JPH10507341A - Isolation and production of catalytic antibodies using phage technology - Google Patents

Isolation and production of catalytic antibodies using phage technology

Info

Publication number
JPH10507341A
JPH10507341A JP7525622A JP52562295A JPH10507341A JP H10507341 A JPH10507341 A JP H10507341A JP 7525622 A JP7525622 A JP 7525622A JP 52562295 A JP52562295 A JP 52562295A JP H10507341 A JPH10507341 A JP H10507341A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
phage
library
catalytic
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
JP7525622A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
ロジャー ジー． スミス，
ジョン マッカフェーティ，
デイビッド チスウェル，
マイケル ジェイ． ダースリー，
ケビン フィッツジェラルド，
ジョン エイチ． ケンテン，
マーク ティー． マーティン，
リチャード シー． ティトマス，
リチャード オー． ウィリアムズ，
Original Assignee
アイジェン， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アイジェン， インコーポレイテッド filed Critical アイジェン， インコーポレイテッド
Publication of JPH10507341A publication Critical patent/JPH10507341A/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0002—Antibodies with enzymatic activity, e.g. abzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 バクテリオファージから、ヒト触媒性抗体を含む触媒性抗体を産生する方法が開示されそして請求されている。この方法は、触媒性抗体のクローニング、選択、スクリーニング、および単離を必要とする。ファージ技術から作成される産物自体、すなわち触媒性抗体も、開示されそして請求されている。さらに、ファージ技術から産生されそしてプロドラッグの活性化に有用な触媒性抗体が開示されそして請求されている。そして最後に、本発明はまた、ホスホネートに対する触媒性抗体の産生も理解する。   (57) [Summary] Methods for producing catalytic antibodies, including human catalytic antibodies, from bacteriophages are disclosed and claimed. This method requires the cloning, selection, screening, and isolation of a catalytic antibody. The products themselves from phage technology, ie, catalytic antibodies, are also disclosed and claimed. Further, catalytic antibodies produced from phage technology and useful for prodrug activation are disclosed and claimed. And finally, the invention also understands the production of catalytic antibodies to phosphonates.

Description

【発明の詳細な説明】 ファージ技術を用いる触媒性抗体の単離および産生 関連出願についての参考 本出願は、1991年7月10日の国際出願日、1992年1月23日の公開日を有する国際 出願 WO 92/01047（PCT/GB91/01134）の一部継続出願であり、そして米国が指定 国であり、この国際出願 WO 92/01047（PCT/GB91/01134）は本明細書中に参考と して援用されている。 発明の分野 本発明は、バクテリオファージ上に提示される触媒性抗体の単離および産生に 関し、そしてより特定には、ヒト触媒性抗体の単離および産生に関する。本発明 はまた、プロドラッグの活性化に使用するための触媒性抗体の単離および産生に 関する。本発明はさらに、遷移状態のアナログに結合する触媒性抗体の産生に関 する。 発明の背景 モノクローナル抗体は、慣例的に、特定の特異性を有する生物学的機能性抗体 分子の１つの形態を分泌する単一の免疫グロブリン産生細胞由来の不死化哺乳動 物細胞株を樹立することにより作成される。この抗体分泌哺乳動物細胞株が不死 化されているので、抗体の特徴付けはバッチからバッチへ再生可能である。モノ クローナル抗体の重要な特性は、特定の抗原に対する特異性、および製造され得 る再生可能性である。 構造的には、最も単純な抗体（IgG）は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジ スルフィド結合により連結された２つの重(Ｈ)鎖および２つの軽(Ｌ)鎖を含む。 軽鎖には、Ｋ（カッパ）およびλ（ラムダ）と呼ばれる２つの異なる形態がある 。各鎖は定常領域(Ｃ)および可変領域(Ｖ)を有する。各鎖は一連のドメインに組 み立てられる。軽鎖は２つのドメインを有し、１つはＣ領域に対応しそして他は Ｖ 領域に対応する。重鎖は４つのドメインを有し、１つはＶ領域に対応しそして３ つのドメイン（１、２、および３）はＣ領域にある。抗体は２つのアーム（各ア ームはFab領域である）を有し、それらのそれぞれは互いに関連するVLおよびVH 領域を有する。このＶ領域の対（VLおよびVH）は、１つの抗体と別の抗体とは異 なり（アミノ酸配列の改変のため）、そしてともに抗原を認識して抗原結合部位 （ABS）を提供する原因である。さらにより詳細には、各Ｖ領域は４つのフレー ムワーク領域（FR）により分断された３つの相補性決定領域（CDR）から形成さ れる。CDRは、可変領域のうちの最も可変の部分であり、そして重要な抗原結合 機能を行う。CDR領域は、組換え、変異、および選択を包含する複合プロセスを 介して多くの潜在的な生殖系列配列に由来する。 結合抗原の機能が抗体全体のフラグメントにより行われ得ることが示されてい る。結合フラグメントの例は、(i)VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなるFab フラグメント；(ii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント；(iii)抗体の 一本のアームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント；(iv)VHドメインか らなるdAbフラグメント（Wardら、Nature 341(1989):544-546）；(v)単離したCD R領域；および(vi)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２つのFabフラ グメントを含む二価フラグメントである、F(ab')2フラグメントである。 Fvフラグメントの２つのドメインが別の遺伝子によりコードされているが、組 換え法により、それらを単一のタンパク質鎖（単鎖Fv(scFv)として公知；Birdら 、Science 242(1988):423-426；Hustonら、Proc ．Natl．Acad．Sci.，USA 85(19 88):5879-5883）として作成させ得る合成リンカーを作成できることが証明され ている。これらのscFvフラグメントは、既に単離されているモノクローナルから の遺伝子から組み立てられた。発明者らの先の出願（WO 92/01047）において、 既に単離された抗体の一部ではないVHおよびVLドメインからのscFvフラグメント を組み立てるためのプロセスを記載している。 モノクローナル抗体、そのフラグメント、および誘導体は非常に有益であるが 、それにもかかわらすそれらに関連する多くの制限がある。第１に、ヒト不死化 細胞株により産生されたモノクローナル抗体の治療的適用は、広範な病気の処置 に大きな見込みがある（Lennox、Clinical Applications of Monoclonal Anitib od ies 、British Medical Bulletin 1984）。不運にも、不死化抗体産生ヒト細胞株 は樹立するのが非常に難しく、そしてそれらは抗体の収率が低い（約１μg/ml） 。対照的に、同量の齧歯類細胞株は、高量の抗体を得る（約100μg/ml）。しか し、これらの外来の齧歯類タンパク質のヒトへの繰り返しの投与は有害な過敏反 応を生じ得る。結果として、これらの齧歯類由来のモノクローナル抗体は治療的 使用が制限されている。 第２に、モノクローナル抗体の単離における重要な局面は、所望の特異性特徴 を有する抗体を産生する細胞を単離するために、種々の特異性を有する抗体産生 細胞のどれだけの異なるクローンが、サンプリングされるに理論的にどれだけ必 要とされるかと比較して、実際に樹立されてサンプリングされ得るかということ である（Milstein、Royal Soc．Croonian Lecture、Proc ．R．Soc．London B. 2 39(1990):1-16）。例えば、マウスの免疫系のリンパ球により任意の１つの時点 において発現される異なる特異性の数は約107であると考えられ、そしてこれは 可能な特異性のレパートリーのほんの少ない割合でしかない。しかし、所望の特 異性を有する代表的な抗体産生細胞の単離の間、研究者は103〜104の個別の特異 性をサンプリングし得るのみである。この問題は、ヒトにおいていっそう悪く、 この場合約1012リンパ球特異性を有するが、103または104のサンプリングでの制 限が残る。 この問題は、免疫療法の使用により実験動物においてある程度まで軽減されて いる。したがって、特定のエピトープに対する特異性を有するモノクローナル抗 体を産生しようとする場合、動物をそのエピトープを発現する免疫原で免疫する 。次いで、この動物は、免疫原に対する免疫応答を高め、そしてこのエピトープ に対する特異性を有するリンパ球が増殖する。所望の特異性を有するリンパ球の この増殖のため、サンプリング手順においてそれらを検出することがより容易に なる。しかし、このアプローチは、適切な免疫原が入手可能であり得ないので、 すべての場合で成功するわけではない。さらに、ヒトモノクローナル抗体を（例 えば、治療投与のために）産生しようとする場合、このようなアプローチは実際 にまたは倫理的に実行できそうにない。 発明者らの先の出願（WO 92/01047）において、発明者らは、大きな生物学的 機能性の結合分子（例えば、抗体フラグメント、酵素、およびレセプター）を表 面に発現および提示し、そしてインタクトかつ感染性のままであるバクテリオフ ァージを構築する方法を記載している。発明者らは、ウイルス粒子およびこのウ イルス表面で提示される結合分子を含む構造物を、「パッケージ」と称した。結 合分子が抗体、抗体の誘導体もしくはフラグメント、または免疫グロブリンドメ インと相同であるドメインである場合、発明者らはこのパッケージを「ファージ 抗体」（pAb）と称した。しかし、文脈が他を記載する以外は、ファージ抗体と いう用語が一般的に用いられる場合、それはまた、ウイルス粒子およびこのウイ ルス表面で提示される生物学的機能性の結合分子を含むあらゆるパッケージをい うと解釈された。WO 92/01047の最初の出願以来、機能的抗体およびバクテリオ ファージの表面で発現される他のタンパク質ドメインの多くの例が、文献および 別の特許出願の両方に報告されている。 不死化された細胞の細菌細胞での「ファクトリー」としてのこの簡単な置換は 、バクテリオファージの表面で発現される大量の結合分子を調製するための手順 をかなり簡単にする。さらに、細胞（例えば、ハイブリドーマおよびＢ細胞）か ら抗体産生配列を単離するためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅（Saikiら、Science 239(1988):487-491）の使用は、結合特異性が単離され得るタイムスケ ールを早める大きな可能性がある。ファージ抗体発現ライブラリーは、バクテリ オファージ発現ベクター中に増幅したVHおよびVL遺伝子を直接クローニングする ことにより、容易に生成され得る。さらに、バクテリオファージを基礎とする組 換え産生システムは、注文作成の抗体およびそのフラグメントを産生するための 余地がある。例えば、結合機能とエフェクター機能との新規な組み合わせを有す るキメラ分子、ヒト化抗体（例えば、ヒト定常ドメインと組み合わせたマウス可 変領域、または、ヒトFR上に移植したマウス抗体CDR）、および新規な抗原結合 分子を産生することが可能である。このファージを基礎とするシステムの重要な 利点は、所望の結合特異性に対して直接的な組換え抗体を直接的にスクリーニン グする能力があることである。 組換えVHおよびVLファージライブラリーを生成するにおいて、いくつかの問題 について述べられる必要がある。例えば、マウスにおいて、約107の可能なＨ鎖 および107の可能なＬ鎖がある。したがって、Ｈ鎖およびＬ鎖の1014の可能な組 み合わせがあり、このような数の組み合わせのいずれかをテストするためには、 約1014クローンのライブラリーを生成し、そしてスクリーニングしなくてはなら ない。これについて、これまでは実際的な可能性はなかった。PCT/GB92/00883お よびPCT/GB92/01755出願（これらは参考として本明細書中に援用されている）は 、この問題を改善する多くのアプローチを開示している。これらの出願はそれぞ れ、発明者らの国際出願 WO 92/01047の一部継続出願である。 さらに、抗体活性部位の加工のために既に開発されている多くの分子生物学的 技術は、既述のファージ抗体ライブラリーアプローチと組み合わせて適用され得 る。これらの技術には、CDR内残基の部位特異的変異誘発、すべてまたは一部のC DRのランダムアミノ酸配列への置換、CDR領域がCDR領域のライブラリーで本質的 に置換されるCDRシャッフリングが挙げられる。pAbの使用もまた、全合成抗体の 構築を可能にし得る。さらに、いくつかの合成配列（例えば、CDR）およびいく つかの天然由来の配列を有する抗体が作成され得る（例えば、PCT/BG92/06372を 参照のこと）。例えば、Ｖ遺伝子レパートリーは、再配列されていないＶ遺伝子 をＤおよびＪセグメントと組み合わせることによりインビトロで作成され得た。 次いで、pAbのライブラリーは、抗原への結合により選択され、抗原結合ループ またはＶドメインフレームワーク領域においてインビトロで過剰変異され、そし て選択および変異誘発のさらなるラウンドに供され得る。 pAbは、抗原結合活性をコードする抗体遺伝子の選択において適用の範囲を有 する。適用の１つの特に刺激的な領域は、触媒特性を有する抗体（触媒性抗体） の開発である。触媒性抗体は、Schochetmanらの米国特許第4,888,281号；Kimら の米国特許第4,963,355号；およびSchochetmanらの米国特許第5,037,750号に記 載されており、これらはすべて本明細書中に参考として援用されている。これら に開示されているように、触媒性抗体は、酵素の触媒能力を抗体の結合能力とを 兼ね備える。 現在までに記載されたすべての触媒性抗体は、モノクローナル抗体技術を用い て生成されている。そのプロセスの詳細は当業者に周知である。代表的な方法と しては、第１に、適切な抗原でマウスを免疫することが挙げられる。抗原は、所 望の反応物；ペプチドまたは他のキャリア分子に結合した所望の反応物；反応中 間体または反応物のアナログ；あるいは、産物または反応中間体であり得る。 本明細書で用いられる「アナログ」という用語は、異性体、ホモログ、遷移状 態アナログ、または化学構造の点で反応物に十分に類似している他の化合物を包 含し得る。このようなアナログに対して惹起された抗体は、反応物との免疫学的 反応に関連し得るが、アナログの反応を必ずしも触媒しない。 多くの異なるタイプの抗体触媒がこの技術で開発されたが、所望の特異性につ いてのハイブリドーマを樹立しそしてスクリーニングするに必要な時間がかなり 重要である。 所望の特異性が十分にまれである場合、この所望の特異性を回収するに十分な ハイブリドーマ細胞株をサンプリングすることは実際的でないかまたは不可能で あり得る。 さらに、現在は、完全なヒト触媒性抗体を作成するための適切なハイブリドー マを基礎とする技術はない。 本発明の方法はまた、ある生物学的機能の活性化を生じる切断を引き起こすた めに用いられ得る。 このような反応はペプチド結合の切断を包含するが、エステル結合またはグリ コシド結合または他のタイプの結合も包含し得る。 生物学的機能の活性化を生じる生体分子の切断の１つの例は、インスリン依存 性糖尿病の処置である。患者は、注射によりインスリンを自分で投与する。循環 中へのインスリンの放出が天然の膵臓のインスリン放出の薬物速度論を模倣する インスリン処方物の開発へのこれまでの試みは、成功することが証明されていな い。インスリンは、プロ型のプロインスリンで膵臓に存在し、その活性はインス リン自体よりも多くの桁数低い強さである。プロインスリンからインスリンへの 変換を生じるペプチド結合に特異的な抗体プロテアーゼは、その速度論的特徴が プロインスリンと抗体プロテアーゼとの注射後にインビボでインスリンを放出さ せるように設計され得る。これはプロドラッグの活性化の例であり、この場合薬 物は天然のタンパク質ホルモンである。プロドラッグは、生物学的機能の活性化 または不活性化を生じる多くの治療的活性分子を包含し得る。プロ型は、薬物の 天然の改変またはその適切な合成改変のいずれかを利用し得る。低い活性（治療 的に有用または毒性である）を有する適切な薬物誘導体は、適切な触媒性抗体で 改変され、活性化形態に変換される。このプロセスの特定の例が、1989年5月4日 に出願されたPCT/US89/01951に記載されており、これは本明細書中に参考として 援用されている。 発明の要旨 本発明の１つの目的は、化学反応速度を触媒的に上昇させ得る、ファージ上に 提示される触媒性抗体を産生および単離する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、以下に概説するいくつかの異なる方法の１つによってヒ ト触媒性抗体を産生することである。 本発明のさらなる目的は、遷移状態アナログ、ホスホネート、およびRT3に結 合する抗体エピトープを提示するファージを単離することである。 本発明のさらに他の目的は、変異誘発、鎖シャッフリング、およびCDRシャッ フリング、またはこれらの手順の種々の組み合わせを包含するいくつかの異なる 方法の１つによって、遷移状態アナログ、ホスホネート、およびRT3を結合する 抗体（マウスまたはヒト由来）から触媒性抗体を産生することである。 そして最後に、本発明のさらに他の目的は、プロドラッグ活性化に使用するた めの触媒性抗体を産生することである。 したがって、本発明は、ファージ上に提示される触媒性抗体を産生する方法を 提供し、以下の工程を包含する： (a)抗体由来ドメインの遺伝子ライブラリーを生成する工程； (b)ファージ発現ベクター中に上記ドメインをコードするものを挿入する工程 ；および (c)上記触媒性抗体を単離する工程。 本発明はさらに、ファージ上に提示される触媒性抗体を単離する方法を提供し 、以下の工程を包含する： (a)抗原を調製する工程； (b)上記抗原で免疫する工程； (c)上記免疫した動物からVHおよびVLドメインのライブラリーを生成する工程 ； (d)ファージディスプレイ抗体を生成するためにファージ発現ベクター中に上 記VHおよびVLドメインをクローニングする工程； (e)上記抗原に特異的に結合するファージディスプレイ抗体を選択する工程； (f)基質に対する触媒活性について上記選択されたファージディスプレイ抗体 をスクリーニングする工程；および (g)上記触媒性抗体を単離する工程。 本発明はさらに、ファージ上に提示される触媒ヒト抗体を単離する方法を提供 し、以下の工程を包含する： (a)抗原を調製する工程； (b)VHおよびVLドメインのライブラリーを生成する工程； (c)ファージディスプレイ抗体を生成するためにファージ発現ベクター中に上 記VHおよびVLドメインをクローニングする工程； (d)上記抗原に特異的に結合するファージディスプレイ抗体を選択する工程； (e)基質に対する触媒活性について上記選択したファージディスプレイ抗体を スクリーニングする工程；および (f)上記触媒性抗体を単離する工程。 本発明はさらに、鎖シャッフリングを介してファージ上に提示される触媒性抗 体を産生する方法を提供し、以下の工程を包含する： (a)鎖シャッフルされたライブラリーを形成するためにVL遺伝子のライブラリ ーをVH遺伝子と組み合わせる工程； (b)シャッフルされた鎖をクローニングする工程； (c)ファージ上で上記触媒性抗体を発現させる工程； (d)抗原に対して選択する工程；および (e)触媒活性についてスクリーニングする工程。 本発明はさらに、CDRシャッフリングを介してファージ上に提示される触媒性 抗体を産生する方法を提供し、以下の工程を包含する： (a)VLおよびVH遺伝子を単離する工程； (b)CDR領域のライブラリーを単離する工程； (c)CDRシャッフルされたライブラリーを生成するために上記VLおよびVH遺伝子 を上記CDR領域のライブラリーと再度組み合わせる工程；および (d)上記CDRシャッフルされたライブラリーをクローニングする工程； (e)ファージ上で上記CDRシャッフルされたライブラリーを発現させる工程； (f)抗原に対して選択する工程；および (g)触媒活性についてスクリーニングする工程。 本発明はさらに、インプリンティングを介してファージ上に提示される触媒性 抗体を産生する方法を提供し、以下の工程を包含する： (a)抗体のセットを選択する工程； (b)上記抗体からVH遺伝子のセットおよびVL遺伝子のセットを単離する工程； (c)２つの組み合わせライブラリーを形成するために、上記VHのセットをVLの ライブラリーと組み合わせ、そして上記VLのセットをVHのライブラリーと組み合 わせる工程； (d)上記組み合わせライブラリーをクローニングする工程； (e)上記ライブラリーをファージ上で発現させる工程； (f)抗原に対して選択する工程； (g)VHおよびVL遺伝子の選択されたライブラリーを単離する工程； (h)上記VHおよひVL遺伝子のライブラリーを組み合わせる工程； (i)上記組み合わされたライブラリーをクローニングする工程； (j)上記組み合わされたライブラリーをファージ上で発現させる工程； (k)抗原に対して再選択する工程；および (l)触媒活性についてスクリーニングする工程。 本発明はさらに、インビボで分子内の特定の結合の切断または形成速度を上昇 させる方法を提供し、ファージ由来の触媒性抗体の有効量を動物に導入する工程 を包含する。 本発明はさらに、プロドラッグのインビボでの活性化の方法を提供し、以下の 工程を包含する： (a)プロドラッグを患者に導入する工程であって、上記プロドラッグが、切断 されて、この薬物の活性形態を放出する化学結合を有する、工程；および (b)上記プロドラッグ中の上記結合を切断し得るファージ由来の触媒性抗体の 有効量を上記患者に導入する工程。 図面の簡単な説明 請求の範囲に定義される本願発明は、本明細書および図面を参照してより容易 に理解され得る。 図１から図４は、それぞれ、化合物７（RT3ハプテン）、化合物８、化合物１ ２および化合物１５およびそれらの中間体の合成の反応スキームを示す。 図５は、His-6 オリゴをpHEN-OX16に挿入してpHEN-OX16hisllを作製する、プ ラスミド構築物を示す。 図６はクマーシーで染色したSDSポリアクリルアミドゲルを示す： (a)1mlの細胞からの全ペリプラズムタンパク質。 (b)結合マトリックス添加後の、1mlの細胞の非結合画分。 (c)1mlの細胞に相当する、マトリックスに結合し溶出した画分。 (d-f)は5mlの細胞に相当する精製した画分である。 (d)PBS+1M NaCl、250mMイミダゾールで溶出したpOX16-his-11抗体フラグメ ント。 (e)PBS、250mMイミダゾールで溶出したpOX16-his-11抗体フラグメント。 (f)PBS+1M NaCl、250mMイミダゾールで溶出したpSCFv4his-6抗体フラグメン ト。 図７は、C末端his-6ペプチドをコードするpCANTABベクターを示す。 図８は、選択されたマウスRT3ファージ抗体とハプテン(RT3)、ハプテン部分（ RT3AおよびRT3B）、あるいは産物の部分（Prod AおよびProd B）との競合アッセ イ結果を示す。 図９は、マウス由来RT3ファージ抗体からの、軽鎖パターンＡおよび軽鎖パタ ーンＣの遺伝子配列を示す。 図１０は、マウス由来RT3ファージ抗体からの、軽鎖パターンＢ、Ｄ、および Ｉの遺伝子配列とマウス生殖系列との整列を示す。 図１１は、マウス由来RT3ファージ抗体からの、軽鎖パターンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ 、およびＩの遺伝子配列の比較を示す。 図１２は、マウス由来RT3ファージ抗体からの、重鎖パターンＡの遺伝子配列 を示す。 図１３は、マウス由来RT3ファージ抗体からの、重鎖パターンＢ、およびＤの 遺伝子配列とマウス生殖系列との整列を示す。 図１４は、マウス由来RT3ファージ抗体からの、重鎖パターンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ 、およびＩの遺伝子配列の比較を示す。 図１５Ａは、クローン18からのIMACで純粋なscFvの触媒性アッセイのHPLCクロ マトグラムを示す。 図１５Ｂは、クローン18からのIMACで純粋なscFvの触媒性アッセイ（＋RT3ハ プテン）のHPLCクロマトグラムを示す。 図１５Ｃは、pH 9.0での触媒性RT3アッセイのブランクのHPLCクロマトグラム を示す。 図１６は、クローン18からのHICで純粋なscFvの触媒性アッセイのHPLCクロマ トグラムを示す。 図１７Ａは、クローン83からのIMACで純粋なscFvの触媒性アッセイのHPLCクロ マトグラムを示す。 図１７Ｂは、クローン83からのIMACで純粋なscFvの触媒性アッセイ（＋RT3ハ プテン）のHPLCクロマトグラムを示す。 図１８は、クローン83からのHICで純粋なscFVの触媒性アッセイのHPLCクロマ トグラムを示す。 図１９Ａは、未処置のヒト由来ファージ抗体ライブラリーの３ラウンドのパン ニングの後に得られたRT3に対するクローンの結合パターンを示す。 図１９Ｂは、未処置のヒト由来ファージ抗体ライブラリーの４ラウンドのパン ニングの後のRT3に対するクローンの結合パターンを示す。 図２０は、未処置のヒト由来ファージ抗体ライブラリーから選択されたRT3特 異的ファージ抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子配列を示す。 図２１は、VH鎖およびVL鎖シャッフリングの一般的なスキームを示す。 図２２は、PAN0、PAN1、およびPAN2後のヒトのシャッフルされたライブラリー に由来するポリクローナルファージを用いるRT3-BSA ELISAアッセイを示す。 図２３Ａは、RT3ハプテンの左側部（RT3A）あるいは基質（Product A）による ファージ抗体のRT3-BSAへの結合の阻害を示す。 図２３Ｂは、RT3ハプテンの右側部（RT3B）あるいは基質（Product B）による ファージ抗体のRT3-BSAへの結合の阻害を示す。 図２４Ａは、0.3μgのRT3-BSAでコートしたELISAウエルからRT3、RT3A、RT3B 、TEA、およびPBSで溶出したファージの収率を示す。 図２４Ｂは、15μgのRT3-BSAでコートしたELISAウエルからRT3、RT3A、RT3B、 およびTEAで溶出したファージの収率を示す。 本願明細書に記載される発明をより十分に理解し得るために、以下に詳細な説 明を記載する。この記載は、本願発明を例示して説明するが、特定の発明に限定 すると解釈すべきでなく、当業者の範囲内にある変法は、本願発明の範囲に属す ると考えられるべきである。 好適な実施態様の詳細な説明 便宜のためおよび即座に参照できるために、本願発明を記載するにおいて以下 の定義を用いる。 アナログは、異性体、ホモログ、遷移状態、あるいは化学構造の点で反応物に 十分に類似している他の化合物を包含する。このようなアナログに対して惹起さ れた抗体は、反応物との免疫学的反応に関連し得るが、アナログの反応を必ずし も触媒しない。 抗体は、天然か、一部あるいは全部が合成的に生成された免疫グロブリンをい う。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインと相同な結合ドメインを有す るあらゆるタンパク質を含む。これらのタンパク質は天然供給源に由来し得るか 、あるいは一部あるいは全部が合成で生成され得る。例示の抗体は、免疫グロブ リン同位体およびFab、F(ab1)2、scFv、fV、dAb、Fdフラグメントである。 抗体由来ドメインは抗体分子に由来する配列をいう。 抗原は、動物体を抗体を産生させるように刺激し得、これらの産生された抗体 と結合し得る物質であり、だいたいタンパク質である。 ドメインは、タンパク質の一部であって、それ自身の中に折り畳まれ、同じタ ンパク質の他の部分とは独立しており、相補的な結合メンバーとは独立している 。 ホモログは、一次構造、二次構造、または三次構造中の対応する位置で同じ残 基あるいは保存された残基を有するポリペプチドである。この用語はまた、相同 なポリペプチドをコードする２つあるいはそれ以上のヌクレオチド配列をも含む 。相同なポリペプチドの例は、免疫グロブリン同位体である。 単離は、ライブラリーから特定のファージを分離することをいう。 ライブラリーはオリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチド（例えば、クロ ーン中のDNA配列）のコレクションをいう。 未処置のライブラリーは、未だ免疫化されていない動物に由来する免疫グロブ リン配列のファージディスプレイライブラリーをいい、免疫化は以下のもので行 われる：反応物；ペプチドあるいは他のキャリアに結合した反応物；反応中間体 ；反応物のアナログ；産物のアナログであって、そのようにして生成された抗体 が反応物あるいは反応中間体に結合し得る、アナログ；および反応中間体あるい は遷移状態のアナログ。 パッケージは、複製し得る遺伝子ディスプレイパッケージをいい、粒子がその 表面にsbpのメンバーを提示しているものをいう。このパッケージは、その表面 に抗原結合ドメインを提示するバクテリオファージであり得る。このタイプのパ ッケージはファージ抗体(pAb)と呼ばれている。 ファージベクターはファージゲノムの修飾に由来するベクターであり、バクテ リオファージの複製開始点を有するが、プラスミドの複製開始点を有しない。 ファージミドベクターはプラスミドゲノムの修飾に由来するベクターであり、 バクテリオファージの複製開始点およびプラスミドの複製開始点を有する。 ベクターは宿主生物中で複製し得るDNA分子であって、その中に遺伝子が挿入 されて、組換えDNA分子が構築される。 方法の概観 本願発明は、触媒特性を有する抗体をその表面に発現するファージ粒子を作製 し単離する方法を記載する。本願発明を実施する際に、触媒機能性をコードする 抗体ドメインは、以下に定義するように、特異的に免疫したあるいは免疫してい ない動物供給源あるいはヒト供給源のいずれかから調製され得る。さらに、本願 発明は、結合および/または触媒機能を、いくつかの方法（鎖シャッフリング、C DRグラフト化、および変異誘発を含むがこれに限定されない）の一つにより生成 あるいは改良する方法を記載する。本願発明のさらなる実施態様においては、マ ウス由来VHおよびVLドメインによって全体的にコードされている触媒性抗体を、 ヒト由来VHおよびVLドメインによってコードされている触媒性抗体に変換する方 法を開示する。 特異的な触媒機能を有する抗体を生じさせる最初の工程は、化学物質ハプテン （例えば、触媒される反応の基質とは関連するが異なっている遷移状態アナログ (TSA)）を必要とするが、必ずしもこのハプテンに限定されない。触媒機能を有 する抗体を生じさせる手段としてのこのTSAの構造、合成、および使用は、1980 年4月1日に発行された米国特許第4,196,265号に記載されており、参考として本 願明細書に援用する。先行技術に記載されているように、触媒性抗体の産生およ び単離の伝統的な方法は、モノクローナル抗体によるアプローチ（ハイブリドー マ技術）で行われている。 本願発明は、ホスホネート遷移状態アナログを免疫原としてあるいは固相上に 固定化して用いて、そのTSAと結合しかつ触媒特性を有し得る抗体の生成および 選択を可能にする（図１参照）。ハイブリドーマ法を用いて触媒性抗体が産生さ れる以前の発明と異なって、本願発明のユニークな実施態様はバクテリオファー ジの表面に抗体ドメイン（触媒機能を有する抗体ドメインを含む）を発現し得る ことにある。表面に触媒性抗体ドメインを提示する能力を有するファージライブ ラリーを作製する方法を、以下に記載する。 １．免疫化供給源からの結合および/または触媒性ファージ抗体の産生 TSAをキャリア分子あるいはペプチドに結合させ、BALB/Cマウスを免疫した。 適当な期間の経過後、マウスから脾臓を取り出し、細胞からmRNAを単離した。RN Aを免疫グロブリンの可変ドメインを増幅させる出発供給材料として用い、バク テリオファージ発現ベクターへのクローニングおよび引き続くバクテリオファー ジ粒子の表面上での発現を行う。本願発明の実施態様において、可変ドメインは 、本願発明の背景に記載されるように、典型的には短いペプチドにより連結され てscFvを生成している。別のファージ発現ベクターがFabのような抗体を発現さ せるのに用いられ得ることに注目すべきである。このファージ抗体ライブラリー を作製する技術は既に記載されており、そのプロセスの詳細は当業者に周知であ る（例えば、WO 92/01047; McCaffertyら、Nature(1990):552-564; Hoogenboom ら、Nucl ．Acids．Res.(1991)4133-4137; Marksら、J ．Mol．Biol.(1991):581-5 97を参照のこと）。 TSAと特異的に結合し認識するファージ抗体は、以下に記載するいくつかの方 法の一つを用いてライブラリーから単離される： a)パンニング−TSAを直接、固相表面（すなわち、チューブまたはプレート） 上に固定化するか、または別途、この固相表面をコートする前にキャリアタンパ ク質と結合させる。ファージ抗体のライブラリーを含む懸濁液をコートされた表 面とある時間反応させ、その後、結合していないファージ抗体（TSAと結合しな い抗体）を洗浄して除いた。 b)アフィニティークロマトグラフィー TSAを適切なカラムマトリックスに（ すなわち、セファロース）に結合させる。ファージ抗体懸濁液をカラムに通し、 結合しないファージを緩衝液でカラムから洗い流した。 固相表面に結合し固定化されるファージ抗体は、以下を含むいくつかの方法の うちの一つで取り出され得る： a)低い（酸性）あるいは高い（塩基性）pHのいずれかのバッファーを用いる 非特異的溶出； b)もとのホスホネートTSAまたは反応基質または産物などの遊離のハプテン を用いる特異的溶出； c)TSAの部分、または基質または産物を用いる特異的溶出。 TSAに結合したファージ抗体の特異的溶出に加えて、最初のパンニングまたは アフィニティークロマトグラフィー工程の間に、ファージ抗体の結合をコントロ ールすることが望ましいとされ得る。一つの方法は競合阻害を用いることであり 、 ファージ抗体をまず、反応物、反応産物またはTSAの部分と予めインキュベート しておくことである（実施例９を参照）。このような「予備選択」の目的は、触 媒的でないと思われる抗体を結合抗体の集団から除くことにある。本願発明の実 施例においては、これらの除かれたものはTSAのホスホネート部分と実質的に結 合しないファージ抗体である。ファージ抗体ライブラリーの予備選択のタイプは 実験的に決定される必要があるが、結局は、TSA結合ファージ抗体の集団の中で 、触媒性ファージの比率を非触媒性ファージに対して増加させる方法となり得る 。このような手順がELISAウエルで行われる場合は、より高い適応性が与えられ 得る。このように、特定の手順に従って、溶出物を集め得、プレート全体に検出 手順を適用し得る。結果に基づいて、特定のウエルからの溶出物を選択して、さ らに分析/パンニングに供し得る。 上記方法のいずれかあるいは全てによるファージ抗体の溶出に続いて、ファー ジを集め、そしてTSA固相上での先のパンニングと再インキュベートから溶出し たファージを単に集めることによって、追加のパンニング（2、3、4、5など）に供 し得る。TSAに特異的に結合しないファージのある割合(%)はそれぞれのパンニン グ工程（すなわち、非特異的結合体）を通して行われるので、ファージクローン のプールまたは個々に単離されたファージクローンは、典型的には、固相ELISA アッセイによって、TSAへの結合に関して再度スクリーニングされる。ELISAアッ セイは、バクテリオファージ表面に発現される抗体または可溶な形態で発現され る抗体を用いて、以下に述べるように行われ得る。ELISAアッセイの別の形式、 例えば、遊離のハプテン、このハプテンの基質または産物または種々の半分ある いは部分、基質または産物を用いる競合阻害は、ファージクローンのプールまた は個々の結合クローンの結合特異性をさらに特徴付けるために用いられ得る。 適切な結合特異性を有する個々のファージ抗体クローンまたはクローンのプー ルは、次に触媒活性に関してアッセイされる。触媒に関するアッセイは最も便利 には可溶性の抗体を用いて行われ、ファージ抗体発現E.coliクローンから可溶性 抗体を産生させる方法はすでに記載されている(Marksら、J ．Mol．Biol.(1991): 581-597)。触媒活性が抗体活性部位にあるとする基準は、混入タンパク質また は酵素からの抗体の厳しい精製にある。本願発明においては、可溶性抗体の精製 は、 発現した抗体の３’カルボキシ末端に特異的なペプチドを導入することにより容 易とされる。現在用いられているおよび先行技術に記載されているこのようなペ プチドの例は、以下を含む： a)ヒスチジンペプチド−カラムマトリックスに固定化された金属での抗体の精 製を可能にする（IMAC、Hochuliら、Bio/Technology(1988):1321-1325）。 b)mycペプチド−mycペプチドに特異的に結合する抗体が固定化されているカラ ムマトリックスでの精製を可能にする（Clacksonら、Nature(1991):624-628）。 抗体フラグメントを提示するのに使用される従来のベクターは、mycペプチド のみを含んでいた（図５参照）。本願に記載され開示されているベクターは、ヒ スチジンペプチドをmycペプチドに直列して導入した最初の例を示す。これは、 従来技術の改良を示すが、それは、２つの独特の異なる形式と精製条件とを用い る、可溶性抗体の精製を可能にするからである。 抗体のさらなる精製は、目的の抗体に独特の特異的な特性（例えば、疎水性、 電荷、およびサイズ）を利用して行い得る。精製は、すでに記載されているよう に、多くの標準的なタンパク質精製技術のいずれかにより影響を与えられる（De utscher、Methods in Enzymology, 182巻，Guide to Protein Purification(199 0)）。 上記のファージ抗体技術により単離された抗体は、当業者に周知の多くの方法 により目的の反応を触媒し得る能力についてスクリーニングされ得る。その最も 単純な形態では、スクリーニングは、抗体と反応物（基質）とを適切な条件下で インキュベートし、例えば分光学的方法あるいは高圧液体クロマトグラフィーな どの多くの手段のいずれかいよって反応産物の形成を測定することにより、達成 される。 ２．非免疫化供給源からの結合および/または触媒性ファージ抗体の産生 本発明のこの実施態様において、ファージ抗体ライブラリーを生成させるため の供給材料は、非免疫化動物または哺乳動物（例えばヒト）由来である。本実施 例における非免疫化は、特異的な反応物（キャリアタンパク質に結合しているか または遊離の反応物としてのいずれか）、反応中間体、反応物のアナログまたは 特定の反応の予想される産物で特異的に免疫化されないことを意味する。先行技 術において示されるように、低親和性ヒト抗体および中親和性ヒト抗体が、非免 疫化供給源から生成されたファージ抗体ライブラリーを用いて、特異的な抗原に 対して生成されている。そのようなアプローチは、TSAに結合する動物またはヒ ト抗体を、上記のように単に未処置の動物またはヒト由来ファージ抗体ライブラ リーをTSA上にパンニングすることにより生成する方法を提供する。次いで、TSA を特異的に結合および認識するファージクローンを、上記のように所望の触媒機 能についてアッセイし得る。そのようなアプローチは、ヒト由来触媒性抗体を直 接的および全体的に単離する方法を提供する。 ３．鎖シャッフリングによる結合および/または触媒性ファージ抗体の産生 ファージ抗体ライブラリーを生成するための鎖シャッフリングアプローチは、 VHおよびVK対の間の結合の無差別性を利用する。本発明のこの実施態様において 、１つ、いくつか、または多数の異なるファージ抗体クローン由来のVHまたはVK ドメインを、VKまたはVHドメインのライブラリーと再度組み合わせる。VHおよび VKドメインのファージクローンおよびライブラリーは、上記の第１節に記載のよ うに免疫化した供給源または上記の第２節に記載のように非免疫化供給源から得 られ得る。さらに、鎖シャッフリングのために選択されるファージクローンは、 以前特定のTSAへの結合について選択されたファージクローンであり得るが、必 ずしもそれに限定されない。鎖シャッフリング手順の後、再度組み合わせた鎖（ すなわちシャッフルされた鎖）をファージ抗体発現ベクターにクローン化し直す 。発現されたファージ抗体ライブラリーをTSA上に再度パンニングし、そして個 々の結合クローンを先に記載のように触媒活性についてスクリーニングする。 ４．CDRシャッフリングによる結合および/または触媒性ファージ抗体の産生 抗体特異性および抗原結合親和性はVHおよびVLドメインによりコードされる６ つのCDRにより特定されることが周知である。それで、所定の抗体由来のCDRのい ずれかまたはすべてを変化させることはその抗体の結合特性に劇的な効果を有す ることになる。ファージ抗体に関する場合のCDRシャッフリングは、VHまたはVL ドメイン内のCDR（単数または複数）をコードする領域をCDR（単数または複数） のライブラリーで置換するためのプロセスを描写する。上記の第３節に記載の鎖 シャッフリングアプローチと同様に、CDRシャッフリングのために使用されるVH またはVKドメインは、１つ、いくつか、または多数の異なるファージ抗体クロー ン由来であり得る。シャッフリングのために使用されるCDR領域のファージクロ ーンおよびライブラリーは、免疫化供給源または非免疫化供給源のいずれかから 得られ得る。CDRシャッフリングの後、組換えVHおよびVLドメインをファージ抗 体発現ベクターに再クローン化する。発現されるファージ抗体をTSAに対して再 度パンニングし、そして個々の結合クローンを上記のように触媒活性についてア ッセイする。 ５．変異誘発による結合および/または触媒性ファージ抗体の産生 CDRシャッフリングについて上記したように、抗体の結合特異性は、CDR内にコ ードされるアミノ酸を変化させることにより変化し得る。本発明の目的のための CDR変異誘発は、以下のように定義され得る： a）特定のCDR内の１つまたは少数個の特異的なアミノ酸を変異誘発させる部位 特異的。このプロセスは通常、変異誘発される領域のヌクレオチド配列および変 異誘発プライマーの配列に依存して、野生型アミノ酸配列のいくつかの異なるア ミノ酸への変化を生じる。 b）CDR（単数または複数）内のいくつかまたはすべてのアミノ酸がランダムな ヌクレオチド配列で置換され、その結果野生型配列がアミノ酸のすべての可能な 組み合わせにより置換されるランダム変異誘発。 部位特異的変異誘発およびランダム変異誘発のための多数の異なる方法が文献 に記載されており、そして当該分野において周知である。その他の方法と同様に 、変異誘発のために選択されるファージ抗体クローン（単数または複数）は、TS Aへの結合について既に選択されたクローンであり得るが、それに限定されない 。さらに、選択された結合クローンは、免疫化または非免疫化のいずれかの動物 またはヒト供給源由来のファージ抗体ライブラリーから単離されるクローンであ り得る。 抗原結合部位のモデリングにおける近年の成功は、良好に新たな設計を予言す る。このアプローチは、特に小さい基質に対する触媒性抗体を作製するために特 に魅力的である。ここで、側鎖または補欠分子族のための結合部位が、基質の遷 移状態に選択的に結合するためのみならず、結合の作製および破壊に直接関係す るためにも導入され得る。 ６．「インプリンティング」によるヒト触媒性抗体の誘導 「インプリンティング」のプロセスは、所望の結合特徴を有する既存の抗体を 用いて類似の特徴を有する新たな抗体を誘導する工程を包含する。これは、もと の抗体鎖またはその部分を相補的な部分のライブラリーと組み換えることにより 行われる。新たな抗体エレメント（もとの抗体結合特徴を相補する）が見出され ると、これらをもとの抗体結合特徴を置換するライブラリーと再度組合せ、これ らをもとの抗体部分を置換するライブラリーと再度組合せ、もとの抗体の結合を 模倣する完全に新たな抗体を得る（PCT/GB/92/01755）。 例えば、インプリンティングアプローチは、上記第１節に記載のファージ抗体 技術を用いて単離されたマウス触媒性抗体のヒト化に対して価値を有する。一旦 単離されれば、触媒性抗体のマウスがコードするVHまたはVLドメインを、相補的 なヒト由来VLまたはVHドメインのライブラリーと再度組合せ得る。次いで、半マ ウス−半ヒトファージ抗体を、触媒活性を生成するために、もともと使用したTS Aへの結合について再度選択する。選択されるバインダーの残存するマウスVHま たはVLドメインが、今や相補的なヒト由来VLまたはVHドメインのライブラリーで 置換される。今やヒト由来の配列で完全にコードされる生じるファージ抗体を、 TSAに対する結合について再度選択する。次いで、TSAへの結合について選択され た個々のクローンを上記のように触媒活性についてアッセイする。 今、一般的に本発明を記載したが、以下の実施例は例示の目的のために含まれ 、いかなる限定形態をも意図しない。実施例1.1 RT3ホスホネート遷移状態アナログハプテンの合成 RT3ホスホネート遷移状態アナログハプテンの合成についての反応スキームを 図１に示す。アセトン中のヨウ化ナトリウムを用いるハロゲン交換によってα2- クロロイソジュレン(1)からα2-ヨードイソジュレン(2)を得た。トリメチルホス ファイトを用いるMichaelis-Arbusov反応によって、ジメトキシホスホネート化 合物(3)を得た。五塩化リンとともに加熱して活性化し、次いでメチル4-ヒドロ キシフェニルアセテート(4)と反応させて化合物(5)を得た。チオフェノールおよ びトリエチルアミンを用いる脱メチル化により、化合物(6)を得た。この化合物 を水酸化リチウムの強塩基条件下で完全に脱保護して所望の生成物(7)にした。 さらに詳細には、α2-ヨードイソジュレン(化合物２)は、以下のようにして調 製された： α2-クロロイソジュレン(化合物１)(2.28g)をアセトン(45ml)中に溶解し、そ してNaI(2.25g)を加えた。反応混合物を75℃、暗所で、16時間、激しく撹拌した 。反応混合物を濃縮し、酢酸エチル(100ml)に再溶解し、水で洗浄し、そして濃 縮して固体にした。この固体を酢酸エチル(5ml)に再溶解し、そして100gのシリ カを用いてヘキサンで溶出するフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、 α2-ヨードイソジュレン(2)(2.717g)を得た。これを以下の分光法により確認し た。 化合物３の調製 新たに蒸留したトリメトキシフォスファイト(５ml)およびα2-ヨードイソジュ レン(2)(0.765g)を共に110℃で16時間加熱した。反応混合物を濃縮して少容量に し、そして50gのシリカを用いて酢酸エチル-ヘキサン(2:8容量比)で溶出するフ ラッシュクロマトグラフィーによって精製し、化合物３(0.550g)を得た。これを 以下の分光法により確認した。 メチル4-ヒドロキシフェニルアセテート(化合物４) 4-ヒドロキシフェニル酢酸(1.75g)をメタノール(30ml)に溶解し、そして10Mの 塩酸水溶液(0.15ml)を添加し、そして15時間加熱還流した。室温まで冷却した後 、トリエチルアミン(1ml)を添加し、混合物を濃縮し、そしてシリカゲル(30g)を 用いて酢酸エチル-ヘキサン(2:8 容量比)で溶出するフラッシュクロマトグラフ ィーによって精製し、メチル4-ヒドロキシフェニルアセテート(4)(1.693g)を得 た。これを以下の分光法により確認した。 化合物５の調製 化合物３(0.243g)を乾燥クロロホルム(3ml)に溶解し、そして五塩化リン(0.24 0g)の乾燥クロロホルム溶液(3ml)を添加し、次いで60℃で３時間加熱した。反応 混合物を濃縮してオイルにし、このオイルを高減圧下で16時間撹拌しなから放置 した。得られたホスホロクロリデート（phosphorochloridate）を乾燥ジクロロ メタン(3ml)に再溶解し、そしてこれをメチル4-ヒドロキシフェニルアセテート( 4)(0.150g)と4-ジメチルアミノピリジン(0.146g)との乾燥ジクロロメタン(3ml) 溶液に０℃で添加した。反応混合物を室温で16時間撹拌した。飽和塩化アンモニ ウム水溶液(15ml)を添加し、そして生成物をジクロロメタン(40ml)中に抽出した 。有機層を水(10ml)で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、濾過し、そして濃縮し、次 いでシリカ(30g)を用いて酢酸エチル-ヘキサン(4:6 容量比)で溶出するフラッシ ュクロマトグラフィーによって精製し、化合物５(0.20g)を得た。これを以下の 分光法により確認した。 化合物６の調製 化合物５(0.19g)をジオキサン(1.5ml)に溶解した。チオフェノール(0.575g)お よびトリエチルアミン(0.70ml)を添加し、そして反応混合物を16時間撹拌した。 混合物を濃縮し、水(30ml)に再溶解し、そしてジクロロメタン(５×25ml)で洗浄 した。水層をHCl水溶液でpH１調整し、そして酢酸エチル(５×30ml)で抽出した 。有機層を一緒にし、無水MgSO4燥し、濾過し、そして濃縮して化合物６(0.176g )を得た。これを以下の分光法により確認した。 化合物７の調製 化合物６(0.087g)を、メタノール(1.4ml)および水(0.30ml)中の水酸化リチウ ム１水和物(0.025g)の溶液で50時間激しく撹拌して処理した。反応混合物をその 体積が３分の１になるまで濃縮し、水(10ml)を添加し、そして水層をジクロロメ タン(３×10ml)で洗浄した。水層を濃HClを用いてpH１に調整し、そして酢酸エ チル(７×20mL)で溶出した。有機層を一緒にし、無水MgSO4で乾燥し、濾過し、 そして濃縮して、化合物７(0.063g)を得た。これを以下の分光法により確認した 。 実施例1.2 RT3ホスホネート遷移状態アナログ(RT3A)の左側部分(化合物８)の合成（図２ を参照のこと） チオフェノールおよびトリエチルアミンを用いる化合物３の脱メチル化からの 化合物８の調製 化合物３(0.122g)をジオキサン(1.5ml)に溶解し、そしてチオフェノール(0.55 g)のジオキサン(1.5ml)溶液を撹拌しながら添加した。次いで、トリエチルアミ ン(0.70ml)を添加し、そして溶液を室温で24時間撹拌した。反応混合物を分液ロ ートに移し、水(50ml)を加え、水層をHCl水溶液でpH７に調整し、次いでこの溶 液をジクロロメタン(５×50ml)で洗浄した。水層を１M HCl水溶液でpH１に酸性 化し、そして酢酸エチル(２×75ml)で抽出した。有機層を一緒にし、そして水(5 ml)で洗浄し、無水MgSO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。シリカ(10g)を用 いてメタノール-ジクロロメタン(8:92容量比〜15:85容量比)で溶出して精製し、 化合物８(0.055g)を得た。これを以下の分光法により確認した。 実施例1.3 RT3ホスホネート遷移状態アナログ(RT3A)の右側部分(化合物12)の合成（図３ を参照のこと） ジベンジルメチルホスホレート(化合物９)の調製 水素化ナトリウム(鉱油中の60％分散体)(0.16g)を乾燥ヘキサン(２×10ml)で 洗浄した。デカントして得られる固体に、乾燥THF(5ml)を添加し、そして撹拌し た懸濁液を０℃まで冷却した。ジベンジルホスファイト(1.048g)の乾燥THF(5ml) 溶液を添加し、そして混合物を室温まで加温した。30分後、ヨウ化メチル(0.32m l)を添加し、そして反応混合物を２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、酢酸エ チル(75ml)に再溶解し、飽和塩化アンモニウム水溶液(50ml)および水（10ml)で 洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、濾過し、濃縮し、次いでシリカ(10g)を 用いて酢酸エチル-ヘキサン(1:1 容量比)で溶出するフラッシュクロマトグラフ ィーによって精製し、ジベンジルメチルホスホネート(9)(0.750g)を得た。これ を以下の分光法により確認した。 ベンジルメチルリン酸（化合物10）の調製 ジベンジルメチルホスホネート(9)(0.277g)をジオキサン(1ml)および水(0.5ml )に溶解した。2M LiOH水溶液(1ml)を添加し、そして混合物を48時間激しく撹拌 た。水(25ml)を添加し、水層を酢酸エチル(25ml)で洗浄した。水層を濃HClを用 いてpH１に酸性化し、酢酸エチル(２×35ml)で抽出した。有機層を一緒にし、無 水MgSO4で乾燥し、濾過し、そして濃縮して、ベンジルメチルリン酸(10)(0.183g )を得た。これを以下の分光法により確認した。 化合物11の調製 ベンジルメチルリン酸(10)(0.118g)を塩化チオニル(1ml)に溶解し、４時間撹 拌した。反応混合物を濃縮して乾燥させ、高減圧下に16時間放置した。これを乾 燥ジクロロメタン(1ml)およびDMF(1.5ml)に溶解した。撹拌しながら、メチル4- ヒドロキシフェニルアセテート(4)(0.083g)およびトリエチルアミン(0.170ml)を 添加した。16時間後、飽和塩化アンモニウム水溶液(30ml)を添加し、そして混合 物を酢酸エチル(２×50ml)で抽出した。有機抽出物を一緒にし、無水MgSO4で乾 燥し、濾過し、そして濃縮した。分取tlcプレート(1mm)を用い、そして酢酸エチ ル-ヘキサン(4:6 容量比)を溶媒として用いて精製を行い、化合物11(0.068g)を 得た。これを以下の分光法により確認した。 化合物12の調製 ジベンジルホスファイトをヨウ化メチルを用いてメチル化し、ジベンジルメチ ルホスホネート(9)を得た。これを水酸化リチウムで加水分解し、リン酸10を得 た。塩化チオニルを用いて活性化し、次いでメチル4-ヒドロキシフェニルアセテ ート(4)と反応させて化合物11を得た。11を接触水素化することにより、最終生 成物(12)を得た。 化合物11(0.060g)を酢酸エチル(10ml)に溶解し、10％パラジウム-活性炭(0.03 g)を添加した。混合物を水素雰囲気下、３時間撹拌した。次いで、これをセライ トのベットを通して濾過し、酢酸エチル(２×10ml)を添加して、セライトから生 成物を洗浄した。全洗浄物および濾液を一緒にし、そして濃縮して化合物12(0.0 38g)を得た。これを以下の分光法により確認した。 実施例1.4 RT3基質の合成(図４を参照のこと) 4-ヒドロキシフェニルアセトアミド（化合物13）の調製 メチル4-ヒドロキシフェニルアセテート(4)(0.83g)を飽和アンモニアメタノー ル溶液(30ml)に溶解し、そしてテフロンスクリューキャップを有する肉厚のチュ ーブに入れた。この溶液を室温で72時間、この密封チューブ中で撹拌した。反応 混合物を濃縮し、そしてメタノールクロロホルム(2:8 容量比、75ml)に再溶解し た。結晶化は起こらなかったので、溶液をその体積が半分になるまで濃縮し、そ してヘキサンを添加して加熱した。０℃まで冷却し、4-ヒドロキシフェニルアセ トアミド(13)(0.524g)の結晶を得た。これを以下の分光法により確認した。 化合物15の調製 メチルエステル４をアンモニア分解することにより、アミド13を調製した。メ シチル酢酸を塩化チオニルを用いて活性化し、次いでアミド13と反応させ、最終 生成物15を得た。 メシチル酢酸(0.10g)を塩化チオニル(1ml)に溶解し、そして４時間撹拌した。 反応混合物を濃縮して乾燥し、そして高減圧下に16時間置いた。得られたメシチ ルアセチルクロリド(14)を乾燥ジクロロメタン(1ml)に溶解し、そして4-ヒドロ キシフェニルアセトアミド(13)(0.076g)およびトリエチルアミン(0.077mL)の乾 燥DMF(1ml)溶液に添加した。反応混合物を90分間撹拌し、次いで濃縮し、酢酸エ チル(30ml)に再溶解し、そして飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(25ml)および水(5 ml)で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、濾過しそして濃縮した。酢酸エチ ルを溶媒として用いる分取シリカtlc(1mm)によって精製し、化合物15(0.055g)を 得た。これを以下の分光法により確認した。 実施例２ ハプテン結合体 RT3ハプテン（4-(カルボキシメチル)フェニル-(2,4,6-トリメチルフェニル)- メチルホスホネート(化合物７、図１)）を、ハプテン上の遊離カルボキシル基に よってウシ血清アルブミン(BSA)およびキーホールリンペットヘモシアニン(KLH) にに結合させた。 5.4mgのRT3を37℃でリン酸緩衝液に溶解し、次いで6mgのEDC（1-エチル-3-(3 -ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド-HCl）、およびN-ヒドロキシスルホス クシンイミド(S-NHS)と、それぞれ1:2:2のモル比で混合した。10mgのBSAを水に 溶解し、そして次いでハプテンに添加した。ハプテンのBSAに対するモル比は、B SAの分子量を64,000として、100:1であった。混合物を室温で３時間撹拌し、次 いで４℃で２日間にわたり、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に対して２回、透析 を行った。 RT3-KLH結合体を、KLHを添加する前にハプテン、EDC、S-NHS混合物のpHをNaOH を用いて6.0に調節したことを除き、RT3-BSAと同様の方法で調製した。ハプテン のタンパク質に対する比は、BSAの分子量を64,000として、100:1であった。反応 混合物を２時間室温で撹拌し、次いで４℃で２日間にわたり、PBSに対して透析 を行った。 透析後、タンパク質の濃度を、BSAをタンパク標準として用いるミクロ-ビシン コニン酸(micro-bicinchonic acid)アッセイによって測定した(Pierce、Rockfor d、Illinois)。実施例３ 免疫化およびmRNA単離 BALB/c雌性マウス（14週齢）に、完全フロイントアジュバント中に乳化した50 μgのRT3-KLHを腹腔内注射した。マウスを、４週目および７週目に不完全フロイ ントアジュバント中に乳化した10μgのRT3-KLHで追加免疫した。マウスを最後の 注射の３日後に屠殺し、そして脾臓を取り出してmRNAの供給源として使用した。 ２回目の注射後の免疫応答をELISAにより測定した。RT3-BSAに対する抗血清の力 価は1:100,000であった。 mRNAの調製−mRNAを、上記のようにRT3-KLHで免疫したマウスから得た105 mg の脾臓から単離した。mRNAを、FastTrack mRNA単離キット（Invitrogen Corp，S an Diego，CA）を用いて、製造者の説明書に従って精製した。mRNAの収量は、以 下の式を用いて分光光度的に測定したところ5.4μgであった： [mRNA]＝(A260)(0.04μg/μl)D ここでＤは希釈係数である実施例４ ファージディスプレイライブラリーの構築のための材料および方法 以下の手順において使用されるプロトコルは、Sambrookら、Molecular Clonin g: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に記載 された。 制限消化、アガロースゲルでの制限酵素消化産物の分析、フェノール/クロロ ホルムを用いるDNAの精製、２×TY培地およびプレートの調製、テトラサイクリ ンおよびアンピシリンストック溶液の調製、タンパク質のPAGE、リン酸緩衝化生 理食塩水の調製、アルカリ溶解によるプラスミドDNAの調製、プラスミドDNAの塩 化セシウム精製。 すべての酵素は、New England Biolabs（Beverly，MA）により供給され、そし て記載しない限り製造者の説明書に従って使用した。 連結はAmersham（Arlington Heights，IL）連結キットを使用して行った。グ ラスミルク（Bio 101，La Jolla，CA）あるいはマジックミニプレップまたはマ ジックPCRプレップ（Promega，Madison，WI）を使用するDNAの精製は、製造者の 条件に従って行った。 コンピテントセルの調製および形質転換は、Bio-Rad（Hercules，CA）エレク トロ形質転換プロトコルに記載の方法に従って行った。 以下は、McCaffertyら、1992、特許第WO92/01047号に記載される： ファージの調製、ファージミド粒子、一本鎖DNA、可溶性単鎖Fv抗体の発現、パ ンニングおよびELISAの手順、PCRおよびBstN1消化による多様性の分析。 DNAは、コンピテントなTG1細胞（遺伝子型：K12d(lac-pro)，sup E，thi，hsd D5/F'traD36，pro A+B+，Lac Iq，lac ZdM15）またはHB2151細胞（遺伝子型：K1 2d(lac-pro)，thi/F' pro A+B+，Lac IqZ dM15）中に形質転換した。 マウスPCRプライマー、ベクターpCANTAB 3およびpCANTAB 5、ならびに抗M13抗 体は、Pharmacia（Piscataway，NJ）から入手可能である（それぞれカタログ番 号27-9400-01、27-9401-01、27-9402-01）。実施例4.1 「固定化金属アフィニティクロマトグラフィー手順」（IMAC）を用いる可溶性単 鎖Fv（scFv）抗体の迅速な/複数の単離を容易にするベクターの調製 触媒性抗体のスクリーニングにおいて、ファージミドベクターから細菌で発現 された抗体を容易に精製/濃縮する手段を有することか有利である。以下の変化 をファージミドベクターpHEN、pCANTABに組み込んだ（McCaffertyら、(1992)特 許出願第WO 92/01047号、Hoogenboom H.R.ら、Nacl ．AcidR es. 19，(1991):413 3-4137、Pharmacia製品文献カタログ番号27-9401-01）： i） 抗体のＣ末端に６つのヒスチジン残基をコードする配列を導入した。 ii）抗体のＣ末端にmycタグペプチドをコードする配列を、SCFvの高感度の検 出/別の精製のために含んだ。これらの変化を組み込むことにより、細菌で発現 した抗体を濃縮および精製するための非常に簡便で迅速な手順を開発した。 ２対のオリゴヌクレオチドを合成して以下に示す二本鎖挿入物を生成した。こ れらは、NotI部位に適合性の5'突出を有し、それゆえpHEN、pCANTAB中のこの部 位にクローン化して、下記のように5'末端でNatI部位を再生し得る。 His-6 3/4を、pHEN1のPst1/Not1部位にクローン化した、Clacksonら、Nature 352(1991):624-628に記載の高親和性オキサゾロン（oxazalon）結合クローンか らなるpHEN-OX16にクローン化した。この構築物は、9E10抗体９を用いて検出さ れ得る[aOX抗体-his-6-mycタグ-アンバーコドン-遺伝子３]からなる産物を生じ る（9E10抗体９を産生する細胞株はATCC，Rockville，MDから入手可能である。M YC1-9E10.2と称するCRL1729）。この新たな構築物をpOX16his-11と呼び、そして 図５に示す。 このクローンを用いて下記の「固定化金属アフィニティクロマトグラフィー手 順」（IMAC）精製方式を実施した。さらなる構築物をHis-6 1/2をクローンscFv4 に挿入することにより作製し、これはpCANTAB3にクローン化したリソソーム（ly sozome）結合D1.3 scFv抗体からなる。この構築物は、抗D1.3抗血清を用いて検 出され得る（D1.3抗体-his-6-アンバーコドン-遺伝子３）からなる産物を生じる 。 すべてのクローニング操作をTG1において実施し、そして正確なクローンを単 鎖Fvとしての発現のために非サプレッサー株HB2151に導入した。 すべての容量は開始培養容量の50 mlであり、そしてすべての細菌の増殖は宿 主HB2151において30℃であった。目的のプラスミドを有するE．coli細胞を、２% グルコース、100μg/mlのアンピシリンを補充した２×TY培地中で0.7〜1.0 O.D. /mlまで増殖させた。培養物を、50 ml Falconチューブ中で3500 rpmで10分間室 温で遠心分離し、２×TY/100μg/mlアンピシリン/１mM IPTG中に再懸濁し、そし て３時間増殖させた。培養物を、50 ml Falconチューブ中で3500 rpmで15分間4 ℃の温度で遠心分離し、そして１mlの冷緩衝液Ａ（PBS/１M NaCl/1mM EDTA）中 に再懸濁して氷上に15分間置く。サンプルを10分間２回遠心分離し、ペリプラズ ム含有物を有する上清を採集し、そしてMgCl2を１〜２mMに添加した。 400μlの、緩衝液Ａで予め平衡化しておいたNi-NTAアガロース：緩衝液１の１ ：１スラリー（Qiagen，Chatsworth，CA）をペリプラズム調製物に添加し、そし て10分間反転プラットフォーム（inverting platform）上で室温でインキュベー トした。混合物をマイクロ遠心分離機で10〜15秒間低速で遠心分離し、そしてペ レットを１mlの緩衝液Ａに再懸濁した。このプロセスをさらに２回繰り返してか ら250 mMのイミダゾールを有する100μlのPBSまたは緩衝液Ａのいずれかに再懸 濁した。10分後、上清を採集し、そしてペレットを別の100μlの同じ緩衝液で再 抽出してプールした。 結果を図６中に、大文字Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦで印を付したレーンにお いて示す。図６レーンＡは、３時間の誘導後ペリプラズム中にscFvが豊富に蓄積 することを示す。予想されたとおり、scFvは一晩のインキュベーション後の培養 上清中にのみ見出された（データは示さず）。ペリプラズムからの抗体の単離は 、 それがより短い誘導の後に、より良好な質の産物の潜在性を有して調製され得る のみならず、ペリプラズムから実施する場合、最初の遠心分離工程自体が抗体を 効果的に濃縮するという有利性も有する。レーンＢおよびCは、抗体フラグメン トが、上記のようにNi-NTAマトリックスをペリプラズム抽出物とインキュベート し（レーンＡを参照のこと）、そして結合したscFvを緩衝液Ａ/250 mMイミダゾ ールで溶出した後に、効率的に結合および回収されることを示す。レーンＤおよ びEは、溶出をPBS/250 mMイミダゾール（NaClの添加なし）中で実施し得ること を示す。これは抗体のその後の使用のためにより有用な緩衝液であり得る。レー ンＦは、クローンscFv4his-6が同じ方法で回収され得る抗体フラグメントを産生 することを示す。 この手順は抗体を濃縮/精製する非常に簡便な手段であり、触媒作用について のスクリーニングに必要な複数のサンプルの同時の調製を容易にする。 遺伝子IIIの中央のNot1クローニング部位からBamH1部位にわたるDNAを単離す るために、上記の構築物のベクター形態をNot1およびBamH1での切断により調製 した。これを用いてPCANTAB 3およびpCANTAB5内の等価なNot1/BamH1部位を置換 して、ベクターPCANTAB 3 his-6およびpCANTAB5 his-6を得た。これはmycタグお よびhis-6タグを新たな骨格に移行させる（図７）。実施例4.2 RT3で免疫したマウス由来のファージライブラリーの調製 構築、PCRおよびマウス由来ファージディスプレイライブラリーの配列分析に 使用したすべてのプライマーの配列を以下に示す： 脾臓mRNAは、RT3-KLHで免疫したマウス（実施例３を参照のこと）由来のもの を用い、そしてプライマーとしてランダムヘキサマー（Pharmacia，Piscataway ，N.J.）を用いて、cDNAを調製した。PCR反応条件は、本質的にMcCaffertyら、 特許出願WO92/01047に記載の通りであり、製造業者の条件に従ってTaqポリメラ ーゼを用いる。 １次重鎖産物（VH）を、プライマーVH1FOR-2およびVH1BACKを用いて作製した 。１次軽鎖PCR産物（VL）を、等モル量の４つのMJKFONXプライマーと５つのVKBA CKプライマー（VKABACK、VKCBACK、VKDBACK、VKEBACK、VKFBACK）の１つとを用 いて、５つの個別の反応で作製した。VLに関するPCR条件は、94℃１分間、55℃ １分間、および72℃２分間の25サイクル、それに続く10分間の72℃でのインキュ ベーションであった。VHについては、ハイブリダイゼーション温度として55℃で はなく60℃を用いた。これは、より良好な結果が得られるためである。 リンカーフラグメントを、テンプレートpscFvNQ11（McCafferty，J.ら、WO92/ 01047）をプライマーLINKBACKとともに用いて、それぞれプライマーVKALINKFOR 、VKCLINKFOR、VKDLINKFOR、VKELINKFOR、VKFLINKFORの内の１つを含有する５つ の個別の反応で調製した。 １次産物をゲル精製し、そしてVHの3'末端および種々のVLの5'末端に相補的な リンカーフラグメントを用いて、５つの個別の連結反応で互いに連結した。連結 を、３つのフラグメントを用いて、そしてプライマーを添加することなく「モッ ク(mock)」PCR反応中で行った。連結を、約10ngのそれぞれのフラグメントが存 在する25μl容量中において２つ組で（in duplicate）実施した。この連結は、9 4℃１分間、60℃２分間、そして72℃２分間の25の温度サイクル、それに続く10 分間の72℃でのインキュベーションを通して行った。25μlのアセンブリ反応物 をゲルに泳動し、そして脱染の後、アセンブルした産物を、ゲル上で適切に可視 化した（データは示さず）。 クローニングのための材料を、クローニング部位を導入するプライマー（VH1B ACKAPA10およびJK1NOT10、JK2NOT10、JK4NOT10、JK5NOT10の混合物）を用いて、 2次PCR反応において調製した。連結反応からの少量の産物をテンプレート（50μ lのPCR反応中に１μl）として用いた。PCR条件は、94℃１分間、55℃１分間、お よび72℃２分間の25サイクル、それに続く10分間の72℃でのインキュベーション であった。 2次PCR産物を、酵素ApaL1/Not1で切断し、ゲル精製し、pCANTAB3his-6のApaL1 およびNot1部位にクローン化し、そしてエレクトロコンピテントTG1細胞に形質 転換した。（形質転換効率は、pUC19については5×108/μgであり、連結したベ クターについては1×106〜107/μgであった）。1.2×106クローンのライブラリ ーを作製し、そして18/20のクローンが挿入物を有することを見出した。PCRによ る分析およびBstN1消化は、これらが全て異なることを示す。実施例4.3 RT3-BSAに対するマウス抗RT3ライブラリーのパンニング パンニング手順は、本質的にMarks，J.D.ら、Biotechnology 10(1992)：779-7 83に記載の通りであった。RT3ハプテン（化合物７、図１）を、実施例２に記載 のようにBSAに結合させた。Nunc（Kamstrup，Denmark）免疫吸着チューブを、１ mlの20mg/mlのRT3-BSAでコートした。チューブを、２時間37℃にて４ml PBS/２ ％ミルクパウダーで上部までブロックし、0.8〜1.0mlの濃縮ファージ（10〜50ml の培養上清に等価）を結合に用いた。チューブを反転させなかった。ファージの 結合および洗浄を、MOPS緩衝化生理食塩水（MBS、これは50mM MOPS pH 7.4、150 mM NaClである）を用いて行った。 洗浄を、MBS/0.1％Tween 20で10回、そしてMBSで10回行った。結合したファー ジを、800mlの100mMトリエチルアミンを用いて溶出し、400mlの１M Tris pH7.4 で中和し、そして指数的に増殖するTG1-tr細胞（Tファージ耐性TG1細胞）に感染 させた。溶出液で感染させた細胞を、２％グルコース／100mg/mlアンピシリンを 補充した大きな(22×22cm）TYプレートにプレートした。細菌のストックを次の 日に調製し、それらから液体培養物に播種し、M13ヘルパーファージでレスキュ ーし、そしてパンニング手順を、濃縮ファージを用いて２回目を繰り返した。 パンニングプロセスを繰り返し、濃縮ファージをポリクローナルELISAに用い た。パンニングしていないライブラリーからは、シグナルは得られなかったが、 連続的なパンニングを通して増加したシグナルが得られた（示さず）。PAN1、PA N2、およびPAN3後に溶出したファージの数は、予測されるようにそれぞれの倍数 で増加した（それぞれ、0.12、50、および2200×106の感染ファージ）。 PAN1およびPAN2からの溶出ファージを、HB2151細胞（可溶性SCFvを産生する非 サプレッサー株）に導入した。個々のコロニーを、２％グルコースを補充した10 0mg/mlアンピシリンを有するTY培地（TY/G/A）を含有する96ウェルプレートに取 り出し、４〜16時間成育した（ストックプレート）。これらの培養物を用いて、 TY/Aおよび0.1％グルコースを含有する第２の96ウェルプレートに播種した。こ のプレートを、30℃にて２〜４時間インキュベートした後に、IPTGを１mMまで添 加することにより誘導し、そして一晩増殖させた。翌日、培養上清を、予め２mg /mlのRT3-BSAでコートし、そして２％ミルクパウダーでブロックしたELISAプレ ートに添加した。結合を１×MBS/２％ミルクパウダー中で実施し、そして結合を 、マウス9E10抗体を用い、それに続いてヤギ抗マウス−ペルオキシダーゼ（Sigm a，St．Louis，Missouri）を用いて検出した。mycタグペプチドを検出するため に用いた9E10抗体は、ATCC、Rockville，Maryland（CRL1729、与えられた名称は 、MYC1-9E10.2である）から入手可能である。 この手順を通して抗原としてRT3-BSAを用い、そしてMBS緩衝液を用いるPAN1か らの結合に関するスクリーニングにより、364のクローンから47の陽性を同定し た。同様の方法で、115/184の陽性を、PAN2から同定した。クローンの多様性を 、実施例4.0に記載のようにそれぞれのクローンからPCR増幅した一本鎖DNA挿入 物のBstNI消化により分析した。 結果を、以下に示すように１グループづつ表１に要約する。PAN1からの分析し た48の内の17のバインダー（35％）は、パターンAを有した。PAN2からの115の内 合計78の結合クローン（68％）が、PCRパターンAを有した。（これらの内の22を 再ストリークし、そしてさらに分析した。これらを図１および表１に示す）。パ ターンBは、PAN1からの48の内の２クローン（4.1％）、およびPAN2からの115の 内の24（21％）に見出された。PAN1からの48の内の２は、パターンCを有し（4.1 ％）、一方PAN2からの115の内の３（2.6％）は、このパターンを有した。パター ンDは、PAN1からの48クローンの内の３（6.2％）、およびPAN2からの115の内の ３（2.6％）において見出された。従って、それぞれのグループからの陽性の比 率は、PAN1からPAN2で変化するようである。選択が、単にRT3への結合の強度に 基づく場合、これは、いくつかのラウンドのパンニングの後に潜在的に触媒作用 的なクローンの損失を生じ得る。 少なくとも15の他のパターン（多くが１度のみ現れる）が、PAN1において見出 された。PAN1に存在する多くの他のパターンは、PAN2において同定されなかった 。さらに、PAN1において同定されなかったいくつかのパターンが、PAN2に現れた 。これは、ライブラリー中に、本発明者らが同定したPCRパターングループによ り示されるよりもかなり多くの多様性が存在することを主張する。実施例4.4 マウスRT3ファージ抗体ライブラリーから選択されたクローンの結合分析 PAN2から単離したいくつかのマウスRT3ファージ抗体クローン（表１、実施例4 .3を参照のこと）を、結合特異性に関してさらに特徴付けた。競合阻害様式を用 いて分析を行った。この分析において、以下に詳細に記載されるように、RT3-BS Aコートしたウェルに添加する前に、抗体を遊離ハプテンまたは産物あるいはハ プテンおよび産物の一部と最初に反応させる。 分析のために選択されたクローンおよびそれらの相当するPCRパターン（表１ 、実施例4.3を参照のこと）は、50（PCR B）、64（PCR A）、68（PCR D）、71（ PCR E）、80（PCR C）、84（PCR A）、95（PCR I）、96（PCR A）、および97（P CR A）であった。結合した抗体を50mM EDTA、0.5M NaClで溶出した以外は、実施 例4.1に記載のIMACプロトコルを用いて、各々のクローンの50ml培養物から可溶 性scFvを精製した。各々のクローンに対するscFv濃度を、適切なscFv濃度スタン ダードを含有するゲル上で溶出したタンパク質の一部を泳動することにより、銀 染色SDSポリアクリルアミドゲルから見積った。scFvタンパク質を４μg/mlにま で希釈し、次いでRT3-BSAコートしたELISAプレートの11ウェルにわたって1:2に 系列希釈した。最大ELISAシグナルの50％を与えるscFvの濃度を、滴定から測定 した。このscFvの濃度を、以下に記載の引き続く競合阻害アッセイに用いた。 競合阻害ELISAアッセイを、各々100μMの以下の化合物とともにscFv（上記の 滴定によって決定した濃度で）をインキュベートすることにより実施した：RT3 ハプテン（化合物７、図１）、RT3ハプテンの左側部分（RT3Aと呼ばれる、化合 物８、図２）、RT3ハプテンの右側部分（RT3Bと呼ばれる、化合物12、図３）、 基質（化合物15、図４）のエステル分解切断（esteriolytic cleavage）からの 予測される産物の左側および右側部分（Product A（メシチル酢酸(Mesitylaceti c acid)、図４）およびProduct B（化合物13、図４）と呼ばれる）。scFvを、RT 3-BSAコートELISAウェルに添加する前に、室温にて１時間チューブ中でインヒビ ター化合物とともにプレインキュベートした。アッセイの結果を図８に示す。OD415 nmでの読み取り値を、１の値（これは、添加した競合インヒビターの非存在 下で相当するscFvに対して見られるELISAシグナルを表す）に規格化した。この 結 果は、68および71の例外を除く全てのクローンが、RT3-BSAへのそれらの結合に おいて遊離RT3ハプテンにより阻害されることを示す。遊離RT3による阻害を示さ なかったクローンは、BSAとの交差反応性を有することが示された。クローン64 、84、96、97、および50はまた、RT3Aによる結合阻害を示し、そしてProduct A によりもっと小さな程度の結合阻害を示す。RT3BまたはProduct Bで試験したク ローンのいずれについても阻害は見られない。実施例4.5 マウス抗RT3 scFv（単数または複数）の配列決定 PAN1およびPAN2由来のクローンの大部分は、PCR Aパターングループに分類さ れるが、このグループのクローンが、同一であるか、または異なるかは明確でな かった。そこで、これらのクローンの多くを配列決定した。さらに、同一の重鎖 および軽鎖が、他の主要なパターングループ内で用いられているかを決定する試 みにおいて、他の主要なグループからのいくつかの代表的なクローンを配列決定 した。 一本鎖DNAを、表１に示されるこれらのクローンから調製し、配列決定を、Seq uenaseキット（USB，Cleveland OH）を用いて実施した。Genbank生殖系列配列に 対する配列アライメント、およびクローン間での配列アライメントを、「MacVec torTM」（IBI，New Haven，Connecticut）プログラムを用いて実施した。5'およ び3'末端の配列は、PCRプライマーによりコードおよび強要されているので、こ れらをアライメントのために「除去」した。軽鎖配列の提示において、プライマ ーコード配列は示していないが、用いたプライマーを右側のカラムに示す。重鎖 について、5'プライマーは、単一であるが、縮重プライマーであるので、このプ ライマーにより導入される配列を、各々の場合において示す。比較のために、実 際の重鎖プライマー配列を、各々のクローンの5'および3'末端で示す。１つのク ローンの配列を、最上列に示し、そして他のクローンについてこの配列との差異 を示す。全てのPCR A変異が示す（アミノ酸を生じる）変化を、配列決定ゲルに おいて再検討した。パターンAの重鎖について、全ての独自の変化を、配列決定 ゲルにおいて再検討し、そして多数のクローンにおいて生じる変化を、この変化 を保有する少なくとも１つのクローンにおいて検討した。 マウスRT3バインダーの軽鎖配列 図９に示すように、８つの異なる軽鎖は、パターンAからの15の異なるクロー ンに用いられている。クローンmR6およびmR8に関連する鎖は、１つのサイレント なヌクレオチド変化により、生殖系列V遺伝子と異なる。mR9、mR18およびmR27に 用いられる鎖は、別の１つのサイレント変異により、mR6およびmR8と異なる。従 って、これらの５つのクローンは、生殖系列と同一のタンパク質配列を共有する 。クローンmR9およびmR27は、異なるプライマーを使用して同一の配列を派生し ている。これは、それらがこの同一配列の独立した単離物であることを示す。 クローンmR3およびmR25は、増幅されているが、また互いに異なるプライマー を使用している配列において同一である。mR3およびmR25が共有する配列は、２ つのサイレントなヌクレオチド変化および、FR3およびCDR3において２つのアミ ノ酸変化を生じる２つの変化により、mR6およびmR8と異なる。ほとんどの変化は 、クローン14、30、36、84、および96により共有される軽鎖中に生じる。これら およびこのグループのすべての他の軽鎖において、ほとんどのアミノ酸変化は、 FR3、CDR3、およびFR4に集まる。 mR6/8またはmR9/25で示される基礎的な生殖系列クローンが予想され得る。こ れらは、CDR2におけるSからNへの変化、および次いで３つの異なる様式における 変化により、４、97、および14（＋他の４つ）により示されるクローンを生じる 。同様に、同一の開始点からCDR3におけるYからFへの変化が存在し得、これによ り、mR3およびmR25が生じる。変化の第３系列は、mR24を生じ得る。 パターンC（クローンmR80）に関連する軽鎖もまた、パターンAクローンで用い られる生殖系列配列とともに整列させて図９に示す。パターンCの軽鎖は、パタ ーンAにおいて用いられているものと同一の生殖系列に由来する、より高度に変 異した形態であるようである。 他のPCRパターンを示すクローンは、異なる生殖系列由来の配列を使用するよ うである。最も近親な生殖系列に対するこれらの他のクローンの関係を図10に示 す。パターンB（50、69）において、生殖系列からの２つのヌクレオチド変化は 、 １つのアミノ酸変化を生じる。パターンD（10、43、および68、および83）にお いて、生殖系列からの８つのヌクレオチド変化は、５つのアミノ酸変化を生じる 。パターンI（95）において、生殖系列からの２つのヌクレオチド変化は、１つ のアミノ酸変化を生じる。 図11は、パターンA（mR6、mR8に関する）の軽鎖配列に対する異なる軽鎖配列 の関係を示す。これらの間には多くの差異が存在する。パターンDおよびIに関し て、タンパク質配列のみを示す。なぜなら、ヌクレオチド配列は、多くの差異を 有するからである。後者の２つのグループは、他のものよりも長いCDR2を有する 。 マウスRT3バインダーの重鎖配列 PCRパターンAに関連する重鎖配列の分析は、軽鎖に関するのと同様に、それら が全て密接に関係しているが、ほとんどの場合において互いに異なることを示す （図12）。生殖系列に対するアライメントは、これらのサンプルにおいて幾分明 確ではない。単離されたクローンにおいて、最も近親な生殖系列は、サブグルー プVH-IIに属するが、この生殖系列とは多数の差異が存在する。さらに、クロー ン間でより多くのアミノ酸変化が存在するようである。予測したように、変化は 、CDR中に集まっている。 パターンBの重鎖（図13）を、異なる生殖系列に対して整列させて、そして再 びこれからの多数の変化を示す。このグループにおけるの４つ全てクローンは、 同一のようである。従って、パターンBから配列決定されたクローンは、同一の 抗体の複数の単離物であるようである。パターンDにより示されるクローンは、 全て互いに同一であり、そしてCDR3の配列を除いて、４つのアミノ酸が最も近親 な生殖系列と異なる（図13）。 パターンBの重鎖と全ての異なる重鎖パターンとのアライメントを図14に示す 。パターンC（80）およびパターンI（95）の重鎖は、パターンBの重鎖と密接に 関係する。パターンCは、４つのアミノ酸が異なる。パターンIは、１つのサイレ ントな変異および１つのアミノ酸変化により異なる。興味深いことに、パターン B、C、およびIに関連する重鎖は、わずか３アミノ酸のCDRを有する。 mR95におけるアミノ酸変化は、アンバーコドンを導入するようである。これは 、 サプレッサー株TG1が、ファージの調製に用いられる場合、この位置にアミノ酸 を導入するが、可溶性抗体のスクリーニングに用いられる非サプレッサー株HB21 51においては、終止コドンとして作用することが予測される。 パターンAにおけるクローンの多様性 表２は、PCRパターンA中のクローンを配列決定したことから得られた情報を照 合する。このグループにおける各々の異なる軽鎖配列を、ラベルai〜aviiiで示 す。このグループにおける各々の異なる重鎖配列を、ラベルAi〜Axで示す。 クローン14、30、36（PAN1）、84、96（PAN2）は、同一であり、そしておそらく 同一の最初のクローンの複製した単離物を表す。クローン６および８はまた、互 いに同一である。他の場合は、全てのクローンは異なる。同一の軽鎖が、２つの 異なる重鎖とともに用いられた２つの場合が存在する（mR9/mR27のaiiおよびmR3 およびmR25のaiii）。上述したように、各々のペアリングにおける軽鎖は、異な るプライマーを用いた。複製した単離物は別として、同一の重鎖が異なるクロー ンに用いられる場合は、ここでは存在しない。 これらのPCRおよび配列決定実験は、マウスライブラリーにおいて、PCR分析に より判断される全体規模、および配列決定により判断されるより微小(subtle le vel)レベルの両方において、かなりの多様性が実際存在することを示唆する。実施例5.1 触媒活性に関するscFv分子のスクリーニング １．第１の選択 初期のスクリーニングプロトコルを用いて、ハプテン親和性に基づいて選択し た多数のscFvフラグメントから潜在的に触媒性のscFv分子のサブセットを迅速に 選択した。 a）固定化：ELISAアッセイにおいてハプテンに結合したscFvフラグメントを、 触媒活性を検出するスクリーニングについて選択した。96ウェルMillititer GV 濾過プレート（Millipore）を、0.05％Tween-20を含有するPBSで予め湿らせ、そ して洗浄した。抗myc抗体Protein Aアガロースに固定化したscFvフラグメントの 懸濁液（前記参照、さらに実施例6.1も参照のこと）を、96ウェルフィルタープ レート中の個々のウェルにそれぞれ移した。残渣の上清を、フィルタープレート を通しての吸引により除去した。固定化scFvフラグメントを、PBS/Tween（5×20 0μL）、PBS（3×200μL）、および25mM HEPES（pH 7.0）、140mM NaCl、0.01％ NaN3（3×200μL）による４℃での濾過によりウェル中で洗浄した。 b）scFvおよび基質のインキュベーション：固定化し洗浄した抗体に、25mM He pes(pH7.0)、140mM NaCl、0.01％ NaN3中の約50μMの基質（1）の200μLを添加 した。引き続く約24時間室温（約22℃）でのインキュベーションの後、基質溶液 （ビーズではない）を取り除き、そして高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に より分析するまで凍結（-20℃）した。同一の96ウェルプレート（依然として固 定化scFvを含有する）を、10mM Tris，pH9.0、140mM NaCl、0.01％ NaN3にて、 ４ ×200μL/ウェルで洗浄した。再び、200μLの（今回は上記のpH 9.0緩衝液中の ）35〜50μMのRT3基質（化合物15、図４）を添加した。scFvフラグメントを、３ 時間化合物１とともにインキュベートし、そしてpH 7.0の場合と同様に、基質溶 液を除去し、後の産物形成の分析のために凍結した。 c）産物形成に関する反応混合物の分析：サンプル数を減少させるために、概 して２または３つの反応混合物（50μLの各々の反応混合物）のプールを、HPLC 分析にかけた。混合物（100または150μL）を、Eppendorf遠心分離器において遠 心分離し、HPLCシステムへのアガロースの持ち越しを防止した。次いでサンプル を、Vydac C-18分析用逆相カラムを備えたWaters HPLCシステムに注入した。溶 出液の成分を、30分にわたる、0.1％TFA水溶液から0.1％TFAアセトニトリル溶液 への直線勾配を用いて分離した。産物を、Watersスペクトル検出システムを用い て（代表的には、215または270nmに設定して）、分光光度的に検出および定量し た。 46個のハプテン結合scFvフラグメントの初期のスクリーニング分析を、pH 7.0 および9.0で実施し、触媒活性を検出した。HPLC分析を実施し、そして産物の予 測される保持時間にピークを与えるサンプルプールについてピーク面積を測定し た。結果を、下の表３に要約する。反応混合物（２または３のプールとして）の HPLC分析は、pH 7.0において、３つのサンプルからなる１つのプールおよび２つ のサンプルからなる１つのプールが、実質的な産物形成を有するようであること を示した。pH 9.0において、多数のプールが、バックグラウンドより上の産物ピ ーク面積を示した。３つのサンプルからなる３つのプールが、0.6よりも大きな ピーク面積を有する大きな産物ピークを示し、これらは陽性として得点付けられ た。従って、初期のスクリーニング分析は、潜在的に触媒性のscFvフラグメント の数を、pH 7.0において46から５に、そしてpH 9.0において46から９に限定した 。pH 7.0における３つの候補は、pH 9.0における３つの候補物と同一のscFvフラ グメントであった。 上記の同定された各々の活性プール由来の個々のクローンを、触媒活性について 再アッセイした。scFvは、抗Mycアガロースに結合したままであるので、プール アッセイに用いた同一の材料を、個々のクローンのアッセイに再使用した。触媒 性アッセイの結果を以下の表４に示す。触媒性アッセイは、６つのクローンを同 定した：11、12、18、19、30、および83。これらは、HPLCにおいて産物ピークを 生じた。クローン83は、pH 7.0において活性であったが、pH 9.0において活性で はなかった。クローン18およびクローン19は、pH 7.0および9.0の両方において 活性であった。クローン11、12、および30は、pH 9.0においてのみ活性であった 。 実施例5.2 １．触媒活性の２次スクリーニング scFvフラグメントを触媒活性についてさらに調べるために、上記の初期スクリ ーニングで同定された潜在的に触媒性のタンパク質を個々に増殖させ、そして精 製した。scFvの精製は、IMACまたは抗Myc-プロテインＡアガロースでのアフィニ ティークロマトグラフィーのいずれかを使用して実施例6.1に記載のように達成 された。アッセイは、初期スクリーニングと同じ緩衝液システムおよびpH値で行 われたが、しかし抗体は個々に試験され、そして抗体は固定化されず溶液中に遊 離していた。 これらの２次アッセイから、18および83と称する２つのscFv分子の触媒活性が 見出された。クローン18は、pH9.0で活性であるがpH7.0で不活性であるようであ り、一方クローン83は、pH7.0で活性であるがpH9.0または5.0で不活性であるよ うである。両方の活性は、10μMの抗体を40μMの基質および30μMのハプテンと 共にアッセイした場合、ハプテン(2)により有意に阻害された。これらの２つの クローンを以下に記載のようにscFvの大量精製のための候補として選択した。こ れらのアッセイの結果を実施例6.4に示す。実施例6.1 触媒性mRT3ファージ抗体クローン18およびクローン83由来のscFvの大量精製 ペリプラズム溶解物の調製−可溶性抗RT3 scFvを発現するE.coli HB2151クロ ーンを、２％グルコースおよび100μg/mlアンピシリンを含む２×YTにおいて一 晩増殖させた。一晩培養物を使用して0.1の出発OD600で500mlの２×YTに接種し 、そして培養物を1.2〜1.8のOD600まで28℃にて３〜５時間振盪した。IPTGを１m Mの最終濃度で添加し、そして振盪インキュベーションを25℃にて2.5時間続けた 。細胞を4000×Ｇで10分間ペレット化し、そしてペレットを６mlのペリプラズム 溶解緩衝液(10mMリン酸緩衝液、１M NaCl、１mM EDTA、pH7.5)に再懸濁した。氷 上にて30分間インキュベーションした後、溶解物を6,000×Ｇで遠心分離して細 胞の破片を除去した。PMSFを清澄な溶解物に最終濃度５μg/mlで添加し、そして 溶解物を以下に記載のように精製するまで氷上で保存した。 固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC) MgCl2をペリプラズム溶解物に１mMの最終濃度で添加し、そして溶解物を10mM リン酸緩衝液、１M NaClで洗浄し、そして平衡化した１mlのベッド容量のNi2+荷 電セファロースカラム(Probond Metal binding Resin，Invitrogen Corp.,San D iego，CA.)に通した。カラムを10ベッド容量の10mMリン酸緩衝液、１M NaCl、pH 7.5で洗浄し、そして結合したscFvを50mM EDTA、0.5M NaClで溶出させた。カラ ム溶出物を濃縮し、そして７mMリン酸緩衝液、0.15M NaCl、pH8.0においてCentr icon 10マイクロコンセントレーター(Amicon，Beverly，MA)を製造者の説明書に 従って使用して透析した（Mol.Cell.Biol. 5（1985）：3610-3616を参照のこと ）。scFvのいくつかの調製物については、IMAC溶出物の濃縮は必要でなかった。 抗mycペプチドアフィニティー精製−scFvのＣ末端の13アミノ酸のペプチドタ グを認識するモノクローナル抗体9E10を、Affinica Antibody Orientation Kit (Schleicher and Schull，Keene，NH)を製造者の説明書に従って使用してプロテ インＡアガロースに架橋結合させた。１mlのベッド容量のカラムを0.23Mグリシ ン、0.3M NaCl、pH2.5で予め洗浄し、そして10mMリン酸緩衝液、0.5M NaCl、pH7 .5で再び平衡化した。ペリプラズム溶解物を等量の10mMリン酸緩衝液、pH7.5で 希釈し、次いでカラムを通過させた。カラムを10ベッド容量の10mMリン酸緩衝液 、0.5M NaClで洗浄し、そして結合したscFvを0.23Mグリシン、pH2.5、0.3M NACl で溶出させた。いくつかの調製物については、カラム溶出物を透析し、そして上 記のようにCentricon 10マイクロコンセントレーターを使用して濃縮した。実施例6.2 疎水性相互作用クロマトグラフィーによるファージ抗体触媒性クローン18および クローン83由来のScFvフラグメントの精製 E.coliクローン18および83の溶解物に由来するscFvのIMACまたは抗mycペプチ ドプロテインＡアガロース精製（実施例6.1を参照のこと）の後、scFvのさらな る精製をFPLCシステム(Pharmacia)に接続したアルキルsuperose 5/5カラムで達 成した。 クロマトグラフィーを、0.1M リン酸ナトリウム(pH7.0)中の(NH4)2SO4の直線 逆勾配を使用して行った。これは２つの緩衝液から形成されている： 緩衝液Ａ：0.1M リン酸ナトリウム(pH7.0)中の２M(NH4)2SO4 緩衝液Ｂ：0.1M リン酸ナトリウム(pH7.0) 勾配条件は以下のようであった： ０〜３ml：10％緩衝液Ｂ ３〜39ml：直線勾配、10％〜70％緩衝液Ｂ 39〜42ml：直線勾配、70％〜100％緩衝液Ｂ 42〜44ml：100％緩衝液Ｂ 44〜46ml：直線勾配、100％〜10％緩衝液Ｂ 46〜49ml：10％緩衝液Ｂ サンプルを0.783容量の0.1M リン酸ナトリウム中の(NH4)2SO4飽和溶液(4.1M(N H4)2SO4)の添加により1.8M(NH4)2SO4の最終濃度に調整し、そして適切な容量の1 0％緩衝液Ｂ：90％緩衝液Ａで希釈し、カラムに注入するために適切な値に容量 を増大させた。画分を採集し、そしてScFvに対応するピークをSDS-PAGEにより上 記のように同定した。これらをプールし、濃縮し、そして適切に結合活性または 触媒活性のアッセイに使用した。カラムからのタンパク質の溶出を、OD280によ りモニターし、そして自動的にプロットした。クローン18由来のIMAC精製scFvの 代表的なクロマトグラムは、２つの異なるピークに溶出するタンパク質の大部分 を示す。それぞれのピークに対応する画分を示したようにプールした。ピーク１ は、17.25〜21.90％の緩衝液Ｂで溶出する広いショルダー（プール１）とそれに 続く24.2％緩衝液Ｂでの鋭いピーク（プール２）からなる。ピーク２は、48.10 ％緩衝液Ｂで溶出する鋭いピーク（プール３）である。scFvの精製を、銀染色SD S/PAGEによりモニターして、以下の結果を有する。HICカラム(IMAC精製scFv＋(N H4)2SO4)へのロード物質は、90％より多くのタンパク質がscFvであることを示し た。少なくとも４つの別のバンドも可視であった。HICの後に得られたプール１ およびプール２の分析により、ロードされたscFvの大部分がこれらのプールに同 等に分布しており、そしてscFvの実質的な精製が達成されなかったことを示した 。プール３は、少量のscFvおよびさらなる低分子量のバンドを含んでいた。 クローン83についてのクロマトグラムは、scFvタンパク質の大部分が54.7％緩 衝液Ｂでの単一の鋭いピークにおいて溶出することを示す。タンパク質の第２の 小さなピークは、100％緩衝液Ｂでの最終洗浄の間に溶出する。これらのピーク に対応する画分をプールし、そしてSDS/PAGEとその後の銀染色により分析した。 HIC(IMAC精製物質＋(NH4)2SO4)のカラムロード物質は、90％より多くのscFvを含 んでいた。HIC後、scFvの大部分を、54.7％緩衝液Ｂで溶出する単一の主なピー クにおいて回収した。クローン18については、scFvの実質的な精製はHICによっ ては達成されなかった。少量のscFvが後に溶出する小さなピークにおいて見出さ れた。実施例6.3 ファージ抗体触媒性クローン18およびクローン83に由来するIMACおよびHIC精製S cFvの結合アッセイ 上記の精製プロトコルに由来する画分または画分のプールを（実施例6.1また は6.2）、本質的に実施例4.4に記載のようにRT3-BSA固相ELISAアッセイを使用し て、RT3結合活性について分析した。画分または画分のプールをまず第１にPBS/T ween-20中で１：５または１：10に希釈し、次いでRT3-BSAでコートしたELISAプ レートの11個のウェルにわたってPBS/Tween-20中で１：２に連続希釈した。50％ 最大のELISAシグナルを与える力価を、分析した各サンプルについて測定した。 分析したプールまたは画分の容量をこの力価に掛けることにより、各サンプルに おける結合単位の数の推定値を決定し得る。この分析は、クローン83について、 HICカラムにロードしたscFvの大部分が回収されたが、これはカラムロードと比 較して10％未満の結合活性を有したことを示した。この結果は、HICがscFvの精 製に不適切であり得ることを示唆する。なぜなら、結合活性およびおそらくは触 媒活性の損失をもたらすscFvタンパク質の不安定性をもたらし得るからである。実施例6.4 ファージ抗体クローン18およびクローン83に由来するIMACおよびHIC精製scFvの 触媒性アッセイ クローン18については、代表的な触媒性アッセイを以下のように設定した：50 μlのscFvを、145μlのRT3基質（化合物15、図４）および５μlの水またはいく つかのアッセイでは５μlのRT3ハプテンに添加した。50μlの水および147μlのR T3基質からなるブランクを、RT3基質のバックグランド加水分解をモニターする ために設定した。反応を６時間進行させ、その後サンプルを−20℃で凍結させて 反応を停止させた。サンプルを実施例5.1に記載のようにHPLCにより分析した。 アッセイに添加したscFvの量は代表的に１〜５μgの範囲であり、そしてタンパ ク質を10mM Hepes、150mM NaCl、pH7.3において緩衝化した。代表的なRT3基質濃 度は、25mM Tris-HCl(pH9.0)、140mM NaCl、および0.01％NaN3において緩衝化し て50μMであった。 IMAC精製18scFvについての代表的な陽性の触媒性アッセイの結果を示すHPLCプ ロフィールを図15Aに示す。図15Bは、同じアッセイであるがRT3ハプテン（化合 物５、図１）の存在下で行ったHPLCプロフィールを示す。最後に、図15Cは、ブ ランク（scFvを加えない）のHPLCプロフィールを示す。 同様の様式で、18 scFvのHIC精製（実施例6.2を参照のこと）後に得られた画 分プールのアッセイも行った。主要なscFv含有プール（上記の実施例6.2に記載 のプール２）のアッセイの代表的な結果を図16に示す。同様の結果がプール１お よびプール３のアッセイから得られた（データは示さず）。 クローン83に由来するIMACまたはHIC精製scFvのアッセイを以下を除いてクロ ーン18について記載したのと同様の様式で行った。基質を25mM HEPES(pH7.0)、1 40mM NaClおよび0.01％NaN3において緩衝化した。中性のpHでのRT3基質のより低 いバックグランド加水分解のために、反応は代表的に24時間行った。IMAC精製83 scFvについての陽性の触媒性アッセイの結果のHPLCプロフィールを図17Aに示す 。RT3ハプテンの存在下で繰り返した同じアッセイを図17Bに示す。ブランクもま た分析し、そして図17Bにおけるプロフィールと同様のプロフィールが得られた （データは示さず）。HIC後（実施例6.2を参照のこと）に得られた主なscFvを含 有するプールの触媒性アッセイを図18に示す。 期待された産物ピークならびに産物に関連しないピークの保持時間がHPLCのラ ンの度に変化したことに留意されたい。この変化の理由は未知である。RT3産物 （化合物13、図４）単独のHPLCでの試験ランおよび215nMでのモニターにより、 異なるピークプロフィールが生成されたことが示された。この215nMのプロフィ ールを内部コントロールとして使用して、各HPLCランの270nMプロフィールでの 産物ピークの位置を正確に決定した。 上記のように行った触媒アッセイの結果からの結論は、以下のとおりである。 クローン18および83の両方に由来するIMAC精製scFvはRT3基質を加水分解し得、 そして適切な保持時間でHPLCカラムから溶出する産物ピークを生成する。RT3ハ プテンの存在下では、触媒作用は、おそらくRT3基質と比較して抗体ポケット中 でのRT3のより強い結合により、完全に排除される。これは、scFvが触媒作用を 担うというさらなる証拠である。なぜなら、高い親和性でRT3基質またはハプテ ンを特異的に認識し、そして結合し得る天然のエステラーゼが存在しなさそうで あるからである。 クローン18または83のいずれかについてのscFvのHIC精製後、scFv含有画分に おいて触媒活性が観察されなかった。活性の損失は、おそらく折り畳まれていな いことまたは凝集をもたらすscFvの不安定性により得る。クローン83についての scFvの不安定性は、実施例6.3に記載のHIC精製scFvで行われたアッセイにおける 結合の損失により明らかに示された。実施例7.1 未処置のヒトライブラリーからの遷移状態アナログRT3に対するバインダーの単 離 免疫化スキームが迂回され得、そして低親和性および中程度親和性のヒト抗体 （Kds86nMまで）が非免疫化供給源に由来するヒト抗体ライブラリーから直接単 離され得ることが示された(Marksら，J.Mol.Biol. 222(1991): 581-597)。この アプローチは、以下の実施例に記載された多くのアプローチにより改良され得る （単数または複数の）出発クローンを提供し得る(関連した実施例についてはMar ksら，Bio Technology 10(1992): 779-783を参照のこと)。従って、これらのア プローチは、特に治療的触媒性抗体の領域において極めて価値があると証明され 得る完全なヒト触媒性抗体の単離を導き得る。 Marksら，J.Mol.Biol. 222(1991): 581-597に記載された非免疫化ヒトライブ ラリーを、100〜200μg/mlのRT3-BSAのコート濃度が使用されたことを除いて免 疫化マウスライブラリーについて記載されたようにチューブにコートしたRT3-BS Aについてパンニングした。精製スキームの進行は、ポリクローナルなファージ を使用してELISAによりモニターした。RT3-BSAに対する２回のパンニングに由来 するポリクローナルなファージ(RT3BSA:2)は基質と共に一晩インキュベーション した後に可視シグナルを生じる。RT3-BSAに対する３回のパンニングに由来する ポリクローナルなファージ(RT3BSA:3)はELISAで強いシグナルを生じる（５分間 に１O.D.）。BSAに対する結合は全く観察されず、そしてRT3-BSAへの結合は10〜 100μg/mlの可溶性非結合RT3と予めインキュベーションすることにより阻害され た、このことは、これがRT3に特異的であることを示唆する（示さず）。 ３回および４回のパンニングに由来する個々のクローンを、実施例4.3に記載 の方法を使用して結合について試験した。大規模にスクリーニングを始める前に 、最少のELISAコート濃度を決定した。抗原濃度を100μg/mlから1.6μg/ml(100 μl/ウェル)に減少させると、シグナルの減少は30％しか招かなかったので（デ ータは示さず）、従って２μg/ml濃度を全ての以降のELISAスクリーニングに使 用した。 ３回のパンニングに由来する144クローンを、IPTGで誘導したHB2151クローン に由来する培養上清100μlを使用してRT3-BSAに対する特異的結合についてELISA アッセイにより試験した。図19Aに示すように、40クローンは強いELISAシグナル （基質との一晩インキュベーション後0.7〜2.5 O.D.）を与え、そして27クロー ンは中程度のシグナル（基質との一晩インキュベーション後0.2〜0.5 O.D.）を 与えた。図19Bは、RT3-BSAに対する４回のパンニングに由来する48クローンにつ いての結果を示す。この39クローンからは強いELISAシグナル（0.7〜2.5 O.D.） が示され、１クローンは中程度のELISAシグナル（0.34 O.D.）を示した。 PCR分析およびBst NI消化により、両方の回のパンニングに由来する試験した 良好なバインダーは全て、共通のPCRパターンを共有し、そして１つを除いて全 てのより弱いバインダーは、より高いバインダーのPCRパターンとは異なる共通 のPCRパターンを共有したことが明らかになった。１つのさらに別のパターンが 弱いバインダーの１つに関して見出された。Clacksonら，Nature 352(1991): 62 4-628により以前に記載されたように、中程度のシグナルについての濃縮と比較 して高いELISAシグナルに関するクローンの連続的な回のパンニングでの濃縮を 見ることは興味深い。実施例7.2 ヒトRT3バインダーの配列分析 以下に示す各PCRパターン群の種々のメンバーについて配列決定を行った： PCR1=RT3:1、４、５、41、63、80 PCR2=RT3:47、54 PCR3=RT3:61 各群のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図20に示す。実施例8.1 ヒトRT3バインダーの鎖シャッフリング 鎖シャッフリングに使用されるスキームを図21に示す。ヒトライブラリーまた はマウスライブラリーにおけるscFvクローンは全て、重鎖上流のプラスミド配列 、重鎖と軽鎖との間のリンカー配列、および軽鎖下流の遺伝子３配列を含む特定 の共通配列を共有する。プライマーをこれらの領域から選択／合成してクローン 化された重鎖または軽鎖のＶ領域を増幅する一般的手段を提供した。従って、プ ライマーLMB3およびPCRHLINKを使用するPCRは重鎖産物を生じるが、しかしプラ イマーFDTSEQ1およびLINKPCRLは軽鎖産物を生じる。LINKPCRLおよびPCRHLINKは 相補的であり、それゆえ産物を連結する手段を提供する。この方法により、各ク ローンに由来する別々の重鎖または軽鎖を、最初のライブラリーに由来する相補 鎖の集団全体に連結し得る。連結した産物は、プライマーLMB3およびFDTSEQ1を 使用する第２次のPCRのテンプレートとして作用し、そして第２次の産物を、ク ローニングのためにSfiIおよびNotIで消化する。プライマーを、各消化工程後に 観察されるべきフラグメントのサイズの変化を可能にするように選択した。さら に、消化の効率は、比較的大きな突出している制限部位の上流を有することによ りおそらく改良される。 鎖シャッフリングの方法 以下のプライマーを使用する： １次重鎖および軽鎖PCR産物を以下の反応により調製する： PCRの条件は、94℃１分間、60℃１分間、72℃２分間を25サイクルと最後に72 ℃で10分間である。単離されたクローンについては、テンプレートは細菌コロニ ー由来の爪楊枝接種物として最も簡便に提供され得る。ライブラリー材料につい ては、DNAを凍結細菌ストックから調製し、そして２〜10ngを反応液に添加した 。１次PCR産物をアガロースゲルで精製し、そして５μlのGeneclean「グラスミ ルク」(Bio 101，La Jolla，CA)を用いて精製し、それぞれ10μlの水中の２つの 溶出物を得た。 アセンブリーは、以下のように行う： 精製Ｈ 2.5μl(20〜50ng) 精製Ｌ 2.5μl(20〜50ng) 10×反応緩衝液 ２μl ５mM各dNTP 1.0μl Taqポリメラーゼ 0.2μl 水 37μl PCRの条件は、94℃１分間、65℃４分間を25サイクルと最後に72℃で10分間で ある。 2次PCRについては、１μlの連結した物質をテンプレートとして使用した。反 応は、以下のように設定した： 連結したPCR産物 １μl LMB3プライマー(10pmoles/ml) 2.5μl FDTSEQ1プライマー(10pmoles/ml) 2.5μl 10×PCR反応緩衝液 5.0μl ５mM各dNTP 2.5μl Taqポリメラーゼ(５U/ml) 0.3μl 水 37μl PCRの条件は、94℃１分間、60℃１分間、72℃２分間を25サイクルと最後に72 ℃で10分間である（５μlがゲルで容易に見られ得る）。 ２次産物をフェノール：クロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈澱させ てTaqポリメラーゼを除去した。PCR産物を、製造者の説明書に従って50℃にてSf ilで一晩消化した。翌日、37℃にてNotIで３時間消化する前に、１/10容量の１M NaClを添加して最終濃度を150mM NaClとし、Triton-XI00を添加して最終濃度を 0.01％とした。消化物をフェノール：クロロホルムで処理し、沈澱させ、H2Oに 溶解し、そして1.5％アガロースで泳動することにより精製し、そして「Genecle an」(Bio 101，La Jolla，CA)で精製した。DNAを最終容量10〜15μlで溶出し、 そしてpCANTAB5 his-6のSfiI/NotI部位にクローン化した。 pCANTAB5 his-6のプラスミドDNAをアルカリ溶解法により調製し、そして塩化 セシウム遠心分離により精製した。精製DNAを、100μg/mlのDNA濃度でSfiIで製 造者の説明書に従って消化し(SfiIについては50℃にて一晩)、次いでNotIで３時 間消化した。消化産物を直接Chromaspin 1000カラム(Clontech，Palo Alto，CA) にロードしてスタッファーフラグメントを除去し、そして卓上型遠心機にて2200 rpmで３分間スピンした。次いでDNAをフェノール：クロロホルム抽出し、そして 使用するために100μg/mlで溶解した。 ライゲーションをAmersham(Arlington Heights，IL)ライゲーションキットを 使用して以下のように行う： ベクターDNA １μl(100ng) 挿入DNA ２μl(10〜50ng) 10mM MgCl、200mM Tris（pH7.4） ３μl 緩衝液Ａ 24μl 緩衝液Ｂ ６μl 16℃にて30〜60分インキュベートする。ライブラリーの調製のために、上に示 す５倍の容量を使用した。ライゲーション産物を濃縮し、Genecleanを使用して 精製し、そして10〜15μlの容量の水に溶出した。これを、エレクトロコンピテ ントなＴファージ耐性TG1細胞にBio-Rad(Hercules，CA)エレクトロポレーターを 製造者の説明書に従って使用して導入した。 未処置ヒトライブラリー（実施例5.1を参照のこと）の４回のパンニング後に 単離された３つのクローンhRT3-1、hRT3-47、およびhRT3-61を、上記の鎖シャッ フリングプロトコルのテンプレートとして使用した。実施例5.2に記載のように 、配列分析により、３クローンはそれぞれVHおよびVL遺伝子利用に関して互いに 独特であることが示された。６つの異なるライブラリーを調製した。それぞれの 場合、ライブラリーの名前は、固定された鎖およびそれが由来するクローン番号 をいう。従って、H47は、ヒト軽鎖のライブラリーと結合したRT3:47由来の固定 された重鎖を有するライブラリーである。 得られたライブラリーのサイズは以下のとおりである： プライマーFDTSEQ1およびLMB3を使用するPCRを各ライブラリーに由来する10の コロニーについて行い、挿入の比率を決定した。結果を上の表に示す。さらに、 PCR産物をBstNIで消化して多様性を決定した。しかし、鎖シャッフルしたライブ ラリーにおける（所定のクローンの）約2/3の配列が現在固定されており、そし て同じＶ遺伝子ファミリーの異なるメンバーが同じ「BstNI特徴」を与え得るこ とを思い出すべきである。これにも関わらす、ライブラリーメンバーはいずれも もとのクローンに関連するパターンを有していなかった。いくつかの場合では、 同じライブラリー内にパターンが重複して見出され、そして１つのパターンはH1 ライブラリーにおいて３回見出され得た。実施例8.2 ヒト鎖シャッフリングライブラリーのパンニング ファージ粒子を、Marksら，Biotechnology 10(1992): 779-783に記載されたよ うにライブラリーからレスキューした。同じ出発クローンに由来するライブラリ ー対からのファージをプールし、そしてRT3-BSAに対してパンニングした（例え ば、H1およびL1）。パンニングおよびレスキューを、Nunc(Kamstrup，Denmark) 免疫吸着チューブを１mlのRT-BSA(20μg/ml)で一晩コートしたことを除いて、本 質的にMarksら，J.Mol.Biol. 222(1991): 581-597に記載のように行った。コー ティングおよびブロッキングを以前のようにリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中で 行った。等量の20mlのファージを、最終容量800μlの２％脱脂粉乳を有するMO PS緩衝化生理食塩水(MBS)中で使用した。洗浄、溶出、感染、およびM13ヘルパー ファージでのレスキューは上記のとおりである。 非パンニングライブラリー(PAN0)、１回目のパンニング(PAN1)、またはパンニ ング２回(PAN2)のいずれかに由来する「ポリクローナルな」ファージをELISAに 使用して各ライブラリー対のパンニングプロセスの進行を決定した。 図18に示すように、PAN0サンプルからシグナルは観察されなかった。低レベル のシグナルがRT3:1およびRT3:47に由来するPAN1サンプルにおいて観察され、そ してPAN2サンプルにおいて著しい改善が見られる。RT3:61に由来するライブラリ ーにおいては、ELISAシグナルは２回のパンニング後でさえ比較的低い。ELISAの 結果は、表４に示すように各回のパンニング由来の溶出液を定量する場合に反映 される。増加する数のファージが２回目のパンニングから溶出される。H61/L61 ライブラリーでのPAN1およびPAN2で得られるファージ数は、H1/L1およびH47/L47 ライブラリー由来の対応する収量よりも少ない。 表５は、再シャッフルしたヒトバインダーのパンニング由来の陽性物の比率を 示す。再シャッフルしたRT3:1およびRT3:47については、パンニング１回の後で すら大部分が陽性であるとスコアされた。再シャッフルしたRT3:61由来のポリク ローナルなファージはPAN1の後で陰性であり、そしてPAN2の後で陽性であったた め、個々のコロニーはこのライブラリー由来のPAN2からしか分析されなかった。 陽性クローンを再ストリークし、そしてRT3およびBSA結合について再試験した 。全ての再シャッフルしたヒトライブラリーは、パンニングの１〜２回後に高い 比率のバインダーを生じた。これらは、(FTDSEQ1およびLMB3を使用する)PCR/Bst NI消化により、以下の表６に示すように、RT3:1再シャッフルライブラリーにつ いては９PCRパターンに、RT3:47再シャッフルライブラリーについては４PCRパタ ーンに、そしてRT3:61再シャッフルライブラリーについては８PCRパターンにグ ループ分けされた。 軽鎖のライブラリーとシャッフルされた重鎖が、互いに関連しており、従って PCRパターンの多様性の可能性が減少した、異なる軽鎖を引き出すことの強い可 能性がある。逆に、所定のPCRグループ分けの中でさえ、ある程度の多様性が配 列決定により見出されることがありそうである。 どの抗体鎖がもとのヒトクローンに由来するかを決定する目的で、重鎖および 軽鎖のＶ遺伝子の別々のPCRを個々のクローンについて行った（鎖間のフレキシ ブルリンカーペプチドをコードする配列中に位置するプライマー（PCRHLINKおよ びLINKPCRL）と共にFDTSEQ１またはLMB3のいずれかを用いた）。各PCRグループ 由来のクローン対を分析した（表６中の下線）。この結果は、hu61:16およびhu6 1:33の例外を有して（パターンＢ）、全ての重鎖がもとの単離物と同じ重鎖を有 したことを示す。これらの２つのクローンは、今やRT3:47と同様な重鎖パターン および親クローンRT3:61と同様であり得る軽鎖パターンを有する。同じPCRパタ ーンを有すると記載された再シャッフルされたクローンは（３%ゲルで泳動した 全体のSCFvのPCR/消化から）、今や微小な相違を示す（４%ゲルで泳動した個々 の軽鎖のPCR/消化から）。従って、hu1:11およびhu1:22間（パターンＢ）、hu1: 17およびhu1:26間（パターンＤ）、hu1:32およびhu1:40間（パターンＥ）に相違 が見出された。RT3:47に由来するクローンについて、hu47:9およびhu47:10（パ ターンＢ）、hu47:37およびhu47:1（パターンＣ）の軽鎖間の差違が見出された 。RT3:61に由来するクローンについて、hu61:13およびhu61:24の軽鎖間（パター ンＡ）に相違が見出された。それゆえ、この分析はこれらのクローン間のより大 きな多様性を示す。 RT3:47のシャッフリングことに由来するクローンに対して配列決定を行った（ 表５で確認）。重鎖の分析は、hu47:7を除いて配列がもとの重鎖と同一であるこ とを示す。（分析したクローンは、hu47:1、2、3、5、6、8、9、10、12、20、お よび22であった）。hu47:7において、CDR2中のバリンはＴからＣへの変化により アラニンに変換された。軽鎖の配列決定を表５において下線で示したクローンに 対して行った。実施例9.0 特異的溶出／競合結合を使用する方向づけされた選択 結合に対する競合（例えば、反応産物を用いる）を使用するパンニングまたは 特異的溶出（例えば、より小さいホスホネートを用いる）を、パンニングプロセ スを制御するために使用し得る。このような手順をELISAウェルにおいて行う場 合、より高度の可変性が発揮され得る。従って、特定の手順の後溶出物を採集し 得、そしてプレート全体を検出手順にかける。結果に基づいて、特定のウェル由 来の溶出物を、さらなる分析／パンニングについて選択し得る。 100mMトリエチルアミンを使用して96ウェルプレートからの溶出物を試験する ための実験において、溶出後の一晩のELISAシグナルが0.289から0.019になった ことを見出した。（シャッフルされたヒトRT3:47ライブラリーの１回のパンニン グに由来する（47PAN1ファージ）2.5×1011個のポリクローナルなファージ／ウ ェルを使用した）。溶出物の力価測定は、7.5×107個の感染性ファージ（すなわ ち、インプットの0.03%）が採集されたことを示した。これは、Nunc免疫吸着チ ューブからの溶出物と良好に比較される。この場合、同じサンプルについて1.6 ×109個の感染性ファージが１×1013個のインプットから生じた（すなわち0.016 %）（表３を参照のこと）。このタイプのアプローチにより、特定の溶出手順の 範囲を比較し得、そして最も適切なサンプルをさらなる研究のためにE.coliに感 染させた。 RT3分子の左側および右側に等価な最少の遷移状態のアナログをRT3a（化合物 ８、図２）およびRT3b（化合物12、図３）という。基質切断の左側の産物および 右側の産物を産物Ａ（メシチル酢酸、図４）および産物Ｂ（化合物13、図４）と いう。もとのマウスライブラリーのパンニング／溶出のために必要な種々の成分 の最適濃度を決定するために、希釈系列をRT3、RT3a、RT3bおよび両方の反応産 物（産物Ａおよび産物Ｂ）について調製した。これらを、マウスRT3ライブラリ ーの１回目のパンニングに由来する100μlの10×ポリクローナルなファージとプ レインキュベートした（トリエチルアミン溶出を使用した）。 この分析の結果を図23Aおよび図23Bに示す。最も効果的な阻害は、RT3自体を 用いて生じる。この選択されたファージ集団の結合が、右側の部分（図23Ｂ）に よってよりも左側のTSAおよび産物（図23A）によりかなり大きな程度まで阻害さ れることが明らかである。実際、右側のTSAおよび産物を用いて試験される濃度 でなんらかの阻害が生じるかどうかは全く明らかではない。さらに左側の産物よ りも左側のTSAによるより大きな阻害が存在するようである。 もとの非パンニングマウスライブラリーを使用して特異的溶出を試みた。これ は、150μlの２μg/mlのRT3-BSAでコートし、そして200μlの２%Marvelでブロッ クしたELISAウェルへの、200μlの10×ファージ濃縮物の結合により行った。フ ァージを１時間結合させ、以下を200μl添加することにより溶出した： 0.05μM,0.5μMまたは5μM RT3 5μM,50μMまたは500μM RT3a 5μM,50μMまたは500μM RT3b 100 mMトリエチルアミン ２回の15分間の溶出に由来するファージをプールし、そしてTG1細胞またはHB2 151細胞に再導入した。図24Aは、それぞれの条件の設定下で生じたファージの収 量をプロットする。トリエチルアミンは、２mlの培養上清に等価なインプットか ら約104個のファージを与える。これは、以前の報告において記載される好結果 のパンニングと一致し、これは以前に記載されたマウスクローンの全てを生じて いる。この実験において、約105個のファージが20mlの培養上清に等価であるイ ンプットに由来した。RT3およびRT3aでの溶出は、トリエチルアミンよりも多数 のファージを生じる。RT3bは、「緩衝液単独」のコントロールにおいて達成され る溶出のレベルに等価な、またはそれよりも多くの溶出レベルを与える。 この実験を反復したが、高いコート濃度（100μg/ml）のRT3-BSAを使用し、そ して容量をインプットファージの容量を上回るコート容量およびブロック容量を 確実にするように（ウェルの側面への非特異的なファージの接着に関連するあら ゆるバックグランド問題を防止するため）調整した。この実験（図24B）におい て、全てのサンプルにおける溶出されたファージの総収量は、以前よりも減少し た。 ポリクローナルなファージおよび可溶性抗体を種々の集団から調製し、そして ELISAにおいて試験した。陽性シグナルを可溶性およびファージELISAを用いて、 500μMのRT3aを用いた溶出により由来するサンプルから達成した。この集団由来 の個々のコロニーをスクリーニングし、そして22/144のクローンが陽性であるこ とを見出した。 もとの免疫吸着チューブ（Nunc）においてまた、パンニングを行った。溶出を 100mMトリメチルアミンまたは500μM RT3aのいずれかを用いて行った。結合を産 物Ａの存在下（50、500、5000μM）または非存在下で行った。結果を以下にまと める： この実験において、トリエチルアミンおよびRT3a溶出によるファージの収量（ 42〜52×106個）は、以前の実験よりも高い。50μMの産物Ａが結合の間に存在す る場合、RT3a溶出に由来するファージの収量は70倍減少する（このことは、結合 が特異的であることを示している）。500μMの産物Ａを用いて同様の減少が存在 するが、5000μMの産物Ａを使用する場合、収量は47×106個に戻る。（このこと は産物を溶解するために使用したDMSの効果であり得、DMSはこの特定のサンプル 中に7.2%で存在した）。従って、最少のTSA分子でハプテン溶出を使用して96ウ ェルかまたは免疫吸着チューブのいずれかからファージを溶出することが可能で ある。さらに、結合プロフィールは反応産物と競合することにより変化され得、 それによって、所望の要求に従って溶出された集団の結合プロフィールを調製し 得る。実施例10 ヒトRT3バインダーのCDRシャッフリング CDRフラグメントをシャッフルするために使用するスキームは、実施例8.1に記 載される鎖シャッフリングスキームの改変である。 プライマーVHCDR3BACKおよびREV VHCDR3BACKは、互いにそしてCDR3のすぐ上流 のヒトVH遺伝子のフレームワーク領域における保存配列に相補的である。Marks ら(1991)により記載されるライブラリー由来の重鎖のCDR1およびCDR2の両方を含 むDNAフラグメントの集団を、REV VHCDR3BACK（配列については下記を参照のこ と）およびLBM3（実施例4.2に記載）を用いて増幅し得、そして選択されたクロ ーンからのscFVの残りをVHCDR3BACK（配列については下記を参照のこと）および FDTSEQ1（実施例4.2に記載）を用いて増幅し得る。このことは、２つのフラグメ ントのアセンブリ反応により単一クローンの残存部分とCDR1およびCDR2の集団と の結合を可能にする。 同様に、重鎖のCDR3領域を含むDNAフラグメントのライブラリーを、VHCDR3BAC Kおよびリンカーに位置するプライマーPCRHLINK（実施例4.2を参照のこと）を用 いて増幅し得る。選択したクローン由来の重鎖の残存部分を、REV VHCDR3BACKお よびLMB3を用いて増幅し、そして軽鎖をLINKPCRL（実施例4.2を参照のこと）お よびFDTSEQ1を用いて増幅した。このように、CDR3フラグメントの集団を２つの 連続した２つのフラグメントのアセンブリ反応（第一は、CDR3の集団とのクロー ンに由来するCDR1およびCDR2のアセンブリを包含する）により単一のクローンに 導入し得る。この後に、このフラグメントのフランキングプライマーであるLMB3 およびPCRHLINKを用いて二次PCR反応を行う。この産物を、クローン由来の軽鎖 とのこれの次のアセンブリのためにゲル精製した。 両方のCDRシャッフリング方法のために、scFVフランキングプライマーであるL MB3およびFDTSEQ1を用いる最後のPCR反応を行う。次いでCDRシャッフルされた物 質を、pCANTAB5-his6にクローニングするために、NotIおよびSfiIで消化する（ 図７を参照のこと）。 CDRシャッフリングのための方法 プライマーFDTSEQ1、LMB3、PCRHLINKおよびLINKPCRLは、実施例4.2に記載され ている。さらに、以下のプライマーを使用する： （括弧内のヌクレオチドは、普遍的な増幅を確実にするために設計されたプライ マー中の「変動」を示す。） 一次PCR産物を以下の反応において調製する。CD1 および2フラグメント LBM3プライマー （10pmoles/μl） 2.5μl REV VHCDR3BACKプライマー （10pmoles/μl） 2.5μl 10×PCR 反応緩衝液 5.0μl 5mM各dNTP 2.5μl Taqポリメラーゼ （5U/μl） 0.3μl 水 50μlにするCDR3 フラグメント PCRHLINKプライマー （10pmoles/μl） 2.5μl VHCDR3BACKプライマー （10pmoles/μl） 2.5μl 10×PCR 反応緩衝液 5.0μl 5mM各dNTP 2.5μl Taqポリメラーゼ （5U/μl） 0.3μl 水 50μlにするVHCDR3- リンカー-VLフラグメント FDTSEQ1プライマー （10pmoles/μl） 2.5μl VHCDR3BACKプライマー （10pmoles/μl） 2.5μl 10×PCR 反応緩衝液 5.0μl 5mM各dNTP 2.5μl Taqポリメラーゼ （5U/μl） 0.3μl 水 50μlにするリンカー-VLフラグメント FDTSEQ1プライマー （10pmoles/μl） 2.5μl LINKPCRLプライマー （10pmoles/μl） 2.5μl 10×PCR 反応緩衝液 5.0μl 5mM各dNTP 2.5μl Taqポリメラーゼ （5U/μl） 0.3μl 水 50μlにする ミニプレップDNAを、Marksら（1991）に記載されるライブラリーから、PCRの テンプレートのために調製した。クローンから生成されたPCRを細菌コロニーか ら接種することにより調製した。 PCR条件は、94℃で１分間、55℃で１分間、72℃で２分間を25サイクル、最後 に72℃で10分間であった。 一次PCR産物を、そのより小さいサイズのためにMermaid精製（Bio101）を必要 とするCDR3フラグメント以外はPromega Magic PCR Prep Systemを使用してゲル 精製した。 CDR1＋2シャッフリング単離されたクローン由来のVH CDR3-リンカー-VLフラグメントとのライブラリーC DR1+2フラグメントのアセンブリ 精製ライブラリーCDR1＋2DNA 20-50 ng 単離されたクローン由来の精製VHCDR3-リンカー-VLフラグメント 20-50 ng 10×PCR緩衝液 5.0μl 5mM各dNTP 2.5μl Taqポリメラーゼ （5U/μl） 0.3μl 水 50μlにする 一次PCRについてのPCR条件アセンブルされたCDR1+2シャッフルDNAの二次PCR アセンブリ産物 1.0μl FDTSEQ1プライマー （10pmoles/μl） 2.5μl LMB3プライマー （10pmoles/μl） 2.5μl 10×PCR 反応緩衝液 5.0μl 5mM各dNTP 2.5μl Taqポリメラーゼ （5U/μl） 0.3μl 水 50μlにする CDR3シャッフリング単離されたクローン由来のCDR1+@フラグメントとのライブラリーCDR3フラグメン トのアセンブリ 精製ライブラリーCDR3 DNA 20-50 ng 単離されたクローン由来の精製CDR1＋2 20-50 ng 10×PCR緩衝液 5.0μl 5mM各dNTP 2.5μl Taqポリメラーゼ （5U/μl） 0.3μl 水 50μlにする単離されたクローン由来のアセンブルされたライブラリーCDR3-CD1+2シャッフル DNAの二次PCR アセンブリ産物 1.0μl PCRHLINKプライマー実施例11 「インプリンティング」によるヒト触媒性抗体の誘導 「インプリンティング」のプロセスは、所望の結合特徴を有する既存の抗体を 使用して同様の特徴を有する新たな抗体を誘導する工程を包含する。このプロセ スは、もとの抗体鎖またはその部分を相補的な部分のライブラリーと再度組合せ ることにより行われる。新たな抗体エレメントが見出されると（これはもとの抗 体結合特徴を相補する）、これらをもとの抗体結合特徴を置換するライブラリー と再度組合せ、これらをもとの抗体結合部分を置換するライブラリーと再度組合 せ、もとの抗体の結合を模倣する完全に新たな抗体を与える（PCT/GB/92/01755 ）。このアプローチは、既存のマウス触媒性抗体からヒト触媒性抗体を誘導する ために使用され得る。 本実施例は「２段階の変換」を記載する。もちろん、これは複数回の工程にわ たって、または単一の工程において行われ得る（もとの抗体の部分からなるハイ ブリッド分子が十分である場合）。 これは、例えば既存のマウス抗体と同様の結合活性を有するヒト抗体を誘導す るために有用な方法である。 pCANTAbベクター中の触媒性ファージ抗体クローン18および83（実施例5.2を参 照のこと）を（pCANTABベクター中にクローン化された）、別々の重鎖および軽 鎖のPCR増幅のためのテンプレートとして使用した。上記のように重鎖をLMB3お よびPCRHLINKを用いて増幅し、そして軽鎖をLINKPCRLおよびFDTSEQ1を用いて増 幅した。ヒト重鎖および軽鎖のライブラリーもまた同じプライマーを使用して、 上記のMarksら、J.Mol.Biol. 222(1991)：581-597により記載されるヒトscFVラ イブラリーから調製したDNAを用いてPCRにより増幅した。 次いで、各クローン由来の個々のマウスの重鎖を、上記のようにPCR結合によ りヒト軽鎖のライブラリーと再度組合せた。同様に、個々の軽鎖を同じ方法で、 重鎖のライブラリーと再度組合せた。 得られた結合産物を、NotIとともに、ApaLI（マウス重鎖について）またはSFi I（ヒト重鎖について）で消化し、適切なpCANTABベクターに連結し、そしてE.co li TG1細胞に形質転換した。全ての工程は上記のとおりであった。 それぞれの別々のライブラリーを有するTG1細胞の個々の集団を、30℃で２〜 ３時間増殖させ、そして37℃でVCSM13ヘルパーファージでの感染によりレスキュ ーした。一晩の増殖後、ファージ粒子を採集し、そして濃縮した。各集団を数回 RT3-BSAに対してパンニングし、そして個々の結合クローンをELISAにより同定し た。 結合クローンを選択し、そして各クローンのヒト鎖を前述のようにPCRにより 増幅した。この鎖を、相補的な鎖のヒトライブラリーのPCR産物と再度組合せた 。PCR結合、SFi1およびNotIでの消化、ライゲーション、形質転換、ファージレ スキュー、パンニングおよびスクリーニングは前述のとおりであった。 この方法において、結合プロフィールはもとのマウスクローンにより方向づけ られたが、完全にヒトであったRT3バインダーの新たな集団が誘導された。上記 の実施例は、別々の鎖のシャッフリングによるインプリンティングを包含するが 、単一回または複数回における鎖の部分のシャッフリングに等しく適用し得る（ 上記のように）。ライブラリー物質は、Marksら、J.Mol.Biol. 222(1991)：581- 597ライブラリーに由来したが、ヒト血液、脾臓などのPCR産物に等しく由来し得 、あるいは、部分的にまたは全体的に合成DNAに由来し得る。 上記の実施例は、単一のレプリコンにおける単鎖Fv内の鎖のシャッフリングを 包含する。同様の結果が、ファージにおいて提示された非結合VH/VLまたはVH-CH G/VL-CLフラグメントを使用することにより達成され得る（McCaffertyら、WO92/ 01047）。これらはまた同じレプリコンにおいてであり得、または異なるレプリ コンにおいてであり得る。例えば、もとのマウス抗体の重鎖は、pUC19または他 のプラスミドに、細菌のペリプラズムにおいて可溶性VHまたはVH-CH1フラグメン トとして発現させることを可能にする適切なプロモーター、シグナルペプチドお よび停止コドン（１つまたは複数）とインフレームにクローン化され得る（Bett erら、1989；Skerraら、1989）。次いで、このプラスミドを有する細胞の増殖培 養物を、例えば、ヒト軽鎖（VLまたはVL-CLのいずれか、適切なように）のライ ブラリーに由来するヘルパーファージで感染させ、fd-CAT1またはfd-DOG1中で遺 伝子IIIとの融合体としてクローン化し得る（McCaffertyら、上述、1991）。こ れは、マウスクローン由来の重鎖パートナーを有する、遺伝子IIIに融合された 個々のヒト軽鎖を発現するファージの集団を生じさせる。マウス鎖の結合活性を 相補するこれらのヒト鎖は、パンニング（McCaffertyら、上述、1991）により濃 縮され、そしてこの鎖をコードする遺伝子がファージ粒子中に存在する。 この方法に由来する軽鎖は、もとのマウス鎖について行われたように、ペリプ ラズムにおける単鎖の可溶性発現のためにベクターに再クローン化され得る。前 述のように、これらの個々のヒト軽鎖を発現する細胞の増殖培養物を、例えば、 ヒト重鎖のライブラリーに由来するヘルパーファージで感染させ、fd-CAT1また はfd-DOG1中で遺伝子IIIとの融合体としてクローン化し得る（McCaffertyら、上 述、1991）。前述のように、抗原に対してパンニングして適切な結合活性を有す るクローンを濃縮する。この結果、もとのマウスクローンの結合を反映する一対 のヒトクローンを生じる。 同様のプロセスを、初めにヒト重鎖、次いで軽鎖とシャッフリングすることに より行い得る。あるいは、重鎖および軽鎖の１回の別々のシャッフリングに由来 する濃縮された集団またはクローンを、SCFv（１つまたは複数）または別々の鎖 のいずれかについて上記したと同じ方法で互いに再度組合せ得る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION               Isolation and production of catalytic antibodies using phage technology Reference for related applications   This application is an international application with a filing date of July 10, 1991, and a publication date of January 23, 1992. A continuation-in-part of application WO 92/01047 (PCT / GB91 / 01134), and designated by the United States And this International Application WO 92/01047 (PCT / GB91 / 01134) is hereby incorporated by reference. It has been used. Field of the invention   The present invention relates to the isolation and production of catalytic antibodies displayed on bacteriophages. And more particularly to the isolation and production of human catalytic antibodies. The present invention Has also been used to isolate and produce catalytic antibodies for use in prodrug activation. Related. The invention further relates to the production of catalytic antibodies that bind to a transition state analog. I do. Background of the Invention   Monoclonal antibodies are customarily biologically functional antibodies with a specific specificity Immortalized mammals derived from a single immunoglobulin-producing cell that secretes one form of the molecule It is created by establishing a product cell line. This antibody secreting mammalian cell line is immortal As such, antibody characterization is reproducible from batch to batch. mono Important properties of a clonal antibody are its specificity for a particular antigen, and the Reproducibility.   Structurally, the simplest antibody (IgG) has four polypeptide chains, It contains two heavy (H) chains and two light (L) chains connected by sulfide bonds. There are two different forms of light chains, called K (kappa) and λ (lambda) . Each chain has a constant region (C) and a variable region (V). Each chain is organized into a set of domains I can stand up. The light chain has two domains, one corresponding to the C region and the other V Corresponding to the region. The heavy chain has four domains, one corresponding to the V region and three Two domains (1, 2, and 3) are in the C region. The antibody has two arms (each Are Fab regions), each of which is associated with VL and VH With regions. This pair of V regions (VL and VH) is different from one antibody and another. (For modification of the amino acid sequence), and both recognize the antigen and bind to the antigen (ABS) is the reason for providing. Even more specifically, each V region has four frames. Formed from three complementarity determining regions (CDRs) separated by a network region (FR). It is. CDRs are the most variable part of the variable region, and important antigen binding Perform the function. CDR regions represent a complex process involving recombination, mutation, and selection. From many potential germline sequences.   It has been shown that the function of binding antigens can be performed by fragments of whole antibodies. You. Examples of binding fragments include (i) Fab consisting of VL, VH, CL, and CH1 domains A fragment; (ii) an Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; Fv fragment consisting of VL and VH domains of one arm; (iv) VH domain DAb fragment (Ward et al.,Nature 341 (1989): 544-546); (v) Isolated CD R region; and (vi) two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region. Fragment (F (ab '))TwoIt is a fragment.   Although the two domains of the Fv fragment are encoded by different genes, By recombination, they are known as a single protein chain (single-chain Fv (scFv); Bird et al. ,Science 242 (1988): 423-426; Huston et al.Proc . Natl. Acad. Sci., USA 85 (19 88): 5879-5883). ing. These scFv fragments were derived from previously isolated monoclonals. Was constructed from the genes. In our earlier application (WO 92/01047), ScFv fragments from VH and VL domains that are not part of already isolated antibodies Describes the process for assembling.   Monoclonal antibodies, their fragments and derivatives are very valuable Nevertheless, there are many limitations associated with them. First, human immortalization Therapeutic applications of monoclonal antibodies produced by cell lines have been used to treat a wide range of diseases Has great promise (Lennox,Clinical Applications of Monoclonal Anitib od ies , British Medical Bulletin 1984). Unfortunately, immortalized antibody-producing human cell lines Are very difficult to establish and they have low antibody yields (about 1 μg / ml) . In contrast, the same amount of rodent cell line gives high amounts of antibody (about 100 μg / ml). Only However, repeated administration of these foreign rodent proteins to humans is harmful to hypersensitivity. Response can occur. As a result, these rodent-derived monoclonal antibodies are therapeutic Limited use.   Second, an important aspect in monoclonal antibody isolation is the desired specificity characteristics. Production of antibodies with various specificities to isolate cells producing antibodies with How many different clones of cells theoretically need to be sampled Whether it can be actually established and sampled compared to what is needed (Milstein, Royal Soc. Croonian Lecture,Proc . R. Soc. London B. Two 39 (1990): 1-16). For example, any one time point by the lymphocytes of the mouse immune system Number of different specificities expressed in7And this is Only a small percentage of the repertoire of possible specificities. However, the desired features During isolation of a representative antibody-producing cell with the opposite sex, researchersThree~TenFourIndividual singularity of It can only sample gender. This problem is even worse in humans, In this case about 1012Lymphocyte specificity, but 10ThreeOr 10FourIn sampling Limitations remain.   This problem has been alleviated to some extent in laboratory animals by the use of immunotherapy. I have. Thus, monoclonal antibodies with specificity for a particular epitope When trying to produce the body, immunize the animal with an immunogen that expresses that epitope . The animal then raises an immune response to the immunogen and the epitope Lymphocytes with specificity for proliferate. Of lymphocytes with the desired specificity Because of this growth, it is easier to detect them in the sampling procedure Become. However, this approach does not allow for the availability of a suitable immunogen, Not all cases will be successful. In addition, human monoclonal antibodies (eg, Such an approach is actually Unlikely to be able to perform ethically or ethically.   In our earlier application (WO 92/01047), we found that large biological Lists functional binding molecules (eg, antibody fragments, enzymes, and receptors) Bacteriophage that are expressed and displayed on a surface and remain intact and infectious It describes how to build the image. The inventors have identified virus particles and this virus. The structure containing the binding molecules presented on the irs surface was called a "package". Conclusion The combined molecule is an antibody, an antibody derivative or fragment, or an immunoglobulin domain. If the domain is homologous to the Antibodies "(pAb). However, unless context dictates otherwise, phage antibodies are When the term is commonly used, it also refers to virus particles and this virus. Any package containing a biologically functional binding molecule presented on the surface of a virus. Was interpreted. Functional antibodies and bacteriostats since the first filing of WO 92/01047 Many examples of other protein domains expressed on the surface of phage are available in the literature and It has been reported in both separate patent applications.   This simple replacement of immortalized cells as "factories" with bacterial cells For preparing large quantities of binding molecules expressed on the surface of bacteriophages Make it pretty easy. In addition, cells (eg, hybridomas and B cells) Polymerase chain reaction (PCR) amplification to isolate antibody-producing sequences from Saiki et al. (Saiki et al.,Science  239 (1988): 487-491) is a time-schedule in which binding specificity can be isolated. There is great potential to speed up the rules. Phage antibody expression library Direct cloning of amplified VH and VL genes into ophage expression vectors Thereby, it can be easily generated. In addition, bacteriophage-based pairs The recombinant production system is used to produce custom antibodies and fragments thereof. There is room. For example, having a new combination of binding and effector functions Chimeric molecules, humanized antibodies (eg, murine Variable region or mouse antibody CDR grafted on human FR) and novel antigen binding It is possible to produce the molecule. An important part of this phage-based system The advantage is that the recombinant antibodies are screened directly for the desired binding specificity. Is the ability to   Some issues in generating recombinant VH and VL phage libraries Need to be mentioned. For example, in mice, about 107Possible H chain And 107There are possible light chains. Therefore, 10 of the heavy and light chains14Possible pairs There are combinations, and to test any of these number combinations, About 1014A library of clones must be generated and screened Absent. Until now, there was no practical possibility. PCT / GB92 / 00883 And PCT / GB92 / 01755 applications, which are incorporated herein by reference. Discloses many approaches to remedy this problem. Each of these applications It is a continuation-in-part of International Patent Application WO 92/01047 of the inventors.   In addition, there are many molecular biological The technology can be applied in combination with the phage antibody library approach described above. You. These techniques include site-directed mutagenesis of residues within the CDR, all or some C Replacement of DR with random amino acid sequence, CDR region is essential in CDR region library CDR shuffling. The use of pAbs is also Construction may be possible. In addition, some synthetic sequences (eg, CDRs) Antibodies with some naturally occurring sequences can be generated (eg, PCT / BG92 / 06372 See). For example, the V gene repertoire is an unrearranged V gene Could be made in vitro by combining with D and J segments. A library of pAbs is then selected by binding to the antigen and the antigen binding loop Or hypermutated in vitro in the V domain framework region, Can be subjected to further rounds of selection and mutagenesis.   pAbs have applicability in the selection of antibody genes that encode antigen binding activity. I do. One particularly exciting area of application is antibodies with catalytic properties (catalytic antibodies) Is the development of Catalytic antibodies are described in US Pat. No. 4,888,281 to Schochetman et al .; Kim et al. No. 4,963,355; and Schochetman et al., US Pat. No. 5,037,750. And all of which are incorporated herein by reference. these As disclosed in U.S. Pat. Combine.   All catalytic antibodies described to date use monoclonal antibody technology. Has been generated. Details of the process are well known to those skilled in the art. Representative methods and First, immunizing mice with the appropriate antigen. Antigen Desired reactant; desired reactant attached to peptide or other carrier molecule; during reaction It can be an analog of an intermediary or reactant; or a product or reaction intermediate.   The term "analog" as used herein refers to isomers, homologs, transitions Enantiomeric or other compounds that are sufficiently similar in chemical structure to the reactants. May be included. Antibodies raised against such analogs will be immunologically reactive with the reactants. It may be involved in the reaction, but does not necessarily catalyze the reaction of the analog.   Many different types of antibody catalysts have been developed with this technology, but with the desired specificity. The time required to establish and screen for hybridomas is important.   If the desired specificity is rare enough, it is not sufficient to recover this desired specificity. It is impractical or impossible to sample hybridoma cell lines possible.   In addition, at present, suitable hybrids to generate fully human catalytic antibodies are There is no technology based on ma.   The method of the present invention also provides for cleavage that results in activation of certain biological functions. Can be used for   Such reactions include cleavage of peptide bonds, but not ester bonds or glycans. Cosidic bonds or other types of bonds may also be included.   One example of biomolecule cleavage that results in activation of a biological function is insulin-dependent It is a treatment for sexual diabetes. Patients administer insulin themselves by injection. Circulation Release of insulin into mimics the pharmacokinetics of natural pancreatic insulin release Previous attempts to develop insulin formulations have not proven to be successful. No. Insulin is a pro-form of proinsulin that is present in the pancreas and its activity is It is many orders of magnitude less powerful than phosphorus itself. From proinsulin to insulin Antibody proteases specific for the peptide bond that causes the conversion have kinetic characteristics. Release of insulin in vivo after injection of proinsulin and antibody protease Can be designed to This is an example of prodrug activation, in which case the drug Things are natural protein hormones. Prodrugs activate biological functions Alternatively, it can include many therapeutically active molecules that cause inactivation. The professional form of the drug Either natural modifications or appropriate synthetic modifications thereof may be utilized. Low activity (treatment Drug derivatives that are chemically useful or toxic) are suitable catalytic antibodies Modified and converted to the activated form. A specific example of this process is May 4, 1989 PCT / US89 / 01951, which was incorporated herein by reference. Has been incorporated. Summary of the Invention   One object of the present invention is to provide a phage that can catalytically increase the rate of a chemical reaction. It is to provide a method for producing and isolating the presented catalytic antibodies.   Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing an object by one of several different methods outlined below. To produce catalytic antibodies.   A further object of the present invention is to bind to transition state analogs, phosphonates, and RT3. Phage displaying the matching antibody epitope.   Yet another object of the invention is to provide for mutagenesis, chain shuffling, and CDR shuffling. Fling, or several different, including various combinations of these procedures Bind transition state analogs, phosphonates, and RT3 by one of the methods The production of catalytic antibodies from antibodies (of mouse or human origin).   And finally, yet another object of the present invention is to provide a method for activating prodrugs. To produce catalytic antibodies.   Accordingly, the present invention provides a method for producing catalytic antibodies displayed on phage. Providing and including the following steps:   (a) generating a gene library of the antibody-derived domain;   (b) Step of inserting the one encoding the domain into a phage expression vector ;and   (c) a step of isolating the catalytic antibody.   The present invention further provides a method for isolating a catalytic antibody displayed on a phage. Including the following steps:   (a) preparing an antigen;   (b) immunizing with the above antigen;   (c) generating a library of VH and VL domains from the immunized animal ;   (d) place in phage expression vector to generate phage display antibodies Cloning the VH and VL domains;   (e) selecting a phage display antibody that specifically binds to the antigen;   (f) Phage display antibody selected above for catalytic activity on substrate Screening for; and   (g) a step of isolating the catalytic antibody.   The present invention further provides a method for isolating catalytic human antibodies displayed on phage. And includes the following steps:   (a) preparing an antigen;   (b) generating a library of VH and VL domains;   (c) place in phage expression vector to generate phage display antibodies Cloning the VH and VL domains;   (d) selecting a phage display antibody that specifically binds to the antigen;   (e) using the phage display antibody selected above for catalytic activity on the substrate Screening; and   (f) a step of isolating the catalytic antibody.   The present invention further provides catalytic antisense displayed on phage via chain shuffling. A method for producing a body is provided, comprising the following steps:   (a) A library of VL genes to form a chain shuffled library Combining with the VH gene;   (b) cloning the shuffled strand;   (c) expressing the catalytic antibody on a phage;   (d) selecting against an antigen; and   (e) screening for catalytic activity.   The present invention further provides catalytically displayed phage via CDR shuffling. A method for producing an antibody is provided, comprising the following steps:   (a) isolating the VL and VH genes;   (b) isolating a library of CDR regions;   (c) the VL and VH genes described above to generate a CDR shuffled library Recombining with the CDR region library; and   (d) cloning the CDR-shuffled library;   (e) expressing the CDR-shuffled library on a phage;   (f) selecting against an antigen; and   (g) screening for catalytic activity;   The present invention further provides catalytically displayed phage via imprinting. A method for producing an antibody is provided, comprising the following steps:   (a) selecting a set of antibodies;   (b) isolating a set of VH genes and a set of VL genes from the antibody;   (c) To form a two-combination library, the set of VHs Combine with the library, and combine the above VL set with the VH library The process of giving;   (d) cloning the combination library;   (e) expressing the library on a phage;   (f) selecting against an antigen;   (g) isolating a selected library of VH and VL genes;   (h) combining the VH and VL gene libraries;   (i) cloning the combined library;   (j) expressing the combined library on phage;   (k) reselecting for the antigen; and   (l) Screening for catalytic activity.   The invention further increases the rate of cleavage or formation of specific bonds within a molecule in vivo. And introducing an effective amount of a phage-derived catalytic antibody into an animal. Is included.   The present invention further provides a method of in vivo activation of a prodrug, comprising: Including the steps:   (a) a step of introducing a prodrug into a patient, wherein the prodrug is cleaved Having a chemical bond to release the active form of the drug; and   (b) a phage-derived catalytic antibody capable of cleaving the bond in the prodrug Introducing an effective amount to the patient. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   The invention defined in the claims is more easily described with reference to the specification and drawings. Can be understood.   1 to 4 show Compound 7 (RT3 hapten), Compound 8, and Compound 1, respectively. 2 shows a reaction scheme for the synthesis of Compound 2 and Compound 15 and their intermediates.   FIG. 5 shows the production of pHEN-OX16hisll by inserting His-6 oligo into pHEN-OX16. 1 shows a rasmid construct.   FIG. 6 shows an SDS polyacrylamide gel stained with Coomassie:     (a) Total periplasmic protein from 1 ml of cells.     (b) 1 ml unbound fraction of cells after addition of binding matrix.     (c) Eluted fraction bound to the matrix, corresponding to 1 ml of cells.     (d-f) is the purified fraction corresponding to 5 ml of cells.     (d) pOX16-his-11 antibody fragment eluted with PBS + 1 M NaCl, 250 mM imidazole And     (e) pOX16-his-11 antibody fragment eluted with PBS, 250 mM imidazole.     (f) pSCFv4his-6 antibody fragment eluted with PBS + 1 M NaCl, 250 mM imidazole G.   FIG. 7 shows the pCANTAB vector encoding the C-terminal his-6 peptide.   FIG. 8 shows the selected mouse RT3 phage antibody and hapten (RT3), hapten portion ( RT3A and RT3B), or the product portion (Prod A and Prod B). A shows the results.   FIG. 9 shows light chain pattern A and light chain pattern from RT3 phage antibody derived from mouse. 1 shows the gene sequence of Region C.   FIG. 10 shows light chain patterns B, D, and 1 shows the alignment of the I gene sequence with the mouse germline.   FIG. 11 shows light chain patterns A, B, C, and D from a mouse-derived RT3 phage antibody. 3 shows a comparison of the gene sequences of I, I and I.   FIG. 12 shows the gene sequence of heavy chain pattern A from a mouse-derived RT3 phage antibody. Is shown.   FIG. 13 shows heavy chain patterns B and D from a mouse-derived RT3 phage antibody. Figure 2 shows the alignment of the gene sequence with the mouse germline.   FIG. 14 shows heavy chain patterns A, B, C, and D from a mouse-derived RT3 phage antibody. 3 shows a comparison of the gene sequences of I, I and I.   FIG. 15A shows an HPLC chromatogram of the catalytic assay of IMAC pure scFv from clone 18. 3 shows a mattogram.   FIG. 15B shows the catalytic assay of IMAC pure scFv from clone 18 (+ RT3 2 shows an HPLC chromatogram of (pten).   FIG. 15C shows a blank HPLC chromatogram of the catalytic RT3 assay at pH 9.0. Is shown.   FIG. 16 shows the HPLC chromatogram of the catalytic assay of HIC pure scFv from clone 18. Shows a togram.   FIG. 17A shows an HPLC chromatogram of the catalytic assay of IMAC pure scFv from clone 83. 3 shows a mattogram.   FIG. 17B shows the catalytic assay of IMAC pure scFv from clone 83 (+ RT3 2 shows an HPLC chromatogram of (pten).   FIG. 18 shows the HPLC chromatogram of the catalytic assay of HIC pure scFV from clone 83. Shows a togram.   FIG. 19A shows a three round pan of an untreated human-derived phage antibody library. 2 shows the binding pattern of the clone to RT3 obtained after the tanning.   FIG. 19B shows a 4-round pan of an untreated human-derived phage antibody library. Figure 4 shows the binding pattern of clones to RT3 after tanning.   FIG. 20 shows RT3 features selected from an untreated human-derived phage antibody library. 1 shows the gene sequences of the heavy and light chains of the heterologous phage antibody.   FIG. 21 shows the general scheme of VH and VL chain shuffling.   FIG. 22 shows a human shuffled library after PAN0, PAN1, and PAN2. 2 shows an RT3-BSA ELISA assay using a polyclonal phage derived from E. coli.   FIG. 23A shows by RT3 hapten left side (RT3A) or substrate (Product A) Figure 4 shows inhibition of binding of phage antibodies to RT3-BSA.   FIG. 23B shows the right side (RT3B) or substrate (Product B) of the RT3 hapten. Figure 4 shows inhibition of binding of phage antibodies to RT3-BSA.   FIG. 24A shows RT3, RT3A, RT3B from ELISA wells coated with 0.3 μg RT3-BSA. 4 shows the yield of phage eluted with, TEA, and PBS.   FIG. 24B shows RT3, RT3A, RT3B, RT3B from ELISA wells coated with 15 μg RT3-BSA. And the yield of phage eluted with TEA.   In order that the invention described herein may be more fully understood, the following detailed description is set forth. Write a description. This description illustrates the invention of the present application, but is limited to a specific invention. Variations that should not be construed as being within the purview of those skilled in the art are within the scope of the present invention. Should be considered. Detailed Description of the Preferred Embodiment   For convenience and for ease of reference, the following will be described in describing the present invention. Is used.   Analogs can react to isomers, homologs, transition states, or chemical structures. Include other compounds that are sufficiently similar. Raised against such analogs Antibodies may be involved in immunological reactions with the reactants, but do not necessarily Also does not catalyze.   Antibodies are immunoglobulins that are natural or partially or wholly synthetically produced. U. The term also has a binding domain homologous to an immunoglobulin binding domain All proteins. Can these proteins come from natural sources? Alternatively, some or all may be generated synthetically. An exemplary antibody is an immunoglobulin. Phosphorus isotope and Fab, F (ab1)Two, ScFv, fV, dAb and Fd fragments.   An antibody-derived domain refers to a sequence derived from an antibody molecule.   Antigens can stimulate the animal body to produce antibodies, and these produced antibodies It is a substance that can bind to, and is roughly a protein.   A domain is a part of a protein that folds within itself and Independent of other parts of the protein, independent of complementary binding members .   Homologs have the same residue at corresponding positions in the primary, secondary, or tertiary structure. A polypeptide having groups or conserved residues. The term is also homologous Also contains two or more nucleotide sequences encoding different polypeptides . An example of a homologous polypeptide is an immunoglobulin isotope.   Isolation refers to separating a particular phage from a library.   Libraries can be oligonucleotides or polynucleotides (eg, Collection of DNA sequences).   Untreated libraries are immunoglobulins from animals that have not yet been immunized. Phosphate display library of phosphorus sequence.Immunization is performed with Includes: Reactant; Reactant bound to peptide or other carrier; Reaction intermediate Analogues of the reactants; analogues of the products, the antibodies thus produced That can bind to a reactant or reaction intermediate; and a reaction intermediate or Is the transition state analog.   Package refers to a gene display package that can be replicated, It refers to the one displaying sbp members on the surface. This package has its surface May be a bacteriophage that displays an antigen binding domain. This type of The package is called a phage antibody (pAb).   A phage vector is a vector derived from a modification of the phage genome. It has an origin of replication for lyophage but no origin of replication for plasmid.   Phagemid vectors are vectors derived from modification of the plasmid genome, It has a bacteriophage origin of replication and a plasmid origin of replication.   A vector is a DNA molecule that can replicate in a host organism, into which a gene is inserted. Thus, a recombinant DNA molecule is constructed. Overview of the method   The present invention provides a phage particle expressing an antibody having catalytic properties on its surface. The method for isolation is described. In carrying out the present invention, the catalytic function is encoded. The antibody domain may be specifically immunized or immunized as defined below. Can be prepared from either animal or human sources. Further, the present application The invention provides for binding and / or catalytic functions in several ways (chain shuffling, C Generated by one of the following (including but not limited to, DR grafting and mutagenesis) Alternatively, a method for improvement is described. In a further embodiment of the present invention, A catalytic antibody, which is entirely encoded by the mouse-derived VH and VL domains, Convert to catalytic antibodies encoded by human VH and VL domains Disclose the law.   The first step in generating antibodies with specific catalytic functions is the chemical hapten (Eg, a transition state analog that is related but distinct from the substrate of the catalyzed reaction (TSA)), but is not necessarily limited to this hapten. Has catalytic function The structure, synthesis, and use of this TSA as a means of raising antibodies to U.S. Pat.No. 4,196,265, issued on Apr. 1, 2014, is hereby incorporated by reference. Incorporated into the application specification. As described in the prior art, the production and production of catalytic antibodies Traditional methods of isolation and isolation are based on monoclonal antibody approaches (hybrid Technology).   The present invention provides phosphonate transition state analogs as immunogens or on solid phases. Generation of antibodies that can be used by immobilization to bind to the TSA and have catalytic properties and Enable selection (see FIG. 1). Catalytic antibodies are produced using the hybridoma method. Unlike previous inventions, a unique embodiment of the present invention is a bacteriophage Antibody domain (including antibody domain having catalytic function) can be expressed on the surface of It is in. Phage live capable of displaying catalytic antibody domain on the surface The method for producing the rally is described below. 1. Production of bound and / or catalytic phage antibodies from immunization sources   TSA was conjugated to a carrier molecule or peptide to immunize BALB / C mice. After an appropriate period, the spleen was removed from the mouse, and mRNA was isolated from the cell. RN A is used as a starting material to amplify the variable domain of Cloning into a Teriophage Expression Vector and Subsequent Bacteriophage Expression is performed on the surface of the diparticle. In an embodiment of the present invention, the variable domain is As described in the Background of the Invention, typically linked by short peptides. To generate scFv. Another phage expression vector expresses an antibody such as Fab It should be noted that it can be used to cause This phage antibody library The techniques for making are already described and the details of the process are well known to those skilled in the art. (Eg, WO 92/01047; McCafferty et al.,Nature(1990): 552-564; Hoogenboom Et al.,Nucl . Acids. Res.(1991) 4133-4137; Marks et al.J . Mol. Biol.(1991): 581-5 97).   Phage antibodies that specifically bind and recognize TSA Isolated from the library using one of the methods:   a) Panning-TSA directly to solid phase surface (ie tube or plate) Immobilized on top or separately before coating this solid surface. To bind to the substrate. Table coated with suspension containing library of phage antibodies React with the surface for a period of time and then unbound phage antibody (not binding to TSA). Antibody was removed by washing.   b) Affinity chromatography TSA into appropriate column matrix ( Ie, Sepharose). Pass the phage antibody suspension through the column, Unbound phage was washed off the column with buffer.   Phage antibodies bound to and immobilized on a solid surface can be obtained by several methods, including: Can be retrieved in one of:     a) Use either low (acidic) or high (basic) pH buffers Non-specific elution;     b) free hapten such as the original phosphonate TSA or reaction substrate or product Specific elution using     c) Specific elution with a portion of TSA or a substrate or product.   In addition to specific elution of phage antibodies bound to TSA, initial panning or Control the binding of phage antibodies during the affinity chromatography step. May be desirable. One way is to use competitive inhibition , Preincubate phage antibodies first with reactants, reaction products or portions of TSA (See Example 9). The purpose of such “preliminary selection” is The elimination of antibodies that appear to be unmediated from the population of bound antibodies. Fruit of the present invention In the examples, these exclusions are substantially linked to the phosphonate portion of TSA. Phage antibodies that do not match. Pre-selection types for phage antibody libraries It must be determined experimentally, but ultimately, within the population of TSA-binding phage antibodies Could be a way to increase the ratio of catalytic phage to non-catalytic phage . If such procedures are performed in ELISA wells, greater flexibility is given. obtain. In this way, the eluate can be collected and detected across the plate according to a specific procedure. Procedures can be applied. Based on the results, select the eluate from a particular well and And can be subjected to analysis / panning.   Following elution of the phage antibody by any or all of the above methods, Collect and elute from previous panning and reincubation on the TSA solid phase. For additional panning (2, 3, 4, 5, etc.) by simply collecting I can do it. The percentage (%) of phage that do not specifically bind to TSA Phage clones, since they are performed through a cloning step (ie, a non-specific binder). Pools or individually isolated phage clones are typically used in solid-phase ELISAs. The assay rescreens for binding to TSA. ELISA Say is expressed in an antibody or soluble form expressed on bacteriophage surface This can be done as described below using an antibody. Another format for ELISA assays, For example, there is a free hapten, substrate or product of this hapten or various halves Competition inhibition using a phage clone, Can be used to further characterize the binding specificity of individual binding clones.   Pooling of individual phage antibody clones or clones with appropriate binding specificity Is then assayed for catalytic activity. The most convenient assay for catalysis Is performed using a soluble antibody and soluble from E. coli clones expressing phage antibodies. Methods for producing antibodies have been described previously (Marks et al.,J . Mol. Biol.(1991):  581-597). The criterion that catalytic activity is in the antibody active site is Lies in the rigorous purification of antibodies from enzymes. In the present invention, purification of a soluble antibody Is By introducing a specific peptide at the 3 'carboxy terminus of the expressed antibody, It is easy. Such papers currently used and described in the prior art Examples of peptides include:   a) Purification of antibody with metal immobilized on histidine peptide-column matrix (IMAC, Hochuli et al.,Bio / Technology(1988): 1321-1325).   b)mycPeptide-mycImmobilized antibody that specifically binds to the peptide Enables purification on a matrix (Clackson et al.,Nature(1991): 624-628).   Conventional vectors used to display antibody fragments are:mycpeptide (See FIG. 5). The vectors described and disclosed in this application Stidine peptidemycShown is the first example of introduction in series with a peptide. this is, An improvement over the prior art is shown, which uses two unique different formats and purification conditions. This makes it possible to purify the soluble antibody.   Further purification of the antibody will require specific properties unique to the antibody of interest (eg, hydrophobicity, Charge, and size). Purification as already described Can be affected by any of a number of standard protein purification techniques (De utscher,Methods in Enzymology, 182, Guide to Protein Purification (199 0)).   Antibodies isolated by the phage antibody technology described above can be prepared by a number of methods well known to those skilled Can be screened for the ability to catalyze the desired reaction. Its most In a simple form, screening involves combining the antibody and reactant (substrate) under appropriate conditions. Incubate, for example, by spectroscopic methods or high pressure liquid chromatography. Achieved by measuring the formation of reaction products by any of a number of means Is done. 2. Production of bound and / or catalytic phage antibodies from non-immunized sources   In this embodiment of the invention, to generate a phage antibody library Is from a non-immunized animal or mammal (eg, a human). This implementation The non-immunization in the examples is based on specific reactants (eg, Or as a free reactant), a reaction intermediate, an analog of the reactant or Means not specifically immunized with the expected product of a particular reaction. Advanced technique As shown in the art, low and medium affinity human antibodies are non-immunized. Use phage antibody libraries generated from epidemiological sources to target specific antigens Has been generated for it. Such an approach may be useful for animals or animals that bind to TSA. Antibody is simply obtained from an untreated animal or human phage antibody library as described above. The present invention provides a method for generating a tree by panning on a TSA. Then TSA A phage clone that specifically binds and recognizes Can be assayed for performance. Such an approach would directly address human-derived catalytic antibodies. Methods for indirect and total isolation are provided. 3. Binding and / or production of catalytic phage antibodies by chain shuffling   A chain shuffling approach to generate a phage antibody library is: It takes advantage of the promiscuous nature of the binding between VH and VK pairs. In this embodiment of the invention VH or VK from one, some or many different phage antibody clones The domain is recombined with a library of VK or VH domains. VH and VK domain phage clones and libraries are described in Section 1 above. From an immunized source or from a non-immunized source as described in Section 2 above. Can be In addition, the phage clones selected for chain shuffling are: It may be a phage clone previously selected for binding to a particular TSA, but The invention is not limited to this. After the chain shuffling procedure, the reassembled chains ( (Ie, the shuffled chains) are cloned back into the phage antibody expression vector . Re-panned the expressed phage antibody library on TSA, and Each binding clone is screened for catalytic activity as described above. 4. Binding and / or production of catalytic phage antibodies by CDR shuffling   Antibody specificity and antigen binding affinity are encoded by VH and VL domains 6 It is well known that it is specified by one CDR. Therefore, the CDRs from a given antibody Changing some or all has a dramatic effect on the binding properties of the antibody Will be. CDR shuffling in the context of phage antibodies is VH or VL CDR (s) encoding the CDR (s) within the domain Depicts a process for replacement with a library of A chain according to section 3 above VH used for CDR shuffling as well as shuffling approach Alternatively, the VK domain comprises one, several, or many different phage antibody clones. May be derived from Phage Cloning of CDR Region Used for Shuffling And libraries can be obtained from either immunized or non-immunized sources. Can be obtained. After CDR shuffling, recombinant VH and VL domains were Recloning into a body expression vector. Re-express phage antibodies against TSA And ligating individual bound clones for catalytic activity as described above. I'll do it. 5. Production of binding and / or catalytic phage antibodies by mutagenesis   As described above for CDR shuffling, the binding specificity of the antibody is It can be changed by changing the amino acids that are loaded. For the purpose of the present invention CDR mutagenesis can be defined as follows:   a) Site that mutagenizes one or a few specific amino acids in a specific CDR Specific. This process usually involves the nucleotide sequence and mutation of the region to be mutagenized. Depending on the sequence of the mutagenic primer, several different variants of the wild-type amino acid sequence may be used. This produces a change to the amino acid.   b) some or all amino acids in the CDR (s) are random Nucleotide sequence so that the wild-type sequence Random mutagenesis replaced by a combination.   Many different methods for site-directed and random mutagenesis are documented And are well known in the art. As with other methods The phage antibody clone (s) selected for mutagenesis are Can be, but is not limited to, a clone already selected for binding to A . In addition, the selected binding clones were obtained from either immunized or non-immunized animals. Or a clone isolated from a phage antibody library from a human source. Can get.   Recent success in modeling antigen-binding sites predicts new designs well You. This approach is particularly useful for generating catalytic antibodies against small substrates. Attractive. Here, the binding site for the side chain or prosthetic group is Not only for selective binding to the transition state, but also for Can also be introduced. 6. Induction of human catalytic antibodies by "imprinting"   The "imprinting" process involves the use of existing antibodies with the desired binding characteristics. Deriving new antibodies with similar characteristics. This is originally By recombining the antibody chain or part thereof with a library of complementary parts Done. New antibody elements (complementing the original antibody binding characteristics) found These are then recombined with a library that replaces the original antibody binding characteristics, Re-combined with the library that replaces the original antibody part, Obtain completely new antibodies that mimic (PCT / GB / 92/01755).   For example, the imprinting approach is based on the phage antibody described in Section 1 above. It has value for the humanization of mouse catalytic antibodies isolated using technology. Once Once isolated, the mouse-encoded VH or VL domain of the catalytic antibody complements the Can be recombined with a library of human-derived VL or VH domains. Next, The us-semi-human phage antibody was originally used to generate catalytic activity in TS Select again for binding to A. The remaining mouse VH of the selected binder Or the VL domain is now a library of complementary human VL or VH domains. Will be replaced. The resulting phage antibody, now completely encoded by human-derived sequences, Select again for binding to TSA. Then selected for binding to TSA The individual clones are assayed for catalytic activity as described above.   Having now generally described the present invention, the following examples are included for illustrative purposes. No limitation is intended.Example 1.1 Synthesis of RT3 phosphonate transition state analog hapten   Reaction scheme for the synthesis of the RT3 phosphonate transition state analog hapten As shown in FIG. Α2- by halogen exchange with sodium iodide in acetone Α2-Iodoisodurene (2) was obtained from chloroisodurene (1). Trimethylphos Dimethoxyphosphonation by Michaelis-Arbusov reaction using phyt Compound (3) was obtained. Activated by heating with phosphorus pentachloride, then methyl 4-hydrogen The compound (5) was obtained by reacting with xyphenyl acetate (4). Thiophenol and Compound (6) was obtained by demethylation using triethylamine. This compound Was completely deprotected under strong base conditions of lithium hydroxide to give the desired product (7).   More specifically, α2-iodoisodurene (compound 2) was prepared as follows. Made:   α2-Chloroisodurene (Compound 1) (2.28 g) was dissolved in acetone (45 ml). Then NaI (2.25 g) was added. The reaction mixture was stirred vigorously at 75 ° C. in the dark for 16 hours . The reaction mixture was concentrated, redissolved in ethyl acetate (100 ml), washed with water and concentrated. Compacted to a solid. This solid was redissolved in ethyl acetate (5 ml) and 100 g Purified by flash chromatography eluting with hexane using mosquitoes, α2-Iodoisodurene (2) (2.717 g) was obtained. This was confirmed by the following spectroscopy Was. Preparation of Compound 3   Freshly distilled trimethoxyphosphite (5 ml) and α2-iodoisoju Len (2) (0.765 g) was heated together at 110 ° C. for 16 hours. Concentrate the reaction mixture to a small volume And use 50 g of silica to elute with ethyl acetate-hexane (2: 8 by volume). Purification by lash chromatography gave compound 3 (0.550 g). this It was confirmed by the following spectroscopy. Methyl 4-hydroxyphenyl acetate (compound 4)   Dissolve 4-hydroxyphenylacetic acid (1.75 g) in methanol (30 ml) and add 10 M Aqueous hydrochloric acid (0.15 ml) was added and heated at reflux for 15 hours. After cooling to room temperature , Triethylamine (1 ml) was added, the mixture was concentrated, and silica gel (30 g) was added. Chromatograph eluting with ethyl acetate-hexane (2: 8 volume ratio) Purification by methylation gave methyl 4-hydroxyphenyl acetate (4) (1.693 g). Was. This was confirmed by the following spectroscopy. Preparation of Compound 5   Compound 3 (0.243 g) was dissolved in dry chloroform (3 ml) and phosphorus pentachloride (0.24 g) was added. 0 g) of a dry chloroform solution (3 ml) was added and then heated at 60 ° C. for 3 hours. reaction Concentrate the mixture to an oil and stir the oil under high vacuum for 16 hours and leave did. The resulting phosphorochloridate is dried in dichloro Redissolve in methane (3 ml) and add this to methyl 4-hydroxyphenyl acetate ( 4) (0.150 g) and 4-dimethylaminopyridine (0.146 g) in dry dichloromethane (3 ml) Added to the solution at 0 ° C. The reaction mixture was stirred at room temperature for 16 hours. Saturated ammonium chloride Aqueous solution (15 ml) was added and the product was extracted into dichloromethane (40 ml) . The organic layer was washed with water (10 ml) and dried over anhydrous MgSOFour, Filtered and concentrated, then Using silica (30 g) to elute with ethyl acetate-hexane (4: 6 volume ratio) Purification by flash chromatography provided compound 5 (0.20 g). This is Confirmed by spectroscopy. Preparation of Compound 6   Compound 5 (0.19 g) was dissolved in dioxane (1.5 ml). Thiophenol (0.575g) And triethylamine (0.70 ml) were added and the reaction mixture was stirred for 16 hours. Concentrate the mixture, redissolve in water (30 ml) and wash with dichloromethane (5 × 25 ml) did. The aqueous layer was adjusted to pH 1 with aqueous HCl and extracted with ethyl acetate (5 × 30 ml) . The organic layers are combined and anhydrous MgSOFourDry, filter and concentrate to give compound 6 (0.176 g ). This was confirmed by the following spectroscopy.   Preparation of Compound 7   Compound 6 (0.087 g) was prepared by adding lithium hydroxide in methanol (1.4 ml) and water (0.30 ml). And treated with a vigorous stirring solution of the solution of dimethyl monohydrate (0.025 g). The reaction mixture is Concentrate to a third volume, add water (10 ml) and dilute the aqueous layer Washed with tan (3 × 10 ml). The aqueous layer was adjusted to pH 1 using concentrated HCl and acetic acid was added. Eluted with chill (7 × 20 mL). The organic layers are combined and anhydrous MgSOFour, Filtered, Then, the mixture was concentrated to obtain a compound 7 (0.063 g). This was confirmed by the following spectroscopy . Example 1.2   Synthesis of the Left Part (Compound 8) of RT3 Phosphonate Transition State Analog (RT3A) (FIG. 2) checking)   From the demethylation of compound 3 using thiophenol and triethylamine Preparation of Compound 8   Compound 3 (0.122 g) was dissolved in dioxane (1.5 ml) and thiophenol (0.55 A solution of g) in dioxane (1.5 ml) was added with stirring. Then, triethylamine (0.70 ml) was added and the solution was stirred at room temperature for 24 hours. Separate the reaction mixture Water (50 ml), the aqueous layer was adjusted to pH 7 with aqueous HCl, and The liquid was washed with dichloromethane (5 × 50 ml). Aqueous layer is acidified to pH 1 with 1M HCl aqueous solution And extracted with ethyl acetate (2 × 75 ml). Combine the organic layers and add water (5 washed with anhydrous MgSOFourDry with, filter and concentrate. Use silica (10g) And purified by elution with methanol-dichloromethane (8:92 by volume to 15:85 by volume). Compound 8 (0.055 g) was obtained. This was confirmed by the following spectroscopy. Example 1.3   Synthesis of the right part (Compound 12) of the RT3 phosphonate transition state analog (RT3A) (FIG. 3) checking) Preparation of dibenzyl methyl phosphate (compound 9)   Sodium hydride (60% dispersion in mineral oil) (0.16 g) with dry hexane (2 × 10 ml) Washed. To the decanted solid, dry THF (5 ml) was added and stirred. The suspension was cooled to 0 ° C. Dibenzyl phosphite (1.048 g) in dry THF (5 ml) The solution was added and the mixture was warmed to room temperature. 30 minutes later, methyl iodide (0.32m l) was added and the reaction mixture was stirred for 2 hours. Concentrate the reaction mixture and add Redissolve in chill (75 ml) and add saturated aqueous ammonium chloride (50 ml) and water (10 ml). Washed. The organic layer was dried over anhydrous MgSOFour, Filtered, concentrated and then silica (10 g) Chromatograph eluting with ethyl acetate-hexane (1: 1 volume ratio) Purification was carried out to obtain dibenzylmethylphosphonate (9) (0.750 g). this Was confirmed by the following spectroscopy. Preparation of benzyl methyl phosphate (compound 10)   Dibenzylmethylphosphonate (9) (0.277 g) was added to dioxane (1 ml) and water (0.5 ml). ). 2M LiOH aqueous solution (1 ml) is added and the mixture is stirred vigorously for 48 hours Was. Water (25 ml) was added and the aqueous layer was washed with ethyl acetate (25 ml). Use concentrated HCl for aqueous layer And acidified to pH 1 and extracted with ethyl acetate (2 × 35 ml). Combine the organic layers and Water MgSOFour, Filtered, and concentrated to give benzyl methyl phosphate (10) (0.183 g ). This was confirmed by the following spectroscopy. Preparation of Compound 11   Benzyl methyl phosphate (10) (0.118 g) was dissolved in thionyl chloride (1 ml) and stirred for 4 hours. Stirred. The reaction mixture was concentrated to dryness and left under high vacuum for 16 hours. Dry this Dissolved in dry dichloromethane (1 ml) and DMF (1.5 ml). While stirring, methyl 4- Hydroxyphenyl acetate (4) (0.083 g) and triethylamine (0.170 ml) Was added. After 16 hours, a saturated aqueous ammonium chloride solution (30 ml) was added and mixed. The material was extracted with ethyl acetate (2 × 50 ml). The organic extracts were combined and anhydrous MgSOFourDry Dry, filter, and concentrate. Use a preparative tlc plate (1 mm) and Purification was performed using toluene-hexane (4: 6 volume ratio) as a solvent, and Compound 11 (0.068 g) was obtained. Obtained. This was confirmed by the following spectroscopy. Preparation of Compound 12   Methylation of dibenzyl phosphite with methyl iodide gives Lephosphonate (9) was obtained. This is hydrolyzed with lithium hydroxide to obtain phosphoric acid 10. Was. Activation with thionyl chloride, followed by methyl 4-hydroxyphenylacetate Compound 11 was obtained by reacting with Compound (4). The final production is achieved by catalytic hydrogenation of 11 The product (12) was obtained.   Compound 11 (0.060 g) was dissolved in ethyl acetate (10 ml), and 10% palladium-activated carbon (0.03 g) was dissolved. g) was added. The mixture was stirred under a hydrogen atmosphere for 3 hours. Then, this Filter through a bed of ethyl acetate and add ethyl acetate (2 × 10 ml) to recover The product was washed. All washes and filtrates were combined and concentrated to give compound 12 (0.0 38g) was obtained. This was confirmed by the following spectroscopy. Example 1.4   Synthesis of RT3 substrate (see FIG. 4)   Preparation of 4-hydroxyphenylacetamide (Compound 13)   Methyl 4-hydroxyphenyl acetate (4) (0.83 g) was added to saturated ammonia methanol Solution (30 ml) and a thick tube with a Teflon screw cap. Put it in the oven. The solution was stirred at room temperature for 72 hours in the sealed tube. reaction The mixture was concentrated and redissolved in methanol chloroform (2: 8 by volume, 75 ml). Was. Since no crystallization occurred, the solution was concentrated to half its volume and And hexane was added and heated. Cool to 0 ° C and add 4-hydroxyphenylacetate. Crystals of toamide (13) (0.524 g) were obtained. This was confirmed by the following spectroscopy. Preparation of Compound 15   Amide 13 was prepared by ammonolysis of methyl ester 4. Me The cytyl acetic acid is activated with thionyl chloride and then reacted with amide 13 to give the final The product 15 was obtained.   Mesityl acetic acid (0.10 g) was dissolved in thionyl chloride (1 ml) and stirred for 4 hours. The reaction mixture was concentrated to dryness and placed under high vacuum for 16 hours. Mesich obtained Dissolve acetyl chloride (14) in dry dichloromethane (1 ml) and add Drying of xyphenylacetamide (13) (0.076 g) and triethylamine (0.077 mL) Added to dry DMF (1 ml) solution. The reaction mixture was stirred for 90 minutes, then concentrated and extracted with ethyl acetate. Redissolved in chill (30 ml) and saturated aqueous sodium bicarbonate (25 ml) and water (5 ml). ml). The organic layer was dried over anhydrous MgSOFour, Filtered and concentrated. Ethyl acetate Was purified by preparative silica tlc (1 mm) using toluene as the solvent to give compound 15 (0.055 g). Obtained. This was confirmed by the following spectroscopy. Example 2   Hapten conjugate   RT3 hapten (4- (carboxymethyl) phenyl- (2,4,6-trimethylphenyl)- Methylphosphonate (compound 7, FIG. 1)) to the free carboxyl group on the hapten Therefore bovine serum albumin (BSA) and keyhole limpet hemocyanin (KLH) To   5.4 mg of RT3 was dissolved in phosphate buffer at 37 ° C. and then 6 mg of EDC (1-ethyl-3- (3 -Dimethylaminopropyl) carbodiimide-HCl), and N-hydroxysulfos It was mixed with succinimide (S-NHS) at a molar ratio of 1: 2: 2, respectively. 10mg BSA in water Dissolved and then added to the hapten. The molar ratio of hapten to BSA is B When the molecular weight of SA was 64,000, it was 100: 1. The mixture was stirred at room temperature for 3 hours. Dialysis twice against phosphate buffered saline (PBS) at 4 ° C. for 2 days Was done.   The RT3-KLH conjugate was brought to pH of the hapten, EDC, S-NHS mixture prior to adding KLH by NaOH Was prepared in the same manner as RT3-BSA, except that the pH was adjusted to 6.0 using. Hapten Was 100: 1 with a BSA molecular weight of 64,000. reaction The mixture is stirred for 2 hours at room temperature, then dialyzed against PBS at 4 ° C. for 2 days Was done.   After dialysis, the protein concentration is determined by micro-bicine using BSA as a protein standard Conic acid (micro-bicinchonic acid) assay (Pierce, Rockfor d, Illinois).Example 3 Immunization and mRNA isolation   BALB / c female mice (14 weeks old) were emulsified in complete Freund's adjuvant μg of RT3-KLH was injected intraperitoneally. Mice were incompletely floundered at 4 and 7 weeks Booster with 10 μg RT3-KLH emulsified in adjuvant. Mouse last Three days after injection, they were sacrificed and spleens were removed and used as a source of mRNA. The immune response after the second injection was measured by ELISA. Antiserum potency against RT3-BSA The value was 1: 100,000.   Preparation of mRNA-mRNA was obtained from mice immunized with RT3-KLH as described above, 105 mg Isolated from the spleen. mRNA was purified using the FastTrack mRNA isolation kit (Invitrogen Corp, S an Diego, CA) according to the manufacturer's instructions. The yield of mRNA is It was 5.4 μg as measured spectrophotometrically using the following formula:   [mRNA] = (A260) (0.04μg / μl) D where D is the dilution factorExample 4 Materials and methods for construction of phage display libraries   The protocol used in the following procedure is described in Sambrook et al., Molecular Clonin. g: described in A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) Was done.   Restriction digestion, analysis of restriction enzyme digests on agarose gel, phenol / chloro Purification of DNA using form, preparation of 2 × TY medium and plate, tetracycline And ampicillin stock solutions, protein PAGE, phosphate buffered Preparation of physiological saline, preparation of plasmid DNA by alkaline lysis, salt of plasmid DNA Cesium chloride purification.   All enzymes are supplied by New England Biolabs (Beverly, MA) and Unless otherwise stated, they were used according to the manufacturer's instructions.   Ligation was performed using the Amersham (Arlington Heights, IL) ligation kit. G Lath milk (Bio 101, La Jolla, CA) or Magic Miniprep or Purification of DNA using Gick PCR Prep (Promega, Madison, WI) was performed by the manufacturer. Performed according to conditions.   Preparation and transformation of competent cells was performed using Bio-Rad (Hercules, CA) Electronics. Performed according to the method described in the Toro Transformation Protocol.   The following is described in McCafferty et al., 1992, Patent WO92 / 01047: Preparation of phage, expression of phagemid particles, single-stranded DNA, soluble single-chain Fv antibody, Analysis of diversity by tanning and ELISA procedures, PCR and BstN1 digestion.   DNA was obtained from competent TG1 cells (genotype: K12d (lac-pro), sup E, thi, hsd D5 / F'traD36, pro A + B +, Lac Iq, lac ZdM15) or HB2151 cells (genotype: K1 2d (lac-pro), thi / F'pro A + B +, Lac IqZ dM15).   Mouse PCR primers, vectors pCANTAB 3 and pCANTAB 5, and anti-M13 The body is available from Pharmacia (Piscataway, NJ) (each catalog number Nos. 27-9400-01, 27-9401-01, 27-9402-01).Example 4.1 Soluble units using the “Immobilized Metal Affinity Chromatography Procedure” (IMAC) Vector preparation to facilitate rapid / multiple isolation of chain Fv (scFv) antibodies   Bacterial expression from phagemid vector for catalytic antibody screening It would be advantageous to have a means for easily purifying / concentrating the antibodies obtained. Changes below Was incorporated into the phagemid vector pHEN, pCANTAB (McCafferty et al., (1992) Patent Application No.WO 92/01047, Hoogenboom H.R., et al.Nacl . AcidR es. 19, (1991): 413 3-4137, Pharmacia product literature catalog number 27-9401-01):   i) A sequence encoding six histidine residues was introduced at the C-terminus of the antibody.   ii) The sequence encoding the myc tag peptide at the C-terminal of the antibody is Included for out / separate purification. Incorporate these changes to express in bacteria A very simple and rapid procedure was developed for concentrating and purifying isolated antibodies.   Two pairs of oligonucleotides were synthesized to produce the double stranded insert shown below. This They have a compatible 5 'overhang at the NotI site and therefore this part in pHEN, pCANTAB. Can be regenerated to regenerate a NatI site at the 5 'end as described below.   Clackson et al., Which cloned His-6 3/4 into the Pst1 / Not1 site of pHEN1,Nature  352 (1991): clones with high affinity oxazalon binding described in 624-628 And cloned into pHEN-OX16. This construct was detected using 9E10 antibody 9. A product consisting of [aOX antibody-his-6-myc tag-amber codon-gene 3] (Cell lines producing 9E10 antibody 9 are available from ATCC, Rockville, MD. M CRL1729 called YC1-9E10.2). Call this new construct pOX16his-11, and As shown in FIG.   Using this clone, the following “Immobilized metal affinity chromatography A "order" (IMAC) purification scheme was performed. Further construct His-61 / 2 clone scFv4 Into the lysosome (lysine) cloned into pCANTAB3. sozome) consisting of a conjugated D1.3 scFv antibody. This construct was tested using the anti-D1.3 antiserum. (D1.3 antibody-his-6-amber codon-gene 3) .   All cloning operations were performed on TG1 and exact clones were simply It was introduced into the non-suppressor strain HB2151 for expression as a chain Fv.   All volumes are 50 ml of the starting culture volume, and all bacterial growth It was 30 ° C in the main HB2151. E. coli having the desired plasmid coli cells at 2% 0.7-1.0 O.D. in 2 × TY medium supplemented with glucose, 100 μg / ml ampicillin. / ml. Cultures are incubated in a 50 ml Falcon tube at 3500 rpm for 10 minutes. Centrifuge at room temperature, resuspend in 2 × TY / 100 μg / ml ampicillin / 1 mM IPTG, And grown for 3 hours. Cultures are grown for 15 minutes at 3500 rpm in 50 ml Falcon tubes. Centrifuge at a temperature of 0 ° C. and in 1 ml of cold buffer A (PBS / 1M NaCl / 1 mM EDTA) And resuspended on ice for 15 minutes. Centrifuge the sample twice for 10 minutes. The supernatant with the media content is collected and the MgClTwoWas added to 1-2 mM.   400 μl of Ni-NTA agarose pre-equilibrated with buffer A: buffer 1 : 1 slurry (Qiagen, Chatsworth, CA) was added to the periplasmic preparation and For 10 minutes at room temperature on an inverting platform. I did it. The mixture is centrifuged at low speed for 10-15 seconds in a microcentrifuge and The let was resuspended in 1 ml of buffer A. Repeat this process twice more Resuspend in either 100 μl of PBS with 250 mM imidazole or buffer A. It became cloudy. After 10 minutes, the supernatant is collected and the pellet re-reconstituted with another 100 μl of the same buffer. Extracted and pooled.   The results are shown in lanes marked with uppercase letters A, B, C, D, E and F in FIG. Shown. FIG. 6 lane A shows rich accumulation of scFv in the periplasm after 3 hours of induction To do so. As expected, scFv is cultured after overnight incubation Found only in the supernatant (data not shown). Isolation of antibodies from the periplasm , It can be prepared after shorter induction with better quality product potential In addition, if performed from the periplasm, the first centrifugation step itself will It also has the advantage of effective concentration. Lanes B and C show antibody fragment Incubate Ni-NTA matrix with periplasmic extract as described above (See lane A) and the bound scFv was buffered A / 250 mM imidazo Shows that it is efficiently bound and recovered after elution with a gel. Lane D and And E, elution can be performed in PBS / 250 mM imidazole (without addition of NaCl) Is shown. This may be a more useful buffer for subsequent use of the antibody. Leh F produces an antibody fragment from which the clone scFv4his-6 can be recovered in the same manner. To do so.   This procedure is a very convenient way to concentrate / purify antibodies Facilitates the simultaneous preparation of multiple samples required for screening of DNA.   Isolate DNA spanning the BamH1 site from the central Not1 cloning site of gene III Prepared by cutting with Not1 and BamH1 did. Use this to replace equivalent Not1 / BamH1 sites in PCANTAB 3 and pCANTAB5 Thus, vectors PCANTAB 3 his-6 and pCANTAB5 his-6 were obtained. This is myc tag And the his-6 tag is transferred to a new scaffold (FIG. 7).Example 4.2 Preparation of phage library from mouse immunized with RT3   For construction, PCR and sequence analysis of mouse-derived phage display libraries The sequences of all primers used are shown below:   Spleen mRNA is derived from mice immunized with RT3-KLH (see Example 3) And random hexamers (Pharmacia, Piscataway) as primers , NJ) was used to prepare cDNA. PCR reaction conditions are essentially McCafferty et al. Taq polymer as described in patent application WO 92/01047 and according to the manufacturer's requirements Use   Primary heavy chain product (VH) was generated using primers VH1FOR-2 and VH1BACK . The primary light chain PCR product (VL) was prepared by equimolar amounts of 4 MJKFONX primers and 5 VKBA Use one of the CK primers (VKABACK, VKCBACK, VKDBACK, VKEBACK, VKFBACK) And made in five separate reactions. PCR conditions for VL are as follows: 94 ° C for 1 minute, 55 ° C 25 cycles of 1 minute and 2 minutes at 72 ° C, followed by a 10 minute incubation at 72 ° C. It was a privation. For VH, the hybridization temperature is 55 ° C. And 60 ° C was used. This is because better results can be obtained.   The linker fragment was prepared using the template pscFvNQ11 (McCafferty, J. et al., WO92 / 01047) with primer LINKBACK and primer VKALINKFOR respectively 5 containing one of VKCLINKFOR, VKDLINKFOR, VKELINKFOR, VKFLINKFOR Prepared in separate reactions.   The primary product was gel purified and complementary to the 3 'end of VH and the 5' end of various VLs. The linker fragments were used to link together in five separate ligation reactions. Linking Using the three fragments and without adding primers Performed in a "mock" PCR reaction. After ligation, approximately 10 ng of each fragment was present. Performed in duplicate in an existing 25 μl volume. This concatenation is 9 25 temperature cycles of 1 minute at 4 ° C, 2 minutes at 60 ° C, and 2 minutes at 72 ° C, followed by 10 cycles This was done through a 72 minute incubation at 72 ° C. 25 μl assembly reaction Run the gel on a gel and, after destaining, the assembled product is (Data not shown).   The material for cloning was prepared using primers (VH1B ACKAPA10 and a mixture of JK1NOT10, JK2NOT10, JK4NOT10, JK5NOT10) Prepared in a secondary PCR reaction. A small amount of the product from the ligation reaction was 1 μl) during the PCR reaction. PCR conditions were 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 25 cycles of 2 min at 72 ° C followed by 10 min incubation at 72 ° C Met.   The secondary PCR product was cut with the enzyme ApaL1 / Not1, gel purified, and the ApaL1 of pCANTAB3his-6. And Not1 sites and transformed into electrocompetent TG1 cells Converted. (Transformation efficiency was 5 × 10 for pUC198/ μg and 1 × 10 for6~Ten7/ μg). 1.2 × 106Clone library And 18/20 clones were found to have the insert. By PCR Analysis and BstN1 digestion show that they are all different.Example 4.3   Panning of mouse anti-RT3 library against RT3-BSA   The panning procedure is essentially Marks, J.D., et al.Biotechnology 10 (1992) ： 779-7 83 as described. The RT3 hapten (compound 7, FIG. 1) is described in Example 2. And bound to BSA. Nunc (Kamstrup, Denmark) immunoadsorption tubes Coated with ml of 20 mg / ml RT3-BSA. Tubes are placed in 4 ml PBS / 2 at 37 ° C for 2 hours. % Milk powder to the top and 0.8-1.0 ml of concentrated phage (10-50 ml) Was used for binding. The tube was not inverted. Phage Binding and washing was performed using MOPS buffered saline (MBS, 50 mM MOPS pH 7.4, 150 mM NaCl).   Washing was performed 10 times with MBS / 0.1% Tween 20 and 10 times with MBS. Fur joined The eluate was eluted with 800 ml of 100 mM triethylamine and 400 ml of 1 M Tris pH 7.4. Infect TG1-tr cells (T-phage resistant TG1 cells) I let it. Cells infected with the eluate were treated with 2% glucose / 100 mg / ml ampicillin. Plated on replenished large (22 × 22 cm) TY plates. Following bacterial stock Day, seed them in liquid culture and rescue them with M13 helper phage. The panning procedure was repeated a second time with the enriched phage.   Repeat the panning process and use enriched phage for polyclonal ELISA Was. No signal was obtained from the unpanned library, An increased signal was obtained through continuous panning (not shown). PAN1, PA The number of phages eluted after N2 and PAN3 was a multiple of each, as expected. (0.12, 50, and 2200 × 10, respectively)6Infected phage).   Eluted phage from PAN1 and PAN2 were transferred to HB2151 cells (non-soluble SCFv Suppressor strain). Individual colonies were harvested with 10% supplemented with 2% glucose. Transfer to a 96-well plate containing TY medium (TY / G / A) with 0 mg / ml ampicillin. The seeds were grown for 4 to 16 hours (stock plate). Using these cultures, Plated in a second 96-well plate containing TY / A and 0.1% glucose. This After incubating the plate at 30 ° C. for 2 to 4 hours, IPTG was added to 1 mM. Induced by addition and grown overnight. On the next day, add 2 mg of the culture supernatant in advance. ELISA plates coated with RT3-BSA / ml and blocked with 2% milk powder Added to the plate. The conjugation was performed in 1 × MBS / 2% milk powder and the conjugation was , Mouse 9E10 antibody followed by goat anti-mouse-peroxidase (Sigm a, St. Louis, Missouri). To detect myc tag peptide The 9E10 antibody used for ATCC, Rockville, Maryland (CRL1729, given name is MYC1-9E10.2).   PAN1 using RT3-BSA as antigen throughout this procedure and using MBS buffer Screening for their binding identified 47 positives from 364 clones. Was. In a similar manner, 115/184 positives were identified from PAN2. Diversity of clones Single stranded DNA insert PCR amplified from each clone as described in Example 4.0 The products were analyzed by BstNI digestion.   The results are summarized in Table 1 for each group as shown below. Analysis from PAN1 Seventeen of the forty-eight binders (35%) had pattern A. Out of 115 from PAN2 A total of 78 binding clones (68%) had PCR pattern A. (22 of these Restreaked and analyzed further. These are shown in FIG. 1 and Table 1.) Pa Turn B shows two of the 48 clones (4.1%) from PAN1 and 115 from PAN2. Within 24 (21%) were found. Two of the 48 from PAN1 have pattern C (4.1 %), While three of the 115 from PAN2 (2.6%) had this pattern. putter D was 3 out of 48 clones from PAN1 (6.2%) and 115 out of PAN2 3 (2.6%). Therefore, the ratio of positives from each group The rate seems to vary from PAN1 to PAN2. The choice simply depends on the strength of the binding to RT3 If based, this could potentially catalyze after several rounds of panning Clonal loss.   At least 15 other patterns (many appear only once) are found in PAN1 Was done. Many other patterns present in PAN1 were not identified in PAN2 . In addition, several patterns not identified in PAN1 appeared in PAN2 . This is due to the PCR pattern groups we identified in the library. Claim that there is much more diversity than is shown.Example 4.4 Binding analysis of clones selected from a mouse RT3 phage antibody library   Several mouse RT3 phage antibody clones isolated from PAN2 (Table 1, Example 4 .3) was further characterized in terms of binding specificity. Use competitive inhibition mode And performed the analysis. In this analysis, as described in detail below, the RT3-BS Prior to addition to the A-coated wells, the antibody is free hapten or product or hapten. First react with the putene and some of the product.   Clones selected for analysis and their corresponding PCR patterns (Table 1 , See Example 4.3) are 50 (PCR B), 64 (PCR A), 68 (PCR D), 71 (PCR D). PCR E), 80 (PCR C), 84 (PCR A), 95 (PCR I), 96 (PCR A), and 97 (P CR A). Performed except that bound antibody was eluted with 50 mM EDTA, 0.5 M NaCl. Soluble from 50 ml cultures of each clone using the IMAC protocol described in Example 4.1 Sex scFv was purified. Set the scFv concentration for each clone to the appropriate scFv concentration By running a part of the eluted protein on a gel containing Estimated from stained SDS polyacrylamide gel. Reduce scFv protein to 4 μg / ml. And then 1: 2 over 11 wells of an RT3-BSA coated ELISA plate Serial dilutions were made. The concentration of scFv that gives 50% of the maximum ELISA signal is determined from the titration did. This scFv concentration was used in the subsequent competitive inhibition assay described below.   Competition inhibition ELISA assays were performed using scFv (as described above) with 100 μM At a concentration determined by titration): RT3 The hapten (compound 7, Fig. 1), the left part of the RT3 hapten (called RT3A, a compound Article 8, FIG. 2), the right part of the RT3 hapten (compound 12, called RT3B, FIG. 3), From the esteriolytic cleavage of the substrate (compound 15, FIG. 4) The left and right portions of the expected product (Product A (Mesitylaceti) c acid), FIG. 4) and Product B (compound 13, FIG. 4)). scFv, RT Incubate for 1 hour at room temperature in a tube before adding to 3-BSA-coated ELISA wells. Pre-incubated with the starting compound. The results of the assay are shown in FIG. OD415 Read the nm reading at a value of 1 (this is the absence of added competitive inhibitor). (Representing the ELISA signal seen for the corresponding scFv below). this Conclusion The result is that all clones, with the exception of 68 and 71, show their binding to RT3-BSA. Inhibition by free RT3 hapten. Shows inhibition by free RT3 None of the clones were shown to have cross-reactivity with BSA. Clone 64 , 84, 96, 97, and 50 also show binding inhibition by RT3A and Product A Indicates a lesser degree of binding inhibition. Quartz tested with RT3B or Product B No impediments to any of the loans.Example 4.5 Sequencing of mouse anti-RT3 scFv (s)   Most of the clones from PAN1 and PAN2 fall into the PCR A pattern group. However, it is not clear whether the clones in this group are the same or different. won. Therefore, many of these clones were sequenced. In addition, the same heavy chain To determine if and light chains are used in other major pattern groups Only several representative clones from other major groups did.   Single-stranded DNA was prepared from these clones shown in Table 1 and sequencing was performed using Seq This was performed using a uenase kit (USB, Cleveland OH). Genbank germline sequence Sequence alignment between clones and clones is described in "MacVec torTM(IBI, New Haven, Connecticut) program. 5 'and Since the sequence at the 3 'end is coded and forced by the PCR primers, They were "removed" for alignment. For presentation of the light chain sequence, -The coding sequence is not shown, but the primers used are shown in the right column. Heavy chain The 5 'primer is a single but degenerate primer, The sequence introduced by the primer is indicated in each case. For comparison, the actual The respective heavy chain primer sequences are shown at the 5 'and 3' ends of each clone. One ku The sequence of the loan is shown in the top row, and the difference from this sequence for other clones Is shown. The changes (resulting in amino acids) exhibited by all PCR A mutations are Was reviewed again. Sequence all unique changes in the heavy chain of pattern A The changes that were reviewed in the gel and that occurred in a large number of clones were Were examined in at least one clone carrying Light chain sequence of mouse RT3 binder   As shown in FIG. 9, the eight different light chains consisted of 15 different clones from pattern A. Used for The chains associated with clones mR6 and mR8 have one silent Germline V genes due to various nucleotide changes. mR9, mR18 and mR27 The chain used differs from mR6 and mR8 by another silent mutation. Obedience Thus, these five clones share the same protein sequence as the germline . Clones mR9 and mR27 derive identical sequences using different primers. ing. This indicates that they are independent isolates of this same sequence.   Clone mR3 and mR25 are amplified but also different primers Are identical in the sequence using The sequence shared by mR3 and mR25 is 2 Two silent nucleotide changes and two amino acids in FR3 and CDR3 It differs from mR6 and mR8 by two changes that result in a no acid change. Most changes are , Occur in the light chain shared by clones 14, 30, 36, 84, and 96. these And in all other light chains of this group, most amino acid changes are Gather in FR3, CDR3, and FR4.   A basic germline clone designated mR6 / 8 or mR9 / 25 can be expected. This They show an S to N change in CDR2, and then in three different ways Changes result in clones designated by 4, 97, and 14 (+ the other four) . Similarly, there may be a change from Y to F in CDR3 from the same starting point, MR3 and mR25. A third series of changes can result in mR24.   The light chain associated with pattern C (clone mR80) was also used in the pattern A clone FIG. 9 is aligned with the germline sequence used. The light chain in pattern C More highly variable from the same germline used in It appears to be a different form.   Clones showing other PCR patterns may use sequences from different germlines. It is. The relationship of these other clones to the closest germline is shown in Figure 10. You. In pattern B (50, 69), two nucleotide changes from the germline , Causes one amino acid change. Pattern D (10, 43, and 68, and 83) And eight nucleotide changes from the germline result in five amino acid changes . In Pattern I (95), two nucleotide changes from the germline Amino acid changes.   FIG. 11 shows different light chain sequences for the light chain sequence in pattern A (for mR6, mR8). Shows the relationship. There are many differences between them. Regarding patterns D and I Only the protein sequence is shown. Because nucleotide sequences have many differences Because it has. The latter two groups have longer CDR2s than others . Heavy chain sequence of mouse RT3 binder   Analysis of the heavy chain sequences associated with PCR pattern A Are all closely related, but in most cases differ from each other (Figure 12). Germline alignments were somewhat evident in these samples. Not sure. Among the clones isolated, the closest germline Belongs to the VH-II group, but there are a number of differences from this germline. In addition, claw There appear to be more amino acid changes between amino acids. As expected, change is , Gathered during CDR.   The heavy chain of pattern B (Figure 13) was aligned against different germlines and re- And a number of changes in the coming years. All four clones in this group It seems the same. Thus, clones sequenced from pattern B have identical clones. It appears to be multiple isolates of the antibody. The clone indicated by pattern D All are identical to each other and, except for the sequence of CDR3, the four amino acids are closest relatives. Germline (Fig. 13).   The alignment of the heavy chain of pattern B with all the different heavy chain patterns is shown in FIG. . The heavy chains in Pattern C (80) and Pattern I (95) are closely related to the heavy chains in Pattern B Involved. Pattern C differs by four amino acids. Pattern I is a single siren Unique amino acid changes and single amino acid changes. Interestingly, the pattern The heavy chains associated with B, C, and I have a CDR of only three amino acids.   Amino acid changes in mR95 appear to introduce an amber codon. this is , If the suppressor strain TG1 is used for phage preparation, an amino acid But non-suppressor strain HB21 used for screening for soluble antibodies At 51, it is predicted to act as a stop codon. Diversity of clones in pattern A   Table 2 references information obtained from sequencing clones in PCR pattern A. Combine. Each different light chain sequence in this group is indicated by the labels ai-aviii You. Each different heavy chain sequence in this group is denoted by the labels Ai-Ax. Clones 14, 30, 36 (PAN1), 84, 96 (PAN2) are identical and probably Represents a duplicated isolate of the same original clone. Clone 6 and 8 also It is always the same. In other cases, all clones are different. The same light chain has two There are two cases used with different heavy chains (aii of mR9 / mR27 and mR3 And mR25 aiii). As mentioned above, the light chain in each pairing is different Primers were used. Apart from replicated isolates, the same heavy chain has different clones. If it is used for an application, it does not exist here.   These PCR and sequencing experiments can be used for PCR analysis in mouse libraries. Overall size, as determined by sequencing, and subtle le At both vel) levels, it suggests that substantial diversity actually exists.Example 5.1 Screening scFv molecules for catalytic activity 1. First choice   Select based on hapten affinity using early screening protocols Rapid Subset of Potentially Catalytic ScFv Molecules from Large Numbers of ScFv Fragments Selected.   a) Immobilization: scFv fragment bound to hapten in ELISA assay Selected for screening to detect catalytic activity. 96-well Millititer GV Filter plates (Millipore) are pre-wetted with PBS containing 0.05% Tween-20 and And washed. Of scFv fragment immobilized on anti-myc antibody Protein A agarose The suspension (see above, see also Example 6.1) is added to a 96-well filter plate. Each was transferred to an individual well in the rate. Transfer the supernatant from the residue to a filter plate. And removed by suction. Immobilize the immobilized scFv fragment in PBS / Tween (5 × 20 0 μL), PBS (3 × 200 μL), and 25 mM HEPES (pH 7.0), 140 mM NaCl, 0.01% NaNThreeWashed in the wells by filtration at 4 ° C. (3 × 200 μL).   b) Incubation of scFv and substrate: immobilized and washed antibody with 25 mM He pes (pH 7.0), 140 mM NaCl, 0.01% NaNThreeAdd 200 μL of about 50 μM substrate (1) did. After subsequent incubation at room temperature (about 22 ° C) for about 24 hours, the substrate solution (Not beads) and run on high performance liquid chromatography (HPLC) Frozen (-20 ° C) until further analysis. Identical 96-well plate (still solid) Containing 10 mM Tris, pH 9.0, 140 mM NaCl, 0.01% NaNThreeAt 4 Washing was performed at × 200 μL / well. Again, 200 μL (this time in the pH 9.0 buffer above) 3.) 35-50 μM RT3 substrate (compound 15, FIG. 4) was added. scFv fragment Incubate with Compound 1 for hours, and lyse the substrate as in pH 7.0. The liquor was removed and frozen for later analysis of product formation.   c) Analysis of the reaction mixture for product formation: Pools of 2 or 3 reaction mixtures (50 μL of each reaction mixture) Analyzed. Centrifuge the mixture (100 or 150 μL) in an Eppendorf centrifuge. Separation was performed to prevent carryover of agarose to the HPLC system. Then sample Was injected into a Waters HPLC system equipped with a Vydac C-18 analytical reverse phase column. Dissolution The components of the effluent were converted from 0.1% TFA aqueous solution to 0.1% TFA acetonitrile solution for 30 minutes. Separated using a linear gradient to. The product is analyzed using the Waters spectrum detection system. (Typically set at 215 or 270 nm) for spectrophotometric detection and quantification. Was.   Initial screening analysis of 46 hapten-binding scFv fragments was performed at pH 7.0. And 9.0 to detect the catalytic activity. Perform HPLC analysis and predict product Measure the peak area for the sample pool that gives a peak at the measured retention time. Was. The results are summarized in Table 3 below. Of the reaction mixture (as two or three pools) HPLC analysis shows one pool of three samples and two at pH 7.0 That one pool of samples from each other has substantial product formation showed that. At pH 9.0, a large number of pools have product peaks above background. Work area. 3 pools of 3 samples larger than 0.6 Show large product peaks with peak areas, these are scored as positive Was. Therefore, an initial screening analysis was performed on potentially catalytic scFv fragments Were limited to 46 to 5 at pH 7.0 and 46 to 9 at pH 9.0 . The three candidates at pH 7.0 are the same scFv flags as the three candidates at pH 9.0. Was a mentor. Individual clones from each of the above identified active pools were evaluated for catalytic activity. Reassayed. Since the scFv remains bound to anti-Myc agarose, the pool The same material used in the assay was reused in the assay of individual clones. catalyst The results of the sex assay are shown in Table 4 below. The catalytic assay identified six clones Specified: 11, 12, 18, 19, 30, and 83. These show product peaks in HPLC occured. Clone 83 was active at pH 7.0, but was active at pH 9.0. There was no. Clone 18 and clone 19 at both pH 7.0 and 9.0 Was active. Clones 11, 12, and 30 were only active at pH 9.0 . Example 5.2 1. Secondary screening of catalytic activity   To further examine the scFv fragment for catalytic activity, Potentially catalytic proteins identified in Made. Purification of scFv was performed by affinity with IMAC or anti-Myc-protein A agarose. Achieved as described in Example 6.1 using any of the tea chromatography Was done. Assays are run with the same buffer system and pH values as the initial screen. However, the antibodies were tested individually and the antibodies were not immobilized and Was separated.   From these secondary assays, the catalytic activity of two scFv molecules, designated 18 and 83, was Was found. Clone 18 appears to be active at pH 9.0 but inactive at pH 7.0. Clone 83, on the other hand, is active at pH 7.0 but inactive at pH 9.0 or 5.0. It is. Both activities were achieved by combining 10 μM antibody with 40 μM substrate and 30 μM hapten. When assayed together, they were significantly inhibited by hapten (2). These two Clones were selected as candidates for large-scale purification of scFv as described below. This The results of these assays are shown in Example 6.4.Example 6.1 Large-scale purification of scFv from catalytic mRT3 phage antibody clones 18 and 83   Preparation of periplasm lysate-E. coli HB2151 clone expressing soluble anti-RT3 scFv The plate was incubated in 2 × YT containing 2% glucose and 100 μg / ml ampicillin. Grow overnight. The overnight culture was used to inoculate 500 ml of 2 × YT at a starting OD600 of 0.1. And the culture was shaken at 28 ° C for 3-5 hours to an OD600 of 1.2-1.8. 1m IPTG M at a final concentration and shaking incubation continued at 25 ° C. for 2.5 hours . Pellet cells at 4000 x G for 10 minutes and pellet the pellet to 6 ml periplasm Resuspended in lysis buffer (10 mM phosphate buffer, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5). ice Lysate after centrifugation at 6,000 x G for 30 min. The vesicle debris was removed. PMSF is added to the clear lysate at a final concentration of 5 μg / ml, and Lysates were stored on ice until purification as described below. Immobilized metal affinity chromatography (IMAC)   MgClTwoWas added to the periplasmic lysate at a final concentration of 1 mM and the lysate was added to 10 mM 1 ml bed volume of Ni, washed with phosphate buffer, 1 M NaCl, and equilibrated2+load Denka Sepharose column (Probond Metal binding Resin, Invitrogen Corp., San D iego, CA.). The column is 10 bed volumes of 10 mM phosphate buffer, 1 M NaCl, pH Washed with 7.5 and the bound scFv was eluted with 50 mM EDTA, 0.5 M NaCl. Kara The eluate is concentrated and centrifuged in 7 mM phosphate buffer, 0.15 M NaCl, pH 8.0. icon 10 Microconcentrator (Amicon, Beverly, MA) included in manufacturer's instructions Therefore, it was used and dialyzed (Mol.Cell.Biol. 5 (1985): see 3610-3616 ). For some preparations of scFv, concentration of the IMAC eluate was not required.   Anti-myc peptide affinity purification-Peptide of 13 amino acids at the C-terminus of scFv Affinica Antibody Orientation Kit (Schleicher and Schull, Keene, NH) according to the manufacturer's instructions. Cross-linked to in-A agarose. A column with a bed volume of 1 ml is 0.23 M Pre-washed with 0.3 M NaCl, pH 2.5, and 10 mM phosphate buffer, 0.5 M NaCl, pH 7 Equilibrated again at .5. Periplasmic lysate was prepared with an equal volume of 10 mM phosphate buffer, pH 7.5. Diluted and then passed through the column. Column with 10 bed volumes of 10 mM phosphate buffer , Washed with 0.5 M NaCl, and bound scFv was washed with 0.23 M glycine, pH 2.5, 0.3 M NaCl Was eluted. For some preparations, dialyze the column eluate and Concentration was performed using a Centricon 10 microconcentrator as described.Example 6.2 Phage antibody catalytic clone 18 by hydrophobic interaction chromatography and Purification of ScFv fragment from clone 83   IMAC or anti-myc peptides of scFv from lysates of E. coli clones 18 and 83 After doprotein A agarose purification (see Example 6.1), further scFv Purification with an alkyl superose 5/5 column connected to an FPLC system (Pharmacia) Done.   Chromatography was performed using (NH) in 0.1 M sodium phosphate (pH 7.0).Four)TwoSOFourStraight line Performed using a reverse gradient. It is formed from two buffers: Buffer A: 2 M (NH) in 0.1 M sodium phosphate (pH 7.0)Four)TwoSOFour Buffer B: 0.1 M sodium phosphate (pH 7.0) The gradient conditions were as follows: 0-3 ml: 10% buffer B 3-39 ml: linear gradient, 10% -70% buffer B 39 to 42 ml: linear gradient, 70% to 100% buffer B 42-44 ml: 100% buffer B 44 to 46 ml: linear gradient, 100% to 10% buffer B 46-49 ml: 10% buffer B   Samples were placed in 0.783 volumes of 0.1 M sodium phosphate (NHFour)TwoSOFourSaturated solution (4.1 M (N HFour)TwoSOFour) By addition of 1.8M (NHFour)TwoSOFourAdjust to the final concentration of, and one of the appropriate volume 0% buffer B: diluted with 90% buffer A and volume to the appropriate value for injection on the column Was increased. Fractions were collected and the peak corresponding to ScFv was spotted by SDS-PAGE. Identified as described. These are pooled, concentrated, and appropriately bound or Used for catalytic activity assays. Elution of the protein from the column280By Monitored and plotted automatically. Of IMAC purified scFv from clone 18 A typical chromatogram shows that most of the protein elutes in two different peaks Is shown. Fractions corresponding to each peak were pooled as indicated. Peak 1 Is a broad shoulder (Pool 1) eluting with 17.25-21.90% buffer B and Consisting of a sharp peak at 24.2% buffer B (pool 2). Peak 2 is 48.10 A sharp peak (Pool 3) eluting with% buffer B. Purify scFv by silver staining SD Monitored by S / PAGE with the following results: HIC column (IMAC purified scFv + (N HFour)TwoSOFour) Indicates that more than 90% of the protein is scFv Was. At least four additional bands were also visible. Pool 1 obtained after HIC And pool 2 analysis shows that most of the loaded scFvs are in these pools. And that no substantial purification of the scFv was achieved . Pool 3 contained a small amount of scFv and additional low molecular weight bands.   The chromatogram for clone 83 shows that the majority of the scFv protein was 54.7% relaxed. It shows elution at a single sharp peak in Impact B. The second of protein The small peak elutes during the final wash with 100% buffer B. These peaks The fractions corresponding to were pooled and analyzed by SDS / PAGE followed by silver staining. HIC (IMAC purified substance + (NHFour)TwoSOFour) Column load material contains more than 90% scFv I was out. After HIC, the majority of the scFv was transferred to a single major peak eluting with 54.7% buffer B. Recovered in For clone 18, substantial purification of the scFv was performed by HIC. Was not achieved. Small amounts of scFv found in small peaks that elute later Was.Example 6.3 IMAC and HIC purified S from phage antibody catalytic clones 18 and 83 cFv binding assays   Fractions or pools of fractions from the above purification protocol (Example 6.1 or 6.2) using the RT3-BSA solid-phase ELISA assay essentially as described in Example 4.4. And analyzed for RT3 binding activity. Fractions or pools of fractions are first of all PBS / T ELISA plates diluted 1: 5 or 1:10 in ween-20 and then coated with RT3-BSA Serial dilution 1: 2 in PBS / Tween-20 over 11 wells of the rate. 50% The titer giving the largest ELISA signal was determined for each sample analyzed. Multiply the titer by the volume of the pool or fraction analyzed to give each sample An estimate of the number of linking units in a cell can be determined. This analysis shows that clone 83 Most of the scFv loaded on the HIC column was recovered, which was lower than the column load. Compared to less than 10% of the binding activity. This result indicates that HIC Suggests that it may be inappropriate for production. Because of the binding activity and possibly This is because it can lead to instability of the scFv protein resulting in loss of mediation activity.Example 6.4 Of IMAC and HIC purified scFv from phage antibody clone 18 and clone 83 Catalytic assay   For clone 18, a representative catalytic assay was set up as follows: 50 μl scFv was added to 145 μl RT3 substrate (compound 15, FIG. 4) and 5 μl water or In some assays, it was added to 5 μl of the RT3 hapten. 50 μl water and 147 μl R Monitor blanks consisting of T3 substrate for background hydrolysis of RT3 substrate Set for. The reaction was allowed to proceed for 6 hours, after which the sample was frozen at -20 ° C The reaction was stopped. The sample was analyzed by HPLC as described in Example 5.1. The amount of scFv added to the assay typically ranges from 1 to 5 μg and The proteins were buffered in 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.3. Typical RT3 substrate concentration The degree was 25 mM Tris-HCl (pH 9.0), 140 mM NaCl, and 0.01% NaN.ThreeBuffered in 50 μM.   HPLC protocol showing the results of a typical positive catalytic assay for IMAC-purified 18scFv The lofil is shown in FIG. 15A. FIG. 15B shows the same assay but with the RT3 hapten (compound 2 shows an HPLC profile performed in the presence of compound 5, FIG. 1). Finally, FIG. Figure 3 shows the HPLC profile of the rank (no scFv added).   In a similar manner, the fractions obtained after HIC purification of 18 scFv (see Example 6.2) An assay of the minute pool was also performed. Major scFv containing pool (as described in Example 6.2 above) Representative results of the assay of pool 2) are shown in FIG. Similar results were obtained for pool 1 And pool 3 assays (data not shown).   Assays for IMAC- or HIC-purified scFv from clone 83 were cloned except for the following: Performed in a similar manner as described for run 18. Substrate was 25 mM HEPES (pH 7.0), 1 40 mM NaCl and 0.01% NaNThreeBuffered. Lower RT3 substrate at neutral pH The reaction was typically run for 24 hours due to low background hydrolysis. IMAC purification 83 The HPLC profile of the result of the positive catalytic assay for scFv is shown in Figure 17A. . The same assay repeated in the presence of the RT3 hapten is shown in FIG. 17B. Blank momo And a profile similar to the profile in FIG.17B was obtained. (Data not shown). Contains the main scFv obtained after HIC (see Example 6.2). The catalytic assay of the pool is shown in FIG.   The retention times of the expected and non-product related peaks were Note that it changed every time. The reason for this change is unknown. RT3 products (Compound 13, FIG. 4) By test run on HPLC alone and monitored at 215 nM, It was shown that different peak profiles were generated. This 215nM profile Using the RL as an internal control for each HPLC run with a 270 nM profile. The location of the product peak was determined exactly.   The conclusions from the results of the catalytic assay performed as described above are as follows. IMAC-purified scFvs from both clones 18 and 83 can hydrolyze RT3 substrates, The product peak elutes from the HPLC column with an appropriate retention time. RT3 C In the presence of putene, catalysis is probably in the antibody pocket relative to the RT3 substrate Is completely eliminated by the stronger binding of RT3 at This is because scFv catalyzes Further evidence of carrying. Because of the high affinity of RT3 substrates or haptic It is unlikely that there are natural esterases that can specifically recognize and bind to Because there is.   After HIC purification of the scFv for either clone 18 or 83, the scFv containing fraction No catalytic activity was observed. Loss of activity is probably unfolded Obtained due to instability of the scFv which results in aggregation or aggregation. About clone 83 The instability of the scFv was determined in assays performed with the HIC purified scFv described in Example 6.3. Clearly indicated by loss of coupling.Example 7.1 A simple binder for the transition state analog RT3 from an untreated human library. Separation   Immunization schemes can be bypassed, and low and medium affinity human antibodies (Up to Kds86nM) directly from human antibody libraries derived from non-immunized sources (Marks et al.,J. Mol. Biol. 222 (1991): 581-597). this The approach can be improved by a number of approaches described in the examples below The starting clone (s) may be provided (see Mar. ks et al.Bio Technology 10 (1992): 779-783). Therefore, these The approach has proven extremely valuable, especially in the area of therapeutic catalytic antibodies. It can lead to the isolation of the resulting fully human catalytic antibody.   Marks et al.J. Mol. Biol. 222 (1991): Non-immunized human live described in 581-597 Rally was excluded except that a coat concentration of 100-200 μg / ml RT3-BSA was used. RT3-BS coated in tubes as described for the epidemic mouse library Panned for A. The progress of the purification scheme is based on polyclonal phage Was monitored by ELISA using From two rounds of panning for RT3-BSA Polyclonal phage (RT3BSA: 2) is incubated with substrate overnight Produces a visible signal after Derived from 3 rounds of panning for RT3-BSA Polyclonal phage (RT3BSA: 3) gives a strong signal in ELISA (5 min 1O.D.). No binding to BSA was observed, and binding to RT3-BSA was 10- Inhibited by pre-incubation with 100 μg / ml soluble unbound RT3 Also, this suggests that it is specific for RT3 (not shown).   Individual clones from three and four rounds of panning are described in Example 4.3. Was tested for binding. Before you start screening on a large scale The minimum ELISA coat concentration was determined. Antigen concentration from 100 μg / ml to 1.6 μg / ml (100 (μl / well) reduced the signal by only 30% (de Data are not shown), so the 2 μg / ml concentration was used for all subsequent ELISA screens. Used.   HB2151 clone induced by IPTG was extracted from 144 clones derived from three rounds of panning. ELISA for specific binding to RT3-BSA using 100 μl of culture supernatant derived from Tested by assay. As shown in FIG. 19A, 40 clones had a strong ELISA signal. (0.7-2.5 O.D. after overnight incubation with substrate) and Is a moderate signal (0.2-0.5 O.D. after overnight incubation with substrate). Gave. FIG. 19B shows 48 clones from four rounds of panning against RT3-BSA. The results are shown below. Strong ELISA signal (0.7-2.5 O.D.) from these 39 clones And one clone showed a moderate ELISA signal (0.34 O.D.).   Tested from both rounds of panning by PCR analysis and Bst NI digestion All good binders share a common PCR pattern, and all but one All weaker binders are different from higher binder PCR patterns It was revealed that the PCR patterns were shared. One further pattern Found for one of the weak binders. Clackson et al.Nature 352 (1991): 62 Enrichment and comparison for moderate signal as previously described by 4-628 To enrich clones for successive ELISAs for high ELISA signals Interesting to see.Example 7.2 Sequence analysis of human RT3 binder   The various members of each PCR pattern group shown below were sequenced: PCR1 = RT3: 1, 4, 5, 41, 63, 80 PCR2 = RT3: 47, 54 PCR3 = RT3: 61 FIG. 20 shows the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of each group.Example 8.1 Chain shuffling of human RT3 binder   The scheme used for chain shuffling is shown in FIG. Human library or Indicates that all scFv clones in the mouse library have plasmid sequences upstream of the heavy chain. , Including the linker sequence between the heavy and light chains, and the gene 3 sequence downstream of the light chain Share a common array of Select / synthesize primers from these regions and clone General means were provided for amplifying the heavy or light chain V regions. Therefore, PCR using the primer LMB3 and PCRHLINK yields heavy chain products, but Immer FDTSEQ1 and LINKPCRL yield light chain products. LINKPCRL and PCRHLINK It is complementary and therefore provides a means of linking the products. In this way, each Separate heavy or light chains from the loan to the complement from the first library It can be linked to an entire population of chains. The ligated product was prepared using primers LMB3 and FDTSEQ1. It serves as a template for the secondary PCR to be used, and the secondary product is Digest with SfiI and NotI for roning. Primer after each digestion step The choice was made to allow for a change in the size of the fragment to be observed. Further In addition, the efficiency of digestion is due to having a relatively large protruding restriction site upstream. Will probably be improved. How to shuffle chains   Use the following primers: Prepare the primary heavy and light chain PCR products by the following reaction:   The PCR conditions were 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes in 25 cycles, and finally 72 cycles. At 10 ° C. for 10 minutes. For isolated clones, the template is the bacterial colony. -It can be most conveniently provided as a toothpick inoculum of origin. About library materials DNA was prepared from the frozen bacterial stock and 2-10 ng was added to the reaction . The primary PCR product was purified on an agarose gel and 5 μl of Geneclean Luc (Bio 101, La Jolla, Calif.), Each containing 2 μl of water in 10 μl of water. An eluate was obtained.   Assembly proceeds as follows:   Purified H 2.5 μl (20-50 ng)   Purified L 2.5μl (20-50ng)   10x reaction buffer 2μl   5 μm each dNTP 1.0 μl   Taq polymerase 0.2μl   Water 37μl   The PCR conditions were 94 ° C for 1 minute, 65 ° C for 4 minutes in 25 cycles, and finally 72 ° C for 10 minutes. is there.   For secondary PCR, 1 μl of the ligated material was used as a template. Anti The response was set as follows:   1 μl of the ligated PCR product   LMB3 primer (10 pmoles/ml) 2.5μl   FDTSEQ1 primer (10 pmoles/ml) 2.5μl   5.0 μl of 10 × PCR reaction buffer   2.5 μl of each 5 mM dNTP   Taq polymerase (5U / ml) 0.3μl   Water 37μl   The PCR conditions were 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes in 25 cycles, and finally 72 cycles. C for 10 minutes (5 μl can be easily seen on the gel).   The secondary product is extracted with phenol: chloroform and precipitated with ethanol. To remove Taq polymerase. The PCR product is subjected to Sf at 50 ° C according to the manufacturer's instructions. Digested overnight with il. The next day, before digesting with NotI for 3 hours at 37 ° C, 1/10 volume of 1M  NaCl was added to a final concentration of 150 mM NaCl, and Triton-XI00 was added to a final concentration of 150 mM. 0.01%. The digest is treated with phenol: chloroform, precipitated,TwoO Lysate and purify by running on 1.5% agarose, and "Genecle an "(Bio 101, La Jolla, CA). Elute the DNA in a final volume of 10-15 μl, Then, it was cloned into the SfiI / NotI site of pCANTAB5 his-6.   pCANTAB5 his-6 plasmid DNA was prepared by the alkaline lysis method and Purified by cesium centrifugation. Purified DNA was prepared with SfiI at a DNA concentration of 100 μg / ml. Digest according to manufacturer's instructions (50 ° C. overnight for SfiI), then 3 hours with NotI Digested. Digest products directly to Chromaspin 1000 column (Clontech, Palo Alto, CA) To remove stuffer fragments, and 2200 in a tabletop centrifuge. Spin at rpm for 3 minutes. The DNA is then phenol: chloroform extracted, and Dissolved at 100 μg / ml for use.   Ligation with Amersham (Arlington Heights, IL) ligation kit Do the following using:   Vector DNA 1μl (100ng)   Inserted DNA 2μl (10-50ng)   3 μl of 10 mM MgCl, 200 mM Tris (pH 7.4)   Buffer A 24μl   Buffer B 6μl   Incubate at 16 ° C for 30-60 minutes. For library preparation, shown above Five times the capacity was used. Concentrate the ligation product and use Geneclean Purified and eluted in a volume of 10-15 μl water. This is an electrocompete Bio-Rad (Hercules, CA) electroporator for unique T-phage resistant TG1 cells Introduced using according to the manufacturer's instructions.   After 4 rounds of panning of the naive human library (see Example 5.1) The three clones, hRT3-1, hRT3-47, and hRT3-61, were isolated by the chain shut Used as a template for the fling protocol. As described in Example 5.2 By sequence analysis, the three clones were mutually reciprocal for VH and VL gene utilization, respectively. It has been shown to be unique. Six different libraries were prepared. each If available, the name of the library is the fixed strand and the clone number from which it was derived. Say. Thus, H47 is immobilized from RT3: 47 bound to a library of human light chains. Is a library having a heavy chain.   The size of the resulting library is as follows:   PCR using primers FDTSEQ1 and LMB3 was performed for 10 Performed on colonies to determine the ratio of insertions. The results are shown in the table above. further, PCR products were digested with BstNI to determine diversity. But the chain shuffled live About two-thirds of the sequence (of a given clone) in the rally is currently fixed, and And that different members of the same V gene family can confer the same "BstNI characteristics". And should be remembered. Despite this, all library members It had no pattern associated with the original clone. In some cases, Duplicate patterns were found in the same library, and one pattern was H1 Could be found three times in the library.Example 8.2 Panning of human chain shuffling library   Phage particles were purchased from Marks et al.Biotechnology 10 (1992): described in 779-783 Rescue from the library. Libraries derived from the same starting clone -Phage from the pair were pooled and panned against RT3-BSA (eg, For example, H1 and L1). Panning and rescue, Nunc (Kamstrup, Denmark) Except that the immunoadsorption tube was coated overnight with 1 ml RT-BSA (20 μg / ml), Marks et al.J. Mol. Biol. 222 (1991): 581-597. Co For blocking and blocking as before in phosphate buffered saline (PBS) went. An equal volume of 20 ml of phage was added to a final volume of 800 μl of MO with 2% skim milk powder. Used in PS buffered saline (MBS). Washing, elution, infection, and M13 helpers Rescue with phage is as described above.   Non-panning library (PAN0), first panning (PAN1), or panning "Polyclonal" phage from one of the two rounds (PAN2) for ELISA Was used to determine the progress of the panning process for each library pair.   As shown in FIG. 18, no signal was observed from the PAN0 sample. Low level Signals were observed in PAN1 samples from RT3: 1 and RT3: 47, And a significant improvement is seen in the PAN2 sample. Library derived from RT3: 61 In ELISA, the ELISA signal is relatively low even after two rounds of panning. ELISA The results are reflected when quantifying the eluate from each round of panning as shown in Table 4. Is done. Increasing numbers of phages are eluted from the second panning. H61 / L61 The phage counts obtained for PAN1 and PAN2 in the library were H1 / L1 and H47 / L47. Less than the corresponding yield from the library.   Table 5 shows the percentage of positives from panning of the reshuffled human binder. Show. For reshuffled RT3: 1 and RT3: 47, after one panning Even the majority scored positive. Polyc from RT3: 61 reshuffled Lonal phage was negative after PAN1 and positive after PAN2 Therefore, individual colonies were only analyzed from PAN2 from this library.   Positive clones were restreaked and retested for RT3 and BSA binding . All reshuffled human libraries are high 1-2 times after panning A proportion of binder resulted. These are PCR / Bst (using FTDSEQ1 and LMB3) NI digestion resulted in RT3: 1 reshuffle library as shown in Table 6 below. For the 9 PCR pattern and for the RT3: 47 reshuffle library, the 4 PCR pattern. And for the RT3: 61 reshuffle library to an 8 PCR pattern. Looped.   The library of light chains and the shuffled heavy chains are related to each other, thus Possibility to derive different light chains with reduced possibility of PCR pattern diversity There is a potential. Conversely, even within a given PCR grouping, there is some diversity It is likely to be found by column determination.   To determine which antibody chains are from the original human clone, Separate PCR of the light chain V gene was performed on individual clones (flexibility between chains). Primers located in the sequence encoding the bulllinker peptide (PCRHLINK and And LINKPCRL) with either FDTSEQ1 or LMB3). Each PCR group The resulting clone pairs were analyzed (underlined in Table 6). The results are hu61: 16 and hu6 With the exception of 1:33 (pattern B), all heavy chains have the same heavy chain as the original isolate Indicates that you have done. These two clones now have a heavy chain pattern similar to RT3: 47 And has a light chain pattern that may be similar to the parent clone RT3: 61. Same PCR pattern Reshuffled clones described as having PCR / digestion of whole SCFv), now showing small differences (individuals run on 4% gels) From light chain PCR / digestion). Therefore, between hu1: 11 and hu1: 22 (pattern B), hu1: Difference between 17 and hu1: 26 (pattern D), between hu1: 32 and hu1: 40 (pattern E) Was found. For clones derived from RT3: 47, hu47: 9 and hu47: 10 (P Differences between the light chains of turns B), hu47: 37 and hu47: 1 (pattern C) were found . For clones derived from RT3: 61, the light chain between hu61: 13 and hu61: 24 (pattern A). Therefore, this analysis is much larger between these clones. Demonstrate great diversity.   Sequences were performed on clones derived from shuffling of RT3: 47 ( Confirmed in Table 5). Analysis of the heavy chain revealed that the sequence was identical to the original heavy chain except for hu47: 7. And (The clones analyzed were hu47: 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 20, and And 22). In hu47: 7, the valine in CDR2 is changed by the change from T to C. Converted to alanine. Light chain sequencing was performed on the clones underlined in Table 5. I went for it.Example 9.0 Directed selection using specific elution / competitive binding   Panning using competition for binding (eg, using reaction products) or Specific elution (eg, using smaller phosphonates) is performed using a panning process. Can be used to control traffic. When performing such procedures in ELISA wells In this case, a higher degree of variability can be exhibited. Therefore, collect the eluate after a specific procedure. And subject the entire plate to the detection procedure. Based on the results, the specific well The incoming eluate may be selected for further analysis / panning.   Test eluate from 96-well plates using 100 mM triethylamine Overnight ELISA signal after elution went from 0.289 to 0.019 I found that. (One pannin of shuffled human RT3: 47 library 2.5 × 10 (47PAN1 phage)11Polyclonal phage / c Was used.) The eluate titer was 7.5 × 107Individual infectious phage (0.03% of the input). This is the Nunc immunoadsorption Good comparison with eluates from tubes. In this case, 1.6 for the same sample × 1091 x 10 infectious phage13Results (ie 0.016 %) (See Table 3). This type of approach allows for specific elution procedures The range can be compared and the most appropriate sample will be sent to E. coli for further study. Dyed.   The minimal transition state analog equivalent to the left and right sides of the RT3 molecule is labeled RT3a (compound 8, FIG. 2) and RT3b (compound 12, FIG. 3). Products on the left side of substrate cleavage and The products on the right are designated as product A (mesityl acetic acid, FIG. 4) and product B (compound 13, FIG. 4). Say. Various components required for panning / elution of the original mouse library To determine the optimal concentration of RT, use the dilution series for RT3, RT3a, RT3b and both reactions. (Product A and product B). These are the mouse RT3 library 100 μl of 10 × polyclonal phage from the first panning Re-incubated (using triethylamine elution).   The results of this analysis are shown in FIGS. 23A and 23B. The most effective inhibition involves RT3 itself Produced using The binding of the selected phage population is shown in the right part (FIG. 23B). Thus, the TSA and product on the left (FIG. 23A) were more significantly inhibited. It is clear that In fact, the concentration tested with TSA and product on the right It is not clear at all whether any inhibition occurs. The product on the left There appears to be greater inhibition by TSA on the left.   Specific elution was attempted using the original non-panning mouse library. this Was coated with 150 μl of 2 μg / ml RT3-BSA and blocked with 200 μl of 2% Marvel. This was accomplished by binding 200 μl of 10 × phage concentrate to the clicked ELISA wells. H The ligation was allowed to bind for 1 hour and eluted by adding 200 μl of: 0.05 μM, 0.5 μM or 5 μM RT3 5 μM, 50 μM or 500 μM RT3a 5 μM, 50 μM or 500 μM RT3b 100 mM triethylamine   The phage from the two 15 minute elutions were pooled and TG1 cells or HB2 Reintroduced into 151 cells. FIG.24A shows the yield of phage generated under each condition. Plot the quantities. Is triethylamine an equivalent input to 2 ml of culture supernatant? About 10FourGives the phage. This is a good result described in a previous report. This resulted in all of the previously described mouse clones I have. In this experiment, about 10FivePhages are equivalent to 20 ml of culture supernatant. Derived from Input. Elution at RT3 and RT3a is higher than triethylamine Of phage. RT3b was achieved in a "buffer alone" control. Provides elution levels equivalent to or greater than the level of elution.   This experiment was repeated but using a higher coat concentration (100 μg / ml) of RT3-BSA. To increase the coat volume and block volume beyond the input phage volume. To ensure that any non-specific phage adhesion to the sides of the wells Adjusted to prevent loose background problems). In this experiment (Figure 24B) Therefore, the total yield of eluted phage in all samples is less than before. Was.   Preparing polyclonal phage and soluble antibodies from different populations; and Tested in ELISA. Positive signals were obtained using soluble and phage ELISA, Achieved from samples derived by elution with 500 μM RT3a. From this population Individual colonies were screened and 22/144 clones were positive. And found.   Panning was also performed on the original immunoadsorption tube (Nunc). Elution Performed with either 100 mM trimethylamine or 500 μM RT3a. Yield bond Performed in the presence (50, 500, 5000 μM) or absence of product A. The results are summarized below To:   In this experiment, phage yield from elution of triethylamine and RT3a ( 42 ~ 52 × 106Is higher than previous experiments. 50 μM product A is present during binding Phage yield from RT3a elution is reduced by a factor of 70 Is specific). Similar reduction exists with 500 μM product A However, if 5000 μM of product A is used, the yield is 47 × 106Return to the individual. (this thing Can be the effect of DMS used to dissolve the product, and DMS Was present at 7.2%). Therefore, using hapten elution with a minimum of Phage can be eluted from either gel or immunosorbent tubes. is there. Further, the binding profile can be altered by competing with the reaction product, Thereby, the binding profile of the eluted population is prepared according to the desired requirements. obtain.Example 10 CDR shuffling of human RT3 binder   The scheme used to shuffle CDR fragments is described in Example 8.1. It is a modification of the listed chain shuffling scheme.   Primers VHCDR3BACK and REV VHCDR3BACK are mutually upstream and immediately upstream of CDR3 Is complementary to a conserved sequence in the framework region of the human VH gene. Marks (1991) contains both CDR1 and CDR2 of the heavy chain from the library described by A population of DNA fragments is identified as REV VHCDR3BACK (see below for sequence). And LBM3 (described in Example 4.2), and The rest of the scFV from the VHCDR3BACK (see below for sequence) and It can be amplified using FDTSEQ1 (described in Example 4.2). This means that Assembly reaction with the remaining portion of the single clone and the population of CDR1 and CDR2 Enables the combination of   Similarly, a library of DNA fragments containing the CDR3 region of the heavy chain was converted to VHCDR3BAC Using primer PCRHLINK (see Example 4.2) located at K and linker And can be amplified. Remaining heavy chains from the selected clones can be removed using REV VHCDR3BACK and And LMB3 and amplify the light chain with LINKPCRL (see Example 4.2). And FDTSEQ1. Thus, the population of CDR3 fragments The assembly reaction of two consecutive fragments (the first is the The assembly of CDR1 and CDR2 from Can be introduced. This is followed by LMB3, the flanking primer for this fragment. And a secondary PCR reaction using PCRHLINK. This product is used as the light chain from the clone. This was gel purified for subsequent assembly with this.   The scFV flanking primer, L, for both CDR shuffling methods A final PCR reaction using MB3 and FDTSEQ1 is performed. Next, the CDR shuffled The quality is digested with NotI and SfiI for cloning into pCANTAB5-his6 ( See FIG. 7). Methods for CDR shuffling   Primers FDTSEQ1, LMB3, PCRHLINK and LINKPCRL are described in Example 4.2. ing. In addition, use the following primers: (Nucleotides in parentheses indicate primers designed to ensure universal amplification. Indicates "fluctuations" in the markers. )   The primary PCR product is prepared in the following reaction.CD1 And 2 fragments LBM3 primer (10 pmoles/μl) 2.5μl REV VHCDR3BACK primer (10 pmoles/μl) 2.5μl 10 × PCR Reaction buffer 5.0 μl 2.5 mM each 5 mM dNTP Taq polymerase (5U / μl) 0.3μl Make water 50 μlCDR3 Fragment PCRHLINK primer (10 pmoles/μl) 2.5μl VHCDR3BACK primer (10 pmoles/μl) 2.5μl 10 × PCR Reaction buffer 5.0 μl 2.5 mM each 5 mM dNTP Taq polymerase (5U / μl) 0.3μl Make water 50 μlVHCDR3- Linker-VL fragment FDTSEQ1 primer (10 pmoles/μl) 2.5μl VHCDR3BACK primer (10 pmoles/μl) 2.5μl 10 × PCR Reaction buffer 5.0 μl 2.5 mM each 5 mM dNTP Taq polymerase (5U / μl) 0.3μl Make water 50 μlLinker-VL fragment FDTSEQ1 primer (10 pmoles/μl) 2.5μl LINKPCRL primer (10 pmoles/μl) 2.5μl 10 × PCR Reaction buffer 5.0 μl 2.5 mM each 5 mM dNTP Taq polymerase (5U / μl) 0.3μl Make water 50 μl   Miniprep DNA was obtained from the library described in Marks et al. (1991) by PCR. Prepared for template. Is PCR generated from the clone a bacterial colony? It was prepared by inoculation.   PCR conditions were 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes, 25 cycles, For 10 minutes at 72 ° C.   Primary PCR product requires Mermaid purification (Bio101) for its smaller size Gels using the Promega Magic PCR Prep System except for the CDR3 fragment Purified. CDR1 + 2 shufflingLibrary C with VH CDR3-linker-VL fragment from isolated clone Assembly of DR1 + 2 fragment Purified library CDR1 + 2 DNA 20-50 ng 20-50 ng of purified VHCDR3-linker-VL fragment from isolated clone 5.0 μl of 10 × PCR buffer 2.5 mM each 5 mM dNTP Taq polymerase (5U / μl) 0.3μl Make water 50 μl PCR conditions for primary PCRSecondary PCR of assembled CDR1 + 2 shuffled DNA 1.0 μl of assembly product FDTSEQ1 primer (10 pmoles/μl) 2.5μl LMB3 primer (10 pmoles/μl) 2.5μl 10 × PCR Reaction buffer 5.0 μl 2.5 mM each 5 mM dNTP Taq polymerase (5U / μl) 0.3μl Make water 50 μl CDR3 shufflingLibrary CDR3 fragment with CDR1 + @ fragments from isolated clones Assembly Purified library CDR3 DNA 20-50 ng 20-50 ng of purified CDR1 + 2 from isolated clones 5.0 μl of 10 × PCR buffer 2.5 mM each 5 mM dNTP Taq polymerase (5U / μl) 0.3μl Make water 50 μlAssembled library CDR3-CD1 + 2 shuffle from isolated clone Secondary PCR of DNA 1.0 μl of assembly product PCRHLINK primerExample 11 Induction of human catalytic antibodies by "imprinting"   The "imprinting" process involves the use of existing antibodies with the desired binding characteristics. And deriving new antibodies with similar characteristics. This process Recombines the original antibody chain or part thereof with a library of complementary parts It is done by doing. When a new antibody element is found (this is Libraries that replace the original antibody-binding features And recombining them with the library that replaces the original antibody binding portion To give a completely new antibody that mimics the binding of the original antibody (PCT / GB / 92/01755 ). This approach derives human catalytic antibodies from existing mouse catalytic antibodies Can be used for   This embodiment describes “two-step conversion”. Of course, this involves multiple steps. This can be done in a single step or in a single step (a high If bridging molecules are sufficient).   This induces, for example, a human antibody having similar binding activity to existing mouse antibodies. Is a useful way to   Catalytic phage antibody clones 18 and 83 in the pCANTAb vector (see Example 5.2) (See cloned in pCANTAB vector), separate heavy and light chains Used as template for PCR amplification of the strand. LMB3 and heavy chain as described above And light chain amplified using LINKPCRL and FDTSEQ1. Width. Libraries of human heavy and light chains also use the same primers, Marks et al., Above,J. Mol. Biol. 222 (1991): human scFV gene described by 581-597 Amplification was performed by PCR using DNA prepared from the library.   The individual mouse heavy chains from each clone were then subjected to PCR ligation as described above. And recombined with the human light chain library. Similarly, individual light chains can be Recombined with the heavy chain library.   The resulting ligation product is combined with NotI with ApaLI (for mouse heavy chain) or SFi Digested with I (for human heavy chain), ligated into the appropriate pCANTAB vector, and li TG1 cells were transformed. All steps were as described above.   Individual populations of TG1 cells with each separate library were incubated at 30 ° C. for 2- Grow for 3 hours and rescue by infection with VCSM13 helper phage at 37 ° C. - After overnight growth, phage particles were harvested and concentrated. Each group several times Panned against RT3-BSA and identified individual binding clones by ELISA Was.   Select binding clones, and the human chain of each clone is determined by PCR as described above. Amplified. This strand was recombined with the complementary strand human library PCR product. . PCR binding, digestion with SFi1 and NotI, ligation, transformation, phage Skew, panning and screening were as described above.   In this way, the binding profile is directed by the original mouse clone However, a new population of RT3 binders that were fully human was induced. the above Examples include imprinting by shuffling separate chains, , Can be equally applied to shuffling a portion of a chain in a single or multiple times ( As described above). Library materials include Marks et al.J. Mol. Biol. 222 (1991): 581- Derived from 597 libraries, but could equally be derived from PCR products such as human blood, spleen, etc. Alternatively, it can be partially or wholly derived from synthetic DNA.   The above example demonstrates shuffling of chains within a single chain Fv in a single replicon. Include. Similar results were obtained with unbound VH / VL or VH-CH displayed in phage. This can be achieved by using the G / VL-CL fragment (McCafferty et al., WO92 / 01047). These can also be in the same replicon, or In a con. For example, the heavy chain of the original mouse antibody is pUC19 or other Plasmid contains soluble VH or VH-CH1 fragment in the bacterial periplasm. Suitable promoters, signal peptides and And stop codon (s) can be cloned in frame (Bett er et al., 1989; Skerra et al., 1989). Then, the growth medium of the cells having this plasmid is The nourishment is, for example, obtained from a human light chain (either VL or VL-CL, as appropriate). Infected with helper phage from the library and left in fd-CAT1 or fd-DOG1 It can be cloned as a fusion with gene III (McCafferty et al., Supra, 1991). This It was fused to gene III, with a heavy chain partner from a mouse clone A population of phage expressing individual human light chains is generated. Mouse chain binding activity These complementary human chains are enriched by panning (McCafferty et al., Supra, 1991). The gene encoding this chain is present in phage particles.   The light chains derived from this method are used in the It can be recloned into a vector for soluble expression of a single chain in rasmus. Before As mentioned, growth cultures of cells expressing these individual human light chains are, for example, Infected with helper phage from a human heavy chain library, fd-CAT1 or Can be cloned as a fusion with gene III in fd-DOG1 (McCafferty et al., Supra). 1991). As described above, panning for antigen has appropriate binding activity Enriched clones. This resulted in a pair reflecting the binding of the original mouse clone. Of human clones.   A similar process involves shuffling the human heavy chain first and then the light chain. More can be done. Alternatively, from one separate shuffling of heavy and light chains Enriched populations or clones are separated by SCFv (s) or separate chains. May be recombined with one another in the same manner as described above for either.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 チスウェル， デイビッド イギリス国 エムケイ８ ２エルディー バックス， ミドル ケイストン， サン ドヒル ハウス １ (72)発明者 ダースリー， マイケル ジェイ. アメリカ合衆国 メリーランド 20851, ロックビル，ハルシー ロード 5905 (72)発明者 フィッツジェラルド， ケビン イギリス国 シービー11 ３ビーエックス エセックス，サフロン ワルダー， バ ーンステーブル クローズ ３ (72)発明者 ケンテン， ジョン エイチ. アメリカ合衆国 メリーランド 20879, ガイザースバーグ，ウィンドジャマー ウェイ 1921 (72)発明者 マーティン， マーク ティー. アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ガイザースバーグ，プライリー ローズ レーン ９ (72)発明者 ティトマス， リチャード シー. アメリカ合衆国 メリーランド 20872, ダマスカス，ブリガディアー プレイス 26001イー (72)発明者 ウィリアムズ， リチャード オー. アメリカ合衆国 メリーランド 20854, ポトマック，アルセア コート 9408──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C12N 9/00 C12N 9/00 G01N 33/531 G01N 33/531 A // (C12N 9/00 C12R 1:19) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, HU, JP, KP, KR, KZ, LK, LU, LV, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SK, UA, US, V (72) Inventor Chiswell, David MK8 2nd England Eldie Bax, Middle Kaston, Sandhill House 1 (72) Inventor Darsley, Michael Jay. United States of America 20851, Rockville, Halsey Road 5905 (72) Inventor Fitz Gerald, Kevin United Kingdom CB11 3 BX Essex, Saffron Walder, Burnstable Close 3 (72) Inventor Kenten, John H. United States Maryland 20879, Geysersburg, Windjammer Way 1921 (72) Inventor Martin, Mark Tee. United States Maryland 20878, Geysersburg, Prairie Rose Lane 9 (72) Inventor Titmouth, Richard Sea. United States Maryland 20872, Damascus, Brigade Ah Place 26001 E (72) inventor Williams, Richard Oh. United States, Maryland 20854, Potomac, Arcea coat 9408

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ファージ上に提示される触媒性抗体を産生する方法であって、以下の工程： (a)抗体由来ドメインの遺伝子ライブラリーを生成する工程； (b)ファージ発現ベクター中に該ドメインをコードするものを挿入する工程； および (c)該触媒性抗体を単離する工程、 を包含する、方法。 ２．前記触媒性抗体が単鎖抗体である、請求項１に記載の方法。 ３．工程(c)で単離される抗体がE．coli細胞を培養することにより大量に産生さ れる、請求項１に記載の方法。 ４．請求項１に記載の方法により調製される触媒性抗体。 ５．請求項１に記載の方法であって、前記抗体由来ドメインの遺伝子ライブラリ ーが以下の群： (a)免疫された動物由来のリンパ球から得られる遺伝子フラグメント； (b)免疫されていない動物由来のリンパ球から得られる遺伝子フラグメント； (c)VHおよびVL鎖のシャッフリングにより得られる遺伝子フラグメント； (d)CDR領域のシャッフリングにより得られる遺伝子フラグメント； (e)CDR領域の変異誘発により得られる遺伝子フラグメント； (f)インプリンティング；または (g)合成抗体遺伝子、 の１つまたはそれより多いものから生成される、方法。 ６．ファージ上に提示される触媒性抗体を単離する方法であって、以下の工程： (a)抗原を調製する工程； (b)該抗原で免疫する工程； (c)該免疫した動物からVHおよびVLドメインのライブラリーを生成する工程； (d)ファージディスプレイ抗体を生成するためにファージ発現ベクター中に該V HおよびVLドメインをクローニングする工程； (e)該抗原に特異的に結合するファージディスプレイ抗体を選択する工程； (f)基質に対する触媒活性について該選択したファージディスプレイ抗体をス クリーニングする工程；および (g)該触媒性抗体を単離する工程、 を包含する、方法。 ７．前記触媒性抗体が単鎖抗体である、請求項６に記載の方法。 ８．前記抗原が遷移状態アナログである、請求項６に記載の方法。 ９．前記抗原がホスホネートである、請求項６に記載の方法。 請求項６に記載の方法。 １１．請求項６に記載の方法により調製される触媒性抗体。 １２．ファージ上に提示される触媒性ヒト抗体を単離する方法であって、以下の 工程： (a)抗原を調製する工程； (b)VHおよびVLドメインのライブラリーを生成する工程； (c)ファージディスプレイ抗体を生成するためにファージ発現ベクター中に該V HおよびVLドメインをクローニングする工程； (d)該抗原に特異的に結合するファージディスプレイ抗体を選択する工程； (e)基質に対する触媒活性について該選択されたファージディスプレイ抗体を スクリーニングする工程；および (f)該触媒性抗体を単離する工程、 を包含する、方法。 １３．前記ライブラリーがマウス由来である、請求項１２に記載の方法。 １４．前記抗原が遷移状態アナログである、請求項１２に記載の方法。 １５．前記抗原がホスホネートである、請求項１２に記載の方法。 請求項１２に記載の方法。 １７．請求項１２に記載の方法により調製される触媒性抗体。 １８．鎖シャッフリングを介してファージ上に提示される触媒性抗体を産生する 方法であって、以下の工程： (a)鎖シャッフルされたライブラリーを形成するためにVL遺伝子のライブラリ ーをVH遺伝子と組み合わせる工程； (b)シャッフルされた鎖をクローニングする工程； (c)ファージ上で該鎖シャッフルされた抗体を発現させる工程； (d)抗原に対して選択する工程；および (e)触媒活性についてスクリーニングする工程、 を包含する、方法。 １９．CDRシャッフリングを介してファージ上に提示される触媒性抗体を産生す る方法であって、以下の工程： (a)VLおよびVH遺伝子を単離する工程； (b)CDR領域のライブラリーを単離する工程； (c)CDRシャッフルされたライブラリーを生成するために該VLおよびVH遺伝子を 該CDR領域のライブラリーと再度組み合わせる工程；および (d)該CDRシャッフルされたライブラリーをクローニングする工程； (e)ファージ上で該CDRシャッフルされたライブラリーを発現させる工程； (f)抗原に対して選択する工程；および (g)触媒活性についてスクリーニングする工程、 を包含する、方法。 ２０．インプリンティングを介してファージ上に提示される触媒性抗体を産生す る方法であって、以下の工程： (a)抗体のセットを選択する工程； (b)該抗体からVH遺伝子のセットおよびVL遺伝子のセットを単離する工程； (c)２つの組み合わせライブラリーを形成するために、該VHのセットをVLのラ イブラリーと組み合わせ、そして該VLのセットをVHのライブラリーと組み合わせ る工程； (d)該組み合わせライブラリーをクローニングする工程； (e)該ライブラリーをファージ上で発現させる工程； (f)抗原に対して選択する工程； (g)VHおよびVL遺伝子の選択されたライブラリーを単離する工程； (h)該VHおよひVL遺伝子のライブラリーを組み合わせる工程； (i)該組み合わされたライブラリーをクローニングする工程； (j)該組み合わされたライブラリーをファージ上で発現させる工程； (k)抗原に対して再選択する工程；および (l)触媒活性についてスクリーニングする工程、 を包含する、方法。 ２１．抗体、６His残基、myc遺伝子の一部、およびファージ遺伝子IIIを含む、 組換えクローニングベクター。 ２２．前記ベクターが、以下のエレメント：結合活性を保持する抗体、金属イオ ン結合活性を保持するHis-6配列、および抗原性を保持するmyc配列からなる融合 タンパク質の産生を可能にする、請求項２１に記載の組換えクローニングベクタ ー。 ２３．前記ベクターが、以下のエレメント：結合活性を保持する抗体、His-6配 列、myc配列、および生物学的活性を保持する遺伝子IIIタンパク質からなる融合 タンパク質の産生を可能にする、請求項２１に記載の組換えクローニングベクタ ー。 ２４．インビボで分子内の特定の結合の切断または形成速度を上昇させる方法で あって、ファージ由来の触媒性抗体の有効量を動物に導入する工程を包含する、 方法。 ２５．プロドラッグのインビボでの活性化の方法であって、以下の工程： (a)プロドラッグを患者に導入する工程であって、該プロドラッグが、切断さ れて、該薬物の活性形態を放出する化学結合を有する、工程；および (b)該プロドラッグ中の該結合を切断し得るファージ由来の触媒性抗体の有効 量を該患者に導入する工程、 を包含する、方法。 ２６．インビボで分子内の特定の結合の切断または形成速度を上昇させることに より、動物で生物学的機能を活性化または不活性化する方法であって、触媒性抗 体の有効量を動物に導入する工程を包含し、該抗体が請求項１に記載の方法によ り産生される、方法。 ２７．インビボで分子内の特定の結合の切断または形成速度を上昇させることに より、動物で生物学的機能を活性化または不活性化する方法であって、触媒性抗 体の有効量を動物に導入する工程を包含し、該抗体が請求項１８に記載の方法に より産生される、方法。 ２８．インビボで分子内の特定の結合の切断または形成速度を上昇させることに より、動物で生物学的機能を活性化または不活性化する方法であって、触媒性抗 体の有効量を動物に導入する工程を包含し、該抗体が請求項１９に記載の方法に より産生される、方法。 ２９．インビボで分子内の特定の結合の切断または形成速度を上昇させることに より、動物で生物学的機能を活性化または不活性化する方法であって、触媒性抗 体の有効量を動物に導入する工程を包含し、該抗体が請求項２０に記載の方法に より産生される、方法。[Claims] 1. A method for producing a catalytic antibody displayed on a phage, comprising the following steps: (a) generating a gene library of an antibody-derived domain; (b) encoding the domain in a phage expression vector And (c) isolating the catalytic antibody. 2. 2. The method according to claim 1, wherein said catalytic antibody is a single chain antibody. 3. The antibody isolated in step (c) is E. coli. The method according to claim 1, which is produced in large amounts by culturing E. coli cells. 4. A catalytic antibody prepared by the method of claim 1. 5. 2. The method according to claim 1, wherein the gene library of the antibody-derived domain comprises the following groups: (a) a gene fragment obtained from lymphocytes from an immunized animal; (b) a non-immunized animal (C) a gene fragment obtained by shuffling VH and VL chains; (d) a gene fragment obtained by shuffling CDR regions; (e) a gene fragment obtained by mutagenesis of CDR regions (F) imprinting; or (g) a synthetic antibody gene. 6. A method for isolating a catalytic antibody displayed on a phage, comprising the steps of: (a) preparing an antigen; (b) immunizing with the antigen; (c) VH from the immunized animal. And (c) cloning the VH and VL domains into a phage expression vector to generate a phage display antibody; (e) phage display that specifically binds to the antigen Selecting an antibody; (f) screening the selected phage display antibody for catalytic activity on a substrate; and (g) isolating the catalytic antibody. 7. 7. The method according to claim 6, wherein said catalytic antibody is a single chain antibody. 8. 7. The method of claim 6, wherein said antigen is a transition state analog. 9. 7. The method of claim 6, wherein said antigen is a phosphonate. The method of claim 6. 11. A catalytic antibody prepared by the method of claim 6. 12. A method for isolating a catalytic human antibody displayed on phage, comprising: (a) preparing an antigen; (b) generating a library of VH and VL domains; (c) Cloning the VH and VL domains into a phage expression vector to produce a phage display antibody; (d) selecting a phage display antibody that specifically binds to the antigen; (e) catalytic activity on a substrate Screening the selected phage display antibody; and (f) isolating the catalytic antibody. 13. 13. The method of claim 12, wherein said library is derived from a mouse. 14． 13. The method of claim 12, wherein said antigen is a transition state analog. 15. 13. The method according to claim 12, wherein said antigen is a phosphonate. The method according to claim 12. 17． A catalytic antibody prepared by the method of claim 12. 18. A method for producing a catalytic antibody displayed on a phage via chain shuffling, comprising the steps of: (a) combining a VL gene library with a VH gene to form a chain shuffled library (B) cloning the shuffled chains; (c) expressing the chain-shuffled antibodies on phage; (d) selecting against antigen; and (e) screening for catalytic activity. Performing the method. 19. A method for producing a catalytic antibody displayed on a phage via CDR shuffling, comprising the following steps: (a) isolating VL and VH genes; (b) isolating a library of CDR regions (C) recombining the VL and VH genes with the library of CDR regions to generate a CDR shuffled library; and (d) cloning the CDR shuffled library; (e) expressing the CDR-shuffled library on phage; (f) selecting against antigen; and (g) screening for catalytic activity. 20. A method for producing a catalytic antibody displayed on a phage via imprinting, comprising: (a) selecting a set of antibodies; (b) a set of VH genes and a VL gene from said antibodies (C) combining the set of VHs with the library of VL to form a two combinatorial library, and combining the set of VLs with the library of VH; (d) ) Cloning the combinatorial library; (e) expressing the library on phage; (f) selecting for antigen; (g) simply selecting the selected library of VH and VL genes. (H) combining the VH and VL gene libraries; (i) cloning the combined library; (j) furnishing the combined library Step expressing above; (k) reselection to step to the antigen; step of screening for and (l) the catalytic activity including, method. 21. A recombinant cloning vector comprising an antibody, a 6His residue, a portion of the myc gene, and phage gene III. 22. 22. The vector according to claim 21, wherein the vector enables the production of a fusion protein consisting of the following elements: an antibody retaining binding activity, a His-6 sequence retaining metal ion binding activity, and a myc sequence retaining antigenicity. The recombinant cloning vector according to the above. 23. 22. The vector of claim 21, wherein the vector enables the production of a fusion protein consisting of the following elements: an antibody that retains binding activity, a His-6 sequence, a myc sequence, and a gene III protein that retains biological activity. Recombinant cloning vector. 24. A method for increasing the rate of cleavage or formation of a specific bond in a molecule in vivo, comprising introducing an effective amount of a phage-derived catalytic antibody into an animal. 25. A method of in vivo activation of a prodrug, comprising: (a) introducing the prodrug into a patient, wherein the prodrug is cleaved to release the active form of the drug Having a chemical bond; and (b) introducing into said patient an effective amount of a phage-derived catalytic antibody capable of cleaving said bond in said prodrug. 26. A method of activating or inactivating a biological function in an animal by increasing the rate of breaking or forming a specific bond in a molecule in vivo, comprising introducing an effective amount of a catalytic antibody into the animal. And wherein the antibody is produced by the method of claim 1. 27. A method of activating or inactivating a biological function in an animal by increasing the rate of breaking or forming a specific bond in a molecule in vivo, comprising introducing an effective amount of a catalytic antibody into the animal. 19. The method of claim 18, wherein said antibody is produced by the method of claim 18. 28. A method of activating or inactivating a biological function in an animal by increasing the rate of breaking or forming a specific bond in a molecule in vivo, comprising introducing an effective amount of a catalytic antibody into the animal. 20. The method of claim 19, wherein said antibody is produced by the method of claim 19. 29. A method of activating or inactivating a biological function in an animal by increasing the rate of breaking or forming a specific bond in a molecule in vivo, comprising introducing an effective amount of a catalytic antibody into the animal. 21. The method according to claim 20, wherein said antibody is produced by the method of claim 20.
JP7525622A 1994-03-30 1994-03-30 Isolation and production of catalytic antibodies using phage technology Ceased JPH10507341A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US1994/003420 WO1995027045A1 (en) 1994-03-30 1994-03-30 The isolation and production of catalytic antibodies using phage technology

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004141717A Division JP2004283175A (en) 2004-05-11 2004-05-11 Isolation and production of catalytic antibody using phage technology

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH10507341A true JPH10507341A (en) 1998-07-21

Family

ID=22242396

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7525622A Ceased JPH10507341A (en) 1994-03-30 1994-03-30 Isolation and production of catalytic antibodies using phage technology

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0759976A4 (en)
JP (1) JPH10507341A (en)
AU (1) AU695406B2 (en)
WO (1) WO1995027045A1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006506634A (en) * 2002-11-18 2006-02-23 ヴァルション テクニリネン ツッキムスケスクス Non-competitive immunoassay for small analytes
US8178320B2 (en) 2001-11-22 2012-05-15 Keio University Artificial antibody library with super-repertory

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2301198T3 (en) 1997-06-12 2008-06-16 Novartis International Pharmaceutical Ltd. ARTIFICIAL POLYPEPTIDES OF ANTIBODIES.
AU5122499A (en) 1998-07-27 2000-02-21 Genentech Inc. Improved transformation efficiency in phage display through modification of a coat protein
AU2001277867B2 (en) * 2000-07-11 2006-12-07 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
AU2003243436A1 (en) 2002-06-06 2003-12-22 Shohei Koide Reconstituted polypeptides

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2016842A1 (en) * 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
US5258289A (en) * 1990-09-05 1993-11-02 Davis Claude G Method for the selecting of genes encoding catalytic antibodies
CA2125396A1 (en) * 1991-12-10 1993-06-24 Wayne A. Marasco Reactive neutralizing human anti-gp 120 recombinant antibody, dna coding the same and use thereof

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8178320B2 (en) 2001-11-22 2012-05-15 Keio University Artificial antibody library with super-repertory
JP2006506634A (en) * 2002-11-18 2006-02-23 ヴァルション テクニリネン ツッキムスケスクス Non-competitive immunoassay for small analytes
US7749712B2 (en) 2002-11-18 2010-07-06 Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus Non-competitive immunoassay for small analytes
JP4729701B2 (en) * 2002-11-18 2011-07-20 テクノロジアン・トゥトキムスケスク・ブイティーティー Non-competitive immunoassay for small analytes

Also Published As

Publication number Publication date
EP0759976A1 (en) 1997-03-05
AU7014194A (en) 1995-10-23
EP0759976A4 (en) 2001-02-07
AU695406B2 (en) 1998-08-13
WO1995027045A1 (en) 1995-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5855885A (en) Isolation and production of catalytic antibodies using phage technology
Andris-Widhopf et al. Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display
EP1054018B1 (en) Fab fragment libraries and methods for their use
Gram et al. In vitro selection and affinity maturation of antibodies from a naive combinatorial immunoglobulin library.
US9631017B2 (en) Fab fragment libraries and methods for their use
JP4414900B2 (en) Light chain deficient immunoglobulin
RU2608640C2 (en) Methods for generation of multispecific and multivalent antibodies
JP4323317B2 (en) Methods for cloning variable region sequences
US20060147995A1 (en) Method for producing antibody fragments
JPH06121696A (en) Antigen combining protein and its preparation
JP2003505025A (en) Novel method for displaying (poly) peptides / proteins on bacteriophage particles via disulfide bonds
JPH08504320A (en) Target binding polypeptide
JP2003536048A (en) Protein isolation and analysis
JP2024014897A (en) Mixed binding domains
Foti et al. Rabbit monoclonal Fab derived from a phage display library
JPH10507341A (en) Isolation and production of catalytic antibodies using phage technology
Kim et al. Expression and characterization of recombinant single-chain Fv and Fv fragments derived from a set of catalytic antibodies
CN114075282B (en) IL-5 binding molecules, methods of making and uses thereof
JP2004283175A (en) Isolation and production of catalytic antibody using phage technology
Leow et al. Monoclonal IgY Antibodies
Wang et al. Construction and characterization of phage display library: recognition of mouse serologically detected male (SDM) antigen
Leow et al. Monoclonal IgY Antibodies 13
JP2004283111A (en) Nucleic acid, monoclonal antibody derived from chicken containing the same nucleic acid and method for detecting prion protein by using the same
Deen Isolation of Human Endoplasmic Reticulum Antibodies Using Phage Display Technology
Jung et al. Isolation of Human scFv Antibodies Specific for House Dust Mite Antigens from an Asthma Patient by Using a Phage Display Library

Legal Events

Date Code Title Description
A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20040210

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20040210

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20040329

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20040511

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20050419

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20050707

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20050822

A313 Final decision of rejection without a dissenting response from the applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A313

Effective date: 20051205

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20061003