JPH10506382A

JPH10506382A - 急性および慢性ｃ型肝炎ウイルス感染の鑑別診断のための方法および組成物

Info

Publication number: JPH10506382A
Application number: JP8506653A
Authority: JP
Inventors: ホワードエイ．フィールズ，; ユリーイー．クドヤコブ，
Priority date: 1994-07-29
Filing date: 1995-07-28
Publication date: 1998-06-23
Also published as: WO1996004300A1; CA2196195A1; EP0804473A1; AU3205395A; US5670310A

Abstract

(57)【要約】本発明は、急性および慢性ＨＣＶ感染の鑑別診断のために抗ＨＣＶ抗体と結合する抗原性ペプチドを提供する。本発明は、さらに、被験体において、急性および慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染を鑑別する方法であって、ａ)被験体由来の抗体含有サンプルと、ペプチド59(アミノ酸AFASRGNHVSPTHYVPESDA(配列番号１)を含む)、ペプチド137(アミノ酸MNRLIAFASRGNHVSPTHYV(配列番号２)を含む)、およびペプチド138(アミノ酸SRGNHVSPTHYVPESDAAAR(配列番号３)を含む)からなる群から選択される１またはそれ以上のペプチドとを、このペプチドと上記抗体との間の結合を可能にする条件下で接触させる工程；ｂ)このペプチドと上記抗体との間の結合の存在を検出する工程；ｃ)上記被験体由来の抗体含有サンプルと、所定量のペプチド139(アミノ酸NHVSPTHYVPESDAAARVTA(配列番号４)を含む)とを、このペプチドと上記抗体との間の結合を可能にする条件下で接触させる工程；ｄ)このペプチドと上記抗体との間の結合の存在を検出する工程；および工程ｂ)における抗体結合の強さと、工程ｄ)における抗体結合の強さを比較する工程であって、工程ｄ)における結合と比較して工程ｂ)における結合がより強力である場合、急性Ｃ型肝炎ウイルス感染を示し、そして工程ｂ)およびｄ)の両方における結合が等しい場合、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染を示す工程、を包含する方法、を提供する。本発明は、さらに、被験体におけるＣ型肝炎ウイルス感染を診断する方法であって、この被験体由来の抗体含有サンプルと、アミノ酸SPTHYV(配列番号５)を含むペプチドとを接触させる工程、およびこのペプチドと上記サンプル由来の抗体との間の結合の存在を決定する工程であって、このペプチドと抗体との間の結合の存在がＣ型肝炎ウイルス感染を示す工程、を包含する方法、を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】急性および慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染の鑑別診断のための方法および組成物発明の背景発明の分野本発明は、被験体における初期（急性）および後期（慢性）Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）感染の鑑別診断のための組成物および方法に関する。組成物は、HCVの抗原性ペプチドを含有する。方法は、HCV感染の血清学的診断および急性または慢性のいずれかとしてのHCV感染の鑑別を包含する。背景技術Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は、世界的に非経口的に伝染した非Ａ型非Ｂ型肝炎の主要な原因因子である（１、７）。HCVゲノムは、3010または3011アミノ酸のポリタンパク質をコードし得る１つの大きなオープンリーディングフレームを含む9.4kbの正センスRNA分子からなる（２）。HCV構造タンパク質、特にヌクレオカプシドタンパク質は、広範囲に反応性の抗原性エピトープを含むことが見出されており（４、６、９、17、18）、そして大部分の利用可能な診断試験システムに取り入れられている（５、９、10、11、19、20、23）。非構造タンパク質NS3およびNS4もまた、非常に反応性である抗原性エピトープを含み、そしてこれらのタンパク質由来の組換えポリペプチドが診断試験に使用されている（５、８）。合成ペプチドが、非構造タンパク質（NS4を含む）の抗原性組成物を特徴付けるために使用され、これは少なくとも２つの抗原性エピトープを含む主要抗原性領域5-1-5を含むと決定されている（３、12）。 HCV感染を診断するための現在利用可能なアッセイは、被験体がその寿命のある時点でこのウイルスに曝されたことのみを示す。急性または慢性感染のいずれかとしてのHCV感染の鑑別診断のためのアッセイは、臨床医に、例えば、感染が一次的かまたは二次的であるかの情報を提供する。一次感染は、急性感染期の間に起こり、そして臨床的に現れ得るか、または現れ得ない。二次感染は、慢性HC Vキャリアである被験体において数年後に起こり得る。急性（一次）感染と慢性（二次、三次など）感染との間の鑑別は、臨床医を種々の治療養生法を開始し得る時期の決定に導き得る。さらに、鑑別アッセイは、種々の治療薬の臨床試験のために一次感染を区別する。HCV感染に対する期識別試験は、最近の感染のマーカーとしてのIgM抗HCV活性の使用に関する明らかな困難さのため、特に重要である（13）。本発明は、非常に強力かつ広範囲に反応性のＢ細胞エピトープを含む、新たに同定されたＣ末端領域由来の抗原を提供することにより、このような期識別試験を提供する。この領域の抗原特性は、HCVポリタンパク質のNS3-NS4-NS5領域の90 ％を超える領域にわたる150の合成ペプチドのパネルの分析により、調べられた。この研究から、この領域内でのIgG免疫応答の複雑なパターンが同定され、これは特定のエピトープが、HCV感染の経過の間に異なる持続時間で抗体を誘発することを示す。特に、HCV感染の初期段階に抗体と強力に反応する３つのペプチドが同定されたが、一方、第４のペプチドは顕著に遅延性の（delayed）反応性を示した。従って、本発明は、初期（急性）および後期（慢性）HCV感染を鑑別するためのイムノアッセイにおいて使用される、HCV NS4タンパク質のＣ末端領域由来の特定のペプチド配列を提供する。発明の要旨本発明は、急性および慢性HCV感染の鑑別診断のための、抗HCV抗体を結合する抗原性ペプチドを提供する。本発明は、さらに、以下の工程を包含する、被験体における急性および慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染を鑑別する方法を提供する：ａ）上記被験体由来の抗体含有サンプルを、アミノ酸AFASRGNHVSPTHYVPESDA（配列番号１）を含むペプチド59、アミノ酸MNRLIAFASRGNHVSPTHYV（配列番号２）を含むペプチド137およびアミノ酸SRGNHVSPTHYVPESDAAAR（配列番号３）を含むペプチド138からなる群から選択される１つ以上のペプチドと、このペプチドと上記抗体との間の結合を可能にする条件下で接触させる工程；ｂ）このペプチドと上記抗体との間の結合の存在を検出する工程；ｃ）上記被験体由来の抗体含有サンプルを、アミノ酸NHVSPTHYVP ESDAAARVTA（配列番号４）を含む所定量のペプチド139と、このペプチドと上記抗体との間の結合を可能にする条件下で接触させる工程；ｄ）このペプチドと上記抗体との間の結合の存在を検出する工程；および工程ｂ）の抗体結合強度と工程ｄ）の抗体結合強度とを比較する工程。工程ｄ）における結合と比較して、工程ｂ）におけるより強力な結合は、急性Ｃ型肝炎ウイルス感染を示し、そして工程ｂ）およびｄ）の両方における同等の結合は、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染を示す。本発明は、さらに、以下の工程を包含する、被験体におけるＣ型肝炎ウイルス感染を診断する方法を提供する：上記被験体由来の抗体含有サンプルを、アミノ酸SPTHYV（配列番号５）を含むペプチドと接触させる工程、およびこのペプチドと上記サンプル由来の抗体との間の結合の存在を測定する工程。このペプチドと上記抗体との間の結合の存在は、Ｃ型肝炎ウイルス感染を示す。発明の詳細な説明本発明は、本明細書に含まれる以下の特定の実施態様の詳細な説明および実施例を参照することにより、より容易に理解され得る。血清診断法１つの実施態様において、本発明は、以下の工程を包含する、被験体における急性および慢性HCV感染を鑑別する方法を提供する：上記被験体由来の抗体含有サンプルを、アミノ酸AFASRGNHVSPTHYVPESDA（配列番号１）を含むペプチド59、アミノ酸MNRLIAFASRGNHVSPTHYV（配列番号２）を含むペプチド137およびアミノ酸SRGNHVSPTHYVPESDAAAR（配列番号３）を含むペプチド138からなる群から選択される１つ以上の所定量のペプチドと、このペプチドと上記抗体との間の結合を可能にする条件下で接触させる工程；このペプチドと上記被験体サンプル中の抗体との間の結合の存在を検出する工程；上記被験体由来の抗体含有サンプルを、アミノ酸NHVSPTHYVPESDAAARVTA（配列番号４）を含む所定量のペプチド139と、このペプチドと上記抗体との間の結合を可能にする条件下で接触させる工程；このペプチドと上記抗体との間の結合の存在を検出する工程；および２つの工程における抗体結合強度を比較し、急性または慢性HCV感染が上記被験体に存在するかどうかを決定する工程。ペプチド59、137および138のうちの１つより多いペプチドを上記抗体含有サンプルと接触させる方法において、これらのペプチドを別々に接触させ得る。あるいは、これらのペプチドを同一サンプルと一緒に接触させ得る。本方法に使用されるペプチドは、ペプチド59、137、138および139のいずれか、または以下にさらに記載されるようにHCVに対する抗体との反応性を維持するそれらの改変形態であり得る。本明細書で使用される「ペプチドと抗体との間の結合」とは、ペプチドと、そのペプチドと特異的に反応する抗体（または複数の抗体）との間の複合体形成を意味する。経験的に決定されたバックグラウンド（ランダム結合）レベルを超える強度を示す結合反応は、特異的であると考えられる。本明細書で使用される「抗体結合強度」とは、ペプチドと被験体サンプル中に存在する抗体との間の任意の結合反応の量的測定値を意味する。例えば、ELISAアッセイ（実施例を参照のこと）において、反応ウェル中の全ての反応工程の完了後のサンプルの光学密度値は、そのウェル中の抗原と抗体との間の結合反応の量的測定値である。ペプチドと抗体との間の結合強度の他の定量的測定は、とりわけ定量的免疫蛍光アッセイ、イムノブロットアッセイおよび凝集／沈降アッセイを包含し得る。また、本明細書で使用される「より強力な結合」とは、2.0より大きい比値または経験的に決定されたカットオフ値を意味し、ここでこの比は、HCV感染の急性段階で抗体と強力に反応するペプチド（例えば、ペプチド59、137および138）と、遅延性の反応性を示すペプチド（例えば、ペプチド139）との間での免疫反応性の定量的比較である。例えば、本発明において分析された慢性HCV感染サンプルは、0.3 3〜1.87の範囲の、ペプチド59と139との間の光学密度値の比を示したが、一方、急性HCV感染サンプルは、2.52〜35.40の範囲の、ペプチド59と139との間の比を示した（実施例を参照のこと）。本明細書で使用される「同等な結合」とは、約 1.0、そして一般的には2.0未満の比値を意味し、ここでこの比は、HCV感染の急性段階で抗体と強力に反応するペプチド（例えは、ペプチド59、137および138）と、遅延性の反応性を示すペプチド（例えば、ペプチド139）との間の免疫反応性の定量的比較である。急性または慢性HCV感染を示す、本明細書に提供される光学密度値の比は、他の定量的方法（例えば、とりわけ定量的免疫蛍光アッセイ、イムノブロットアッセイおよび凝集／沈降アッセイ）との比較のために標準化され得る。本明細書で使用される「急性Ｃ型肝炎ウイルス感染」とは、HCV感染の初期段階を意味し、この間に免疫系が被験体へのHCVの最近の導入に対する初期応答を誘導する。「慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染」とは、初期の症状の出現を過ぎたHCV感染の任意の段階を意味する。さらなる実施態様において、本発明は、以下の工程を包含する、被験体におけるＣ型肝炎感染の存在または非存在を診断する方法を提供する：この被験体由来の抗体含有サンプルをアミノ酸SPTHYV（配列番号５）を含むペプチドと接触させる工程、およびこのペプチドと上記サンプル由来の抗体との間の結合の存在を測定する工程。このペプチドと上記抗体との間の結合の存在は、Ｃ型肝炎ウイルス感染を示し、そして結合の非存在は、Ｃ型肝炎ウイルス感染がないことを示す。本方法に使用されるペプチドは、ペプチド59、137、138および139のいすれか、または以下にさらに記載するようにHCVに対する抗体との反応性を維持するそれらの改変形態であり得る。イムノアッセイイムノアッセイ（例えば、免疫蛍光アッセイ（IFA）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）およびイムノブロット）は、容易に適合され、HCV抗体の検出を達成し得る。抗体の検出に有効なELISA法は、例えば、以下の通りである：（１）抗原を基質に結合する；（２）結合した抗原を、抗体を含む流体または組織サンプルと接触させる；（３）上記のものを、結合した抗体と反応性である検出可能部分（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼ酵素）に結合した２次抗体と接触させる；（４）上記のものを、酵素に対する基質と接触させる；（５）上記のものを発色剤と接触させる；（６）色の変化を観察する。競合阻害アッセイ急性および慢性HCV感染の鑑別に有用であり得る別の免疫学的技術は、HCV抗原と特異的に反応する抗体の検出のためにモノクローナル抗体（MAb）を使用する。簡潔に述べれば、被験体由来の血清を、基質（例えば、ELISA 96ウェルプレート）に結合した抗原と反応させる。過剰の血清を、完全に洗浄する。次いで、標識した（酵素結合、蛍光、放射性など）モノクローナル抗体を、先に反応させた抗原−血清抗体複合体と反応させる。モノクローナル抗体結合の阻害量を、コントロール（患者の血清抗体なし）と比較して測定する。モノクローナル抗体阻害の程度は、特定の変種または株に対して非常に特異的な試験である。なぜなら、その程度はモノクローナル抗体の結合特異性に基づくからである。MAbはまた、IFA による細胞における直接検出に使用され得る。微小凝集アッセイ微小凝集テストはまた、被験体における急性および慢性HCV感染を鑑別するために用いられ得る。簡単に言うと、ラテックスビーズ(latex beads)、赤血球、または他の凝集可能な粒子を、ペプチドでコートし（このペプチドは、ペプチドを多価にする部分に結合されている）、そして被験体由来のサンプルと混合する。その結果、このペプチドと特異的に反応する組織中または体液中の抗体は、ペプチドと架橋し、凝集を引き起こす。この凝集したペプチド-抗体複合体は、裸眼または分光光度計によって見ることのできる沈澱を形成する。サンドイッチアッセイ／フローサイトメトリー／免疫沈降法さらに、代表的なサンドウィッチアッセイの場合のように、抗体は基質に結合され、そして抗原と反応し得る。その後、標識した２次抗体は、１次抗体によって認識されないエピトープに結合し、この２次抗体が検出される。本発明は急性および慢性HCV感染を鑑別するためのHCV抗原を提供するので、他の血清学的方法（例えば、フローサイトメトリーおよび免疫沈降法）もまた、検出方法として用いられ得る。本明細書で教示される診断方法において、抗原を基質と結合し、そして体液サンプル（例えば血液、血清、尿または唾液）に接触させ得る。このサンプルは、患者から直接的に得られ得、または部分的に精製され得る。この方法において、抗原に特異的な抗体（１次抗体）は、この結合した抗原に特異的に反応する。その後、検出可能部分に結合した２次抗体または検出可能部分で標識された２次抗体が、１次抗体の検出を高めるために添加され得る。一般的には、２次抗体または他のリガンドは、抗原の異なるエピトープと特異的に反応するか、あるいはそのリガンドまたは反応抗体に非特異的に反応するかのいずれかである。この２次抗体または他のリガンドは、１次抗体の複数部位と反応する能力によって選択される。それゆえ、例えば、２次抗体のいくつかの分子は、それぞれの１次抗体と反応し得、１次抗体をさらに検出可能にする。検出可能部分検出可能部分により、沈澱または色の変化の可視検出、顕微鏡または分光光度計による可視検出、放射能測定などによる自動検出が可能となる。検出可能部分の例として、フルオレセインおよびローダミン（蛍光顕微鏡の場合）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（光学顕微鏡または電子顕微鏡のいずれか、および生化学的検出の場合）、ビオチン-ストレプトアビジン（光学顕微鏡または電子顕微鏡の場合）、アルカリホスファターゼ（色の変化による生化学的検出の場合）および放射性同位体（オートラジオグラフィ、蛍光光度計および放射線検出の場合）が挙げられる。抗原本発明はHCVの抗原ペプチドを提供する。このペプチドは、通常、精製された形態で存在する。本明細書で用いられる「精製された」は、臨床設定または検査設定（例えば診断アッセイ）において有用であるように、ペプチドが他のウイルス性または細胞性混入物から十分に分離されることを意味する。種々のレベルの精製は既知の方法によって達成され得る。本発明の精製された抗原HCVペプチドはまた、「抗原」または「HCV抗原」として本明細書中て称され、そしてペプチド番号または配列番号のいずれかによって、互換的に命名される。本発明のペプチドは、配列番号１、２、３、４、または５によって配列表中に規定されるアミノ酸配列内に含まれるアミノ酸を包み得る。それゆえ、本発明のペプチドは、配列表中に見出されるのと同じ配列を有し得る。本発明のペプチドは、結合され得ないか、あるいは、例えば、凝集アッセイにおける使用の場合はペプチドを多価にする部分、または固相上のペプチドの配置を容易にするキャリアタンパク質に結合し得る。キャリアタンパク質は合成ペプチドが結合され得るものであり、そしてヒト血清中の抗体と反応しない。このようなキャリアの例は、ウシ血清アルブミン(BSA)である。本発明の免疫反応性ペプチドのアミノ酸配列を提供することにより、本明細書によって教示される方法および標準的なペプチド合成技術を使用して、特別に引用されたペプチドの免疫反応性領域に相同性があるように選択された他のペプチドを合成し、そしてこれらのペプチドを、得られた配列中の特定のアミノ酸残基の挿入、欠失または改変によって改変することが可能になる。例えば、そのコア配列SPTHYV（配列番号５）は、免疫反応性であることが測定された。このコア配列に基づいて、種々の長さのペプチドが、HCVゲノムのこの領域の天然配列から得られ、そして合成され得るこれらのペプチドは、HCVに対するコア配列の特異性または免疫反応性を、実質的に減少または変更しない非必須なアミノ酸を含み得る。例えば、ペプチドの酸性特性または塩基性特性を維持する保存的なアミノ酸置換が導入され得る。この方法において合成されたペプチドは、本明細書中で教示される方法（例えばELISA（実施例を参照のこと））によって、コア配列と同様の免疫反応性を有することが測定され得る。それゆえ、開示されたNS4タンパク質のＣ末端由来のきわめて多くのペプチドの合成または精製が可能である。本明細書のペプチドのアミノ酸配列は、いくつかの付加的な特質（例えば、本明細書中で教示される可溶性）を与えるよう設計された配列に結合したHCV抗原の免疫反応性部分（配列番号：１〜５）を含み得る。HCV抗原のアミノ酸配列は、いくつかの付加的な特質を提供する他のアミノ酸により、１つ以上のアミノ酸が置換された配列を包含し得る。例えば、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去／付加して、より堅固な２次構造を提供することによってエピトープの反応性を増加させる、その生体寿命(bio-longevity)を増加させる、その細胞傷害性を変化させる、または感染を防止する。いずれの場合においても、ペプチドは免疫反応性および免疫原性を持たなければならない。このようにして得られた精製ペプチドは、本明細書中で教示される方法（例えばELISA（実施例を参照のこと））によって、（HCV抗体に対する、あるいは急性または慢性HCV抗体に対する）それらの抗原性および特異性を決定するようテストされ得る。免疫反応性ペプチドは、天然NS4タンパク質のＣ末端領域由来の少なくとも６つのそして任意の数までの連続した、アミノ酸であって、抗HCV抗体を結合するアミノ酸配列として定義される。例えば、このペプチドは長さ6〜100 のアミノ酸の範囲であり得る（例えば、20アミノ酸）。本発明のペプチドはまた、抗原ペプチドを産生することが可能な発現系においてペプチドをコードするクローン化された核酸によって得られる組換えタンパク質であり得る。あるいは、抗原ペプチドは、化学的切断または機械的切断によって全タンパク質から分離され得る。ペプチドの組み合わせ本発明はまた、被験体の急性および慢性肝炎Ｃ型ウイルス感染を鑑別する方法において、配列番号１、配列番号２、および配列番号３として配列表で規定される、２つまたは３つのペプチドの組み合わせを提供する。個々のペプチドに加えて、本発明のペプチドに組み合わせはまた、本明細書中で「抗原」または「HCV 抗原」として称され得る。個々のペプチドと同じく、本発明のペプチドの組み合わせは、結合ペプチド、非結合ペプチド、またはその両方を包含し得る。さらに、本発明の結合ペプチドは、キャリアと結合した所定量の個々のペプチドまたは単一のキャリアに結合した所定量の異なるペプチドであり得る。組み合わせ物および個々のペプチドは、基質（固相）に付着または結合され得、そして、HCV感染の診断に用いられ得る。抗原性／免疫反応性の決定本発明のペプチドと反応する抗体を用いて、特異的な免疫反応性を持つ別のペプチドを選択する方法がさらに、提供される。例えば、HCVと反応する抗体を用いて、免疫反応性を持つペプチドの免疫反応性についての最小の配列を決定する方法は、次の工程を包含する：(a)本発明のペプチドの改変；(b)被験体由来の確認されたHCV陽性血清サンプルと、改変させたペプチドとの接触；および(c)改変されたペプチドと抗HCV抗体との結合を検出（結合は、改変されたペプチドがHCV に免疫反応性を持つことを示す）。本発明の他のペプチドに適用し得るこの方法は、例えば、実施例に例示される。本発明のいずれのペプチドも同様に改変され得る。組換えモザイクタンパク質本発明は、抗原性ペプチドのアミノ酸配列およびHCVゲノム(2)中のこれらの核酸コード配列を提供するので、組換えモザイクタンパク質は、本発明の複数のペプチドを含むよう産生され得る。このタンパク質は、とりわけペプチド59、137 、138、および139のエピトープを任意に１つ以上含む。そして、このタンパク質はまた、タンパク質の抗原性または特異性に実質的な影響を与えない付加的なアミノ酸を含む。このモザイクタンパク質は、エピトープの提示を妨害し得る外因性アミノ酸が存在しないため、高い感受性および特異性を有する。本発明のモザイクタンパク質は、本明細書で記載されるように、診断テストおよびワクチン用に使用され得ることが意図される。現在のところ、モザイクタンパク質を発現するための好ましい方法は、ベクター宿主発現系によるものである。精製された抗体抗原に特異的に反応する精製されたモノクローナル抗体はまた、本発明の範囲内である。この抗体は特有のエピトープと特異的に反応し得、あるいはまた、他の生物のエピトープと反応し得る。用語「反応する」とは、抗原と結合可能であるか、そうでなければ、非ランダム的に会合し得ることを意味する。本明細書で用いられる「特異的に反応する」とは、１つの特定の抗原（本発明の場合はHCV 抗原）以外のいずれの抗原とも、実質的に交差反応しない抗体または他のリガンドをいう。抗体は、HarlowおよびLane(14)に記載されるように作られ得る。簡単に言うと、精製された抗原は、免疫応答を誘起するのに十分な量および間隔で、動物に注射され得る。抗体は直接精製され得るか、または、脾臓細胞がその動物から得られ得る。次いで、その細胞は不死化細胞株と融合され、抗体分泌をスクリーニングされる。その抗体を用いて、抗原を分泌する細胞に対してDNAクローンライブラリーをスクリーニングし得る。これらの陽性クローンは、次いで配列決定され得る(15,16)。本明細書中で提供する、HCV抗原ペプチドと反応する、精製された非ヒト、好ましくは哺乳動物のポリクローナル抗体もまた意図される。このポリクローナル抗体もまた、標準的な免疫化および精製プロトコールによって得られ得る(14)。抗体は基質と結合し得るか、または検出可能な部分で標識されるか、あるいは結合と標識化の両方がなされ得る。本発明の組成物の場合に意図される検出可能な部分は診断方法の記載において列挙されており、蛍光マーカー、酵素マーカーおよび放射性マーカーを包含する。ワクチンこのように得られた精製されたペプチドフラグメントを、中和抗体を誘起する構造ペプチドと結合し得、そしてワクチンにおける使用のためのこれらの抗原性および特異性を決定するためにテストし得る。簡単に言うと、種々の濃度の推定上の免疫原性的に特異的なペプチドが調製され、そして動物に投与される。そしてそれぞれの濃度に対する免疫学的応答（すなわち抗体の産生）が測定される。投与される免疫原の量は、被験体に依存する（例えば、ヒトまたは他の感受性の強い動物、被験体の状態、被験体のサイズなど）。その後、免疫原を接種された感染にかかりやすい動物を、特異的免疫原性ペプチドの潜在的ワクチン効果をテストするために、ウイルスに曝露し得る。推定免疫原性ペプチドの特異性は、他の近縁のウイルスとの交差反応性について接種した動物からの血清または他の体液をテストすることによって確かめられ得る。あるいは、免疫原性は、免疫化された動物由来の血清を用いて感染性ウイルスの中和を試みるインビトロ法でテストされ得る（血清は、次いでペプチドが中和抗体を誘起するか否かを決定するために細胞培養物に添加される）。本発明の抗原は、免疫原量の抗原および薬学的に受容可能なキャリアを含有するワクチンの構築において用いられ得る。本発明のワクチン中の薬学的に受容可能なキャリアは、生理食塩水または他の適切なキャリアを包含し得る(22)。アジュバントもまたワクチンのキャリアの一部であり得、この場合、アジュバントは、用いられる抗原を基礎とする標準的な基準、投与様式および被験体によって選択され得る(22)。投与様式は、用いられる特定のワクチンおよびこれが投与される被験体に応じて、経口または舌下手段、あるいは注射による様式であり得る。このワクチンが予防または治療として用いられ得ることは、上述から理解され得る。それ故、本発明は、被験体へのワクチンの投与により、HCV感染および関連する疾患を防止または治療する方法を提供する。以下の実施例は、本発明を例示することが意図されるが、本発明を限定することは意図されない。これらの実施例は使用され得る代表的実施例であるが、当業者に公知の他の手順もまた代わりに使用され得る。実施例合成ペプチドペプチドは、ACT Model MPS 350マルチペプチド合成機(Advanced Chemtech，L ouisville，KY)において製造者のプロトコールに従ってFMOC化学(21)により合成した。アミノ酸分析、高速液体クロマトグラフィー、およびキャピラリー電気泳動によって特徴付けた後、ペプチドを酵素イムノアッセイにより特徴付けた。血清全ての抗HCV陽性血清を、D.I．Ivanovsky Institute of Virology，Moscow，R ussiaに保管されているコレクションから入手した。血清試料を、25人の急性肝疾患の抗HCV陽性患者(ｎ＝36)および28人の慢性肝疾患の抗HCV陽性患者(ｎ＝43) から収集した。正常血液ドナー由来の抗HCV陰性血清試料(ｎ＝32)を、Centers f or Disease Control and Preventionに保管されているコレクションから入手した。全ての血清は、最初に、Ｂ型肝炎感染およびＣ型肝炎感染のマーカー、ならびに抗HCV活性の存在について、市販のキット(ABBOTT Laboratories，Abbott Pa rk，IL)により試験した。抗HCVの酵素イムノアッセイ(ELISA) 0.1Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.5)中の濃度10μl/mlの合成ペプチド(110 μl)を、室温でマイクロタイターウェル(Immulon II，Dynatech Laboratories， Inc.)に12時間吸着させた。血清を0.1％ Tween 20および10％正常ヤギ血清を含有するPBS(PBS-T)で１：50に希釈した。希釈血清100μlを各ウエルに添加し、そして37℃で１時間インキュベートした。抗体のペプチドへの結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)にカップリングしたヒトIgGに対するアフィニティー精製抗体を用いて、100μlのPBS-T中の１：30 ,000希釈液を添加しそして37℃で１時間インキュベートすることにより、同定した。いくつかのカットオフ(cutoff)を、急性および慢性抗HCV陽性血清について確立した。20マー合成ペプチドを用いた実験では、Ｐ/Ｎ比として表現されかつ3 .0に等しいカットオフを、陰性コントロールの平均値＋5.5(この平均値を超える標準偏差(SD))として統計的に確立した。ここで、Ｐは抗HCV陽性試料の493nmでの光学密度値(OD₄₉₃)を表し、そしてＮは陰性コントロールの光学密度値を表す。６マーペプチドまたは10マーペプチドを用いた実験では、より高いカットオフを用いて、陽性結果の統計的信頼度および正確な分析を確実にした。この場合、Ｐ/Ｎ比として表現されかつ5.0に等しいカットオフは、陰性コントロールの平均値＋14(この平均値を超えるSD)に対応した。配列番号17のペプチドについて、Ｐ /Ｎ値が5.0に等しいカットオフを用いた；しかし、このペプチドは、陰性血清とのより広い範囲の反応性を示し、そしてこのカットオフは5.5(平均値を超えるSD )にしか等しかった。 HCV血清変換パネル４つのHCV血清変換パネルは全て、Serologicals，Inc.(Clarkston，Georgia) から入手した。これらのパネル由来の全てのサンプルを未希釈かつ加熱失活されていない血清として入手した。パネル4811は、378日の期間にわたって採集した2 1系列の血漿サンプルを有していた。ドナー4811は、最初の採血日の14日前および11日後に輸血を受けた46才の女性であった。アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の上昇は、最初の輸血後28日目に初めて観察された。ALT値は、血漿採集期間中に上下起伏したが、血漿提供期間の末期に正常レベルに戻った。ドナーは、血液提供期間中に疾患の臨床的な症状を示さなかった。ドナー4811は試験を受けた結果、抗ヒト免疫不全ウイルス(抗HIV)抗体、抗Ｂ型肝炎コア抗原(抗HBc)抗体、および抗Ｂ型肝炎表面抗原(抗HBs)抗体に対して陰性であった。このドナーは、Ａ型肝炎ウイルス(HAV)、サイトメガロウイルス(CMV)、およびエプスタイン・バーウイルス(EBV)に特異的なIgGに対して陽性であった。パネル4812は、333日の期間にわたって採集した22系列の血漿サンプルを有していた。ドナー4812は、最初の採血日前10日、９日および７日に静脈内輸血を受けた33才の女性である。最初の輸血の35日間内で、ドナー4812はALTの上昇を示した。ALTは血漿採集期間中に上下起伏したが、血漿提供期間の末期に正常に戻った。このドナーは、血液提供期間中に疾患の臨床的な症状を示しておらず、そして試験を受けた結果、抗HIV抗体、抗HVA抗体、抗HBc抗体、および抗HBs抗体に対して陰性であった。ドナー4812は試験を受けた結果、CMVおよびEBVのIgGに対して陽性であった。パネル4813は、400日の期間にわたって採取した22系列の血漿サンプルを有していた。ドナー4813は、最初のサンプルを採集した日に全部の血液を受けた67才の女性であった。39日内で、ドナー4813はALTの上昇に発展した。このALTは血漿採集期間中に上下起伏したが、血漿提供期間の末期に正常に戻った。このドナーは、血液提供期間中に疾患の臨床的な症状を示しておらず、そして試験を受けた結果、抗HIV抗体、および抗HBc抗体に対して陰性であった。このドナーは試験を受け、CMVおよびEBVのIgGに対して陽性であった。パネル4814は、137日の期間にわたって採取した13系列の血漿サンプルを有していた。ドナー4814は、最初の採血日前57日、50日および35日に輸血を受けた28 才の男性であった。最初の輸血の90日内で、ドナー4814はALTの上昇に発展した。このALTは血漿採集期間中に上下起伏したが、血漿提供期間の末期に正常に戻った。このドナーは、血液提供期間中に疾患の臨床的な症状を示しておらず、そして試験を受けた結果、抗HIV抗体、および抗HBc抗体および抗HBs抗体に対して陰性であった。 HCV NS4タンパク質のＣ末端由来の合成ペプチドとのHCV特異的IgGの反応性の時間的パターン HCVポリタンパク質の1916〜1946位のアミノ酸領域をカバーする合成ペプチド5 9、137、138、および139(表１)は、輸血後にHCVで感染させた４個体から得られた上記４つのHCV血清変換パネルを用いて試験した。各ペプチドは、血清変換パネルのそれぞれのメンバーを用いて別々に試験した。各パネルでは、４つのペプチドの全ては、HCV特異的IgG抗体と反応した。しかし、これらのペプチドの免疫反応性のパターンは異なった。ペプチド59および137は、HCV感染の初期段階で抗体と反応し、その時、ALT値は上昇した。これらのペプチドはまた、OD値により指示されるように最も強い免疫反応性を示した。ペプチド139は免疫反応性が低かった。このペプチドの反応性、特に輸血後最初の100〜150日前に得られた血清試料由来の抗体との反応性は、いずれの他のペプチドの反応性より著しく弱かった。ペプチド138は、各血清変換パネルに対して中程度の反応性を示した。従って、ペプチド59および137は、感染の初期段階で抗HCV IgGと比較的に強く反応したが、ペプチド139は、感染の初期段階で比較的に弱く反応し、そして感染の後期段階では強度が増加した。このパターンは、十分な数の追跡血清試料を有さなかったパネル4814を除いて、各HCV血清変換パネルにおいて観察された。それにもかかわらず、このパネルにより、輸血後最初の120日の期間で、ペプチド139が第１のグループのペプチドに比べてより低い反応性を示すという観察を確認した。ペプチド59および139の急性および慢性HCV感染者から得られた血清との相対的な抗原反応性４つの血清変換パネルの全てから得られたデータは、HCV感染の最初の100〜15 0日の期間で、感染の初期のペプチド139の免疫反応性に対するペプチド59、137 、または138の免疫反応性の比が感染の後期よりも高いことを示した。この比を用いて、慢性HCV感染症と急性HCV感染症を区別し得る。ペプチド免疫反応性の比がHCV感染の間に段階特異的パターンで変化し得るという観察をさらに確認するために、２つの追加の血清パネルを分析した。一方のパネルは、25人の抗HCV陽性の急性肝炎患者から得られた36の血清試料から構成された。他方のパネルは、31の抗HCV陽性の慢性肝炎患者から得られた43の血清試料を有していた。各サンプルを合成ペプチド59、137、138、および139で試験した。OD₄₉₃値を、ペプチド免疫反応性の基準として使用した。ペプチド59、137 、および138の急性肝炎患者からの血清との反応性は、通常、ペプチド139の反応性よりも高かったが、ペプチド59、137、および138の慢性HCV感染患者からの血清との反応性はペプチド139の反応性に等しいかまたはそれより低かった。急性および慢性サンプルの間の最良の区別を、ペプチド59および139の間の反応性の比を発展させることにより達成し得た。急性肝疾患の患者からの36の試料のうち、４つ(３つの血清試料は１人の患者由来、そして１つは別の患者由来)のみは、 1.0に非常に接近するかまたは1.0より有意に小さい59/139比を有していた。23人の急性感染患者からの他の32の試料について、59/139比の平均値は7.91(範囲：2 .52〜35.40)であった。31人の慢性感染患者から得られた43の試料のうち、28人の患者からの40の試料は1.01(範囲：0.33〜1.87)に等しい平均比を生じた。異なる患者からの３つの試料は、それぞれ、2.99、4.59および6.64の59/139比を有していた。1.01＋3.5 SDのカットオフに基づいて、25人の急性肝炎患者の23人および31人の慢性肝炎患者の３人は、急性感染または最近のHCV感染と診断され得る。従って、このカットオフは、本研究で使用される急性HCV感染の92.0％および慢性HCV感染の90.3％の同定を可能にした。各グループ中に見出される相違は、ペプチド59および139中に提示される抗原エピトープに応答する個体の能力における遺伝的変化に起因し得る。例えば、低い59/139比を示す２人の急性感染患者から得られた血清は、本研究で使用されるいずれのペプチドとも強く反応しなかった。他方、３人の慢性感染患者のカットオフを超える比が、HCV感染の悪化に関連し得る。 NS4タンパク質のＣ末端領域内の抗原性エピトープ合成ペプチド59、137、138、および139を用いて得られたデータは、NS4タンパク質のこの領域が、予想されるものより複雑な抗原性構造を有することを示唆した。これらのペプチドと反応性である抗体の時間的プロフィールの差は、この領域が１より多い抗原性エピトープを含み得ることを示唆した。この領域の抗原性組成をより詳細に特徴付けるために、２つのさらなるセットの重複合成ペプチドを合成した(表２および３)。１つのセットは、10merの合成ペプチドを含んでいた。一方、第２のセットは、各ペプチドのＮ末端およびＣ末端で２つのグリシンに隣接するわずか6merのHCV特異的配列を含んでいた。免疫反応性の分析のために、血清試料を、ペプチド59および139の相対的反応性の特徴付けのために使用した抗HCV陽性急性肝炎患者(n=15)および抗HCV陽性慢性肝炎患者(n=17)のパネルから選択した(上記参照)。血清を、それらの強力な免疫反応性に基づいて選択した。さらに、32の抗HCV陰性血清もまた、これら２つのさらなるセット(表２および３)の各ペプチドを用いて試験した。免疫反応性10mer合成ペプチドのセットは、配列SRGNHVSPTHYVPESDA(配列番号3 8)を含む、HCV NS4タンパク質の17アミノ酸領域をカバーし、そして６アミノ酸のHCV特異的配列を含む免疫反応性ペプチドのセットは、配列HVSPTHYVPES(配列番号39)を含む11アミノ酸領域をカバーした(表２および３)。両領域は、配列SPT HYV(配列番号５)を含む。この配列は、最近、HCV NS4タンパク質のＣ末端内に位置する抗原性エピトープの重要な成分として同定された。免疫反応性ペプチド配列番号29および配列番号34は、たった１つのアミノ酸が重複し、従ってエピトープを共有し得ない(表３)ので、この領域は１より多い抗原性エピトープを含むと結論され得る。さらに、血清試料と両セットの短い合成ペプチドとの反応性のパターンの比較は、２より多い抗原性エピトープがこの領域内に存在し得ることを示唆した。例えば、血清試料６は、いくつかの10merペプチドと反応したが、6me rペプチドのいずれとも反応しなかった。一方、試料８は、いずれの10merペプチドとも反応しなかったが、6merペプチド配列番号32と反応した。この観察は、一方のエピトープがあるサイズのペプチドで模倣され得、そして他方のエピトープが別のサイズのペプチドで模倣され得ることを示唆した。表２および３に含まれるすべての血清がペプチド59と免疫反応性であったが、短い合成ペプチドは、これらの血清のいくつかと反応しなかった。このことは、より長いペプチドでのみ機能的に模倣される、この領域内の抗原性エピトープの存在を示す。ペプチド配列番号34は、唯一のサイズのペプチドで機能的に形作られ得るＢ細胞エピトープの別の興味深い例である(表３)。このペプチドは、HCV特異的配列HYVPES(配列番号40)を含む。この配列は、いくつかの10merペプチド内に完全に示される(表２) 。しかし、これらの10merのうちの２つは、この研究に用いられたいずれの抗HCV 陽性血清とも反応しなかった。まとめると、これらのデータは、いくつかの抗原性エピトープがこの領域内に位置し、そしてそれらのいくつかが、唯一のサイズのペプチドで抗原的に活性な形態に形作られ得ることを示唆した。異なる合成ペプチドとの特異的な免疫反応性を示す血清のサブセットの分析は、NS4領域の複雑な抗原性組成に関するさらなる証拠を提供した。すべての免疫反応性10merおよび6merペプチドは、血清の異なるサブセットと反応した。いくつかの重複ペプチドにおけるアミノ酸配列の顕著な共有のために、これらのペプチドは、同じ抗原性エピトープを共有し得、従って非常に似るかまたは同一の反応性パターンを生じるはずである。例えば、ペプチド59および137は、表２および３のすべての血清との強力な免疫反応性を示した。この知見は、これらのペプチドが非常に似たＢ細胞エピトープ組成を有することを意味する。しかし、短い合成ペプチドは、各個のペプチドについて独特な、これらの血清との反応性パターンを示した(表２および３)。例えば、ペプチド配列番号32は、32の血清中15の血清と反応した。このペプチドは、少なくとも４つのアミノ酸を、ペプチド配列番号30、配列番号31、配列番号33、および配列番号34と共有する。にもかかわらず、これらのペプチドは、抗HCV陽性血清との、同一かまたは非常に良く似た反応性パターンを示さなかった(表３)。表２および３に示された他のペプチドについて同様な結果を得た。短い合成ペプチドとのHCV特異的IgGの反応性の時間的パターンの変動両セットの短い合成ペプチドを、４つの血清変換パネルを用いて試験した。予め同定されたほとんどの免疫反応性ペプチド(表２および３)はまた、これらの血清変換パネル由来の血清試料といくらかの免疫反応性を示した。しかし、各血清変換パネルは、異なるサブセットのペプチドと免疫反応した。この知見は上記の観察を支持する。例えば、パネル4811は10merペプチド配列番号12〜17との、パネル4812はペプチド配列番号11〜13との、パネル4813はペプチド配列番号11〜17 との、パネル4814はペプチド配列番号13〜16との反応性を示した。6merペプチドを用いて同様な結果を得た。抗体とのペプチドの反応性の時間的パターンの分析は、NS4タンパク質のこの領域に対して免疫応答するIgGの３つのさらなる特性を同定した。第一に、20未満のアミノ酸のこの小さな領域は、異なる時間でIgG抗体を誘発する抗原性エピトープを含む。４つすべてのパネルは、これらの短い合成ペプチドとの２つのパターンのIgG反応性を示した：初期および後期。例えば、ペプチド配列番号31および配列番号32は、パネル4811由来の血清と異なる時間で反応した。ペプチド配列番号29および配列番号32とパネル4812由来の血清、ペプチド配列番号12および配列番号14とパネル4813由来の血清、ならびにペプチド配列番号 13および配列番号30とパネル4814由来の血清について同様なパターンを観察した。さらに、短いペプチドを用いて得られたIgGプロフィールは、より長いペプチド59、137、および138を用いて得られたパターンと異なった。これらのより長いペプチドは、最初のALT増強の間、常に、抗体と反応した。一方、短い合成ペプチドは、少なくともパネル4813および4814と、HCV感染の後期段階で反応した。この観察はまた、ある程度、血清変換パネル4811に適用可能であり、そして20me rペプチドが、より短いペプチドで形作られない初期抗原性エピトープを模倣し得ることを意味する。第二に、10merおよび6mer合成ペプチドと反応する抗体は、比較的短い期間に検出可能である傾向にある。一方、20merペプチドと反応性の抗体は、観察の全期間にわたって反応性のままである。第三に、５アミノ酸が重複する6merペプチド(例えば、ペプチド配列番号31および配列番号32)は、非常に異なるパターンの時間的な免疫反応性を有する。上記のタイプの分析により、非必須アミノ酸の置換を有する上記ペプチドを試験してそれらの免疫反応性のレベルならびに急性および慢性HCV感染を鑑別する能力を測定することは、通常の手順である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フィールズ，ホワードエイ. アメリカ合衆国ジョージア 30068，マリエッタ，ジャクソンクリークドライブ 1823 (72)発明者クドヤコブ，ユリーイー. アメリカ合衆国ジョージア 30329，アトランタ，ドルイドバリードライブ 1402−エフ

Claims

【特許請求の範囲】１．抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体と結合する、アミノ酸配列SPTHYV(配列番号５)を含むペプチド。２．前記アミノ酸配列がAFASRGNHVSPTHYVPESDA(配列番号１)である、請求項１に記載のペプチド。３．前記アミノ酸配列がMNRLIAFASRGNHVSPTHYV(配列番号２)である、請求項１に記載のペプチド。４．前記アミノ酸配列がSRGNHVSPTHYVPESDAAAR(配列番号３)である、請求項１に記載のペプチド。５．前記アミノ酸配列がNHVSPTHYVPESDAAARVTA(配列番号４)である、請求項１に記載のペプチド。６．被験体において、急性および慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染を鑑別する方法であって、ａ)該被験体由来の抗体含有サンプルと、配列番号１として配列表に規定されるペプチド、配列番号２として配列表に規定されるペプチド、および配列番号３として配列表に規定されるペプチドからなる群から選択されるペプチドとを、該ペプチドと該抗体との間の結合を可能にする条件下で接触させる工程；ｂ)工程ａ)における該ペプチドと該抗体との間の結合の存在を検出する工程；ｃ)該被験体由来の該抗体含有サンプルと、配列番号４として配列表に規定される所定量のペプチドとを、該ペプチドと該抗体との間の結合を可能にする条件下で接触させる工程；ｄ)工程Ｃ)における該ペプチドと該抗体との間の結合の存在を検出する工程；およびｅ)工程ｂ)の抗体結合の強さと、工程ｄ)の抗体結合の強さを比較する工程であって、工程ｄ)における結合と比較して工程ｂ)におけるより強力な結合が、急性Ｃ型肝炎ウイルス感染を示し、そして工程ｂ)およびｄ)の両方における等価な結合が、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染を示す、工程、を包含する、方法。７．前記工程ａ)におけるペプチド群のうちの２種類のペプチドを前記抗体含有サンプルと接触させる、請求項６に記載の方法。８．前記２種類のペプチドのそれぞれを、別々に、前記抗体含有サンプルと接触させる、請求項７に記載の方法。９．前記工程ａ)におけるペプチド群のうちの３種類すべてのペプチドを前記抗体含有サンプルと接触させる、請求項６に記載の方法。１０．前記３種類のペプチドのそれぞれを、別々に、前記抗体含有サンプルと接触させる、請求項９に記載の方法。１１．被験体において、Ｃ型肝炎ウイルス感染を診断する方法であって、該被験体由来の抗体含有サンプルと、配列番号５として配列表に規定されるペプチドとを接触させる工程、および該ペプチドと該サンプル由来の抗体との間の結合の存在を決定する工程であって、該ペプチドと該抗体との間の結合の存在がＣ型肝炎ウイルス感染を示す、工程、を包含する、方法。１２．前記アミノ酸配列がAFASRGNHVSPTHYVPESDA(配列番号１)を含む、請求項１に記載のペプチド。１３．前記アミノ酸配列がMNRLIAFASRGNHVSPTHYV(配列番号２)を含む、請求項１に記載のペプチド。１４．前記アミノ酸配列がSRGNHVSPTHYVPESDAAAR(配列番号３)を含む、請求項１に記載のペプチド。１５．前記アミノ酸配列がNHVSPTHYVPESDAAARVTA(配列番号４)を含む、請求項１に記載のペプチド。