JPH10507636A

JPH10507636A - ラセミインデンオキシドの（１ｓ，２ｒ）−インデンオキシドへの生物分割

Info

Publication number: JPH10507636A
Application number: JP8514028A
Authority: JP
Inventors: チャートレイン，ミツシエル・エム; セナナヤケ，クリス・エイチ; ロサツザ，ジヨン・ピー・エヌ; ザン，ジンユー
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1994-10-21
Filing date: 1995-10-17
Publication date: 1998-07-28
Also published as: CA2203016A1; US5849568A; WO1996012818A1; EP0784698A1; EP0784698A4

Abstract

(57)【要約】ラセミインデンオキシド、即ちインダンのエポキシドの所望でない鏡像異性体を、ジプロジア・ゴシピナ(Diplo dia gossipinaＡＴＣＣ16391又はＡＴＣＣ10936のエポキシドヒドロラーゼの作用により加水分解する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ラセミインデンオキシドの（１Ｓ，２Ｒ）− インデンオキシドへの生物分割発明の背景本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によりコードされるプロテアーゼを阻害する化合物の中間体、及び特に、下記の実施例に記載の化合物Ｊ及びＫなどのある特定のオリゴペプチドアナログを合成する方法に関する。これらの化合物は、ＨＩＶ感染の予防、ＨＩＶ感染の治療、及び結果として罹患する後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療において価値がある。これらの化合物はまた、レニン及び他のプロテアーゼの阻害に有用である。本明細書に記載する発明は、以下のスキームで説明するラセミエポキシドの生物分割に関する。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と命名されているレトロウイルスは、免疫系の進行的破壊（後天性免疫不全症候群；ＡＩＤＳ）及び中枢と末梢神経系の変性を含む複雑な病気の病原体である。このウイルスは以前はＬＡＶ、ＨＴＬＶ−II I、又はＡＲＶと言われていた。レトロウイルス複製の共通の性質は、ウイルスアッセンブリと機能に必要な成熟ウイルスタンパク質を産生させる、ウイルスによってコードされるプロテアーゼによる前駆体ポリタンパク質の広範な翻訳後プロセシングである。このプロセシングの阻害は正常な感染性ウイルスの産生を防止する。例えば、Kohl,N.E.ら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.,85,4686(1988)は、ＨＩＶによってコードされるプロテアーゼの遺伝子的不活化により末成熟の非感染性ウイルス粒子ができることを証明した。これらの結果は、ＨＩＶプロテアーゼの阻害が、ＡＩＤＳの治療及びＨＩＶ感染の予防又は治療の実行できる方法の一例であることを示す。ＨＩＶのヌクレオチド配列は一つの読み枠の中のｐｏｌ遺伝子の存在を示す（ Ratner,L.ら、Nature,313,277(1985)）。アミノ酸配列相同性によると、ｐｏｌ配列は逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ及びＨＩＶプロテアーゼをコードする（ Toh,H.ら、 EMBO J.，4，1267(1985)；Power,M.D.ら、Science，231，1567(1986)；Pearl,L. H.ら、Nature，329，351(1987)）。本発明の新規中間体及び方法から製造できるある特定のオリゴペブチドアナログを含む最終化合物はＨＩＶプロテアーゼの阻害剤であり、1993年５月12日公開のＥＰＯ 541,168に開示されている。例えば、下記の実施例でも説明されている、該特許出願の化合物Ｊを参照せよ。本出願は、構造を有する１（Ｓ）−アミノ−２（Ｒ）−ヒドロキシインダニル側鎖を実質的にエナンチオマー純度で製造する改良方法を開示する。上記構造は、両方ともＨＩＶプロテアーゼの強力な阻害剤である化合物Ｊ及びＫの側鎖基である。合成によるラセミインデンオキシドからの１（＋／−）−アミノ−２（＋／− ）ヒドロキシインダンの非効率的製造が以前に試みられた。本出願人は、ジプロジア・ゴシビナ(Diplodia gossipina)ＡＴＣＣ16391又はＡＴＣＣ10936の細胞懸濁液と、ラセミインデンオキシドをインキュベーションして、構造を有する所望でない（１Ｒ，２Ｓ）インデンオキシドを加水分解する方法を提供する。発明の概要本発明は、１（Ｓ）−アミノ−２（Ｒ）−ヒドロキシインダンを生物変換で合成する新規方法を提供する。産物である化合物は、ＨＩＶプロテアーゼ、レニン及び他のプロテアーゼの阻害剤、例えば化合物Ｊ及びＫの合成に有用な化合物の中間体である。発明の詳細な説明本発明は、ＨＩＶプロテアーゼを阻害する化合物の中間体を合成する方法に関する。所望の中間体は、所望でないエナンチオマー（１Ｒ，２Ｓ）インダニルエポキシドを実質的に含まない（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドである。本発明において、（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドと（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの鏡像異性体の混合物からの実質的に１００％エナンチオマー過剰率の（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの合成方法であって、（ａ）緩衝液中の（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドと（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの鏡像異性体の相当量の混合物を提供すること；（ｂ）実質的に全ての（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドが消費されるまで、上記混合物と、エポキシドヒドロラーゼを有する菌類細胞の懸濁液とをインキュベートすること；及び（ｃ）得られた（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドを単離すること；の各工程を含む上記方法を記載する。一実施態様において、本発明の方法は、ジプロジア・ゴシピナ（Diplodia gos sipina ）又はラシジプロジア・テオブロマエ(Lasidiplodia theobromae)である菌類細胞に限定される。別の実施態様において、本発明の方法は、ＡＴＣＣ16391又はＡＴＣＣ10936由来であるDiplodia gossipinaに更に限定される。別の実施態様において、本発明の方法は、約１０％アセトニトリルを含む、約０．１Ｍトリス、ｐＨ約７．５の緩衝液中で行われる。別の実施態様において、本発明の方法は、（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドと（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの鏡像異性体の混合物からの実質的に１００％エナンチオマー過剰率の（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの合成方法であって、（ａ）約１０％アセトニトリルを含む、約０．１Ｍトリス、ｐＨ約７．５中で、上記混合物の濃度が約１ｇ／Ｌである、（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドと（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの鏡像異性体の相当量の混合物を提供すること；（ｂ）実質的に全ての（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドが消費されるまで、上記混合物と、Diplodia gossipinaＡＴＣＣ16391又はＡＴＣＣ10936由来の菌類細胞の懸濁液とをインキュベートすること；及び（ｃ）得られた（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドを単離すること；の各工程を含む上記方法である。緩衝液系が、基質エポキシドを安定化し、このエポキシドヒドロラーゼの酵素活性の保持を最適化する必要性を、本出願人らは見出した。最適の緩衝液系は、約１０％アセトニトリル中約０．１Ｍトリス、ｐＨ約７．５である。他の適切な緩衝液系は、当業者によって、容易に利用でき、容易に決定される。好適な生物変換微生物は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ1639 1）に寄託されたDiplodiagossipina(Diplodiagossypinaとも言われる)である。他の適切な菌類微生物には、Diplodia gossipinaとして分類され、ＡＴＣＣ1639 1に非常に類似しているLasidiplodia theobromaeＭＦ5215（ＡＴＣＣ10936）があるが、それに限定されない。ＡＴＣＣ16391寄託本出願の米国出願日前に、微生物Diplodia gossipinaのサンプルを American Type Culture Collection(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 に寄託した。菌受託番号は16391である。ブダペスト条約寄託への変換の申し込みは、1994年10月15日又はその頃になされた。この寄託はＡＴＣＣで少なくとも３０年間維持され、それを開示する特許が付与されれば一般に入手できるようになる。寄託の入手可能性は、政府が授与する特許権の適用制約において本発明を実施するライセンスを構成しないことを理解すべきである。ＡＴＣＣ10936寄託本出願の米国出願日前に、微生物Diplodia gossipinaのサンプルを American Type Culture Collection(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 に寄託した。菌受託番号は10936である。ブダペスト条約寄託への変換の申し込みは、1994年10月15日又はその頃になされた。この寄託はＡＴＣＣで少なくとも３０年間維持され、それを開示する特許が付与されれば一般に入手できるようになる。寄託の入手可能性は、政府が授与する特許権の適用制約において本発明を実施するライセンスを構成しないことを理解すべきである。ＡＴＣＣ16391及びＡＴＣＣ19036の一般的特徴形態的、培養的、生物的、生理的特徴を含む菌の特徴と分類を以下に簡単に記載する。ＡＴＣＣ16391及び10936の一般的特徴は、特に記載された場合を除いて同一である。なされた分類学的解析に基づき、両方の微生物をDiplodia gossypina 目（Dip lodia gossipina とも言われる）に帰属させた。Jones,J.P.，Mycotaxon 6，24- 26(1977)及び（編）CMI Description of Pathogenic Fungi and Bacteria N o．519（３頁）を参照せよ。各培養菌は、トリプティケース大豆寒天(２８℃及び３７℃)、酵母麦芽エキス寒天、グリセロールアスパラギン寒天、無機塩澱粉寒天、オートミール寒天、ツアペックドックス(Czapek Dox)、ツアペック溶液寒天とペプトン寒天、及びベネット寒天（全て２８℃）を含む慣用培地で良く生育する。オート(oat)寒天上のコロニーは、灰色がかったセピア〜マウス灰色〜黒、豊富な連続した菌糸体によりふわふわしている；裏面は暗灰色がかった黒〜黒である。分生子殻は、単純又は複雑、しばしば凝集、子座を有し、孔口を有し、しばしばとげだらけであり、最大５ｍｍの幅を有する。分生子柄は、透明、単純、時々有壁、まれに分岐した円筒状、分生子殻空洞に整列している細胞の内部層から起る。分生子形成細胞は、透明単純、円筒状〜subobpyriform、holoblastic ann elidicである。分生子は、最初は単細胞、透明、顆粒状、ほぼ卵形〜楕円-ooblo ng、厚壁、base truncateである；成熟分生子は、単一隔壁、シナモン〜鹿毛色、しばしば縦線のある、（１８−）２０−３０×１０−１５μである。側糸が存在するときは、それは透明、円筒状、時々有壁、長さは最大５０μである。葉、茎、果実体の分生子殻は、沈み、後に突出し、単純又はグループ分けされ、２−４ｍｍの幅であり、孔口を有し、しばしば有毛で、黒集団の中に突出している分生子を有する。宿主：約５００宿主植物に対する多数を宿主とする。潰瘍化ヒト角膜、病巣から、爪及び皮下組織からも分離された。病気：以下の病気の原因となる、又は関連する：立枯れ病(damping-off)、立枯れ病(wilt)、胴枯れ病(blight)、根腐敗病(dieback root rot)、カラー(collar) 腐敗病、茎壊死、ラバーのパネル壊死(panel necrosis of rubber)、異状樹脂分泌病、ジュートの黒帯病、切株腐敗病、幹腐敗病、サトウキビ腐敗病、葉斑点、天狗巣病、果実腐敗病（fruit blight）、果実腐敗病(fruitrot)、カカオのさや腐敗病、綿のさや腐敗病、種子腐敗病、カツサバ・サツマイモ・ヤマノイモの保存腐敗病。また、カカオのさし穂の損失及びラバーの出芽不能の原因となる。木材の青染色及びクレープゴムの青斑点の原因となる。地理的分布：世界中、但し主に北緯４０°〜南緯４０°に限られる。生理学的特徴：特異的でない毒性の腐敗病原体。一つの宿主からの分離菌は別の宿主にも感染できる。培養で区別できる幾つかの株が存在することが知られている。同化できる炭素源及び窒素源を含む水性栄養培地で、好ましくは深部好気条件下（例えば振盪培養、深部培養など）で、（１Ｒ，２Ｓ）インデンオキシド及び（１Ｓ，２Ｒ）インデンオキシドの混合物、又は他の適切な基質と共にＡＴＣＣ 16391株又はＡＴＣＣ10936株を培養して（発酵させて）、一般的に、実質的に１００％エナンチオマー過剰率の化合物（１Ｓ，２Ｒ）インデンオキシドを生産することができる。好ましくは、水性培地を、発酵工程の開始及び終了（収穫）のときにｐＨを約５．５に保つ。ｐＨがより高いと産物の実質的及び／又は総計の損失が生じる。モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）などの緩衝液の使用によって、又は下記の生産培地などの緩衝化特性を固有に有する栄養物質の選択によって、所望のｐＨを維持することができる。基質エポキシドの安定性を高めるために１０％アセトニトリルを添加することに注意されたい。あるいは、アセトニトリルの代わりに５−１５％ＥｔＯＨ、又はそれらの混合物を使用できる。１０−１５％ＴＨＦ、又は約５−１５％の任意のアルコール性溶媒などの他の安定性増強剤がある。あるいは、緩衝液にはリン酸塩がある。栄養培地の好適炭素源には、グルコース、キシロース、ガラクトース、グリセリン、澱粉、デキストリンなどの炭水化物がある。含めることができる他の源には、マルトース、ラムノース、ラフィノース、アラビノース、マンノース、サリシン、コハク酸ナトリウムなどがある。窒素の好適源は、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、グルテンミール、綿実ミール、大豆ミール、他の植物ミール（部分的又は全部の脱脂肪）、カゼイン加水分解物、大豆加水分解物、酵母加水分解物、コーンスチープリカー、乾燥酵母、小麦芽、フェザーミール(feather meal)、ピーナッツ粉、蒸留器可溶物など、並びにアンモニウム塩（例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなど）、尿素、アミノ酸などの無機及び有機の窒素化合物である。炭素源及び窒素源は、組合せて使用するのが有利であるけれども、純粋形態で使用する必要はない。微量の生長因子及び相当量の無機栄養物を含む、より純粋でない物質はまた使用に適しているからである。所望ならば、培地に、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩などの無機塩を加えてもよい。必要ならば、特に培養培地がかなり泡立つとき、脱泡剤、例えば液体パラフィン、脂肪油、植物油、無機油又はシリコーンを加えてもよい。（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの大量製造の条件に関しては、深部好気培養条件が好ましい。小量製造の場合は、フラスコ又は瓶での振盪又は表面培養を使用する。更に、大タンクで生育させる場合には、製造過程での生育ラグを避けるために、製造タンクへの植菌のために生物の増殖型を使用するのが好ましい。故に、“スラント”で産生された生物の胞子又は菌糸を比較的小量の培養培地に植菌し、“シード培地”とも言われる植菌された培地を培養して生物の増殖型植菌材料を最初に製造し、その後培養された増殖型植菌材料を無菌的に大タンクに移すことが好ましい。植菌材料が製造される発酵培地は一般的にオートクレーブされ、植菌前に滅菌される。一般的に、培地のｐＨを、オートクレーブ段階の前に約５．５に調整する。培養混合物の撹拌及び通気は種々の方法で達成されることができる。撹拌は、プロペラ又は同様の機械的撹拌装置により、又は発酵槽を回転又は振盪することにより、又は種々のポンプ装置又は培地への滅菌空気の通気により行うことができる。通気は、発酵混合物に滅菌空気を通過させて行うことができる。発酵は通常、温度約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、約１０〜６４時間、行われるが、発酵条件と規模に応じて異なりうる。好ましくは、生産培養液は２２０ｒｐｍのロータリーシェイカー上で約４８時間２８℃でインキュベートする。発酵を行う好適な培養／生産培地には次の培地がある。ＹＭＥｇ／Ｌ麦芽エキス２０酵母エキス３グルコース３ＣＦＭｇ／Ｌポテトデキストロースブロス２４酵母エキス３ＣＦＭ微量元素溶液１ｍｌＭＯＰＳ緩衝液、及びｐＨを7.0にするための水酸化ナトリウム２０微量元素溶液は以下のものを含む：ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．８ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ０．６４ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．１１ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ０．８ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．１５産物（１Ｓ，２Ｒ）インデンオキシドは、他の公知の物質の回収に通常使用される通常の方法によって培養培地から回収されることができる。製造された物質は、培養菌糸及び濾液に存在するので、培養ブロスの濾過又は遠心により得られる菌糸及び濾液から、減圧下濃縮、凍結乾燥、塩化メチレン又はメタノールなどの通常の溶媒による抽出、ｐＨ調整、通常の樹脂による処理（例えば、アニオン又はカチオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など）、通常の吸着剤による処理（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど）、結晶化、再結晶化などの通常の方法により単離精製できる。好適な方法は溶媒抽出、特に塩化メチレンを使用する溶媒抽出である。組成物本発明の中間体から合成される産物化合物を、通常の非毒性の医薬として許容可能な担体、アジュバント及びベヒクルを含む投与単位組成物の形態で、経口的、非経口的（皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、胸骨内注射、又は輸液技術を含む）、吸入噴霧、又は直腸内に投与できる。本発明の方法及び中間体は、ＨＩＶプロテアーゼの阻害、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染の予防又は治療、ＡＩＤＳなどの結果として起こる病理学的状態の治療に有用である最終産物である化合物の製造に有用である。ＡＩＤＳの治療又はＨＩＶ感染の予防もしくは治療は、ＨＩＶ感染の広範な状態、即ちＡＩＤＳ、症状の有るものと無いもののＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連症候群）、ＨＩＶとの実際の接触又は接触の可能性、を治療することを含むがそれらに限定されないものとして定義される。例えば、本発明の方法及び中間体から製造できる最終産物である化合物は、例えば輸血、器官移植、体液交換、かみ傷、注射針を刺す事故、又は手術中の患者血液との接触などによる過去にＨＩＶと接触した可能性の後のＨＩＶ感染を治療するのに有用である。最終産物であるＨＩＶプロテアーゼ阻害剤はまた、対照としての使用を含む、抗ウイルス化合物のスクリーニングアッセイの調製及び実行に有用である。例えば、最終産物である化合物は、より強力な抗ウイルス化合物の優れたスクリーニングの道具である酵素の変異体を単離するのに有用である。更に、このような化合物は、例えば競合阻害によって、ＨＩＶプロテアーゼへの他の抗ウイルス剤の結合部位を確立又は決定することにおいて有用である。したがって、本発明の方法及び中間体から製造される最終産物である化合物は、これらの目的のために販売されるはずの市販品である。本発明の中間体及び方法から製造できるＨＩＶプロテアーゼ阻害化合物は、ＥＰＯ 541,168に開示されている。ＨＩＶプロテアーゼ阻害化合物は、医薬担体と治療上有効量の化合物又は医薬として許容可能なその塩を含む医薬組成物として、このような治療の必要のある患者に投与されることができる。ＥＰＯ 541, 168は、適切な医薬組成物、投与経路、化合物の塩形態及び投与量を開示する。本発明の化合物は、不斉中心を有しうるし、ラセミ化合物、ラセミ混合物、及び個々のジアステレオマー又は鏡像異性体として存在しうるが、すべての異性体形態は本発明に含まれるものとする。鏡像異性体の混合物には１：１混合物、及び例えば１：４、４：３、２：１などの任意の他の混合物がある。新規方法を利用する代表的実験方法を以下に詳述する。これらの方法は例としてだけであり、本発明の新規方法に限定を置くものではない。実施例１Ａ．化学試薬及び培地ＫＦ培地をシード培地として、ＹＭＥを生産培地として使用した。使用したすべての組成を表１に列挙する。Ｔｒｉｓ緩衝液[Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン]を生物変換のために使用した。Ｂ．シード工程ＹＭＥ／寒天スラントからの一白金耳の細胞を、シード培地５０ｍｌを含む２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに植菌した。培養液を、ロータリーシェイカー（２２０ｒｐｍ）上で２８℃で４８時間好気的にインキュベートした。Ｃ．生産工程シード培養液３ｍｌを、生産培地５０ｍｌを含む邪魔板のある２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに植菌した。培養液を、ロータリーシェイカー（２２０ｒｐｍ）上で２８℃で４８時間好気的にインキュベートした。Ｄ．スクリーニング法菌類培養液を、上記条件下に培養した。細胞を、遠心により得て、０．１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５で２度洗浄した。更に、１０％アセトニトリルを含む０．１ＭＴｒｉｓ／ｐＨ７．５で一度細胞を洗浄し、パックされた細胞容積：緩衝液／溶媒比を１．５：１にして、同一の緩衝液／溶媒系に再懸濁した。ラセミエポキシド（アセトニトリルに溶解）１ｇ／Ｌを細胞懸濁液に加え、生物変換を開始させた。反応を、振動シェーカー(oscillatory shaker)上、室温で行い、一定の間隔でのサンプリングよりモニターした。サンプルを２部に分け、一部を、エナンチオマー過剰率（ｅｅ）分析のためにヘプタンで抽出し、もう一部をエポキシドの濃度測定のために直接希釈した。Ｅ．逆相アッセイサンプル中のエポキシドの濃度を測定するために、逆相ＨＰＬＣカラム(４．６ｍｍ×２５ｃｍ)、ＵＶ検出器、溶媒デリバリー用に装着した２個のポンプを使用した。６０％（ｖ／ｖ）０．０１Ｍリン酸カリウム／ｐＨ７．５及び４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルからなる移動相を用いるアイソクラティック方法により、流速１．０ｍｌ／分で、エポキシド濃度を分析した。検出を２２０ｎｍのＵＶ吸収で行った。２種のエポキシド鏡像異性体（１Ｓ，２Ｒ及び１Ｒ，２Ｓ）がクロマトグラムで単一のピークとして出現し、そのためサンプル中の総エポキシドが測定可能となった。Ｆ．エポキシドキラルアッセイ本アッセイには、１Ｓ，２Ｒ及び１Ｒ，２Ｓ鏡像異性体を良好に分離する正常相カラムを用いた。自動サンプラー、ＵＶ検出器、溶媒デリバリー用の２個のポンプを装着したＨＰＬＣカラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、コンピューター制御プログラムによるＨＰＬＣ分析のために使用した。移動相は、９７％ヘキサン及び３％イソプロパノールからなっており、流速は１．０ｍｌ／分であった。溶出液を２３０ｎｍでモニターした。実施例２菌スクリーニング文献(J．Org．Chem.，58，5533-5536，(1993))に基づき、菌類株を選択し、所望の酵素を求めてスクリーニングした。８種の培養液を試験し、それらの１０％が所望でない１Ｒ，２Ｓエポキシドを優先的に加水分解し、１Ｓ，２Ｒ鏡像異性体含量を高めることが知見された（表１）。Diplodia gossipinaＡＴＣＣ16391及びLasiodiplodia theobromae ＭＦ5215は最強の活性のエポキシドヒドロラーゼを有し、４時間の反応の間１００％エナンチオマー過剰率を与えた。実施例３エポキシドの生物分割での培養齢の影響培養齢はＡＴＣＣ16391の生物分割活性に影響するようには考えられなかった。何故ならば、２〜９日培養から収穫した細胞は全て、４時間反応後、ラセミエポキシドを完全に分割できたからであった。しかし、培養齢は、表２に示すようにいくつかの他の菌による生物分割に影響を与えた。AspergillusnigerＭＦ1909の場合、２日培養は最高の酵素活性を有したが、より古い培養では確実に減少した。Aspergillus caespitosur ＭＦ1664は、生育４日後最高酵素活性を有した。ＭＦ1667の活性は大きく培養齢に依存したが、最高ｅｅ％は４−５日齢細胞によってのみ達成されることができた。実施例４エポキシドの生物分割への培養培地の影響６種の別の培養培地をＡＴＣＣ16391を用いて試験した。すなわち、最小、ペプトン、ＫＦ、ＣＳＬ、ＣＦＭ、ＹＭＥ（表３）であった。最小培地では最小の生物変換であり、ＹＭＥ及びＣＦＭでは最良であった。実施例５Ｎ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−フェニルメチル−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−（１−（４−（３−フロ［２，３−ｂ］−ピリジルメチル）−２（Ｓ）−Ｎ′−（ｔ−ブチルカルボキサミド）ピペラジニル））−ペンタンアミドの製造ジメチルホルムアミド１２ｍＬ中に溶解したＮ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−フェニルメチル−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５（−２（ｓ）−Ｎ′−（ｔ−ブチルカルボキサミド）ピペラジニル））ペンタンアミド（６．５０ｇ，１２．４８ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン下、３−クロロメチルフロ−［２，３−ｂ］ピリジン塩酸塩（２．８０ｇ，１３．７２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（５．２１ｍＬ，３７．４４ｍｍｏｌ）を加えた。１８時間後、反応混合液を酢酸エチル４００ｍＬに希釈し、飽和ＮａＨＣＯ₃（１×２５ｍＬ）、水（５×２０ｍＬ）、ブライン（１×２５ｍＬ）で洗浄した。溶液をＭｇＳＯ₄で脱水し、濾過し、濃縮し、油状物を得た。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（６０×１５０ｍｍカラム、グラジエント溶出、ＣＨ₂Ｃｌ₂ ：ＮＨ₃飽和ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ６０：３９：１．０（１０００ｍＬ）、６０：３８：２（１５００ｍＬ）、６０：３７：３（１５００ｍＬ）、６０：３６：４（１５００ｍＬ））で精製した。得られた泡状物を酢酸エチル中で滴定し、所望の産物を濾過し、６５℃で高真空下一晩乾燥させ、白色結晶固体５．３０ｇを得た。カラムクロマトグラフィーからの画分を一緒にし、再精製して、より多くの産物を得ることができた。ｍ．ｐ．１８３．５ −１８４．５℃。¹ ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ８．２５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３２−７．１０（ｍ，９Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），５．９５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２７（ｄｄ，Ｊ＝８．５，４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２７−４．２６（ｍ，１Ｈ），４．１２（ｂｒｓ，１Ｈ），３．８９−３．８３（ｍ，１Ｈ），３．５１（ｓ，２Ｈ），３．２９（ｄｄ，Ｊ＝１７．５，４．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１６（ｄｄ，Ｊ＝３．６６，３．４８Ｈｚ，１Ｈ），３．１５（ｄｄ，Ｊ＝６．６，５．１Ｈｚ，１Ｈ），２．９４−２．５０（ｍ，１１Ｈ），２．３６−２．３４（ｍ，１Ｈ），１．６６（ｓ，１Ｈ），１．６２−１．４７（ｍ，１Ｈ），１．３５（ｓ，９Ｈ）。分析Ｃ₃₈Ｈ₄₇Ｎ₅Ｏ₅として計算値Ｃ，６９．８１；Ｈ，７．２５；Ｎ，１０．７１実測値Ｃ，６９．４６；Ｈ，７．２２；Ｎ，１０．６９。実施例６Ａ．フロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸の製造キノリン３ｍｌ中のフロ［２，３−ｂ］ピリジン−２，５−ジカルボン酸（０．３６ｇ，１．４８４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ａｒ下、Ｃｕ粉（１８０ｍｇ，２．８２ｍｍｏｌ）を加え、１．５時間２１０℃に暖めた。反応液を室温に冷却し、塩化メチレン５０ｍＬで希釈し、セライトで濾過した。有機層を飽和ＮａＣＯ₃ で抽出し（２×４０ｍＬ）、３ＮＨＣｌでｐＨ３に調整し、濾過し、黄褐色の固体８０ｍｇを得た。水層をエーテル／メタノール（８５／１５）（３×５０ｍＬ）で抽出し、ブラインで洗浄し（１×１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で脱水し、濾過し、濃縮して産物を更に３５ｍｇ得た。¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）δ８．８９（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）。Ｂ．メチルフロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボキシレートの製造メタノール４０ｍＬに溶解したフロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸（３．０ｇ，１８．４０ｍｍｏｌ）に、クロロホルム１６０ｍＬ、次にトリメチルシリルジアゾメタン（４２ｍＬ，ヘキサン中１０％溶液）をゆっくりと加えた。０．５時間後、４滴の氷酢酸を加え、反応混合物を濃縮した。これにより、オフホワイトの固体として３．２０ｇを得た。¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ９．０２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．６０（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ）。Ｃ．５−ヒドロキシメチルフロ［２，３−ｂ］ピリジンの製造フレーム乾燥の５００ｍＬの丸底フラスコに、ＴＨＦ９０ｍＬ中に溶解したメチルフロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボキシレート（３．２０ｇ，１８．０８ｍｍｏｌ）をチャージし、０℃に冷却した。この液に水素化ジイソブチルアルミニウム（４６ｍＬ，４６．１ｍｍｏｌ，ヘキサン中の１Ｍ溶液）を１０分かけて加え、冷却浴を取除いた。４時間後、反応混合液を０℃に冷却し、ロシェル塩でゆっくりと反応を止めた（１００ｍＬ）。更なる１８時間後、層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出した（４×４０ｍＬ）。一緒にした有機層を、ブライン（１×２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で脱水し、濾過し、濃縮した。残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（４０×１５０ｍｍカラム、グラジエント溶出、ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＮＨ₃飽和ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ６０：３９：１．０（１０００ｍＬ）、６０：３８：２（１０００ｍＬ）、６０：３７：３（１０００ｍＬ）、６０：３６：４（１０００ｍＬ））により精製した。これにより、白色固体２．１６ｇを得た。¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ８．１９（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７８（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，２Ｈ），４．６９（ｂｒｓ，１Ｈ）。Ｄ．３−クロロメチルフロ［２，３−ｂ］ピリジン塩酸塩の製造０℃に冷却した塩化メチレン９ｍＬに溶解した５−ヒドロキシメチルフロ［２，３−ｂ］ピリジンの溶液に、塩化チオニル（４．２３ｍＬ，５７．９９ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を取除き、１時間後反応混合液を濃縮し、オフホワイトの固体２．８６ｇを得た。¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ８．４０（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７４（ｓ，２Ｈ）。実施例７アミド９の製造熱電対プローブ、機械的攪拌子、窒素入口アダプター、バブラーを備えた５０Ｌの丸底フラスコ中、乾燥ＴＨＦ（ＫＦ＝５５ｍｇ／ｍＬ）（ＫＦは水のカールフィシャー滴定を表す）１７．８Ｌ中の（−）−シス−１−アミノインダン−２ −オ−ル（８８４ｇ，５．９３ｍｏｌ）とトリエチルアミン（８６８ｍＬ，６．２２ｍｏｌ）の溶液を１５℃に冷却した。それから、塩化３−フェニルプロビオニル（１０００ｇ，５．９３ｍｏｌ）を７５分間かけて加えた。その間、氷−水冷却浴で内部温度を１４−２４℃に保った。添加後、混合液を３０分間１８−２０℃に放置し、（−）−シス−１−アミノインダン−２−オールの消失を見るためにＨＰＬＣ分析でチェックした。反応の進行を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析でモニターする。２５ｃｍＤｕｐｏｎｔＣ８−ＲＸカラム、６０：４０アセトニトリル／１０ｍＭ（ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄）、１．０ｍＬ／分、注入量＝２０ｍＬ、検出＝２００ｎｍ、サンプル調製＝５００倍希釈。およその保持時間：保持時間（分）同定６．３シス−アミノインダノール反応液を、ピリジニウムｐ−トルエンスルホネート（２４１ｇ，０．９６ｍｏｌ，０．１６当量）で処理し、１０分間攪拌した（サンプル１ｍＬの等量の水での希釈後の混合液のｐＨは４．３−４．６である）。その後、２−メトキシプロペン（１．２７Ｌ，１３．２４ｍｏｌ，２．２当量）を加え、反応液を２時間３８−４０℃に加熱した。反応混合液を２０℃に冷却し、酢酸エチル（１２Ｌ）と５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（１０Ｌ）で分配した。混合液を攪拌し、両層を分離した。酢酸エチル抽出液を５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（１０Ｌ）と水（４Ｌ）で洗浄した。酢酸エチル抽出液を大気圧蒸留で乾燥させ、溶媒をシクロヘキサンに変換した（総量約３０Ｌ）。蒸留と濃縮の終わりに（酢酸エチル抽出液容量の２０容量％）、熱シクロヘキサン溶液をゆっくりと２５℃に冷却し産物を結晶化させた。得られたスラリーを更に１０℃に冷却し、１時間放置した。産物を濾過で分離し、湿ったケーキを冷（１０℃）シクロヘキサン（２×８００ｍＬ）で洗浄した。洗浄したケーキを４０℃で真空下（Ｈｇ２６″）乾燥させ、アセトニド９を１．６５ｋｇ得た（８６．４％、ＨＰＬＣで９８エリア％）。¹ＨＮＭＲ（３００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，主要回転異性体）δ７．３６−７．１４（ｍ，９Ｈ），５．０３（ｄ，Ｊ＝４．４，１Ｈ），４．６６（ｍ，１Ｈ），３．１５（ｍ，２Ｈ），３．０６（ｂｒｓ，２Ｈ），２．９７（ｍ，２Ｈ），１．６２（ｓ，３Ｈ），１．３７（ｓ，３Ｈ）；¹³ＣＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，主要回転異性体）δｃ１６８．８，１４０．９，１４０．８，１４０．６，１２８．６，１２８．５，１２８．４，１２７．１，１２６．３，１２５．８，１２４．１，９６．５，７８．６，６５．９，３８．４，３６．２，３１．９，２６．５，２４．１。分析Ｃ₂₁Ｈ₂₃ＮＯ₂として計算値Ｃ，７８．４７；Ｈ，７．２１；Ｎ，４．３６実測値Ｃ，７８．６５；Ｈ，７．２４；Ｎ，４．４０。実施例８エポキシド１１製造、トシレート方法熱電対、機械的攪拌子、更なる漏斗、窒素入口アダプター、を備えた５０Ｌの４首丸底フラスコ中、ＴＨＦ（ＫＦ＝２２ｍｇ／ｍＬ）１５．６Ｌ中のアセトニド９（１０００ｇ，３．１１ｍｏｌ）と２（Ｓ）−グリシジルトシレート１０（８５３ｇ，３．７４ｍｏｌ，１．２当量）の溶液を真空−窒素パージにより３回脱気して、−５６℃に冷却した。それから、リチウムヘキサメチルジシラジド（ＬｉＮ［ＣＨ₃］₃Ｓｉ］₂）（２．６Ｌ，１．３８Ｍ，１．１５当量）を２時間かけて加えた。その間、内部温度を−５０〜−４５℃に保った。反応混合液を− ４５〜−４０℃で１時間攪拌し、それから１時間 −２５℃に暖めた。混合液を−２５〜−２２℃で４時間攪拌する（又は出発アセトニドが３．０エリア％になるまで）。反応の進行をＨＰＬＣ分析でモニターする。２５ｃｍ×４．６ｎｍＺｏｒｂａｘＳｉｌｉｃａカラム、ヘキサン中２０％酢酸エチル、２．０ｍＬ／分、注入量＝２０ｍＬ、検出＝２５４ｎｍ、サンプル調製＝１００倍希釈。およその保持時間：保持時間（分）同定５．５アミド９６．５グリシジルトシレート１０１３．５エポキシド１１反応液の反応を、−１５℃の脱イオン水（６．７Ｌ）で止め、酢酸エチル（１０Ｌ）で分配した。混合液を攪拌し、層を分離した。酢酸エチル抽出液を、１％ＮａＨＣＯ₃水溶液（５Ｌ）と飽和ＮａＣｌ（０．５Ｌ）の混合液で洗浄した。酢酸エチル抽出液（２８．３Ｌ）を真空蒸留し（Ｈｇ２８″）濃縮し、更なる酢酸エチルを加え、酢酸エチルへの溶媒交換を完全に行った（最終容量１１．７Ｌ）。酢酸エチル濃縮液を更にＭｅＯＨへ溶媒交換を行い、産物を結晶化させ、最終容量３．２Ｌまで濃縮した。メタノール１０Ｌをチャージし、蒸留液を１０Ｌ集めて、残った酢酸エチル溶媒を除去した。残渣のスラリーを２２℃で攪拌し、それから５℃に冷却し、０．５時間放置した。産物を濾過により分離し、湿ったケーキを冷メタノールで洗浄した（２×２５０ｍＬ）。洗浄したケーキを真空（Ｈｇ２６″）乾燥し、エポキシド１１を７２７ｇ得た（６１．２％、ＨＰＬＣでの主要エポキシド９８．７エリア％）。¹³ＣＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ１７１．１，１４０．６，１４０．５，１３９．６，１２９．６，１２８．８，１２８．２，１２７．２，１２６．８，１２５．６，１２４．１，９６．８，７９．２，６５．８，５０．０，４８．０，４４．８，３９．２，３７．４，３６．２，２６．６，２４．１。実施例９ペナルチメート１４の製造機械的攪拌子、還流コンデンサー、蒸気浴、テフロンでコートされた熱電対、窒素流入口を備えた４口の７２Ｌの丸底フラスコ中、イソプロパノール（２−プロパノール，１８．６Ｌ）中の２（ｓ）−ｔ−ブチルカルボキサミド−４−Ｎ− Ｂｏｃ−ピペラジン１２（１９５０ｇ，６．８３ｍｏｌ，＞９９．５％ｅｅ）（ｅｅ＝エナンチオマー過剰率）とエポキシド１１（２４５６ｇ，４Ｓ／Ｒエポキシドの９７．５：２．５混合物）のスラリーを加熱還流した（内部温度は８４− ８５°Ｃであった）。４０分後、均一な溶液を得た。混合液を２８時間加熱還流した。還流の間、内部温度は８４−８５℃であった。反応の進行をＨＰＬＣ分析でモニターした。２５ｃｍＤｕｐｏｎｔＣ８−ＲＸカラム、６０：４０アセトニトリル／１０ｍＭ（ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄）、１．０ｍＬ／分、検出＝２２０ｎｍ、サンプル調製物＝２μＬ，反応混合液をアセトニトリル中１ｍＬに希釈した。およその保持時間：保持時間（分）同定４．８ピペラジン１２８．９エポキシド１１１５．２結合産物１３２８時間後、残余のエポキシド１１と結合産物１３は、ＨＰＬＣ分析でそれぞれ１．５エリア％、９１−９３エリア％であった。混合液を０−５℃に冷却し、６ＮＨＣｌ２０．９Ｌを、温度を１５℃末満に保ちながら加えた。添加を終えた後、混合液を２２℃に暖めた。ガスの発生がこの時点で起こる（イソブチレン）。混合液を６時間２０−２２℃で放置した。反応の進行をＨＰＬＣ分析でモニターした。上記と同一の条件。およその保持時間：保持時間（分）同定７．０シス−アミノインダノール１１．９ペナルチメート１４１５．１結合産物１３混合液を０℃に冷却し、５０％ＮａＯＨ７．５Ｌをゆっくりと加え、混合液のｐＨを１１．６に調整した。添加の間、温度を２５℃未満に保った。混合液を酢酸エチル（４０Ｌ）と水（３Ｌ）の間で分配した。混合液を攪拌し、層を分離した。有機層（６０Ｌ）を減圧下（Ｈｇ２９″）濃縮し、溶媒をＤＭＦに交換し、最終容量１０．５Ｌ（ＫＦ＝１．８ｍｇ／ｍＬ）に濃縮した。ＨＰＬＣ分析による酢酸エチル中の１４の収率は８６．５％であった。ＤＭＦ中のペナルチメート(penultimate)化合物１４を、更に精製せすに次の工程で直接使用した。単離された１４について：¹³ＣＮＭＲ（７５．４ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ１７５．２，１７０．５，１４０．８，１４０．５，１３９．９，１２９．１，１２８．５，１２７．９，１２６．８，１２６．５，１２５．２，１２４．２，７３．０，６６．０，６４．８，６２．２，５７．５，４９．５，４７．９，４６．４，４５．３，３９．６，３９．３，３８．２，２８．９。実施例１０化合物Ｊの一水和物の製造ＤＭＦ（１０．５Ｌ，ＫＦ＝１０ｍｇ・ｍＬ）中の、前記工程からの１４の溶液に、分子ふるいで乾燥したＤＭＦ（ＫＦ３０ｍｇ／Ｌ末満）８Ｌを加え、混合液を真空（Ｈｇ３０″）下蒸気浴で加熱し、主に水及び／又は残りのイソプロパノール又は酢酸エチル溶媒を蒸留で除去した。最終濃縮容量は１３．５Ｌ（ＫＦ＝１．８ｍｇ／ｍＬ）であり、それから、トリエチルアミン（２．８６Ｌ，２０．５１ｍｏｌ）、次に塩化３−ピコリル塩酸塩（９６％，１２８７ｇ，７．８４ｍｏｌ）を２５℃の溶液に加えた。得られたスラリーを６８℃に加熱した。反応の進行をＨＰＬＣ分析で、上記工程と同一の条件を用いて追跡した。およその保持時間：保持時間（分）同定２．７ＤＭＦ４．２塩化３−ピコリル４．８化合物Ｊ９．１ペナルチメート１４ＨＰＬＣ分析で残りのペナルチメート化合物１４が０．３エリア％末満になるまで、混合液を６８℃で放置した。混合液を６８℃で４時間攪拌し、その後２５℃に冷却し、酢酸エチル（８０Ｌ）と飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液２４Ｌ及び蒸留水（１４Ｌ）の混合液で分配した。混合液を５５℃で攪拌し、層を分離した。酢酸エチル層を、５５℃で水（２０Ｌ）で３回洗浄した。洗浄した酢酸エチル層を、最終ポット容量３０Ｌまで大気圧下濃縮する。大気圧濃縮の終わりに、水（５６０ｍＬ）を熱溶液に加え、混合液を５５℃に冷却し、化合物Ｊ一水和物の種を入れた。混合液を４℃に冷却し、濾過し、産物を集めた。産物を冷酢酸エチル（２×３Ｌ）で洗浄し、２５℃でハウス(house)真空下で乾燥し、化合物Ｊ一水和物を白色固体として２９０５ｇ（７０．７％）を得た。実施例１１ピラジン−２−tert−ブチルカルボキサミド１７２−ピラジンカルボン酸（８）：３．３５Ｋｇ（２７ｍｏｌ）塩化オキサリル：３．４６ｋｇ（２７．２ｍｏｌ） tert-ブチルアミン（ＫＦ＝４６０μｇ／ｍｌ）：９．３６Ｌ（８９ｍｏｌ）ＥｔＯＡｃ（ＫＦ＝５６μｇ／ｍｌ）：２７ＬＤＭＦ：１２０ｍＬ１−プロパノール：３０Ｌ７２Ｌの３首フラスコ中の、ＥｔＯＡｃ２７ＬとＤＭＦ１２０ｍＬ中のカルボン酸１６をＮ₂下機械的に攪拌しながら懸濁し、懸濁液を２℃に冷却した。温度を５〜８℃に保ちながら、塩化オキサルを加えた。添加を５時間で終えた。発熱添加の間、ＣＯとＣＯ₂が発生した。生成したＨＣｌは溶液に大部分残った。恐らくピラジン酸クロリドのＨＣｌ塩である沈殿物が存在した。酸クロリドの生成のアッセイを、ｔ−ブチルアミンとの反応の無水サンプルをクエンチすることで行った。反応の終わった後、酸１６の０．７％未満が残った。酸クロリド生成の終わりのアッセイは重要である。何故ならば、不完全な反応により、不純物であるビス-tert-ブチルオキサミドが生成されるからである。反応をＨＰＬＣでモニターできる：２５ｃｍＤｕｐｏｎｔＺｏｒｂａｘＲＸＣ８カラム、流速１ｍＬ／分、検出２５０ｎｍ；０．１％Ｈ₃ＰＯ₄水溶液が９８％と２％ＣＨ₃ＣＮ〜５０％Ｈ₃ＰＯ₄水溶液と５０％ＣＨ₃ＣＮの３０分間のリニアグラジエント、保持時間：酸１６＝１０．７分、アミド１７＝２８．１分。反応混合液を５℃で１時間放置した。得られたスラリーを０℃に冷却し、tert −ブチルアミンを、内部温度が２０℃末満に保つ速度で加えた。反応が非常に発熱性であるので、添加には６時間を要した。生成したtert-ブチルアンモニウム塩酸塩の小部分を、ふわふわした白色固体として反応液から除いた。混合液を更に３０分１８℃で放置した。沈殿したアンモニウム塩を濾過で除去した。フィルターケーキをＥｔＯＡｃ１２Ｌで洗浄した。一緒にした有機層を３％ＮａＨＣＯ₃６Ｌと飽和ＮａＣｌ水溶液（２×２Ｌ）で洗浄した。有機層をＤａｒｃｏＧ６０炭素２００ｇで処理し、ＳｏｌｋａＦｌｏｋでろ過し、ケーキをＥｔＯＡｃ４Ｌで洗浄した。炭素処理で効率的に産物のやや紫色を除去した。１７のＥｔＯＡｃ溶液を１０ｍｂａｒで最初の容量の２５％に濃縮した。１− プロパノール３０Ｌを加え、２０Ｌの最初の容量になるまで、蒸留を続けた。この時点で、ＥｔＯＡｃは¹ＨＮＭＲの検出限界以下であった（１％未満）。この溶媒交換の内部温度は３０℃未満であった。３の１−プロパノール／ＥｔＯＡｃ溶液は、数日間大気圧還流で安定であった。アリコートの蒸発により、黄褐色の固体を得た。ｍ．ｐ．８７−８８℃。¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，ｐｐｍ）１６１．８，１４６．８，１４５．０，１４３．８，１４２．１，５１．０，２８．５。実施例１２ｒａｃ−２−tert−ブチル−カルボキサミド−ピペラジン１８原料１−プロパノール溶液１２Ｌ中のピラジン−２−tert−ブチルカルボキサミド１７（２．４ｋｇ，１３．４ｍｏｌ）、２０％Ｐｄ（ＯＨ）₂／Ｃ１６ｗｔ％，水１４４ｇ。ピラジン−２−tert−ブチルカルボキサミド１７／１−プロパノール溶液を５ｇａｌのオートクレーブに入れた。触媒を加え、混合液を、Ｈ₂ ４０ｐｓｉ（３気圧）、６５℃で水素化した。２４時間後、反応液は水素の理論量を取り込んでおり、ＧＣは１７が１％未満であることを示した。混合液を冷却し、Ｎ₂でパージし、ＳｏｌｋａＦｌｏｃで濾過して触媒を除去した。触媒を暖かい１−プロパノール２Ｌで洗浄した。フィルターケーキ洗浄の間、暖かい１−プロパノールを使用することによって、濾過は改良され、フィルターケーキ上の産物の損失は低減された。反応をＧＣでモニターした。３０ｍＭｅｇａｂｏｒｅカラム、１００〜１６０℃、１０℃／分、５分保持、それから１０℃／分で２５０℃まで、保持時間：１７＝７．０分、１８＝９．４分。溶媒としてＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（５０：５０）、発色剤としてニンヒドリンを用いるＴＬＣによっても反応をモニターできた。アリコートの蒸発によって、アミド化と水素化にわたる収率は８８％であり、１８の濃度は１３３ｇ／Ｌであることが分かった。アリコートを蒸発させて、１８を白色固体として得た。ｍ．ｐ．１５０−１５１℃；¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ，ｐｐｍ）１７３．５，５９．８，５２．０，４８．７，４５．０，４４．８，２８．７。実施例１３（Ｓ）−２−tert−ブチル−カルボキサミド−ピペラジンビス（Ｓ）−カンフルスルホン酸塩（Ｓ）−１９原料ｒａｃ−２−tert−ブチル−カルボキサミド−ピペラジン１８：４．１０ｋｇ（２２．１２ｍｏｌ）１−プロパノール中：２５．５ｋｇ溶媒中（Ｓ）−（＋）−１０−カンフルスルホン酸：１０．０ｋｇ（４３．２ｍｏｌ）１−プロパノール：１２Ｌアセトニトリル：３９Ｌ水：２．４Ｌ１−プロパノール中のアミン１８の溶液を、付属のバッチ濃縮器を備えた１００Ｌフラスコに加えた。溶液を１０ｍｂａｒ、温度２５℃末満で、約１２Ｌまで濃縮した。この時点で、産物は溶液から沈殿し、混合液を５０℃まで加熱すると、溶解した。均一なアリコートの分析により、１８の濃度は３４１ｇ／Ｌであることが分かった。濃度をＨＰＬＣで測定した。２５ｃｍＤｕｐｏｎｔＺｏｒｂａｘＲＸＣ８カラム、流速１．５ｍＬ／分、検出２１０ｎｍ，アイソクラティック（９８／２）ＣＨ₃ＣＮ／０．１％Ｈ₃ＰＯ₄水溶液。１８の保持時間２．５分。アセトニトリル（３９Ｌ）と水（２．４Ｌ）を加え、清澄なわずかに茶色の溶液を得た。ＫＦ滴定による水含量の測定と¹ＨＮＭＲによるＣＨ₃ＣＮ／１−プロパノール比の測定によって、ＣＨ₃ＣＮ／１−プロパノール／Ｈ₂Ｏ比は、２６／８／１．６であることが分かった。溶液の濃度は７２．２ｇ／Ｌであった。（Ｓ）−１０−カンフルスルホン酸を２０℃で４部に分けて３０分かけて加えた。ＣＳＡの添加後、温度は４０℃に上がった。数分後、厚い白色沈殿が生じた。白色スラリーを７６℃に加熱し、全ての固体を溶解させた。それから、わずかに茶色の溶液を８時間にわたって２１℃に冷却した。産物は６２℃で沈殿した。産物を２１℃で直ちに濾過し、フィルターケーキをＣＨ₃ＣＮ／１−プロパノール／Ｈ₂Ｏ２６／８／１．６溶媒混合液５Ｌで洗浄し、Ｎ₂供給下真空オーブンで３５℃に乾燥させ、１９を白色結晶性固体として５．６ｋｇ（３９％）を得た。ｍ．ｐ．２８８−２９０℃（分解）。［α］Ｄ²⁵＝１８．９°（ｃ＝０．３７，Ｈ₂Ｏ）。¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ，ｐｐｍ）２２２．０，１６４．０，５９．３，５４．９，５３．３，４９．０，４８．１，４３．６，４３．５，４３．１，４０．６，４０．４，２８．５，２７．２，２５．４，１９．９，１９．８。以下のキラルＨＰＬＣアッセイによれば、産物のｅｅは９５％であった。１９のアリコート（３３ｍｇ）を、ＥｔＯＨ４ｍＬとＥｔ₃Ｎ１ｍＬに懸濁した。Ｂｏｃ₂Ｏ（１１ｍｇ）を加え、反応混合液を１時間放置した。溶媒を、完全に真空除去し、残渣をＥｔＯＡｃ約１ｍＬに溶解し、ＳｉＯ₂入りのパスツールピペット、溶離液としてＥｔＯＡｃを用いて濾過を行った。蒸発させた産物分画を約１ｍｇ／ｍＬの濃度でヘキサン中に溶解させた。ヘキサン／ＩＰＡ（９７：３）溶媒系、流速１ｍＬ／分、検出２２８ｎｍのＤａｉｃｅｌＣｈｉｒａｃｅｌｌＡＳカラム上で鏡像異性体を分離した。保持時間：Ｓ対掌体＝７．４分、Ｒ＝９．７分。実施例１４塩１９からの（Ｓ）−２−tert−ブチルカルボキサミド−４−tert−ブトキシカルボニル−ピペラジン１２原料（Ｓ）−２−tert−ブチル−カルボキサミド−ピペラジンビス（Ｓ）−（＋）−ＣＳＡ塩１９，９５％ｅｅ：５．５４ｋｇ（８．５３ｍｏｌ）ジ−tert−ブチルジカーボネート：１．８６ｋｇ（８．５３ｍｏｌ）Ｅｔ₃Ｎ：５．９５Ｌ（４２．６ｍｏｌ）ＥｔＯＨ純度２００プルーフ：５５ＬＥｔＯＡｃ：２ＬＮ₂下、更なる漏斗を備えた１００Ｌの３首フラスコ中の（Ｓ）−ＣＳＡ塩１９に、２５℃でＥｔＯＨ、次にトリエチルアミンを加えた。Ｅｔ₃Ｎの添加で固体は容易に溶解した。Ｂｏｃ₂ＯをＥｔＯＡｃに溶解させ、更なる漏斗に加えた。ＥｔＯＡｃ中のＢｏｃ₂Ｏ溶液を、温度を２５℃未満に保つ速度で加えた。添加には３時間を要した。Ｂｏｃ₂Ｏ溶液の添加が終わった後、反応混合液を１時間放置した。反応をＨＰＬＣでモニターできる。２５ｃｍＤｕｐｏｎｔＺｏｒｂａｘＲＸＣ８カラム、流速１ｍＬ／分、検出２２８ｎｍ、アイソクラティック（５０／５０）ＣＨ₃ＣＮ／０．１ＭＫＨ₂ＰＯ₄（ＮａＯＨでｐＨ＝６．８に調整）。１２の保持時間＝７．２分。キラルアッセイを、前記工程と同一の系を用いて行った。溶媒として１００％ＥｔＯＡｃを用いるＴＬＣでも反応をモニターできた（Ｒｆ＝０．７）。その後、真空下（１０ｍｂａｒ）バッチタイプの濃縮器で、内部温度２０℃末満で、溶液を約１０Ｌに濃縮した。ＥｔＯＡｃ２０Ｌ中にゆっくりと流れ出させ、約１０Ｌに再濃縮させて、溶媒交換を行った。反応混合液を、ＥｔＯＡｃ６０Ｌの入った抽出器で洗浄した。有機層を、５％ＮａＣＯ₃水溶液１６Ｌ、脱イオン水(2×１０Ｌ)、飽和塩化ナトリウム水溶液 (2×６Ｌ)で洗浄した。一緒にした水層をＥｔＯＡｃ２０Ｌで逆抽出し、有機層を、水（２×３Ｌ）、飽和塩化ナトリウム水溶液(2×４Ｌ)で洗浄した。一緒にしたＥｔＯＡｃ抽出液を、１００Ｌのバッチタイプ濃縮器で、１０ｍｂａｒ真空下、２０℃未満の内部温度で濃縮し、約８Ｌにした。シクロヘキサンへの溶媒交換を、シクロヘキサン約２０Ｌ中にゆっくりと流出させ、約８Ｌに再濃縮することで行った。スラリーに、シクロヘキサン５ＬとＥｔＯＡｃ２８０ｍＬを加え、混合液を加熱還流し、全てを溶解させた。溶液を冷却し、種（１０ｇ）を５８℃ で加えた。スラリーを４時間で２２℃に冷却し、２２℃で１時間放置の後、産物を濾過により分離した。フィルターケーキをシクロヘキサン１．８Ｌで洗浄し、Ｎ₂供給下３５℃での真空オーブンで乾燥し、１２をわずかに黄褐色の粉として１．８７ｋｇを得た（７７％，ＨＰＬＣで９９．９エリア％を超える、Ｒ−異性体は検出限界末満）。［α］Ｄ²⁵＝２２．０°（ｃ＝０．２０，ＭｅＯＨ），ｍ．ｐ．１０７℃；¹³ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，ｐｐｍ）１７０．１，１５４．５，７９．８，５８．７，５０．６，４６．６，４３．６，４３．４，２８．６，２８．３。実施例１５フレーム乾燥の５０ｍＬの丸底フラスコ中に、ヨウ化物２ｂ（６．８２ｍｍｏｌ）、続いてＰｄ（ＯＡｃ）₂（０．０６８２ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（０．１３７ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（０．１３７ｍｍｏｌ）を加えた。全ての固体を逐次的に加え、わずかにＮ₂圧力下、ＴＨＦ（１１．０ｍＬ）に懸濁した。フェニルアセチレン（７．６４ｍｍｏｌ）、ｎ−ＢｕＮＨ₂（１３．７ｍｍｏｌ）を加え、緑色の均一溶液を得た。それから、Ｎ₂圧力下反応混合液を密封し、＋４０℃で２２−２４時間加熱した。この時点で出発物質エチルエステルの消費とアセチレン付加物の生成が観察された。反応混合液をそれから＋６３℃に４４−４８時間加熱し、その時点でアセチレン付加物は所望のフロピリジンに変換した。その後、反応混合液を塩化メチレン（５０ｍｌ）とＥＤＴＡ二ナトリウム（５％水溶液，５０ｍｌ）で分配した。その後、有機抽出液を、重亜硫酸ナトリウム（１０％水溶液，５０ｍＬ）、続いて０．１ＮＨＣｌ（５０ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。その後、有機抽出液を、ＭｇＳＯ₄で脱水し、濾過し、真空濃縮した。その後、粗物質を、１２：１ヘキサン−ＥｔＯＡｃを使用して、ＳｉＯ₂上のフラッシュクロマトグラフィーにかけ、単離収率７８％で所望の産物を得た。実施例１６ヨウ化物(１．７６ｇ，６ｍｍｏｌ)、Ｐｄ(ＯＡｃ)₂（１３．５ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）、ＰＰｈ₃（３１．５ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（２２．９ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）を、Ｎ₂下、丸底フラスコ中に固体として加え、続いてｎ−ＢｕＮＨ₂（１．２ｍＬ，１２．０ｍｍｏｌ）、プロパニルメチルエーテル（０．５６ｍＬ，６．６ｍｍｏｌ）を加え、緑色の均一溶液を得、それを４５− ５０℃に４８時間加熱した。ＨＰＬＣ分析により、出発物質が存在しなくなったとき、混合液をＣＨ₂Ｃｌ₂とＥＤＴＡ二ナトリウム（５％水溶液）で分配し、有機層を、重亜硫酸ナトリウム水溶液、０．５ＮＨＣｌ、ＮａＨＣＯ₃（水溶液）で逐次洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ₄で脱水し、濾過し、真空濃縮し、それからクラマトグラフィーを行い（フラッシュ−グレードのＳｉＯ₂、３：１ヘキサン−ＥｔＯＡｃ）、産物１．０７ｇを得た（７６％）。実施例１７乾燥ＴＨＦ１２．９Ｌ中に、エステル（５４７．６ｇ，２．８７ｍｏｌ）を溶解し、−７℃に冷却し、純粋の水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ）１．１１Ｌで処理した。このとき、温度が−５〜−６℃を超えないようにする。ＴＬＣにより、出発物質が完全に消費されたことが判明したとき（約３５分）、飽和Ｎａ，Ｋ酒石酸（Ｈ₂Ｏ２０Ｌ中のＮａ，Ｋ酒石酸１０ｋｇ）を、温度が−４℃未満に維持されるように加えた（“塩”溶液約８Ｌを加えた）。冷却を止め、混合液の脱気ができるように、混合液を４０℃に２時間加熱した。層を分離し、酢酸イソプロピルエステル１２Ｌを加え、更なるＮａ，Ｋ酒石酸２Ｌで洗浄し、層を分離し、有機層をＨ₂Ｏ２Ｌで洗浄する。有機層をＭｇＳＯ₄で脱水し、濾過し、ヘキサン−１ＰＡＣから再結晶化し、アルコール７８０．３ｇを得る。実施例１８アルコール（７８０ｇ，４．８１ｍｏｌ、純度により補正）を、ＣＨ₂Ｃｌ₂１６Ｌに溶解し、溶液を−２℃に冷却した。ＳＯＣｌ₂を１５分かけて加えた。このとき、温度が０℃を超えないようにした。溶液を２時間１５℃に暖めた。このとき、ＨＰＬＣアッセイによると出発物質は残っていなかった。ＮａＨＣＯ₃水溶液１６Ｌをゆっくりと加えると、二相性混合液を得た。有機相を分離し、活性炭（ＤａｒｃｏＧ−６０）４０ｇと無水Ｎａ₂ＳＯ₄１ｋｇで処理し、濾過し、真空濃縮し、所望の塩化物８５０．７ｇを得た。実施例１９ラセミインデンオキシドの製造インデン（９５％，１２２ｍＬ）を、メタノール（８１２ｍＬ）とアセトニトリル（３４８ｍＬ）に溶解し、濾過した。濾液を０．０５Ｍ二塩基性リン酸ナトリウム（１１６ｍＬ）で希釈し、それから１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．５に調整した。過酸化水素水溶液（３５％，１０５ｍＬ）を水（５３ｍＬ）で希釈し、３時間かけて加えた。この間温度を２５℃に保ち、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（合計１２０ｍＬ）で内部ｐＨを１０．５に維持した。６時間後、１Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム水溶液（２６ｍＭ）を加えた。その間１ＭＮａＯＨ水溶液の添加（３９ｍＬ）によりｐＨを８．３を超えるように保った。水（７００ｍＬ）を加え、混合液を塩化メチレンで抽出した（５８０ｍＬ及び３００ｍＬ）。インデンオキシド（１１７ｇ）を含む一緒にした有機抽出液を６００ｍＬの容量まで濃縮した。上述の明細書は本発明の原則を教示し、実施例は例示を示すが、本発明の実務は、以下の請求の範囲及びその等価物の範囲内にある、通常の変化、適用、又は改変の全てを包含することを理解するであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者セナナヤケ，クリス・エイチアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ロサツザ，ジヨン・ピー・エヌアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ザン，ジンユーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドと（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの鏡像異性体の混合物からの実質的に１００％エナンチオマー過剰率の（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの合成方法であって、（ａ）緩衝液中の（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドと（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの鏡像異性体の相当量の混合物を提供する；（ｂ）実質的に全ての（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドが消費されるまで、上記混合物と、エポキシドヒドロラーゼを有する菌類細胞の懸濁液とをインキュベートする；及び（ｃ）得られた（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドを単離する；工程を含む上記方法。２．菌類細胞がジプロジア・ゴシピナ（Diplodia gossipina）又はラシジプロジア・テオブロマエ(Lasidiplodia theobromae)であることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．上記細胞がＡＴＣＣ16391又はＡＴＣＣ10936由来であることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．上記緩衝液が、約１０％アセトニトリルを含む、約０．１Ｍトリス、ｐＨ約７．５であることを特徴とする請求項１に記載の方法。５．（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドと（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの鏡像異性体の混合物からの実質的に１００％エナンチオマー過剰率の（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの合成方法であって、（ａ）約１０％アセトニトリルを含む、約０．１Ｍトリス、ｐＨ約７．５中で、上記混合物の濃度が約１ｇ／Ｌである、（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドと（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの鏡像異性体の相当量の混合物を提供する；（ｂ）実質的に全ての（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドが消費されるまで、上記混合物と、ジプロジア・ゴシピナ(Diplodia gossipina)ＡＴＣＣ16391由来の菌類細胞の懸濁液とをインキュベートする；及び（ｃ）得られた（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドを単離する；工程を含む上記方法。６．（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドと（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの鏡像異性体の混合物からの実質的に１００％エナンチオマー過剰率の（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの合成方法であって、（ａ）約１０％アセトニトリルを含む、約０．１Ｍトリス、ｐＨ約７．５中で、上記混合物の濃度が約１ｇ／Ｌである、（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドと（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドの鏡像異性体の相当量の混合物を提供する；（ｂ）実質的に全ての（１Ｒ、２Ｓ）インダニルエポキシドが消費されるまで、上記混合物と、ジプロジア・ゴシピナ(Diplodia gossipina)ＡＴＣＣ10936由来の菌類細胞の懸濁液とをインキュベートする；及び（ｃ）得られた（１Ｓ，２Ｒ）インダニルエポキシドを単離する；工程を含む上記方法。