JPH10509592A

JPH10509592A - Neural stem cell proliferation regulation

Info

Publication number: JPH10509592A
Application number: JP8515600A
Authority: JP
Inventors: サミュエルワイス; ブレントエイレイノルズ
Original assignee: ニューロスフィアーズホウルディングスリミテッド
Priority date: 1994-11-14
Filing date: 1995-11-14
Publication date: 1998-09-22
Also published as: NO972171L; EP0792350A1; AU716811B2; AU3836795A; MX9703492A; FI971956A0; WO1996015226A1; CN1170435A; FI971956A; KR970707272A; NO972171D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、様々な生物学的因子を含む組成物を使用してインビトロおよびインビボにおいて多能性神経幹細胞の増殖を調節する方法に関する。より詳細には、本発明は、幹細胞を特定の生物学的因子またはその組み合わせに接触させることにより神経幹細胞を分離することにより産生される前駆細胞の数を調節する方法に関する。 (57) SUMMARY The present invention relates to methods of regulating the proliferation of pluripotent neural stem cells in vitro and in vivo using compositions comprising various biological factors. More particularly, the present invention relates to a method of regulating the number of progenitor cells produced by isolating neural stem cells by contacting the stem cells with a specific biological factor or a combination thereof.

Description

【発明の詳細な説明】神経幹細胞増殖調節本発明の背景血液細胞を与える骨髄のような活性に***する組織内には、幹細胞として知られる特別な細胞が存在する。幹細胞を識別する決定的な性質は、自己再生を行う能力または自己を増大する能力である。幹細胞のもっとも単純な定義は、自己保存能を有する細胞という定義である。Potten and Loeffler[Development，110:1 001(1990)]らによる幹細胞のより厳格な（しかしより単純な）定義は、a)増殖、 b)自己保存、c)より多数の分化した機能プロゲニー(子孫、progeny)の生産、d) 障害を受けた組織の再生、およびe)これらのオプションを使用する際の柔軟性、を有する未分化の細胞というものである。幹細胞は分化し、前駆細胞として知られるプロゲニーを産生する。前駆細胞は、新しい幹細胞およびプロゲニター細胞(前駆細胞、progenitor cell)を含む。新しい幹細胞は、再度***することが可能であり、さらに幹細胞（自己保存を確実にする）およびプロゲニター細胞を生産する。プロゲニター細胞は抑制された増殖を行うことができ、その全てのプロゲニーは最終的に無糸***性機能細胞への不可逆的分化を受ける。図１は幹細胞、プロゲニター細胞および分化細胞の関係を示している。幹細胞の役割は細胞の自然死、障害または病気により失われる細胞を再置換することである。特定の組織における幹細胞の存在は、通常高代謝回転の細胞を有する組織と関連する。しかし、この関連性は、幹細胞が高代謝回転の細胞を有さない肝臓のような組織に存在すると考えられるため、常に保持されるわけではない[Travis，Science，259:1829(1989)]。最もよくその性質の研究が行われた幹細胞系は、造血幹細胞である。骨髄に位置する単一造血幹細胞は、一連のプロゲニター細胞を介して全ての血液細胞系列を与える。米国特許番号5,061,620(1991年10月29日特許)には、造血幹細胞の単離、再生および使用方法が記載されている。出生前には、造血幹細胞は多くの部位（胎児卵黄嚢、骨髄、肝臓および脾臓）において活性である。出生の直前には、骨髄は造血の一次部位として作用する。肝臓および脾臓における造血幹細胞は静止し、骨髄の造血幹細胞活性が抑制されるかまたは広範囲な血液細胞の破壊が起こらない限り血液細胞の産生は再開されない。成体哺乳類CNSの分化した細胞は、有糸***サイクルに入って新規神経組織を発生させる能力をほとんどまたは全く有さない−全ての神経発生は出生前および出生直後の期間において本質的に起こる。アストロサイトの制限され、かつゆっくりした代謝回転があり（[Korr et al.，J．Comp．Neurol.，150: 169(1971)］、およびオリゴデンドロサイトを与えることができるプロゲニター細胞が存在する（[Wolsquijk and Noble,Development，105: 386-698(1989)]と考えられているが、新規ニューロンの発生は通常起こらない。しかし、ラットは歯状回や嗅球のような制限された成体脳領域において、新規なニューロンを発生する制限された能力を示す[Kaplan，J．Comp．Neurol.，195: 323(1987)；Bayer，S.A，NY.Ac ad．Sci.，457; 163-172(1985)]がこれは全ての哺乳類に適用できない；および成体霊長類では新規ニューロンの発生はみられない（[Rakic，P.，Science，227 : 1054(1985)]。このような殆どの哺乳類（特に霊長類）における新規ニューロン細胞の発生能の欠如は、長期記憶保持にとっては利点であるかもしれない；しかし、傷害または病気により失われたニューロン細胞の置換が必要な場合には、明確な欠点となる。成体哺乳類CNSの障害や病気による細胞の欠失に対する新規細胞の発生能の欠如を伴う哺乳類CNSにおける細胞の低い代謝回転は、成体哺乳類CNSが幹細胞を含まないという仮定に至った。しかし、インビトロにおいて幹細胞の性質を示す細胞がCNSから最近単離された。胚[Reynolds et al.，J.Neuro sci,．12:4565(1992)]から成体[Reynolds and Weiss，Science，255; 1707(1992 )]にこの細胞は存在し、障害や病気に応答して新規細胞を産生しないが、成体CN Sが、造血系と同様に幹細胞およびそのプロゲニーの分化および増殖により自己を修復しかつ新規細胞を産生する能力を有することを示している。インビボ実験から得られた最近の知見は、比較的静止した幹細胞細胞が成体脳室の表皮下の裏側に存在することを示している(Moreshead et al.，Neuron vol.13(5):1071-108 2(1994))。これらの幹細胞は、適当な刺激の下に、神経の損傷または病気の場合に置換細胞源となりえる。造血幹細胞の生存、伸張および増殖並びに肝臓、腸および皮膚の幹細胞系は、多数の異なる栄養因子のコントロール下にあることが示された。例えば、造血系においてエリスロポエチンおよびグリコプロテインCSF(コロニー刺激因子)のような成長因子および様々なインターロイキンが幹細胞機能を調節する因子として単離された[Metcalf，D.，Bioassays，14(12): 799-805(1992)]。胚発達期間におい神経細胞における栄養因子の影響の研究は、血小板由来成長因子（PDGF）、毛様栄養因子（CNTF）、塩基性繊維芽成長因子(bFGF)、上皮成長因子(EGF)、形質転換成長因子α(TGFα)および神経成長因子(NGF)のような内生的発生物質が出産前の神経系の発達に寄与することを示唆している。例えば、0- 2A細胞として知られる胚神経プロゲニター細胞の型はオリゴデンドロサイトを与え、かつタイプ2のアストロサイトを与える。PDGFの存在下において、0-2A細胞は分割し、幾つかの分割の後、オリゴデンドロサイトに分化する。CNTFおよび基質因子の添加はPDGFの添加よりも、0-2Aプロゲニター細胞をタイプＩのアストロサイトに分化を進行させる[Raff et al.，Nature(Lond)，303: 390-396(1983)] 。bFGFはニューロンに発達する胚プロゲニター細胞の増殖において二倍の増加をもたらす[Gensberger et al．FEBLett.，217: 1-5(1987)]。CattaneoおよびMcKa y(1990)は同時にまたは逐次的に成長因子を加えると、因子を個々に加えた時には明らかではなかった、新規な応答を顕在化することを示した。彼らは、bFGFを前もって加えた場合にのみ、NGFが胚ニューロブラストの増殖を刺激してニューロンを産生することを示した[Cattaneo，E．and McKay，R.，Nature，347: 762- 765(1990)]。bFGFはまた、PDGFに接触した際に、PDGF受容体の発現に影響を与え、0-2Aプロゲニター細胞の分化をブロックすることが示された[McKinnon et al. ，Neuron，5: 603-614(1990)]。EGFまたはTGFαは培養内において成長する胚網膜神経上皮細胞における細胞***促進性効果を示し、成長因子の継続的存在下において、ニューロンを与えるがグリア細胞を与えないプロゲニター細胞となる[A nchan et al.，Neuron，6: 923-936(1991)]。同じ研究において、ニューロンおよびミュラー細胞は、出産後のラット神経上皮由来の培養において生じることが報告されている。 CNS障害としては、神経組織変性障害（例えばアルツハイマーおよびパーキンソン病）のような多数の病気、急性脳障害（例えば卒中、頭部障害、脳性麻痺）およびCNS機能不全を伴う多数の疾病（例えば鬱病、癲癇、および精神***病）が挙げられる。近年、神経組織変性障害は、これらの障害の危険性を有する初老の人口が増大しているため、重要な問題となってきた。アルツハイマー症、複合硬化症、ハンチントン病、筋萎縮性側方硬化症、およびパーキンソン病を含むこれらの障害は、CNSの特定の部位における神経細胞の分解に関連しており、これらの細胞または脳部位が所定の機能をはたすことを不可能にする。神経組織変性障害に加えて、急性脳障害はしばしば神経細胞の喪失、患部脳部位の不適当な機能、およびその後に行動異常を起こす。CNS機能障害の最も一般的なタイプ（患者数に関連して）は、神経細胞の喪失により特徴づけられるのではなく、むしろ存在する神経細胞の異常な機能により特徴づけられる。これは、ニューロンの不適当な発火（firing）、または神経伝達物質の異常な合成、放出および変遷過程によるものであろう。これらの機能障害の幾つかはよく研究されており、鬱病および癲癇のような障害は詳細にわたり研究されているが、神経症および精神病の様な他の障害はあまり理解されていない。現在までのところ、CNS障害の一次的な治療は薬剤の投与により行われてきた。不幸なことにこの型の治療は、血液−脳関門を通過する薬剤の限られた能力、およびこのような薬剤を長期に渡り投与された患者が得る薬剤耐性を含む多数の複雑な状況を伴う。例えば、パーキンソン病の患者におけるドーパミン様活性の部分的回復はレボドーパ(levodopa)（レボドーパは血液−脳関門を通過することができるドーパミン前駆体である。）により達せられる。しかし、患者はレボドーパの効果に耐性となり、そのためその効果を維持するためには、絶え間なく投与量を増加させることが必要となる。加えて、増加し、コントロールできない動きのようなレボドーパに伴う多数の副作用が現れる。神経学的疾患の緊急的な治療技術としては、CNS内に細胞を移植し、ホスト神経細胞の機能喪失または機能異常を置換または補償することが挙げられる。胚CN S細胞はヒトの試験においては良好な結果が得られており[Winder et al.，NewEn g．J．Med.，327:1556(1992)]、好ましいドナー組織であるが、倫理的にも政治的にも、また、十分な量の組織の入手性から考えてもこれらの細胞の使用は制限される。CNS障害の治療における使用のためのドナー組織の他の型は研究されている。これらの例としては、遺伝工学的に改良された神経細胞[Renfranz et a l.，Cell，66: 173(1991); Synder et al;l Cell 68: 1，(1992)]、フィブロブラスト(Kawaja et al.，J．Neurosci.，12: 2849，(1992))、筋細胞[Jiao et al .，Nature，363: 456(1993)]、グリアプロゲニター細胞[Groves et al,Nature， 362; 453(1993)]、カプセル化細胞[Hoffman et al.，Exp．Neurol.,132: 100(19 93)]が挙げられる。移植方法は最近行われている神経学的疾患の治療において明らかな改良をもたらしたが、この技術はまだ完全なものではない。例えば、移植において幾つかの細胞型はホストCNS組織と融和しない。特に、非神経一次細胞培養の使用は、移植された物質のホスト組織に結合する能力を制限する。一次神経組織から得られる不滅化したドナー細胞は結合することができるが、これらの細胞内に取り込まれた癌細胞の遺伝学的発現はコントロールするのが困難であり、癌および他の合併症を引き起こす。ドナーおよびホストの移植細胞の拒絶という結果もありうる。また、移植細胞が癌を形成したり、またはドナー組織からホストへ感染性物質が渡るという可能性もある。 Gage et alは、米国5,082,620号において、適当なCNS部位内に遺伝的に改良した神経細胞を移植することにより、欠損、疾病またはCNS細胞障害を治療する方法を報告している。上記特許に記載されたドナー細胞は非神経一次培養から得られたものであるが、遺伝的に形質転換された神経細胞系も使用できることが示唆された。これらのドナー細胞源は本質的に問題がある。Gageらは、彼らの技術において使用するドナー細胞により課せられる制限を認識し、および“少数の非形質転換細胞培養系の複製”ということを認識している。彼らはまた、“非複製神経細胞がウィルス感染に対して難治性であること”も認識している。この後者の記述は従来技術における方法を遺伝的に改良した神経細胞（これらは胚組織から得られない限り正常な有糸***促進物質ではない）に適用する試みに伴う困難性を要約したものである。この技術における本質は組織拒絶の可能性である。理想的には、遺伝的に改良された移植細胞は自己由来のものであるべきであり、それにより免疫学的複合作用を防ぐ−i.e.もし、インビトロにおいて、患者自身の静止性の神経幹細胞を遺伝工学的に改良および／または刺激を行って、新規な神経細胞に分化するように***させ、欠失または障害を受けた神経組織を置換するように移植することができるならば、有利であろう。生存中に哺乳類の脳内に存在することが知られている多能性神経幹細胞[Reyno lds and Weiss，Science，255: 1707(1992)]は、上皮成長因子のような成長因子の存在下において、刺激を行って、有糸***的に活性にすることができる非形質転換神経細胞源を提供する。培養内で、神経幹細胞を増殖するように誘導し、大量の未分化の神経細胞を与えることができ、これらの未分化の神経細胞を神経細胞の主型に分化して移植すること、遺伝的に改良して移植すること、または薬剤のスクリーニングやその他の目的に使用することが可能である。神経幹細胞および／またはそのプロゲニーの有糸***活性を上昇、低下または他の方法で変化させるために、インビトロにおいて神経幹細胞の増殖を調節することができるのは利点である。移植、遺伝的改良、薬剤スクリーニングなどのために得られるプロゲニーの数がより増加するため、静止神経幹細胞の有糸***活性の上昇は明らかに有利である。また、増殖誘導性成長因子の存在下において成長する増殖神経幹細胞が、インビトロにおいて、どのように増殖量の低下を調節することができるか決定することは利点である。この情報はインビボにおいて、米国継続特許番号08/149,508号(1993年11月9日)に記載されているような増殖誘導成長因子を調節するのに使用することができる。成長因子または成長因子の組み合わせ存在下において、有糸***的に活性になる神経幹細胞の数だけでなく、これらの幹細胞の前駆プロゲニーの有糸***の速度も調節しえることは、また有利である。脳または脊髄組織の障害に対する応答においてグリオーシス(gliosis)が生じる。このプロセスから生じるグリア瘢痕は、神経軸策が障害を受けた部への結合の再確立を防ぎ、機能の破壊を防ぐ。障害を受けた部位および障害を受けた部位に非常に近接した部位から少し離れた部位の両方の部位において増殖するアストロサイトは、グリア瘢痕の重要な細胞成分である(Reier，P.J．Astrocytes vol. 3: 263-323(1986))。神経幹細胞およびそのプロゲニーの障害に応答した増殖はグリオーシスの発達における因子であるかもしれない。障害を受けた部位のグリオーシスの範囲を縮小することができれは、神経修復を増強することができる。障害部位に近接した部位でアストロサイトの数を増加するように誘導する有糸 ***活性を阻害または減少させることによりグリオーシスを低下させることができるのは利点である。神経幹細胞および／またはそのプロゲニーの障害−誘導シグナルに応答して増殖する能力を低下させることが、グリア瘢痕形成範囲を制限する方法であってもよい。***した軸策の、増加した障害部位に対する再結合する能力は、神経修復プロセスおよび修復機能の質を改良する。前述した、移植または他の使用のためのCNS細胞源の不足という観点から、未制限の増殖を誘導するために腫瘍形成遺伝子を挿入することにより意図的に不死化するという方法によらない、ヒトおよび非ヒトから得られる胚および成体神経細胞を大量に培養する確実な方法（それにより細胞の正常な機能への遺伝的変化という影響に対するいかな問題も除かれる）に対する希求が存在する。また、特定の条件下において、インビトロおよびインビボにおける細胞増殖を調節することができる必要がある。従って、本発明の目的は、成長因子または成長因子の組み合わせの様な特定の生物学的因子の添加を通じて、幹細胞が生育する培地を改変することにより、CN S幹細胞の増殖をインビトロにおいて調節する方法を提供することである。本発明の他の目的は、CNS幹細胞の増殖をインビボにおいて調節する方法およびそのための治療組成物を与えることである。組成物は、成長因子およびその組み合わせのような特定の生物学的因子を含んでおり、これらの成長因子はCNSの脳室系内に注入され幹細胞増殖を調節する。本発明のこれらのおよび他の目的は以下に述べる詳細な説明および特許請求の範囲の記載から当業者に明らかである。上述した参考文献はいずれも本発明を記載するものではなく、先行技術ではない。これらの参考文献は背景情報開示の目的で示されたものである。本発明の要約多能性神経幹細胞および／またはそのプロゲニーのインビトロにおける増殖を調節する方法を以下に述べる。方法は、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに分化し得るプロゲニーを生産することができる多能性神経幹細胞を少なくとも一種含む哺乳類神経組織を分断する工程、および少なくとも一種の幹細胞増殖を誘導する増殖因子および多能性神経幹細胞および／またはそのプロゲニーの増殖を調節する調節因子を含む培地内で、多能性幹細胞を増殖する工程を含む。さらに、多能性神経幹細胞および／またはそのプロゲニーのインビボにおける増殖を調節する方法および組成物を以下に述べる。該方法は、哺乳類の脳室内に、多能性神経幹細胞の増殖および／またはそのプロゲニーの増殖における調節効果を有する因子を少なくとも一種含む治療組成物を到達させる。本発明の一つの実施態様において、増殖因子はbFGFであり、および調節因子は EGFまたはヘパラン硫酸であり、これらは幹細胞プロゲニーの増殖速度を増加する。本発明の他の態様において、神経幹細胞の増殖を阻害する因子またはその組み合わせは、インビボにおいて細胞増殖を低下させるように投与される。図面の簡単な説明図１：多能性神経幹細胞の増殖を示した概略図。（Ａ）増殖因子の存在下において幹細胞は***し、より多くの幹細胞およびプロゲニター細胞からなる未分化細胞の球体（sphere）を与える。（Ｂ）クローン的に誘導された未分化細胞の球体が分断されて単細胞として非接着物質上に置かれ、増殖因子存在下に置かれると、各幹細胞は新しい球体を産生する。（Ｃ）もし球体が分化を許容するような条件下において培養される場合には、プロゲニター細胞はニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに分化する。図２：（Ａ）20 ng/mlのEGF中で培養した10日後の神経球体（neuroshpere）の写真（倍率：100倍）。（Ｂ）20 ng/mlのFGF中で培養した10日後の神経球体の写真（倍率：100倍）。（Ｃ）20 ng/ml EGF＋20 ng/ml FGF中で培養した10日後の神経球体の写真（倍率：100倍）。図３： 20 ng/ml EGF＋20 ng/ml FGFまたは20 ng/ml FGF＋2 μg/mlヘパラン硫酸の存在下において、成体マウス脊髄の頸部、胸部および腰部から誘導された一次細胞由来の神経球体の数を示している。発明の詳細な説明本発明は多能性神経幹細胞の増殖を調節および操作する方法および組成物の研究に基づいており、インビトロおよびインビボにおける多能性神経幹細胞由来のプロゲニーの数を調節することに関している。“神経幹細胞”または“中枢神経系(CNS)幹細胞”という用語は、比較的静止した、神経組織由来の未分化の幹細胞を意味し、増殖することができ、より多くの神経幹細胞（従って、自己保存を確立する）およびプロゲニター細胞のもととなることができるものを意味する。 “多能性”という用語はニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトのような分化神経細胞の主要な型の元となるプロゲニーを産生することが可能な神経幹細胞を意味する。比較して、分化細胞の二種類の型のもととなる未分化細胞（例えば、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトの元となるＯ−２Ａ細胞）は“二分化性(bipotent)”と呼び、一種類の型の分化細胞のみを生ずるものを“単能性(unipotent)”と呼称する。 “プロゲニター細胞”という用語はまた、神経幹細胞由来の未分化細胞を意味するが、制限された増殖能を有し、自己保存を行わない幹細胞とは区別される。各神経プロゲニター細胞のプロゲニーは、適する条件下においてニューロン、アストロサイト（Ｉ型またはII型）またはオリゴデンドロサイトに分化する。オリゴデンドロサイトは、中枢神経系（CNS）における軸策に接するミエリン由来の分化したグリア細胞である。オリゴデンドロサイトはガラクトセレブロシド(+) 表現型、ミエリン塩基性タンパク(+)表現型、およびグリア繊維性酸性タンパク( +)表現型[GalC(+),MBP(+),GFAP(-)]を有する。ニューロンはニューロン特異性エノラーゼ(+)表現型、ニューロフィラメント(+)表現型、微小管を伴うタンパクまたはTau-1(+)表現型[NSE(+),NF(+),MAP-2(+)またはTau-1(-)]を有する分化した神経細胞である。アストロサイトはGFAP(+)、GalC(-)、およびMBP(-)表現型を有する分化したグリア細胞である。 CNS幹細胞については既に報告されており、その使用が記載されている[Reynol des and Weiss，Science，255: 1707(1992); Reynolds et al.，J.Neurosci.，1 2: 4565(1992); Reynolds and Weiss，Restorative Neurology and Neuroscienc e，4: 208(1992); Reynolds and Weiss，”Neuronal Cell Death and Repair”ed．Cuello，A.C.，Elsevier Science，pp．247-255(1993)]。さらに、これらの細胞の有用性は、PCT出願公開番号WO 93/01275号，WO 94/16718号，WO 94/10292号およびWO 94/09119号に記載されている。他の哺乳類組織内で見いだされた幹細胞のように、CNS幹細胞は自己保存を行うことができ、かつ新規幹細胞およびニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに分化することができるプロゲニター細胞を含む大量のプロゲニーを産生することができる。 CNS幹細胞は、ReynoldsおよびWeiss[Science，255: 1707，(1992)]らによる方法、上記に述べたPCT出願特許および下記の実施例１に記載されている方法により単離および培養することができる。多能性CNS幹細胞は脊髄の髄体(conusmedul laris)、頸部、胸部および腰部、脳幹、線条体および視床下部を含む様々なCNS 領域内で発生することができる。神経幹細胞はこれらの各領域由来の組織から得ることができ、インビトロにおいて***するように誘導し、自己保存を行い、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを含む大量のプロゲニーを産生することができる。要約すると、多能性神経幹細胞は神経組織から得ることができ、並びに好ましくは血清を含まず、かつ細胞の生存を支持することが知られている物質の組み合わせを含んでいてもよい培地内で生育する。適する血清を含まない培地は、この明細書において、以下、“完全培地”と呼称し、ダルベコ改変イーグルス培地(D MEM)およびF-12栄養混合物（ギブコ）（１：１）、グルコース(0.6%)、グルタミン(2 mM)、炭酸水素ナトリウム(3mM)、HEPES(４−［２−ヒドロキシエチル］− １−ピペラジンエタンスルホン酸)バッファー(5mM)並びにインスリン(25μg/ml ）、トランスフェリン(100μg/ml)、プロゲステロン(20μM)、プトレスシン(60 μM)、およびセレニウムクロリド(30 nM)を含む、血清の代わりに用いられる所定のホルモン混合物および塩混合物(10%; シグマ社製)を含んでいてもよい。多能製幹細胞の増殖を誘導する、少なくとも一種の生物学的因子を完全培地に添加する。 “生物学的因子”という用語はこの明細書において、タンパク、ペプチド、核酸、成長因子、ステロイドまたは幹細胞または幹細胞プロゲニーに対する成長、増殖、分化、栄養または調節効果（単一でも他の生物学的因子との組み合わせによっても）を有する他の天然または人工の分子のような、CNS細胞内において機能する生物学的に活性な物質を意味する。生物学的因子の例としては、酸性および塩基性繊維芽細胞成長因子(aFGF,bFGF)、上皮成長因子(EGF)およびEGF-様リガンド、トランスフォーミング成長因子アルファ(TGFα)、インスリン様成長因子( IGF-1)、神経成長因子(NGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ);脳由来神経栄養因子(BDNF)、毛様体神経栄養因子(CNT F)、およびグリア由来神経栄養因子(GDNF)を例とする栄養因子; ホルボール12- ミリステート13-アセテート、スタウロスポリン、CGP-41251、チルホスチン(tyr phostin)などのような成長因子活性を有する細胞内経路の調節剤; アクチビンおよび甲状腺刺激ホルモン(TRH)を例とするホルモン; インターロイキン、Bcl-2遺伝子生産物、骨形成タンパク(BMP-2)、マクロファージ炎症性タンパク(MIP-1α ，MIP-1β，MIP-2)を例とする様々なタンパクおよびポリペプチド; 例えばEGF受容体、FGF受容体などの転写に対する反意鎖のようなオリゴヌクレオチド; ヘパラン硫酸のようなヘパリン様分子; およびアンフィレグリン、レチノイン酸および腫瘍壊死因子α(TNFα)を含む、神経幹細胞または幹細胞プロゲニーに対する効果を有する様々な他の分子が挙げられる。個々に多能性神経幹細胞に対する増殖効果を有するEGFおよびbFGFのような生物学的因子を、この明細書では、“増殖因子”と呼称する。一般に増殖因子は細胞表面受容体に結合し、増殖を誘導する。好ましい増殖因子としては、EGF、アンフィレグリンン、aFGF、bFGF、TGFαおよびこれらの組み合わせ並びにヘパラン硫酸のような他の生物学的因子が挙げられる。神経幹細胞の増殖を誘導する特に好ましい組み合わせとしては、EGFおよびbFGFの組み合わせが挙げられる。増殖因子は、通常、培地に対して約10 pg/ml〜500 ng/ml、好ましくは約1 ng/ml〜 100 ng/mlの範囲内の濃度で添加される。EGF、aFGFおよびbFGFの最も好ましい濃度は、それぞれ約20 ng/mlである。幹細胞はどのような培養容器内で培養してもよく、例えば96ウェルプレートまたは培養フラスコが挙げられる。増殖誘導成長因子または因子の組み合わせ存在下において、多能性神経幹細胞は***し、3〜4日以内に未分化の幹細胞プロゲニーを生ずる。ここでは“前駆細胞”を意味する、幹細胞プロゲニーは新しく産生された多能性幹細胞およびプロゲニター細胞を含む。インビトロにおいて、単一幹細胞のプロゲニーは、この明細書において“神経球体(neurosphere)”と称する前駆細胞の集合体を典型的には形成するが、培養条件を（例えば、増殖細胞が接着する処理基質を与えることにより）増殖細胞が特有の神経球体を形成しないように、変えてもよい。前駆細胞はいずれの神経細胞またはグリア細胞マーカーに対しても免疫応答性ではないが、未分化CNS細胞内で見いだされた中間フィラメントタンパクであるネスチンに対して免疫応答性である[Lehndahl et al.,C ell，60: 585-595(1990)]。増殖誘導成長因子の継続的存在下において、神経球体内の前駆細胞は継続して ***し、未分化細胞数の増加の結果神経球体のサイズは増大する[nestin(+)，NF (-)，NSE(-)，GFAP(-)，MBP(-)]。分化を促進せずにさらなる増殖を行わせる同じ成長因子または異なる成長因子の存在下において、前駆細胞の継代を行うことができる。細胞を増殖培養法を用いて30回またはそれ以上継代し、前駆細胞の数を指数的に増加させることができる。上述したインビトロにおけるCNS幹細胞の増殖のための培養技術は、EGFまたは他の増殖因子に応答して幹細胞から得られる前駆細胞の数および性質を増加、減少または他の方法で改変する付加的な生物学的因子またはその組み合わせの使用により改良することが可能である。増殖における変化は、形成される神経球体数の増加または減少および／または神経球体のサイズの増大または減少により観察される（これらは神経球体当たりの前駆細胞数で決定される増殖速度の反映である）。このように、“調節因子”という用語は、この明細書では、幹細胞および／または前駆細胞の増殖に対して調節効果を有する生物学的因子を意味する。例えば、増殖誘導成長因子（例えばEGFのような）に応答してインビトロにおいて増殖する幹細胞数を増加または減少させるならば、そのような生物学的因子は“ 調節因子”であると考えられる。または、増殖誘導因子に応答して幹細胞数が同数のままであってもよいが、調節因子の添加は幹細胞および／または幹細胞プロゲニーの増殖する速度に影響する。増殖因子は、他の増殖因子と組み合わせて使用される場合には、調節因子の役割をしてもよい。例えば、bFGFおよびEGFの組み合わせ存在下において形成する神経球体はbFGFのみの存在下に形成される神経球体より明らかに大きく、幹細胞および幹細胞プロゲニーの増殖速度がより早いことを示している。調節因子の他の例としては、ヘパラン硫酸、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)、アクチビン、骨形成タンパク(BMP-2)、毛様体神経栄養因子(CNTF) 、レチノイン酸、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)、マクロファージ炎症性タンパク(MIP-1α,MIP-1βおよびMIP-G)、神経成長因子(NGF)、血小板由来成長因子(PD GF)、インターロイキンおよびBcl-2遺伝子生産物が挙げられる。増殖因子の転写物に結合するアンチセンス分子およびその受容体に対する転写物はまた、幹細胞増殖を調節する。幹細胞増殖に対する調節効果を有する他の因子としては、c-fo s経路を上方制御するホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA; シグマ)を含むc-fos経路(EGFにより活性かれることが知られている中間初期遺伝子)の活性化を阻害するもの、c-fos発現を下方生後するスタウロスポリン（リサーチバイオケミカルインターナショナル）およびCGP-41251（チバ−ガイギー）並びに受容体へのEGFの結合によるチロシンキナーゼ活性化を抑制するのチルホスチン[Fa llon，D et al.，Mol．Cell Biol.，11(5): 2697-2703(1991)]などが挙げられる。神経幹細胞プロゲニーがFGFに応答して増殖する速度を増加するための調節因子としてはヘパラン硫酸およびEGFが好ましい。増殖因子に応答して幹細胞数を減少させる調節因子としては、TGFβ族、インターロイキン、MIP、PDGF、BMP-2 、TNFα、レチノイン酸(10^-6M)およびCNTFが好ましい。増殖因子により産生される神経球体のサイズを減少する因子としては、TGFβ族、レチノイン酸(10^-6M)およびCNTFが好ましい。調節因子は、培地に対して約10 pg/ml〜500 ng/ml、好ましくは約1 ng/ml〜10 0 ng/mlの範囲内の濃度で添加される。最も好ましい調節因子濃度は、約10 ng/m lである。調節因子レチノイン酸は、１mMストック溶液から調整され、最終濃度が約0.01μM〜100μM、好ましくは約0.05〜5μMの間となる濃度で使用する。神経球体の発生におけるEGFまたはbFGFの増殖効果を減少させるには、約1μMのレチノイン酸濃度が好ましい。アンチセンス鎖は約1〜25μMの濃度で使用することが可能である。好ましい範囲は約2〜約7μMである。増殖を増加するために使用されるPMAおよび関連分子を約1 μg/ml〜500 μg/ml、好ましくは1 0μg/ml〜200 μg/mlの濃度で使用してもよい。グリコサミノグリカン、ヘパラン硫酸は様々な細胞性プロセスに影響することが知られる哺乳類細胞表面上に偏在する成分であり、FGFおよびアンフィレグリンのような成長因子分子に結合し、それにより細胞表面の受容体に対するこれらの分子の結合を促進する。これは、約1 ng/ml〜1 μg/ml、好ましくは約0.2 μg/ml〜20μg/ml、最も好ましくは約2 μg/mlの濃度において、他の生物学的因子と組み合わせて培地に添加することが可能である。 PCT出願特許WO 93/01275、WO 94/16718、WO 94/10292およびWO 94/09119に記載されているように、前駆細胞は様々な神経学的疾患を治療するための移植に使用することができる。移植に使用される細胞は、当業者らに既知の方法を用いて、培地から収集し、異常な神経性または神経変性症状（化学的、電気的、機械的または他の傷害、実験的な神経領域の吸引または病気若しくは加齢プロセスの結果得られるものを含む全ての症状）を呈する動物に移植することができる。ここに記載された方法は、インビボにおいて患者の正常な静止幹細胞の増殖の調節のために生物学的因子を使用する前に、インビトロにおける多能性哺乳類神経幹細胞の増殖におけるその生物学的因子の増殖または調節効果を試験するために使用することができる。機能傷害を有する組織、病変を有する組織または傷害を受けた組織への生物学的因子の増殖または調節効果を試験するために、神経幹細胞を、神経性疾患を有するヒトから得てもよい。調節因子を含む治療組成物を、様々な神経性障害、疾患または傷害の治療に使用するために調製することが可能である。該組成物は一種以上の調節因子を、生理学的に許容される形態で上記の濃度で含む。治療組成物は神経幹細胞の増殖を調節するためにインビボにおいて投与されてもよい。正常な静止神経幹細胞は、脳室領域に近接したCNS内に位置する。側脳（第一および第二）室は前脳内である。第三の脳室は後脳内に位置する第四の脳室に接続する前脳の低位置の腔である。前記脳室構造と連続する中心管は、脊髄の脳室成分である。 CNS幹細胞が、脳室に裏打ちされた組織内に位置するという事実は、これらの細胞のインビボにおける改変および操作、およびCNSの異なる領域に影響する様々な神経性疾患、障害および障害の根本的な治療において幾つかの有利な点を与える。これらの治療は、ここに述べる方法により、患部領域に近い脳室を取り巻く幹細胞がインビボにおいて操作または改変されるように、改良されることができる。脳室系はほとんど全ての脳領域内で見いだされ、従って、患部領域へのより早い接近を可能とする。もし、幹細胞を、成長因子またはウィルスベクターを含む組成物と接触させることにより改変したければ、その組成物を脳室に投与する装置を移植することが比較的簡単である。例えば、浸透圧ポンプに接続したカニューレを使用して、組成物を分布させてもよい。または、組成物を脳室内に直接注入してもよい。これは、傷害または疾病により障害を受けた領域内にCNS幹細胞プロゲニーの移入を許容する。さらに、脳室が多くの脳領域に対して極めて近傍にあるため、幹細胞またはそのプロゲニーから分泌された神経性薬剤の分布を許容する。グリア瘢痕組織の形成の結果生ずるグリオーシスはCNS組織への傷害の結果起こる。瘢痕組織は、軸策の成長および重要な要素の再接続における主要な阻害活性を有し、それにより脳または脊椎傷害の後の機能回復を阻害すると考えられる。CNS瘢痕組織の唯一の成分ではないが、アストロサイトは関連する主要な成分の一つである(Reier,P.J．Astrocytes vol，3: 263-323(1986))。グリオーシス（少なくとも一部）は、以前の静止幹細胞の増殖から生じる可能性がある。CNS に対する傷害後、神経幹細胞増殖を阻害することが知られている因子を脳室系に投与することは有利である。アストロサイトを生ずる幹細胞プロゲニーの増殖を低減することにより、傷害部位における瘢痕組織の形成を減少させ、軸策成分の再結合を許容する条件を増強する。好ましい阻害因子はBMP-2である。実施例1 胚性脳組織由来の多能性CNS幹細胞のインビトロ増殖-EGF応答神経球体増殖胚齢14日(E14)のCD₁アルビノマウス（チャールズリバー）を断頭し、脳及び線条体(striata)を無菌方法を用いて除去した。組織を、口焼きしたパスツールピペットを用いて、完全培地内に機械的に分離した。細胞を800r.p.mで5分間遠心分離を行い、上澄み液を吸引し、細胞を計測するために、再び完全培地内に再懸濁した。細胞を20ng/mlのEGFを含む完全培地内に、25,000細胞／ｍｌの密度で懸濁した。５mlチップがついたエッペンドルフリピートピペッターを使用して、200μｌの細胞懸濁液を前処理を行った基質を含まない96ウェルプレート内の各ウェルに添加し、37℃、湿度100％、95％空気／5％ＣＯ₂の条件下のインキュベーター内においた。細胞が、インビトロにおいて最初の48時間以内及び３〜４日（ＤＩＶ）後迄に増殖した時、それらは神経球体として知られる小さなクラスターを形成しており、これは４〜６ＤＩＶの間に基質を持ち上げた。１ウェルあたりの産生した神経球体数を計測し、細胞を継代した後（実施例２）、EGFに応答して産生される神経球体数を、他の生物学的因子のみ、またはEGFとの組み合わせ（実施例３）に応答したものと比較し、結果を表に示した。実施例2 増殖神経球体の継代パラダイム１：細胞および培地は実施例１に述べたように調製した。細胞を、前処理した物質を含まないフラスコ（コーニング）内に0.2×10⁶細胞/mlプレートし、実施例１に述べたように培養を行った。７ＤＩＶ後、神経球体を除去し、400r.p.m．で遠心分離を2.5分行った。ペレットを機械的に、口焼きしたガラス製のパスツールピペットを用いて、2 mlの完全培地にそれぞれ細胞を分離した。 20 mlのEGF-含有完全培地を含む75cm²組織培養フラスコ内に1×10⁶細胞を再プレートした。幹細胞の増殖および新規神経球体の形成を再度開始した。この工程を６〜８日毎に繰り返すことができる。パラダイム２：EGFの代わりに20 ng/mlのFGFを完全培地に添加する工程以外は、実施例１および実施例２のパラダイム１の方法を繰り返した。パラダイム３：20ng/mlのEGFに加えて、20 ng/mlのFGFを完全培地に添加する工程以外は、実施例１および実施例２のパラダイム１を繰り返した。継代により得られた神経球体は、実施例１に述べられているように、機械的に分離し、細胞を96ウェルプレート（ヌンクロン）上に再プレートすることができる。特定の生物学的因子、または生物学的因子の特定の組み合わせの、継代した神経球体由来の細胞からの神経球体の増殖における効果を測定し、一次組織由来の細胞から得られた結果と比較することができる。実施例3 様々な増殖因子および調節因子の組み合わせに応答した線条体由来神経球体増殖のアッセイパラダイム１：実施例１に述べた方法により調製した一次線条体細胞を、実施例１の記載に従い、成長因子を含まない完全培地に懸濁し、96ウェルプレート（ヌンクロン）内にプレートし、培養を行った。１時間培養を行った後、完全培地内に、特定の増殖因子またはEGF若しくはbFGF(組み換え型ヒトbFGF：R & D システム)を含む増殖因子の組み合わせ、またはEGFとbFGFの組み合わせ、またはEGF、F GFとヘパラン硫酸（シグマ）またはbFGFとヘパラン硫酸を、各成長因子が20ng/m l、ヘパラン硫酸が2 μg/mlの濃度で、プレートの各ウェルに添加した。アクチビン、BMP-2、TGF-β、IL-2、IL-6、IL-8、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2( 全てChiron Corp.から得られた)、TNFα、NGF(シグマ)、PDGF(R & Dシステム)、 EGFおよびCNTF(R.Dunn and P.Richardson，McGill大学)を別々の完全培地を含むフラスコ内に、最終濃度が0.2 μg/mlとなるように調製した。レチノイン酸（シグマ）を10^-6M濃度で添加した。10μlのこれらの調節因子含有溶液の一つを96ウェルプレートの各増殖因子含有ウェルに添加した。増殖因子のみを含有するコントロールウェルもまた調製した。他の一連の実験において、これらの各調節因子の性質を誘導する神経球体を、これらの存在下に、増殖因子を含まない完全培地中で細胞を生育することにより試験を行った。EGFまたはFGFのような増殖誘導因子の不存在下で使用した場合には、EGFを除いて神経幹細胞の増殖に効果を示したものはなかった。アクチビン、BMP-2、TGF-β、IL-2、IL-6、IL-8、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、 TNFαおよびEGFの添加を二日毎に繰り返し、CNTFは毎日添加し、およびレチノイン酸、NGFおよびPDGFは実験の始めに一回添加したのみであった。細胞を10〜12 日間培養を行った。各ウェル内の神経球体数を計測し、得られた計測数をクリケットグラフIIIを用いて表にした。他の、球体のサイズおよび形状に関する情報についても記述した。一般に、bFGFの１ウェル当たりの産生神経球体数における増殖効果は、EGFよりも大きかった。20 ng/mlのEGF存在下において、１ウェルあたり約29神経球体が産生された。bFGFの存在下において、約70神経球体が産生された。しかし、bF GFのみでは（図１Ｂ）神経球体のサイズは、EGFの存在下において産生されるものの約20％であった（図１Ａ）。EGFおよびbFGFの組み合わせ（図１Ｃ）は、EGF 単独の場合よりも、明らかにより多くの神経球体を産生したが、bFGF単独の場合よりも少なかった。また、神経球体のサイズはbFGFにおいて観察されるよりも大きく、EGFにおける場合とほぼ同様の大きさであった。bFGF産生球体の場合には、ヘパラン硫酸の添加により、EGFに応答して生ずるサイズの約70％に、そのサイズが増大した。これらのデータはEGFおよびFGFが幹細胞の有糸***の誘導に関して異なる作用を有することを示している。増殖因子含有ウェルに添加した調節因子の効果を表１に要約した。一般に、TG F-β族、インターロイキン、マクロファージ阻害タンパク、PDGF、TNFα、レチノイン酸(10^-6M)およびCNTFは、全ての試験を行った増殖因子およびその組み合わせにおいて神経球対数を顕著に減少させた。BMP-2(10 ng/mlの投与量）は、完全にEGFに応答した神経球体の増殖を無効にした。EGFおよびヘパラン硫酸は両方とも、bFGFに応答して形成される神経球体のサイズを増大した（約400%）。パラダイム２：アンチセンス／センス実験：胚組織を実施例１に記載されたように調製し、96ウェルプレート内の完全培地中にプレートした。アンチセンスおよびセンス実験を、次のオリゴデオキシヌクレオチドを使用して行った（全ての配列は５’から３’へと記載されている。）： EGF 受容体：センス鎖： GAGATGCGACCCTCAGGGAC アンチセンス鎖： GTCCCTGAGGGTCGCATCTC EGF ：センス鎖： TAAATAAAAGATGCCCTGG アンチセンス鎖： CCAGGGCATCTTTTATTTA 各オリゴデオキシヌクレオチドを生育し、ddH₂Oで希釈を行って、-20 ℃に維持した。96ウェル内の各ウェルに10μlのオリゴデオキシヌクレオチドを加え、最終濃度がそれぞれ、１、２、３、４、５、10、または25μMとなるように調製した。オリゴデオキシヌクレオチドを24時間毎に加えた。EGF受容体(EGFr)およびEGFオリゴデオキシヌクレオチドをbFGF(20 ng/ml)内で生育した培養に適用し、EGFrオリゴデオキシヌクレオチドをEGF(20 ng/ml)内で生育した培養に適用した。細胞をインキュベーター内で、37℃、湿度100％、５％CO₂という条件下で培養した。10〜12日後に、１ウェルあたりの神経球対数を計測し、表にした。３μ Mの濃度のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、EGFおよびFGFに応答して、１ウェルあたりの産生される神経球体数の50％減少を生じたが、センスオリゴデオキシヌクレオチドは産生される神経球体数に影響を与えなかった。センスおよびアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、10μMより高い濃度を使用すると細胞に対して毒性であった。同様の実験を以下のオリゴヌクレオチドを使用して行った。 FGF 受容体：センス鎖： GAACTGGGATGTGGGGCTGG アンチセンス鎖： CCAGCCCCACATCCCAGTTC FGF ：センス鎖： GCCAGCGGCATCACCTCG アンチセンス鎖： CGAGGTGATGCCGCTGGC FGF受容体(FGFr)およびFGFオリゴデオキシヌクレオチドを、EGF中で生育した培地に加え、FGFrオリゴデオキシヌクレオチドを、bFGF中で生育した培地に加えた。パラダイム３ :胚組織を実施例１に記載された方法に従い調製した。20 ng/mlの EGFまたはbFGFを含む完全培地を各ウェルに加えた。10μlの希釈したホルボール 12-ミリステート13-アセテート(PMA)を、実験の始めに96ウェルプレート内の各ウェルに500 μlチップのエッペンドルフリピートピペッターを用いて一度に加え、最終濃度がそれぞれ、10、20、40、100、または200 μg/mlとなるように調製した。細胞をインキュベーター内で、37℃、湿度100 ％、５％CO₂という条件下で培養した。10〜12日後に、１ウェルあたりの神経球対数を計測し、表にした。パラダイム４ :胚組織を実施例１に記載された方法に従い調製した。10μlの希釈したスタウロスポリンを、96ウェルプレート内の各ウェルに500 μlチップのエッペンドルフリピートピペッターを用いて加え、最終濃度がそれぞれ、10、１、0.1または0.001 μMとなるように調製した。細胞をインキュベーター内で、37 ℃、湿度100％、５％CO₂という条件下で培養した。10〜12日後に、１ウェルあたりの神経球対数を計測し、表にした。実施例４成体脊髄幹細胞増殖−特定の生物学的因子またはその組み合わせに対するインビトロ応答６週間〜６カ月のマウスから脊髄組織を以下のように除去した。頸部組織を椎柱領域頭側〜第一肋骨から除去し；胸髄組織を尾側〜第一肋骨および約５mm頭側〜第一肋骨から得て；脊髄の残部を構成する腰仙部組織を得た。切断した組織を通常の人工脳脊髄液（aCSF）中で洗浄し、小断片にカットして、高Mg²⁺および低Ca²⁺並びにトリプシン／ヒアルロンヂアーゼおよびキヌレン酸酵素を含む酸素添加されたaCSFを含む攪拌フラスコ内にプレートした。組織を酸化、攪拌および30℃で1 1/2時間加熱し、次にバイアルビンに移して、培養液（DME M/12/ホルモン混合物）内でトリプシン阻害剤により処理を行った。組織を、口焼きした細いピペットで、25〜50倍に倍散した。分離した細胞を400r.p.m．で遠心分離を5分行い、新鮮な培養液に再懸濁した。細胞を35mm皿（コースター）上にプレートし、安定させた。ほとんどの培養液を吸引し、新鮮な培養液を添加した。EGF単独またはEGFおよびbFGFを、幾つかの皿に最終濃度が20 ng/mlとなるように加え、bFGF（20 ng/ml）を、２μg/mlのヘパラン硫酸と共に残りの皿に添加した。細胞を、37℃、湿度100％、５％CO₂という条件下で10〜14日間培養した。１ウェル当たりの産生された神経球体数を測定し、結果を表にした。EGF単独使用は、どの脊髄領域からも神経球体の発生がみられなかった。EGFとbFGFの存在下において、神経球体は脊髄の全ての領域、特に腰部仙椎領域から発生した。EG F＋FGFおよびFGF＋ヘパラン硫酸の組み合わせは頸部において同数の球体を産生したが、bFGFとヘパラン硫酸の組み合わせは、胸部および腰部領域からより少ない神経球体を産生した（図３）。実施例５インビトロにおける増殖因子に応答した霊長類組織からの神経球体の発生第一継代神経球体を成体ヒト組織から得た。ルーチンの生検において、６５歳の女性の患者から正常組織を得た。生検部位は右前頭葉であり、側脳室の前角／後角のチップから6mmであった。組織を実施例４に記載の方法と実質的に同じ方法によりaCSFを用いて調製した。幹細胞をT25フラスコ（ヌンクロン）内の、20n g/mlのEGF、20ng/mlのbFGF、または各20ng/mlのEGF＋bFGFを含む完全培地中で培養した。フラスコを2〜3日毎に神経球体の形成が行われているか評価した。EGF またはFGF単独それぞれよりも、EGF＋EGFの組み合わせの方がより多くの神経球体を産生した。実施例６傷害CNSにおける幹細胞および幹細胞プロゲニー増殖の阻害Ａ：脊髄傷害成体雄ＣＤ１マウス（チャールズリバー、St．コンスタント、ケベック）を、ペントバルビタールナトリウム塩（80 mg/kg、i.p.）により麻酔を行った。椎弓切除を、頸部、胸部または腰部レベルで行い、および背部珠柄(dorsalfuniculus )を顕微手術用のハサミを用いて切断する。同じ日に傷害を行い、幹細胞の増殖を阻害する調節因子を含む組成物を、30ゲージのカニューレがついた100 μlの容量の浸透圧ミニポンプ(ALZA、分配速度：0.5 μl/h/7 日；モデル1007D)を用いて第４の脳室内に注入した。定位固定を用いてカニューレを、人字縫合および十字縫合の間の頭蓋骨位置を伴う第４脳室内のＡＰ-6.0 mm後方からブレグマ、L-0.3 mmおよびDV-4.3 mm下方硬膜へ移植した。カニューレを歯科用アクリルセメントにより固定した。傷害刺激に応答して幹細胞増殖を阻害する調節因子を含む組成物を、流速0.5 μl/hで１〜２８日間注入した。組成物は0.9 ％生理食塩水、１mg/mlのマウス血清アルブミン（シグマ）およびBMP-2を10 ng/ mlの濃度で含む。他の使用できる調節因子としてはCNTF、レチノイン酸、TGF-β およびMIP族のメンバー、およびEGFおよびFGFに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのようなインビトロにおける神経幹細胞増殖における阻害活性を有することが見いだされたものが挙げられる。傷害を受けた部位の細胞の応答を実施例 7に述べた方法に従い測定した。Ｂ：脳傷害成体ヒト雄ＣＤ１マウス（チャールズリバ−St．コンスタント、ケベック）を、ペントバルビタールナトリウム塩（80 mg/kg、i.p.）により麻酔を行った。頭蓋骨の小部位を除去して、大脳皮質領域に接触させた。Cavanagah，J.B．J. Anatomy 106: 471-487(1970)に従い、切除傷害を皮質内で生じさせた。同日に、傷害を起こし、幹細胞増殖を阻害する因子を30ゲージのカニューレを有する100 μlの容量の浸透圧ミニポンプ(ALZA、分配速度：0.5 μl/h/7 日；モデル1007D) を用いて同側室内に注入した。定位固定を用いてカニューレを移植した。カニューレを歯科用アクリルセメントにより固定した。傷害刺激に応答する幹細胞増殖を阻害する調節因子を、流速0.5 μl/hで１〜２８日間注入した。ビヒクル溶液は1 mg/mlのマウス血清アルブミン（シグマ）を含む0.9 ％生理食塩水である。阻害因子としてはCNTF、レチノイン酸、TGF-βおよびMIP族のメンバー、およびE GFおよびFGFに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのようなインビトロにおける神経幹細胞増殖における阻害活性を有することが見いだされたものが挙げられる。傷害を受けた部位の細胞の応答を実施例7に述べた方法に従い測定した。実施例７ CNSの傷害部位における増殖細胞の検出実施例６の注入期間の後に続き、マウスにブロモデオキシウリジン（BrdU; シグマ、120mg/kg、i.p.）を２時間毎に、計５回注射を行って傷害を受けた部位のラベルを行った。動物を最終注入から30分後、２日後、４日後、１週間後、６週間後または６カ月後に、それぞれ、過剰の麻酔を行うことにより犠牲にし、４％のパラホルムアルデヒドと共に灌流する。傷害部位を含む、近接した領域および傷害部位に近接した脳室部位を除去し、灌流液中で、４℃において一晩ポストフィックス(postfix)を行い、凍結保護を行う。30μm矢状の低温槽部分をカットして、直接ゲル化したスライド上に張りつける。BrdU検出のために、その部位を1M のHClで、65℃30分間処理を行って細胞性DNAを変性させた後に、組織を免疫細胞化学的に処置を行う。ラットアンチ-BrdU（セララブ）をロバアンチ-ラット-FIT Cと共に免疫細胞化学的処置に使用する。GFAP（アストロサイトにより表現される）に対する血清を使用し、次にロバアンチ-ラット-FITCを使用してGFAP発現およびグリア瘢痕生産物を視覚化する。ネスチン発現における効果を、ネスチンに対する抗血清および続いてロバアンチ-ラット-FITCによりラベル化を行うことにより定量化し、脳室および傷害部位に近いネスチン免疫応答性細胞の数を計測する。免疫染色の特異性は、一次抗体が存在しないことにより確認する。処置動物の得られた結果を、ビヒクルのみを脳室内治療として投与されたコントロールと比較する。全てここに挙げた文献をここに参考文献として引用する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Regulation of Neural Stem Cell Proliferation Background of the Invention Within active dividing cells, such as the bone marrow that gives blood cells, special cells known as stem cells are present. A decisive property of identifying stem cells is their ability to perform self-renewal or self-renewal. The simplest definition of a stem cell is a cell that has self-preservation ability. A more rigorous (but simpler) definition of stem cells by Potten and Loeffler [Development, 110: 1 001 (1990)] et al. Is: a) proliferation, b) self-preservation, c) more differentiated functional progenies (progeny). Undifferentiated cells, which produce progeny), d) regeneration of damaged tissue, and e) the flexibility in using these options. Stem cells differentiate and produce progenies known as progenitor cells. Progenitor cells include new stem cells and progenitor cells (progenitor cells). New stem cells are capable of dividing again and produce stem cells (ensure self-preservation) and progenitor cells. Progenitor cells can undergo suppressed proliferation, and all of their progenies eventually undergo irreversible differentiation into amitotic functional cells. FIG. 1 shows the relationship between stem cells, progenitor cells and differentiated cells. The role of stem cells is to replace cells that are lost due to natural death, injury or disease of the cells. The presence of stem cells in a particular tissue is usually associated with a tissue having high turnover cells. However, this association is not always maintained because stem cells are thought to be present in tissues such as the liver that do not have high turnover cells [Travis, Science, 259: 1829 (1989)]. The stem cell line best studied for its properties is the hematopoietic stem cell. A single hematopoietic stem cell located in the bone marrow gives all blood cell lineages through a series of progenitor cells. U.S. Pat. No. 5,061,620 (October 29, 1991) describes methods for isolating, regenerating and using hematopoietic stem cells. Before birth, hematopoietic stem cells are active in many sites (fetal yolk sac, bone marrow, liver and spleen). Immediately before birth, the bone marrow acts as the primary site of hematopoiesis. Hematopoietic stem cells in the liver and spleen are quiescent and blood cell production is not resumed unless hematopoietic stem cell activity in the bone marrow is suppressed or extensive blood cell destruction occurs. Differentiated cells of the adult mammalian CNS have little or no ability to enter the mitotic cycle and generate new neural tissue-all neurogenesis occurs essentially during the pre- and post-natal period. There is limited and slow turnover of astrocytes ([Korr et al. , J. et al. Comp. Neurol. , 150: 169 (1971)], and there are progenitor cells capable of giving oligodendrocytes ([Wolsquijk and Noble, Development, 105: 386-698 (1989)]. Development does not usually occur, but rats show a limited ability to generate new neurons in restricted adult brain regions such as the dentate gyrus and olfactory bulb [Kaplan, J. et al. Comp. Neurol. 195: 323 (1987); Bayer, S .; A, NY. Ac ad. Sci. , 457; 163-172 (1985)], but this is not applicable to all mammals; and there is no development of new neurons in adult primates ([Rakic, P. et al. , Science, 227: 1054 (1985)]. Such a lack of development of new neuronal cells in most mammals (especially primates) may be beneficial for long-term memory retention; however, replacement of neuronal cells lost due to injury or disease is required. In that case there is a distinct disadvantage. Low cell turnover in the mammalian CNS with a lack of ability to develop new cells in response to cell loss due to damage or disease in the adult mammalian CNS has led to the assumption that the adult mammalian CNS does not contain stem cells. However, cells that exhibit stem cell properties in vitro have recently been isolated from the CNS. Embryo [Reynolds et al. , J. Neuro sci ,. 12: 4565 (1992)], but in adult [Reynolds and Weiss, Science, 255; 1707 (1992)], these cells do not produce new cells in response to injury or disease, but adult CNS It has been shown to have the ability to repair self and produce new cells by differentiation and proliferation of stem cells and their progenies as well as lines. Recent findings from in vivo experiments indicate that relatively quiescent stem cell cells reside under the epidermis subepidermally in the adult ventricle (Moreshead et al. , Neuron vol. 13 (5): 1071-1082 (1994)). Under appropriate stimulation, these stem cells can be a source of replacement cells in case of nerve damage or disease. Hematopoietic stem cell survival, expansion and proliferation and liver, intestinal and dermal stem cell lines have been shown to be under control of a number of different trophic factors. For example, in the hematopoietic system, growth factors such as erythropoietin and glycoprotein CSF (colony stimulating factor) and various interleukins have been isolated as factors that regulate stem cell function [Metcalf, D. et al. Bioassays, 14 (12): 799-805 (1992)]. Studies on the effects of trophic factors on neurons during embryonic development include platelet-derived growth factor (PDGF), ciliary trophic factor (CNTF), basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF), and transformation Endogenous substances such as growth factor α (TGFα) and nerve growth factor (NGF) have been suggested to contribute to the development of the prenatal nervous system. For example, the type of embryonic neural progenitor cell known as 0-2A cells gives oligodendrocytes and gives type 2 astrocytes. In the presence of PDGF, 0-2A cells divide and after some division differentiate into oligodendrocytes. The addition of CNTF and substrate factors promotes the differentiation of 0-2A progenitor cells into type I astrocytes more than the addition of PDGF [Raff et al. , Nature (Lond), 303: 390-396 (1983)]. bFGF causes a two-fold increase in the proliferation of embryonic progenitor cells that develop into neurons [Gensberger et al. FEBLett. 217: 1-5 (1987)]. Cattaneo and McKay (1990) showed that simultaneous or sequential addition of growth factors revealed a novel response that was not evident when the factors were added individually. They have shown that NGF stimulates the growth of embryonic neuroblasts to produce neurons only when bFGF is added in advance [Cattaneo, E. et al. and McKay, R. , Nature, 347: 762-765 (1990)]. bFGF has also been shown to affect PDGF receptor expression and block the differentiation of 0-2A progenitor cells when contacted with PDGF (McKinnon et al. , Neuron, 5: 603-614 (1990)]. EGF or TGFα exerts a mitogenic effect on embryonic retinal neuroepithelial cells growing in culture, resulting in progenitor cells that give neurons but not glial cells in the continued presence of growth factors [Anchan et al. . , Neuron, 6: 923-936 (1991)]. In the same study, neurons and Muller cells are reported to arise in culture from postnatal rat neuroepithelium. CNS disorders include numerous diseases such as neurodegenerative disorders (eg, Alzheimer's and Parkinson's disease), acute brain disorders (eg, stroke, head disorders, cerebral palsy) and numerous diseases associated with CNS dysfunction (eg, depression, Epilepsy, and schizophrenia). In recent years, neurodegenerative disorders have become a significant problem due to the growing elderly population at risk for these disorders. These disorders, including Alzheimer's disease, complex sclerosis, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, and Parkinson's disease, are associated with the breakdown of nerve cells at specific sites in the CNS, and these cells or brain sites Makes it impossible to perform certain functions. In addition to neurodegenerative disorders, acute brain injury often results in neuronal loss, improper functioning of the affected brain site, and subsequent behavioral abnormalities. The most common type of CNS dysfunction (related to the number of patients) is not characterized by neuronal loss, but rather by abnormal functioning of existing neurons. This may be due to improper firing of neurons, or abnormal synthesis, release and transition processes of neurotransmitters. Some of these dysfunctions are well studied, and disorders such as depression and epilepsy are being studied in detail, while others such as neurosis and psychosis are poorly understood. To date, the primary treatment of CNS disorders has been the administration of drugs. Unfortunately, this type of treatment involves a number of complex situations, including the limited ability of drugs to cross the blood-brain barrier and the drug resistance that patients who have received such drugs for long periods of time. . For example, partial recovery of dopamine-like activity in patients with Parkinson's disease is achieved by levodopa, a levodopa that is a dopamine precursor that can cross the blood-brain barrier. However, patients become tolerant of the effects of levodopa, and continually increasing doses are required to maintain that effect. In addition, a number of side effects associated with levodopa appear, such as increased and uncontrolled movements. Emergency treatment techniques for neurological disorders include transplanting cells into the CNS to replace or compensate for loss or dysfunction of host neurons. Embryonic CNS cells have shown good results in human studies [Winder et al. , NewEng. J. Med. , 327: 1556 (1992)], although preferred donor tissues, the use of these cells is limited both ethically and politically and in view of the availability of sufficient amounts of tissue. Other types of donor tissue for use in treating CNS disorders are being studied. Examples of these include genetically engineered neurons [Renfranz et al. , Cell, 66: 173 (1991); Synder et al; l Cell 68: 1, (1992)], fibroblast (Kawaja et al. , J. et al. Neurosci. , 12: 2849, (1992)), muscle cells [Jiao et al. , Nature, 363: 456 (1993)], glial progenitor cells [Groves et al, Nature, 362; 453 (1993)], encapsulated cells [Hoffman et al. , Exp. Neurol. , 132: 100 (1993)]. Although transplantation methods have provided significant improvements in the current treatment of neurological disorders, this technique is not yet complete. For example, in transplantation, some cell types do not integrate with host CNS tissue. In particular, the use of non-neural primary cell cultures limits the ability of the implanted material to bind to host tissue. Immortalized donor cells from primary nervous tissue can bind, but the genetic expression of cancer cells taken up by these cells is difficult to control and may reduce cancer and other complications. cause. Rejection of donor and host transplant cells may also be the result. It is also possible that the transplanted cells form cancer or that infectious agents pass from the donor tissue to the host. Gage et al. In U.S. Pat. No. 5,082,620 report a method of treating a deficiency, disease or CNS cell disorder by transplanting genetically modified neurons into the appropriate CNS site. Although the donor cells described in the above patents were obtained from non-neural primary cultures, it was suggested that genetically transformed neural cell lines could also be used. These donor cell sources are inherently problematic. Gage et al. Recognize the limitations imposed by the donor cells used in their technology, and recognize that "replication of a small number of non-transformed cell culture systems". They also recognize that "non-replicating neurons are refractory to viral infections." This latter statement summarizes the difficulties involved in attempting to apply the methods of the prior art to genetically modified neurons, which are not normal mitogens unless obtained from embryonic tissue. is there. The essence of this technique is the possibility of tissue rejection. Ideally, the genetically modified transplant cells should be autologous, thereby preventing immunological complex effects-i. e. If in vitro, the patient's own quiescent neural stem cells can be genetically engineered and / or stimulated to divide to differentiate into new neural cells and replace deleted or damaged neural tissue It would be advantageous if it could be implanted as such. Pluripotent neural stem cells, known to be present in the brain of mammals during their life [Reyno lds and Weiss, Science, 255: 1707 (1992)], can be used in the presence of growth factors such as epidermal growth factor. Provide a source of non-transformed neurons that can be stimulated to become mitotically active. In culture, neural stem cells can be induced to proliferate and give large amounts of undifferentiated neurons, and these undifferentiated neurons can be differentiated into the main type of neurons and transplanted, It can be used for drug screening or other purposes. It is advantageous to be able to regulate the proliferation of neural stem cells in vitro to increase, decrease or otherwise alter the mitotic activity of the neural stem cells and / or their progenies. Increased mitotic activity of quiescent neural stem cells is clearly advantageous because of the greater number of progenies available for transplantation, genetic improvement, drug screening, and the like. It is also advantageous to determine how proliferating neural stem cells that grow in the presence of growth-inducing growth factors can modulate a decrease in proliferation in vitro. This information can be used in vivo to modulate growth-inducing growth factors as described in US Pat. No. 08 / 149,508 (November 9, 1993). It would also be advantageous to be able to regulate not only the number of neural stem cells that become mitotically active, but also the rate of mitosis of these stem cell progenitors in the presence of growth factors or combinations of growth factors. . Gliosis occurs in response to damage to brain or spinal cord tissue. Glial scars resulting from this process prevent neural axons from re-establishing connections to the affected area and prevent disruption of function. Astrocytes, which proliferate both at the site of injury and at a distance from sites very close to the site of injury, are an important cellular component of glial scarring (Reier, P. et al. J. Astrocytes vol. 3: 263-323 (1986)). Proliferation in response to neural stem cell and its progeny damage may be a factor in the development of gliosis. The ability to reduce the extent of gliosis at the damaged site can enhance nerve repair. It is an advantage that gliosis can be reduced by inhibiting or reducing mitotic activity that induces an increase in the number of astrocytes at sites adjacent to the site of injury. Reducing the ability of neural stem cells and / or their progenies to proliferate in response to impaired-inducing signals may be a way to limit the extent of glial scar formation. The ability of split axons to rejoin the increased site of injury improves the quality of the neural repair process and repair function. Humans do not rely on the method of deliberately immortalizing by inserting a tumorigenic gene to induce unrestricted growth in view of the lack of a source of CNS cells for transplantation or other uses as described above. There is a need for reliable methods for culturing large numbers of embryonic and adult neurons obtained from non-humans, thereby eliminating any problem with the effect of genetic alterations on the normal functioning of the cells. There is also a need to be able to regulate cell growth in vitro and in vivo under certain conditions. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method of regulating the growth of CNS stem cells in vitro by modifying the medium in which the stem cells grow, through the addition of specific biological factors, such as growth factors or combinations of growth factors. It is to provide. It is another object of the present invention to provide a method of modulating CNS stem cell proliferation in vivo and a therapeutic composition therefor. The composition contains certain biological factors, such as growth factors and combinations thereof, which are injected into the ventricular system of the CNS to regulate stem cell proliferation. These and other objects of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the following detailed description and the appended claims. None of the above references describe the present invention and is not prior art. These references are provided for background information purposes. SUMMARY OF THE INVENTION Methods for regulating the in vitro proliferation of pluripotent neural stem cells and / or their progenies are described below. The method comprises the step of disrupting mammalian neural tissue comprising at least one pluripotent neural stem cell capable of producing a progeny capable of differentiating into neurons, astrocytes and oligodendrocytes, and a growth factor for inducing at least one stem cell proliferation And expanding the pluripotent stem cells in a medium containing regulators that regulate the growth of the pluripotent neural stem cells and / or their progenies. In addition, methods and compositions for regulating the in vivo proliferation of pluripotent neural stem cells and / or their progenies are described below. The method allows a therapeutic composition comprising at least one factor having a regulatory effect on the proliferation of pluripotent neural stem cells and / or its progeny to reach the ventricle of the mammal. In one embodiment of the invention, the growth factor is bFGF, and the modulator is EGF or heparan sulfate, which increase the growth rate of stem cell progeny. In another aspect of the invention, the factor or combination thereof that inhibits neural stem cell proliferation is administered to reduce cell proliferation in vivo. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1: Schematic showing proliferation of pluripotent neural stem cells. (A) In the presence of growth factors, stem cells divide, giving a sphere of undifferentiated cells consisting of more stem cells and progenitor cells. (B) Each stem cell produces a new sphere when the sphere of clonally-derived undifferentiated cells is disrupted and placed as a single cell on non-adherent material and placed in the presence of growth factors. (C) If the spheres are cultured under conditions that permit differentiation, the progenitor cells differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Figure 2: (A) Photograph of a neurosphere (neuroshpere) 10 days after culturing in 20 ng / ml EGF (magnification: 100x). (B) A photograph of the neurosphere 10 days after culturing in 20 ng / ml FGF (magnification: 100 times). (C) A photograph (magnification: 100 times) of a neurosphere 10 days after culturing in 20 ng / ml EGF + 20 ng / ml FGF. Figure 3: Number of neurospheres derived from primary cells derived from the cervical, thoracic and lumbar regions of the adult mouse spinal cord in the presence of 20 ng / ml EGF + 20 ng / ml FGF or 20 ng / ml FGF + 2 μg / ml heparan sulfate Is shown. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention is based on the study of methods and compositions for regulating and manipulating pluripotent neural stem cell proliferation and relates to regulating the number of progenies derived from pluripotent neural stem cells in vitro and in vivo. I have. The term “neural stem cells” or “central nervous system (CNS) stem cells” refers to relatively quiescent, undifferentiated stem cells derived from neural tissue, which can proliferate and increase the number of neural stem cells (and thus Storage) and those that can be the source of progenitor cells. The term "pluripotency" refers to neural stem cells that are capable of producing progenies that underlie major types of differentiated neurons such as neurons, astrocytes and oligodendrocytes. In comparison, undifferentiated cells that underlie two types of differentiated cells (eg, O-2A cells that underlie oligodendrocytes and astrocytes) are termed "bipotent" and Those that give rise to only different types of differentiated cells are called "unipotent". The term "progenitor cells" also refers to undifferentiated cells derived from neural stem cells, but is distinguished from stem cells that have limited proliferative potential and do not undergo self-preservation. The progeny of each neural progenitor cell differentiates into neurons, astrocytes (type I or type II) or oligodendrocytes under suitable conditions. Oligodendrocytes are differentiated glial cells derived from myelin that border axons in the central nervous system (CNS). Oligodendrocytes have a galactocerebroside (+) phenotype, a myelin basic protein (+) phenotype, and a glial fibrillary acidic protein (+) phenotype [GalC (+), MBP (+), GFAP (-)]. Have. Neurons have a neuron-specific enolase (+) phenotype, a neurofilament (+) phenotype, a protein with microtubules or a Tau-1 (+) phenotype (NSE (+), NF (+), MAP-2 (+ ) Or Tau-1 (-)]. Astrocytes are differentiated glial cells with a GFAP (+), GalC (-), and MBP (-) phenotype. CNS stem cells have already been reported and their use described [Reynol des and Weiss, Science, 255: 1707 (1992); Reynolds et al. , J. Neurosci. Reynolds and Weiss, Restorative Neurology and Neuroscience, 4: 208 (1992); Reynolds and Weiss, “Neuronal Cell Death and Repair” ed. Cuello, A. C. , Elsevier Science, pp. 247-255 (1993)]. Further, the utility of these cells is described in PCT Application Publication Nos. WO 93/01275, WO 94/16718, WO 94/10292 and WO 94/09119. Like stem cells found in other mammalian tissues, CNS stem cells are capable of self-preservation and large numbers of progenies, including progenitor cells that can differentiate into new stem cells and neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Can be produced. CNS stem cells can be isolated and cultured by the method described by Reynolds and Weiss [Science, 255: 1707, (1992)], the PCT application patent mentioned above and the method described in Example 1 below. . Pluripotent CNS stem cells can develop in various CNS regions, including the conusmedul laris of the spinal cord, cervix, thoracic and lumbar, brain stem, striatum and hypothalamus. Neural stem cells can be obtained from tissues from each of these areas and can be induced to divide in vitro, perform self-preservation, and produce large quantities of progenies, including neurons, astrocytes and oligodendrocytes. In summary, pluripotent neural stem cells can be obtained from neural tissue and are preferably in a medium that is free of serum and may contain a combination of substances known to support cell survival. Grow. A suitable serum-free medium is hereinafter referred to as a "complete medium", and includes Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM) and F-12 nutrient mixture (Gibco) (1: 1), glucose (0. 6%), glutamine (2 mM), sodium bicarbonate (3 mM), HEPES (4- [2-hydroxyethyl] -1-piperazineethanesulfonic acid) buffer (5 mM) and insulin (25 μg / ml), transferrin (100 μg / ml), progesterone (20 μM), putrescine (60 μM), and selenium chloride (30 nM), as well as certain hormone and salt mixtures (10%; Sigma) used in place of serum. Is also good. At least one biological factor that induces the proliferation of pluripotent stem cells is added to the complete medium. The term “biological factor” is used herein to refer to a protein, peptide, nucleic acid, growth factor, steroid or growth, proliferation, differentiation, trophic or regulatory effect on stem cells or stem cell progenies (single or other biological factors). (Also in combination with) a biologically active substance that functions in CNS cells, such as other natural or artificial molecules having Examples of biological factors include acidic and basic fibroblast growth factors (aFGF, bFGF), epidermal growth factor (EGF) and EGF-like ligand, transforming growth factor alpha (TGFα), insulin-like growth factor ( IGF-1), nerve growth factor (NGF), platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor beta (TGFβ); brain-derived neurotrophic factor (BDNF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), and Nutritional factors such as glial-derived neurotrophic factor (GDNF); phorbol 12-myristate 13-acetate, staurosporine, CGP-41251, intracellular pathways with growth factor activity such as tyrphostin (tyr phostin) Modulators; hormones such as activin and thyroid stimulating hormone (TRH); interleukins, Bcl-2 gene products, bone morphogenetic proteins (BMP-2), macrophage inflammatory proteins (MIP-1α, MIP-1β, MIP -2) Various examples Proteins and polypeptides; oligonucleotides such as the opposite strand to transcription, e.g., EGF receptor, FGF receptor; heparin-like molecules such as heparan sulfate; and amphiregulin, retinoic acid and tumor necrosis factor alpha (TNFα) A variety of other molecules that have an effect on neural stem cells or stem cell progenies, including: Biological factors such as EGF and bFGF that individually have a proliferative effect on pluripotent neural stem cells are referred to herein as “growth factors”. Generally, growth factors bind to cell surface receptors and induce proliferation. Preferred growth factors include EGF, amphiregulin, aFGF, bFGF, TGFα and combinations thereof and other biological factors such as heparan sulfate. Particularly preferred combinations for inducing the proliferation of neural stem cells include a combination of EGF and bFGF. Growth factors are usually added to the medium at a concentration in the range of about 10 pg / ml to 500 ng / ml, preferably about 1 ng / ml to 100 ng / ml. The most preferred concentrations of EGF, aFGF and bFGF are each about 20 ng / ml. Stem cells may be cultured in any culture vessel, such as a 96-well plate or culture flask. In the presence of a growth-inducing growth factor or combination of factors, pluripotent neural stem cells divide and give rise to undifferentiated stem cell progenies within 3-4 days. Stem cell progeny, referred to herein as "progenitor cells", includes newly produced pluripotent stem cells and progenitor cells. In vitro, the progeny of a single stem cell typically forms an aggregate of progenitor cells, referred to herein as a "neurosphere", but alters the culture conditions (eg, the processing substrate to which proliferating cells adhere). May be altered so that the proliferating cells do not form distinctive neurospheres. Progenitor cells are not immunoreactive with any neuronal or glial markers, but are immunoreactive with nestin, an intermediate filament protein found in undifferentiated CNS cells (Lehndahl et al. , Cell, 60: 585-595 (1990)]. In the continuous presence of growth-inducing growth factors, progenitor cells in the neurosphere continuously divide and the size of the neurosphere increases as a result of an increase in the number of undifferentiated cells [nestin (+), NF (-), NSE (-), GFAP (-), MBP (-)]. Progenitor cells can be passaged in the presence of the same growth factor or a different growth factor that allows for further expansion without promoting differentiation. Cells can be passaged 30 or more times using a growth culture method to exponentially increase the number of progenitor cells. Culture techniques for the expansion of CNS stem cells in vitro as described above may be used to increase, decrease or otherwise alter the number and properties of progenitor cells obtained from stem cells in response to EGF or other growth factors. It can be improved by the use of biological factors or combinations thereof. Changes in proliferation are observed by increasing or decreasing the number of neurospheres formed and / or increasing or decreasing the size of neurospheres (these are reflections of the growth rate determined by the number of progenitor cells per neurosphere) ). Thus, the term "modulator" as used herein means a biological agent that has a regulatory effect on the growth of stem cells and / or progenitor cells. For example, a biological factor is considered to be a "modulator" if it increases or decreases the number of stem cells growing in vitro in response to a growth-inducing growth factor (such as, for example, EGF). Alternatively, the number of stem cells may remain the same in response to a growth inducing factor, but the addition of a modulator affects the rate at which stem cells and / or stem cell progenies grow. Growth factors may also act as modulators when used in combination with other growth factors. For example, neurospheres formed in the presence of a combination of bFGF and EGF are clearly larger than neurospheres formed in the presence of bFGF alone, indicating that stem cells and stem cell progeny have a faster growth rate. Other examples of modulators include heparan sulfate, transforming growth factor beta (TGFβ), activin, bone morphogenetic protein (BMP-2), ciliary neurotrophic factor (CNTF), retinoic acid, tumor necrosis factor alpha ( TNFα), macrophage inflammatory proteins (MIP-1α, MIP-1β and MIP-G), nerve growth factor (NGF), platelet-derived growth factor (PDGF), interleukin and Bcl-2 gene products. Antisense molecules that bind to growth factor transcripts and transcripts to their receptors also regulate stem cell proliferation. Other factors that have a regulatory effect on stem cell proliferation include c-fos pathways, including phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma), which up-regulate the c-fos pathway (known to be activated by EGF). Staurosporine (Research Biochemical International) and CGP-41251 (Ciba-Geigy), which down-regulate c-fos expression, and tyrosine by binding of EGF to the receptor Tyrphostin inhibits kinase activation [Fallon, D et al. , Mol. Cell Biol. , 11 (5): 2697-2703 (1991)]. Heparan sulfate and EGF are preferred as modulators for increasing the rate at which neural stem cell progenies grow in response to FGF. Regulators that reduce the number of stem cells in response to growth factors include the TGFβ family, interleukins, MIP, PDGF, BMP-2, TNFα, retinoic acid (10 ^-6 M) and CNTF are preferred. Factors that reduce the size of neurospheres produced by growth factors include the TGFβ family, retinoic acid (10 ^-6 M) and CNTF are preferred. The modulator is added to the medium at a concentration in the range of about 10 pg / ml to 500 ng / ml, preferably about 1 ng / ml to 100 ng / ml. The most preferred modulator concentration is about 10 ng / ml. The modulator retinoic acid is prepared from a 1 mM stock solution and used at a final concentration of between about 0.01 μM and 100 μM, preferably between about 0.05 and 5 μM. To reduce the proliferative effects of EGF or bFGF on neurosphere development, a retinoic acid concentration of about 1 μM is preferred. The antisense strand can be used at a concentration of about 1-25 μM. A preferred range is from about 2 to about 7 μM. PMA and related molecules used to increase proliferation may be used at a concentration of about 1 μg / ml to 500 μg / ml, preferably 10 μg / ml to 200 μg / ml. The glycosaminoglycan, heparan sulfate, is a ubiquitous component on mammalian cell surfaces known to affect a variety of cellular processes and binds to growth factor molecules such as FGF and amphiregulin, thereby Promotes the binding of these molecules to the receptor for It is added to the medium in combination with other biological factors at a concentration of about 1 ng / ml to 1 μg / ml, preferably about 0.2 μg / ml to 20 μg / ml, most preferably about 2 μg / ml. It is possible to As described in PCT application patents WO 93/01275, WO 94/16718, WO 94/10292 and WO 94/09119, progenitor cells may be used for transplantation to treat various neurological diseases. it can. Cells used for transplantation are harvested from the culture medium using methods known to those of skill in the art and used for abnormal neurological or neurodegenerative conditions (chemical, electrical, mechanical or other injuries, experimental neurological disorders). The animal can be transplanted into an animal exhibiting any symptoms (including those resulting from aspiration of the area or disease or the aging process). The methods described herein include the use of biological factors in the growth of pluripotent mammalian neural stem cells in vitro before the use of the biological factors for modulation of normal quiescent stem cell growth in a patient in vivo. Can be used to test for growth or regulatory effects. Neural stem cells may be obtained from a human with a neurological disease to test the growth or regulatory effects of a biological factor on tissue with functional dysfunction, diseased or injured tissue. Therapeutic compositions containing modulators can be prepared for use in treating various neurological disorders, diseases or injuries. The composition comprises one or more modulators in a physiologically acceptable form at the concentrations described above. Therapeutic compositions may be administered in vivo to modulate neural stem cell proliferation. Normal quiescent neural stem cells are located in the CNS close to the ventricular region. The lateral (first and second) ventricles are in the forebrain. The third ventricle is the lower cavity of the forebrain that connects to the fourth ventricle located in the hindbrain. The central canal that is continuous with the ventricular structure is the ventricular component of the spinal cord. The fact that CNS stem cells are located in the tissue lined by the ventricles is the underlying modification and manipulation of these cells in vivo and the various neurological diseases, disorders and disorders affecting different areas of the CNS. It offers several advantages in treatment. These treatments can be improved by the methods described herein such that the stem cells surrounding the ventricle near the affected area are manipulated or modified in vivo. The ventricular system is found in almost all brain regions, thus allowing faster access to the affected area. If the stem cells are to be modified by contact with a composition comprising a growth factor or a viral vector, it is relatively simple to implant a device that administers the composition to the ventricle. For example, the composition may be distributed using a cannula connected to an osmotic pump. Alternatively, the composition may be injected directly into the ventricle. This allows for the transfer of the CNS stem cell progeny into the area damaged by the injury or disease. In addition, the ventricle is in close proximity to many brain regions, allowing for the distribution of neural drugs secreted from stem cells or their progenies. Gliosis resulting from the formation of glial scar tissue results from damage to the CNS tissue. Scar tissue is thought to have major inhibitory activity in axonal growth and reconnection of key components, thereby inhibiting functional recovery following brain or spinal injury. Although not the only component of CNS scar tissue, astrocytes are one of the major components involved (Reier, PJ. Astrocytes vol. 3: 263-323 (1986)). Gliosis (at least in part) can result from previous proliferation of quiescent stem cells. Following injury to the CNS, it is advantageous to administer factors known to inhibit neural stem cell proliferation to the ventricular system. Reducing the proliferation of stem cell progenies that give rise to astrocytes reduces the formation of scar tissue at the site of injury and enhances the conditions that allow axonal components to recombine. A preferred inhibitor is BMP-2. Example 1 In Vitro Proliferation of Pluripotent CNS Stem Cells Derived from Embryonic Brain Tissue-EGF-Responsive Neurosphere Expansion CD of Embryonic Day 14 (E14) ₁ Albino mice (Charles River) were decapitated and the brain and striata were removed using aseptic methods. Tissues were mechanically dissociated into complete medium using a baked Pasteur pipette. The cells were centrifuged at 800 rpm for 5 minutes, the supernatant was aspirated and resuspended in complete medium again for cell counting. Cells were suspended at a density of 25,000 cells / ml in complete medium containing 20 ng / ml EGF. Using an Eppendorf Repeat Pipettor with a 5 ml tip, add 200 μl of the cell suspension to each well in the pretreated substrate-free 96-well plate, 37 ° C., 100% humidity, 95% air / 5% CO _Two Was placed in an incubator under the following conditions. When cells proliferate in vitro within the first 48 hours and by 3-4 days (DIV) later, they form small clusters known as neurospheres, which form a substrate during 4-6 DIV. Lifted. After counting the number of neurospheres produced per well and subculturing the cells (Example 2), the number of neurospheres produced in response to EGF was measured using other biological factors alone or with EGF. The results are shown in the table in comparison with those responding to the combination (Example 3). Example 2 Passage of Proliferating Neurospheres Paradigm 1: Cells and media were prepared as described in Example 1. Cells were placed in a pretreated material-free flask (Corning) at 0.2 x 10 ⁶ Cells / ml were plated and cultured as described in Example 1. After 7 DIV, the neurosphere was removed and 400 rpm. Centrifugation was performed for 2.5 minutes. The pellets were mechanically separated from each other into 2 ml of complete medium using a glass roasted glass Pasteur pipette. 75 cm with 20 ml of EGF-containing complete medium ^Two 1 x 10 in tissue culture flask ⁶ Cells were replated. Proliferation of stem cells and formation of new neurospheres were started again. This process can be repeated every 6-8 days. Paradigm 2: The procedure of Paradigm 1 of Example 1 and Example 2 was repeated, except for the step of adding 20 ng / ml FGF instead of EGF to the complete medium. Paradigm 3: Paradigm 1 of Examples 1 and 2 was repeated, except for the step of adding 20 ng / ml FGF to the complete medium in addition to 20 ng / ml EGF. The neurospheres obtained from the passage can be mechanically separated and the cells re-plated on 96-well plates (Nunclon) as described in Example 1. Measure the effect of specific biological factors, or specific combinations of biological factors, on the growth of neurospheres from cells derived from passaged neurospheres and compare with results obtained from cells from primary tissues can do. Example 3 Assay of Striatal-Derived Neurosphere Proliferation in Response to Combinations of Various Growth Factors and Regulators Paradigm 1: Primary striatal cells prepared by the method described in Example 1 were used as described in Example 1. The cells were suspended in a complete medium containing no growth factors, plated in a 96-well plate (Nunclon), and cultured. After culturing for 1 hour, a specific growth factor or a combination of growth factors containing EGF or bFGF (recombinant human bFGF: R & D system), a combination of EGF and bFGF, or a combination of EGF and F GF and heparan sulfate (Sigma) or bFGF and heparan sulfate were added to each well of the plate at a concentration of 20 ng / ml for each growth factor and 2 μg / ml for heparan sulfate. Activin, BMP-2, TGF-β, IL-2, IL-6, IL-8, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2 (all obtained from Chiron Corp.), TNFα, NGF (Sigma) , PDGF (R & D system), EGF and CNTF (R. Dunn and P. Richardson, McGill University) were prepared in separate flasks containing complete medium to a final concentration of 0.2 μg / ml. Retinoic acid (Sigma) 10 ^-6 M concentration was added. 10 μl of one of these modulator-containing solutions was added to each growth factor-containing well of a 96-well plate. Control wells containing only growth factors were also prepared. In another series of experiments, neurospheres that induce the properties of each of these regulators were tested by growing the cells in their presence in complete medium without growth factors. When used in the absence of a growth-inducing factor such as EGF or FGF, none showed any effect on neural stem cell growth except for EGF. The addition of activin, BMP-2, TGF-β, IL-2, IL-6, IL-8, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, TNFα and EGF was repeated every two days, and CNTF was added daily. , And retinoic acid, NGF and PDGF were only added once at the beginning of the experiment. Cells were cultured for 10-12 days. The number of neurospheres in each well was counted, and the obtained count was tabulated using Cricket Graph III. Other information about the size and shape of the sphere was also described. In general, the proliferative effect of bFGF on the number of neurospheres produced per well was greater than that of EGF. In the presence of 20 ng / ml EGF, about 29 neurospheres were produced per well. Approximately 70 neurospheres were produced in the presence of bFGF. However, with bFGF alone (FIG. 1B), the size of the neurosphere was about 20% of that produced in the presence of EGF (FIG. 1A). The combination of EGF and bFGF (FIG. 1C) produced significantly more neurospheres than EGF alone, but less than bFGF alone. Also, the size of the neurosphere was larger than that observed for bFGF, almost the same size as for EGF. In the case of bFGF producing spheres, the addition of heparan sulfate increased its size to about 70% of the size produced in response to EGF. These data indicate that EGF and FGF have different effects on inducing mitosis of stem cells. The effects of modulators added to growth factor-containing wells are summarized in Table 1. In general, TGF-β family, interleukin, macrophage inhibitory protein, PDGF, TNFα, retinoic acid (10 ^-6 M) and CNTF significantly reduced neurosphere logarithm in all tested growth factors and combinations. BMP-2 (a dose of 10 ng / ml) completely abrogated neurosphere growth in response to EGF. EGF and heparan sulfate both increased the size of neurospheres formed in response to bFGF (about 400%). Paradigm 2: Antisense / sense experiments: Embryo tissues were prepared as described in Example 1 and plated in complete medium in 96-well plates. Antisense and sense experiments were performed using the following oligodeoxynucleotides (all sequences are listed from 5 'to 3'): EGF receptor: sense strand: GAGATGCGACCCTCAGGGAC antisense strand: GTCCCTGAGGGTCGCATCTC EGF: sense strand: TAAATAAAAGATGCCCTGG antisense strand: CCAGGGCATCTTTTATTTA Each oligodeoxynucleotide is grown and ddH _Two Dilute with O and maintain at -20 ° C. 10 μl of oligodeoxynucleotide was added to each well in the 96 wells to adjust the final concentration to 1, 2, 3, 4, 5, 10, or 25 μM, respectively. Oligodeoxynucleotides were added every 24 hours. EGF receptor (EGFr) and EGF oligodeoxynucleotides were applied to cultures grown in bFGF (20 ng / ml), and EGFr oligodeoxynucleotides were applied to cultures grown in EGF (20 ng / ml). Place the cells in an incubator at 37 ° C, 100% humidity, 5% CO _Two Cultured under the following conditions. After 10-12 days, the log count of neurospheres per well was counted and tabulated. Antisense oligodeoxynucleotides at a concentration of 3 μM caused a 50% reduction in the number of neurospheres produced per well in response to EGF and FGF, whereas sense oligodeoxynucleotides produced a number of neurospheres. Did not affect. Sense and antisense oligodeoxynucleotides were toxic to cells when using concentrations higher than 10 μM. Similar experiments were performed using the following oligonucleotides. FGF receptor: Sense strand: GAACTGGGATGTGGGGCTGG Antisense strand: CCAGCCCCACATCCCAGTTC FGF: Sense strand: GCCAGCGGCATCACCTCG Antisense strand: CGAGGTGATGCCGCTGGC FGF receptor (FGFr) and FGF oligodeoxynucleotide were added to the medium grown in EGF and oxynucleotide deoxynucleotides were added. Was added to the medium grown in bFGF. Paradigm 3: Embryo tissue was prepared according to the method described in Example 1. Complete medium containing 20 ng / ml EGF or bFGF was added to each well. 10 μl of diluted phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) was added to each well in a 96-well plate at the beginning of the experiment at once using a 500 μl tip of an Eppendorf repeat pipettor to give final concentrations of 10 and 10 respectively. It was prepared to be 20, 40, 100, or 200 μg / ml. Cells are placed in an incubator at 37 ° C, 100% humidity, 5% CO _Two Cultured under the following conditions. After 10-12 days, the log count of neurospheres per well was counted and tabulated. Paradigm 4: Embryo tissue was prepared according to the method described in Example 1. 10 μl of the diluted staurosporine was added to each well in a 96-well plate using a 500 μl tip eppendorf repeat pipettor to make a final concentration of 10, 1, 0.1 or 0.001 μM, respectively. Cells are placed in an incubator at 37 ° C, 100% humidity, 5% CO _Two Cultured under the following conditions. After 10-12 days, the log count of neurospheres per well was counted and tabulated. Example 4 Adult Spinal Cord Stem Cell Proliferation-In Vitro Response to Specific Biological Factors or Combinations Thereof Spinal cord tissue was removed from mice between 6 weeks and 6 months as follows. Cervical tissue removed from the vertebral column area cranial to first rib; thoracic spinal cord tissue obtained from caudal to first rib and about 5 mm cranial to first rib; lumbosacral tissue making up the rest of the spinal cord I got The dissected tissue is washed in normal cerebrospinal fluid (aCSF), cut into small fragments, and ²⁺ And low Ca ²⁺ And plated in a stirred flask containing oxygenated aCSF containing trypsin / hyaluronidase and kynurenic enzyme. Tissues were oxidized, agitated and heated at 30 ° C. for 11/2 hours, then transferred to vials and treated with trypsin inhibitor in culture (DME M / 12 / hormone mixture). Tissues were triturated 25-50 times with a thin roasted pipette. The separated cells were collected at 400 rpm. Was centrifuged for 5 minutes and resuspended in fresh culture solution. Cells were plated on 35 mm dishes (coaster) and allowed to settle. Most of the culture was aspirated and fresh culture was added. EGF alone or EGF and bFGF were added to some dishes to a final concentration of 20 ng / ml, and bFGF (20 ng / ml) was added to the remaining dishes with 2 μg / ml heparan sulfate. Cells at 37 ° C, 100% humidity, 5% CO _Two For 10 to 14 days. The number of neurospheres produced per well was determined and the results tabulated. EGF alone did not produce neurospheres from any of the spinal cord regions. In the presence of EGF and bFGF, neurospheres originated from all regions of the spinal cord, especially the lumbar sacral region. The combination of EGF + FGF and FGF + heparan sulfate produced the same number of spheres in the neck, whereas the combination of bFGF and heparan sulfate produced fewer neurospheres from the thoracic and lumbar regions (FIG. 3). Example 5 Generation of Neurospheres from Primate Tissues in Response to Growth Factors In Vitro First passage neurospheres were obtained from adult human tissues. In a routine biopsy, normal tissue was obtained from a 65-year-old female patient. The biopsy site was the right frontal lobe, 6 mm from the anterior / dorsal horn tip of the lateral ventricle. Tissues were prepared using aCSF in substantially the same manner as described in Example 4. Stem cells were cultured in T25 flasks (Nunclon) in complete medium containing 20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF, or each 20 ng / ml EGF + bFGF. Flasks were evaluated every 2-3 days for neurosphere formation. The combination of EGF + EGF produced more neurospheres than EGF or FGF alone, respectively. Example 6 Inhibition of Proliferation of Stem Cells and Stem Cells in Injured CNS A: Spinal Cord Injury Adult male CD1 mice (Charles River, St. Constant, Quebec) were anesthetized with pentobarbital sodium salt (80 mg / kg, ip). . Laminectomy is performed at the cervical, thoracic or lumbar level, and the dorsal funiculus is cut with microsurgical scissors. On the same day, the composition containing the regulator that inhibits the proliferation of stem cells was inoculated with a composition containing a modulator that inhibits the proliferation of stem cells in a volume of 100 μl osmotic minipump (ALZA, distribution rate: 0.5 μl / h / 7 days with a 30-gauge cannula; It was injected into the fourth ventricle using model 1007D). The cannula was implanted with stereotactic fixation from the AP-6.0 mm posterior in the fourth ventricle with bkull, L-0.3 mm and DV-4.3 mm inferior dura in the fourth ventricle with skull position between the human and cruciate sutures. The cannula was fixed with dental acrylic cement. Compositions containing modulators that inhibit stem cell proliferation in response to injury stimuli were injected at a flow rate of 0.5 μl / h for 1-28 days. The composition contained 0.9% saline, 1 mg / ml mouse serum albumin (Sigma) and BMP-2 at a concentration of 10 ng / ml. Other modulators that can be used have been found to have inhibitory activity on neural stem cell proliferation in vitro, such as CNTF, retinoic acid, members of the TGF-β and MIP families, and antisense oligonucleotides to EGF and FGF Is mentioned. The response of the cells at the injured site was measured according to the method described in Example 7. B: Brain injury Adult human male CD1 mice (Charles River-St. Constant, Quebec) were anesthetized with pentobarbital sodium salt (80 mg / kg, ip). A small portion of the skull was removed and brought into contact with the cerebral cortex area. Cavanagah, JB. In accordance with J. Anatomy 106: 471-487 (1970), excision lesions were generated intracortically. On the same day, factors that cause injury and inhibit stem cell proliferation were assayed using a 100 μl osmotic minipump (ALZA, delivery rate: 0.5 μl / h / 7 days; model 1007D) with a 30 gauge cannula. Injected into the room. The cannula was implanted using stereotaxic. The cannula was fixed with dental acrylic cement. Modulators that inhibit stem cell proliferation in response to injury stimuli were injected at a flow rate of 0.5 μl / h for 1-28 days. The vehicle solution is 0.9% saline containing 1 mg / ml mouse serum albumin (Sigma). Inhibitors include those found to have inhibitory activity in neural stem cell proliferation in vitro, such as CNTF, retinoic acid, members of the TGF-β and MIP families, and antisense oligonucleotides to EGF and FGF . The response of the cells at the injured site was measured according to the method described in Example 7. Example 7 Detection of Proliferating Cells at the Injured Site in the CNS Following the injection period of Example 6, the mice were given 5 injections of bromodeoxyuridine (BrdU; Sigma, 120 mg / kg, ip) every 2 hours for a total of 5 injections. The injured part was labeled. The animals are sacrificed 30 minutes, 2 days, 4 days, 1 week, 6 weeks or 6 months after the last injection by over-anaesthesia and perfused with 4% paraformaldehyde, respectively. The adjacent area, including the site of injury, and the ventricular site adjacent to the site of injury are removed and postfixed overnight at 4 ° C. in perfusate to provide cryoprotection. Cut the 30 μm sagittal cold bath part and paste directly onto the gelled slide. For BrdU detection, the site is treated with 1 M HCl at 65 ° C. for 30 minutes to denature cellular DNA, and then the tissue is subjected to immunocytochemical treatment. Rat anti-BrdU (Seralab) is used for immunocytochemical treatment with donkey anti-rat-FITC. Serum against GFAP (represented by astrocytes) is used, and then donkey anti-rat-FITC is used to visualize GFAP expression and glial scar production. The effect on nestin expression is quantified by labeling with antiserum to nestin and subsequently with donkey anti-rat-FITC, and the number of nestin immunoreactive cells near the ventricle and the site of injury is measured. The specificity of the immunostaining is confirmed by the absence of the primary antibody. The obtained results of the treated animals are compared with controls where vehicle alone was administered as an intraventricular treatment. All references cited herein are hereby incorporated by reference.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者レイノルズブレントエイカナダアルバータティ２エヌ１エックス９カルガリーノースウェストエイストリート 235−11────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, U G), AL, AM, AT, AU, BB, BG, BR, B Y, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES , FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, L V, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ , PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, UG, US, UZ, V N (72) Inventor Reynolds Brent A Canada Alberta Ti 2N 1E Campus 9 Calgary Northwest Lee Street 235-11

Claims

【特許請求の範囲】１．インビトロにおける多能性神経幹細胞の増殖および／または該神経幹細胞のプロゲニー(子孫、progeny)の増殖を調節する方法であって、下記の工程を含む方法。 (a)ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに分化し得るプロゲニーを産生することが可能な多能性神経幹細胞を少なくとも一種含む哺乳類神経組織を分離する工程、および (b)幹細胞の増殖を誘導する増殖因子を少なくとも一種、および該多能性神経幹細胞の増殖および／または該多能性神経幹細胞のプロゲニーの増殖を調節する調節因子を含む培地内で該多能性神経幹細胞を増殖する工程。２．該増殖因子がEGF、アンフィレグリン、aFGF、bFGF、およびTGF αからなる群から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。３．該増殖因子がbFGFである、請求の範囲第１項に記載の方法。４．該調節因子がヘパラン硫酸、CNTF、レチノイン酸、アクチビン、インターロイキンおよびEGFからなる群から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。５．該調節因子がヘパラン硫酸である、請求の範囲第３項に記載の方法。６．該調節因子がEGFである、請求の範囲第３項に記載の方法。７．該多能性神経幹細胞が哺乳類由来のものである、請求の範囲第１項に記載の方法。８．該多能性神経幹細胞が成体ドナー由来のものである、請求の範囲第１項に記載の方法。９．該幹細胞がヒト由来のものである、請求の範囲第１項に記載の方法。 10．該幹細胞が神経学的疾患を患うヒト由来のものである、請求の範囲第８項に記載の方法。 11．患者のCNSにおける神経幹細胞の増殖を調節するための治療組成物であって、治療上有効量の神経幹細胞調節因子を含むことを特徴とする治療組成物。 12．該調節因子が神経幹細胞の増殖を阻害する、請求の範囲第11項に記載の組成物。 13．該調節因子が、BMP-2、CNTF、レチノイン酸、TGF-β族およびMIP族のメンバー、並びにEGFおよびFGF受および容体に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドからなる群から選択される、請求の範囲第12項に記載の組成物。 14．該調節因子がBMP-2である、請求の範囲第13項に記載の組成物。 15．脳または脊髄傷害を受けた患者における瘢痕組織形成を阻害するための、請求の範囲第12〜14項のいずれか一項に記載の組成物の使用。[Claims] 1. Proliferation of pluripotent neural stem cells in vitro and / or proliferation of said neural stem cells A method of regulating the growth of progeny (progeny), comprising the following steps: Method. (a) A process that can differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes Mammals containing at least one pluripotent neural stem cell capable of producing rogeni Separating neural tissue; and (b) at least one growth factor that induces proliferation of stem cells, and the pluripotent nerve Regulates proliferation of stem cells and / or progeny of said pluripotent neural stem cells Growing said pluripotent neural stem cells in a medium containing a regulatory factor. 2. The growth factor consists of EGF, amphiregulin, aFGF, bFGF, and TGFα The method according to claim 1, wherein the method is selected from the group. 3. 2. The method according to claim 1, wherein said growth factor is bFGF. 4. The modulator is heparan sulfate, CNTF, retinoic acid, activin, interlo 2. The method according to claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of Ikin and EGF. 5. 4. The method according to claim 3, wherein said modulator is heparan sulfate. 6. 4. The method according to claim 3, wherein said modulator is EGF. 7. The pluripotent neural stem cell according to claim 1, wherein the pluripotent neural stem cell is derived from a mammal. Method. 8. 2. The method according to claim 1, wherein the pluripotent neural stem cell is derived from an adult donor. The method described. 9. 2. The method of claim 1, wherein said stem cells are of human origin. Ten. 9. The method according to claim 8, wherein the stem cells are derived from a human suffering from a neurological disease. The described method. 11． A therapeutic composition for modulating neural stem cell proliferation in the CNS of a patient. A therapeutic composition comprising a therapeutically effective amount of a neural stem cell modulator. 12． 12. The composition of claim 11, wherein said modulator inhibits proliferation of neural stem cells. Stuff. 13. The modulator comprises BMP-2, CNTF, retinoic acid, members of the TGF-β and MIP families. Bars and antisense oligodeoxynuclein against EGF and FGF receptors and receptors 13. The composition according to claim 12, wherein the composition is selected from the group consisting of nucleotides. 14. 14. The composition according to claim 13, wherein said modulator is BMP-2. 15． Contractors to inhibit scar tissue formation in patients with brain or spinal cord injury Use of the composition according to any one of claims 12 to 14.