JPH10505221A - アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを特定する植物遺伝子およびこれを含む形質転換植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 外来性ＡＣＣａｓｅ遺伝子の遺伝子産物の発現を阻害するために、植物由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのＤＮＡ配列をセンスまたはアンチセンス方向で植物のゲノム中に挿入し、該酵素の基質であるアセチルＣｏＡの脂肪酸合成への変換を減少し、この基質を別の生合成経路に迂回させる。このような迂回の１つは、ポリヒドロキシアルカノエートポリマーの合成を特定する遺伝子を植物ゲノムに提供することによって達成される。

Description

【発明の詳細な説明】 アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを特定する植物遺伝子 およびこれを含む形質転換植物技術分野 本発明は酵素アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）を特定する植 物遺伝子および該遺伝子で遺伝的に形質転換した植物ゲノムに関する。特に、た だしこれに限定するわけではないが、本発明はアブラナ属の種（Brassica speci es）、特にブラシカ・ナプス（Brassica napus：セイヨウアブラナ）（ナタネ油 種子）植物由来のＡＣＣａｓｅ遺伝子、ならびにこの遺伝子またはそのアンチセ ンス配列で遺伝的に形質転換したアブラナ属植物による遺伝子発現の制御に関す る。背景技術 アセチルＣｏＡカルボキシラーゼはナタネ油種子などの油生産性作物による油 の合成に関与する遺伝子の１つである。この遺伝子の発現が変わることにより生 産される油の量および／または質が変わる。発明の開示 本発明の目的は植物におけるＡＣＣａｓｅを特定する遺伝子を提供することで ある。 本発明によると、ブラシカ・ナプスの種子から単離し、図６および図１２に示 すヌクレオチド配列をもつＡＣＣａｓｅを特定する部分ｃＤＮＡ、ならびに遺伝 コードの縮重によって許容されるその変種を提供する。 本発明はさらに、コムギ胚芽から単離し、図４に示すヌクレオチド配列をもつ 部分ｃＤＮＡ、ならびに遺伝コードの縮重によって許容されるその変種を提供す る。 本発明はさらに、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）由来で 、図８に示すヌクレオチド配列をもつＡＣＣａｓｅを特定する全長ゲノムＤＮＡ 、ならびに遺伝コードの縮重によって許容されるその変種を提供する。 本発明はさらに、大腸菌（Escherichia coli）ＤＨα株宿主中に挿入された以 下のクローンを提供する。これらは特許を目的とする微生物寄託に関するブダペ スト条約に基づき、１９９３年３月２５日に国立工業および海洋細菌コレクショ ン（National Collectin of Industrial & Marine Bacteria: 23 St.Machar Roa d，Aberdeen，AB2 1RY，英国）に寄託されており、詳細は以下の通りである： １．プラスミドｐＫ１１１、寄託番号ＮＣＩＢ ４０５５３ ２．プラスミドｐＫＬＵ８１、寄託番号ＮＣＩＢ ４０５５４ ３．プラスミドｐＲＳ１、寄託番号ＮＣＩＢ ４０５５５ 本発明はさらに、本発明のＤＮＡまたはその断片をセンス方向で、あるいは完 全または部分的にセンスまたはアンチセンスなその変種で含む、遺伝的に形質転 換された植物、植物細胞および植物部分を提供する。 澱粉よりもかなりの量の油を生産する種の植物が好ましい。そのような植物種 は公知であり、単に「油種子(oil-seed)」作物と呼び、ナタネ、カノラ（ｃａｎ ｏｌａ）、ダイズおよびヒマワリを含む。多くの油作物を遺伝的に形質転換する 方法は公知であり、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobact erium tumefacience）法による形質転換が最も適している。そのような方法は文 献に記載されており、当業界で公知であり広く実施されている。 本出願人による１９９２年１１月１２日に公開された国際特許出願ＷＯ９２／ １９７４７において、基質アセチルＣｏＡからのポリヒドロキシブチレートの生 合成を記載する。この活性は３つの酵素触媒による段階を含む。関与する３つの 酵素は、β−ケトチオラーゼ、ＮＡＤＰ結合アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素、 およびポリヒドロキシブチレート合成酵素であり、これらの酵素の遺伝子はアル カリゲネス・ユートロフス(Alcaligenes eutrophus)にクローン化されたことが 報告されている(Schubert et al.，1988，J．Bacteriol.，170)。上述の国際特 許出願で、我々はこれら３つの遺伝子を油合成植物にクローン化したことを記載 する。 しかしながら、植物油の構成成分である脂肪酸の合成には、ポリヒドロキシア ルカノエート遺伝子で要求されるのと同じ基質であるアセチルＣｏＡ基質を用い る。本発明によって、ＡＣＣａｓｅを阻害し、これによってアセチルＣｏＡをポ リヒドロキシアルカノエートへの変換に使用できるようにすることにより、脂肪 酸合成を下方制御する手段を提供する。 遺伝子発現を制御する方法は当業界で公知である。２つの主な方法がよく用い られ、これらはおおまかに”センス”および”アンチセンス”制御と呼ばれる。 アンチセンス制御では、植物細胞中に挿入されたときに、標的遺伝子によって生 じるメッセンジャーと相補的配列であるメッセンジャーＲＮＡの発現をもたらす ように遺伝子を構築する。この理論は、相補的ＲＮＡ配列が二本鎖を形成し、こ れによってタンパク質への翻訳を阻害するというものである。相補的配列は標的 遺伝子の全配列と長さが同じであることができるが、通常は断片で十分であり、 この方が操作が簡便である。センス制御では、標的遺伝子のコピーを植物ゲノム 中に挿入する。この場合も全長配列であっても部分配列であってもよい。標的遺 伝子によってコードされるタンパク質の発現が阻害される個体から、遺伝子産物 の発現が増加する個体として同定および単離されるような広範な表現型が得られ る。部分配列を用いるセンス制御は阻害に適している傾向がある。このメカニズ ムはよく理解されていない。アンチセンス制御と関連する欧州特許出願１４０， ３０８および米国特許５，１０７，０６５、ならびにセンス制御を記載する国際 特許出願ＷＯ９０／１２０８４を参照として挙げる。本発明は以下の遺伝子修飾 を行うことを可能にする： １．本発明のクローンを用いて植物ＤＮＡを釣り上げて（ゲノムまたはｃＤＮＡ ライブラリー）相同配列を得ることができる。これらは例えばコムギまたはナタ ネ、カノラ、ダイズ、ヒマワリ、トウモロコシ、油ヤシおよびココナツなどの油 作物由来のＡＣＣａｓｅ遺伝子の、短いか、または全長のｃＤＮＡまたはゲノム ＤＮＡでありうる。 ２．ナタネ種子ＡＣＣａｓｅの部分ｃＤＮＡを植物認識プロモーターと一緒に用 いて発現カセット（部分的センスまたはアンチセンス）を作製し、ＡＣＣａｓｅ 酵素の下方制御生産をするようにナタネ植物を形質転換するのに使用できる。こ れによって低い油含量または質の変わった油をもつ植物を与える。同じカセット を用いてアブラナ属の他の植物におけるＡＣＣａｓｅ酵素の生産を下方制御する ことができる。その他の作物から単離したｃＤＮＡを用いて発現カセット（部分 的、センスまたはアンチセンス）を作製し、油含量を修飾するためにこれらの作 物を形質転換できる。 油合成の下方制御（ナタネまたはその他の油作物において）を用いて基質であ るアセチルＣｏＡを、澱粉、タンパク質、または遺伝子修飾によって導入される 新規ポリマー、例えばポリヒドロキシアルカノエートなどの代替貯蔵物質の合成 に転じることができる。 ３．ナタネまたはアラビドプシスＡＣＣａｓｅ ＤＮＡの全長クローンを用いて 、強力なプロモーターとともに、または余分の遺伝子コピーを挿入することによ って発現カセットを作製し、ナタネまたはその他の油作物中のＡＣＣａｓｅの過 発現を促進し、種子中の油含量の増強された植物を作ることができる。ＡＣＣａ ｓｅ ＤＮＡは、種子発生中にＡＣＣａｓｅプロモーターとは異なる発現ウイン ドウをもつナピン（napin）プロモーターのような種子特異的プロモーターの制 御下におくこともできる。これにより発生期の種子中におけるＡＣＣａｓｅの発 現時期が延期され、種子の油含量が増加する。 ４．ナタネＡＣＣａｓｅのゲノムＤＮＡを用いてＡＣＣａｓｅ遺伝子のプロモー ターを回収することができる。このプロモーターは組織特異的かつ発生制御的な やり方でＲＮＡを生成するのに使用できる。このようにして生成されたプロモー ターはＡＣＣａｓｅの発現を促進するか、あるいはその後ろに置かれた遺伝子構 築物（例えば異なる酵素の構造遺伝子）の発現を制御し、構造遺伝子は発生中の 種子で特異的に発現するであろう。 ５．ナタネまたはアラビドプシスＡＣＣａｓｅの全長ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮ Ａは、成熟タンパク質の翻訳開始部位とＮ末端配列との間の”トランジットペプ チド”配列として知られる配列を含む。この配列は遺伝子産物をプラスチドに向 かわせ、プラスチドへのタンパク質の移入中に切断される。このトランジットペ プチド配列を、異なる遺伝子産物をプラスチドに向かわせるための遺伝子融合に 用いることができる。 ６．コムギ、オオムギ、トウモロコシおよびコメなどの単子葉植物は通常、双子 葉植物が通常耐性なアリールオキシフェノキシ−プロピオネートおよびアルキル ケトン除草剤に対して感受性である。これらの除草剤に耐性な単子葉植物は以下 のようにして作製できる： （ａ）ナタネやアラビドプシスなどの双子葉種由来のＡＣＣａｓｅを単子葉ゲノ ム中に形質転換し； （ｂ）単子葉中でＡＣＣａｓｅを過発現させ；あるいは、 （ｃ）ＡＣＣａｓｅの突然変異誘発を行い、この突然変異遺伝子を単子葉に挿入 する。 ７．ＡＣＣａｓｅ活性はプラスチドと細胞質ゾルの両方に存在すると信じられて いる。本発明のナタネ種子ＡＣＣａｓｅの部分ｃＤＮＡを植物認識プロモーター と一緒に用いて発現カセット（部分的センスまたはアンチセンス）を作製し、細 胞質ゾルＡＣＣａｓｅの下方制御生産をするよう形質転換植物に使用できる。こ れは長鎖の脂肪酸（約Ｃ１８以上の鎖長）の生産を阻害することにより油の質を 変えるであろう。 ８．ＡＣＣａｓｅの第２のプラスチド形が植物中で同定されている。このＡＣＣ ａｓｅはトランスカルボキシラーゼ、ビオチンキャリヤータンパク質（ＢＣＰ） およびビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）のための解離しうるサブユニットから なる。トランスカルボキシラーゼ遺伝子はクロロプラストゲノムによってコード され、ＢＣＰとＢＣは核でコードされる。本発明のｃＤＮＡと、ＢＣＰおよびＢ Ｃとの間の配列相同性を用いてＢＣＰおよびＢＣを単離できる。これらの遺伝子 の下方制御に効果を及ぼすためにＢＣＰおよびＢＣに対するセンスおよびアンチ センスの構築物を作製できる。 ９．本発明のｃＤＮＡ自体がＢＣＰおよびＢＣ遺伝子と十分な相同性をもってお り、これらの遺伝子の下方制御に直接使用できる。 我々は発生中のナタネ種子からポリｄＴでプライムしたｃＤＮＡライブラリー を調製し、発生中のコムギ胚から別のライブラリーを得た。これらのライブラリ ーから、部分長のトウモロコシ葉ＡＣＣａｓｅ ＤＮＡから以前に単離しておい たＤＮＡ断片（ｐＡ３）をプローブとしてスクリーニングし、ナタネ種子ＡＣＣ ａｓｅを特定する部分長のｃＤＮＡクローン（ｐＲＳ１）およびコムギ胚芽ＡＣ Ｃａｓｅ（ｐＫ１１１）をこれによって選択し配列決定した。 部分長ナタネＡＣＣａｓｅ ＤＮＡから単離したＤＮＡ断片をプローブとして 用いて次にアラビドプシス・タリアナから調製したゲノムＤＮＡライブラリーを スクリーニングし、全長アラビドプシスゲノムＤＮＡを選択し配列決定した。 アラビドプシスゲノムＤＮＡの配列を用いてＰＣＲにより特異的プローブを作 製した。これを用いてナタネ種子由来のランダムプライムしたｃＤＮＡライブラ リーをスクリーニングし、さらに２つのナタネＡＣＣａｓｅ部分ｃＤＮＡを単離 した。 次に全長アラビドプシスＡＣＣａｓｅゲノムＤＮＡをプローブとして用いてナ タネ由来のゲノムライブラリーをスクリーニングし、全長ナタネＡＣＣａｓｅゲ ノムＤＮＡを選択し配列決定した。 これらのクローンが確かにＡＣＣａｓｅ遺伝子であることは以下のようにして 確認した： コムギＡＣＣａｓｅ ｃＤＮＡの演繹されたアミノ酸配列は、コムギ胚から精 製されたＡＣＣａｓｅ酵素から単離された４つのペプチドから得られたアミノ酸 配列と４つの配列領域で完全な相同性を示す。演繹されたアミノ酸配列はラット およびニワトリのＡＣＣａｓｅ遺伝子の両方と高い相同性を示す。トウモロコシ 葉ＡＣＣａｓｅとのアミノ酸レベルでの高い相同性が見いだされ、４８アミノ酸 からなる２つのセクションが完全に保存されている。 ナタネ種子部分ｃＤＮＡ（ｐＲＳ１）配列から演繹されたアミノ酸配列は、ト ウモロコシ葉ｃＤＮＡおよびニワトリ、ラット、酵母および藻類ＡＣＣａｓｅ遺 伝子の配列と高い相同性を示す。 アラビドプシスゲノムＤＮＡから演繹されたアミノ酸配列は、ラット、ニワト リおよび酵母ＡＣＣａｓｅ遺伝子と高い相同性を示す。ナタネ種子ＡＣＣａｓｅ 部分ｃＤＮＡ（ｐＲＳ１）のアミノ酸配列との高い相同性が見いだされ、４８ア ミノ酸からなる１つのセクションがほぼ完全に保存されている。図面の簡単な説明 本発明を添付の図面を参照してさらに説明する。 図１は、酵素の精製中におけるＱ−セファロース（図１Ａ）およびブルーセフ ァロース（図１Ｂ）からのコムギ胚ＡＣＣａｓｅの溶出プロフィールを示す。点 線は塩化ナトリウムグラジエント濃度を表し、四角で表されるＡＣＣａｓｅ活性 は以下に記載する方法で測定した。 図２Ａは、ストレプトアビジンの結合によって起きた移動度の変化を示すコム ギ胚ＡＣＣａｓｅのＳＤＳ ＰＡＧＥゲルである。レーン１はミオシン（２００ ｋＤａ）５００ｎｇを含む；レーン２はストレプトアビジン不在下でのブルーセ ファロース精製後の物質１０μＬを含む；レーン３はストレプトアビジン存在下 でのブルーセファロース精製後の物質１０μＬを含む。正常な移動のときと、Ａ ＣＣａｓｅ／ストレプトアビジン複合体の移動におけるＡＣＣａｓｅをそれぞれ 星印で表した。 図２Ｂは、精製コムギ胚ＡＣＣａｓｅのＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを示し、２２０ ｋＤａのバンドを配列決定に用いたことを示す。レーン１はブルーセファロース 精製後の物質１μＬを含み、レーン２はブルーセファロース精製後の物質１０μ Ｌを含む。 図３は、ｐＫ１１１コムギＡＣＣａｓｅ ｃＤＮＡから演繹されるアミノ酸の ４つのセクションと、精製コムギ胚ＡＣＣａｓｅ酵素から単離した４つのペプチ ドから得られたアミノ酸とを比較したものである。 図４は、コムギ胚ＡＣＣａｓｅクローンｐＫ１１１のセンス鎖の配列を３つの 翻訳可能性で示す。ペプチドのアミノ酸配列と相同な配列を下線で示す。 図５は、コムギＡＣＣａｓｅクローンｐＫ１１１の演繹アミノ酸配列の、トウ モロコシＡＣＣａｓｅクローンｐＡ３の演繹アミノ酸配列に対するドットマトリ ックスプロットを示す。 図６Ａは、ＡＣＣａｓｅのトランスカルボキシラーゼドメインをコードするナ タネｃＤＮＡから由来するアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は絵で表した最初 のオープンリーディングフレームから翻訳する。全長の垂直線はストップコドン を表し、半分の垂直線はＡＴＧ配列を表す。図６Ｂは、ＡＣＣａｓｅのトランス カルボキシランドメインに対応するｃＤＮＡクローンｐＲＳ１のヌクレオチド配 列を示す。 図７は、既知のＡＣＣａｓｅ配列と比較したナタネトランスカルボキシラーゼ ドメインを示す。演繹したナタネＡＣＣａｓｅアミノ酸配列（トランスカルボキ シラーゼドメイン）のドットマトリックス（DNA Strider，Stringency 9 Window 21）をラット、酵母および藻（クロレラ：Chorella）ＡＣＣａｓｅに対して比 較する。 図８は、アラビドプシスゲノムサブクローンｐＫＬＵ８１のセンス鎖からの５ ’配列を３つの翻訳可能性で示す。 図９は、アラビドプシスゲノムサブクローンｐＫＬＵ８１のセンス鎖からの３ ’配列を３つの翻訳可能性で示す。 図１０は、アラビドプシスｐＫＬＵ８１の５’翻訳オープンリーディングフレ ームをＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースから得たラットおよびニワトリＡＣＣａ ｓｅ遺伝子の配列と比較したものである。 図１１は、高等植物ＡＣＣａｓｅのドメイン順序の割り当てを示す。図１１Ａ は酵母ＡＣＣａｓｅドメイン順序をアラビドプシスゲノムクローンの配列領域（ 斜線の箱で囲む）と比較した模式図である。配列決定したゲノムクローンの領域 は本明細書中で簡単に同定するためにＡ−Ｆと命名した。 図１１Ｂｉ）は、領域Ａｉｉから翻訳したオープンリーディングフレームを酵 母のビオチンカルボキシラーゼドメインからの領域と直接比較したものである。 箱で囲んだ領域は同じアミノ酸を示す。 図１１Ｂii）は、領域Ｃにあるビオチン結合部位に対応する翻訳したオープン リーディングフレームを酵母のビオチン結合部位と直接比較したものである。箱 で囲んだ領域は同じアミノ酸を示す。 図１１Ｂiii）は、ＡＣＣａｓｅのナタネトランスカルボキシラーゼドメイン と、アラビドプシスゲノムクローン由来のＥ／Ｆ領域との、ドットマトリックス （DNA Strider，Stringency 15 Window 23）によるＤＮＡ配列の比較を示す。 図１１Ｃは、アラビドプシスゲノムクローンｐＫＬＳ２の領域Ａ、Ａｉｉ、Ｂ 、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆのヌクレオチド配列を示す。 図１２は、ナタネＡＣＣａｓｅのビオチン結合ドメインの配列を示す。 図１２Ａｉ）はＡＣＣａｓｅビオチン結合ドメインをコードするナタネｃＤＮ Ａから由来するアミノ酸配列を示す。実際のビオチン結合部位を下線で示す。 図１２Ａii）はビオチン結合部位を酵母ＡＣＣａｓｅの対応する配列と直接比 較したものである。箱で囲んだ領域は同じアミノ酸配列を示す。 図１２Ｂは、演繹したナタネＡＣＣａｓｅアミノ酸配列（ビオチン結合ドメイ ン）の、酵母ＡＣＣａｓｅに対するドットマトリックス比較（DNA Strider，Str ingency 9 Window 21）を示す。 図１２Ｃは、ｐＲＳ６とｐＲＳ８のヌクレオチド配列を全部組み合わせたもの である。 図１３は、ナタネおよびアラビドプシスゲノムＤＮＡのＡＣＣａｓｅのサザン ブロット分析を示す。制限酵素で切断したＤＮＡをサザンブロットによりアラビ ドプシスＡＣＣａｓｅゲノムクローンとハイブリダイズした。ハイブリダイゼー ションおよび洗浄条件は以下の材料と方法の部に記載したように行った。ブロッ トを５日間露光し、それ以上露光しても余分の情報は得られなかった。同じ１％ ゲルにλ ＨｉｎｄＩＩＩおよびＯＸ １７４ ＨａｅＩＩＩ ＤＮＡマーカー を流し（左側に示す）、臭化エチジウム染色／ＵＶによって可視化した。 図１４は、ナタネＡＣＣａｓｅのノーザンブロット分析を示す。 図１４Ａでは、グラフはナタネの胚形成の段階と関連した全脂肪酸としての油 含量（ｍｇ／種子）を示す。分析方法の詳細は材料と方法の部に記載した。異な る胚形成の段階に関連する３つのノーザンブロットは全て、連続的ストリッピン グ後の同じブロットに由来する。使用したプローブは明細書に記載の通りであり 、各段階でのポリＡ＋ＲＮＡの量は５μｇであった。ハイブリダイゼーションお よび洗浄条件は以下の材料と方法の部に記載したように行った。露光は７日間で あった。 図１４Ｂでは、ノーザンブロットで使用したプローブは胚ライブラリー由来の ナタネトランスカルボキシラーゼドメインｃＤＮＡであった。ブロットには、開 花２９日後の胚および若い葉由来のポリＡ＋ＲＮＡを１μｇ使用した。ハイブリ ダイゼーションおよび洗浄条件は以下の材料と方法の部に記載したように行った 。露光は７日間であった。分子量マーカーを臭化エチジウム／ＵＶで可視化した 。発明を実施するための最良の形態 材料と方法 １．０ タンパク質精製とアミノ酸配列データ １．１ ＡＣＣａｓｅのアッセイ アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性は、不揮発性マロニルＣｏＡへの¹⁴Ｃ− 重炭酸塩からの放射能活性の導入によってアッセイした（Hellyer et al.，1986 ） 。 １．２ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 特記しない限り、全てのＳＤＳ ＰＡＧＥゲルはミニＢｉｏｒａｄ Ｐｒｏｔ ｅａｎゲルキット上で３％のスタッキングゲルと７．５％のラニングゲルからな る。使用したバッファー系は特記しない限りLaemmli et al（1970）のバッファ ー系であった。配列決定に用いるペプチドの分離に使用した全てのゲルはラニン グバッファー中、チオグリコール酸２００μＭの存在下で予めラニングしておい た。 ２．０ コムギ／ナタネ／アラビドプシスＡＣＣａｓｅのクローニング ２．１ コンピテントＸＬ１−ＢｌｕｅおよびＫＷ２５１の調製 大腸菌細胞ＸＬ１−ＢｌｕｅおよびＫＷ２５１細胞を５０ｍｌのＬＢ培地／０ ．２％マルトース／５０μｇ／ｍｌテトラサイクリン／１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄中 で一晩増殖した。細胞を３０００ｇで１０分遠心し、細胞ペレットを１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄２．５ｍｌに取り、４℃で保存した。一次スクリーニングには新鮮な 細胞を、次のスクリーニングには１週間以内の細胞を用いた。 ２．２ ｃＤＮＡライブラリー ２．２．１ コムギ 使用したｃＤＮＡライブラリー（Dr．Charles Ainsworth，Wye College，Lond onからの恵与）は、開花の３、５、７、１０、１５、２５、３０および３５日後 に収穫したＣｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇの形成期の穀物全体からプールしたＲ ＮＡを用いて作製した。ｃＤＮＡはλ−ＺＡＰ ＩＩ（Stratagene）のＥｃｏＲ Ｉ／ＸｈｏＩ部位にクローン化し、用いた宿主細菌はＸＬ−１Ｂｌｕｅであった （細胞の調製については２．１を参照のこと）。 ２．２．２ ナタネ （ｉ）ポリＡ＋ＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリー 使用したｃＤＮＡライブラリーはLogemann et al（1987）の方法に従い、発生 期中段階のＪｅｔ ｎｅｕｆナタネ胚（開花の約３５日後に収穫）から単離した ｍＲＮＡを用いて作製した。第１鎖の合成は製造者（Amersham International） の指示に従いポリｄＴプライマーを用いて行った。得られたｃＤＮＡを製造者 （Stratagene）の指示に従いλ−ＺＡＰＰＩＩのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位にク ローン化した。使用した宿主細菌はＸＬ−１Ｂｌｕｅ（細胞調製については２． １参照）。 （ii）ランダムプライム化ライブラリー ３５日齢（開花後）のＪｅｔ ｎｅｕｆナタネ胚からのポリＡ＋ｍＲＮＡ５μ ｇを用いてランダムプライム化ｃＤＮＡライブラリーを構築した。Ｔｉｍｅ Ｓ ａｖｅｒ^TMｃＤＮＡ合成キット（Pharmacia）の指示に従い、ｐｄ（Ｎ）６プラ イマー（０．７４μｇ／μＬ）の１：１０希釈を用いて二本鎖ｃＤＮＡを調製し た。λＺＡＰＰＩＩ中にライブラリーを調製し、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｇｏ ｌｄパッケージングエキストラクト（Stratagene）でパッケージングした。使用 した宿主大腸菌はＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Stratagene）であった。 ２．３ ゲノムライブラリー 使用したアラビドプシス・タリアナライブラリー（Dr．John Cowl，John Inne s Institute，Norwichからの恵与）はλＦＩＸＩＩ中の葉全ＤＮＡ由来であり、 使用した宿主細菌は大腸菌ＫＷ２５１であった（細胞調製については２．１参照 ）。 ２．４ プローブ調製と標識 ｐＡ３／ＤＨ５α（ＩＣＩ由来）とｐＲＳ１／ＤＨ５α（ｐＲＳ１の記載につ いての結果参照）からのプラスミドＤＮＡをＱｕａｇｅｎチップ法により調製し た。コムギおよびナタネｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用プローブはｐ Ａ３ １０μｇをＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ（New Englaind Biolabs）２ ０Ｕで消化して調製した。プローブから単離した断片はそれぞれ２．７および１ ．５４ｋｂの長さであった。アラビドプシスゲノムライブラリーのスクリーニン グ用プローブはｐＲＳ１ １０μｇのＸｈｏｌ／ＰｓｔＩ（それぞれ１０Ｕ）に よる二重消化により調製して１．２ｋｂの長さの単離断片を得た。全ての消化は Pharmaciaの”ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＰＬＵＳ”中、３７ ℃、３時間で行った。消化物は１％ＴＡＥ緩衝化アガロースゲル電気泳動で分離 し、必要な断片をゲルから切り出した。Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩ（Bio 101） の指示する方法に従いゲルスライスからＤＮＡを得た。ＤＮＡ濃度を分光光学的 に測 定した。 製造者（Amersham International）の指示に従いＭｅｇａｐｒｉｍｅキットを 用いてプローブ（２００−３００ｎｇ）をＰ³²αｄＣＴＰで５ｘ１０⁹ｄｐｍ／ μｇのレベルに放射性標識した。導入されなかった標識をＢｉｏｓｐｉｎクロマ トグラフィーカラム（Biorad）で除去した。 ハイブリダイゼーションの直前に、放射性標識したプローブを５分沸騰させ、 氷水に２分置いた後、６５℃でハイブリダイゼーションバッファーに加えた。 ２．５ ｃＤＮＡライブラリーの一次スクリーニング コムギｃＤＮＡライブラリー３００，０００ｐｆｕ、ならびにナタネランダム プライム化およびポリｄＴプライム化ｃＤＮＡライブラリー１５０，０００ｐｆ ｕを、コンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（１５０，０００ｐｆｕ／２ｍｌ）２ ｍｌに加え、混合し３７℃で２０分インキュベートした。培養物を次いで、予め 溶解し５０℃に維持しておき、素早く混合して予め暖めておいた（３７℃）大き なＬＢプレート（２４３ｘ２４３ｘ１８ｍｍ）上に流したアガロース３０ｍｌの 上部に加えた（１５０，０００ｐｆｕ／３０ｍｌ）。プレートを室温で１０分放 置し、３７℃で一晩インキュベートした。最後にプレートを４℃で３０分インキ ュベートした。 ニトロセルロースの四角いシートを注意深く各プレートの表面上に置き、３０ 秒浸し、はがして変性バッファー（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨ） に２分浸しておいた３ｍｍブロッティングペーパー上に置いた。フィルターを中 和するには、それぞれを中和バッファー（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒ ｉｓ ｐＨ７．４）に浸しておいた３ｍｍペーパー上に５分置き、最後にＸ２ ＳＳＣに浸しておいた３ｍｍペーパー上に５分置いた。２回目のリフトを２分行 い同様に処理した。ブロットしたＤＮＡを固定するために各フィルターを真空オ ーブン中に３０分置いた。 フィルターをプレハイブリダイゼーションバッファー（５０ｍｌ ｘ６ ＳＳ Ｃ、ｘ１ Ｄｅｎｄｈａｒｔ’ｓ、０．５％ ＳＤＳ、０．０５％ピロリン酸ナ トリウム、５０μｇ／ｍｌニシン***ＤＮＡ）中、６５℃で３時間絶えず撹拌し ながらインキュベートし、その時点でバッファーを捨てる。放射性標識プローブ （２．４参照）を、予め６５℃に平衡化しておいたハイブリダイゼーションバッ ファー（５０ｍｌ ｘ６ ＳＳＣ、ｘ１ Ｄｅｎｄｈａｒｔ’ｓ、０．５％ Ｓ ＤＳ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）１０ｍｌ中に加え た。絶えず撹拌しながらフィルターを６５℃で１４時間インキュベートし、ハイ ブリダイゼーションバッファー／プローブを除去するが、これは次のスクリーニ ングのために−２０℃で取って置く。 結合しなかったプローブを洗浄するために、フィルターをｘ１ ＳＳＣ、０． １％ ＳＤＳ、３０分、６５℃で４回洗浄した。フィルターを風乾しフィルムに 一晩露光した。陽性プラークの位置を確認し、ギルソンチップ１ｍｌの広い端を 使ってプレートから引き出した。いずれのリフト（３０秒と２分のリフト）でも 陽性を示したプラークのみを用いた。クロロホルム１０μＬを含むＳＭバッファ ー５００μＬ中にプラグを置き、時々混合しながら２時間室温でインキュベート した。懸濁液をベンチトップ遠心機で５分遠心し、ｐｆｕを含む上清を保持した 。 ２．６ ゲノムライブラリーの一次スクリーニング 用いた方法は上述（２．５参照）と同様であるが、２つのプレートで合計２ｘ １０⁴ユニットの遺伝子操作単離物をスクリーニングした。 ２．７ ｃＤＮＡおよびゲノムの二次スクリーニング ＳＭバッファー２００μＬ中の５０−２００ｐｆｕを、コンピテントＸＬ１− Ｂｌｕｅ細胞２００μＬに加え、混合し３７℃で２０分インキュベートした。培 養物を次いで、素早く混合して予め暖めておいた（３７℃）大きなＬＢプレート （８５０ｍｍ直径）上に流した５０℃の溶解アガロース３ｍｌの上部に加えた。 プレートを室温で１０分放置し、３７℃で一晩インキュベートした。最後にプレ ートを４℃で３０分インキュベートした。 プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションは一次スクリーニング （２．５参照）と同様に、使用前に５分沸騰した同じプローブ／ハイブリダイゼ ーションバッファーを用いて行った。 リフティング、調製、プローブ化、洗浄およびニトロセルロースフィルターの 露光は上述と実質的に同様に行った（２．５参照）。 陽性プラークをギルソンチップ２００μＬの広い端を使ってプラグとして引き 出し、クロロホルム１０μＬを含むＳＭバッファー５００μＬ中に置き、時々混 合しながら２時間室温でインキュベートした。懸濁液をベンチトップ遠心機で５ 分遠心し、ｐｆｕを含む上清を保持した。 ２．８ ｃＤＮＡおよびゲノムの三次スクリーニング 植物当たり１０−２０ｐｆｕのみを用いて二次スクリーニング（２．７参照） と実質的に同様の方法で行った。ニトロセルロースフィルターへの露光はこの場 合２時間のみを要した。 ２．９ 陽性プラークからのＤＮＡの単離 Stratagene 社のプロトコール”λ−ＺＡＰＩＩ クローンからのｐＳＫのイ ンビボ切り出し”に従い、ｃＤＮＡクローンのためのプラスミド救出を行った。 Ｑｕａｇｅｎチップ法を用いて大量のｐＳＫ由来のクローンからのＤＮＡを調製 した。 ２．１０ 陽性プラークからのゲノムＤＮＡの調製 三次スクリーニングにおける陽性ｐｆｕのプレートから１つの陽性プラークを 除去し、新鮮なＫＷ２５１細胞５００μＬ（細胞調製の方法については２．１参 照）と３７℃で２０分インキュベートした。１Ｍ ＭｇＳＯ₄ ５００μＬに予 め暖めておいたＬＢ培地（３７℃で５０ｍｌ）を加え、穏やかに震盪しながら３ ７℃で５〜７時間インキュベートした。５〜７時間後、クロロホルム２５０μＬ を培養物に加えてさらに３７℃で１５分インキュベートした。細胞カスを１００ ００ｇで遠心し、上清に最終濃度１μｇｍｌ^-1となるようＤＮａｓｅ／ＲＮａｓ ｅを加え、さらに３７℃で３０分インキュベートした。ポリエチレングリコール ８０００ ５ｇ／ＮａＣｌ ３．２ｇを上清にゆっくり加えて４℃で絶えず撹拌 しながら一晩置いた。 得られる懸濁液を１００００ｇでペレットにし（４℃）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ ｐＨ７．４／１００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ ５ｍｌ 中に取った。次に溶液を３〜５回のクロロホルム抽出と、３〜５回のフェノール ：クロロホルム（１：１）抽出に付した。ＤＮＡを沈殿させるために、等量のイ ソプロパノール（−２０℃）を加えて氷上に３０分置いた。沈殿したＤＮＡを１ ００００ｇでペレットとし、７０％エタノール（−２０℃）で洗浄した後、再度 ペレットとした。ＤＮＡをＴ₁₀Ｅ₁バッファー３００μＬ中に再懸濁した。 サブクローニングは Sambrook et al（1989）の方法を用いて行った。 ２．１１ ＤＮＡクローンの配列決定 配列決定は使用した機械（Applied Biosystems Inc 373A DNA シークエンサ） の製造者の推奨する方法で行った。最初全てのクローンに順行と逆行プライマー の両方（−２１ ｍ１３およびＭ１３ＲＰ１）を用いた。オリゴヌクレオチド（ ２０ｍｅｒ）を作製してｐＲＳ１（ナタネＡＣＣａｓｅクローン）をさらに配列 決定するのに用いた。製造者（Pharmacia，"d.d．Nested Deletion Kit"）の推 奨する方法を用いてｐＫ１１１（コムギＡＣＣａｓｅクローン）をネスト化欠失 に付し、順行および逆行プライマーの組み合わせによって配列決定し、オリゴヌ クレオチドプライミングを作製した。ＤＮＡ配列のコンピュータ分析はDaresbur yにあるＳＥＲＣ設備からのＳＥＱＮＥＴパッケージとＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ を用いて行った。 ３．ノーザンブロット分析 製造者（Pharmacia ｍＲＮＡ精製キット）の推奨する方法を用いて、若い葉 ５ｇまたは開花の１５、２２、２９、３６、４２および４９日後に収穫した胚５ ｇからポリＡ＋ｍＲＮＡを調製した。１−５μｇを１％ホルムアミド／ホルムア ルデヒドアガロースゲルに乗せて電気泳動を行った。ノーザンブロットは文献記 載の方法（Elborough et al.，1994）で行った。 ４．サザンブロット分析 ナタネおよびアラビドプシス葉から単離した全ＤＮＡ（それぞれ１０μｇおよ び２μｇ／消化）をＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで別々に８時 間消化した。ＤＮＡをＴＡＥアガロース電気泳動で分離し、ブロットしてSambro okらの記載する方法によって放射性標識プローブとハイブリダイズさせた。結果 １．１ コムギ胚芽からのＡＣＣａｓｅの部分精製 コムギＡＣＣａｓｅの部分精製は実質的に Egin-Buhler ら(1989)の記載する 方法をいくらか修飾して用いて実施した。 全ての操作は特記しない限り４℃で行った。使用した全てのバッファーは１４ ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび０．３ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいた。 乾燥Ａｖａｌｏｎ Ｗｈｅａｔ胚芽６ｘ２５ｇをコーヒーグラインダーで１５ 秒ひいた。それぞれに１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５ ２００ｍｌ を加えてフルスピードで１分ポリトロン化した。ホモジェネートを１５分撹拌し 、２００００ｇで遠心した。上清を予め１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７ ．５で１５分平衡化しておいた湿重量２５ｇのＤｏｗｅｘ ５０と撹拌した。上 清をチーズクロスで濾過し１０％ポリエチレンイミンｐＨ７．５を撹拌しながら ０．０３％ｗ／ｖで加えた。１５分後に上清を２００００ｇで遠心した。粉末（ ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を最終飽和６０％となるよう加えて１時間撹拌した。２００００ ｇで遠心後、ペレットを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５／１００ｍ Ｍ ＮａＣｌ １００ｍｌ中に再懸濁した。上清を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ ｐＨ７．５／１００ｍＭ ＮａＣｌ ５リットルに対して１時間透析し、次 に新しいバッファー（５リットル）で一晩透析した。粉末（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を最 終飽和２５％となるよう加えて１時間撹拌し２００００ｇで遠心し上清を７０％ 飽和とした。遠心後、得られるペレットを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７ ．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ ５０ｍｌに再懸濁し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ／２０％グリセロール５リットルに対して１ 時間ごとに交換しながら３回透析した。得られる懸濁液を導電率＜４．３ｘ１０^-3 ｃｍ^-1に希釈し、予め平衡化したＱ−セファロース（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ／２０％グリセロール中）１５０ｍｌと ２時間かけてゆっくり撹拌した。結合しないタンパク質を焼結ガラス漏斗で除去 しマトリックスを１０容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２０ｍ Ｍ ＮａＣｌ／２０％グリセロールで洗浄した。スラリーを直径１０ｃｍのPhar macia カラムに詰めた。６０−５００ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ ｐＨ７．５／２０％グリセロールのグラジエントでカラムから１００ｍｌ ／時で約９ｍｌの分画を回収しながらタンパク質を溶出した（溶出プロフィルに ついては図１Ａ参照）。１つおきの分画でＡＣＣａｓｅ活性をアッセイし、最も 活性な分画を集めて５０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄飽和とした。遠心後のペレットを＞ ４．６ ｘ１０^-3ｃｍ^-1の導電率となるよう２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、 ５ｍＭ ＭｇＣｌ、２０％グリセロールの最小容量（約１００ｍｌ）中に取った 。これを予め平衡化したブルーセファロース（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ Ｈ７．５／５ｍＭ ＭｇＣｌ／２０％グリセロール中）１００ｍｌと混合しなが ら２時間インキュベートした。マトリックスを１０容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ ｐＨ７．５／５ｍＭ ＭｇＣｌ／２０％グリセロールで焼結ガラス漏斗 を用いて洗浄した。洗浄したマトリックスを直径１０ｃｍのPharmaciaカラムに 詰め、６０−５００ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５ ／５ｍＭ ＭｇＣｌ／２０％グリセロールのグラジエントでカラムから１００ｍ ｌ／時で９ｍｌの分画を回収しながらタンパク質を溶出した（溶出プロフィルに ついては図１Ｂ参照）。集めた活性分画（ブルーセファロース後物質）は−７０ ℃で凍結保存した。 １．２ 約２２０ｋＤａのタンパク質をビオチン含有とするとの同定 ブルーセファロース後物質中の主要な２２０ｋＤａのバンドを、ストレプトア ビジン存在下でのＳＤＳ ＰＡＧＥ中に移動度を変化しうること、ならびに推定 分子量（Egin-Buhler et al(1980)）からＡＣＣａｓｅと同定した。ブルーセフ ァロース後物質２０μＬにＳＤＳ ＰＡＧＥｘ５装填バッファー（５μＬ）を加 え、１００℃で２分沸騰させ、５ｍＭストレプトアビジンストック１μＬをすぐ に加えた。溶液を６５０℃で５分インキュベートし、比較のためのミオシン（分 子量２００ｋＤａ）および未処理のブルーセファロース後物質サンプルと並べて に次いでＳＤＳ ＰＡＧＥゲルに装填した（図２Ａ参照）。ストレプトアビジン は２２０ｋＤａのバンドの移動度を明瞭に減少し、これがビオチンを含有するこ とを示唆した。分子量２２０ｋＤａをもつ唯一の公知のビオチン酵素はＡＣＣａ ｓｅである。 １．３ コムギＡＣＣａｓｅペプチドの産生および配列決定 既知の濃度標準との比較から計算して約４００ｐＭ（８０μｇ）のＡＣＣａｓ ｅを含むと推定されるブルーセファロース後物質のサンプルをＳＤＳ ＰＡＧＥ プレップゲルに装填した（方法については１．３を、サンプルの挙動については 図２Ｂ参照）。ラニングバッファーは新しいものでＳＤＳ濃度が少ない（０．０ ３５％ＳＤＳ）。電気泳動中に上部タンクにクロマフォアグリーン（Promega） を１：１０００希釈で加えてタンパク質を可視化した。約２２０ｋＤａのＡＣＣ ａｓｅタンパク質のバンドをゲルから切り出し、凍結して−２０℃で一晩保存し た。ゲルスライスを過剰のアクリルアミドで整え、３ｍｍ厚さの大きなBiorad P roteanゲルの１ウエル上に装填した。装填したゲルスライスを、５０％グリセロ ール/０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８／０．１％ ＳＤＳ／３％Ｂ−メル カプトエタノール／０．００５％ブロモフェノールブルー中の６．５％タンパク 質濃度で Endoproteinase LysC（Promega）とともに装填した。タンパク質が積 み重ね（stacker）の境界に至るまでゲルを流し、そこで電気泳動を１時間室温 で停止した。染料の先端がゲルの底に達するまで電気泳動を再開した。製造者の 指示に従いペプチドを ProBlot（Applied Biosystems Inc．）に半乾燥状態でブ ロットした。ブロットをクマシーで迅速に染色（ProBlotの指示による）してペ プチド断片を同定し、これを膜から切り出した、ＡＢＩ ４７７Ａパルス液体タ ンパク質シークエンサーに装填した。配列データは１０−２０ｐＭのアミノ酸レ ベルで得た（図３参照）。 ４つのペプチドについて配列データが得られ、１７、１８、９および２０アミ ノ酸からなる一連のＮ末端アミノ酸配列を得た（図３参照）。 ２．ＡＣＣａｓｅクローンの単離および配列決定 ２．１ コムギＡＣＣａｓｅ ｃＤＮＡ コムギｃＤＮＡライブラリーを、２．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、および４．５ ｋｂの３’トウモロコシＡＣＣａｓｅを含むトウモロコシの部分ｃＤＮＡクロー ンｐＡ３の１．５４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片をプローブとしてスクリーニング した。これによりｐＳＫのマルチクローニングカセット中のＥｃｏＲＩとＸｈｏ Ｉの間に挿入された１．８５ｋｂのクローンを得た。宿主株ＤＨ５α中でのプラ スミドレスキューによりＤＮＡを回収した。このクローンをｐＫ１１１と命名し た。 この部分ｃＤＮＡのヌクレオチド配列データおよびこれに由来する３つの読み 枠から得られるアミノ酸配列を図４に示す。 図４はまた、ｐＫ１１１のセクションが精製コムギ胚芽酵素から単離された４ つのペプチドのアミノ酸配列と完全に相同であることを示しており、このｃＤＮ Ａがコムギ胚ＡＣＣａｓｅを実際にコードすることの良い証拠を提供する。 最大のオープンリーディングフレームから演繹されるアミノ酸配列と、トウモ ロコシＡＣＣａｓｅの配列とのドットマトリックスの比較を図５に示す。ｐＫ１ １１はトウモロコシｃＤＮＡとヌクレオチドレベルで８２．３３％の相同性を、 またアミノ酸レベルで８８．１７％の類似性／７８．４４％の同一性を示す。 さらにコムギｃＤＮＡの演繹アミノ酸のデータは既知のラット（６２％）およ び酵母（６２％）ＡＣＣａｓｅの配列とかなりの相同性を示した。 ２．２ トランスカルボキシラーゼドメインをコードする部分ナタネＡＣＣａｓ ｅ ｃＤＮＡの単離 ＡＣＣａｓｅはナタネ胚から精製されたが、得られた量はタンパク質の配列決 定を行うには不十分であった。配列レベルでのＡＣＣａｓｅの研究を行うために は、そのｃＤＮＡを単離する必要があった。以前に単離しておいた部分コムギＡ ＣＣａｓｅ ｃＤＮＡを用いて、ナタネ胚由来のポリｄＴでプライム化したλＺ ＡＰＩＩライブラリーをスクリーニングした。３回のスクリーニングとプラスミ ドレスキューでで２．５ｋｂのハイブリダイズするｃＤＮＡを取り出した（ｐＲ Ｓ１）。このクローンをネスト化欠失および染色プライマー配列決定の組み合わ せにより両方向で完全に配列決定した。このｃＤＮＡ配列をＥＭＢＬに寄託した （寄託番号：Ｘ７７３８２）。最大のオープンリーディングフレームから予測さ れるアミノ酸配列を図６に示す。このｃＤＮＡと上述のＡＣＣａｓｅ配列とのド ットマトリックス分析は、これがトランスカルボキシラーゼドメインに対応する ＡＣＣａｓｅの部分クローンであることを示した（図７）。ナタネクローンの予 測されるアミノ酸配列は、酵母（Al-Feel et al，1992）、ラット（Lopez-Casil las et al，1988）、藻（Roessler and Ohlrogge，1993）およびコムギＡＣＣａ ｓｅ ｃＤＮＡ ｐＫ１１１と約４４／６１％の配列同一性／類似性を示した。 ｍＲＮＡはポリＡテイルを含んでおりポリＡ分画から得られたので、単離された ＡＣＣａｓｅ ｃＤＮＡは核でコードされた可能性がある。 ２．３ アラビドプシスＡＣＣａｓｅゲノムクローンの単離とさらなるナタネｃ ＤＮＡのクローニング 上述した我々のナタネポリｄＴプライム化ｃＤＮＡライブラリーの平均挿入サ イズは約２−２．５ｋｂであった。従って、このライブラリーが５’ｃＤＮＡを より多く含んでいそうにはなかった。より多くの５’配列を得るために、ナタネ 胚ｍＲＮＡからランダムプライム化ライブラリーを構築した。より多くの５’ｃ ＤＮＡをクローニングするための適当なライブラリーを構築するには以下の２つ の戦略がある：ｉ）我々のｃＤＮＡの５’領域を用いてスクリーニングする、ま たはii）ゲノムクローンからの５’プローブを用いてスクリーニングする。我々 は２番目の戦略を選択した。戦略は、ＡＣＣａｓｅゲノム遺伝子をクローニング し、配列比較によりオープンリーディングフレームを同定し、ＰＣＲを用いて特 異的プローブを作製することである。アラビドプシスはナタネと関連しより小さ いゲノムをもつので、アラビドプシスからのゲノムクローンを得る方を選択した 。本研究所の以前のデータから、アラビドプシスのＤＮＡ配列はナタネの配列と 相同性が高いことが示されていた（データ示さず）。ナタネＡＣＣａｓｅ ｃＤ ＮＡ ｐＲＳ１の１．２ｋｂのＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ断片でλＦｉｘＩＩアラビド プシスゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、ｐＲＳ１ ＡＣＣ ａｓｅプローブと強くハイブリダイズする２つの独立したゲノムクローンを得た 。これらをλＡＹＥ４およびλＡＹＥ８と命名した。λＡＹＥ８をサブクローニ ングして以下の２つのプラスミドを作製した：ｐＧＥＭ ３ＺＦ＋のＥｃｏＲＩ 部位にサブクローニングした５．３ｋｂのｐＫＬＵ８１と、λクローンからＳａ ｌＩの部分消化により切り出してｐＳＫ＋にサブクローニングしたｐＫＬＳ２。 部分長のゲノムクローンであると考えられるｐＫＬＵ８１サブクローンを５’ および３’末端から部分的に配列決定した。従って、同じクローンから５’と３ ’配列の２つのデータが得られた。ヌクレオチド配列と、３つの読み枠から由来 するアミノ酸配列を図８および９に示す。５’の０．５６ｋｂのＤＮＡ配列から 由来するアミノ酸配列を用いてデータベースサーチ（Swissprot）を行ったとこ ろ、ニワトリおよびラットのＡＣＣａｓｅと４０％の同一性を示した（図１０参 照）。 ゲノムクローン（ｐＫＬＳ２）をＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ／ＸｂａＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ消化の組み合わせによりサブクローニングし、ＤｙｅプライマーとＤｙｅ ターミネーターの両方を用いて部分的に配列決定した。我々はｃＤＮＡデータが なければイントロン−エキソンの境界を特定することができないことを見いだし た。従って我々は、ｃＤＮＡスクリーニングのためのオープンリーディングフレ ームプローブの作製ができるようなゲノムクローンに十分な配列のみを選択した 。得られた全配列データを図１１Ａに模式的に示し（斜線領域Ａ、Ａｉｉ、Ｂ、 Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ）、これをＥＭＢＬデータベースに寄託した（寄託番号：Ｘ ７７３７５−Ｘ７７３８１）。 ゲノムクローン中のＡＣＣａｓｅ活性ドメインの順序を特定するために、別々 に配列決定された領域からのオープンリーディングフレーム配列を全長酵母ｃＤ ＮＡの最初の２つのドメイン（図１１Ｂｉおよびii）およびナタネトランスカル ボキシラーゼドメイン（図１１Ｂiii）と比較した。アラビドプシス遺伝子に対 して、図１１Ａに示す酵母ＡＣＣａｓｅのドメイン順序と同じ順序、すなわち［ ビオチンカルボキシラーゼ−ビオチン結合−トランスカルボキシラーゼ］の順序 を割り当てるに十分な相同性が得られた。 ゲノムクローンの５’末端にあるオープンリーディングフレーム（領域Ａｉｉ ）の配列データは、酵母ＡＣＣａｓｅの５’領域と顕著な相同性（演繹アミノ酸 レベルで４９．５／６４％同一性／類似性）を示した（図１１Ｂｉ）。クローン 化ゲノム断片（１９ｋｂ）の３’末端を配列決定し、ポリｄＴでプライム化した ｍＲＮＡライブラリーから単離したナタネの２．５ｋｂのｃＤＮＡクローンの３ ’末端と相同であることを示した（図１１Ｂiii）。領域Ａiiの５’の約１．３ ｋｂの断片を我々は既にもっていたので、ｐＫＬＳ２が全長ゲノムクローンであ るらしいと理論付けた。ｐＫＬＵ８１サブクローンはｐＫＬＳ２の配列の一部に 対応する部分長のゲノムクローンであった。 アラビドプシスのゲノムクローンは単離したナタネｃＤＮＡと高度の相同性を 有していた（領域ＥおよびＦのエキソンで８６％が同一）ので、このゲノムクロ ーンを用いてさらにナタネｃＤＮＡを単離することができることは明らかであっ た。ゲノムクローン内の領域ＣのＰＣＲにより特異的プローブを作製して、これ を用いてナタネ胚ｍＲＮＡから作製したランダムプライム化ライブラリーをスク リーニングした。２つのｃＤＮＡクローン（それぞれ２．０ｋｂと１．１ｋｂの ｃＤＮＡを含むｐＲＳ８とｐＲＳ６）を単離し配列決定した。それぞれから得た ｃＤＮＡはオーバーラップすることが示された。組み合わせで得られた全長のア ミノ酸配列を図１２Ａｉに示す（ＥＭＢＬ寄託番号Ｘ７７３７４）。このクロー ンの配列を分析したところ、酵母（３９／５８％の同一性／類似性）、ラット（ ３８／５９％の同一性／類似性）および藻（３４／５４％の同一性／類似性）Ａ ＣＣａｓｅと有意の相同性を示した。図１２Ａｉに下線で示すように、ｃＤＮＡ 配列中でビオチン結合部位［Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ］がよく保存され ている。酵母のビオチン結合部位との直接の比較を図１２Ａiiに示す。興味深い ことに、またこの配列はその５’末端で、酵母のビオチンカルボキシラーゼドメ インの３’部分と相同性を示した。このデータは、ナタネにおけるドメイン順序 ［ビオチンカルボキシラーゼ−ビオチン結合−トランスカルボキシラーゼ］がア ラビドプシスのドメイン順序と一致することを示した。 ３．サザンブロット分析 ナタネおよびアラビドプシスにいくつのＡＣＣａｓｅ遺伝子が存在するのかが わからなかったので、サザンブロット法により全ＤＮＡを分析した。ナタネおよ びアラビドプシスの全ＤＮＡを３つの別々の制限酵素で消化し、ブロットした。 アラビドプシスのゲノムクローンはＡＣＣａｓe遺伝子が比較的大きいことを示 唆した。そのサイズから、部分ｃＤＮＡをプローブとして用いてサザンブロット によって遺伝子コピー数の正確な評価を得ることは不可能であることが判った。 従って、ブロットをランダムプライム化標識により標識した全アラビドプシスゲ ノムクローン（１９ｋｂ）とハイブリダイズした。プローブとハイブリダイズし たアラビドプシスのバンドの値は約２０ｋｂであった（図１３）。ゲノムクロー ンは約１９ｋｂであり、同じ酵素で消化したときに同様のパターンを示す（結果 示さず）ので、アラビドプシスには１つの遺伝子のみが存在すると結論した。ナ タネのパターンはもっと複雑であったが、比較的少ない遺伝子ファミリーからな ることが見てとれた（図１３参照）。 ４．ノーザンブロット分析 ２．５ｋｂのナタネｃＤＮＡをプローブとして用いてナタネの胚発生中におけ るＡＣＣａｓｅの発現をノーザンブロットにより試験した。ブロットには、開花 の１５、２２、２９、３５、４２および４９日後に Brassica napus Jet Neufか ら取った各段階の胚から調製したナタネポリＡ＋ｍＲＮＡ５μｇを含む。同じ種 子から取った胚の油含量も分析して発生段階をモニターした。油含量のデータを 図１４Ａにグラフとして示す（脂肪酸／ｍｇ種子で表す）。ノーザンブロットを ３つの連続するプローブと別々にハイブリダイズさせ、それぞれの後に次のプロ ーブの調製のためにストリップした。用いた３つのプローブはエノイル還元酵素 （１．１５ｋｂ）、βケト還元酵素（１．１８５ｋｂ）およびＡＣＣａｓｅ（２ ．５ｋｂ）のための胚由来ｃＤＮＡであった。これらの３つのｃＤＮＡは全て、 種子中で最大発現度で発現しており、開花２９日目の胚とも一致した（図１４Ａ ）。しかしながら、ｍＲＮＡ産生の最初の着手はエノイル還元酵素、βケト還元 酵素およびＡＣＣａｓｅの順序であるように思われる。胚形成中における３つの 遺伝子の発現全てのプロフィルは、個々にプローブしたブロット中で２９日目に おきるピーク発現とともに再現可能であった。ハイブリダイズしたバンドのサイ ズはブロットに適用した同じアガロースゲル上のサイズマーカーで測定したとこ ろ、それぞれ１．６５、１．７および７．５ｋｂであった。ＡＣＣａｓｅ ｍＲ ＮＡのレベルはエノイル還元酵素およびβケト還元酵素のレベルよりも比較的低 かった。これは部分的には、ブロットの連続的ストリッピングと、操作中の大き な７．５ｋｂ遺伝子の分解によるものと思われる。 胚由来の２．５ｋｂのｃＤＮＡをプローブとして用いる、開花後２９日目の胚 と若い葉におけるＡＣＣａｓｅ発現のノーザンブロットによる比較を図１４Ｂに 示す。ハイブリダイズした７．５ｋｂのバンドは葉におけるよりも種子における 方が約５倍強く、これはＡＣＣａｓｅで予期されたのと同様である。全長ｍＲＮ Ａのサイズ（７．５ｋｂ）はトウモロコシおよびコムギＡＣＣａｓｅの全長ｍＲ ＮＡの既知のサイズと一致した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ブライト，シモン・ウィリアム・ジョナサ ン イギリス国バッキンガムシャー エスエル ７ ２エイワイ，マーロウ，パウンド・レ ーン 24 (72)発明者 フェンテム，フィリップ・アンソニー イギリス国バークシャー アールジー11 ４エックスエイ，ウォーキンガム，フィン チャンプステッド，ブライアウッド ８エ イ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．図６または１２に示すヌクレオチド配列をもつ、ブラシカ・ナプスの種子か ら単離されたアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）を特定する部分 ｃＤＮＡ、および遺伝子コードの縮重により許容されるその変種。 ２．図４に示すヌクレオチド配列をもつ、コムギ胚芽から単離されたＡＣＣａｓ ｅを特定する部分ｃＤＮＡ、および遺伝子コードの縮重により許容されるその変 種。 ３．図８に示すヌクレオチド配列をもつ、アラビドプシス・タリアナから単離さ れたＡＣＣａｓｅを特定する全長ゲノムＤＮＡ、および遺伝子コードの縮重によ り許容されるその変種。 ４．特許を目的とする微生物寄託に関するブダペスト条約に基づき、１９９３年 ３月２５日に国立工業および海洋細菌コレクション（National Collectin of In dustrial & Marine Bacteria: 23 St．Machar Road，Aberdeen，AB2 1RY，英国 ）に寄託された、大腸菌（Escherichia coli）ＤＨα株宿主の以下のクローンに 挿入されたＤＮＡ挿入物： プラスミドｐＫ１１１、寄託番号ＮＣＩＢ ４０５５３； プラスミドｐＫＬＵ８１、寄託番号ＮＣＩＢ ４０５５４；および プラスミドｐＲＳ１、寄託番号ＮＣＩＢ ４０５５５。 ５．植物細胞中で活性なプロモーター、ＡＣＣａｓｅ遺伝子の１以上のドメイン とセンスまたはアンチセンスの方向でｍＲＮＡをコードする構造領域および３’ 非翻訳領域を含み、これによって植物細胞を形質転換することにより脂肪酸生産 の減少または変わった組成の脂肪酸の生産を特徴とする表現型をもたらす、ＡＣ Ｃａｓｅ発現の制御を目的とする形質転換植物に使用するための遺伝子構築体。 ６．プロモーターが組織特異的または発生学的に制御されたプロモーターである 、請求項５に記載の構築体。 ７．プロモーターがブラシカ・ナプスのナピン遺伝子である、請求項６に記載の 構築体。 ８．請求項５〜７のいずれかに記載の遺伝子構築体を含む、遺伝的に形質転換さ れた植物、植物細胞および植物部分。 ９．植物ゲノムが請求項５〜７のいずれかに記載の遺伝子構築体を含むことを特 徴とする、減少した脂肪酸合成能力をもつか、または変わった組成の脂肪酸合成 能力をもつ、遺伝的に形質転換された植物、植物細胞および植物部分。 １０．植物が油合成植物である、請求項９に記載の遺伝的に形質転換された植物 。 １１．植物がアブラナ属（Brassicaceae）のものである、請求項１０に記載の植 物。 １２．アセチルＣｏＡから脂肪酸を合成する植物の能力を減少させる請求項５〜 ７のいずれかに記載の構築体と、さらにアセチルＣｏＡからポリヒドロキシアル カノエートの合成を指示する遺伝子とを植物がそのゲノム中に含むことを特徴と する、ポリヒドロキシアルカノエートポリマーを合成することのできる植物。 １３．請求項５〜７のいずれかに記載の遺伝子構築体を形質転換によって植物の ゲノム中に安定に導入することからなる、植物中のＡＣＣａｓｅの発現を制御す る方法。 １４．単子葉植物にとって外来のＡＣＣａｓｅ活性を阻害する、除草剤への耐性 が増加した単子葉植物であって、単子葉植物がそのゲノム中に安定に導入された ＡＣＣａｓｅを特定するＤＮＡをもち、該ＤＮＡが該除草剤への天然の耐性をも つ双子葉植物から単離されたものである、上記単子葉植物。 １５．除草剤がアリールフェノキシ−プロピオネートおよびアルキルケトン除草 剤からなる群より選ばれる、請求項１４に記載の植物。