JPH10509580A

JPH10509580A - 遠心分離シリンジ装置および方法

Info

Publication number: JPH10509580A
Application number: JP8508984A
Authority: JP
Inventors: ブラッセラエア，ピーターバン
Original assignee: アクティベイテッドセルセラピー，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-08-31
Filing date: 1995-08-31
Publication date: 1998-09-22
Anticipated expiration: 2015-08-31
Also published as: WO1996006679A1; AU680383B2; EP0778794A1; EP0778794B1; DE69503512T2; NZ292754A; CA2198606C; JP3487604B2; DE69503512D1; ATE168288T1; AU3502395A; US5577513A; DK0778794T3; HK1013807A1; ES2121414T3; CA2198606A1

Abstract

(57)【要約】細胞およびその他の生物物質の密度勾配分離に有用な遠心分離可能な細胞分離装置が開示されている。特定の実施態様において、この装置は、サンプルの引き入れが可能な、遠心分離後にペレットと上清画分との混合を制限する拘束領域(28)を含む動作可能なプランジャー(18)を備えるシリンジ(10)の形態をとる。シリンジ(10)はまた、密度勾配分離溶液(20)を含み得る。また、この装置を利用して流体標本を抽出するためのキットおよび方法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】遠心分離シリンジ装置および方法１．発明の分野本発明は、細胞およびその他の生物物質の密度勾配分離に用いられる遠心分離可能な細胞分離装置に関する。２．背景従来技術には、流体サンプルの抽出およびそれらの遠心分離を提供する多くの装置が含まれる。例えば、Sarstedt、米国特許第4,459,997号は、患者の血液を、遠心分離に用いられ得るチューブへ採り入れることを提供する血液抽出および遠心分離装置を開示している。遠心分離チューブは、拘束(constricted)領域を含まない、または密度勾配物質を使用しない単純な直壁のチューブである。 Adler、米国特許第4,020,831号は、標本を採り、次いでシリンジの特定部分を解体して、シリンジの標本を保持する部分が遠心分離器に配置され得るシリンジを開示している。シリンジは、また特定密度のプラグを含む。遠心分離の間、軽い相はプラグの上、そして重い相はプラグの下になるように標本が分離する。この装置は、分離された相の容易な取り出し、および密度勾配物質の使用を提供しない。さらに、Sachs、米国特許第3,965,889号は、血液採取および血漿を分離するための装置を開示している。シリンジは、血液が採取される内側拘束部(medial re striction)を有する熱封止可能な(thermosealable)壁をめぐらした容器を含む。血液が容器に採取された後、容器は、取り出され、遠心分離のためにキャリアに配置され、その後容器は、血液の相を分離するために拘束部において封止され得る。この装置は、遠心分離のために、標本容器を取り出し、異なるキャリアへ入れることを必要とするため、標本の汚染のおそれが増大する。当該分野において、低い相およびペレットに存在する高密度細胞による干渉または汚染なしに、デカンテーションによって、上清に存在する細胞が容易かつ量的に採集できるように、細胞混合物の成分を分離するために用いられ得る遠心分離チューブが必要とされている。特に、混合物からの比較的希な細胞の分離および採集をもたらすために、密度勾配物質と共に用いられ得る装置が必要とされている。また、当該分野において、遠心分離のためにサンプルを異なる容器へ移動することを必要としない一体化ユニットであり、従って汚染のおそれの減少された、異なる密度の物質を分離するために使用することができるシリンジが必要とされている。本発明は、これらの特徴、および必要とされる全ての細胞選別操作が実施され得る無菌環境を提供する。３．発明の要旨ひとつの局面において、本発明は、遠心分離可能な細胞分離装置に向けられている。装置は、容器、および容器内にスライド可能に配置されたプランジャーを含む。好ましい実施態様において、プランジャーは、円筒状ハウジングを含む。本実施態様においては、ハウジングの外径は、装置容器の内径とシールを形成する。容器は、流体が容器に流れるためのオリフィスを有する。オリフィスは、好ましくは、流体の装置への無菌移動を可能にする取り付け部(fitting)を含む。好ましい実施態様において、オリフィスを介しての流体移動は、無菌針、またはリザーバにさらに接続されるように適合されるチューブによって導入され得る。プランジャーは、流体収容空間を形成する。プランジャーの上壁は、開口部を規定する拘束部材(constriction member)であり、流体は、開口部を通じて空隙に流れる。拘束部材は、プランジャーが逆さにされた場合に、流体がプランジャーに保持されるように構成される。好ましい実施態様において、プランジャーの上壁により規定された開口部は環状である；しかし、開口部は、星型、楕円、長方形などを含む多くの異なる形状を取り得る。あるいは、開口部は、複数の開口部であり得、またはメッシュもしくはグリッドで覆われ得る。装置は、また、プランジャーを装置容器内でスライドするための手段も含んでいる。好ましい実施態様において、スライド手段は、プランジャーに固定された延伸部材である。延伸部材は、容器の他端の中央オリフィスを通る。好ましい実施態様において、延伸部材は、プランジャーの底壁に取り外し可能に固定されている。他の好ましい実施態様において、部材は底壁に再度取り付けられる。特定の実施態様において、本発明は、ひとつの装置に一体化したシリンジおよび遠心分離チューブを備え、さらにその細胞分離性能を向上するために密度勾配物質の使用を提供する遠心分離シリンジを含む。装置は、一端が流体の無菌導入または排出に適合したオリフィスを覆う取り付け部を有し、対向する端がプランジャーのハンドルとの係合を封止するための中央オリフィスを有する標本容器を有する。ハンドルの一端が、容器内に位置するプランジャーと接続される。ハンドルの対向する端は、標本容器の外にそのまま残り、容器内でプランジャーを長手方向に移動するために用いられる。他の実施態様において、プランジャーの流体収容空間は、密度勾配物質で充填される。密度勾配物質は、好ましくは、拘束部材の上壁より上のレベルまで延び、容器の上部の一部を充填する。他の局面において、本発明は、流体分析のための閉鎖システムを含む。そのようなシステムは、分離されるべき細胞が患者から採取され、装置内にて直接分離され得る場合に特に有用である。あるいは、細胞混合物は、抽出および細胞分離装置の使用による分離前に、無菌バッグに貯蔵される。従って、本発明の本実施態様は、細胞分離装置に加えて、患者を含み得る流体サンプルリザーバ、ならびに流体サンプルリザーバおよび装置の間に無菌的に接続されているチューブを含む。更なる局面において、本発明はキットを包含することが分かる。キットは、上記のような細胞分離装置、プランジャーの流体収容空間を充填し、さらにプランジャーの上壁の上のレベルまで容器を充填するのに十分な多量の密度勾配物質を含む。更なる局面において、本発明は、流体標本を抽出および遠心分離するための方法を包含し、標本に存在する細胞のような成分を分離する。本方法によれば、上記のような遠心分離装置において、密度勾配物質がプランジャーの上壁の上のレベルまで充填される。次いで標本サンプルが、装置に入れられ、装置内の密度勾配物質の上に入れられる。次いで、遠心分離圧が装置にかけられ、装置容器の下端に向かってサンプルを引っ張る。次いで、プランジャーの上壁に残留したサンプルの一部が取り除かれる。好ましくは、所望の標本成分がこの上部画分にある；しかし、本方法はまた、遠心分離後にプランジャーに残留した分離された標本の一部をさらに抽出することによって、沈殿物質を分離するために用いられ得る。４．図面の簡単な説明図１は、標本の抽出前の、本発明の遠心分離シリンジの断面図を示す；図２は、標本の導入の際の、図１の遠心分離シリンジの断面図を示す：図３は、遠心分離およびハンドルを取り外した後の、図１の遠心分離シリンジの断面図を示す；図４は、ハンドルが再び取り付けられ、標本が取り除かれた、図１の遠心分離シリンジの断面図を示す：図５は、本発明による遠心分離シリンジの他の実施態様の断面図である；図６は、図５の他の実施態様のプランジャーの斜視図である；図７は、図５のプランジャーの拡大図である；図８は、バルブを有する遠心分離シリンジプランジャーの他の実施態様の断面図である；図9A〜Fは、遠心分離シリンジのプランジャーの他の実施態様の断面図である；図10は、複数の拘束部材を有する遠心分離シリンジの他の実施態様の断面図である；および図11は、本発明による遠心分離シリンジを用いる血液分析のための閉鎖システムの概略図である。５．発明の詳細な説明 5.1 遠心分離シリンジおよび使用方法本発明は、特に体液からの細胞の分離に適合した、遠心分離可能な細胞分離装置に向けられている。一般的に、この装置は、シリンジチャンバー内にスライド可能に配置される特殊なプランジャーを有するシリンジである。プランジャーは、流体が送達され得る流体収容空間を有する。プランジャーの重要な特徴は、シリンジが逆さにされた場合に、その流体収容空間に含まれた流体を維持することである。操作の間、プランジャーは、シリンジ容器あるいはバレルの２つの端部の間でスライドする。そのようなスライドは、シリンジバレルの一端を通って突出する延伸部材あるいはハンドルをプランジャーに取り付けて、ハンドルに圧力をかけるような、従来の方法によってもたらすことができる。あるいは、プランジャーは、プランジャーの流体収容端部にかかる流体圧、もしくはプランジャーの下壁にかかる吸引あるいは負圧のような力によってスライドし得ることが理解されるであろう。プランジャーはまた、電磁手段のような、外部から印加される手段によって、シリンジバレル内において動作され得る。操作のためには、プランジャーはまず、シリンジ容器の上部に配置される。プランジャーがシリンジの底に向かって引かれると、流体がシリンジおよびプランジャーに引き入れられる。あるいは、プランジャー、およびプランジャー拘束部より上のシリンジ容器部分は、密度勾配物質のような細胞分離物質で予め充填され、シリンジに引き入れられた流体はこの物質上で層を成す。シリンジが十分に物質によって充填されると、遠心分離のためにハンドルがシリンジのプランジャーから取り外される。プランジャーのいくつかの部分と遠心分離チャンバーの内壁との間の実質的に流体を通さないシール(fluid-tight seal)によって、流体中の十分に密度の濃い物質が、プランジャーの拘束された開口部およびプランジャーの下部のペレットを流れることが確実になる。上記の、遠心分離シリンジおよびその使用方法の一般的な説明は、以下の特定の実施態様によって例証される。 5.2 特定の実施態様本発明による遠心分離シリンジ10のひとつの実施態様を、図１に例示する。遠心分離シリンジ10は、針13、ハンドル16およびプランジャー18を収容するのに適合した取り付け部12から形成される中央オリフィスを有する標本容器14を含む。取り付け部12は、例えば、Luer Lock^TMシリンジチップのような針を支持するのに適合したいかなるタイプの固定チップでもあり得る。あるいは、取り付け部12 は、例えば、Burron Medical Inc.，Bethlehem，Pennsylvaniaから入手可能な、逆流バルブを有するSAFSITE^TM小ワイヤ延長セット、およびSpin-Lock^TMアダプタなどの、無菌流体バッグおよびチューブと接続するのに適合した無菌のセプタムであり得る。ハンドル16は、さらに好ましくは、ノブ22、およびプランジャー18に対して取外し可能な接続部24を備える。図１〜４に示されるように、プランジャー18は、プラスチック材料から機械加工または成形された単体ピースである。公知の医療グレードプラスチック材料が使用され得る。図１に示すように、プランジャー18は、接続部24においてハンドルと取り外し可能に接続されたじょうご状の底壁26を有する。側壁27は、容器の壁に好ましくは密着して、スライド運動を可能にするが、その周辺に実質的に流体を通さないバリアを設ける。上壁は、中央開口部29を規定する拘束部材28から形成される。あるいは、側壁27の外径は、スライドを容易にするためにわずかに小さめにされ得、側壁27と容器14との間にＯリングシールが設けられる。取外し可能な接続部 24は、例えば、ネジ固定またはスナップ止めの形態をとり得る。好ましくは、接続部24はまた、ハンドル16の再取付けを果たす。再取付けが所望でない場合には、接続部24は、ハンドル16を折って取り外し得るように設計され得る。適切な接続部は、当業者によって選択され得る。使用の際に、密度勾配分離プランジャー18は、標本を導入する前に、細胞分離密度勾配媒体20で充填される。当業者に理解されるように、そのような物質は、分離される特定のサンプル物質に基づいて選択される特定の規定された密度を有する。細胞分離密度勾配媒体の例には、スクロース、アルブミン、およびFicoll^TM が含まれる。好ましい物質は、Pharmacia Fine Chemicals of Piscataway，Ne w JerseyおよびUppsala，Swedenから、PERCOLL^TMの商標で入手可能である。好ましくは、密度勾配物質は、拘束部材より高い、あるいは少なくとも開口部29の頂点より高いレベルまで充填される。例えば、約2.8cmの内径を有する標準の50ml シリンジを用いる場合、勾配物質は、好ましくは、拘束部材28より約１mm以上上のレベルまで充填される。この充填のレベルによって、以下に説明されるように、遠心分離の間の拘束部材28の下の界面部の形成の防止を助ける。図２を参照すると、遠心分離シリンジ10への標本の導入が例示されている。ハンドル16およびプランジャー18によって、ハンドルを容器14から引き抜き、プランジャーを取り付け部12から引き離すことによってつくられた真空によって、標本30が、取り付け部12に固定された針13を通ってシリンジに引き入れられる。ハンドルは、標本と、標本がその上に層を成す密度勾配物質との混合を避けるために、十分に低い力および速度で引かれなければならない。ハンドルが適切な力で引かれる場合、好ましくは、図２に示されるように、サンプルは、引き入れられるとともに容器の側面に付着するストリームを形成する。これは、不必要な混合を減少する。２つの物質の混合は、また、標本の密度が、密度勾配物質の密度より好ましくは有意に低いという事実によって最小となる。標本30が容器14に入れられた後、容器は、上向きで維持され、サンプルが、密度勾配物質20の上にある。針13を用いて、末梢血のようなサンプルが分析のために直接患者から採取され得る。本発明は、従って、遠心分離容器に導入する前に、サンプルを直接手で扱うことを省くことによって、そのようなサンプルの無菌性を確実にする。あるいは、図11に例示されているように、無菌セプタムを取り付け部12として用いることによって、あらかじめ公知の技法によって採集され、例えば、無菌バッグ33に貯蔵された血液は、無菌チューブ35または他の公知の無菌接続手段を介して遠心分離容器に入れられ得る。従って、本発明は、完全に閉鎖されたシステムにおいて、同じくサンプル物質を手によって直接操作することなく、より多量のサンプル物質の無菌移動を確実にする。図２を再び参照すると、いったん容器14に標本が完全に入れられ、そして取り外し可能な接続部24が、標本容器14の低部中央オリフィスに位置されるようにハンドル16が引かれると、ハンドル16は、遠心分離工程のために取り外され得る。図３は、遠心分離工程が行われた後の遠心分離シリンジを例示している。示されるように、ハンドルは、容器14の底端部に位置するプランジャー18から取り外される。容器14の遠心分離によって、プランジャー18の底において標本の重い部分から形成されるペレット32を生じる。密度勾配物質20は、ペレット32の上に位置する。目的の細胞を含む界面部34が、上記拘束部材28の上において、標本希釈液33と密度勾配物質20との間に形成される。図４において矢印37で示されるように、ハンドル16をコネクタ24に再度取付け、界面37および上清希釈物質33を、密度勾配物質20の一部とともに排出することによって、界面部34を、遠心分離シリンジ10から取り出すことができる。図４に示されるように、そのような排出は、排出液中の密度細胞分離媒体の含有量を最小にするために、シリンジが逆さの位置にある間に実施され得、あるいは、上向きの位置において排出することによって達成され得る。あるいは、界面部34は、ハンドルを再び取付けることなく、シリンジを取り付け部12下(例えば、39)において開口し、上清および界面物質をデカントすることによって取り出され得る。そのような開口は、切断またはシリンジの容器中の一体取り付け部(integral fi tting)によって達成され得る。ハンドル16を接続部24においてプランジャー18に再度取り付けることによって、密度勾配物質20およびペレット32をさらに取り除くことが達成できる。次いでハンドルが、必要であれば、容器に押し入れられ得、物質の取り出しを助ける。ひとつの理論によれば、拘束(restricted)開口部を有する拘束部材の存在によって、容器を横切る中間表面張力の形成のための支持または基点(nucleus)を提供する。この表面張力によって、例えば、上部領域の内容物がチューブから排出される際に、チューブの上部および下部領域(拘束部材の上下)の混合を妨げる。従って、拘束部材によって形成された開口部の面積は、表面張力を形成する能力に影響される。バレル内のまわりの縁より少し大きい拘束部材が、必要な表面張力を形成するのに十分であり得る。従って、拘束部材によって形成される開口部の断面積は、シリンジの水平断面における表面積の、最小で約５%、または最高で約95%であり得る。例示の実施態様において、シリンジが内径約2.8cmの場合、約0.5cmの直径を有する開口部が適切である。多くの適用において、界面部34を含有する上清画分のみを採集することが望ましい。そのような場合、ペレットは、シリンジから排除される。その他の場合、ペレットは、機械的な操作/破砕によって取り除かれ得る。例えば、シリンジは、逆さにされ、ボルテックス混合に供され得る。そのような混合によって、ペレットは隣接する液相中に破砕され、この液相および破砕された細胞の、シリンジの第２または採集チャンバからシリンジの第１のチャンバへの移動を誘発する。本発明の別の実施態様を図５〜７に示す。遠心分離シリンジ40は、別個のピースから形成され、側壁のないプランジャー42を有する。プランジャー42は、ポリカーボネートのような医療グレードのプラスチックから形成されるワッシャーによって形成される平底板44を有する。底板44は、底板44と標本容器48の内壁との間に流体を通さないシールをつくるために、好ましくは、シリコーンまたはゴムシール46によって囲まれる。ネジまたはスナップによって固定される接続部51は、ハンドル50を取り外し可能に取り付けるために、底板に設けられる。開口部55 を規定する環状の拘束部材54に底板44を接続するために、プランジャー42は、取り付け部52を有する。取り付け部52は、好ましくは、ポリカーボネートのような医療グレードのプラスチックから形成される。拘束部材54は、じょうご状であり、好ましくは、シリコーンまたはゴムからつくられる。図６の装置のプランジャーおよびハンドル部分の斜視図に示されるような、３つの取り付け部52が好ましいが、所望であれば、２つのみ、または３つより多い取り付け部が設けられ得る。図７に示されるように、拘束部材に、キノコ状頭部57を取り付け部に保持するための段の溝56を設けることによって、拘束部材が取り付け部に固定され得る。取り付け部52は、底板44に、好ましくは医療グレードの接着剤によって接着され得る。接続のための他の手段が、当業者によって考案され得る。使用される個々のタイプの接続部は、部材間において安定した接続が維持されれば重要ではない。本発明の利点は、上述のように、プランジャーを活用した単純な排出作業によって、プランジャーの拘束部材の上部の低密度物質が、下部の物質と分離することにある。図１を参照すると、取り付け部12における開口部が十分に大きければ、または図３に関して記載されたように、容器が開けられれば、目的の細胞を流し出し得る。これは、チューブから注意深くピペットで取り出す、あるいはチューブの底に穴を開けチューブの内容物を採集容器にゆっくりと滴下させることによって物質を分離する、標準の直壁の遠心分離チューブを用いて勾配分離を抜き取る多くの従来の方法とは対照的である。従って、本発明は、区別されて分離された物質を抜き取るための便利かつ簡易な手段を提供する。さらに、従来の直壁チューブとは異なり、遠心分離シリンジが落下または誤って逆さにされても、上下部分の内容物は、拘束部材の存在のため容易には混合されない。さらに、いったん分離が行われると、拘束部材より上に存在する溶液は、拘束部材より下のシリンジの内容物を干渉すること(または、汚染のおそれ)なしに、チューブの中で混合されることが可能となる。好ましくは、これは、図４に示すような逆さの位置にあるシリンジにおいて行われる。物質の分離は、図８のプランジャー64に示されるように、バルブ60をプランジャーに追加することによってさらに向上され得る。バルブ60は、プランジャー64 の開口部62に位置する。バルブ60は、一方通過バルブ、または閾遠心分離圧がかかった場合にのみ、開くバルブであり得る。バルブは、柔軟な材料のフラップを穴62の上に設けることによって形成され得る。好ましい実施態様において、バルブ60を開けるために必要とされる力は、重力の垂直力の約850倍である。従って、バルブ60は、初期遠心分離の間、重い細胞が通ることを可能にし、これらの細胞をその場に保持し、バルブの上に位置する目的の軽い細胞の、洗浄または混合のようなさらなる処理を可能にする。このようにして、単一の無菌容器内で、細胞の完全かつ最終的な操作を行うことができる。開口部29、55は、円形に限定されないが、一般的には、概ね円形の環を形成する、勾配のついたまたはじょうご形状の拘束部材が好ましい。開口部は、細胞の開口部通過が可能な、楕円形、星形、または他の非円形の形状をとり得る。あるいは、または加えて、開口部は、複数の開口部から形成され得、もしくは細胞の通過が可能なグリッドまたはメッシュによって覆われ得る。そのようなメッシュまたはグリッド配置も、本明細書において、複数の開口部と称される。図9A〜Fは、本発明による遠心分離シリンジのプランジャーの別の形状および設計の例示である。図9Aは、平底壁を有する流体収容空間を有するプランジャー 70を示す。図9Bは、尖った底壁を有するプランジャー72を示す。尖った底壁を有するプランジャー72は、重い細胞がより良いペレットを形成することを可能にし、これは細胞を採集すべき場合に望ましい。あるいは、細胞採集コンパートメント76を規定するプランジャー74は、細胞の採集を提供するために用いられ得る。図9Dは、スポンジまたはゲルのような細胞捕捉材料78を含むプランジャー70を示す。材料78は、特定の細胞タイプ、または特定の細胞タイプを殺傷する毒素に特異的に結合する化合物を含有し得る。材料78は、所望であれば、また磁気材料からつくられ得る。図9EおよびFは、容器内でのプランジャーの動作を容易にするプランジャーの他の実施態様を示す。図9Eは、広がった接触点82を有するプランジャー80を示す。プランジャー80は、これらの点においてのみ容器に接触する。同様に、図9Fに、広がった接触点86を有するプランジャー84を示す。図10は、追加の拘束部材を有する図１の遠心分離シリンジのさらに別の実施態様を例示している。二重拘束シリンジ90は、取り付け部96によって、第１の拘束部材94に接続した底板92を有する。第２の拘束部材98は、異なる密度の細胞の分離を可能にするために、第１の拘束部材94の上に位置し、追加のコンパートメントを作り出す。第２の取り付け部97は、第２の拘束部材98を固定するために用いられ得る。追加の拘束部材が、さらにいくつかの異なる密度のサンプルが分離される場合に加えられ得る。図10はまた、ハンドル102と底板92との間の取り外し可能および再取り付け可能な接続手段のひとつの実施態様を例示している。この実施態様において、内部ネジ100は、ハンドル102が取り外され、そして遠心分離後に再度取り付けられ得るように、ハンドルと底板との間の取り付け手段を形成している。好ましくは、本発明による遠心分離シリンジは、すでに適切なレベルまで入れられた密度勾配物質を有する減菌された完全なユニットとして提供される。このようにして、シリンジの無菌が保証され、本発明を使用するにあたって、使用者は、無菌パッケージを開けることのみが必要となる。あるいは、シリンジは、密度勾配溶液が別に設けられ、針およびハンドルが取り外されたキットの形態で提供され得る。この場合、使用者は、使用前に、シリンジのプランジャーを密度勾配物質で充填し、次いで針およびハンドルを組み立てる。６．実施例以下の実施例は、限定することなく、本発明を例証する。実施例１血液細胞混合液のCD34⁺細胞の濃縮のための物質１．末梢血および骨髄患者を、水和し、中央静脈カテーテルにより、静脈内(IV)注射によって２時間投与したシクロホスファミド(４g/m²(gm/m²))で処置した。シクロホスファミド注射終了の24時間後、患者を、皮内(SC)注射によって、約10μg/kg/dの用量で投与したG-CSF(NEUPOGEN，Amgen，Thousand Oaks，CA)で処置した。アフェレーシスを、１ｘ10⁹/Ｌ以上の白血球数(WBC)の回収で開始した。Cobe Spectra Cell S eparator(Lakewood，Colorado)を用いて、80 ml/分の速度で200分間(合計容積16 L)アフェレーシスを行った。アフェレーシスされた末梢血を、密度勾配に直接適用した。しかし、完全な血液および骨髄吸引液を、密度勾配に加える前に、バフィーコートに処理(赤血球の除去)した。２．密度勾配の調製 “PERCOLL”溶液をPharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)から購入し、購入元の勧めに従って４℃にて貯蔵した。12部の“PERCOLL”を、１部の10 ｘカルシウムおよびマグネシウムを含有しないリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)と混合することによってストック溶液を調製した。溶液のpHを7.4に、そして重量オスモル濃度を280 mOsm/Kg H₂O(mOsm/Kg H₂O)に調整した。細胞混合物中のCD34⁺細胞の分離における使用のために、ストック溶液は、カルシウムおよびマグネシウムを含有しないPBSで、1.0605±0.0005 gr/mlの密度までさらに希釈し、室温にて使用した。勾配の密度を、1.0605 gr/mlの±0.0005 gr/ml以内の精密度で調整することによって、細胞分離の再現性および正確度を確実にした。これは、DMA 48(A nton PAAR USA，Ashland，VA)のような高精密ディジタル密度メータを用いて行った。全ての手順を無菌条件および室温にて行った。実施例２遠心分離シリンジを用いるCD34⁺前駆体造血細胞の分離本発明の遠心分離シリンジおよび方法は、上記実施例１に記載のように、化学療法および顆粒コロニー刺激因子(G-CSF)で処置された患者からのCD34⁺前駆体細胞を分離するために用いられ得る。これらの細胞は、次いで患者のリンパ球造血系(lymphohematopoietic system)を再増殖するために用いられ得る。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、G-CSF(10μg/kg/日)の日周の注射によって処置されている患者のアフェレーシスによって得る。次いで、サンプルを当業者に理解される標準的な方法によって処理する。細胞を、25 mlのマグネシウムおよびカルシウムを含有しないPBSにて再懸濁し、次いで、図１に例示されるように、拘束部材を含むプランジャーに合わされた、50 ml円錐形の遠心分離シリンジ中の15 mlのPERCOLL^TM溶液の上に引き入れる。このPERCOLL^TM溶液は、1.0605g/ml(重量オスモル濃度280±５ mOsm/kg H₂O；p H 7.4)の濃度を有する。シリンジの拘束部材の開口の直径は、好ましくは約0.5c mである。PERCOLL^TMのこの容量は、拘束部材より約１mm上のレベルまで容器を充填するのに十分な容量である。サンプルが引き入れられた後、針およびプランジャーが外される。次いで、遠心分離シリンジが、約850xgで室温にて30分間遠心分離される。CD34⁺細胞を含有する上部画分を、無菌容器にサンプルを放出することによって回収する。回収された画分の細胞タイプおよび純度を、標準的な方法に従って試験し、機能的なCD34⁺細胞の豊富さを決定する。例えば、細胞は、当該分野において公知の方法に従って、コロニー形成単位(CFU；約束された(commited)造血前駆体細胞を指す)、長期培養開始細胞(LTC-IC;約束されていない造血前駆体細胞を指す)、ナチュラルキラー(NK)細胞、および界面フラクションにおける自然サプレッサー細胞活性の存在について試験され得る。上記装置および方法を用いて、界面は約 70〜90%のCD34⁺細胞、および90%より多いCFUを含有する。本発明は特定の方法および実施態様を参照しながら説明されてきたが、種々の改変および変更が、本発明から逸脱することなく行われ得ることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．側壁、第１および第２の端部を有する容器(14)であって、該第１の端部が流体が流れるための無菌接続部を設けるのに適合可能なオリフィスを規定し、該第２の端部が中央オリフィスを規定する、容器(14)と、該容器内にスライド可能に配置されたプランジャー(18)であって、該プランジャーが、上壁に連結されて流体収容空間を規定する底壁(26)を有し、該上壁が、流体を収容するための開口部(29)を規定するように位置され構成される拘束部材 (28)を規定し、該開口部(29)が、該流体収容空間が該拘束部材(28)の開口部より上に位置されるような状態にシリンジが逆さにされた場合に、該流体収容空間に流体を保持するように適合される、プランジャー(18)と、該プランジャーに固定され、該容器の該第２の端部によって規定される中央オリフィスを通る延伸部材とを備える、遠心分離可能なシリンジ。２．前記第１の端部により規定される前記オリフィスが、その間を流れる流体のための無菌接続部を設けるのに適合した取り付け部(12)を備え、前記拘束部材(2 8)が、中央開口部を規定する環状部材である、請求項１に記載のシリンジ。３．流体サンプルがその中を流れる、前記取り付け部(12)に固定された中空針(1 3)をさらに備える、請求項２に記載のシリンジ。４．流体サンプルがその中を流れる、前記取り付け部(12)に固定された無菌化可能なチューブ(35)をさらに備え、該チューブが、無菌流体サンプル容器との連絡のために適合される、請求項２に記載のシリンジ。５．前記チューブ(35)がさらに流体サンプルリザーバ(33)に接続されている、請求項４に記載のシリンジ。６．前記流体収容空間に配置され、かつ前記容器内の前記拘束部材(28)より上のレベルまで延びる細胞分離媒体(20)をさらに備える、請求項１〜５のいずれかに記載のシリンジ。７．前記延伸部材が、前記プランジャーの底壁に固定された実質的に剛直なハンドル(16)を備える、請求項１〜６のいずれかに記載のシリンジ。８．前記ハンドル(16)が、前記プランジャーの底壁に再取り付け可能に固定されている、請求項７に記載のシリンジ。９．前記プランジャーが、前記容器の内径と係合し封止される外径(46)を有する円筒状のハウジングを備える、請求項１〜６のいずれかに記載のシリンジ。 10．前記シリンジ中の前記拘束部材(28)により規定された前記開口部が複数の開口部を備える、請求項１〜６のいずれかに記載のシリンジ。 11．以下の工程を包含する、流体標本の抽出および遠心分離方法：請求項１〜10のいずれかに記載の遠心分離可能なシリンジ(10)を設ける工程；前記プランジャー(18)内の流体収容空間を、該プランジャーの上壁より上のレベルまで細胞分離媒体(20)で充填する工程；サンプル(30)を、該シリンジ、および該細胞分離媒体上に引き入れる工程と、該シリンジ中の該サンプルが前記シリンジ容器の第２の端部に向かって引かれるように、該シリンジに遠心分離圧をかける工程；および該シリンジに遠心分離圧をかけた後に、該プランジャーの上壁の上に残っている該サンプルの一部を取り出す工程。