【発明の詳細な説明】
リゾチーム分解性の生体材料
〔発明の分野〕
本発明は、生物活性薬剤(bioactive agent)を供給するためのデリバリー担体
に関し、特に、生物活性の眼科薬を目に供給するためのデリバリー担体に関する
。
〔発明の背景〕
眼帯(eye bandage)および薬剤供給手段として使用するための、コラーゲン製
の角膜シールドが知られている。これらは持続的に眼科薬の供給を与えるので、
点眼剤の頻繁な投薬よりも有利である。また、供給量が低く、従って全身投薬よ
りも副作用が低いという利点が得られる。シールドからの薬剤放出の速度は、部
分的にはシールドの溶解速度によって決定される。コラーゲンシールドの薬剤放
出速度はコラーゲナーゼ酵素の活性レベルによって決定されるが、この活性レベ
ルは個々人によって大きく変化する可能性がある。これによってコラーゲンシー
ルドの問題、即ち、溶解時間が広範囲に変化し、従って投薬量が変化し易いとい
う問題が生じる。
リゾチーム酵素は、比較的高い一定のレベルで涙の中に存在していることが知
られているが、コラーゲンはリゾチーム分解性ではない。天然ポリマーのキチン
はリゾチームの基質であるが、体液中には容易に溶解しない。しかしながら、本
発明は、可溶性で且つリゾチーム分解性のキチン誘導体を含有するデリバリー材
料を提供する。
従って、本発明は、リゾチーム分解性のキチン誘導体を含有する複合材料でで
きた、角膜シールドのような薬剤デリバリー担体を提供する。本発明はまた、イ
ン・ビトロにおいてリゾチームで溶解される、キチン誘導体およびコラーゲンの
混合物を含んだ担体材料を提供する。リゾチームは正常な涙の成分であるから、
その加水分解活性に対して感受性を有するシールドは、コラーゲナーゼによって
溶解されるに過ぎないシールドと比較して、溶解速度が一定かつ再現性を有する
という利点をもっている。
本発明による薬剤デリバリーの主要なメカニズムは、担体の酵素的加水分解に
よる持続的放出によるものである。重要な酵素であるリゾチームの存在量は、炎
症領域において増大する。従って、必要性の高い領域において大きな速度で放出
されるように、炎症と戦うための薬剤を担体の中に混合することは有利である。
従って、本発明の目的は、生物活性薬剤を体液または組織の中へ徐々に放出す
るための、リゾチーム分解性デリバリー組成物を提供することである。
本発明のこの目的および他の目的は、以下の説明および添付の請求の範囲、並
びに本発明の実施から明らかになるであろう。
〔発明の概要〕
本発明は、生物活性薬剤を調整されて(controlled)放出するための、リゾチー
ム分解性デリバリー担体の製造方法を提供する。この方法は、水溶性のキチン誘
導体を含む担体組成物を架橋する工程と；必要に応じて、架橋された担体組成物
を所望の形状に成形する工程と；次いで、架橋された担体組成物を生物活性薬剤
に接触させ、該生物活性薬剤を前記担体組成物に可逆的に結合させる工程とを有
する。架橋は、部分的な真空中において、ＵＶ照射、またはエチル・ジメチルア
ミノプロピルカルボジイミドのような架橋剤の使用によって行うのが好ましい。
或いは、生物活性薬剤は、架橋の前に担体組成物に結合される。
ここで用いる「結合親和性」の用語は、遊離薬剤の量に対する結合薬剤（生物
活性薬剤）の比率を意味する。ここで、
［結合薬剤］＝［薬剤の溶液と接触して平衡化された生体ポリマー試料中に存在
する薬剤の総量］−［生体ポリマーによって吸収された溶液の容量×吸収されず
に残った溶液中の薬剤濃度］
［遊離薬剤］＝［生体ポリマー試料中に存在する薬剤の総量］−［結合薬剤］で
ある。従って、
結合親和性＝［結合薬剤］／［遊離薬剤］
＝［結合薬剤］／（［全薬剤］−［結合薬剤］）
である。
特に好ましい組成物は、0.5よりも大きい結合親和性、好ましくは1.0以上の
結合親和性を有している。有用な組成物は、薬剤に対して1.0〜5.0の範囲の結合
親和性を有している。
高い結合親和性によって、該材料は溶液から充分な量の薬剤を結合するから、
デリバリー装置を製造した後で薬剤を組み込むことが可能になる。この特徴がな
ければ、持続的な放出特性を与えるためには、該装置を製造している間にその中
に薬剤を取り込むことが必要となり、滅菌製品の製造は複雑になるであろう。充
分な薬剤親和性とは、当該装置の中に吸収された薬剤が、単純な流体平衡を介し
て存在する薬剤の量よりも大きいこと、即ち、当該装置の中の薬剤濃度が周囲の
流体の中の薬剤濃度よりも大きいことを意味する。上記のように、流体平衡を介
して存在する「遊離の」薬剤の量を、当該装置中の薬剤の全量から差し引けば、
「結合した」薬剤の量についての値を決定することができる。結合された量を吸
収された薬剤の全量で除算することにより、結合フラクション(fraction bound)
、Ｆｂが与えられる。当該装置が薬剤に親和性を有していれば、Ｆｂはゼロより
も大きくなるであろう。親和性が大きくなるにつれて、Ｆｂは1.0に近づくであ
ろう。
〔図面の簡単な説明〕
図１は、ＣＭ−キチンのリゾチームとの反応による粘度低下を示すグラフであ
る。図２は、幾つかのＣＭ−キチン−コラーゲン角膜シールドの酵素加水分解の
速度を示すグラフである。
図３は、リゾチームによるＣＭ−キチン微小球の開裂速度を示すグラフである
。
図４は、炭酸脱水酵素阻害剤のＣＭ−キチン微小球への結合量を示すグラフであ
る。図５は、ＣＭ−キチン微小球へのアプロチニン(aprotinin)の結合量を示す
グラフである。
図６は、ＣＭ−キチン微小球からのチトクロームＣの放出を示すグラフである
。
〔発明の詳細な説明〕
生物活性薬剤を調整されて放出させるための本発明によるリゾチーム分解性デ
リバリー担体は、リゾチーム分解性の水溶性キチン誘導体を含有する薬剤放出材
料を、架橋剤で処理することによって形成することができる。
本発明に従って使用される薬剤放出材料には、６−水酸基がキチンを水溶性に
する置換基で修飾されたキチン誘導体が含まれるが、これに限定されるものでは
ない。好ましい材料は、６−Ｏ−カルボキシメチルキチンである。薬剤放出材料
はまた、キチン誘導体の混合物とコラーゲンまたは他のコラーゲナーゼ分解性コ
ラーゲン誘導体との混合物を含むことができる。好ましいキチン：コラーゲンの
比は、0.01：１〜100：１、好ましくは薬0.25：１〜４：１である。
当該デリバリー担体の厚さは、望ましい薬剤投与量および放出の持続時間に応
じて、所望により変化させることができる。通常、適切なマトリックス厚さは、
約0.02mm〜1.0cm の範囲であろう。角膜シールドについては、その厚さは、典型
的には水和前で0.04〜0.06mmである；水和によって4〜9倍に増大する。
薬剤放出物質に対する架橋剤の比は、特定のキチンに部分的に依存するであろ
う。一般に、架橋材の薬剤放出材料に対する重量比として、約20：１〜約0.5：
１を用いるのが有用である。
ここでの開示から、架橋された薬剤放出材料の架橋の程度、厚さおよび／また
は形状の全てを、架橋された生体ポリマーからの生物活性薬剤の所望の放出プロ
ファイルが得られるように制御し得ることが理解されるであろう。
架橋された薬剤放出材料は、架橋の前に、モールドまたはキャスティングによ
って形成すればよく、或いは架橋の後に、切断により所望の形状に成形してもよ
い。次いで、架橋された材料には所望の生物活性物質が負荷される。これは、所
望の生物活性薬剤との間で、キチンおよび／またはコラーゲンのイオン性部位を
含むイオン結合もしくは疎水結合によって、またはその両者によって生じるもの
と思われる。生理活性物質は、抗生物質、例えば成長因子のような巨大分子、抗
菌剤、抗痙攣剤、何れかの他の生物学的生物活性薬剤であればよい。例えばエフ
ェドリン、デスオキシエフェドリン(desoxyephedrine)、フェニルエピネフィリ
ン、エピネフィリン等のようなアドレナリン作用性薬剤；フィゾスチグミンやネ
オスチグミン等のようなコリン作動性薬剤；アトロピン、メタンセリン(methant
heline)、パパベリン等のような抗痙攣剤；フルフェナジン(fluphenazine)、ク
ロルプロマジン、トリフルプロマジン(triflupromazine)、メフェネシン(mephen
esin)、メプロバメート(meprobamate)のようなトランキライザーお
よび筋弛緩剤；アミトリプチリン(amitriptyline)、ノルトリプチリン(nortript
yline)等のような抗鬱剤；ジフェンヒドラミン、ジメンヒドリネート(dimenhydr
inate)、トリペレンアミン(tripelennamine)、ペルフェナジン(perphenazine)、
クロルプロフェナジン(chlorprophenazine)、クロルプロフェンピラジミン(chlo
rprophenpyradimine)等のような抗ヒスタミン剤；ラウヴォルフィア、レセルピ
ン等のような血圧降下剤；ベンドロフルメチアジド(bendroflumethiazide)、フ
ルメチアジド、クロロチアジド、アミノトレート(aminotrate)、プロプラノロー
ル、ナドロール(nadolol)、プロカインアミド等のような心臓薬；カプトプリル(
captopril)およびエナラプリル(enalapril)のようなアンジオテンシン変換酵素
；テオフィリンのような気管支拡張剤；テストステロン、プレドニゾロンのよう
なステロイド剤；抗菌剤、例えばスルファジアジン、スルファメラジン(sulfame
razine)、スルファメタジン(sulfamethazine)、スルフイソオキサゾール(sulfis
oxazole)等のようなスルホンアミド、クロロキン等のような抗マラリア剤、テト
ラサイクリン、ナイスタチン、ストレプトマイシン、セファラジンおよび他のセ
ファロスフォリン類、半合成ペニシリン類、グリセオフルビン等のような抗生物
質；抱水クロラール、フェノバルビタールおよび他のバルビツレート類、グルテ
チミド(glutethimide)のような鎮静剤；イソニアジド等のような抗結核剤；アス
ピリン、アセトアミノフェン、フェニルブタゾン、プロポキシフェン、メサドン
(methadone)、メペリジン(meperidine)等のような解熱剤が挙げられる。これら
の物質は、遊離の化合物または塩（例えば酸付加塩、アルカリ金属塩のような塩
基性塩など）の何れかの形で用いられることが多い。眼科的用途のための好まし
い薬剤は、抗生物質、ステロイド薬および抗緑内障薬である。同様のもしくは異
なった生理学的活性を有する他の治療剤もまた、本発明の範囲内にある薬学的製
剤に用いることができる。典型的には、適切な溶媒に溶解した一以上の生物活性
薬剤は、浸漬によって薬剤放出材料と接触される。その付加量(loading)は、薬
剤放出材料による生物活性薬剤の取り込みに基づいて容易に測定できる。
薬剤放出材を形成するための好ましい方法においては、一以上の生物活性薬剤
を適切な濃度、典型的には約0.1〜2重量％で水に溶解し、薬剤放出材を約10分
〜240分間その中に浸漬する。次いで、この材料は周囲温度（約20〜25℃）で使
用できる状態になる。
別の好ましい方法においては、生物活性薬剤および薬剤放出材を架橋する前に
、水性溶媒中に溶解させる。薬剤：薬剤放出材の典型的な重量比は、溶液中にお
いて約1:100〜5:100 の範囲である。次いで、この薬剤放出材は、架橋剤で処理
することによって架橋される。キチンまたはコラーゲン誘導体は、例えばより親
水性になるように、或いはより疎水性になるように修飾して、生理活性剤に対す
る適切な結合特性を有するように調節することができる。例えば、架橋に先立っ
て、酸基のエステル化によってこのような修飾を行い、薬剤放出材をより疎水性
にすることができる。
以下の実施例は本発明を例示する目的で提示されるものであり、如何なる意味
においても本発明を限定するものではない。
実施例１
リゾチームとキチン誘導体との反応
次のキチン誘導体を試験した。即ち、カルボキシメチル-キチン、カルボキシ
メチル-キトサン、キトサン-ラクテート、およびキトサンである。各キチン誘導
体の１％溶液7.5ｇに対して、0.8ｍｌの100 ｍＭリン酸ナトリウム（pH7.0）を
添加し、ブルックフィールドモデルDVII粘度計(Brookfield model DVII viscome
ter)を用いて、粘度を時間の関数として測定した。時間ゼロにおいて、80μＬの
２％リゾチーム（または陽性コントロールとしてのキチナーゼ）を添加し、溶液
の粘度をモニターして、ポリマーの加水分解によって生じる粘度低下を検出した
。全ての場合において、酵素キチナーゼは１％ポリマー溶液の粘度の速やかな低
下をもたらした。ＣＭ- キトサン、キトサン- ラクテート、およびキトサンにつ
いてリゾチームを試験したときには、粘度の変化は見られなかった。図１に示す
ように、ＣＭ−キチンを基質に用いたときには、リゾチームは迅速な粘度低下を
生じさせた。
フェリシアニド還元糖試験(ferricyanide reducing sugar assay; Park，J．&
Johnson，M.，J．Biol．Chem．131: 149，1949）を用いて、ＣＭ- キチンのグ
リコシド結合の開裂で形成される還元糖を試験することにより、ＣＭ- キチン／
リ
ゾチーム反応を定量した。非連続的試験は、少なくとも0.25ｍｇ／ｍｌまでは、
時間および酵素濃度に関して直線的であると決定された。リゾチームの比活とし
て、0.097μｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇが得られた。
実施例２
キチン-コラーゲン・シールドの形成
ＣＭ- キチン(Maruben Corp．Tokyo)を1.25％でＨ２Ｏに溶解した。湿潤剤(Pl
uronic L-92)を0.006％にまで添加し、溶液を５μｍシリンジフィルタを通して
濾過した。この溶液を５０ｍｌの管内で脱ガスし、得られたポリマー溶液が40、
60、または80％ＣＭ- キチンとなるように、1.5〜2.3％のコラーゲンスラリーと
混合した。5.75ｍｇ／シールドをシールド型に充填し、室温で空気乾燥した。
115〜135 ℃の温度において、種々の時間、減圧での脱水熱架橋を行った。実施
例３
角膜シールドのリゾチーム分解
シールドの半分を、0.1％リゾチームを含有し且つ0.05または0.5ｍｇ／ｍｌの
コラーゲンを含む涙バッファー中と、0.1％リゾチームを含有し且つコラーゲン
を含まない涙バッファー中とにおいて、37℃で震盪する。これらのシールドを、
肉眼観察により５点から０点の尺度で評価する。ここでは、変化がないものを５
点、完全に溶解したものを０点とする。フェリシアニド還元糖試験を用いて、シ
ールドにおけるＣＭ- キチンポリマーの酵素加水分解を確認した。
コラーゲンに対するＣＭ- キチンの比率が高いシールド（75 ＆ 90％）は、
37℃で一晩インキュベートした後に殆ど完全に溶解した。100％のＣＭ- キチン
膜は完全に溶解した。リゾチームおよびコラーゲナーゼの混合物は、コラーゲン
に対して如何なる比率のＣＭ- キチンを有するシールドをも溶解した。正常なレ
ベルの涙リゾチームの存在下で溶解時間を測定する追加の実験によって、ＣＭ-
キチン／コラーゲンの複合体からなるシールドは、100％コラーゲン製のシール
ドよりも再現性良く溶解し得ることが立証された。ＣＭ- キチン／コラーゲンの
複合体製シールドは、40、60、80％のＣＭ- キチン濃度で試験された。
24時間複合体シールドを処方するための理想的な条件は、80％のＣＭ-キチン
、20％のコラーゲン、130 ℃で15時間のＤＨＴ架橋、およびＥｔ０滅菌であるよ
う
に思える。12時間シールドのためには、125℃で15時間架橋された80％ＣＭ- キ
チンが好ましい。
実施例４
キチン微小球の形成
室温で一晩攪拌し、ビルティス・ポリトロンホモジェナイザ(Virtis polytron
homogenizer）でホモジェナイズすることにより、ＣＭ- キチン（ノバケミカル
社、トロント、ロット番号1348、低粘度）を微小球に成形した。最終的な濃度は
1.25% であった。幾つかの場合には、ベックマンKA-21 ローターを用いて15,000
ｒｐｍで30分間ペレット化すること(pelleting)により、溶液を清澄化した。10
ｍｌの1.25％ＣＭ- キチンを２分間渦を巻かせることにより、2.5 ｍｌのスパン
80(Span-80)と混合した。45にセットしたビルティスポリトロンホモジェナイザ
を用いてトルエンを徐々に添加し、最終容量を55ｍｌにした。この懸濁液を、撹
拌しながら４倍容量のアセトン中に徐々に添加した。次いで、ＥＤＣ（１ｍｌの
水に予め溶解したもの）に４ｍｌのアセトンを混合し、これをＣＭ- キチンに対
するＥＤＣの比率を種々に変えながら、攪拌された懸濁液に添加した。２時間後
、微小球をペレット化してアセトンで再懸濁させることにより３回洗浄し、所望
のバッファーで３回洗浄した。1.0、0.75、および0.5の比率で架橋された微小球
は、夫々が0.1ｍｇ／ｍｌのリゾチームで一晩処理された、２部と１／２部とに
分割された。比率が0.5と0.75の微小球は溶解し、比率が1.0の微小球は元の体積
の約２倍に膨潤した。別の実験では、フェリシアニド還元糖試験を用いて、ＣＭ
- キチン微小球のグリコシド結合の開裂を定量した。微小球は、震盪水浴中にお
いて、37℃の涙バッファー中でインキュベートされた。反応には、0.1ｍｇ／ｍ
ｌのリゾチームが含まれていた。夫々の点は、２回の実験の平均である。反応は
、略３日で完結するに至るようである。図３。
実施例５
微小球ローディング
涙の中にはＣＭ- キチン微小球を分解するリゾチームが高レベルで存在してい
るので、目の疾患に使用される可能性のある二つの薬物への結合性について、微
小球を試験した。即ち、この二つの薬物は、緑内障のための炭酸脱水酵素阻害剤
と、角膜潰瘍のためのアプロチニンである。ＣＭ- キチン微小球／薬剤の結合性
は、スキャッチャード分析によって研究された。図４および図５に見られるよう
に、ＣＡＩおよびアプロチニンは、夫々0.53および0.25ｍＭのＫ４で微小球に結
合する。タンパクであるアプロチニンは、多分、10.5に近い等電点を有するその
カチオン性によって、ＣＡＩよりも更に緊密にポリアニオン性微小球に結合する
。
フラクション結合は、予め形成された微小球および既知容量の薬剤を室温で60
分間インキュベートし、次いで10Ｋ×ｇで５分間微小球をペレット化し、その上
清を、遊離の薬物濃度についてｕｖ吸収で試験するすることにより、カルボキシ
メチルキチン微小球を用いて測定された。結合した量は、上記で説明したように
して全量から計算される。
代表的な薬剤についてのフラクション結合を下記に示す。
実施例６
ＣＭ−キチン微小球からのタンパク放出
巨大分子は小分子の場合のような単純拡散による放出は起こり難いから、酵素
に触媒されたポリマーマトリックスの開裂による持続的な放出は、特に巨大分子
への適用性を有している。容易に検出可能なタンパクであるチトクロームＣを用
いたモデル系で、この持続的な放出を試験した。タンパ負荷の量は、20ｍＭのリ
ン酸バッファー（ｐＨ７）中で平衡化された微小球の50:50 スラリーの200 μｌ
を、１ｍｇ／ｍｌチトクロームＣの200μｌと混合することによって計算された
。微小球をペレット化した後、上清の中のタンパクを検量線から測定したところ
全量の0.5％であり、これは99.5％が微小球に結合されたことを意味している。
バッファー系は、歯周病に用いる可能性に合致するように選択された。唾液中に
おける主なイオンは、略１／３の生理学的強度のナトリウムおよび炭酸イオンで
あり、ｐＨは6.2〜7.4の範囲である。従って、50ｍＭの炭酸ナトリウムバッファ
ー(ｐＨ7.0)が用いられた。バッファー水の中で平衡化された微小球の50:50スラ
リー 100μｌを、１ｍｇ／ｍｌチトクロームＣの200 μｌと1.5時間混合した。
次いで微小球をペレット化し、最終濃度がｍｇ／ｍｇになるように、100 μｌの
上清をリゾチームで置換した。夫々の時点において、微小球を再度ペレット化し
、100 μｌを取り出し、チトクロームＣについて試験し、100 μｌのバッファー
中の新鮮なリゾチームを添加して抜き取った量を置換した。リゾチームを含まな
い対照についても並行して実施した。
図６は、リゾチームを含むバッファー中において、32時間に亘り、微小球から
タンパクが徐々に放出される状態を示している。タンパクのピークは、微小球を
一晩および週末まで(over the weekend)夫々放置したときに放出され、遅い放出
は1.5時間の時点では平衡に達しないことを示している。バッファーで処理され
た対照反応では、評価し得る量のタンパクは放出されなかった。
図６の反応が完結した後にリゾチームが対照反応に加えられて、タンパクが徐
々に放出され、これによって、リゾチームによる放出までタンパクを保持する微
小球の能力が示された。
これらの結果は、薬剤およびタンパクに結合するＣＭ−キチン微小球の能力を
明瞭に立証している。歯周病の環境において、タンパクは徹底した洗浄を通して
結合状態で残留することができ、またリゾチームの存在下で徐々に放出される。
チトクロームＣをモデルタンパクとして用いたが、その理由は、チトクロームＣ
は容易に検出可能で、正味の正電荷を有し、また正味の正電荷を有するペプチド
薬剤またはサイトカインと同様に挙動することが期待されるからである。このシ
ステムは、口の感染領域におけるリゾチームレベルが増大している歯周病の場合
に、このような化合物の持続的な放出を与える。
上記の説明および実施例は、単に本発明を例示するために与えられており、本
発明を限定するものではない。本発明の精神および本質を取り込んだ、上記実施
例の変形が当業者によってなされ得るであろうから、本発明の範囲は添付の請求
の範囲およびその均等物によってのみ限定されるものである。Description: FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a delivery carrier for delivering a bioactive agent, and in particular, to deliver a bioactive ophthalmic drug to the eye. And a delivery carrier for the same. BACKGROUND OF THE INVENTION Collagen shields made of collagen are known for use as eye bandage and drug delivery means. These provide an advantage over frequent dosing of eye drops because they provide a continuous supply of ophthalmic drugs. It also has the advantage of lower supply and therefore lower side effects than systemic dosing. The rate of drug release from the shield is determined in part by the dissolution rate of the shield. The rate of collagen shield drug release is determined by the level of collagenase enzyme activity, which can vary widely from individual to individual. This raises the problem of collagen shielding, that is, the dissolution time varies widely, and therefore the dosage is likely to vary. Lysozyme enzymes are known to be present in tears at relatively high and constant levels, but collagen is not lysozyme degradable. The natural polymer chitin, which is a substrate for lysozyme, does not readily dissolve in body fluids. However, the present invention provides a delivery material containing a soluble and lysozyme-degradable chitin derivative. Accordingly, the present invention provides a drug delivery carrier, such as a corneal shield, made of a composite containing a lysozyme-degradable chitin derivative. The invention also provides a carrier material comprising a mixture of a chitin derivative and collagen that is dissolved with lysozyme in vitro. Because lysozyme is a normal tear component, shields that are sensitive to their hydrolytic activity have the advantage of a constant and reproducible dissolution rate compared to shields that are only dissolved by collagenase. Have. The main mechanism of drug delivery according to the present invention is by sustained release by enzymatic hydrolysis of the carrier. Lysozyme, a key enzyme, is abundant in areas of inflammation. Therefore, it is advantageous to incorporate a drug into the carrier to combat inflammation so that it is released at a high rate in areas of high need. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a lysozyme-degradable delivery composition for slowly releasing a bioactive agent into a body fluid or tissue. This and other objects of the invention will become apparent from the following description and appended claims, as well as from the practice of the invention. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method for producing a lysozyme-degradable delivery carrier for controlled release of a bioactive agent. This method comprises the steps of: cross-linking a carrier composition containing a water-soluble chitin derivative; if necessary, molding the cross-linked carrier composition into a desired shape; Contacting the bioactive agent and reversibly binding the bioactive agent to the carrier composition. Crosslinking is preferably performed in a partial vacuum by UV irradiation or by using a crosslinking agent such as ethyl dimethylaminopropylcarbodiimide. Alternatively, the bioactive agent is bound to the carrier composition before crosslinking. The term "binding affinity" as used herein refers to the ratio of binding agent (bioactive agent) to the amount of free agent. Here, [binding drug] = [total amount of drug present in the biopolymer sample equilibrated in contact with the drug solution] − [volume of solution absorbed by biopolymer × solution left unabsorbed] Drug concentration in medium] [Free drug] = [Total amount of drug present in biopolymer sample] − [Binding drug]. Therefore, binding affinity = [binding agent] / [free agent] = [binding agent] / ([total agent]-[binding agent]). Particularly preferred compositions have a binding affinity greater than 0.5, preferably greater than 1.0. Useful compositions have a binding affinity for the drug in the range of 1.0 to 5.0. The high binding affinity allows the drug to be incorporated after the delivery device is manufactured because the material binds a sufficient amount of the drug from solution. Without this feature, providing a sustained release profile would require incorporating the drug into the device during its manufacture, which would complicate the manufacture of a sterile product. Sufficient drug affinity means that the drug absorbed into the device is greater than the amount of drug present via simple fluid equilibrium, i.e., the drug concentration in the device is Means greater than the drug concentration in the medium. As described above, the amount of “free” drug present via fluid equilibrium can be subtracted from the total amount of drug in the device to determine a value for the amount of “bound” drug. Dividing the amount bound by the total amount of drug absorbed gives the bound fraction, Fb. If the device has affinity for the drug, Fb will be greater than zero. As affinity increases, Fb will approach 1.0. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing a decrease in viscosity due to the reaction of CM-chitin with lysozyme. FIG. 2 is a graph showing the rates of enzymatic hydrolysis of some CM-chitin-collagen corneal shields. FIG. 3 is a graph showing the rate of cleavage of CM-chitin microspheres by lysozyme. FIG. 4 is a graph showing the amount of carbonic anhydrase inhibitor bound to CM-chitin microspheres. FIG. 5 is a graph showing the amount of aprotinin bound to CM-chitin microspheres. FIG. 6 is a graph showing the release of cytochrome C from CM-chitin microspheres. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION A lysozyme-degradable delivery carrier according to the present invention for regulated release of a bioactive drug is obtained by treating a drug-releasing material containing a lysozyme-degradable water-soluble chitin derivative with a crosslinking agent. Can be formed by Drug release materials for use in accordance with the present invention include, but are not limited to, chitin derivatives wherein the 6-hydroxyl group has been modified with a substituent that renders chitin water-soluble. A preferred material is 6-O-carboxymethyl chitin. The drug release material can also include a mixture of a mixture of chitin derivatives and collagen or other collagenase-degradable collagen derivatives. Preferred chitin: collagen ratios are from 0.01: 1 to 100: 1, preferably from 0.25: 1 to 4: 1. The thickness of the delivery carrier can be varied as desired, depending on the desired drug dosage and duration of release. Typically, a suitable matrix thickness will be in the range of about 0.02 mm to 1.0 cm. For a corneal shield, its thickness is typically 0.04-0.06 mm before hydration; hydration increases it by a factor of 4-9. The ratio of crosslinker to drug releaser will depend in part on the particular chitin. Generally, it is useful to use a weight ratio of crosslinker to drug release material of from about 20: 1 to about 0.5: 1. From the disclosure herein, the degree of crosslinking, thickness and / or shape of the cross-linked drug release material can all be controlled to provide the desired release profile of the bioactive agent from the cross-linked biopolymer. It will be appreciated. The crosslinked drug release material may be formed by molding or casting before crosslinking, or may be cut into a desired shape after crosslinking. The crosslinked material is then loaded with the desired bioactive agent. This may be caused by an ionic or hydrophobic bond containing the chitin and / or collagen ionic sites with the desired bioactive agent, or both. The bioactive agent can be an antibiotic, for example, a macromolecule such as a growth factor, an antibacterial agent, an anticonvulsant, or any other biologically bioactive agent. Adrenergic agents such as ephedrine, desoxyephedrine, phenylepinephrine, epinephrine and the like; Cholinergic agents such as physostigmine and neostigmine and the like; Atropine, methantheline, papaverine and the like Anticonvulsants; fluphenazine, chlorpromazine, trifluoropromazine, triflupromazine, mephenesin, tranquilizers such as meprobamate and muscle relaxants; amitriptyline, nortriptyline, etc. Such antidepressants; diphenhydramine, dimenhydrinate, tripelennamine, perphenazine, chlorprophenazine, chlorprophenpyradimine antihistamines such as mine), etc .; antihypertensives such as lauvorfia, reserpine, etc .; bendroflumethiazide, flumethiazide, chlorothiazide, aminotrate, propranolol, nadolol, procainamide, etc. Cardiac drugs such as captopril and enalapril; angiotensin converting enzymes such as captopril; enalapril; bronchodilators such as theophylline; steroids such as testosterone and prednisolone; antibacterials such as sulfadiazine and sulfamerazine. Sulfonamides such as sulfamethazine and sulfisoxazole, antimalarial agents such as chloroquine, tetracycline, nystatin, streptomycin, cepharazine and other Antibiotics such as phalosphorins, semi-synthetic penicillins, griseofulvin and the like; sedatives such as chloral hydrate, phenobarbital and other barbiturates, gluethimide; antituberculosis agents such as isoniazid; Antipyretics such as acetaminophen, phenylbutazone, propoxyphene, methadone, meperidine and the like can be mentioned. These substances are often used in the form of either free compounds or salts (eg, acid addition salts, basic salts such as alkali metal salts, and the like). Preferred drugs for ophthalmic use are antibiotics, steroids and anti-glaucoma drugs. Other therapeutic agents having similar or different physiological activities can also be used in pharmaceutical formulations within the scope of the present invention. Typically, one or more bioactive agents dissolved in a suitable solvent are contacted with the drug release material by dipping. The loading can be easily measured based on the uptake of the bioactive drug by the drug release material. In a preferred method for forming a drug release material, one or more bioactive agents are dissolved in water at a suitable concentration, typically about 0.1-2% by weight, and the drug release material is allowed to flow for about 10 minutes to 240 minutes. Immerse in it. The material is then ready for use at ambient temperature (about 20-25 ° C). In another preferred method, the bioactive agent and the drug release material are dissolved in an aqueous solvent before crosslinking. Typical drug: drug release material weight ratios range from about 1: 100 to 5: 100 in solution. The drug release material is then crosslinked by treatment with a crosslinking agent. The chitin or collagen derivative can be modified, for example, to be more hydrophilic or more hydrophobic to have appropriate binding properties for the bioactive agent. For example, prior to crosslinking, such modifications can be made by esterification of the acid groups to make the drug release material more hydrophobic. The following examples are presented for the purpose of illustrating the invention and are not intended to limit the invention in any way. Example 1 Reaction of lysozyme with chitin derivatives The following chitin derivatives were tested. That is, carboxymethyl-chitin, carboxymethyl-chitosan, chitosan-lactate, and chitosan. To 7.5 g of a 1% solution of each chitin derivative, 0.8 ml of 100 mM sodium phosphate (pH 7.0) was added, and the viscosity was measured using a Brookfield model DVII viscometer. It was measured as a function of At time zero, 80 μL of 2% lysozyme (or chitinase as a positive control) was added and the viscosity of the solution was monitored to detect a decrease in viscosity caused by hydrolysis of the polymer. In all cases, the enzyme chitinase resulted in a rapid decrease in the viscosity of the 1% polymer solution. When lysozyme was tested for CM-chitosan, chitosan-lactate, and chitosan, no change in viscosity was seen. As shown in FIG. 1, lysozyme caused a rapid viscosity decrease when CM-chitin was used as the substrate. Ferricyanide reducing sugar assay; Park, J. & Johnson, M., J. Biol. Chem. 131: 149, 1949. Reduction formed by cleavage of the glycosidic bond of CM-chitin. By testing the sugar, the CM-chitin / lysozyme reaction was quantified. The discontinuous test was determined to be linear with respect to time and enzyme concentration, at least up to 0.25 mg / ml. As a specific activity of lysozyme, 0.097 μmol / hr / mg was obtained. Example 2 Formation of Chitin-Collagen Shield CM-chitin (Maruben Corp. Tokyo) was dissolved in H2O at 1.25%. Wetting agent (Pluronic L-92) was added to 0.006% and the solution was filtered through a 5 μm syringe filter. This solution was degassed in a 50 ml tube and mixed with a 1.5-2.3% collagen slurry so that the resulting polymer solution was 40, 60, or 80% CM-chitin. 5.75 mg / shield was filled in a shield mold and air-dried at room temperature. Dehydration thermal crosslinking under reduced pressure was performed at a temperature of 115-135 ° C for various times. Example 3 Lysozyme Degradation of Corneal Shield Half of the shield was in tear buffer containing 0.1% lysozyme and containing 0.05 or 0.5 mg / ml collagen and in tear buffer containing 0.1% lysozyme and no collagen. And shake at 37 ° C. These shields are rated by visual observation on a scale of 5 to 0. Here, 5 points have no change and 0 points have completely dissolved. The enzymatic hydrolysis of the CM-chitin polymer at the shield was confirmed using a ferricyanide reducing sugar test. Shields with a high ratio of CM-chitin to collagen (75 & 90%) dissolved almost completely after overnight incubation at 37 ° C. The 100% CM-chitin membrane was completely dissolved. The mixture of lysozyme and collagenase dissolved the shield with any ratio of CM-chitin to collagen. Additional experiments measuring dissolution time in the presence of normal levels of tear lysozyme demonstrate that shields comprising the CM-chitin / collagen complex can dissolve more reproducibly than shields made of 100% collagen. Was done. CM-chitin / collagen composite shields were tested at 40, 60 and 80% CM-chitin concentrations. The ideal conditions for formulating a 24-hour complex shield appear to be 80% CM-chitin, 20% collagen, DHT crosslinking at 130 ° C. for 15 hours, and Et0 sterilization. For 12 hour shielding, 80% CM-chitin crosslinked at 125 ° C. for 15 hours is preferred. Example 4 Formation of Chitin Microspheres CM-chitin (Nova Chemical Co., Toronto, Lot No. 1348, low viscosity) was stirred overnight at room temperature and homogenized with a Virtis polytron homogenizer. Formed into microspheres. Final concentration was 1.25%. In some cases, solutions were clarified by pelleting at 15,000 rpm for 30 minutes using a Beckman KA-21 rotor. 10 ml of 1.25% CM-chitin was mixed with 2.5 ml of Span-80 by swirling for 2 minutes. Toluene was slowly added using a Birtis polytron homogenizer set at 45 to bring the final volume to 55 ml. This suspension was slowly added to 4 volumes of acetone with stirring. EDC (pre-dissolved in 1 ml of water) was then mixed with 4 ml of acetone and added to the stirred suspension while varying the ratio of EDC to CM-chitin. After 2 hours, the microspheres were washed three times by pelleting and resuspending with acetone and three times with the desired buffer. Microspheres cross-linked at a ratio of 1.0, 0.75, and 0.5 were split into two and half parts, each treated overnight with 0.1 mg / ml lysozyme. Microspheres with ratios of 0.5 and 0.75 dissolved, and microspheres with a ratio of 1.0 swelled to about twice their original volume. In another experiment, the cleavage of glycosidic bonds in CM-chitin microspheres was quantified using the ferricyanide reducing sugar test. The microspheres were incubated in tear buffer at 37 ° C. in a shaking water bath. The reaction contained 0.1 mg / ml lysozyme. Each point is the average of two experiments. The reaction appears to be complete in approximately three days. FIG. Example 5 Microsphere Loading Since high levels of lysozyme, which degrades CM-chitin microspheres, are present in tears, the binding to two drugs that may be used in eye diseases was determined. The microspheres were tested. That is, the two drugs are a carbonic anhydrase inhibitor for glaucoma and aprotinin for corneal ulcer. CM-chitin microsphere / drug binding was studied by Scatchard analysis. As seen in FIGS. 4 and 5, CAI and aprotinin bind to microspheres at 0.53 and 0.25 mM K4, respectively. The protein, aprotinin, binds to polyanionic microspheres more tightly than CAI, probably due to its cationic nature with an isoelectric point close to 10.5. Fraction binding is performed by incubating preformed microspheres and a known volume of drug for 60 minutes at room temperature, then pelleting the microspheres at 10 K × g for 5 minutes, and testing the supernatant for free drug concentration by uv absorption. This was measured using carboxymethyl chitin microspheres. The bound amount is calculated from the total amount as described above. The fraction binding for representative drugs is shown below. Example 6 Protein release from CM-chitin microspheres Since macromolecules are unlikely to release by simple diffusion as in the case of small molecules, sustained release by cleavage of the polymer matrix catalyzed by the enzyme is particularly important for macromolecules. It has applicability to This sustained release was tested in a model system using a readily detectable protein, cytochrome C. The amount of tamper load was calculated by mixing 200 μl of a 50:50 slurry of microspheres equilibrated in 20 mM phosphate buffer (pH 7) with 200 μl of 1 mg / ml cytochrome C. After pelleting the microspheres, the protein in the supernatant was determined from the calibration curve to be 0.5% of the total amount, meaning that 99.5% was bound to the microspheres. The buffer system was chosen to match the potential for use in periodontal disease. The predominant ions in saliva are sodium and carbonate ions of approximately 1/3 physiological strength, with a pH in the range of 6.2-7.4. Therefore, a 50 mM sodium carbonate buffer (pH 7.0) was used. 100 μl of a 50:50 slurry of microspheres equilibrated in buffered water was mixed with 200 μl of 1 mg / ml cytochrome C for 1.5 hours. The microspheres were then pelleted and 100 μl of the supernatant was replaced with lysozyme to a final concentration of mg / mg. At each time point, the microspheres were pelleted again, 100 μl were removed, tested for cytochrome C, and 100 μl of fresh lysozyme in buffer was added to replace the withdrawn volume. A control without lysozyme was also run in parallel. FIG. 6 shows a state in which protein is gradually released from microspheres in a buffer containing lysozyme over 32 hours. The protein peak is released when the microspheres are left overnight and over the weekend, respectively, indicating that the slow release does not reach equilibrium at 1.5 hours. Control reactions treated with buffer did not release appreciable amounts of protein. After the reaction of FIG. 6 was completed, lysozyme was added to the control reaction to slowly release the protein, indicating the ability of the microspheres to retain the protein until release by lysozyme. These results clearly demonstrate the ability of CM-chitin microspheres to bind drugs and proteins. In a periodontal disease environment, the protein can remain in bound form through thorough washing and is gradually released in the presence of lysozyme. Cytochrome C was used as a model protein because cytochrome C is easily detectable, has a net positive charge, and is expected to behave similarly to a peptide drug or cytokine with a net positive charge. Because it is done. This system provides a sustained release of such compounds in case of periodontal disease where lysozyme levels in the infected area of the mouth are increasing. The above description and examples have been given merely to illustrate the present invention, but not to limit the present invention. The scope of the invention is limited only by the appended claims and equivalents thereof, as modifications of the above described embodiments, which incorporate the spirit and essence of the invention, may be made by those skilled in the art.
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Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
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ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，
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(72) Inventor Broad George L
United States New Jersey
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