JPH10504534A

JPH10504534A - 放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体

Info

Publication number: JPH10504534A
Application number: JP8502468A
Authority: JP
Inventors: ジョンエム．レノ，; サドハーカーカシナ，
Original assignee: ネオルクスコーポレイション
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-13
Publication date: 1998-05-06
Also published as: WO1995034315A1; EP0765166A1; EP0765166A4; EP0765166B1

Abstract

(57)【要約】血管血栓を画像化するのに有用な放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体に関する。また、このような放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体の製造方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体技術分野本発明は放射性標識アネキシン（annexin）−ガラクトース結合体に関する。また、本発明は放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体の投与を含む画像化 (imaging)プロトコールを提供しようとするものである。結合体のアネキシン成分は、血管(vascular)血栓標的部位に結合体の放射性標識活性成分を送達する作用をする。結合体のガラクトース成分はレシピエントの循環系からの放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体の迅速な排除を促進する。発明の背景患者に胸部痛、動悸または心臓のショック性障害(coronary trauma)あるいは心臓疾患の他の症状がある場合には心臓における血管血栓の存在が治療を複雑にする可能性のある重要な因子である。医療分野に従事する者が、１つ以上の血管血栓が存在しているかどうかを、そして存在している場合にはこの血管血栓の位置を非侵入的に決定することができるならば、選択した治療を一層良く評価することができる。さらに、医療分野に従事している者が、血管血栓が存在しないことを決定することができるならば、それによって治療が複雑になる可能性が抑えられ、心臓の病状をより安全かつ効果的に治療することができる。血管血栓の存在を決める現在の大部分の技術は、侵入的であり、および／または煩雑であり、および／またはこのような血管血栓を良好な感度および特異性で検出することができなかった。従って、非侵入的な血管血栓画像化に有用な画像化剤が望まれている。アネキシンは、陰イオン性リン脂質に対するカルシウム媒介結合により特徴付けられるタンパク質の１つのクラスである。陰イオン性リン脂質は活性型血小板と静止状態の血小板（quiescent platelet）より約２０倍大きく結合し、そして活性型血小板は血管血栓と結合する。ヨウ素化アネキシンＶはインビトロで血管血栓に局在することが明らかにされているが、しかし、最適とは言えない画像化特性を有し、これは恐らく血清中高分子または非標的組織中への再取り込みを伴って起こり得るトランスヨーディネーションおよび／または代謝分解によって生じる血中クリアランスの顕著なβ相に起因する。遊離の放射性ヨウ素またはヨウ素含有代謝分解生成物は、非標的組織、特に甲状腺を放射能に曝した。さらに、使用したヨウ素放射性標識は得るのが困難であり、従って広範囲な用途には実用的でない。従って、改善された放射性標識アネキシン化合物が望ましい。発明の要旨本発明は、放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体、その製造方法および使用方法を提供する。本発明の好ましいアネキシン含有結合体は、診断用画像化剤による放射性標識に適切な結合体であり、アネキシン；１個以上のガラクトース残基；およびアネキシンと結合しているN₂S₂キレートを含有することを特徴とする。また、本発明は、血管血栓を画像化するのに適切な放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体において、放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体は：アネキシン；１個以上のガラクトース残基；アネキシンと結合しているN₂S₂キレート；および該キレートによって錯体化されている診断用放射性核種を含有することを特徴とする。本発明に用いるのに好ましいアネキシンはアネキシンＶである。本発明に用いるのに好ましい放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体は、以下の構造式：（式中のｎは１以上の数を示す）で表されることを特徴とする。本発明を実施する際に用いるのに好ましい診断用放射性核種はＴｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１８６およびＲｅ−１８８であり、特に好ましい核種はＴｃ−９９ｍである。心臓内またはその近くに位置する血管血栓は、本発明に係る画像化に特に適合している。図面の簡単な説明図１は、アネキシンＶを放射性標識する方法の概念図である。図２は、Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶの血中クリアランス（○）およびＴｃ− ９９ｍ−アネキシンＶ−ガラクトースの血中クリアランス（△）を示す図である。発明の詳細な説明本発明について記載する前に、本開示内に使用される特定の用語の定義について述べるのが有用であり得る。アネキシン：ミリモル濃度のカルシウムの存在下で高い親和力で膜脂質に結合する能力により特徴付けられる化合物のクラス。アネキシンは、負電荷を有する表面リン脂質（例えば、活性型血小板上の）にアネキシンが結合することによって媒介される抗凝固作用を示すことが明らかにされている。このアネキシン−リン脂質結合は、このような負電荷を有する表面リン脂質による凝固因子の活性化をブロックすると考えられる。アネキシンクラスの分子が認識される前に、そのメンバーは文献中で胎盤抗凝血タンパク質（例えば、ＰＡＰ−１，２，３および４）、リポコルチン（lipocortin）、カルパクチン(calpactin)、血管凝固物質（αおよびβ）、カルホビンディンＩ（calphobindin I）、エンドネキシン（en donexin）II、アンコリン（anchorin）ＣII、カルシウム依存性リン脂質結合性タンパク質などともいわれた。Crumptonら、Nature 345:212，1990を参照のこと。アネキシン−Ｖは本発明の記載に用いる原型（prototypical）アネキシン分子である。 N_xS_y キレート：本明細書中で規定される用語「N_xS_yキレート」は、（ｉ）金属または放射性金属に配位結合することができ、また（ii）アネキシン分子に共有結合することができる二官能性キレート化剤を包含する。特に好ましいN_xS_yキレートはN₂S₂コアおよびN₃Sコアを有する。N_xS_yキレートの例は、例えば、Fritzbe rgら、Proc.Natl ．Acad．Sci.USA 85:4024-29,1988；Weberら、Bioconj ．Chem. 1 :431-37,1990；およびこれらの文献で引用されている文献中に記載されている。この記載の目的のために、原型N_xS_yキレートはN₂S₂キレートであるとする。 N₂S₂ キレート：適切に配置された２個の窒素原子および２個の硫黄原子を介して放射性核種を安定に錯体化することができるN_xS_yファミリーのジアミド、ジメルカプチド二官能性キレート化剤。好ましいN₂S₂キレートは、例えば米国特許第４，８９７，２２５号に記載されている。 N₃S キレート：適当に配置された３個の窒素原子および１個の硫黄原子を介して放射性核種を安定に錯体化することができるN_xS_yファミリーのトリアミド、メルカプチド二官能性キレート化剤。好ましいN₃Sキレートは、例えば、米国特許第４，９６５，３９２号に記載されている。放射性標識アネキシン：キレート内で錯体化されている放射性核種を有するキレートに結合しているアネキシン。放射性標識アネキシン−ガラクトース：キレート内で錯体化されている放射性核種を有するキレートに結合しているガラクトース誘導体化アネキシン。結合体(conjugate)：化学的結合体（共有結合または非共有結合したもの）、融合タンパク質などを包含する結合体。本発明は、アネキシン含有結合体、放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体、および診断用画像化のためのその使用に関する。放射性標識アネキシンは次の特性：陰イオン性リン脂質によって特徴付けられる標的細胞部位への迅速な融合(accretion)、短い循環半減期(short circulating half-life)；代謝分解またはキレートからの放射性核種の分離に対するインビホ安定性；および冷温キットフォーマット（cold kit format）に包装する適合性によって特徴付けられる。本発明の放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体はまた、程度は異なるとしても、上述の特性を示す。例えば、放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体はそれらの放射性標識アネキシン対応物(counterpart)より短い循環半減期を示す。また、放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体は、一般に標的部位に対して、それらの放射性標識アネキシン対応物より低い結合親和性を示す。成功を収めた診断用画像化は、標的部位におけるシグナルの蓄積および非標的シグナルの迅速な排除の両方を必要とする。従って、レシピエントの循環系からの本発明の放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体の排除の強化は、一層短い時間枠内に診断用画像を達成できる明確な機会を提供する。本発明の１つの実施態様は診断用画像化剤によって放射性標識するのに適切なアネキシン含有結合体に関するものであり、このアネキシン含有結合体は：アネキシン；１個以上のガラクトース残基；およびアネキシンと結合しているN_xS_yキレートを含有する。レシピエント内のどの位置でも（しかし、特に心臓内またはその近くで）血管血栓を画像化するのに適切な放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体もまた意図され、この放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体は、アネキシン、１個以上のガラクトース残基、N_xS_yキレート、およびさらにこのキレートによって錯体化されている診断用放射性核種を取り込む。本発明の好適な１つの実施態様は、診断用画像化剤によって放射性標識するのに適切なアネキシン含有結合体を含み、このアネキシン含有結合体は：アネキシン；１個以上のガラクトース残基；およびアネキシンと結合しているN₂S₂キレートを含有している。血管血栓を画像化するのに適切な放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体もまた意図され、この放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体は、アネキシン、１個以上のガラクトース残基、N₂S₂キレート、およびさらにこのキレートによって錯体化されている診断用放射性核種を取り込む。多くの病状と関係する血管血栓を視覚化するために、アネキシンと、例えば、Ｔｃ−９９ｍのような画像化用放射性核種によって錯体化されているキレートとの結合体を、このような画像化診断が望まれるレシピエントに投与する。この結合体のアネキシン部分は、血管血栓のような負電荷を有する表面リン脂質によって特性付けられている標的部位に、迅速に局在する。放射性核種は、種々の視覚化技術の１つ、例えば、γカメラ画像化技術によって視覚化できる能力に関して選択される。標的部位へのアネキシンの迅速な融合およびアネキシン（アネキシンは放射性標識の際に有意に長くなることはない）の短い血清半減期（普通、３０分未満）のために、これらの標的部位の画像化は、非標的部位が放射能にほとんど曝されることなく進行する。診断用画像化はＳＮ比に依存している。標的シグナルの蓄積またはノイズの低下のいずれかを含む改善は、診断用画像化生成物の効能を大きくする。標的部位を画像化する場合には、ノイズの低下はバックグラウンド放射能、特に血液プール（blood pool）活性の低下と同義である。アネキシンはアネキシンＶを含めて、肝臓によって迅速に除去されるが；肝臓を通って循環する結合体が通過するたびに活性の一部分が除去されるにすぎない。血液からバックグラウンド活性を一層効果的に除去するためには、アネキシン含有結合体の肝臓における抽出の改善を行ってもよい。肝臓における抽出を強化する好ましい方法では、アネキシン含有結合体を、ガラクトースのような肝臓レセプターによって認識される部分によって誘導体にする。肝臓レセプターによって認識される部分の肝臓レセプターによる抽出効率が改善されると、誘導体化されたアネキシン含有結合体（例えば、アネキシン−グルコース結合体）の肝臓による「１回通過ごと」の除去量が、このようにして除去された誘導体化されていないアネキシン含有結合体の場合の量と比較して増加する。一般的に、アネキシン（最も注目に値する例外はアネキシンIIである）は、約３３〜７２キロダルトンの分子量を有する単鎖の非グリコキシル化タンパク質である。アネキシンはカルシウムイオンで媒介される結合と関連するいくつかの活性を有する。検討の結果、アネキシンが、ミリモル濃度のカルシウムの存在下に、陰イオン性膜脂質に大きな親和力によって結合することが分かった。このようなタンパク質は、カルシウムの存在下に、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、またはホスファチジルイノシトールのような負電荷を有するリン脂質に対して特に大きな親和力を有する。例えば Funakoshiら、Bioc hem. 26:5572-78,1987；および Taitら、Biochem. 27:6268-76,1988を参照されたい。このような負電荷を有するリン脂質は血管血栓と結合している（例えば、活性化ヒト血小板の表面上に位置する）。アネキシンは抗凝固効果を及ぼす。凝固抑制は、負電荷を有する表面リン脂質（例えば、活性型血小板の表面上に存在する）にアネキシンが結合することによって、媒介される。このように結合すると、上述のような負電荷を有する表面リン脂質によって、凝固因子の活性化が阻止される、と考えられる。アネキシンは迅速に、即ちその循環レベルに応じて約５〜３０分で、標的部位を有する陰イオン性リン脂質に局在するが、やや長い時間の間血清中で循環している（循環半減期＜３０分）。後述の実施例３は、８２分の平均時間（アネキシン投与後）で血管血栓を平面画像で視覚化した画像化実験の結果を説明している。このような性質のために、アネキシンまたは診断薬または治療薬との結合体を形成しているアネキシンを、ＤＶＴ（強度の静脈血栓症）、ＰＥ（肺動脈塞栓病）、心筋梗塞、心房細動、人工心臓血管材料に伴う問題、拍動のような多数の徴候に関連する血管血栓の診断または治療についてのプロトコルで使用することができる。放射性標識アネキシンを使用する診断プロトコルおよび実験の例を、本発明のこの点を一層明瞭にするために、以下に説明する。本発明を実施するのに有用な好ましいアネキシンの一例はアネキシンＶであり、これは１９７９年にBohnによってヒトの胎盤から単離された。ヒトの胎盤はアネキシン含有量の大きい供給源であり、胎盤プロテイン４（Placenta Protein 4 ；ＰＰ４）と呼ばれている。また、アネキシンＶは大腸菌において発現されている。また、アネキシンＶの全長cDNAクローンが得られており、かつ発現ベクターにおいてサブクローン（subclone）されており、これによりアネキシンＶを含有する融合タンパク質の産生が容易になる。アネキシンＶは４種の領域（４個のタンデム（tandem）、約７５個のアミノ酸残基の不完全な繰り返し、Funakoshiら、Bio chem. 26:8087-92,1987）から成り、各領域は５個のα−ヘリックスから構成されている。側方から見ると、アネキシンＶ分子はクラウン様（crown-like）に見え、その凸面上に少なくとも４個のカルシウム結合部位を有し、これを介してアネキシン−リン脂質の相互作用が媒介される。また、他のアネキシン分子も本発明を実施するのに有用であり、ここに述べるアネキシンＶに関する記載は一般的にアネキシン分子に適用される。アネキシンＶは複数個のカルシウム結合部位を有するため、また負電荷を有するリン脂質に結合するアネキシンＶはカルシウムによって媒介されるため、１個以上の個々のアネキシンＶ領域から成る設計された分子（engineered molecule ）を本発明に係る画像化プロトコルに使用することができる。また、アネキシン分子を領域境界とは異なる１個または複数個の位置に分配して、陰イオン性リン脂質のカルシウム媒介結合を可能にする設計された分子を提供することができる。また、陰イオン性リン脂質に対するアネキシンＶの親和力が有意に損なわれない限り、アネキシンＶを１個以上のアミノ酸残基において変えることができる。リン脂質に対するアネキシンの結合度は、Taitら、J ．Biol．Chem. 264:7944-49 ,1989に記載されているように、蛍光消光によって定量することができる。アネキシンのうちで、アネキシンＶは、血漿および細胞外流体に匹敵する条件（イオン化カルシウム1.2 ｍＭ、イオン強度0.15Ｍ）下において、ホスファチジルコリン８０％およびホスファチジルセリン２０％を含有するリン脂質小嚢に対して最も強い結合親和力（Ｋd ＜１０^-10Ｍ）を有する。この結合は可逆性であり、カルシウム依存性である。バックグラウンド放射性標識活性を減少させるために、ヘキソースまたはヘキソースをベースとする部分（moiety）を使用してアネキシンを誘導体にすることができる。特に、肝臓の内皮細胞および／またはクッパー細胞と結合しているアッシュウエル（Aschwell）レセプターまたは他の肝臓レセプター、例えば、マンノース／Ｎ−アセチルグルコサミンレセプターによって、あるいはマンノース６ −ホスフェートレセプターによって認識される１個以上のヘキソース（６炭糖部分）を組み込むために、アネキシンを誘導体にすることができる。このようなヘキソースおよびヘキソースをベースとする部分の例は、ガラクトース、マンノース、マンノース６−ホスフェート、Ｎ−アセチルグルコサミン、ペンタマンノシルホスフェートなどである。アッシュウエルレセプターによって認識される他の部分としては、グルコース、Ｎ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースのチオグリコシド、および、一般的に、Ｄ−ガラクトシドおよびグルコシドなどがあり、これらのものも本発明を実施するのに使用することができる。ガラクトースはこの説明のために使用する基本的なヘキソースである。ガラクトースチオグリコシドとタンパク質との結合体の生成は、Leeら、「２−イミノ −２−メトキシエチル１−チオグリコシド：タンパク質に糖を結合させる新規な試薬」、Biochemistry 15(18):3956,1976の教示に従って達成するのが好ましい。他の有用なガラクトースチオグリコシド結合体の生成方法は、Drantzら、「タンパク質に対するチオグリコシドの結合：肝臓膜との結合性の強化」Biochemist ry 15(18) :3963,1976に記載されている。アネキシン−ガラクトース結合体についても、この文献に示されている例で説明されている。化学的方法によるアネキシンとヘキソースとの結合体の生成は、アネキシンとキレートとの結合体の生成前（形成後アプローチ）あるいは生成後（形成前アプローチ）のいずれかで行なうことができる。しかし、ヘキソース結合体の化学的生成は、キレート結合体の生成前に行うのが好ましい。生成物である結合体におけるガラクトース残基数は、１からアネキシンの標的に対するアネキシンの結合親和力を有意には小さくしない最大ガラクトース数の範囲である。例えば、アネキシンの本来の結合活性の少なくとも２０％が保持されているガラクトース誘導体化が好ましく、アネキシンの本来の結合性の少なくとも５０％が保持されている場合が一層好ましい。アネキシン分子に存在する理論的に可能な最大ガラクトース残基の数は２２（すなわち、アネキシン構造内のリジン残基数）である。本発明に係る放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体におけるガラクトース残基数は、例えば、１〜約５の範囲である。本発明に使用するには、アネキシンＶを画像化用放射性核種で放射性標識する。本発明において有用な放射性核種としては、γ放射体、陽電子放射体、オージェ電子放射体、Ｘ線放射体、蛍光放射体などがある。本発明に用いるのに適当な放射性核種は当業界において既知であり、このような放射性核種としては⁶⁴Ｃｕ、¹⁸⁶ Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、¹⁰⁰Ｐｄ、²¹²Ｂｉ、²¹²Ｐｂ、¹⁰⁹Ｐｄ、⁶⁷Ｃｕ、^99mＴｃ、⁹ ⁴ Ｔｃ、⁹⁵Ｒｕ、¹⁰⁵Ｒｕ、⁹⁹Ｒｈ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹¹¹Ｉｎ、¹⁵³Ｓｍ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁷⁰ Ｌｕ、¹⁸⁹Ｐｔ、¹⁹³Ｐｔ、¹⁹⁹Ａｕ、¹⁹⁷Ｈｇなどがある。Ｔｃ−９９ｍは本発明を実施するのに好ましい放射性核種である。Ｔｃ−９９ｍは、低比活性および高比活性（0.53μＣｉ／μｇ〜101.2 μＣｉ／μｇ）の両方において、本発明に従ってアネキシンＶに安定に結合される。適当な放射化学的収率および良好な放射化学的純度が得られる。また活性型血小板結合性についての研究を行なった。放射性標識アネキシンＶ結合体は活性型血小板に良好に結合した。 N₂S₂キレートおよびN₃Sキレートはその分野で既知である。例えば、好ましいN₂ S₂キレートは米国特許第４，８９７，２２５号に記載され、好ましいN₃Sキレートは米国特許第４，９６５，３９２号に記載されている。本発明者らはこの安定なキレート化技術を適用してアネキシン分子の血栓ターゲッティング能力(targe ting ability)を活用し、これにより血管血栓を迅速にインビボで視覚化することができる画像化剤を生成する。本発明に係る放射性標識アネキシンおよび放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体を使用して、代謝によって分解した放射性標識結合体から生じる高レベルのバックグラウンド放射能が減少または消滅されている血栓画像を得ることができる。また、放射性標識アネキシンおよび放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体は、非標的細胞部位に対して臨床的に許容できない毒性を回避することができる。Ｔｃ−９９ｍ放射性標識アネキシンＶは、後述する実施例IIIで説明するブタについての研究において、Ｉ−１２３より優れた性能を示した。 N₂S₂キレートまたはN₃Sキレートを使用してアネキシンＶを放射性核種で放射性標識することは、形成前アプローチまたは形成後アプローチのいずれかを使用して行うことができる。すなわち、放射性核種は、アネキシンＶとキレートとの結合体の生成前（形成前アプローチ）あるいは生成後（形成後アプローチ）のいずれかで、キレート内で錯体化される。形成前アプローチが好ましく、この方法に適切な操作手順は実施例Ｉ，IIおよびIVに説明されている。アネキシン分子は、約２個〜約６個の末端アミノ酸残基を加えることにより改変して、アネキシン分子とキレートとの間またはアネキシン分子とガラクトース残基との間の結合体生成反応を容易にすることができる。例えば、末端アミノ酸残基を加えてスルフヒドリル基を生成することができ、あるいはマレイミド基に誘導体化することができる基を生成することができ、このようなスルフヒドリル基およびマレイミド基は結合体生成反応に使用することができる。このような改変は、タンパク質化学法により、あるいは適当な融合タンパク質を生成させることにより、あるいは上述の改変に有用な他の技術により、行うことができる。本発明に係る放射性標識アネキシンおよび放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体は、コールドキット内にパッキングすることができる点で、以前に調製されているＩ−１２３標識アネキシンより優れた追加の利点を有する。すなわち、アネキシンまたはアネキシン−ガラクトースおよびキレートの諸成分は、個々に瓶に詰めておき、Ｔｃ−９９ｍ成分とは別個に提供することができる（場合によっては、互いに別個に瓶に詰めておくことができる）。血栓画像を必要とする患者が識別された場合には、コールドキットを注文するか、貯蔵所から持ち出すことができ；Ｔｃ−９９ｍはラディオファーマシー(radiopharmacy)または他の供給源から入手することができ；プレフォームドもしくはポストフォームドキレート化／錯体化処理を行うことができ；放射性標識アネキシンまたは放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体を患者に投与し；次いで患者の画像を作る。放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体の場合には、アネキシン−ガラクトース結合体を調製し、キット内の瓶に詰めておくのが好ましい。結合体成分を凍結乾燥し、発熱分子の存在していない無菌雰囲気で瓶に詰めることは、良好な製造業務、特に生体材料に関する業務の分野における通常の知識を有するものにとって既知である技術によって達成することができる。本発明に係る放射性標識アネキシンおよび放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体は、診断に有効な量の放射性核種が標的部位に供給されるような量で投与する。適当な投与量は大いに患者に固有である種々の因子によって変動し、このような因子は、本発明を実施するに当たって、この分野に従事する者によって考慮される。また、放射性標識アネキシンまたは放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体の成分は、この分野に従事している者にとって既知であるか、あるいはこの分野に従事している者によって日常的に確認可能な道筋で用量に影響を及ぼす。一般的に、放射性標識アネキシンまたは放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体は、患者および関係または疑いのある病気の生理学的特徴によって、レシピエントの体重当たり約0.3 〜約３００μｇ／ｋｇ、好ましくは約３〜約１０μｇ／ｋｇの範囲の用量で、大きな哺乳動物に投与される。この分野に従事している者は、所定の病気にかかっている所定の患者に対して、適当な用量および投与方法を明らかにすることができる。本発明に係る放射性標識アネキシンまたは放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体は、任意の好都合な方法で投与することができる。例えば、静脈注射を使用して放射性標識アネキシンまたは放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体を投与することができる。また、本発明を実施するに当たっては、他の投与方法も使用することができる。追加の投与方法としては、例えば、動脈法（例えば、冠状動脈法）、冠状動脈内法、リンパ管内法、鞘内法、または他の腔内法などによる注入がある。放射性核種の性質（nature）および投与目的に応じて、放射性核種を投与した後に、レシピエントに、放射性核種が存在する部位からの放射性発光を検出するための種々の操作を施す。例えば、Ｔｃ−９９ｍを含有する結合体はγ線カメラによって画像化することができる。本発明を次の実施例についてさらに説明する。これらの実施例は例示のものであって、本発明を限定するものではない。実施例Ｉアネキシン−N₂S₂キレート結合体を放射性標識する方法アネキシンＶは、肝臓、肺臓および胎盤のような種々の組織摘出物（extract ）から、例えば、Funakoshiら、Biochem. 26:8087-92,1987； Taitら、Biochem. 27:6268-76,1988；および米国特許第4,937,324 号に記載されている方法によって単離することがでる。さらに、アネキシンＶは、Taitら、Archives of Bioche mistry and Biophysics 288:141-44,1991に記載されているように、大腸菌において発現させることができる。アネキシンＶをJ.Nucl ．Med. 32:1445-51,1991に記載されているオンコトラック（OncoTrac，登録商標）小細胞肺癌画像化用キット(Small Cell Lung Cancer Imaging Kit)標識法に従って、ジアミドジメルカプチドN₂S₂キレートを使用することにより、Ｔｃ−９９ｍで放射性標識した。アネキシンＶをＴｃ−９９ｍで放射性標識する好ましい方法は、Ｃ−１８ベーカー(Baker)精製Ｔｃ−９９ｍ−N₂S₂−ＴＦＰを使用する改良オンコトラック（登録商標）キット法である。この方法では、0.6 ｍｌの２，３，５，６−テトラフルオロフェニル４，５−ビス−（Ｓ−１−エトキシ−エチル−メルカプトアセトアミド）ペンタノエート（0.3 ｍｇ、0.0005モル、0.9 ｍｌのイソプロピルアルコールに新たに溶解したもの）に0.16ｍｌの0.2 Ｍ塩酸：氷酢酸（１４：２の比）を加えることにより、酸性化活性エステル溶液を調製した。次いで、0.5 ｍｌのこの溶液を1.1 ｍｌのＴｃ−９９ｍ−グルコネート（ｐＨ6.1〜6.3において 0.12ｍｇのＳｎＣｌ₂２Ｈ₂Ｏと5.0 ｍｇのグルコン酸ナトリウムと１００ｍＣｉ／ｍｌの[Ｔｃ−９９]過テクネチウム酸とから調製した、すなわちオンコトラック（登録商標）キット標識法における第１工程）に添加した。この反応混合物を７５℃において１５分間加熱し、次いで氷上で冷却した。生成したＴｃ−９９ｍ −４，５−ビス（チオアセトアミド）ペンタノエートのＴｃ−９９ｍキレート交換化(transchelated)テトラフルオロフェニル活性エステル誘導体を、所要に応じてかつ好ましくは、２ｍｌの水で希釈し、反応混合物を調整Ｃ−１８カートリッジ(J.T.Baker)に装入(loading)し、2.0 ｍｌの水で８回洗浄し、次いでカラムを５分間乾燥し、１００％アセトニトリルで溶離することにより、精製した。溶媒を定常的Ｎ₂流れの存在下でエバポレートした。次いで、0.15ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、0.15ｍｌの2.35ｍｇ／ｍｌアネキシンＶおよび0.2 ｍｌの0.2 Ｍ重炭酸塩（ｐＨ10.0）を添加して、Ｔｃ−９９ｍ−N₂S₂との結合体を生成した。室温において２０分後に、Ｔｃ−９９ｍ−N₂S₂−アネキシンＶ結合体を、ＰＢＳで平衡状態にしたＧ−２５セファデックス（ＳＥＰＨＡＤＥＸ，登録商標）（ＰＤ−１０）カラム（Pharmaciaから入手できる）に通すことにより精製した。複数個の画分（1.0 ｍｌ）を回収し、アネキシンＶを含有するこれらの画分をプールした。タンパク質濃度は２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収によって求めた。Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶ（３００〜３５０ｍｇ）結合体溶液は、注入前に、１ｍｌのＰＢＳ当たり１５〜２０ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する最終濃度において、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで希釈し、貯蔵した。実施例II アネキシン−N₃Sキレート結合体を放射性標識する方法Ｓ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシルグリシン（Ｓ−ベンゾイルＭＡＧ₃）を、米国特許第４，９６５，３９２号明細書に記載されている方法に従って調製した。次いで、２５ミクログラムのＳ−ベンゾイルメルカプトアセチルグリシルグリシルグリシンを0.10ｍｌの1.0 Ｍの炭酸緩衝液（carbonate bu ffer）（ｐＨ１２）に溶解する。次いで、７５ｍＣｉのパーテクテートＴｃ−９９ｍを約1.0 ｍｌ次いで1.0 ｍｇの新たに溶解した亜二チオン酸ナトリウム（１０ｍｇ／ｍｌ）中に添加する。この混合物を１００℃±４℃において３分間加熱し、次いで氷浴中で５分間冷却してＴｃ−９９ｍ−ＭＡＧ₃を生成する。この生成物はＩＴＬＣ（ＣＨ₃ＣＮ溶媒）；陰イオン交換ＨＰＬＣ（ベックマンＡＸ（商品名）、１０ミクロン、0.01ＭＮａ₂ＳＯ₄／0.01ＭＮａ₃ＰＯ₄、ｐＨ7.0 ）、および逆相ＨＰＬＣ（ベックマンＯＤＳ（商品名）、５ミクロン、２％ＣＨ₃ ＣＮ／0.01ＭＮａ₃ＰＯ₄、ｐＨ7.0）によって決定する。次いで、カーボキシレートの形態のＴｃ−９９ｍ−ＭＡＧ₃錯体をエステル化し、0.20 ｍｌの１ＮＨＣｌ、0.30ｍｌの0.2 Ｍリン酸緩衝液ｐＨ6.0、0.01ｍｌの９０％ＣＨ₃ＣＮ中の10.0ｍｇの２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（ＴＦＰ）および0.10ｍｌの９０％ＣＨ₃ＣＮ中の12.5ｍｇのＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド・ヒドロクロリド）と組み合わせ、これらの反応体を室温（２５℃±２℃）において１時間混合する。この時点で、Ｔｃ−９９ｍ−ＭＡＧ₃−ＴＦＰエステルの収量をＩＴＬＣ（ＣＨ₃ＣＮ溶媒）；陰イオン交換ＨＰＬＣ（ベックマンＡＸ、１０ミクロン、０．０１ＭＮａ₂ＳＯ₄／0.01ＭＮａ₃ＰＯ₄、ｐＨ7.0）；および逆相ＨＰＬＣ（ベックマンＯＤＳ、５ミクロン、３４％ＣＨ₃ＣＮ／0.01ＭＮａ₃ＰＯ₄ 、ｐＨ7.0）によって求める。Ｃ−１８ベーカー(Baker)カラムを使用して調製物を精製する。この反応混合物を、必要に応じてかつ好ましくは、２ｍｌの水で希釈し、カラムに装入し、２回水で洗浄し、次いで１０％Ｃ₂Ｈ₅ＯＨ／0.01ＭＮａ₃ＰＯ₄、ｐＨ7.0で８回洗浄する。生成物をＣＨ₃ＣＮで溶離し、アネキシンＶとの結合体を形成する前に溶媒を除去する。活性エステルとアネキシンＶとの結合は、Ｔｃ−９９ｍ−ＭＡＧ３−ＴＦＰエステルにリン酸緩衝液ｐＨ9.5中のアネキシンＶを添加することにより行われる。この反応は少なくとも３０分間にわたって行われ、ＰＤ−１０ゲル濾過カラムに通すことにより所望の放射性標識アネキシン生成物が得られる。実施例III 放射アネキシンによる血栓の画像化Ａ．動物試料−ＬＡ血管血栓絶食している２５〜３０ｋｇのYorkshireブタを、テラゾール(Telazol)（５〜１０ｍｇ／ｋｇ）（AVECO Co.から市販されている）および市販されているアトロピン（１ｍｇ、Elkins-Sinn，Inc.，Cherry Hill，NJ）を筋肉投与することにより鎮静状態にした。スリタール(Surital)（２００ｍｇ）（アボット・ラボラトリーズから市販されている）麻酔薬を静脈内投与した。これらの試験動物に挿管し、1.5 〜２％のハロタン（アボット・ラボラトリーズから市販されている）により吸入麻酔をかけ、深いレベルの麻酔および生理学的動脈血ガスを得るのに充分なＯ₂を与えた。ワニ口クリップ電極を使用して連続的な心電図モニターを行った。頸部で切開（cut down）し、８フレンチカテーテル（8 french cathete r）（USCI Co，Billerica，MA）を右総頸動脈に挿入して血圧および動脈血ガスをモニターし、また血液試料を採取した。これらのブタを右側面位に置き、側部開胸を行って心臓を露出させた。切開部を開胸牽引子によって開いた状態に保持した。心膜を開き、左心耳（left atria l appendage）を血管クロスクランプ(cross-clamp)によって左心房から単離した。ゴム付鉗子を使用して左心耳を穏やかに圧搾した。５分後に、リシノールエート(ricinoleate)（１ｍｇ、ICN Pharmaceuticals，Costa Mesa，CA）およびトロンビン（５０ｍｇ、Johnson and Johnson Co.，Arlington，Texas）をＬＡＡ（左心耳）中に２７Ｇａ針を用いて注射した。クロスクランプを１０分後に取り除いた。圧搾損傷１時間後に、上述の実施例１に従って調製したＴｃ−９９ｍ−アネキシンＶを、耳静脈内に静脈内ボーラス(bolus)用量として投与した。次いで、静脈ライン（intravenous line）を生理食塩水で洗浄した。７匹の動物において、Ｉ−１２５標識オボアルブミンを、例えば、Frakerら、Biochem ．Biophys．Res. commun. 80:849-57、1978に記載されている方法によって、非特異的コントロール調製物として投与した。Ｉ−１２５放射性標識オボアルブミンは、６００μｇのオボアルブミン（Sigma Chemical Co.，St．Louis，Missouri）およびＮａＩ −１２５（２ｍＣｉ，0.92nmol）を使用して、ヨードゲン(Iodogen)法によって調製した。画像化は下記のようにして行った。実験操作（普通約１５０分間）の終りに、動物がなお全身麻酔状態にある間に、静脈内ボーラス用量の８０mEqのＫＣｌによって屠殺した。最終血液試料を適切な計数のために採取した。心臓を迅速に切取り、血液がなくなるまで洗浄し、切り裂いて適切な計数のための試料とした。いくつかの動物において、頸動脈、肺臓、肝臓、脾臓、筋肉および腎臓のさらなる試料を得た。Ｂ．コントロール。異なる５種のタイプのコントロール：開放胸部シャム（ch est sham）；密封胸部シャム；オボアルブミン；インジウム血小板（indium pla telet）；および非特異的Ｔｃ−９９ｍ−標識抗体を使用した。１．開放胸部シャム。３匹の動物において、心臓を上述のように露出させたが、左心房は単離せず、圧搾せず、あるいはリシノールエート／トロンビンを注射しなかった。コバルトマーカーによるマーカー画像（marker image）を後述のようにして形成し、ＬＡＡを露出させてから３０〜６０分後にＴｃ−９９ｍ−アネキシンＶを注射した。画像化および試料採取は上述のＡに記載したと同様に行った。２．密閉胸部シャム（closed chest sham）。７匹の動物において、耳静脈ラインを確認した。開胸は行わなかった。鎮静にし麻酔をかける操作は上述のＡに記載したと同様に行った。Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶ（＋／− Ｉ−１２５オボアルブミンまたはＩｎ−111−血小板のような他のコントロール放射性核種）を投与し、画像化を行った。３．オボアルブミン。７匹の動物において、陰性コントロールタンパク質としてＩ−１２５オボアルブミンを投与した。オボアルブミンはアネキシンと類似の分子のサイズを有し、僅かに遅い血中クリアランス(clearance)を示す。４．インジウム血小板。７匹の動物において、陽性の良好な計数標識としてＩｎ−111 血小板の標識化を行った。Ｉｎ−111−放射性標識血小板は、Stratton ら、Am ．J．Cardiol. 47:874,1981および Strattonら、Circulation 69:561,198 4に記載されている方法に従って調製した。Ｉｎ−111−血小板の血清半減期が長いため、画像化は行わなかった。５．非特異的Ｔｃ−標識抗体。１回の実験において、左心房（ＬＡ）血栓を上述の方法によって生成したが、Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶは投与しなかった。その代わりに、ＮＲ−ＬＵ−１０と呼ばれている抗体のＴｃ−９９ｍ−Ｆａｂ画分を投与した。ＮＲ−ＬＵ−１０は分子量１５０キロダルトンのＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体であり、この抗体は大部分の癌において発現されている約４０キロダルトンの糖タンパク質抗原を認識する。ＮＲ−ＬＵ−１０は良好な特徴付けられている汎ガン腫（pancarcinoma）抗体であり、ヒトの臨床試験において５６５人以上の患者に安全に投与されている。ＮＲ−ＬＵ−１０−Ｆａｂは既知技術によって調製され、J ．Nucl．Med. 32:1445-51,1991記載の方法に従って、放射性標識アネキシンＶの調製に関する実施例１記載の改良Ｃ−１８ベーカー精製Ｔｃ−９９ｍ−N₂S₂−ＴＥＰ法により放射性標識される。このＴｃ−９９ｍ−Ｆａｂ結合体を適切な計数および画像化の両方に対する陰性コントロールとした。Ｃ．画像化。ＬＡＡの露出表面上にコバルトマーカーを載せ、開胸牽引子に取り付けた手術用テープで所定位置に保持した。このテープを調整してマーカーが全般的に心臓周期毎にＬＡＡと共に動くようにした。マーカー画像を、それぞれ平面方向に見て１０秒間にわたって、また断層撮影切片毎に１０秒間にわたって得た。次いで、コバルトマーカーを除去した。一般的な目的に用いられるコリメータを装置したジェネラル・エレクトリック・スターポート(General Electric Starport)カメラを使用してＴｃ−９９ｍ画像を得た。５分間平面方向で撮影し、続いて左側方、４５ＬＡＯ方向、および前方（anterior）から見て撮影を行った。これらの撮影に次いで１０分間断層撮影を行った。３回の平面撮影および１回の断層撮影から成るこのフルセットを全体で５セットになるまで繰り返した。逐次画像化を行う全過程において、ブタまたは画像化用ガントリ（imaging gantry）を動かさないように注意した。画像を、ＶＡＸメインフレーム系の従属装置であるミクロデルタ（Microdelta ）コンピュータに記録した。画像はテープまたはＶＡＸハードドライブに貯蔵した。平面画像の解析は、第１のマーカーを使用して画像を検査する工程と、マーカー位置をビューイング末端スクリーン上に記録する工程とからなる。Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶ注射後に得られた最初の画像を使用して心臓の血液プールを規定した。これに続く各画像を、マーカーおよび対照として当初の血液プールを使用して観察し、解析した。各画像を（＋）、（±）または（−）で評価した。１３匹の動物は上述のようにして生成した左心房血栓を有し、これらの動物を上述のようにして画像化した。１２匹の動物は画像化のために注射したＴｃ−９９ｍ−アネキシンＶを有し、一匹の動物はコントロールとして注射した非特異的Ｔｃ−９９ｍ−Ｆａｂを有していた。密閉胸部の画像化を７匹の動物について心房を損傷することなく行い、開放胸部シャム実験を３匹の動物について行った。心房血栓を有する動物において、Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶを投与後３５分未満で撮影したすべての平面画像は（−）であった。７０分間を超えて撮影した心房血栓平面画像のうち９つは（＋）であり、１つは（±）であり、２つは（−）であった。心房血栓の断層撮影画像はすべて、注射後２時間超の画像化の時点において、（＋）（ｎ＝１０）または（±）（ｎ＝２）であった。Ｔｃ−９９ｍ− アネキシンＶの投与後に平面画像が（＋）になった平均時間は、８２分（３５〜１３５分）であった。密閉胸部コントロール動物はいずれも（＋）の画像を有していなかった。３つの開放胸部シャムの内の１つは８５分で（＋）の画像を有していた。この偽の（＋）は外科的に生じた血栓の産生に由来すると思われる。これらの結果は、Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶを静脈内投与すると、結合体投与後短時間以内に心房血管血栓を同定する診断用画像を得ることができることを示す。Ｄ．試料採取。上述のような試料（血液および組織の両方）を秤量し、Ｔｃ −９９ｍを直ちに計数するためにバイアルのなかに入れた。Ｔｃ−９９ｍが壊変（代表的な例では５〜７日間で）した後、試料を再度アッセイしてＩ−１２５のカウントを得た。各バイアルについて１分間計数した。カウントを、壊変について、次いで重量について補正し、カウント／分／グラムとして記録した。次いで、各試料についてカウント／分／グラムを、最終血液試料のカウント／分／グラムで割ることによって標準化した。次いで、各試料についての結果から最後の血液試料との比を計算し、動物間で意味のある比較ができるようにした。この方法を所定の実験におけるすべての放射性核種について行った。種々の組織試料についての適切な計数比を得た。損傷を受けた組織および血栓については、通常同じ動物から多数の試料を採取した。これらの場合には、任意の１個の試料についての最大比を、採取した全試料の平均値と共に報告する。各動物における最大値を全動物について平均し、これを最大Ａｎｘ−Ｖ比として報告する。これらの結果は、Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶが心房血栓および損傷を受けた左心房に優先的に局在し、最高の非標的局在化(highest non-target localizati on)が腎臓で起こっていることを示す。腎臓レベルは少なくとも部分的に腎臓ルートを経由するＴｃ−９９ｍ−アネキシンＶの分泌を示す。実施例IV 放射性標識アネキシン−ガラクトース結合体Ａ．大腸菌における発現によるヒト胎盤からのアネキシンＶの調製アネキシンＶを、Funakoshiら、Biochemistry 26，5572-78,1987およびTaitら、Biochemistry 27，6268-76,1988に記載されているようにして、ヒト胎盤から９９％の最終純度まで精製した。別法として、以下の実験では使用しなかったが、大腸菌において発現させることにより、アネキシンＶを得た。この発現を以下のように行った。１．大量醗酵上清の調製。標準的な分子生物学の技術を使用して大腸菌においてアネキシンを発現させた。特に、アネキシンＶ cDNAのタンパク質コード領域（上述のFunakoshiらの文献を参照）をプラスミドpET-12a(Novagen，Madison WI)のＮｄｅＩ／Bam ＨＩ部位に挿入した。選定したプラスミドを使用して大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）を形質転換させた。個々のコロニー（クローン）を、Sambrookら、「Molecular Cloning Laborato ry Manual」、第２版、Cold Springs Harbor Laboratory Press、1989に記載されているようにして、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンまたはカルベニシリンを含有するLuria Brothプレート上で単離した。産生させるために、所望のプラスミドを含有する選定したクローンの培養物を、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン（ Sigma Chemical Co.，St．Louis，Missouriから市販されている）を含有するTer rific Broth（Tartofら、Bethesda Res ．Lab．Focus，9:12,1987参照）中で振とうしながら、３７℃において一夜生育させた。この培養物を同じ培地中で１：２０に希釈し、３７℃において振とうしながら１８〜２４時間インキュベーションした。細菌を遠心分離によって採取し、等容積の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８で一回洗浄し、−２０℃においてペレットとして貯蔵した。これらのペレットを溶解し、１０〜１５％（ｗ／ｖ）の冷温の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ，０．０２ＭＮａ₄ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２で再懸濁させた。精製した懸濁液を氷上で４分間超音波処理し、遠心分離し、次いで上清を− ７０℃で貯蔵した。２．大量培養上清からのアネキシンＶの精製。溶解後に、０．１μｍ中空繊維ユニット（A/G Technology，Needham，MAから市販されている）を使用して濾過し、濃塩化ナトリウムを使用して導電率を０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ，０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８に等しくなるように調整した。ポリエチレンイミン− ＷＰ（J.T．Baker，Phillipsberg，NJ）を０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ，０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８中に懸濁させ、１０ｍｌの大量培養上清当り１ｇの樹脂を濾過後の上清に添加した。３０分間かきまぜた後に、上清を取り出し、０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８中に移し、次いで同じ緩衝液中で平衡状態になっているＱ−セファローズ（SEPHAROSE,登録商標）ＨＰカラム（Pharmacia，Piscata way，NJ）に適用した。このカラムを段階的勾配の０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムで展開させた。サイズ排除ＨＰＬＣによって各画分をアネキシンＶについてアッセイし、適当な大きさのＡ₂₈₀吸収物質を含有する画分を集めた。なかば精製されたアネキシンＶをＰＢＳ中に移し、限外濾過によって濃縮した。ＰＢＳ中で平衡状態になっているセファクリル(SEPHACRYL，登録商標)１００ＨＰ（Parmacia ）を使用してゲル濾過を行い、精製されたタンパク質を得た。タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整し、無菌０．２μｍ濾過を行い、２〜８℃で貯蔵した。Ｂ．ガラクトースによるアネキシンＶの誘導体化。Leeら、Biochemistry 15:6 268-76,1976の一般的な方法を使用した。ａ．２−イミノ−２−メトキシエチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの調製。シアノメチル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ− ガラクトピラノシド（Sigma Chemical Company，St．Louis，MOから市販されている）の１．０Ｍ溶液を、この化合物１．８３ｇ（４．５mmole）を４．５ｍｌの無水メタノール中に、５０℃に加熱しながら溶解することにより調製した。この溶液を５０℃に維持し、ナトリウムメトキシドの２５％メタノール溶液（Aldr ich Chemical Company，Milwaukee，WIから市販されている）０．１ｍｌ（0.45m mole）を連続的に撹拌しながら添加した。５０℃において６時間後に、メタノールを減圧下に除去して、ガラクトースメチルイミデートを無色粘性油状物質として得た。ｂ．アネキシンＶのガラクトシル化ガラクトースメチルイミデートをアネキシンＶに対して３００：１、１５０：１および７５：１のモル比で使用した。モル比３００：１で使用した場合には、メタノール中の３．３５ｍｇのガラクトースメチルイミデートを窒素流下に油状物質に溶解させた。この油状物質に、０．０５ＭＨＥＰＥＳ緩衝液（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ・ケミカル社から市販されている）、ｐＨ７．４および０．０４ｍｌの０．５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５中の２．５３ｍｇのアネキシンＶを添加した。この溶液を、反応容器を転倒させることにより、１時間混合し、次いで室温で一夜（約１８時間）静置した。この反応混合物を０．４ｍｌのＰＢＳで希釈し、透析チューブ（カットオフ分子量６０００〜８０００）に移し、ＰＢＳに対して２４時間透析した。本物質を透析バッグから取り出した後に、溶液を０．２μｍシリンジ（syringe）フィルターに通して濾過した。他の使用レベルについても同様に実施した。Ｃ．ガラクトース−誘導体化アネキシンＶの特徴付け。アネキシンＶの１ｍｇ／ｍｌ溶液について、０．６のＡ280を使用してタンパク質濃度を求めた。Hab eeb 、Analytical Biochemistry 14:328-36,1966に記載されているように、トリニトロベンゼンスルホン酸を使用して、ガラクトースメチルイミデートとの反応の前および後におけるアネキシンＶにおける反応性アミンの総数を測定することにより、１個のアネキシンＶ分子当りのガラクトース残基の数を求めた。活性型血小板に結合するガラクトース−改変アネキシンＶの能力は、Thiagaraja nおよびTait、J ．Biol．Chem. 265:17240-43,1990の方法に従って、新たに単離したヒト血小板に対する未改変 125Ｉ放射性標識アネキシンＶの結合を阻止する能力によって、アッセイした。以下の表は、競合アッセイの結果を、絶対値（左欄）および未改変アネキシンＶに対する１００％に標準化した値（右欄）の両方について示した。Ｄ．Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶ−ガラクトースの調製。アネキシンＶ−ガラクトースを、Kasinaら、J ．Nucl．Med. 32:1445-51,1991に記載されているように、ジアミドジメルカプチド（N₂S₂）を使用して、テクネチウム−９９ｍで放射性標識した。あらかじめ形成させた活性エステルキレートを２．０ｍｌの水で希釈し、Fritzbergら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 85:4025-29,1988に記載されているように、アネキシンＶ−ガラクトースとの結合体を精製する前に、改良調整Ｃ−１８カラム(J．T．Bakerから市販されている)を使用して精製し、２．０ｍｌの水で８回洗浄し、次いでこのＣ−１８カラムを乾燥し、１００％アセトニトリルで溶離させた。溶媒をＮ₂定常流下で除去した。次いで、Ｔｃ−９９ｍ −N₂S₂−ＴＦＰエステルとの結合体を精製するために、０．１５ｍｌのＰＢＳ，０．３５ｍｌの１．０ｍｇ／ｍｌアネキシンＶ−ガラクトース（４．７：１のガラクトース：アネキシンＶ）、および０．２ｍｌの０．２Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０．０）を添加した。常温において２０分経過した後に、Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶ−ガラクトース結合体を、ＰＢＳで平衡状化したＧ−２５セファデックス(SEPHADEX,登録商標)ＰＤ−１０カラム（Pharmaciaから市販されている）に通すことにより精製した。複数個の１．０ｍｌ画分を回収し、アネキシンＶを含有する画分をプールした。２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収によって、タンパク質濃度を求めた。結合体の放射化学的収率は３５．３％であった。１２％ｗ／ｖトリクロロ酢酸水溶液中で展開させたシリカゲル含浸ガラス繊維シートにおけるインスタント薄層クロマトグラフィーによってアッセイした際に、放射化学的純度は９９．８％であった。ＩＴＬＣシートを２個の半部に切断し、各半部についてγ線計数器または線量キャリブレータで計数を行った。放射性標識アネキシンＶ−ガラクトース結合体は最初に沈澱し、この溶媒系においてタンパク質と結合していない放射能は溶媒と共に移動した。Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶ−ガラクトース結合体（３００〜３５０ μｇ）溶液を希釈し、ウシ血清アルブミン（Sigma Chemical Co.から市販されている）を含有するＰＢＳ中に、１５〜２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で貯蔵し、その後静脈注射を行った。Ｅ．Ｔｃ−９９ｍ−アネキシンＶおよびＴｃ−９９ｍ−アネキシンＶ−ガラクトースの血中クリアランス。先に実施例IIIに記載の動物モデルを使用して上述の分子の血中クリアランスを評価した。Ｎ＝２０のブタにおいて、血中クリアランス（図２）は二相(biphasic)（二次指数(biexponential）曲線：％ＩＤ／ｇａ＝０．０３８９ｔ１／２ａ＝９．６分％ＩＤ／ｇｂ＝０．０３００ｔ１／２ｂ＝４６分ａ＋ｂ＝０．０６８９であり、従って血液１ｇ当りの注入量の５７％（０．０３８９／０．０６８９）は急速なａ相で消失(clear)し、ＩＤ／ｇの４３％は緩徐なｂ相で消失する。また、ブタにおけるＴｃ−９９ｍ−アネキシンＶ−ガラクトースの血中クリアランス（図２）も、二相（二次指数）曲線：％ＩＤ／ｇａ＝０．０３１３ｔ１／２ａ＝３．５分％ＩＤ／ｇｂ＝０．００４５ｔ１／２ｂ＝１６０分ａ＋ｂ＝０．０３５８であり、従って血液１ｇ当りの注入量の８７％（０．３１３／０．０３５８）は早期のａ相において極めて迅速に消失する。この一層迅速なクリアランスは血液におけるバックグラウンド放射能、すなわちノイズを減少させ、従ってＳＮ比を改善した。従って、血栓の画像化は一層短い時点で達成することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｍ 5:00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ

Claims

【特許請求の範囲】１．診断用画像化剤によって放射性標識するためのアネキシン含有結合体であって、アネキシン、１個以上のガラクトース残基、およびアネキシンと結合しているN₂S₂キレートを含むことを特徴とする、アネキシン含有結合体。２．前記アネキシンがアネキシンＶであることを特徴とする、請求項１に記載のアネキシン含有結合体。３．次式：（式中のｎは１以上の数を示す）で表されることを特徴とする、請求項１に記載のアネキシン含有結合体。４．ｎが１〜約５個のガラクトース残基の数を示すことを特徴とする、請求項１に記載のアネキシン含有結合体。５．血管血栓を画像化するための放射性標識アネキシン−ガラクトースであって、アネキシン；１個以上のガラクトース残基；アネキシンと結合しているN₂S₂キレート；および該キレートによって錯体化されている診断用放射性核種を含むことを特徴とする、放射性標識アネキシン−ガラクトース。６．前記アネキシンがアネキシンＶであることを特徴とする、請求項５に記載の放射性標識アネキシン−ガラクトース。７．次式：（式中のｎは１以上の数を示し、そしてＭは放射性核種を示す）で表されることを特徴とする、請求項５に記載の放射性標識アネキシン−ガラクトース。８．放射性核種がＴｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｐｄ−１００、Ｂｉ−２１２、Ｐｂ−２１２、Ｐｄ−１０９およびＣｕ−６７からなる群から選択される核種であることを特徴とする、請求項５に記載の放射性標識アネキシン −ガラクトース。９．前記放射性核種がＴｃ−９９ｍであることを特徴とする、請求項５に記載の放射性標識アネキシン−ガラクトース。１０．ｎが１〜約５個のガラクトース残基の数を示すことを特徴とする、請求項５に記載の放射性標識アネキシン−ガラクトース。１１．前記放射性標識アネキシン−ガラクトースの結合活性が本来のアネキシンの結合活性より２０％以上大きいことを特徴とする、請求項５に記載の放射性標識アネキシン−ガラクトース。