoc誘導体及び活性剤またはカップリング剤としてのジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を使用して、Boc保護D-AlaをＮ−メチルピロリドン(NMP)/CH₂Cl₂中で約100分の期間にわたって樹脂にカップリングする。D-Ala残基がアミド結合によりMBHA樹脂に付着する。夫々のアミノ酸残基のカップリング後に、自動化機械を使用して次のアミノ酸残基の洗浄、脱ブロッキング及びカップリングを下記のスケジュールに従って行い、そのスケジュールは約３ｇの樹脂に対し行われている合成に使用されてもよい。上記スケジュールを、最初のアミノ酸を付着した後の本発明のペプチドのアミノ酸の夫々のカップリングに使用する。ＮαBoc保護をその合成中にカップリングされるアミノ酸の夫々に使用する。ＮαBoc-β-D-2NALを、当業界で知られている方法、例えば、1980年11月18日に発行された米国特許第4,234,571号明細書に詳しく記載されている方法により調製する。それはまたSyntheTech（オレゴン、米国）から市販されている。５位のAph及び６位のD-Aphの側鎖一級アミノ基を Fmocにより保護する。ベンジルエーテル(Bzl)をSerのヒドロキシル基の側鎖保護基として使用することが好ましいが、Serは側鎖を保護しないでカップリングし得る。Boc-Lys(Ipr,Z)を８位の残基に使用する。 Serを４位の残基にＮαBoc-Ser(Bzl)として付加した後、下記の中間体が存在する。Boc-Ser(Bzl)-Aph(Fmoc)-D-Aph(Fmoc)-Leu-Lys(Ipr,Z)-Pro-D-Ala-NH-［M BHA樹脂担体］。次いで５位及び６位のアミノ酸残基の側鎖を、最初に側鎖保護を除去した後にそれらを同時にアセチル化することにより修飾する。Fmoc保護基を約30分間にわたってDMF(10ml)中の20％のピペリジンによる処理により両方の残基から除去する。中間体をDMFで洗浄することが好ましく、次いで更に30分間にわたって更に多くのピペリジン/DMFで処理する。好ましくはペプチド樹脂をDM Fで洗浄した後、新たに遊離されたアミノ基を室温で15分間またはニンヒドリン試験を使用してチェックして完結するまでDCM中の大過剰の無水酢酸で処理して両方の側鎖をアセチル化する。次いでペプチド樹脂を通常の洗浄にかける。 Aph残基のアセチル化の完結後に、Boc及びFmoc保護D/L-アミノグリシンを3位の残基に鎖にカップリングする。一旦付加すると、Boc保護を除去し、その後の残基を付加し、鎖の完結を行う。トリフルオロ酢酸(TFA)を使用してＮ末端のα −アミノ基を脱ブロックした後、ジクロロメタン中の大過剰の無水酢酸を使用してアセチル化を行う。Ｎ末端のアセチル化後に、Agl側鎖を選択的に脱保護し、４時間にわたってDCM 中のニコチン酸でアシル化し、DCCの如き適当なカップリング剤を使用してγ− ３−ピリジルアミドグリシン残基を形成し、ベタイド中間体と称されるものを生じる。ベタイド樹脂を乾燥させ、次いで樹脂からのベタイドの開裂及びSer側鎖及びL ys側鎖の脱保護を０℃でHFを用いて約40分間にわたって行う。アニソールをHF処理の前に脱除剤として添加する。真空下のHFの除去後に、樹脂をエチルエーテル 100mlで２回洗浄する。開裂したベタイドを等しい部分のCH₃CN及びH₂Oで樹脂から抽出し、毎回100mlを使用してその方法を繰り返す。抽出物を溜め、凍結乾燥し、それらは粗ベタイド粉末を与える。次いでベタイドの精製を、当業界で知られており、J.Rivierら，J.Chromatog- raphy，288，303-328(1984)に詳しく示されているように、分取高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)により行う。最初の分取RP-HPLC分離はTEAP（トリエチルアンモニウムホスフェート）緩衝系を使用する。全てJ.Chromatography文献に詳しく記載されているようにして、この分離を、わずかに異なる勾配を用いて同緩衝系を使用して繰り返し、0.1％のTFA(トリフルオロ酢酸)勾配を使用して、最後の分離を行う。それ故、この操作を使用して、３位にAglのＬ−異性体及びＤ− 異性体を有する２種のベタイドを分離し、脱塩する。キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)を使用し、同様に逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)及び水性トリエチルアンモニウムホスフェート緩衝液＋アセトニトリルを使用することにより、ベタイドフラクションは均一であると判断される。純度は約97％〜98％であると推定される。得られる精製ベタイドのアミノ酸分析は調製された構造の式と一致し、鎖中の夫々のアミノ酸について実質的に整数の値を示す。液体二次イオン質量スペクトロメトリー(LSIMS)がまた一致する。旋光を２種の立体異性体、異性体(1)及び(2)について光電偏光計で測定したところ、［α］_D ²⁰=-34.0°及び-24.4°±1（c=1、50％の酢酸）である。LSIM S分析は両方の異性体について1561.8Daの予想質量を示した。ベタイドをin vivoで分析して雌ラットの***を防止するその有効性を測定する。この試験において、夫々が225gから250gまでの体重を有する、特定数、例えば、５〜10匹の成熟雌SDラットに発情前期の日の正午付近に静菌水中のベタイドの特定ミリグラム投薬量を注射する。発情前期は***の午後である。別の雌ラットグループを、ペプチドが投与されない対照として使用する。対照雌ラットの夫々が発情前期のタ方に***する。***する治療したラットの数を記録する。２種の異性体ベタイドのin vivo試験は、2.5μgの投与量で、治療した７匹のラットのうちの０匹及び５匹のラットのうちの０匹が夫々異性体(1)及び(2)について排卵することを示す。異性体(1)について1.0μgの投与量で、全てが***し、一方、１μgの異性体(2)について、14匹のラットのうちのわずかに６匹が***し、0. 5μgについて、４匹のラットのうちの３匹が***する。以下、異性体(2)をベタイドNo.1と称する。ラットの試験は、ベタイドが非常に良く寛容され、注射の時点で有意なゲル化が検出できなかったことを示す。 30分間にわたって40％の緩衝液Ｂ〜75％の緩衝液Ｂの勾配でRP-HPLCを使用して保持を測定することにより親水性を試験する（緩衝液ＡはTEAP、pH7.3であり、緩衝液Ｂは60％のCH₃CN及び40％の緩衝液Ａである）。ベタイドNo.1は一層親水性であり、アシリンについて24.1分に比較して23.5分間で溶離する。そのベタイドは約５から約７までのpHの水性緩衝液中のその溶解性及びin vivoゲル化に対するその耐性のために特に有益であると考えられ、これはそれを一般に匹敵する生物学的効力のその他の化合物に較べて皮下注射による投与に特に適するようにする。更に、ベタイドNo.1はかなり長く作用するバイオポテンシーを示し、循環するLH濃度をラット当たり50μgの投与量で48時間以上にわたって対照レベルの2 5％より小さいレベルに抑制する。実施例1A DCM中のイソニコチノイルクロリドを置換し、４時間反応させて４−ピリジルアミドグリシン残基を形成して、実施例１に示した合成を繰り返す。樹脂からの開裂及び脱保護、続いて精製を実施例１に記載されたようにして行う。ベタイド Ac-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-γ-(4-ピリジル)D/L-アミドGly-Ser-Aph(アセチル)-D -Aph(アセチル)-Leu-Lys(イソプロピル)-Pro-D-Ala-NH₂(ベタイドNo.1A)は均一であると判定され、純度は80％より大きいと推定される。旋光を２種の異性体の夫々について光電偏光計で測定したところ、［α］_D ²⁰=-31.5°及び25.4°±1(c =1、50％の酢酸)である。MS分析は両方の異性体について1561.8Daの予想質量を示した。また、これらのベタイドの両方がアシリンよりも親水性である。これらの２種のベタイドを通常のin vivoラット***防止試験で評価して、10 μgの投与量では、７匹のラットのうちの３匹及び８匹のラットのうちの０匹が夫々***することを示す。2.5μgの投与量では、第二異性体のみが生物活性であり、８匹のラットのうちの２匹が***する。実施例２式Ac-β-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-Aph(アセチル)-D-Aph(アセチル)-D/LAg l(アセチル)-Lys(イソプロピル)-Pro-D-Ala-NH₂(ベタイドNo.2)を実施例１に示された合成を使用して合成する。ＮαBoc-D/L-Agl(Fmoc)を３位にカップリングする代わりに、それをAgl(アセチル)の前駆体として７位にカップリングし、D-3 PALを３位にカップリングする。この合成において、最初の６残基のカップリング後に、下記のペプチド中間体を得る。 Boc-Aph(Fmoc)-D-Aph(Fmoc)-D/L-Agl(Fmoc)-Lys(Ipr,Z)-Pro-D-Ala-NH-［MBHA樹脂担体］。次いでAph残基、D-Aph残基及びAgl残基の側鎖を、約30分間にわたってDMF（10ml）中20％のピペリジンを使用してFmoc保護の除去により同時に脱保護する。DMFで洗浄した後、ピペリジン/DMF処理を繰り返す。DMFによる最後の洗浄後に、中間体を約10分間にわたって室温でDCM中の大過剰の無水酢酸で処理してこれらの３つの残基の側鎖を同時にアセチル化する。次いでベタイド樹脂を通常の洗浄にかけ、実施例１に一般に教示された方法を使用して合成を完結する。樹脂からの開裂及び脱保護、続いて精製を実施例１に記載されたようにして行う。ベタイドAc-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-(3-ピリジル)Ala-Ser-Aph(アセチル)- D-Aph(アセチル)-D/L-Agl(アセチル)-Lys(イソプロピル)-Pro-D-Ala-NH₂(ベタイドNo.2)は均一であると判断され、その純度は80％より大きいと推定される。その混合物の旋光を光電偏光計で測定したところ、［α］_D ²⁰=-18.1°±1（c=1,50 ％酢酸）である。それは７位に夫々D-及びL-Agl(Ac)を有する２種の異性体の混合物である。MS分析はその混合物について1534.7Daの予想質量を示す。RP-HPLC は、その混合物がアシリンよりも親水性であることを示す。通常のin vivoラット***防止試験を使用してベタイド混合物を評価して、10 μgの投与量では、８匹のラットのうちの０匹が***し、５μgの投与量では、８匹のラットのうちの５匹が***することを示す。10μgでは、８匹のラットのうちの０匹が***し、５μgの投与量では、８匹のラットのうちの５匹が***する。実施例3A 式Ac-D/L-Agl(2-ナフトイル)-D-4Cpa-D-3PAL-Ser-Aph(アセチル)-D-Aph(アセチル)-Leu-Lys(イソプロピル)-Pro-D-Ala-NH₂で表されるベタイドを実施例１に示された合成を使用して合成する。ＮαBoc-D/L-Agl(Fmoc)を３位にカップリングする代わりに、Aph側鎖及びD-Aph側鎖のアセチル化後にそれを１位にカップリングする。D-3PALを３位にカップリングする。この合成において、デカペプチドの完結及びＮ末端のアセチル化後に、下記のペプチド中間体を得る。 Ac-D/L-Agl(Fmoc)-4Cl-D-Phe-D-3PAL-Ser(Bzl)-Aph(Ac)-D-Aph(Ac)-Leu-Lys(Ipr ,Z)-Pro-D-Ala-NH-［MBHA樹脂担体］。次いでAgl残基の側鎖を、約30分間にわたってDMF（10ml）中20％のピペリジンを使用してFmoc保護の除去により脱保護する。DMFで洗浄した後、ピペリジン/DMF処理を繰り返す。DMFによる最後の洗浄後に、中間体を約20分間にわたって室温で三級アミン、即ち、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)の存在下で等しい部数のDMFとDCMの混合物中で２−ナフトイルクロリド10ミリモルで処理してAgl残基の側鎖をアシル化する。次いでベタイド樹脂を通常の洗浄にかけ、樹脂からの開裂及び脱保護、続いて２種の異なる緩衝液系を使用する精製を実施例１に記載されたようにして行う。ベタイドAc-γ-(2-ナフトイル)アミドGly-4Cl-D-Phe-D-3PAL-Ser-Aph(アセチル) -D-Aph(アセチル)-Leu-Lys(イソプロピル)-Pro-D-Ala-NH₂(ベタイドNo.3A)は均一であると判断され、その純度は90％より大きいと推定される。２種の立体異性体をRP-HPLC精製で分離し、２種の異性体について旋光を光電偏光計で測定したところ、夫々［α］_D ²⁰=-31.0°及び-1.2°±1（c=1，50％酢酸）である。MS分析は両方の異性体について1561.8Daの予想質量を示す。通常のin vivoラット***試験を使用してベタイドを評価して、第二異性体は５μgで充分に活性であり(0/8)、第一異性体は2.5μgで充分に活性である(0/8) ことを示す。第二異性体は2.5μgで不活性である(5/5)が、第一異性体は１μgの投与量で活性であり、即ち、４匹のラットのうちのわずかに２匹が***する（合計７個の卵）。実施例3B 実施例3Aで合成したベタイドと同様のベタイドをつくり、それは式Ac-D/L-Agl (2-ナフトイル)-D-4Cpa-D-3PAL-Ser-Aph(atz)-D-Aph(atz)-Leu-Lys(イソプロピル)-Pro-D-Ala-NH₂で表される。実施例3Aに示された合成を使用するが、Aph側鎖及びD-Aph側鎖を、アセチル化する代わりに、実施例３のように反応させて３− アミノ１，２，４トリアゾール部分を形成する。この合成において、デカペプチドの完結及びＮ末端のアセチル化後に、下記のペプチド中間体を得る。 Ac-D/L-Agl(Fmoc)-4Cl-D-Phe-D-3PAL-Ser(Bzl)-Aph(atz)-D-Aph(atz)-Leu-Lys(I pr,Z)-Pro-D-Ala-NH-［MBHA樹脂担体］。次いで１位のAgl残基の側鎖を、約30分間にわたってDMF（10ml）中20％のピペリジンを使用してFmoc保護の除去により脱保護する。DMFで洗浄した後、ピペリジン/DMF処理を繰り返す。DMFによる最後の洗浄後に、中間体を約20分間にわたって室温で三級アミン、即ち、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)の存在下で等しい部数のDMFとDCMの混合物中で２−ナフトイルクロリド10ミリモルで処理してAgl残基の側鎖をアシル化する。次いでベタイド樹脂を通常の洗浄にかけ、樹脂からの開裂及び脱保護、続いて２種の異なる緩衝液系を使用する精製を実施例１に記載されたようにして行う。ベタイドAc-γ-(2-ナフトイル)アミドGly-4Cl-D-Phe-D-3PAL-Ser-Aph(atz)-D-Ap h(atz)-Leu-Lys(イソプロピル)-Pro-D-Ala-NH₂(ベタイドNo.3B)は均一であると判断され、その純度は90％より大きいと推定される。２種の立体異性体をRP-HPL C精製で分離し、２種の異性体について旋光を光電偏光計で測定したところ、夫々［α］_D ²⁰=-23.0°及び-2.0°±1（c=1，50％酢酸）である。MS分析は両方の異性体について1642.0Daの予想質量を示す。通常のin vivoラット***試験を使用してベタイドを評価して、第一異性体は2 .5μgで充分に活性である(0/8)ことを示す。第二異性体は2.5μgで完全に活性であり(0/3)、第二異性体について1μgの投与量では、８匹のラットのうちの４匹が***する。実施例４実施例１に示された合成を使用して、式：Ac-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-S er-(4-アセチル-アミノ-ベンジル)D/L-アミドGly-D-Aph(アセチル)-Leu-Lys(イソプロピル)-Pro-D-Ala-NH₂で表されるベタイドを合成する。ＮαBoc-D/L-Agl(F moc)を３位にカップリングする代わりに、D-Aph側鎖のアセチル化後にそれを５位にカップリングする。Serを４位にカップリングし、鎖の残りを完成する。この合成において、デカペプチドの完結及びＮ末端のアセチル化後に、下記のペプチド中間体を得る。 Ac-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser(Bzl)-D/L-Agl(Fmoc)-D-Aph(Ac)-Leu-Lys( Ipr,Z)-Pro-D-Ala-NH-［MBHA樹脂担体］。Agl残基の側鎖を、約30分間にわたってDMF(10ml)中20％のピペリジンを使用してFmoc保護の除去により脱保護する。D MFで洗浄した後、ピペリジン/DMF処理を繰り返す。DMFによる最後の洗浄後に、中間体を約30〜60分間にわたって室温でHBTUの存在下でDMF中でアセチル−パラ −アミノ安息香酸(Ac-Paba)２ミリモルで処理してAgl残基の側鎖をアシル化する。次いでベタイド樹脂を通常の洗浄にかけ、樹脂からの開裂及び脱保護、続いて精製を実施例１に記載されたようにして行う。得られるベタイドAc-β-D-2NAL-( 4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-(4-アセチル-アミノ-ベンジル)D/L-アミドGly-D-Aph(アセチル)-Leu-Lys(イソプロピル)-Pro-D-Ala-NH₂（ベタイドNo.4）は均一であると判断され、その純度は80％より大きいと推定される。２種の異性体の混合物について、混合物の旋光を光電偏光計で測定したところ、［α］_D ²⁰=-18.9°±1（ c=1，50％酢酸）である。MS分析は1561.8Daの予想質量を示す。通常のin vivoラット***試験を使用してベタイド混合物を評価して、５μgの投与量では、８匹のラットのうちの２匹が***することを示す。実施例4A DMF/DCM中４−アセチル−アミノ安息香酸を４−ヒドロキシ安息香酸に置換し、DIC及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下で７時間反応させて（４ −ヒドロキシフェニル）アミドグリシン残基を形成して、実施例４に示された合成を繰り返す。樹脂からの開裂及び脱保護、続いて精製を実施例１に記載されたようにして行う。ベタイドAc-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-γ-(4-ヒドロキシフェニル)D/L-アミドGly-D-Aph(アセチル)-Leu-Lys(イソプロピル)-Pro-D-Ala -NH₂(ベタイドNo.4A)は均一であると判断され、その純度は80％より大きいと推定される。２種の異性体の混合物について、旋光を光電偏光計で測定したところ、［α］_D ²²=-20.0°±1（c=1，50％酢酸）である。MS分析は1521.8Daの予想質量を示す。通常のin vivoラット***防止試験を使用してベタイド混合物を評価して、５ μgの投与量では、16匹のラットのうちの２匹が***することを示す。実施例５実施例１に示された合成を使用して、式Ac-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser -Aph(アセチル)-γ-(4-アセトアミドフェニル)D/L-アミドGly-Leu-Lys(イソプロピル)-Pro-D-Ala-NH₂で表されるベタイドを合成する。ＮαBoc-D/L-Agl(Fmoc)を３位にカップリングする代わりに、それを６位にカップリングし、D-3PALを３位にカップリングする。Aglのカップリングの直後に、Fmoc基を除去し、反応を実施例４に一般に記載されたようにしてPaba(Fmoc)を用いて行う。DCMによる洗浄後に、Bocを除去し、次にＮαBoc-Aph(Fmoc)をカップリングして下記のベタイド中間体を生じる。Boc-Aph(Fmoc)-D/L-Agl(アミノベンジル)(Fmoc)-Leu-Lys(Ipr, Z)-Pro-D-Ala-NH-［MBHA樹脂担体］。Agl残基及び Aph残基の両方の側鎖を、約 30分間にわたってDMF（10ml）中20％のピペリジンを使用してFmoc保護の除去により同時に脱保護する。DMFで洗浄した後、ピペリジン/DMF処理を繰り返す。DMF による最後の洗浄後に、中間体を約10分間にわたって室温でDCM中の大過剰の無水酢酸で処理してこれらの残基の両方の側鎖を同時にアセチル化する。次いで残りの４アミノ酸を付加し、実施例４のようにＮ末端をアセチル化することにより、合成の完結を行う。次いでベタイド樹脂を通常の洗浄にかけ、樹脂からの開裂及び脱保護、続いて精製を実施例１に記載されたようにして行う。得られるベタイドAc-β-D-2NAL-( 4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-Aph(アセチル)-γ-(4-アセトアミドフェニル)D/L-アミドGly-Leu-Lys(イソプロピル)-Pro-D-Ala-NH₂（ベタイドNo.5）は均一であると判断され、その純度は80％より大きいと推定される。旋光を光電偏光計で測定したところ、２種の異性体の混合物として［α］_D ²²=-27.5°±1（c=1，50％酢酸）である。MS分析は両方の異性体について1561.8Daの予想質量を示す。通常のin vivoラット***試験を使用してペプチドを評価して、5.0μgの投与量では、８匹のラットのうちの１匹が***し、2.5μgの投与量では、４匹のラットのうちの２匹が***することを示す。試験した以上のベタイドは、***防止効果の観点から、生物学的効力を示し、これは夫々が類似体である親ペプチドに一般に匹敵する。優れた溶解性、in viv oゲル化に対する耐性及びその他の性質に基いて、これらのベタイドは***防止剤として特に有益であり、更に一般にゴナドトロピンの分泌を抑制し、ゴナドによるステロイドの放出を抑制するものと考えられる。スクリーニング目的のためのこれらのベタイドの価値が潜在的に更に重要である。何となれば、この位置にＣβ−メチル置換を有する匹敵する残基を有するように合成される或る種の匹敵するペプチド類似体は効能のある性質を有し、これが親ペプチドの性質よりも更に優れているかもしれないからである。例えば、実施例3Bにおいて、良好な生物学的結果が得られ、これから相当するβ−メチル含有類似体が良好な生物活性を有することが予想される。実際に、匹敵するβ−メチル類似体、即ち、Ｅ立体異性体形態及びＴ立体異性体形態の両方のβCH₃-D-2NALを有する［Ac-βCH₃-D-2NA L¹,4ClD-Phe²，D-3PAL³，Aph(atz)⁵，D-Aph(atz)⁶，ILys⁸，D-Ala¹⁰］-GnRHを合成し、両方が2.5μgで充分に活性であり、Ｅ立体異性体が1.0μgで部分的に活性であることがわかった。こうして、簡単かつ直接のベタイド合成は、ベタイドがこのような置換がおそらく有意な改良を示すことを示す時にこのような合成のみを行うことにより、Ｃβ−メチル置換を有する残基を有する類似体の長すぎる骨のおれる合成を行うことを避ける。実施例６実施例１に示された一般的合成を使用して、式(シクロ5-8)Ac-β-D-2NAL-(4Cl )D-Phe-D-3PAL-Ser-Glu-D-Arg-Leu-D/L-Agl(β-Ala)-Pro-D-Ala-NH₂で表されるペプチドを合成する。ＮαBoc-D/L-Agl(Fmoc)を８位にカップリングし、ＮαBoc -Glu(OFm)を５位にカップリングする。この合成において、最初の５残基のカップリング後に、下記のペプチド中間体を得る。 Boc-D-Arg-Leu-D/L-Agl(Fmoc)-Pro-D-Ala-NH-［MBHA樹脂担体］。Agl残基の側鎖を、約30分間にわたってDMF（10ml）中20％のピペリジンを使用してFmoc保護の除去により脱保護する。DMFで洗浄した後、ピペリジン/DMF処理を繰り返す。DMF による最後の洗浄後に、中間体を約30分間にわたって室温でDICをカップリング試薬として使用してDMF/DCM中でＮαFmoc-β-Alaで処理してAgl残基の側鎖をアシル化する。次いでベタイド樹脂を通常の洗浄にかけ、合成をD-ArgのBoc保護の除去及び次のＮαBoc-Glu(OFm)の次のカップリングにより続ける。次いでβ-Ala及びGluの塩基不安定保護基を上記のようにして除去し、β-Alaのα−アミノ基をBOP［ベンゾトリアゾリル−Ｎ−オキシトリス（ジメチルアミノ）−ホスホリウムヘキサフルオロホスフェート］及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で反応させることによりGlu残基側鎖に結合する。その後、合成の完結及びＮ末端アセチル化を前記のようにして行う。樹脂からの開裂及び脱保護、続いて精製を実施例１に記載されたようにして行う。２種の立体異性体をRP-HPLC中に分離する。２種の化合物(シクロ5-8)Ac-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-Glu-D-Arg-Leu-γ-(β -アラニル)D/L-アミドGly-Pro-D-Ala-NH₂の夫々が均一と判断され、夫々の純度は80％より大きいと推定される。２種の異性体について、旋光を光電偏光計で測定したところ、夫々［α］_D ²⁰=-10.3°及び-33.6°±1（c=1，50％酢酸）である。MS分析は両方の異性体について1365.8Daの予想質量を示す。通常のin vivoラット***防止試験を使用して環状化合物を評価して、25μgの投与量では、第一異性体は完全に活性であり、一方、第二異性体は不活性であり、10μgの投与量では、８匹のラットのうちの３匹が第一異性体で***することを示す。実施例７構造：(シクロ1-8)H-Cys-Phe-Phe-D/L-Agl(2-ナフトイル)-Lys-Thr-Phe-Cys-O Hを有するソマトスタチンアゴニストベタイドをクロロメチル化樹脂で段階的様式で下記の固相方法により合成する。樹脂はスチレンと１〜２％のジビニルベンゼンの共重合により調製した合成樹脂の微小ビーズ（直径20〜70ミクロン）を含む。樹脂中のベンゼン環をフリーデル−クラフツ反応でクロロメチルメチルエーテル及び塩化スズ(IV)でクロロメチル化する。こうして導入された塩素はリンカーの反応性塩化ベンジル型を生じる。樹脂が樹脂１g当たり0.5〜２ミリモルの塩素を含むまで、フリーデル−クラフツ反応を続ける。 Cysのtert-ブチルオキシカルボニル-S-パラメトキシベンジル誘導体、即ち、B oc-Cys(Mob)を既知の方法、例えば、(1)トリエチルアミンの存在下のエタノール中の還流、(2)Boc保護アミノ酸のセシウム塩をジメチルホルムアミド(DMF)中で5 0℃に一夜保ち、または(3)Boc保護アミノ酸をKFの存在下でジメチルスルホキシド(DMSO)中80℃に24時間保つことにより樹脂に結合させる。樹脂のClの１ミリ当量当たり１ミリ当量の保護Cysを使用する。脱保護、中和及び夫々のアミノ酸の付加を実施例１に示されたスケジュールに従って行う。夫々のアミノ酸のBoc誘導体を使用する。最初の残基、即ち、Boc-Cys(Mob)の脱保護後に、上記スケジュールに従って、PheのＮαBoc誘導体をカップリング剤、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)とともに添加する。次にThrのＮαBoc 誘導体をDCCとともに添加し、Thrの側鎖をO-ベンジルエーテル(Bzl)で保護する。ベンジルオキシ−カルボニル-2Cl、即ち、2ClZをLys側鎖の保護基として使用する。４位のBoc-D/L-Agl(Fmoc)のカップリング後に鎖延長方法を中断してAglの側鎖を修飾する。Fmoc保護基をDMF(10ml)中で約30分間にわたって20％のピペリジンによる処理により除去する。中間体を好ましくはDMFで洗浄し、次いで更に30分間にわたって更に多くのピペリジン/DMFで処理する。好ましくはペプチド樹脂を DMFで洗浄した後、新たに遊離されたアミノ基を１時間にわたってNMPとジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)の混合物中で２ナフトイルクロリドで処理する。また、ＮαBoc保護を最初に除去し、ナフトイルクロリドとの反応を行い、次いでFmoc保護を除去して鎖延長を進行する。次いでスケジュールをＮ末端のCys に延びるペプチド鎖の３つの残りのアミノ酸の夫々のカップリングに使用する。樹脂からのベタイドの開裂及びベタイドの側鎖保護基の脱保護をアニソール１ ml及びジメチルスルホキシド２mlの存在下でフッ化水素酸(HF)(50ml)中で1.5時間にわたって０℃で行う。高真空下のフッ化水素酸の排除後に、樹脂−ベタイドをエーテルで洗浄する。樹脂を75％の酢酸(200ml)で直ちに抽出する。抽出物を500mlの丸底フラスコに濾過し、素早く攪拌し、その間に得られる溶液が黄色−淡黄色に着色されるまでメタノール中ヨウ素の10重量％の溶液を添加する。次いでそれを更に10分間攪拌し、黄色が消えるまで水中10％のアスコルビン酸で反応停止する。真空下の濃縮を行って容積を約50mlに減少し、続いて水中0.1％のTHAで約300mlに希釈する。次いでその溶液を水中0.1％のTHAで予め平衡にされた粗いガラスロート中のＣ₁₈ シリカの4cm x 7cmのパッドに適用する。真空濾過後に、溶離液を１リットルに希釈し、パッドに再度適用する。その後、パッドを0.1％のTFA中６％のアセトニトリル500mlで洗浄し、水中60％のCH₃CN250ml、続いて水150mlを使用してベタイドを溶離する。得られる溶液を約600mlに希釈し、凍結乾燥させる。次いで凍結乾燥した物質を分析し、Ｃ₁₈カラムによるHPLCにかけることにより精製する。ピークを位置決めし、次いで同様の緩衝液系を使用してこれらを個々に精製する。所望の環状ベタイド(シクロ1-8)H-Cys-Phe-Phe-(2-ナフチルアミド )Gly-Lys-Thr-Phe-Cys-OH(ベタイドNo.7)を２種の別々の立体異性体の形態で得、これらはキャピラリーゾーン電気泳動で80％より大きい純度であることが明らかである。比旋光を測定したところ、第一異性体について［α］_D ²²=-50.5°±1(c=0.875 ，50％酢酸中)であり、第二異性体について-55.8°±(c=0.67、50％酢酸中)であり、ベタイド７及び7'と称する。この物質のアミノ酸分析は異なるアミノ酸について予想された比を示す。MS分析は1119.5Daの予想質量を示す。実施例7A 実施例７に記載された合成を一つの変化により繰り返す。Boc-D/L-Agl(Fmoc) （これは４位の残基を構成すべきである）をカップリングした後、二つのアミノ基の一つをメチル化し、その後にそれをナフトイルクロリドと反応させる。例えば、Boc保護基を約20分間にわたってDCM中で60％のTFAによる処理により除去して保護されていない一級アミノ基を得る。この一級アミノ基をジイソプロピルエチルアミンの存在下で４，４’−ジメトキシジチルクロリドでアルキル化して、 TFA不安定４，４’−ジメトキシジチル基を含む相当するＮ末端二級アミノ基を得る。この二級アミンのメチル化を過剰のシアノホウ水素化ナトリウムの存在下で１％のHOAc(30:70)を含むNMP中で36％の水性ホルムアルデヒドで40分間の処理により行い、この処理を繰り返す。その後、DCM（2 x 20分間）中で60％のトリフルオロ酢酸で処理して４，４’−ジメトキシジチル基を除去し、相当するＮα −メチル化樹脂を得、次いでこれをナフトイルクロリドと反応させる。次いで鎖の更なる延長は実施例７のようにして進行する。開裂、脱保護、環化及び精製を実施例７のようにして行う。２種の異性体について比旋光を測定したところ、夫々［α］_D ²²=-64.7°±1（c=0.43、50％酢酸中）及び-24.0°±1（c=0.57、50％酢酸中）である。MS分析は1133.5Daの予想質量を示す。精製した環状ベタイドは式：(シクロ1-8)H-Cys-Phe-Phe-(β-メチル-γ -2-ナフチル)D/L(アミド)Gly-Lys-Thr-Phe-Cys-OHを有し、ベタイドNo.7A及び7A ’と称される。実施例８実施例７及び7Aにおいて、ソマトスタチン特性を有する環状オクタペプチドが合成され、これらの夫々が５位にLysを有する。この実施例では、ベタイドアミノ酸がリシン残基に代えて使用され、D-Trpが４位に使用される類似体を合成する。実施例７に記載された合成を最初の３残基について繰り返す。次いでＮαBo cにより保護されたD/LAgl(Fmoc)をカップリングし、続いて全てＮαBocにより保護されたD-Trp、Phe、Phe及びCys(Mob)をカップリングする。Fmoc保護基を前記のようにして夫々15分間にわたってNMP中20容量％のピペリジンで２回処理することにより除去する。次いで５位の残基の側鎖一級アミノ基をBoc-β-アラニンと反応させてリシンを模倣する５位の残基を生じる。開裂、脱保護、環化及び精製を実施例７のようにして行う。２種の異性体について比旋光を測定したところ、夫々［α］_D ²²=-3.45°±1（c=0.725、50％酢酸中）及び-19.9°±1（c=0.67、50％酢酸中）である。MS分析はベタイド異性体の夫々について1094.5の予想質量を示す。ベタイドは式：(シクロ1-8)H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-γ-(2-アミノエチル)アミド −グリシン-Thr-Phe-Cys-OHを有し、一方が５位にＬ−異性体を有し、他方がＤ −異性体を有し、これらをベタイドNo.8及び8'と称する。 in vitroバイオアッセイ：種々のソマトスタチン類似体の効果を、COS細胞及びCHO細胞で発現された単離されたクローン化レセプターに結合するそれらの能力についてin vitroで試験する。多重ソマトスタチン(SRIF)レセプターサブタイプをコードする遺伝子の分子クローニングが哺乳類細胞中のこれらのレセプターの個々の発現及びそれらの夫々の薬理学的プロフィールの特性決定を可能にした。SSTR1〜SSTR5と称される５種のこのようなレセプターがクローン化され、Raynorら，Molecular Pharmacol-og y，43，838-844（1993）及びRaynorら，Molecular Pharmacology，44，385-392( 1993)に報告され、記載される。これらの文献は、特別なSRIF類似体が５種のレセプター型の一種以上に選択的に結合するか否かそしてまたそれらが高アフィニティーまたは低アフィニティーのいずれでこのようなレセプター型に結合するかを測定するのに使用し得る結合アッセイを記載している。これらのレセプター型がそれらの薬理学的プロフィールに関して特性決定されたので、生体中のこれらのレセプターの分布の特異なパターンの知識と一緒のこのような結合研究の結果の知識は、夫々のレセプターサブタイプがSRIFの特有であるが重なる生理学的効果を媒介し得ることを示す。それ故、これらのレセプターの一種に選択的に結合する化合物は、SRIFの別の生理機能に副作用を潜在的に有しないでSRIFの特別な生理機能を変調するのに使用し得る。 SRIF及びSRIF-28に対し、クローン化マウスSRIFレセプターへの放射性リガンド結合を抑制する、従来技術の化合物ODT8を含む、SRIF類似体の効力を下記の表に示す。表中、IC₅₀値がナノモル濃度で示される。ベタイドNo.7A及び7A’は、表に示されるように、SRIF及び親化合物ODT-8、即ち、(シクロ1-8)H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-OHと較べて或る種の格別な選択性で結合することが示される。この様式のベタイドの製造及び多重SRIFレセプターによるスクリーニングはソマトスタチンそれ自体よりも成長ホルモン(GH)、インスリン及びグルカゴンの分泌を選択的に抑制するのに更に有効であり、かつまた親(シクロ1-8)ODT-8よりも有効であるペプチドの合成を可能にする。例えば、ベタイドNo.7A中の残基に匹敵する非ベタイドアミノ残基を有するペプチドはレセプターSSTR3の生理機能を変調するように特別に誘導されるSRIF類似体として開発し得ることが予測し得るが、研究者らは実施例７及び８のペプチドに匹敵するペプチド（これらは良好な生物活性を有しないと予測される）の長すぎる骨のおれる合成を行うことから免れるであろう。実施例９ヒトCRFは米国特許第4,489,163号明細書に示された式で表される41残基アミド化ペプチドである。ACTHの放出について天然ホルモンより大きなバイオポテンシーを有することがわかったこのホルモンの一種の類似体は式：H-Ser-Glu-Glu-Pr o-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-D-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met- Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu- Ile-Ile-NH₂で表される［D-Phe¹²］-hCRFである。 22位の置換がこのCRF類似体のバイオポテンシーに有し得る効果を研究することが所望され、この研究を有効に実施するために、CRF類似体のライブラリーがつくられる。最初に22位にAglを有するペプチド−樹脂中間体をMBHA塩酸塩樹脂ビーズに対し段階的様式で合成する。実施例１に示されたような好適なプログラムを使用して、その合成を自動ベックマン990Bペプチド合成装置で行う。 Boc-Ileで開始して、ＮａBoc保護戦略を使用して、ペプチド鎖を樹脂に対しステップ・バイ・ステップでつくる。一般に、塩化メチレン中１〜２ミリモルのBo c保護アミノ酸＋CH₂Cl₂中１当量の２モルのDCCを２時間にわたって樹脂１ｇ当たり使用する。Boc-Arg(Tos)をカップリングする場合、50％のDMFと塩化メチレンの混合物を使用する。BzlをSer及びThrのヒドロキシル側鎖保護基として使用する。p-ニトロフェニルエステル(ONp)をAsnまたはGlnのカルボキシル末端を活性化するのに使用し得る。例えば、DMFと塩化メチレンの50％混合物中で１当量のH OBtを使用して、Boc-Asn(ONp)を一夜にわたってカップリングし得る。DCCカップリングを活性エステル方法に代えて使用する場合、AsnまたはGlnのアミド基をXa nにより保護する。2-Cl-ZをLys側鎖の保護基として使用する。Tosを使用してArg のグアニジノ基及びHisのイミダゾール基を保護し、GluまたはAspの側鎖カルボキシル基をOBzlにより保護する。D/L-Aglの第二アミノ基をFmocにより保護する。合成の終了時に、下記の組成物を得る。Boc-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-P ro-Pro-Ile-Ser(Bzl)-Leu-Asp(OBzl)-Leu-Thr(Bzl)-D-Phe-His(Tos)-Leu-Leu-Ar g(Tos)-Glu(OBzl)-Val-Leu-Glu(OBzl)-Met-D/L-Agl(Fmoc)-Arg(Tos)-Ala-Glu (OBzl)-Gln(Xan)-Leu-Ala-Gln(Xan)-Gln(Xan)-Ala-His(Tos)-Ser(Bzl)-Asn(Xan) -Arg(Tos)-Lys(2-Cl-Z)-Leu-Met-Glu(OBzl)-Ile-Ile-樹脂担体。Xanはα−アミノ保護基を脱ブロックするのに使用したTFA処理により部分的または完全に除去されていてもよい。次いで保護された樹脂の一部を採取してCRF類似体の一つのライブラリーを合成する。例えば、実施例１に記載されたようにしてピペリジンを使用してFmoc保護を除去し、次いで洗浄して22位のAgl残基の側鎖として一級アミノ基を得る。次いでビーズを８の別々のウェルに分配し、次いで８種の普通に入手し得る化学反応体の一種を用いて夫々のウェル中で反応を行う。下記の夫々をDMFの溶液に溶解し、約４時間にわたって室温で反応させる。塩化ベンゾイル、塩化トルオイル、４−クロロ−ベンゾイルクロリド、無水酢酸、無水イソ酪酸、ベンジルオキシアセチルクロリド、β−アラニンペンタフルオロフェニルエステル及びインドール３−カルボキシル−パラ−ニトロフェニルエステル。これは最終的にベタイド樹脂の一部として16種の異なる類似体の生成をもたらす（アミノグリシンのＤ ,Ｌ混合物で開始する場合）。得られる保護されたベタイド−樹脂を開裂し、脱保護するために、それをベタイド−樹脂１ｇ当たり1.5mlのアニソール、0.5mlのメチルエチルスルフィド及び15mlのフッ化水素(HF)で処理する。夫々のCRF類似体の精製は分取HPLCを使用し、米国特許第5,278,146号(1994年１月11日)の教示に従って行われ、これは塩、小さいフラグメント及び疎水性不純物を排除し、最終的にＤ異性体とL異性体を分離する。得られる16種のCRF類似体をEndocrinology，91，562（1972）に記載されたようにしてin vitro培養ラット下垂体細胞アッセイで試験し、結果を天然ホルモンに対し比較することにより、これらの16種の類似体のいずれがこのアッセイにおいて有意なバイオポテンシーを示すかについて指示を得ることが可能である。別のライブラリー構築方法として、保護された樹脂の他の部分を採取し、示されたようにして脱保護し、次いで８種の既に特定された化学反応の混合物と反応させる。反応後に、ベタイドの混合物を同様に脱保護し、樹脂から開裂し、次いで全混合物の単一の精製を同じ一般的様式で行う。精製後に、16種のCRF類似体の全混合物をラット下垂体細胞アッセイでバイオポテンシーについて試験する。バイオポテンシーが検出されない場合、特別なペプチド配列中のこの位置の全ての８種のこのような置換は有効ではないと推定でき、こうして16の異なるアッセイを行うかなりの時間と努力を節減できる。このような有意なバイオポテンシーが検出される場合、同ペプチド樹脂の付加的な部分を使用して少ない反応体を使用して類似体の付加的な混合物を生じ、例えば、４種の反応体の二つのグループが次に夫々生成されてもよい。有意なバイオポテンシーの原因の一種以上の類似体が測定されるまで、その戦略を繰り返す。ライブラリー概念の使用の二つの代表的な実施例のみが示されるが、使用し得る多種の有益な別型があることが理解されるべきである。例えば、多種のアルキル化剤またはその混合物を使用するAgl残基もしくはAal残基またはAsa残基のアルキル化を多種のアシル化剤またはその混合物でアシル化する前に使用でき、またはスクリーニング用のベタイドのライブラリーを生じることが所望された場合にはその後のアシル化を排除できる。ベタイドはモノアルキル化またはジアルキル化のみにより置換されるα−炭素に結合された側鎖アミノ基を有する少なくとも一種の残基を有するペプチドと定義される。それ故、それは相当するペプトイドに似ている。単一のAgl残基もしくはAal残基またはAsa残基のみを含むことに代えて、このような残基の二つ以上をペプチド中に含み、次いで別々のアシル化剤またはその混合物を使用してこのような残基を同時にまたは独立にアシル化することが可能である。選択的脱保護により、このような残基の一つのみを一度に反応させる。しかしながら、多数のピン、プレートまたはウェルを使用し、プログラムされた連続反応が中間体ペプチド−樹脂中の異なる位置で起こる場合、または樹脂ビーズを分け、反応させ、一回以上再度組み合わせて、その結果、夫々のビードが同じ配列のベタイドを有する場合、前記のようなSPPS戦略を使用することが好ましい。 AglもしくはAalまたはAsa或いはMdgまたはMdaの一種以上の差別的に保護された残基を含む単一アミノ酸配列を合成することにより多種のベタイドまたはベタイドのライブラリーを生じるこのような方法は一つ以上の特別な面でバイオポテンシーについて多種の有望なペプチドの有効なスクリーニングを可能にするのに有益な手段であると考えられる。一旦、スクリーニング方法が特異かつ望ましい性質を有する特別なベタイドを検出すると、研究者らはそのベタイド及び同様のベタイドだけでなく、適当な一つ以上の位置に天然側鎖または非ベタイド非天然側鎖を有する残基のみを有する均等ペプチド、並びにこれらのその他の修飾を更に特別に試験して、このようなバイオポテンシーを増進するのに最適の配置を発見することができる。更に、ペプチド配列中の多種のこれらのモジュラー要素の使用は殆ど無制限の数のオリゴマーの生成を可能にし、それらから最良のものを選択し、それに基いて、天然α−アミノ酸または容易に入手し得るα−アミノ酸のみを使用して相当するペプチドを合成することができる。こうして、このような化学的に多様なライブラリーのスクリーニングは新しい薬剤発見をもたらすリードを得るのに有効なビヒクルを与える。本発明が本発明を実施するのに本発明者らに現在知られている最良の様式を構成する或る特定の実施態様に関して記載されたが、当業者に自明であるような種々の変化及び改良が請求の範囲により特定される本発明の範囲から逸脱しないでなし得ることが理解されるべきである。例えば、ペプチド主鎖を延長するためにアミド結合を形成することが意図されているα−アミノ基が、鎖延長工程を行う前に、本明細書に一般に記載されるように（β−部位のアミド基に関して）、同様にアルキル化し得る。これは、直接合成するのが非常に困難である、Ｃβアルキル化、例えば、メチル化を有するペプチドにおいて生物活性等についてスクリーニングするのに有効な方法を与える。また、Aglに代えてAsaもしくはMdgまたはMdaを使用することにより、側鎖または主鎖中にＮ−メチル修飾を有する残基が都合良くとり込み得る。同様に、これらのアルキル化工程のいずれかが二級アミノ部分の一部として未置換アルキルに代えて置換アルキル基を与えるように置換ケトン等を用いて行い得る。同様に、多種のアミノ反応性試薬が側鎖保護基の除去後にβ−部位で反応を行うのに使用し得る。しかしながら、これらのアシル化剤またはその他の反応体、例えばイソシアネート等は、その後の合成工程中に分解されず、かつ生体中の正常な生理条件にさらされる時に容易に脱着されない酸安定かつ塩基安定な結合を生じるように選ばれる。β−部位アミノ基への結合は、主鎖中のペプチド結合を開裂する条件にその分子をさらさないで、アシル化剤が選択的に開裂し得ないようなものであることが好ましい。或る種の非天然α−アミノ酸は市販されておらず、また合成し難いので、ペプチド中の特別な位置のこのような置換がバイオポテンシー等を増進するか否かを試験することが困難である。しかしながら、本発明はその位置で匹敵するベタイドアミノ酸残基を有する相当するベタイドを調製することによりペプチド中のこのような置換の効果をスクリーニングするのに有益な方法を提供する。スクリーニングはバイオポテンシーについて最も普通に行い得るが、その他の性質、例えば、レセプターまたはその他のタンパク質、例えば、抗体に対する結合アフィニティーがまたスクリーニングの主題であってもよい。ベタイド修飾が所望されるペプチド鎖中の位置における差別的に保護されたD/ L-アミノグリシン、Ｃα−アミノアラニンまたはアミノサルコシンを使用することにより、特別なペプチド中のこの位置について種々のＤ置換基及びＬ置換基の両方を同時にスクリーニングすることが可能である。しかしながら、Ｄ−異性体またはＬ−異性体をスクリーニングすることのみが所望される場合、例えば、差別的に保護されたD/L-アミノグリシンのラセミ混合物が、当業界で知られている好適な操作、例えば、Kawaiら，Ｎ−カルボベンゾキシ−α−メトキシグリシンの光学分割，Tetrahedron: Asymmetry，3，1019-1020（1992）により開示された操作を使用して光学分割し得る。差別的に保護されたアミノ基を有するα−アミノ酸の使用が好ましいが、（ビス-Boc)Aglまたは(ビス-Boc)Aalがまた鎖にカップリングされてもよい。その後、１〜５％のTFAによる処理が一つのアミノ基のみを脱保護するのに使用される。続いてその他が所望の時に25％のTFAで除去される。このようなものは二つのアミノ基について差別的保護を使用することの好ましい戦略の均等物であると考えられる。合成がα−アミノ保護アミノ酸またはペプチドをその遊離α−カルボキシ基における反応により鎖に付加する好ましい鎖延長方法に関して本明細書に記載されるが、α−カルボキシ基を保護し、反応が遊離α−アミノ基で起こる鎖延長方法が知られており、またその均等物と考えられることが理解されるべきである。前記のように、足場がAgl残基、Aal残基またはAsa残基をペプチド鎖にとり込むことにより一旦つくられると、ベタイドがまた側鎖アミノ基のみをアルキル化してペプトイドに似ている残基を生じることによりつくられる。全ての引用文献及び特許の開示が参考として本明細書に明らかに含まれる。本発明の特別な特徴が以下の請求の範囲において強調される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｚ 33/68 33/68 // Ｃ０７Ｋ 105:00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ポータージョンエスアメリカ合衆国カリフォルニア州 92024 ルーケイディアサクソニーストリート 1002

Claims

【特許請求の範囲】１．鎖延長プロトコルを使用するベタイドライブラリーの製造方法であって、その方法が a)樹脂またはＮ末端に遊離α−アミノ基を有するアミノ酸残基を有するペプチド中間体を供給する工程、 b)式：（式中、ＲはＨまたは低級アルキルであり、Ｒ₁は不安定なα−アミノ保護基であり、かつＲ₅は不安定なα−アミノ保護基であり、Ｒ₁及びＲ₅はその他の基の除去を生じない条件下で夫々除去できる）で表される非天然α−アミノ酸を供給する工程、 c)前記非天然アミノ酸を前記樹脂または前記中間体のＮ末端にカップリングしてその鎖長を一つの残基だけ延長する工程、 d)Ｒ₁を除去し、少なくとも一つのα−アミノ保護アミノ酸またはペプチドをそれにカップリングし、またはＲ₁の除去の部位をアシル化する工程、 e)Ｒ₅を工程ｄの生成物から除去する工程、及び f)Ｒ₅の除去の部位で、アミノ反応性試薬との付加反応を行うことにより前記のカップリングされた非天然アミノ酸に異なる置換基を有するベタイドのライブラリーをつくる工程を含むベタイドライブラリーの製造方法。２．前記アミノ反応性試薬がカルボン酸、アシルハライド、イソシアネート、イソチオイソシアネート及び塩化スルホニルからなる群から選ばれる請求の範囲第１項に記載の方法。３．前記樹脂がペプチド樹脂物質を生じる固相合成の一部として供給され、少なくとも一種の付加的な前記非天然アミノ酸が工程ｄの一部として前記樹脂の鎖にカップリングされ、前記ペプチド樹脂物質が複数の位置に分布され、異なる前記アミノ反応性試薬が夫々の前記位置で前記ペプチド樹脂物質との前記付加反応を受けるようにされ、Ｒ₅が前記の複数の位置の夫々で前記付加的な非天然アミノ酸から除去され、かつ夫々の前記位置の前記ペプチド樹脂物質がＲ₅が除去される前記付加的な非天然アミノ酸の部位で所望のアミノ反応性試薬との第二の付加反応を夫々受けるようにされる請求の範囲第１項に記載の方法。４．前記樹脂が樹脂のビーズの形態で使用され、少なくとも一種の付加的な前記非天然アミノ酸が工程ｄの一部として前記樹脂ビーズのペプチド鎖にカップリングされ、前記樹脂ビーズが複数の第一部分に分けられ、かつ異なる前記反応体がビーズの前記第一部分の夫々との第一付加反応を受けるようにされ、前記第一部分が前記第一反応後に合わされ、混合され、次いで樹脂ビーズの第二部分に分けられ、かつ前記第二部分の夫々がＲ₅が除去される前記の付加的な非天然アミノ酸の部位で異なるアミノ反応性試薬との更なる付加反応を受けるようにされ、それにより夫々の前記樹脂ビーズがそれにカップリングされた同じ化学構造のベタイドを有する請求の範囲第１項に記載の方法。５．バイオポテンシー等についてペプチドをスクリーニングする方法であって、その方法が前記アミノ反応性試薬の混合物を使用して請求の範囲第１項に記載の方法に従って関係するペプチドに相当するベタイドのライブラリーをつくる工程、前記混合ベタイドライブラリーを前記所望の性質について試験する工程、及びバイオポテンシーを前記ベタイド混合物中で検出した後、前記ライブラリー製造工程を少なくとも２回繰り返し、毎回前記第一混合物よりも少ない前記アミノ反応性試薬を含む混合物を使用し、その後前記試験工程を繰り返す工程を含むスクリーニング方法。６．式：Ｘ_N−Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｘ_m−Ｘ₄−Ｘ₅−Ｘ₆−Ｘ_c のベタイド。（式中、Ｘ_Nはアシル基もしくはその他のＮ末端基またはこのようなＮ末端基を有する長さ約50アミノ酸までのペプチドであり、Ｘ_cはOH、NH₂もしくはその他のＣ末端基またはこのようなＣ末端基を有する長さ約50アミノ酸までのペプチドであり、Ｘ_mはdes-Xまたは約50アミノ酸までのペプチドであり、かつＸ₁〜Ｘ₆は夫々独立にdes-X、ベタイドアミノ酸、天然α−アミノ酸または非天然αアミノ酸であるが、但し、Ｘ₁〜Ｘ₆の少なくとも一つが式：のベタイドアミノ酸の残基であること、及びＸ₁〜Ｘ₆の少なくともその他が式：の異なるベタイドアミノ酸の残基またはα−アミノ酸、（式中、Ｒ₀はＨまたはCH₃であり、Ｒ及びＲ₂は独立にＨまたは置換もしくは未置換の低級アルキルであり、かつＲ₃はアシル基、イソシアネート基、チオイソシアネート基またはスルホニル基である）であることを条件とし、更にベタイドアミノ酸の付加的な残基がＸ_n、Ｘ_m及びＸ_c中に含まれてもよいことを条件とする）。７．Ｒ₃がＣ＝Ｏ（Ｒ₄）であり、Ｒ₄が置換または未置換のアルキル基、アリール基または複素環基であり、−ＮＲ₂Ｒ₃が天然アミノ酸の側鎖に似ている請求の範囲第６項に記載のベタイド。８．前記ベタイドアミノ酸がb-Ala、b-Abu、b-Val、b-Leu、b-Ile、b-Lys、b-Ar g、b-His、b-Orn、b-Pro、b-Phe、b-Tyr、b-Trp、b-Asp、b-Glu、b-Asn、b-Gln 及びb-Metからなる群から選ばれる請求の範囲第６項に記載のベタイド。９．前記ベタイドアミノ酸がb-hSer、b-hThr、b-hCys、b-β-NAL、b-nArg、b-PA L、b-Har、b-nPro、b-Cpa、b-Fpa、b-Nle、b-ILys及びb-Aphからなる群から選ばれる請求の範囲第６項に記載のベタイド。 10．鎖延長プロトコルによる請求の範囲第６項に記載のベタイドの製造方法であって、その方法が a)樹脂またはＮ末端に遊離α−アミノ基を有するアミノ酸残基を有するペプチド中間体を供給する工程、 b)式：（式中、Ｒ₀はＨまたはCH₃であり、ＲはＨまたは低級アルキルであり、Ｒ₁は不安定なα−アミノ保護基であり、かつＲ₅は不安定なアミノ保護基であり、Ｒ₁及びＲ₅はその他の基の除去を生じない条件下で夫々除去可能である）で表される非天然α−アミノ酸を供給する工程、 c)前記の非天然アミノ酸を前記樹脂または前記中間体の前記Ｎ末端にカップリングする工程、 d)Ｒ₁を工程ｃの生成物から除去し、少なくとも一種のα−アミノ保護されたアミノ酸またはペプチドをそれにカップリングする工程、 e)Ｒ₅を工程ｄの生成物から除去する工程、及び f)カルボン酸、活性エステルまたは酸無水物、アシルハライド、イソシアネート、イソチオシアネート及び塩化スルホニルからなる群から選ばれた反応体との付加反応をＲ₅の除去の部位で起こらせ、それによりペプチド結合を開裂しないで選択的に開裂し得ない結合を生じる工程を含むベタイドの製造方法。 11．式：（式中、Ｒ₁は不安定なα−アミノ保護基であり、Ｒ及びＲ₂は独立にＨまたは CH₃であり、かつＲ₃はペプチド結合を開裂しないで選択的に開裂し得ないアミド結合、尿素結合またはスルホンアミド結合によりＮＲ₂に共有結合される部分である）で表される、請求の範囲第６項に記載のベタイドを合成するのに有益であるベタイドアミノ酸。 12．Ｒ₃がからなる群から選ばれた部分であり、これらの部分がＲ₃中の不安定な部分の保護基を含んでいてもよい、天然α−アミノ酸の構造に似ている構造を有する請求の範囲第11項に記載のベタイドアミノ酸。 13．Ｒ₃がからなる群から選ばれた部分であり、これらの部分がＲ₃中の不安定な部分の保護基を含んでいてもよい請求の範囲第11項に記載のベタイドアミノ酸。 14．鎖延長プロトコルによる請求の範囲第６項に記載のベタイドの製造方法であって、その方法が a)式：（式中、Ｒ₀はＨまたはCH₃であり、Ｒ，及びＲ₅はその他の基の除去を生じない条件下で独立に除去可能な不安定なアミノ保護基であり、Ｒ及びＲ₂はＨまたは低級アルキルであり、かつＲ₆はカルボキシ官能基の不安定な保護基またはブロッキング基である）で表される保護されたベタイドアミノ酸前駆体を供給する工程、 b)Ｒ₁またはＲ₆を除去し、少なくとも一種の適当に保護されたアミノ酸またはペプチドをそれにカップリングしてペプチド中間体を生じる工程、 c)Ｒ₅を前記中間体から除去してアミノ基を脱保護する工程、及び d)Ｒ₂がＨである場合に必要により脱保護されたアミノ基をアルキル化剤で修飾して低級アルキル部分を導入し、カルボン酸、活性エステルまたは酸無水物、アシルハライド、イソシアネート、イソチオイソシアネート及び塩化スルホニルから選ばれた反応体との反応を行って付加反応をＲ₅の除去の部位で起こらせる工程を含むベタイドの製造方法。 15．前記反応体がカルボン酸またはアシルハライドであり、かつアシル化反応をＲ₅の除去の部位で起こらせる請求の範囲第14項に記載の所望のベタイドの製造方法。 16．Ｒ₅の除去の部位をアルキル化するためのアルキル化反応を前記アシル化反応の前に行う請求の範囲第14項に記載の方法。 17．鎖延長プロトコルによる請求の範囲第６項に記載の所望のベタイドの製造方法であって、その方法が a)Ｎ末端に遊離α−アミノ基を有するアミノ酸残基を有するペプチド中間体を供給する工程、 b)式：（式中、Ｒ₁は不安定なα−アミノ保護基であり、Ｒは水素または低級アルキルであり、かつＲ₅はＲ₁の除去を生じない条件下で除去できる不安定なα−アミノ保護基である）で表される非天然α−アミノ酸を供給する工程、 c)前記非天然アミノ酸を前記中間体のＮ末端にカップリングしてその長さを一つの残基だけ延長する工程、 d)前記延長されたペプチド中間体からＲ₁を除去しないでＲ₅を除去する工程、 e)ジメトキシベンズヒドリルクロリドで処理することによりＲ₅の除去の部位で一級アミノ基をアルキル化して二級アミノ基を生じる工程、 f)アルデヒドで処理することにより前記二級アミノ基をアルキル化し、その反応生成物を還元して三級アミノ基を生じる工程、 g)工程ｆの生成物から前記ジメトキシベンズヒドリル部分を除去して二級アミノ基を再度生じる工程、 h)カルボン酸、活性エステルまたは酸無水物、アシルハライド、イソシアネート、イソチオイソシアネート及び塩化スルホニルから選ばれた反応体との付加反応を前記の再度生じた二級アミノ基で起こらせる工程、及び i)Ｒ₁を除去し、必要によりＲ₁の除去の部位で一級アミノ基をアルキル化し、必要により一種以上のアミノ酸またはペプチドをそれにカップリングさせ、それにより前記所望のアルキル化ベタイドの長さを有するペプチド鎖を生じる工程を含むベタイドの製造方法。 18．前記アルデヒドがホルムアルデヒドであり、かつホウ水素化ナトリウムを使用して前記還元を行う請求の範囲第17項に記載の方法。 19．配列中の少なくとも一つの位置に天然α−アミノ酸以外のものを有するペプチドのバイオポテンシー等についてスクリーニングする方法であって、その方法が (A)a) 樹脂またはＮ末端に遊離α−アミノ基を有するアミノ酸残基を有するペプチド中間体を供給し、 b)式：（式中、Ｒ₀はＨまたはCH₃であり、ＲはＨまたは低級アルキルであり、Ｒ₁は不安定なα−アミノ保護基であり、かつＲ₅は不安定なアミノ保護基であり、Ｒ₁及びＲ₅はその他の基の除去を生じない条件下で夫々除去可能である）で表される非天然α−アミノ酸を供給し、 c)前記の非天然アミノ酸を前記樹脂または前記中間体の前記Ｎ末端にカップリングし、その結果、それが最終ペプチド配列中に所望の位置を占有し、 d)Ｒ₁を工程ｃの生成物から除去し、少なくとも一種のα−アミノ保護されたアミノ酸またはペプチドをそれにカップリングし、 e)Ｒ₅を工程ｄの生成物から除去し、そして f)アミノ反応性試薬にＲ₅の除去の部位で付加反応を行わせて、ペプチド結合を開裂しないで選択的に開裂し得ない結合を生じることにより鎖延長プロトコルを使用してベタイドをつくり、そして (B) 前記ベタイドをバイオポテンシー等について試験することを含むスクリーニング方法。 20．関係する前記ペプチドがＣβアルキル化を有する少なくとも一つの残基を有し、Ｒ₅の除去後に、アルキル化反応をβ−部位で行い、その後に前記付加反応を行う請求の範囲第19項に記載の方法。