【発明の詳細な説明】
改善洗浄用組成物 発明の分野
本発明は、天然には見られないアミノ酸配列を有する新規αアミラーゼ変異体
に関するものであり、このような変異体は、1またはそれ以上のプレカーサーα
アミラーゼのアミノ酸残基が、特に何れかの酸化可能なアミノ酸が、異なったア
ミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有する。本発明の変異体酵素は、改変酸
化安定性、改変pH作用特性、改変比活性および/または改変温度安定性を含む
がこれに限定されない、改変安定性/活性特性を示す。発明の背景
αアミラーゼ(α−1,4−グルカン−4−グルカノヒドロラーゼ、EC3.
2.1.1)は、デンプン中の内部α−1,4−グリコシド結合を大きくランダ
ムに加水分解し、分子量の小さいマルトデキストリンを生成する。αアミラーゼ
はかなりの商業的価値を有し、デンプン加工の最初の段階(液化)において;ア
ルコール製造において;洗剤母体中の洗浄剤として;およびデンプンのり抜きの
ために繊維産業において用いられている。αアミラーゼは、B.licheni
formis、B.amyloliquefacients、B.subtil
isまたはB.stearothermophilusなどの微生物源から生産
された最も商業的なアミラーゼとともに、BacillusおよびAsperg
illusを含む幅広い微生物によって生産されている。近年、商業的利用にお
いて好ましい酵素は、少なくとも中性および弱アルカリpHでの温度安定性と作
用から、B.licheniformis由来のものである。
以前から、何れの残基がアミラーゼの触媒活性に重要であるかを調べるため、
および/または、いろいろなアミラーゼの活性中心内部の特定のアミノ酸の改変
の影響を調べるために(Vihinen,M.et al.(1990)J.B
ichem.107:267−272;Holm,L.et al.(1990
)Protein Engineering 3:181−191;Taka
se,K.et al.(1992)Biochemica et Bioph
ysica Acta,1120:281−288;Matsui,I.et
al.(1992)Febs Letters Vol.310,No.3;p
p.216−218);何れの残基が温度安定性に重要であるか(Suzuki
,Y.et al.(1989)J.Biol.Chem.264:18933
−18938);を調べるために、組換えDNA技術を用いた研究がされており
、1つのグループはこのような方法を、B.licheniformisアミラ
ーゼ内のさまざまなヒスチジン残基に変異を導入するために用い、ヒスチジン残
基において置換を生じさせる根拠は、B.licheniformisアミラー
ゼ(熱安定性であることが知られている)は、他の類似のバチルスアミラーゼと
比較した場合、過剰のヒスチジン残基を有しており、それ故、ヒスチジン残基の
入れ替えにより酵素の熱安定性が変化することが示唆されていたからである(D
eclerck,N.et al.(1990)J.Biol.Chem.26
5:15481−15488;FR 2 665178−A1;Joyet,P
.et al.(1992)Bio/Technology 10:1579−
1583)。
αアミラーゼは、過酸化水素および他の酸化剤によって、pH4と10.5の
間で、ここでの実施例に記載されているように不活性化されることが明らかとな
った。商業的には、αアミラーゼ酵素は、商業用途に応じて、高および低両方の
pH条件等の、劇的に異なった条件下で用いられる。例えば、αアミラーゼは、
低pH(pH<5.5)で行われるのが好ましい工程であるデンプンの液化に用
いられ得る。他方で、アミラーゼは、漂白剤や過酸等の酸化剤をしばしば含む、
よりアルカリ条件下にある商業的皿用または洗濯用洗剤中に用いられることもあ
る。
多様な条件下でのアミラーゼ酵素の安定性または活性特性を変化させるため、
例えばメチオニン、トリプトファン、チロシン、ヒスチジンまたはシステイン等
の酸化可能なアミノ酸を選択的入れ替え、置換、欠失が、そのプレカーサーと比
較して改変された変異酵素の特性という結果となることが判明した。現在市販さ
れているアミラーゼは多様な条件下では許容できない(安定ではない)ので、改
変された安定性および/または活性特性を有するアミラーゼが必要とされている
。野生型またはプレカーサー酵素と比較して改変された安定性(酸化、温度、ま
たはpH作用特性)を、適度な酵素活性を維持しながら達成することができる。
このような変異を導入することによって影響を受ける特徴は、熱安定性を維持し
ながらの酸化安定性の変化、またはその逆であっても良い。付加的には、αアミ
ラーゼプレカーサー配列中の酸化可能なアミノ酸の他のアミノ酸での置換、また
は1またはそれ以上の酸化可能なアミノ酸の欠失は、プレカーサーαアミラーゼ
で最適と考えられていたpH以外での改変された酵素活性という結果となること
もある。換言すると、本発明の変異酵素は、酵素の促進された酸化安定性による
ものであり得る、改変されたpH作用特性もまた有する。発明の概要
本発明は、αアミラーゼをコードしている変異DNA配列の発現産物である新
規αアミラーゼ遺伝子変異体、プレカーサーαアミラーゼから、1以上の酸化可
能なアミノ酸の欠失または置換(入れ替え)によって派生した変異DNA配列に
関する。1つの好ましい本発明の態様においては、変異は、プレカーサーαアミ
ラーゼ中の1またはそれ以上のメチオニン残基を異なったアミノ酸で置換するこ
とに由来している。別の本発明の好ましい態様においては、変異は、プレカーサ
ーαアミラーゼ中の、1以上のトリプトファン残基だけの、または1以上のメチ
オニン残基と組合せた置換を含む。このような変異体αアミラーゼは、一般に、
プレカーサーのアミノ酸配列中の、1以上のアミノ酸残基を置換または欠失して
コードするように、自然発生または組換えαアミラーゼをコードしているプレカ
ーサーDNA配列を生体外で改変することにより得られる。
好ましくは、1以上のアミノ酸の置換又は欠失は、このような配列中の、1以
上のメチオニン、トリプトファン、システイン、ヒスチジン、またはチロシン残
基の入れ替えによるものであり、最も好ましくは、変えられる残基はメチオニン
残基である。酸化可能なアミノ酸残基は、20の天然アミノ酸の何れによっても
入れ替えられ得る。もし、所望の効果が、プレカーサーの酸化安定性を改変する
ことであれば、アミノ酸残基は、酸化可能ではないアミノ酸(例えばアラニン、
アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリ
シン、イソロイシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン
、スレオニンまたはバリン)または他の酸化可能なアミノ酸(例えばシステイン
、メチオニン、トリプトファン、チロシンまたはヒスチジン、最も容易に酸化さ
れやすいものから容易には酸化されにくいものの順に列挙)で置換されてもよい
。同様に、もし、所望の効果が熱安定性の改変であるならば、20の天然アミノ
酸の何れもが置換されてもよい(例えば、システインがメチオニンで置換されて
もよい)。
好ましい変異は、B.licheniformis αアミラーゼ中に見られ
るメチオニン残基(+8、+15、+197、+256、+304、+366お
よび+438)の何れかに相当するメチオニン残基の置換である。最も好ましく
は、入れ替えられるメチオニンは、B.licheniformis αアミラ
ーゼ中の位置+197または+15に相当するメチオニンである。メチオニンを
位置+197において入れ替えるために好ましい置換アミノ酸は、アラニン(A
)、イソロイシン(I)、スレオニン(T)またはシステインである(C)。位
置+15での好ましい置換アミノ酸は、ロイシン(L)、スレオニン(T)、ア
スパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、セリン(S)、バリン(V)および
イソロイシン(I)であるが、上記で特定されていない他の置換アミノ酸もまた
有用であろう。2つの特に好ましい本発明の変異はM197TとM15Lである
。
本発明の他の態様は、B.licheniformis αアミラーゼ(図2
を参照)中に見られるトリプトファン残基の何れかに相当するトリプトファン残
基の置換を含む変異体に関する。好ましくは、入れ替えられるトリプトファン残
基は、B.licheniformis αアミラーゼ中の+138に相当する
位置のものである。トリプトファン残基の変異(置換)は、単独で成されても、
または他の酸化可能なアミノ酸残基の変異との組合せで成されてもよい。特に、
少なくとも1つのトリプトファンを、少なくとも1つのメチオニンと組み合わせ
て置換すること(例えば、二重変異+138/+197)により修飾することが
有利である。
本発明のαアミラーゼ変異体は、一般に、過酸化水素および漂白剤または過酸
等のその他の酸化剤、より詳細にはクロラミン−T等の穏やかな酸化剤、の存在
下で、改変された酸化安定性を示す。促進された酸化安定性を有する変異酵素は
、貯蔵寿命の延長、漂白剤、ペルオキシホウ酸、ペルオキシ炭酸、または過酸と
、洗浄製品中で用いられるアミラーゼとの共存性を拡張するために有用である。
同様に、減少された酸化安定性は、迅速で効率的な酵素活性の消失が要求される
産業工程において有用である。本発明の変異酵素はまた、拡大されたpH作用特
性を示し、それにより、M15L等の変異体は、低pHデンプン液化工程のため
の安定性を示し、M197T等の変異体は、高pH洗浄製品条件における安定性
を示す。本発明の変異体はまた、改変された温度安定性を示し、それにより、変
異体は高または低いずれの温度においても安定性を示す。プレカーサーと比較し
た何れの変異体の酵素的特性の変化(増加または減少)も、変異αアミラーゼの
最終利用に応じて有利なものとなり得る。
デンプン加工と洗浄用途に加えて、本発明の派生アミラーゼは、公知のアミラ
ーゼが用いられている何れの用途においても用いることが出来、例えば、派生ア
ミラーゼは織物加工、食品加工等で利用できる。特に、M197C等の派生酵素
は、酸化剤で容易に不活性化されてしまうが、工程の最後で完全にアミラーゼ活
性を除去することが要求される、例えば冷凍食品加工用途等の工程において有用
であることが観察された。
好ましい本発明のαアミラーゼ変異体は、B.licheniformis、
B.amyloliquefacients、およびB.stearother
mophilus等のバシルス株、そして最も好ましくは、Bacillus
licheniformisから派生される。
本発明の別の態様においては、B.licheniformisによって通常
生産されるαアミラーゼの新しい型が提供されている。この新しい型は、A4型
と命名され、分泌されたアミラーゼのN末端に4つの付加的なアラニン残基を有
している(図4b)。αアミラーゼのA4型の派生体または変異体は、本発明に
含まれる。A4型の派生体または変異体により、本発明は、例えば、1またはそ
れ以上の酸化可能なアミノ酸の変異(置換、入れ替えまたは欠失)等の、1以上
の付加的な変異を有するA4型αアミラーゼを含む。
本発明の組成物の態様においては、液体、ゲルまたは粒状で、ここに記載され
ているαアミラーゼ変異体を含む洗剤組成物が提供されている。特に好ましいも
のは、+197位置変異体を単独で、または、エンドグリコシダーゼ、セルラー
ゼ、プロテアーゼ、リパーゼ等の他の酵素または他のアミラーゼ酵素との組み合
わせで含有している洗剤組成物である。付加的には、本発明の組成物は1以上の
部位特異的変異を有するαアミラーゼ変異体を含んでもよい。
本発明のさらに別の組成物としての態様においては、デンプン加工、特にデン
プン液化に有用な組成物が提供されている。本発明のデンプン液化組成物は好ま
しくは位置M15に置換もしくは欠失を有するαアミラーゼ変異体を含んでいる
。付加的には、このような組成物は、例えば、抗酸化剤、カルシウム、イオン等
を含む、当業者に公知である成分を含有していてもよいことが観察された。
本発明の工程としての態様においては、湿式または乾燥ミル工程からの、デン
プン、特に粒状デンプンスラリーの液化のための方法が提供されている。一般に
、デンプン分解工程の最初の段階においては、デンプンスラリーは比較的高温(
約110℃まで)でゼラチン化される。デンプンスラリーがゼラチン化された後
、それはαアミラーゼを用いて液化され、デキストリン化される。このような液
化のための条件は、共通して譲渡された米国特許出願第07/785624号お
よび同第07/785623号、および米国特許第5180669号に記載され
ており、それらの開示はここに参考文献として取り込まれている。本方法は、デ
ンプンに本発明のαアミラーゼの有効量を、単独または、抗酸化剤等の付加的な
賦形剤との組合せで添加し、スラリーを適当な時間および温度でデンプンを液化
させるために反応させることから成るデンプンの液化のための方法である。
本発明の更なる態様は、本発明の変異αアミラーゼ(A4型およびその変異体
を含む)をコードしているDNA、および当該DNAをコードしている発現ベク
ター並びにそのような発現ベクターで形質転換された宿主細胞を含む。図面の簡単な説明
図1は、B.licheniformis(NCIB8061)由来のαアミ
ラーゼ遺伝子のDNA配列、配列番号31、および、Gray,G.et al
.(1986)J.Bacter.166:635−643に記載されている推
定翻訳産物を示している。
図2は、B.licheniformis(NCIB8061)由来のαアミ
ラーゼの成熟アミノ酸配列、配列番号32、を示している。
図3は、バシルスαアミラーゼの1次構造を並列したものである。B.lic
heniformisアミラーゼ(Am−Lich)、配列番号33、は、Gr
ay,G.et al.(1986)J.Bacter.166:635−64
3に記載されており、B.amyloliquefaciensアミラーゼ(A
m−Amylo)、配列番号34、は、Takkinen,K.et al.(
1983)J.Biol.Chem.258:1007−1013に記載されて
おり;B.stearothermophilus(Am−Stearo)、配
列番号35、は、Ihara,H.et al.(1985)J.Bioche
m.98:95−103に記載されている。
図4aは、成熟αアミラーゼ派生体M197Tのアミノ酸配列、配列番号36
、を示す。
図4bは、B.licheniformis NCIB8061由来のA4型
αアミラーゼのアミノ酸配列、配列番号37を示す。番号付けはN末端からであ
り、4つの付加的なアラニンから始まる。
図5は、プラスミドpA4BLを示しているが、そこにおいて、BLAAは、
B.licheniformis αアミラーゼ遺伝子、PStIからSstI
を指し;AmpRはpBR322由来のアンピシリン耐性遺伝子を指し;CAT
はpC194由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を指している。
図6は、B.licheniformis(配列番号38)、B.subti
lis(配列番号39)、pA4BL中のB.licheniformis(配
列番号40)およびpBLapr中のB.licheniformis(配列番
号41)に対するシグナル配列−成熟タンパク質結合部分を示している
図7aは、特定のαアミラーゼ(Spezyme(登録商標)AA20および
M197L(A4型))の、0.88M H2O2、pH5.0、25℃での不活
性化を示している。
図7bは、特定のαアミラーゼ(Spezyme(登録商標)AA20、M1
97T)の、0.88M H2O2、pH10.0、25℃での不活性化を示し
ている。
図7cは、特定のαアミラーゼ(Spezyme(登録商標)AA20、M1
5L)の、0.88M H2O2、pH5.0、25℃での不活性化を示している
。
図8は、M197Xカセット変異体の生産の模式図である。
図9は、M197X派生体の発現を示す。
図10は、M197X派生体の、pH5.0、5mMCaCl2、95℃で5
分間の処理での熱安定性である。
図11aおよび11bは、自動皿洗い用洗剤における特定の酵素の不活性化を
示している。図11aは、特定のアミラーゼのカスケード(登録商標)(市販の
皿洗い用製品)中で65℃での、デンプンの存在下または不在下での安定性であ
る。図11bは、特定のアミラーゼのサンライト(登録商標)(市販の皿洗い用
製品)中で65℃での、デンプンの存在下または不在下での安定性である。
図12は、M15Xカセット変異体の生産の模式図を示す。
図13は、M15X派生体の発現を示す。
図14は、M15Xの可溶性デンプンに対する比活性を示す。
図15は、M15X派生体の、90℃、pH5.0、5mMCaCl2、5分
間の処理での熱安定性である。
図16は、B.licheniformis野生型のパーセント活性の関数と
しての、M15派生体の、デンプンおよび水溶性基質に対する比活性、およびp
H5.5でのジェット液化における作用を示したものである。
図17は、派生体M197A(1.7mg/ml)およびM197L(1.7
mg/ml)と比較した、クロラミン−T存在下、pH8.0でのB.lich
eniformis αアミラーゼ(AA20、0.65mg/ml)の不活性
化を示す。
図18は、派生体M197A(4.3mg/ml)およびM197L(0.5
3mg/ml)と比較した、クロラミン−T存在下、pH4.0でのB.lic
heniformis αアミラーゼ(AA20、0.22mg/ml)の不活
性化を示す。
図19は、二重派生体M197T/W138F(0.64mg/ml)および
M197T/W138Y(0.60mg/ml)と比較した、クロラミン−T存
在下、pH5.0でのB.licheniformis αアミラーゼ(AA2
0、0.75mg/ml)の不活性化を示す。
図20は、自動皿洗い用洗剤(ADD)配合剤に取り込まれた多種のαアミラ
ーゼ多重変異体の、室温から65℃まで増加された温度での安定性試験の結果を
示す。
図21は、特定のアミラーゼ変異体の(野生型と比較した)、自動皿洗い用洗
剤中の、0−30日にわたる、その時間で残存しているパーセント活性として決
定された安定性を示している。
図22は、特定のアミラーゼ変異体の(野生型と比較した)、自動皿洗い用洗
剤中の、0−30日にわたる、38℃(100°F)、相対湿度80%での安定
性を示している。発明の詳細な説明
デンプン液化に用いられるアミラーゼは、デンプンスラリー中に存在するいく
つかの活性により、いくつかの不活性型となることを免れないであろうと信じら
れてきた(ここに参考文献として取り込まれた、共通して所有されている米国出
願第07/785624号および第07/785623号および米国特許第51
80669号、1993年1月19日付与を参照されたい)。更には、例えば漂
白剤−、または過酸−含有洗剤等の酸化剤の存在下でのアミラーゼの使用は、ア
ミラーゼの部分的若しくは完全な不活性化という結果となり得る。それ故、本発
明はアミラーゼの酸化感受性を改変することに焦点をあてている。本発明の変異
酵素はまた、低または高pHでの促進された酸化安定性によると思われる、改変
されたpH特性および/または改変された熱安定性を有している。
ここで用いられるαアミラーゼは、天然に生じるアミラーゼ並びに組換体アミ
ラーゼを含む。本発明の好ましいアミラーゼは、ここに開示されているようにB
.licheniformisから派生したA4型αアミラーゼを含む、B.l
icheniformisまたはB.stearothermophilusか
ら派生したαアミラーゼ、並びにAspergillus(例えばA.oryz
a
eおよびA.niger等)から派生されたもの等の菌類αアミラーゼである。
組換えαアミラーゼとは、天然αアミラーゼをコードしているDNA配列が、
αアミラーゼ配列内の1またはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失をコ
ードする変異DNA配列を製造するために改変されたものであるαアミラーゼを
指す。適当な改変方法はここに記載されており、また共通して所有されている米
国特許第4760025号および第5185258号に開示されており、ここに
それらの開示が参考文献として取り込まれている。
これまでに配列決定された、植物、哺乳類、細菌の範囲での、ほとんど全ての
エンドアミラーゼの間にホモロジーが発見されている(Nakajima,R.
T.et al.(1986)Appl.Microbiol.Biotech
nol.23:355−360;Rogers,J.C.(1985)Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.128:470−476)。
あるバシルスアミラーゼには特にホモロジーの高い4つの領域が、図3に示され
るように存在し、下線をひかれた区分が高ホモロジー領域を示している。さらに
、バシルス エンドアミラーゼの間の関係を地図に示すために配列の並列を用い
た(Feng,D.F.and Doolittle,R.F.(1987)J
.Molec.Evol.35:351−360)。B.stearother
mophilusとB.licheniformisアミラーゼとの間の相対的
配列ホモロジーは、Holm,L.et al.(1990)Protein
Engineering 3(3)pp.181−191で決定されたように約
66%であった。B.licheniformisとB.amylolique
faciensアミラーゼとの間の配列ホモロジーは、Holm,L.et a
l.前出のように約81%であった。配列ホモロジーも重要であるが、アミラー
ゼまたはその他の酵素との比較において、構造ホモロジーが重要であることが一
般に認識されている。例えば、菌類アミラーゼと細菌(バシルス)アミラーゼと
の構造ホモロジーが提案されており、および、それ故、菌類アミラーゼは本発明
に含まれる。
1つのαアミラーゼはプレカーサーαアミラーゼのアミノ酸配列から派生され
たアミノ酸配列を有する。そのプレカーサーαアミラーゼは、天然に生成される
αアミラーゼおよび組換えαアミラーゼ(定義されたとおり)を含む。αアミラ
ーゼ変異体のアミノ酸配列は、プレカーサーアミノ酸配列の1またはそれ以上の
アミノ酸の置換、欠失または挿入によりプレカーサーαアミラーゼのアミノ酸配
列から派生される。このような修飾は、プレカーサーαアミラーゼ酵素それ自身
の操作というよりはむしろ、プレカーサーαアミラーゼのアミノ酸配列をコード
しているプレカーサーDNA配列の修飾である。適当な改変方法はここに記載さ
れているもの、また共通して所有されている米国特許第4760025号および
第5185258号に開示されているものを含む。
Bacillus licheniformis αアミラーゼの位置M19
7、M15およびW138に相当する特定の残基が、置換または欠失のために、
全てメチオニン、ヒスチジン、トリプトファン、システインおよびチロシン位置
としてここに同定された。アミノ酸位置番号(例えば+197)は、図2に示さ
れている成熟Bacillus licheniformis αアミラーゼ配
列に割り当てられた番号を指している。しかしながら本発明は、この特定の成熟
αアミラーゼ(B.licheniformis)の変異に限定されるものでは
なく、B.licheniformisの成熟αアミラーゼ中の特に同定された
残基に相当する位置にあるアミノ酸残基を含むプレカーサーαアミラーゼにも拡
張される。あるプレカーサーαアミラーゼの1つの残基(アミノ酸)は、もしそ
れが、B.licheniformisのαアミラーゼの特定の残基もしくはそ
の残基の部分と相同性(例えば1次構造または3次構造いずれかで位置が一致し
ている等)または類似性であれば(例えば同一または類似の機能上の、結合、反
応または化学的若しくは構造的相互作用能力を有する等)、B.licheni
formisのαアミラーゼの残基に相当するものである。
1次構造に対するホモロジーを実現するために、プレカーサーαアミラーゼの
アミノ酸配列を直接、B.licheniformisのαアミラーゼの1次配
列、特に配列が知られている全てのαアミラーゼで変化しないことが知られてい
る一連のアミノ酸残基と、図3に示すように比較した。3次構造によって相当す
る残基を決定することもまた可能である:結晶構造は、ブタ膵臓αアミラーゼ(
Buisson,G.et al.(1987)EMBO J.6:3909
−3916);Aspergillus oryzae由来タカアミラーゼA(
Matsuura,Y.et al.(1984)J.Biochem.(To
kyo)95:697−702);およびA.niger由来酸性αアミラーゼ
(Boel,E.et al.(1990)Biochemistry 29:
6244−6249)に報告されており、前者の2つの構造は類似している。B
acillus αアミラーゼに関しては刊行された構造はないが、グルカナー
ゼの間の共通超2次構造にあると予測されており(MacGregor,E.A
& Svensson,B.(1989)Biochem.J.259:14
5−152)および、B.stearothermophilusの酵素がタカ
アミラーゼAのそれに基づいてモデル化されている(Holm,L et al
.(1990)Protein Engineering 3:181−191
)。図3に示されている4つの高度保存領域は、活性部位の一部であると考えら
れている(Matsuura,Y.et al.(1984)J.Bioche
m.(Tokyo)95:697−702);Buisson,G.et al
.(1987)EMBO J.6:3909−3916;Vihinen,M.
et al.(1990)J.Biochem.107:267−272)、l
icheniformisの番号においてはHis105;Arg229;As
p231;His235;Glu261およびAsp328を含む多くの残基を
含んでいる。
ここで用いられる発現ベクターとは、適切な宿主中でのDNAの発現に影響す
ることが可能である適当な制御配列に操作可能に連結されたDNA配列を有する
DNA構築物をいう。このような制御配列には、転写に影響するプロモーター、
そのような転写をさらに制御可能な付加的なオペレーター配列、適切なmRNA
リボソーム結合サイトをコードしている配列、および転写および翻訳の終結を制
御する配列が含まれてもよい。好ましいプロモーターはB.subtilis
aprEプロモーターである。ベクターはプラスミド、ファージ粒子、または単
に潜在的ゲノムインサートであってもよい。一旦適切な宿主中に形質転換される
と、ベクターは複製し宿主ゲノムとは独立に機能し、あるいはいくつかの例では
、ゲノムそれ自体の中に組み込まれる。本明細書においては、プラスミドは現在
最
も一般的に用いられているベクターの形状であるので、プラスミドとベクターは
しばしば相互交換可能に用いられる。しかしながら、本発明は、相当する機能を
果たし、この分野で公知であるか公知となる他の形状の発現ベクターも含むこと
を意図している。
本発明において有用である宿主菌株(または細胞)は、一般に、原核または真
核宿主および、内部でαアミラーゼの発現が可能である何れの形質転換可能な微
生物をも含む。特に、バシルス株等の、αアミラーゼが由来するものと同一の種
または属の宿主株が好適である。好ましくは、αアミラーゼ陰性株(遺伝子を欠
失)、および/または、αアミラーゼおよびプロテアーゼが欠失された、Bac
illus subtilis BG2473(ΔamyE、Δapr、Δnp
r)等のバシルス株が用いられる。宿主細胞は、組換えDNA技術を用いて構築
されたベクターにより形質転換若しくは移入される。このような形質転換宿主細
胞はαアミラーゼおよびその派生体(変異体)をコードしているベクターを複製
すること、または所望のαアミラーゼを発現することのいずれをも行うことが可
能である。
好ましくは、本発明の変異体は発酵の間に培養用培地中に分泌される。例えば
aprEシグナルペプチド等の、いずれの好適なシグナル配列を、分泌を実現す
るために用いてもよい。
本発明のαアミラーゼ変異体の多くは、多様な洗剤組成物、特に特定の皿洗い
用洗浄組成物、中でも公知の酸化剤を含む洗浄組成物の配合において有用である
。本発明のαアミラーゼ変異体は、公知の粉末化、液体、またはゲル状の、6.
5から12.0までのpHを有する洗剤に配合されることができる。好適な粒状
組成物は、ここに参考文献として取り込まれている、共通して所有されている米
国特許出願第07/429881号、第07/533721号、第07/957
973号に記載されているように生成できる。これらの洗剤洗浄組成物は、例え
ば公知のプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、エンドグリコシダーゼ等の他の
酵素または他のアミラーゼ、並びにビルダー、安定化剤、または他の当業者に知
られた賦形剤を含んでもよい。これらの酵素は、共粒またはブレンドされた混合
物またはその他の当業者に知られた方法で存在していても良い。さらに、多重変
異
体が洗浄若しくは他の用途において有用であることが本発明によって観察された
。例えば、+15と+197の両方で変化を有する変異体酵素は、洗浄用製品に
おいて有用な促進された作用を示し、または、+197および+138で変化を
有する多重変異体は改善された作用を有しうる。洗浄用製品、皿洗い用配合物に
用いるために特に好ましい酵素には、M15T/M197T;M15S/M19
7T;W138Y/M197T;M15S/W138Y/M197T;およびM
15T/W138Y/M197Tが含まれるが、これに限定はされない。
本発明の別の態様は、ここに記載されている変異体αアミラーゼと、他の酵素
(即ち、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ等)、および好適には酸化安定性
プロテアーゼとを組み合わせた組合せから成る。好適な酸化安定性プロテアーゼ
には、例えばここに参考文献として取り込まれているUS Re 34606に
記載されている遺伝子操作されたプロテアーゼ、並びにDURAZYM(Nov
o Nordisk)、MAXAPEN(Gist−brocades)および
PURAFECT OXP(Genencor International
Inc.)等の市販の酵素が含まれる。このようなプロテアーゼ変異体(酸化安
定性プロテアーゼ)を生産する好適な方法、および、特に、B.amyloli
quefaciens中の位置M222に相当するメチオニンの置換を有する変
異体は、US Re 34606に記載されている。他のスブチリシンの中で「
相当する」位置を決定するために好適な方法は、ここに参考文献として取り込ま
れている、Re 34606、EP257446およびUSSN212291に
記載されている。
前述のとおり、本発明のαアミラーゼ変異体はデンプンの液化においてもまた
有用である。デンプン液化、特に粒状デンプンスラリーの液化は、典型的には中
性付近のpHおよび高温度で行われる。共通して所有されている米国出願第07
/788624号、第07/788623号および米国特許第5180669号
に記載されているとおり、数種類の酸化剤または不活性化剤が、典型的な液化工
程において存在し、酵素活性に影響し得るように見える;このように、これらの
関連特許出願においては、酵素を保護するために、抗酸化剤が添加されている。
共通して所有された米国出願第07/788624号、第07/788623
号および米国特許第5180669号に記載されているような好ましい液化工程
の条件、即ち低いpH、高い温度および潜在的酸化条件に基づいて、液化工程の
ために好ましい本発明の変異体は、改変されたpH作用特性(即ち、低pH特性
、pH<6 および好ましくはpH <5.5)、および/または改変された熱
安定性(即ち、高温度、約90−110℃)および/または改変された酸化安定
性(即ち、促進された酸化安定性)を有するものである。
このように、本発明により、改善されたデンプン液化方法が教示され、当該方
法は、湿式または乾燥ミル工程由来の粒状デンプンスラリーを約4から6のpH
で本発明のαアミラーゼ変異体を適当量、当該デンプンスラリーに添加して液化
すること;付加的には、適当量の抗酸化剤または他の賦形剤をスラリーに添加す
ること;およびスラリーをデンプンを液化するために適当な時間と温度で反応さ
せること、から成る。
以下は実施例として示されており、クレームの範囲の限定として構築されたも
のではない。ここに用いられる略語、特に、3文字または1文字のアミノ酸の表
記は、Dale,J.W.,Molecular Genetics of B
acteria,John Wiley & Sons,(1989)Appe
ndix Bに記載されている。実施例
実施例1
B.licheniformis αアミラーゼ中のメチオニン残基の入れ替 え
αアミラーゼ遺伝子(図1)が、National Collection
of Industrial Bacteria、Aberdeen、Scot
landより得られたB.licheniformis NCIB8061から
クローン化された(Gray,G.et al.(1986)J.Bacter
iology 166:635−643)。シグナル配列の最後の3残基、完全
成熟タンパク質およびシグナル配列のターミネーター領域をコードしている1.
72kbpstI−SstI断片を、M13MP18にサブクローン化した。合
成ターミネーターをBclIおよびSstIサイトの間に、以下の型:
の、B.amyloliquefaciens スブチリシン転写ターミネータ
ーを含むよう設計された合成オリゴヌクレオチドカセットを用いて付加した(W
ells et al.(1983)Nucleic Acid Resear
ch 11:7911−7925)。
オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異は、必然的にZoller,M.
et al.(1983)Meth.Enzymol.100:468−500
のプロトコルを用いた:簡潔に言うと、所望の変異をM13−本鎖DNAテンプ
レートに導入するために5’加リン酸分解されたオリゴヌクレオチドプライマー
を用いるもので、表Iに列挙されたオリゴヌクレオチドを、B.licheni
formis αアミラーゼ中に見出された7つのメチオニンのそれぞれを入れ
替えるために用いた。各々の変異オリゴヌクレオチドはまた、制限エンドヌクレ
アーゼサイトを、連結された変異のスクリーンとして用いるために導入した。
ヘテロ二本鎖を、E.coli mutL細胞(Kramer et al.
(1984)Cell 38:879)に移入するために用い、プラーク精製の
のち、クローンはRF1’sの制限酵素分析により解析された。陽性のものはジ
デオキシ配列決定(Sanger et al.(1977)Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.74:5463−5467)で確認し、
各々のPstI−SstI断片をE.coliベクター、プラスミドpA4BL
中にサブクローン化した。プラスミドpA4BL
ここに参考文献として取り込まれている、米国出願第860468号(Pow
er et al.)に記載されている方法に従って、沈黙PstIサイトを、
pS168−1由来のaprE遺伝子(Stahl,M.L.and Ferr
ari,E.(1984)J.Bacter.158:411−418)のコド
ン+1(シグナル分解サイトに続く最初のアミノ酸)に導入した。aprEプロ
モーターおよびシグナルペプチド領域は、続いてpJH101プラスミド(Fe
rrari,F.A.et al.(1983)J.Bacter.154:1
513−1515)からHindIII−PstI断片としてクローン化され、
pUC18−派生プラスミドJM102(Ferrari,E.and Hoc
h,J.A.(1989)Bacillus,ed.C.R.Harwood,
Plenum Pub.,pp.57−72)中にサブクローン化された。B.
licheniformis αアミラーゼ由来のPstI−SstI断片の付
加により、その結果生じる、図6に示されるaprEシグナルペプチド−アミラ
ーゼ結合を有するpA4BL(図5)が供与される。B.subtilis中への形質転換
pA4BLは、E.coli中で複製可能でB.subtilis染色体中に
組み込まれることが可能なプラスミドである。異なった派生体を含んでいるプラ
スミドはB.subtilis中に形質転換され(Anagnostpoulo
s,C.およびSpizizen,J.(1961)J.Bacter.81:
741−746)、Campbellタイプの機構(Young,M.(198
4)J.Gen.Microbiol.130:1613−1621)により、
aprE座において染色体中に組み込まれた。Bacillus subtil
is BG2473株は、アミラーゼ(ΔamyE)および2つのプロテアーゼ
(Δapr、Δnpr)を欠失されているI168(Stahl,M.L.an
d Ferrari,E.(1984)J.Bacter.158:411−4
18および米国特許5264366、参考文献としてここに取り込まれている)
の派生体である。形質転換の後、sacU32(Hy)(Henner,D.J
.et al.J.Bacter.170:296−300)変異をPBS−1
媒介形質導入によって導入した(Hoch,J.A.(1983)154:15
13−1515)。
pA4BLからB.subtilis中で発現されたアミラーゼのN−末端解
析により、それが、4つの余分なアラニンを、分泌されたアミラーゼタンパク質
のN末端に有して(A4型)プロセシングされることが示された。これらの余分
な残基は、A4型アミラーゼの活性や熱安定性に対する顕著で有害な影響は有し
ておらず、いくつかの用途においては作用を促進しうる。引き続いての実験にお
いては、正確にプロセシングされた型のlicheniformisアミラーゼ
と変異体M197Tが、非常に類似した構築物(図6を参照)から作られた。特
に、A4構築物の5’末端がEcoRI−SstII断片上に、pA4BL(図
5)からM13BM20(Boehringer Mannheim)中に、以
下の変異オリゴヌクレオチドのためのテンプレートを得るためにサブクローン化
された:
このプライマーは余分な4つのN末端アラニンを除去し、訂正型はPstIサ
イトの欠如により検索される。EcoRI−SstII断片をpA4BLベクタ
ー(図5)中に戻してサブクローン化し、プラスミドpBLaprとした。続い
てM197Tの置換は、SstII−SstI断片上で、pA4BL(M197
T)から相補的pBLaprベクター中に移動させることが出来、プラスミドp
BLapr(M197T)を提供する。B.subtilis中でpBLapr
から発現されたアミラーゼのN末端解析により、それがB.lichenifo
rmis αアミラーゼにおいて見られるのと同じN末端でプロセシングされる
ことが判明した。
実施例2
メチオニン変異体の酸化安定性
例えばSpezyme(登録商標)AA20(Genencor Inter
national Inc.より市販されている)等のB.lichenifo
rmis αアミラーゼは、過酸化水素の存在により急速に不活性化される(図
7)。多様なメチオニン変異体が、B.subtilisの振とうフラスコ培養
および硫酸アンモニウム型で精製された粗上清中に発現された。アミラーゼは2
0%飽和硫酸アンモニウム上清から、硫酸アンモニウムを70%飽和まで引き上
げることにより沈殿され、再懸濁された。派生体は続いてpH5.0の0.88
M過酸化水素に25℃でさらされた。B.licheniformis αアミ
ラーゼ中の6つのメチオニン位置での変異体はさらに過酸化水素による酸化にさ
らされたが、位置+197(M197L)での入替体は過酸化物酸化に対する抵
抗性を示した(図7を参照されたい)。しかしながら、以下にさらに詳細に記述
される引き続いての分析においては、派生体はpH5.0、25℃では酸化に感
受性であるが、異なった条件(即ち液化)においては、改変された/改善された
性質を示しうる。
実施例3
位置197での可能な全ての派生体の構築
全てのM197派生体(M197X)が、A4型でカセット変異により図8に
略述されたように生産された:
1) 部位特異的変異(M13中のプライマーエクステンションによる)を、以
下の変異オリゴヌクレオチドを用いたM197Aを生産するために用いた:
このオリゴヌクレオチドはまた、EcoRVサイト(コドン200−201)を
、ClaIサイト(コドン201−202)を入れ替えて挿入した。
2)プライマーLAAM12(表2)を、別の沈黙制限サイト(BStBI)を
コドン186−188にかけて導入するために用いた。
3)その結果生じたM197A(BstB I+、EcoRV+)変異体は、続
いてプラスミドpA4BL中にサブクローン化され(PstI−SstI断片)
、その結果生じたプラスミドをBstB IおよびEcoRVで消化し、大きな
ベクターを含む断片をアガロースゲルから電気溶出により単離した。
4)合成プライマーLAAM14−30(表2)を、それぞれ、だいたいは相補
的である共通プライマーのLAAM13(表2)とアニーリングさせた。その結
果生じた、全ての残りの天然アミノ酸を位置+197においてコードしているカ
セットを、上記のように調製されたベクター断片に、個別に連結した。
カセットはライゲーションにおいてEcoRVサイトを破壊するよう設計され
ており、このようにE.coli形質転換体を、この唯一のサイトの欠失に関し
て検索した。これに加えて、カセットの共通底部鎖はフレームシフトを含み、N
siIサイトをコードし、このように、この鎖から派生した形質転換体は唯一の
NsiIサイトの存在に関する検索により排除可能であり、何れの場合でも、活
性型アミラーゼの発現につながることは期待されていない。
制限分析で陽性であったものはシークエンスにより確認し、振とうフラスコ培
地中での発現のためにB.subtilis中に形質転換された(図9)。続い
て、あるM197X変異体の比活性を水溶性基質アッセイにより決定した。以下
のアッセイ方法により得られたデータを表3に示す。水溶性基質アッセイ
: Megazyme社(AUSt.)Pty.Ltd.に
よって供給されている最終点アッセイキットをもとにして、レートアッセイを開
発した:各々の基質(p−ニトロフェニルマルトヘプタオシド、BPNPG7)
のバイアルを、10mlの滅菌水に溶解させ、続いて1から4のアッセイバッフ
ァー(50mMリンゴ酸バッファー、pH6.7、5mM塩化カルシウム、0.
002%Tween20)中での希釈を行った。10μlのアミラーゼを790
μlのキュベット中の基質に25℃で添加することによりアッセイを行った。加
水分解のレートは、75秒後の410nmの吸光度の変化のレートとして測定し
た。このアッセイは、0.4吸光単位/分まで直線的であった。
アミラーゼのタンパク質濃度は、Bradford,M.(1976)Ana
l.Biochem.72:248の方法に基づいた、牛血清アルブミンスタン
ダードを用いた標準的なBio−Radアッセイ(Bio−Rad Labor
atories)により測定した。デンプン加水分解アッセイ
: Spezyme(登録商標)AA20のαアミラ
ーゼ活性のアッセイのための標準的な方法を用いた。この方法は、ここに参考文
献として取り込まれている米国特許出願第07/785624号の実施例1に詳
述されている。天然デンプンは沃素と青色を形成するが、短いデキストリン分子
に加水分解されるとそれが出来なくなる。基質は、リン酸バッファー、pH6.
2(42.5gm/l二水素リン酸カリウム、3.16gm/l水酸化ナトリウ
ム)中の、可溶性Lintnerデンプン5gm/lである。試料を25mM塩
化カルシウムに添加し、活性は、30℃で保温して、沃素試験で陰性となるまで
にかかった時間として測定された。活性は、以下の公式に従って計算された、グ
ラムまたはml(LU)あたりのリケフォン(liquefons)で記録した
。
ここで、
LU=リケフォン単位
V=試料の容量(5ml)
t=デキストリン化時間(分)
D=希釈因子=希釈容量/添加した酵素のmlまたはg。
実施例4
派生体M15Lの特徴付け
以前の実施例のとおりに生産されたM15Lは、増加したアミラーゼ活性を示
さず(表3)、過酸化水素でまだ不活性化された(図7)。しかしながら、デン
プンのジェット液化において、特に以下の表4に示されるように低いpHにおい
て、著しく増加された作用を示した。
デンプン液化は、典型的には、混合チャンバーの後ろに2.5リッター遅延コ
イルを、および最終後部圧力バルブを備えたハイドロヒーターM−103−M蒸
気ジェットを用いて行った。デンプンはモイノポンプ(Moyno pump)
によって加えられ、蒸気は150psi蒸気ラインによって、90−100ps
iに減少されて供給される。温度プローブが、ハイドロヒーターのすぐ後ろで後
部圧力バルブのすぐ前に設置されている。
デンプンスラリーは、トウモロコシ湿式ミラーより得、2日以内に用いられた
。デンプンを脱塩水で所望の固体レベルに希釈し、デンプンのpHは2%NaO
Hまたは飽和Na2CO3によって調整した。典型的な液化の条件は:
デンプン 32%−35%固体
カルシウム 40−50ppm(30ppm添加)
pH 5.0−6.0
αアミラーゼ 12−14LU/g乾燥デンプンベース
であった。
デンプンを350ml/minでジェットに導入した。ジェット温度は105
℃−107℃に保たれた。デンプンの試料は、ジェットクッカーから95℃の第
2段階の液化に移され、90分間保持された。
第2段階の液化の直後に、デンプン液化の度合を、ともにStandard
Analytical Methods of the Member Com
panies of the Corn Refiners Associat
ion Inc.、第6版に記載されている方法にに従って、標準分析法試料の
デキストロース相当(DE)を決定すること、および生デンプンの存在を試験す
ることにより測定した。
デンプンを、上で与えられた条件下およびpH6.0で処理した場合、一般に
、生デンプン無しで約10DEの液化デンプンを得た。本発明の変異体を用いた
デンプン液化試験の結果を、表4に示す。
実施例5
M15X派生体の構築
上記の実施例3に記述された工程に一般に従って、M15における全ての派生
体(M15X)を、図12に概要を示したように、天然B.lichenifo
rmis中でカセット変異により生産した:
1)部位特異的変異(M13中でのプライマーエクステンションによる)を、M
15コドンに隣接した唯一の制限サイトを導入し、変異カセットの挿入を実現す
るために用いた。特に、コドン11−13のBstBIサイト、およびコドン1
8−20のMsc1サイトを、以下に示すオリゴヌクレオチドを用いて導入した
。
2)続いて、M15Xカセット変異のためのベクターを、変異アミラーゼ(Bs
tB1+、Msc1+)由来のSfi1−SstII断片を、プラスミドpB
Lapr中にサブクローン化することにより構築した。その結果生成されたプラ
スミドを、続いて、BstB1およびMsc1で消化し、そして大きなベクター
断片をポリアクリルアミドゲルから電気溶出により単離した。
3)変異カセットをM197X派生体に関して生産した。コドン15での入れ替
えをそれぞれコードしている合成オリゴマーを、共通底プライマーとアニーリン
グさせた。カセットとベクターとの適切なライゲーションにより、Msc1は破
壊され、このサイトの欠失により陽性形質転換体の検索が可能となった。底プラ
イマーは唯一のSnaB1サイトを有し、底鎖から派生した形質転換体を、Sn
aB1サイトの検索により排除することを可能にした。このプライマーはまた、
共通底鎖から派生した変異体のアミラーゼ発現を排除するフレームシフトを含有
している。
合成カセットは表5に列挙され、一般にカセット変異戦略は図12に記載され
ている。
実施例6
M15Xでのベンチ液化
実施例5のとおりに生産された11のM15置換派生体について活性を測定し
、
pH5.5でベンチ液化システムを用いた液化において、Spezyme(登録
商標)AA20(Genencor International,Inc.よ
り市販)と比較した。ベンチスケール液化システムは、前面端から約12インチ
の距離にある、7インチ長静的混合要素を備えたステンレススチールコイル(直
径0.25インチ、容積約350ml)および後面端部に30psi後部圧力バ
ルブから成る。コイルは、それぞれの端を除いて、熱静力学的に制御されたバス
を105−106℃に保温していた加熱要素を備えたグリセロール−ウォーター
バス中に浸されていた。
酵素を含むデンプンスラリーを、撹拌により懸濁液状に保ち、ピストン駆動メ
ータリングポンプにより70ml/minで、反応コイル中に導入した。デンプ
ンをコイルの端から回収し、第2保持(95℃、90min)へ移送した。第2
保持の直後に液化デンプンのDEを、実施例4に記述されているように測定した
。結果を図16に示す。
実施例7
M197X派生体の特徴付け
図9に見られるように、M197X(A4型)派生体によって示された幅広い
アミラーゼ活性(水溶性基質により測定)の範囲があった。アミラーゼは、2倍
量のエタノールでの沈殿および再懸濁により上清から部分精製した。それらを熱
安定性に関して、10mM酢酸バッファーpH5.0、5mM塩化カルシウムの
存在下で95℃で5分間加熱することによりスクリーニングした(図10);A
4野生型は保温後28%の活性を保持していた。M197WおよびM197Pに
関しては、活性なタンパク質を上清から回収することは出来なかった。配列決定
において、M197Hは、第2の変異N190Kを含んでいることが判明した。
M197Lは、別個の実験によって試験されたが、最も熱安定性の低い派生体の
1つであった。アミラーゼ活性の発現と熱安定性との間には幅広い関連があるよ
うに思われた。licheniformisアミラーゼは、位置197に何れの
アミノ酸を受け入れることが出来るかに関して、熱安定性の保持または促進の見
地から制限を受けている:システインおよびスレオニンは、これらの条件の下で
の最高の熱安定性には好ましいものであった一方で、アラニンおよびイソロイシ
ンは中間的な安定性であった。しかしながら、位置+197での他の置換は、他
の用途においては有用であるかもしれない低下された熱安定性という結果となっ
た。さらに、+197での異なった置換は、他の有利な性質、例えば改変された
pH作用特性または改変された酸化安定性を有しているかもしれない。例えば、
M197C派生体は、容易に空気酸化によって不活性化されるがことが判明した
が、促進された熱安定性を有していた。逆に、M197L派生体と比較して、M
197TおよびM197Aは高い熱安定性(図10)のみならず高い活性(表3
)を保持している一方で、pH5からpH10で過酸化物による不活性化に対し
て耐性を有していた(図7)。
実施例8
洗剤配合物における安定性および作用
M197T(A4型)、M197TおよびM197A(A4型)の、自動皿洗
い用洗剤(ADD)母体中での安定性を測定した。2ppmのSavinase
(登録商標)(プロテアーゼで、Novo Industriesから市販され
ており、ADDで普通に用いられるタイプ)を、2つの市販の漂白剤含有ADD
である:Cascade(登録商標)(Procter and Gamble
,Ltd)およびSunlight(登録商標)(Uniliver)に添加し
、アミラーゼ派生体およびTermamyl(登録商標)(Novo Nord
isk、A/Sより入手可能な熱安定性αアミラーゼ)の、65℃での不活性化
のタイムコースを続いて行った。両方の場合において用いられたADD製品の濃
度は、「pre−soak」条件に相当している:水1リットルに対して14g
m(ガロンあたり7グラムの硬度)。見られるとおり(図11aおよび11b)
、両方の型のM197T派生体は、最初のアッセイが行われる前に不活性化され
たTermamyl(登録商標)およびM197A(A4型)と比較して顕著に
安定であった。この安定性の利点は、以下の手順に従って決定されたように、デ
ンプンの存在下または非存在下で見られた。アミラーゼを、試験管内で前もって
温められた5mlのADDおよびSavinase(登録商標)に添加し、ボル
テックスした後、可溶性基質アッセイを用いて活性を時間の関数として測定した
。「+デンプン」管は、側面に焼き付けた(140℃、60分)スパゲティデン
プ
ンを有していた。結果は図11aおよび11bに示した。
実施例9
M15X派生体の特徴付け
全てのM15XをBacillus subtilisにおいて増加させ、発
現レベルを図13に示したようにモニターした。アミラーゼを分離し、20−7
0%の硫酸アンモニウム法により部分精製した。これらの派生体の水溶性基質に
たいする比活性は実施例3と同様に測定した(図14)。M15Xアミラーゼの
多くは、Spezyme(登録商標)AA20のそれより大きい比活性を有して
いた。ベンチトップ(benchtop)熱安定性アッセイを、アミラーゼを9
0℃で5分間、50mM酢酸バッファー、pH5.0中、5mM塩化カルシウム
存在下で加熱することにより行った(図15)。派生体のほとんどが、本アッセ
イにおいてSpezyme(登録商標)AA20と同様に作用した。このアッセ
イにおいて相応の安定性を示した派生体(相応の安定性とは、少なくともSpe
zyme(登録商標)AA20の熱安定性の60%の有するものとして定義)を
、デンプンに対する比活性とpH5.5での液化作用について試験した。これら
の変異体のうち、最も興味深いものを図16に示す。M15D、NおよびT、な
らびにLは、pH5.5の液化において、Spezyme(登録商標)AA20
を上回る性能を示し、水溶性基質とデンプン加水分解活性の両方のアッセイにお
いて増加した比活性を有していた。
一般に、位置15のメチオニンを置換することにより、増加された低pH液化
作用および/または増加された比活性を有する派生体を提供可能であることが発
見された。
実施例10
トリプトファンの酸化感受性
クロラミンT(N−クロロ−p−トルエンスルホンイミドナトリウム)は、選
択的酸化剤であり、中性またはアルカリ性のpHでメチオニンをメチオニンスル
ホキシドに酸化する。酸性pHにおいては、クロラミンTはメチオニンおよびト
リプトファンの両方を修飾する(Schechter,Y.,Burstein
,Y.and Patchornik,A(1975)Biochemistr
y
14(20)4497−4503)。図17は、B.licheniform
is αアミラーゼの、pH 8.0でのクロラミンTでの不活性化を示す(A
A20=0.65mg/ml、M197A=1.7mg/ml、M197L=1
.7mg/ml)。このデータは、位置197のメチオニンをロイシンまたはア
ラニンに変えることにより、αアミラーゼの不活性化を防止可能であることを示
している。これとは逆に、図18に示されるように、pH4.0では、M197
Aおよび、M197Lの不活性化は進行するが、より多くのクロラミンT当量が
必要である(図18;AA20=0.22mg/ml、M197A=4.3mg
/ml、M197L=0.53mg/ml;200mM酢酸ナトリウム、pH4
.0)。このことは、トリプトファン残基も、クロラミンT仲介不活性化事象に
おいて関与していることを示唆している。さらに、トリプティック(trypt
ic)マッピングおよびそれに続くアミノ酸配列決定により、位置138にある
トリプトファンがクロラミンTにより酸化されることが示唆された(データは示
さず)。これを証明するために、部位特異的変異をトリプトファン138に以下
に示したように導入した。αアミラーゼ二重変異体W138およびM197の調製
特定の派生体W138(F、YおよびA)を、M197Tである二重変異体と
して作成した(実施例3の記載と同様に作成された)。二重変異体は実施例1お
よび3記載の方法に従って作成された。一般に、単一陰性鎖のDNAを、B.l
icheniformis αアミラーゼM197T変異体の配列(PstI−
SstI)をコードしている1.72kbのM13MP18クローンより調製し
た。部位特異的変異を、以下に列挙したプライマーを用いて、T4遺伝子32タ
ンパク質およびT4ポリメラーゼをクレノーで代用したことを除いては、本質的
にZoller,M.et al.(1983)の方法に従って行った。全ての
プライマーは、適切な変異を有するクローンを同定するための唯一のサイトを、
所望の変異と同様に有していた。
トリプトファン138をフェニルアラニンへ
トリプトファン138をチロシンへ
トリプトファン138をアラニンへ −このプライマーはまた、位置138の上
流および下流の唯一のサイトを操作している。
変異体を制限分析で同定し、W138FおよびW138YをDNA配列決定に
より確認した。W138A配列は唯一のBspIおよびXmaIサイトとの間に
、ヌクレオチドの欠失があることが判明したが、残りの遺伝子は正確に配列決定
された。W138XおよびM197T変異の両方を有する1.37kbのSst
II−SstI断片を、M13MP18から発現ベクターpBLapr中に移動
させ、pBLapr(W138F、M197T)およびpBLapr(W138
Y、M197T)をその結果生産した。唯一のBspE IおよびXmaIサイ
トを含む断片を、pBLapr(BspE I、Xmal、M197T)中にク
ローン化したが、それは位置138に他のアミノ酸の置換を含んでいるクローニ
ングカセットのために有用であるからである。アミノ酸位置138の単一の変異
以前の実施例に一般に記載された方法に従って、特定のW138(F、Y、L
、HおよびC)単一派生体を生成した。実施例7のプラスミドpBLapr(W
138X、M197T)の、M197T変異を有しているAsp718−Sst
I断片を、197にメチオニンを有する野生型断片で入れ替え、pBLapr(
W138F)、pBLapr(W138Y)およびpBLapr(BspE I
、XmaI)を生成した。
変異体W138L、W138HおよびW138Cは、合成カセットをpBLa
pr(BspE I、XmaI)ベクター中に以下のプライマーを用いてライゲ
ーションすることにより調製した。
トリプトファン138をロイシンへ
トリプトファン138をヒスチジンへ
トリプトファン138をシステインへ
二重変異体M197T/W138FおよびM197T/W138Yとクロラミ
ンTの反応を、野生型と比較した(AA20=0.75ml、M197T/W1
38F=0.64mg/ml、M197T/W138Y=0.60mg/ml;
50mM酢酸ナトリウム、pH5.0)。図19に示された結果は、トリプトフ
ァン138の変異は、変異体がクロラミンTに対してより抵抗性となることを引
き起こしていたことを示している。
実施例11
多重変異体の調製
実施例1、3、5および10の方法に従い、以下の多重変異体を作成した:M
15T/M197T;M15S/M197T;W138Y/M197T;M15
S/W138Y/M197TおよびM15T/W138Y/M197T。これら
の多重変異体のあるものは、例えば、W138Y/M197Tが実施例10にお
いて作成、試験されたように、以前に実験された。多重変異体は制限分析で同定
した。
本発明の範囲に含まれる多様な多重変異体を、さらに、洗浄製品(自動皿洗い
機用洗剤)添加物としての作用について試験した。これらの試験は以下に詳述す
る。安定性試験
過ホウ酸およびTAEDを含む自動皿洗い用洗剤(ADD)の4000ppm
の溶液を、硬度7gpgの水中に調製した。上記の特定のアミラーゼ変異体を、
このADDに、Ceralpha法(Megazyme(Austr.)Pty
.Ltd.,Parramatta,NSW,Australia)によるアッ
セイで比率0.4を得るように添加した。1セットの試料を、室温(21−23
℃)で約30分保温した(非加熱)。第2のセットを室温から約65℃まで、酵
素の添加後に温めた(加熱)。酵素添加の30分後、アミラーゼ変異体の活性を
測定し、酵素添加時の活性に対する相対活性を計算した(相対活性%)。
図20に示されたこの結果は、B.licheniformisのαアミラー
ゼの位置+197にあるメチオニンは、ADD+過ホウ酸+TAEDを有する配
合物における安定性のためには修飾されるべきであることを示唆している。デンプン加水分解アッセイ
過ホウ酸およびTAEDを含む自動皿洗い用洗剤(ADD)の4000ppm
の溶液を、硬度7gpgの水中に調製し、調理された屈曲マカロニ(elbow
macaroni)の3つの破片を添加した。上記のアミラーゼ変異体を、こ
のADD溶液に終濃度で5ppm活性酵素となるよう添加した。チューブを50
℃で約30分保温し、解離した還元糖の濃度を、ジニトロサリチル酸法を用いて
、グルコース標準曲線に対して測定した。結果を表6に示す。
表6に示された結果は、M15T/M197T;M15S/M197T;W1
38Y/M197T;M15S/W138Y/M197TおよびM15T/W1
38Y/M197Tは、酵素の無い、および野生型αアミラーゼ対照と比較して
良好に作用した。オートミールの染み
調理し、混合したオートミールのペーストで、均等に皿を汚し、37℃で一晩
乾燥させた。皿をASKOモデル770皿洗い機中に入れ、45℃で急速洗浄サ
イクルで5%過ホウ酸、3%TAEDおよび11mgの特定のアミラーゼ酵素を
含む、10gの自動皿洗い用洗剤を用いて洗浄した。プレートを、汚す前、汚し
た後、および洗浄後に重さを計り、全てのプレートから除去された汚れの平均%
を計算した。データを以下の表7に示す。
データは、変異体酵素は、野生型酵素によって提供されるより大きな利益を提
供することを示している。オートミール除去において、野生型酵素は、酵素なし
のADDより20%大きい利益を提供した。
実施例12
皿洗い組成物
野生型および変異体アミラーゼの1%(w/w)粒子を、5%(w/w)過ホ
ウ酸一水素ナトリウムおよび3%(w/w)TAEDを添加したKorex自動
皿洗い機用洗剤とともに配合した。これらの配合物の試料を、室温(21−23
℃)、または80%の相対湿度および38℃、で4週間放置した。結果を図21
および22に示す。
この結果は、Ceralpha法によって測定された、野生型アミラーゼの活
性が、洗剤中での貯蔵時間の増加とともに減少していることを示している。室温
では、変異体酵素は完全に安定であった。38℃および80%相対湿度において
は、すべての変異体酵素は野生型より安定であった。
これらの変異体アミラーゼを自動皿洗い機用洗剤に配合する利点とは、これら
の変異体は、過ホウ酸およびTAEDの存在下において野生型より顕著に安定で
あり、それらは洗浄中、デンプンの食物の汚れの除去において顕著に作用する利
益を提供することである。
実施例13
酸化安定性プロテアーゼ/酸化安定性アミラーゼの安定性の研究
1)野生型プロテアーゼおよび野生型アミラーゼ;または2)US Re34
606に記載された方法によって生成された漂白剤安定性プロテアーゼ(GG3
6−M222S)および漂白剤安定性アミラーゼ(AA20−M15T−W13
8Y−M197Tの何れかを含む酵素粒子を、0.1Mホウ酸ナトリウムpH1
0.2および0.005%Tween80を含むバッファー中に、各々の酵素1
2.5mgの濃度で溶解させた。これらの溶液の9mlに、1mlの水または1
mlの30%過酸化水素を添加した。溶液を25℃で30分間保温した後、プロ
テアーゼおよびアミラーゼ活性を測定し、元々の活性の%として示した。データ
を以下の表8に示す。
データは、両方とも酸化に感受性であるアミノ酸残基の変異を有する漂白剤安
定性アミラーゼ変異体および漂白剤安定性プロテアーゼ変異体の組合せは、漂白
剤による不活性化に対して耐性である配合物中でのプロテアーゼおよびアミラー
ゼの組み合わされた利益をもたらした。漂白剤安定性アミラーゼと漂白剤安定性
プロテアーゼの組合せは、漂白剤中で30分後においてもその初期活性のほとん
どを保持していたが、野生型酵素の組合せは、同じ期間の時点で初期活性の80
%以上を失っていた。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Improved cleaning composition Field of the invention
The present invention relates to a novel α-amylase variant having an amino acid sequence not found in nature
Such a variant comprises one or more precursor α
The amino acid residues of the amylase, especially any oxidizable amino acids, are different
It has an amino acid sequence that is substituted with a amino acid. The variant enzyme of the present invention may comprise a modified acid
Including modified stability, modified pH action characteristics, modified specific activity and / or modified temperature stability
Show modified stability / activity properties, including but not limited to:Background of the Invention
α-amylase (α-1,4-glucan-4-glucanohydrolase, EC3.
2.1.1) significantly increases the internal α-1,4-glycosidic bonds in starch
To produce maltodextrin with low molecular weight. α-amylase
Has considerable commercial value and in the first stage of starch processing (liquefaction);
In the manufacture of alcohol; as a detergent in the detergent matrix; and for the removal of starch
For use in the textile industry. α-amylase is a B.A. licheni
formis, B.S. amyloliquefactants, B.A. subtil
is or B. Produced from microbial sources such as stearothermophilus
Bacillus and Asperg, along with the most commercial amylase
It is produced by a wide range of microorganisms, including illus. In recent years, commercial use
Preferred enzymes work with temperature stability at least at neutral and slightly alkaline pH.
From the business, B. licheniformis.
To determine which residues are important for the catalytic activity of amylase,
And / or modification of specific amino acids inside active centers of various amylases
(Vihinen, M. et al. (1990) JB
ichem. 107: 267-272; Holm, L .; et al. (1990
) Protein Engineering 3: 181-191; Taka
se, K .; et al. (1992) Biochemica et Bioph.
ysica Acta, 1120: 281-288; Matsui, I .; et
al. (1992) Febs Letters Vol. 310, no. 3; p
p. 216-218); Which residues are important for temperature stability (Suzuki)
, Y. et al. (1989) J. Am. Biol. Chem. 264: 18933
-18938); studies using recombinant DNA technology have been conducted.
One group describes such a method in B.S. licheniformis amira
Used to introduce mutations at various histidine residues in the histidine residue.
The basis for causing substitution in the group licheniformis amirror
Ze, which is known to be thermostable, works with other similar Bacillus amylase
When compared, they have an excess of histidine residues and therefore
It was suggested that the replacement would change the thermostability of the enzyme (D
eclerck, N.M. et al. (1990) J. Am. Biol. Chem. 26
5: 15481-15488; FR 2 665178-A1; Joyet, P.
. et al. (1992) Bio / Technology 10: 1579-.
1583).
α-amylase is produced at pH 4 and 10.5 by hydrogen peroxide and other oxidants.
In between, it is clear that they are inactivated as described in the examples herein.
Was. Commercially, α-amylase enzymes are available in both high and low
Used under dramatically different conditions, such as pH conditions. For example, α-amylase
For liquefaction of starch, a process that is preferably carried out at low pH (pH <5.5)
You can be. Amylases, on the other hand, often contain oxidizing agents such as bleach and peracids,
It may also be used in commercial dish or laundry detergents under more alkaline conditions.
You.
To alter the stability or activity characteristics of the amylase enzyme under a variety of conditions,
For example, methionine, tryptophan, tyrosine, histidine or cysteine
Selective substitution, substitution, or deletion of oxidizable amino acids
It was found that this resulted in the properties of the modified mutant enzyme. Currently marketed
Amylase is not acceptable (unstable) under a variety of conditions and
There is a need for amylase with altered stability and / or activity properties
. Altered stability (oxidation, temperature, or temperature) compared to wild-type or precursor enzymes
Or pH action properties) can be achieved while maintaining adequate enzyme activity.
Features affected by the introduction of such mutations maintain thermal stability.
The change in oxidative stability while doing so, or vice versa, may be used. Additionally, alpha
Substitution of an oxidizable amino acid for another amino acid in the
Is the deletion of one or more oxidizable amino acids
Results in altered enzyme activity at a pH other than the optimum considered
There is also. In other words, the mutated enzymes of the present invention rely on the enhanced oxidative stability of the enzyme.
It also has modified pH-acting properties, which can be:Summary of the Invention
The present invention relates to a novel expression product of a mutant DNA sequence encoding α-amylase.
One or more oxidizable amino acid mutants from the precursor α-amylase
Mutated DNA sequences derived from deletion or substitution (replacement) of functional amino acids
Related. In one preferred aspect of the invention, the mutation is the precursor alpha amino acid.
Substituting one or more methionine residues in the
It is derived from. In another preferred aspect of the invention, the mutation is a precursor.
-Only one or more tryptophan residues, or one or more
Includes substitutions in combination with onine residues. Such mutant α-amylases are generally
Substituting or deleting one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the precursor
Pre-coding encoding a naturally occurring or recombinant α-amylase as it encodes
Obtained by modifying the DNA sequence of the DNA in vitro.
Preferably, one or more amino acid substitutions or deletions occur in one or more of such sequences.
Methionine, tryptophan, cysteine, histidine, or tyrosine residue
Most preferably, the residue to be changed is methionine.
Residue. Oxidizable amino acid residues can be any of the twenty natural amino acids.
Can be interchanged. If the desired effect alters the oxidative stability of the precursor
Optionally, the amino acid residue is an amino acid that is not oxidizable (eg, alanine,
Arginine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, guri
Syn, isoleucine, leucine, lysine, phenylalanine, proline, serine
, Threonine or valine) or other oxidizable amino acids (eg, cysteine
Methionine, tryptophan, tyrosine or histidine, most easily oxidized
In the order from those that are easily oxidized to those that are not easily oxidized)
. Similarly, if the desired effect is a modification of the thermostability, the 20 natural amino acids
Any of the acids may be substituted (eg, when cysteine is replaced by methionine
Good).
Preferred mutations are described in licheniformis alpha amylase
Methionine residues (+8, +15, +197, +256, +304, +366 and
And +438) for methionine residues. Most preferred
Is methionine to be replaced, licheniformis α Amira
Methionine corresponding to position +197 or +15 in the ose. Methionine
A preferred replacement amino acid for replacement at position +197 is alanine (A
), Isoleucine (I), threonine (T) or cysteine (C). Rank
Preferred substituted amino acids at the position +15 are leucine (L), threonine (T),
Sparagine (N), aspartic acid (D), serine (S), valine (V) and
Other substituted amino acids that are isoleucine (I) but not specified above are also
Will be useful. Two particularly preferred mutations of the invention are M197T and M15L
.
Another embodiment of the present invention relates to licheniformis α-amylase (FIG. 2)
Tryptophan residues corresponding to any of the tryptophan residues found in
Variants that include substitution of groups. Preferably, the tryptophan residue to be replaced
The group is licheniformis corresponds to +138 in α-amylase
Of the position. Mutation (substitution) of a tryptophan residue can be performed alone,
Alternatively, it may be made in combination with mutation of another oxidizable amino acid residue. Especially,
Combining at least one tryptophan with at least one methionine
Can be modified by substitution (eg, double mutation + 138 / + 197).
It is advantageous.
The α-amylase variants of the present invention generally comprise hydrogen peroxide and a bleach or peracid.
The presence of other oxidants, such as chloramine-T, and more particularly mild oxidants, such as chloramine-T.
Below, an altered oxidative stability is shown. Mutant enzymes with enhanced oxidative stability
With shelf life, bleach, peroxyboric acid, peroxycarbonic acid, or peracid
It is useful for extending compatibility with amylase used in cleaning products.
Similarly, reduced oxidative stability requires rapid and efficient loss of enzyme activity
Useful in industrial processes. The mutant enzymes of the present invention also provide enhanced pH action characteristics.
So that mutants such as M15L can be used for low pH starch liquefaction processes.
Mutants such as M197T are stable under high pH washing product conditions.
Is shown. The variants of the present invention also exhibit altered temperature stability, thereby
Variants exhibit stability at either high or low temperatures. Compared to the precursor
Any change (increase or decrease) in the enzymatic properties of any of the mutants
It can be advantageous depending on the end use.
In addition to starch processing and cleaning applications, the derived amylase of the present invention can
It can be used in any application where the enzyme is used.
Millase can be used in textile processing, food processing and the like. In particular, derivative enzymes such as M197C
Is easily inactivated by an oxidizing agent, but is completely amylase-activated at the end of the process.
Useful in processes requiring removal of water, such as frozen food processing applications
Was observed.
Preferred α-amylase variants of the invention are those described in licheniformis,
B. amyloliquefactants, and B.A. stearother
Bacillus strains, such as B. mophilus, and most preferably Bacillus.
licheniformis.
In another embodiment of the present invention, usually by licheniformis
New types of alpha-amylase to be produced have been provided. This new type is A4 type
And four additional alanine residues at the N-terminus of the secreted amylase.
(FIG. 4b). Derivatives or variants of the A4 type of α-amylase are described in the present invention.
included. Depending on the type A4 derivative or variant, the invention provides, for example,
One or more mutations (substitutions, substitutions or deletions) in one or more oxidizable amino acids
A4 type α-amylase having an additional mutation of
In embodiments of the composition of the present invention, described herein are in liquid, gel or granular form.
Detergent compositions comprising the disclosed α-amylase variants are provided. Especially preferred
The +197 position mutant alone or the endoglycosidase, cellular
Combination with other enzymes such as enzymes, proteases, lipases or other amylase enzymes
It is a detergent composition contained in the composition. Additionally, the composition of the present invention may comprise one or more
An α-amylase variant having a site-specific mutation may be included.
In yet another compositional aspect of the present invention, starch processing, especially starch
Compositions useful for pour liquefaction are provided. The liquefied starch compositions of the present invention are preferred.
Or an α-amylase variant having a substitution or deletion at position M15
. Additionally, such compositions may include, for example, antioxidants, calcium, ions, etc.
It has been observed that it may contain components known to those skilled in the art, including:
In a process embodiment of the invention, the densities from a wet or dry mill process are
A method is provided for the liquefaction of a starch, especially a granular starch slurry. In general
In the first stage of the starch degradation process, the starch slurry is relatively hot (
(Up to about 110 ° C.). After the starch slurry has been gelatinized
, It is liquefied and dextrinized using α-amylase. Such liquid
The conditions for the conversion are described in commonly assigned U.S. patent application Ser. No. 07 / 785,624.
No. 07 / 785,623 and US Pat. No. 5,180,669.
And their disclosures are incorporated herein by reference. This method is
An effective amount of the α-amylase of the present invention is added to the starch, alone or in an additional
Added in combination with excipients, slurries starch at appropriate time and temperature
For the liquefaction of starch.
A further aspect of the present invention relates to a mutant α-amylase of the present invention (type A4 and mutants thereof).
And an expression vector encoding the DNA.
As well as host cells transformed with such expression vectors.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIG. α-ami from L. licheniformis (NCIB8061)
DNA sequence of the Rase gene, SEQ ID NO: 31, and Gray, G .; et al
. (1986) J. Am. Bacter. 166: 635-643.
The constant translation product is shown.
FIG. α-ami from L. licheniformis (NCIB8061)
SEQ ID NO: 32 shows the mature amino acid sequence of the lase, SEQ ID NO: 32.
FIG. 3 shows the primary structures of Bacillus α-amylase arranged side by side. B. lic
heniformis amylase (Am-Lich), SEQ ID NO: 33, comprises Gr
ay, G .; et al. (1986) J. Am. Bacter. 166: 635-64
3 and B.3. amyloliquefaciens amylase (A
m-Amylo), SEQ ID NO: 34, is described in Takkinen, K .; et al. (
1983) J. Biol. Chem. 258: 1007-1010
B; stearothermophilus (Am-Stearo), distribution
Column number 35 is from Ihara, H .; et al. (1985) J. Amer. Bioche
m. 98: 95-103.
Figure 4a shows the amino acid sequence of the mature α-amylase derivative M197T, SEQ ID NO: 36.
Is shown.
FIG. A4 type derived from L. licheniformis NCIB8061
SEQ ID NO: 37 shows the amino acid sequence of α-amylase. Numbering is from the N-terminus
Starting with four additional alanines.
FIG. 5 shows plasmid pA4BL, in which BLAA is
B. licheniformis α-amylase gene, PStI to SstI
Refers to; AmpRRefers to the ampicillin resistance gene from pBR322; CAT
Indicates a chloramphenicol resistance gene derived from pC194.
FIG. licheniformis (SEQ ID NO: 38); subti
lis (SEQ ID NO: 39), B. lac in pA4BL. licheniformis (distribution
Column no. 40) and B. in pBLapr. licheniformis (sequence number
No. 41) shows the signal sequence-mature protein binding portion
FIG. 7a shows that certain α-amylases (Spezyme® AA20 and
0.88 MH of M197L (A4 type)TwoOTwoInactive at pH 5.0, 25 ° C
Shows sexualization.
FIG. 7b shows the specific α-amylase (Spezyme® AA20, M1
97T), 0.88 MHTwoOTwoShows inactivation at pH 10.0 and 25 ° C.
ing.
FIG. 7c shows a specific α-amylase (Spezyme® AA20, M1
5L), 0.88 MHTwoOTwoAt pH 5.0, 25 ° C.
.
FIG. 8 is a schematic diagram of the production of the M197X cassette mutant.
FIG. 9 shows expression of M197X derivatives.
FIG. 10 shows the M197X derivative, pH 5.0, 5 mM CaCl2.Two5 at 95 ° C
Thermal stability in minutes of processing.
11a and 11b show the inactivation of certain enzymes in automatic dishwashing detergents.
Is shown. FIG. 11 a shows a specific amylase cascade® (commercially available).
Stability at 65 ° C in the presence or absence of starch in dishwashing products).
You. FIG. 11b shows a specific amylase, Sunlight® (a commercial dishwasher).
Stability at 65 ° C. in the presence or absence of starch.
FIG. 12 shows a schematic diagram of the production of the M15X cassette mutant.
FIG. 13 shows expression of M15X derivatives.
FIG. 14 shows the specific activity of M15X on soluble starch.
FIG. 15 shows the M15X derivative at 90 ° C., pH 5.0, 5 mM CaCl 2.Two5 minutes
Thermal stability in the interim processing.
FIG. licheniformis wild-type percent activity and
Specific activity of M15 derivatives against starch and water-soluble substrates, and p
It shows the effect of jet liquefaction at H5.5.
FIG. 17 shows that derivatives M197A (1.7 mg / ml) and M197L (1.7
mg / ml) in the presence of chloramine-T at pH 8.0. lich
Inactivation of eniformis α-amylase (AA20, 0.65 mg / ml)
Shows
FIG. 18 shows derivatives M197A (4.3 mg / ml) and M197L (0.5 mg / ml).
3 mg / ml) in the presence of chloramine-T at pH 4.0. lic
Inactivation of heniformis α-amylase (AA20, 0.22 mg / ml)
Indicates sexualization.
FIG. 19 shows the dual derivatives M197T / W138F (0.64 mg / ml) and
Chloramine-T presence compared to M197T / W138Y (0.60 mg / ml)
In the presence of B.I. licheniformis α-amylase (AA2
0, 0.75 mg / ml).
FIG. 20 shows various α-amillas incorporated in an automatic dishwashing detergent (ADD) formulation.
The results of stability studies of multiple mutants at elevated temperatures from room temperature to 65 ° C.
Show.
FIG. 21 shows automatic dishwashing of specific amylase variants (compared to wild type).
Determined as the percent activity remaining in the formulation over the period of 0-30 days
It shows a defined stability.
FIG. 22 shows automatic dishwashing of specific amylase variants (compared to wild type).
Stable at 0 ° C (100 ° F), 80% relative humidity for 0-30 days in the formulation
Shows sex.Detailed description of the invention
Amylase used for starch liquefaction is present in the starch slurry
Believe that some activity would inevitably result in some inactive forms
(Commonly owned U.S. origin, incorporated herein by reference)
Nos. 07 / 785,624 and 07 / 785,623 and US Pat.
80669, issued January 19, 1993). Furthermore, for example, drift
The use of amylase in the presence of oxidizing agents such as whitening agent- or peracid-containing detergents is
This can result in partial or complete inactivation of the milases. Therefore,
Akira focuses on modifying the oxidation sensitivity of amylase. Mutations of the invention
Enzymes may also be modified by increased oxidative stability at low or high pH.
Modified pH properties and / or modified thermal stability.
As used herein, α-amylase includes naturally occurring amylase and recombinant amylase.
Including lase. A preferred amylase of the present invention is a B-amylase as disclosed herein.
. , including an A4-type α-amylase derived from B. licheniformis. l
icheniformis or B.i. stearothermophilus or
Α-amylase derived from Aspergillus (eg, A. oryz)
a
e and A. niger et al.) and other fungal α-amylases.
Recombinant α-amylase is a DNA sequence encoding a natural α-amylase,
Replacement, insertion or deletion of one or more amino acids in the α-amylase sequence
Α-amylase that has been modified to produce a mutated DNA sequence
Point. Suitable modifications are described here and are commonly owned rice
Nos. 4,476,0025 and 5,185,258, which are incorporated herein by reference.
Their disclosure is incorporated by reference.
Almost any sequence of plants, mammals and bacteria ever sequenced
Homology has been discovered between endoamylases (Nakajima, R .;
T. et al. (1986) Appl. Microbiol. Biotech
nol. 23: 355-360; Rogers, J.M. C. (1985) Bioc
hem. Biophys. Res. Commun. 128: 470-476).
One particular basyl amylase has four particularly homologous regions shown in FIG.
And the underlined sections indicate regions of high homology. further
Used sequence alignments to map the relationship between Bacillus endoamylases
(Feng, DF and Doolittle, RF (1987) J
. Molec. Evol. 35: 351-360). B. stearother
mophilus and B.M. licheniformis amylase
Sequence homology is described in Holm, L .; et al. (1990) Protein
Engineering 3 (3) pp. About 181-191
66%. B. licheniformis and B. amylolique
sequence homology with S. facilens amylase is described in Holm, L .; et a
l. As mentioned above, it was about 81%. Sequence homology is also important, but
It is important to note that structural homology is important in comparison with zeolites or other enzymes.
It is generally recognized. For example, fungal amylase and bacterial (Bacillus) amylase
Have been proposed and, therefore, the fungal amylase of the present invention
include.
One α-amylase is derived from the amino acid sequence of the precursor α-amylase
Having an amino acid sequence of Its precursor α-amylase is produced naturally
Includes α-amylase and recombinant α-amylase (as defined). α Amira
The amino acid sequence of the protease variant may include one or more of the precursor amino acid sequences.
Amino acid substitution of the precursor α-amylase by amino acid substitution, deletion or insertion
Derived from the column. Such modifications can be made by the precursor α-amylase enzyme itself.
Encodes the amino acid sequence of the precursor α-amylase, rather than
Modification of the precursor DNA sequence. Suitable modification methods are described here.
And commonly owned U.S. Patent No. 4760025 and
No. 5,185,258.
Position M19 of Bacillus licheniformis α-amylase
7, certain residues corresponding to M15 and W138 have, due to substitution or deletion,
All methionine, histidine, tryptophan, cysteine and tyrosine positions
As identified here. Amino acid position numbers (eg, +197) are shown in FIG.
Mature Bacillus licheniformis α-amylase sequence
Points to the number assigned to the column. However, the present invention
α-amylase (B. licheniformis)
No, B. licheniformis, specifically identified in mature α-amylase
Also extends to the precursor α-amylase containing the amino acid residue at the position corresponding to the residue.
Is stretched. One residue (amino acid) of a precursor α-amylase is
However, B. licheniformis α-amylase
Homology (e.g., position matches in either primary or tertiary structure)
Or similar) (e.g., the same or similar functional, binding,
Or have the ability to interact chemically or structurally). licheni
formis α-amylase.
To achieve homology to the primary structure, the precursor α-amylase
The amino acid sequence can be directly licheniformis α-amylase primary sequence
It is known that the sequence, especially the sequence, does not change with all known α-amylases.
A series of amino acid residues were compared as shown in FIG. Equivalent by tertiary structure
It is also possible to determine the residues: porcine pancreatic α-amylase (
Buisson, G .; et al. (1987) EMBO J .; 6: 3909
-3916); Aspergillus oryzae-derived Taka-amylase A (
Matsuura, Y .; et al. (1984) J. Amer. Biochem. (To
kyo) 95: 697-702); Niger-derived acid α-amylase
(Boel, E. et al. (1990) Biochemistry 29:
6244-6249), and the former two structures are similar. B
There is no published structure for A. acillus α-amylase, but
(MacGregor, EA).
& Svensson, B .; (1989) Biochem. J. 259: 14
5-152) and B.I. Stearothermophilus enzyme is hawk
It has been modeled based on that of amylase A (Holm, L et al.
. (1990) Protein Engineering 3: 181-191.
). The four highly conserved regions shown in FIG. 3 are considered to be part of the active site.
(Matsuura, Y. et al. (1984) J. Bioche.
m. (Tokyo) 95: 697-702); Buisson, G .; et al
. (1987) EMBO J .; 6: 3909-3916; Vihinen, M .;
et al. (1990) J. Am. Biochem. 107: 267-272), l
His105 in the number of geniformis; Arg229; As
p231; His235; many residues including Glu261 and Asp328.
Contains.
An expression vector as used herein affects the expression of DNA in a suitable host.
Having a DNA sequence operably linked to a suitable control sequence capable of
Refers to a DNA construct. Such control sequences include promoters that affect transcription,
Additional operator sequences that can further control such transcription, appropriate mRNAs
Controls sequences encoding the ribosome binding site and termination of transcription and translation
Control sequences may be included. Preferred promoters are subtilis
aprE promoter. Vectors can be plasmids, phage particles, or
May be a potential genomic insert. Once transformed into a suitable host
And the vector replicates and functions independently of the host genome, or in some cases
, Integrated into the genome itself. As used herein, the plasmid
Most
Is also in the form of a commonly used vector, so the plasmid and vector
Often used interchangeably. However, the present invention does not
And also include other forms of expression vectors known or known in the art.
Is intended.
Host strains (or cells) useful in the present invention are generally prokaryotic or eukaryotic.
A nuclear host and any transformable microparticle capable of expressing α-amylase therein.
Including living things. In particular, the same species as that from which α-amylase is derived, such as a Bacillus strain
Or a host strain of the genus is preferred. Preferably, an α-amylase-negative strain (lacking the gene)
Bac) in which α-amylase and protease have been deleted
illus subtilis BG2473 (ΔamyE, Δapr, Δnp
Bacillus strains such as r) are used. Host cells are constructed using recombinant DNA technology
The vector is transformed or transferred. Such a transformed host cell
Vesicles replicate vectors encoding α-amylase and its derivatives (mutants)
Or express the desired α-amylase.
Noh.
Preferably, the variants of the invention are secreted into the culture medium during fermentation. For example
Any suitable signal sequence, such as an aprE signal peptide, can be used to achieve secretion.
May be used for
Many of the α-amylase variants of the present invention can be used in a variety of detergent compositions, especially in certain dishwashing.
Cleaning compositions, particularly useful in formulating cleaning compositions containing known oxidizing agents.
. The α-amylase variant of the present invention may be a known powdered, liquid, or gel-form.
It can be incorporated into detergents having a pH from 5 to 12.0. Suitable granular
The composition is a commonly owned rice, incorporated herein by reference.
National Patent Application Nos. 07 / 429,882, 07 / 533,721, 07/957
No. 973. These detergent cleaning compositions, for example,
Other known proteases, lipases, cellulases, endoglycosidases and other
Enzymes or other amylases, as well as builders, stabilizers, or other
Excipients may be included. These enzymes are co-granulated or blended
Or may be present in other ways known to those skilled in the art. In addition, multiple variables
Different
It has been observed by the present invention that the body is useful in cleaning or other uses
. For example, a mutant enzyme that has changes at both +15 and +197 can be used in cleaning products.
Or a change at +197 and +138.
Having multiple variants may have improved action. For cleaning products and dishwashing formulations
Particularly preferred enzymes for use include M15T / M197T; M15S / M19.
7T; W138Y / M197T; M15S / W138Y / M197T; and M
15T / W138Y / M197T, but is not limited thereto.
Another aspect of the present invention relates to the variant α-amylases described herein and other enzymes.
(Ie, proteases, lipases, cellulases, etc.), and preferably oxidative stability
It consists of a combination with a protease. Suitable oxidatively stable protease
Include, for example, US Re 34606, incorporated herein by reference.
The engineered proteases described, as well as DURAZYM (Nov
o Nordisk), MAXAPEN (Gist-brocades) and
PURAFECT OXP (Genencor International)
Inc. ) And other commercially available enzymes. Such protease variants (ammonium oxide
Suitable methods for producing qualitative proteases) and, in particular, B. amyloli
A variant having a methionine substitution corresponding to position M222 in P. quefaiens.
Variants are described in US Re 34606. Among other subtilisins,
Suitable methods for determining the "equivalent" position are incorporated herein by reference.
Re 34606, EP 257446 and USSN 212291
Are listed.
As mentioned above, the α-amylase variant of the present invention also provides for starch liquefaction.
Useful. Starch liquefaction, particularly liquefaction of granular starch slurries, is typically medium
It is carried out at a pH near the pH and at a high temperature. Commonly Owned US Application No. 07
No. 7,788,624, 07 / 788,623 and US Pat. No. 5,180,669.
Several oxidizers or deactivators are used in typical liquefiers, as described in
Appear to be able to affect enzymatic activity;
In related patent applications, antioxidants have been added to protect the enzymes.
Commonly owned U.S. application Ser. Nos. 07 / 788,624, 07 / 788,623.
Liquefaction process as described in US Pat. No. 5,180,669 and US Pat. No. 5,180,669.
Under the conditions of low pH, high temperature and potential oxidation conditions.
Preferred variants of the present invention are those that have altered pH-acting properties (ie, low pH properties).
PH <6 and preferably pH <5.5), and / or modified heat
Stability (ie high temperature, about 90-110 ° C.) and / or modified oxidative stability
(Ie, enhanced oxidative stability).
Thus, the present invention teaches an improved starch liquefaction method,
The method comprises the steps of bringing the granular starch slurry from the wet or dry mill process to a pH of about 4 to 6.
Then, an appropriate amount of the α-amylase variant of the present invention is added to the starch slurry to liquefy.
And, optionally, add an appropriate amount of an antioxidant or other excipient to the slurry.
And reacting the slurry for a suitable time and temperature to liquefy the starch.
To consist of
The following are provided as examples and have been constructed as a limitation of the scope of the claims.
Not. Abbreviations used herein, especially tables of three or one letter amino acids
See, Dale, J. et al. W. , Molecular Genetics of B
acteria, John Wiley & Sons, (1989) Appe
ndix B.Example
Example 1
B. replacement of methionine residues in L. licheniformis α-amylase e
α-amylase gene (Fig. 1)
of Industrial Bacteria, Aberdeen, Scot
B. obtained from B.land. licheniformis NCIB8061
Cloned (Gray, G. et al. (1986) J. Bacter
ology 166: 635-643). Last 3 residues of signal sequence, complete
Encoding the terminator region of the mature protein and signal sequence
The 72 kbstI-SstI fragment was subcloned into M13MP18. Combination
Insert the terminator between the BclI and SstI sites, with the following types:
B. amyloliquefaciens subtilisin transcription terminator
Was added using a synthetic oligonucleotide cassette designed to contain
ells et al. (1983) Nucleic Acid Research
ch 11: 7911-7925).
Site-directed mutagenesis using oligonucleotides is inevitable in Zoller, M .;
et al. (1983) Meth. Enzymol. 100: 468-500
Briefly, the desired mutation was introduced into the M13-stranded DNA template.
Oligonucleotide primers that have been 5'-phosphorylated for incorporation into rates
Using the oligonucleotides listed in Table I with B.I. licheni
each of the seven methionines found in the formis α-amylase
Used to replace. Each mutant oligonucleotide also has a restriction endonuclease.
Aasesite was introduced for use as a screen for ligated mutations.
The heteroduplex is designated E. coli. coli mutL cells (Kramer et al.
(1984) Cell 38: 879) and used for plaque purification.
The clone was subsequently analyzed by RF1's restriction enzyme analysis. Positive ones
Deoxy sequencing (Sanger et al. (1977) Proc. Nat).
l. Acad. Sci. U. S. A. 74: 5463-5467),
Each PstI-SstI fragment was replaced with E. coli. coli vector, plasmid pA4BL
Subcloned intoPlasmid pA4BL
U.S. application Ser. No. 860,468 (Pow, incorporated herein by reference).
er et al. ) According to the method described in
The aprE gene from pS168-1 (Stahl, ML and Ferr
ari, E .; (1984) J. Amer. Bacter. 158: 411-418)
+1 (the first amino acid following the signal degradation site). aprE pro
The motor and signal peptide regions were subsequently transferred to the pJH101 plasmid (Fe
rrari, F.R. A. et al. (1983) J. Amer. Bacter. 154: 1
513-1515) as a HindIII-PstI fragment,
pUC18-derived plasmid JM102 (Ferrari, E. and Hoc)
h. A. (1989) Bacillus, ed. C. R. Harwood,
Plenum Pub. Pp. 57-72). B.
attachment of a PstI-SstI fragment derived from L. licheniformis α-amylase
In addition, the resulting aprE signal peptide-Amira shown in FIG.
PA4BL (FIG. 5) having a ribose bond is provided.B. Transformation into subtilis
pA4BL is E. coli. E. coli and can be replicated. in the subtilis chromosome
It is a plasmid that can be integrated. Plastic containing different derivatives
Sumid is B.I. subtilis (Anagnostpoulo)
s, C.I. And Spizizen, J. et al. (1961) J.I. Bacter. 81:
741-746), a Campbell-type mechanism (Young, M. (198)
4) J.I. Gen. Microbiol. 130: 1613-1621),
It integrated into the chromosome at the aprE locus. Bacillus subtil
The isBG2473 strain contains amylase (ΔamyE) and two proteases.
I168 (Stahl, M.L.an) which has been deleted for (.DELTA.apr, .DELTA.npr).
d Ferrari, E .; (1984) J. Amer. Bacter. 158: 411-4
18 and US Pat. No. 5,264,366, which are incorporated herein by reference.)
Is a derivative of After transformation, sacU32 (Hy) (Henner, DJ).
. et al. J. Bacter. 170: 296-300) Mutation with PBS-1
Introduced by mediated transduction (Hoch, JA (1983) 154: 15).
13-1515).
pA4BL to B.I. N-terminal solution of amylase expressed in subtilis
Analysis revealed that four extra alanines were secreted into the secreted amylase protein.
At the N-terminus (type A4). These extra
Residues have significant and detrimental effects on A4 amylase activity and thermostability
And may promote action in some applications. For subsequent experiments
A correctly processed form of licheniformis amylase
And mutant M197T were made from a very similar construct (see FIG. 6). Special
Next, the 5 'end of the A4 construct was placed on the EcoRI-SstII fragment, pA4BL (Fig.
From 5) to M13BM20 (Boehringer Mannheim),
Subcloning to get template for mutant oligonucleotides below
Was:
This primer removes the extra four N-terminal alanines and the corrected version is PstI
Searched for lack of site. The EcoRI-SstII fragment was converted to a pA4BL vector.
(FIG. 5) and subcloned to obtain a plasmid pBLapr. Continued
The replacement of M197T was performed on the SstII-SstI fragment with pA4BL (M197
T) can be transferred into the complementary pBLapr vector and the plasmid p
BLapr (M197T) is provided. B. pBLapr in subtilis
N-terminal analysis of the amylase expressed from lichenifo
Processed at the same N-terminus as found in rmis α-amylase
It has been found.
Example 2
Oxidation stability of methionine mutants
For example, Spezyme (registered trademark) AA20 (Genencor Inter
national Inc. B.). lichenifo
rmis α-amylase is rapidly inactivated by the presence of hydrogen peroxide (Fig.
7). Various methionine variants have been identified in B.A. Subtilis shake flask culture
And expressed in the crude supernatant purified in ammonium sulfate form. Amylase 2
Raise ammonium sulfate to 70% saturation from 0% saturated ammonium sulfate supernatant
Precipitated and resuspended. The derivative is subsequently 0.88 at pH 5.0
M Hydrogen peroxide at 25 ° C. B. licheniformis α-ami
Mutants at the six methionine positions in the lase are further subject to oxidation by hydrogen peroxide.
However, the replacement at position +197 (M197L) is resistant to peroxide oxidation.
It showed resistance (see FIG. 7). However, described in more detail below
In a subsequent analysis performed, the derivative was susceptible to oxidation at pH 5.0 and 25 ° C.
Susceptible but modified / improved in different conditions (ie liquefaction)
Can exhibit properties.
Example3
Construction of all possible derivatives at position 197
All M197 derivatives (M197X) are of type A4 and are shown in FIG.
Produced as outlined:
1) Site-specific mutation (due to primer extension in M13)
The following mutant oligonucleotides were used to produce M197A:
This oligonucleotide also contains an EcoRV site (codons 200-201).
The ClaI site (codons 201-202) was replaced and inserted.
2) Primer LAAM12 (Table 2) with another silencing restriction site (BStBI)
Used to introduce codons 186-188.
3) The resulting M197A (BstB I +, EcoRV +) mutant
And subcloned into plasmid pA4BL (PstI-SstI fragment)
The resulting plasmid was digested with BstBI and EcoRV,
The fragment containing the vector was isolated by electroelution from an agarose gel.
4) The synthetic primers LAAM14-30 (Table 2) were each
Annealed with the target common primer, LAAM13 (Table 2). The result
The resulting amino acid encoding all remaining natural amino acids at position +197
The sets were individually ligated to the vector fragments prepared as described above.
Cassettes are designed to destroy EcoRV sites in ligation
Thus, E. E. coli transformants were deleted for deletion of this unique site.
I searched. In addition to this, the common bottom chain of the cassette includes a frameshift and N
Transformants encoding the siI site and thus derived from this chain are the only transformants
It can be eliminated by searching for the presence of the NsiI site, and in any case,
It is not expected to lead to the expression of sexual amylase.
Those that were positive by restriction analysis were confirmed by sequencing, and cultured in shake flasks.
B. for expression in the ground. subtilis was transformed (FIG. 9). Continued
Thus, the specific activity of one M197X mutant was determined by a water-soluble substrate assay. Less than
Table 3 shows data obtained by the above assay method.Water-soluble substrate assay
: Megazyme (AUSt.) Pty. Ltd. To
Therefore, open a rate assay based on the supplied end-point assay kit.
Emitted: Each substrate (p-nitrophenyl maltoheptaoside, BPNPG7)
Are dissolved in 10 ml of sterile water, followed by 1 to 4 assay buffers.
(50 mM malate buffer, pH 6.7, 5 mM calcium chloride, 0.
002% Tween 20). Add 10 μl amylase to 790
The assay was performed by adding at 25 ° C. to the substrate in a μl cuvette. Addition
The rate of water splitting was measured as the rate of change in absorbance at 410 nm after 75 seconds.
Was. The assay was linear up to 0.4 absorbance units / minute.
Amylase protein concentration is determined by the method of Bradford, M .; (1976) Ana
l. Biochem. 72: 248, based on the method of bovine serum albuminstan
Standard Bio-Rad Assay with Bio-Rad (Bio-Rad Labor)
atories).Starch hydrolysis assay
: Α Amira of Spezyme® AA20
The standard method for assaying for protease activity was used. This method is here
Reference is made to Example 1 of US patent application Ser. No. 07 / 785,624, which is incorporated by reference.
Has been described. Natural starch forms a blue color with iodine, but short dextrin molecules
When it is hydrolyzed to The substrate was a phosphate buffer, pH 6.
2 (42.5 gm / l potassium dihydrogen phosphate, 3.16 gm / l sodium hydroxide
5 gm / l of soluble Linner starch. Sample is 25 mM salt
Add to calcium iodide and keep the activity at 30 ° C until the iodine test becomes negative
It was measured as the time taken. The activity was calculated according to the following formula:
Recorded in liquefons per ram or ml (LU)
.
here,
LU = Rikephone unit
V = volume of sample (5 ml)
t = Dextrinization time (min)
D = dilution factor = dilution volume / ml or g of enzyme added.
Example 4
Characterization of derivative M15L
M15L produced as in the previous example shows increased amylase activity.
Without (Table 3), it was still inactivated with hydrogen peroxide (FIG. 7). However, Den
In jet liquefaction of pun, especially at low pH as shown in Table 4 below
Showed a markedly increased effect.
Starch liquefaction typically involves a 2.5 liter delay core behind the mixing chamber.
And a hydro-heater M-103-M with a final rear pressure valve.
This was performed using an air jet. Starch is Moyno pump
And the steam is 90-100 ps by a 150 psi steam line.
i. Temperature probe just behind the hydro heater
It is installed just before the head pressure valve.
Starch slurry was obtained from corn wet mirror and used within 2 days
. Dilute the starch to the desired solids level with demineralized water and adjust the pH of the starch to 2% NaO
H or saturated NaTwoCOThreeAdjusted by Typical liquefaction conditions are:
Starch 32% -35% solids
Calcium 40-50ppm (30ppm added)
pH 5.0-6.0
α-amylase 12-14 LU / g dry starch base
Met.
Starch was introduced into the jet at 350 ml / min. Jet temperature is 105
C.-107.degree. C. was maintained. Starch samples were taken from a jet cooker at 95 ° C.
It was transferred to a two-stage liquefaction and held for 90 minutes.
Immediately after the second stage of liquefaction, the degree of starch liquefaction is
Analytical Methods of the Member Com
panies of the Corn Refiners Associate
ion Inc. , According to the method described in the sixth edition,
Determining dextrose equivalent (DE) and testing for the presence of raw starch
It was measured by doing.
When the starch is treated under the conditions given above and at pH 6.0, generally
A liquefied starch of about 10 DE without raw starch was obtained. Using the mutant of the present invention
Table 4 shows the results of the starch liquefaction test.
Example 5
Construction of M15X derivative
All derivations in M15 generally follow the steps described in Example 3 above.
The body (M15X) was prepared as described in FIG. lichenifo
Produced by cassette mutation in rmis:
1) Site-specific mutation (due to primer extension in M13)
Introduce a unique restriction site adjacent to the 15 codons to allow insertion of the mutation cassette
Used for In particular, the BstBI site at codons 11-13, and codon 1
The 8-20 Msc1 site was introduced using the oligonucleotides shown below.
.
2) Subsequently, the vector for the M15X cassette mutation was replaced with a mutant amylase (Bs
tB1 +, Msc1 +) from the plasmid pB
Constructed by subcloning into Lapr. The resulting plastic
The sumid was subsequently digested with BstB1 and Msc1 and the large vector
Fragments were isolated from polyacrylamide gels by electroelution.
3) A mutant cassette was produced for the M197X derivative. Replacement at codon 15
Synthetic oligomers that encode each
Let me do it. Proper ligation of the cassette with the vector breaks Msc1.
The site was destroyed, and the deletion of this site made it possible to search for positive transformants. Bottom plastic
The immer has a unique SnaB1 site and transforms derived from the bottom chain with Sn
It was made possible to eliminate by searching the aB1 site. This primer also
Contains a frameshift that eliminates amylase expression in mutants derived from the common bottom chain
doing.
Synthetic cassettes are listed in Table 5 and generally the cassette mutation strategy is described in FIG.
ing.
Example 6
Bench liquefaction with M15X
The activity was measured on 11 M15 substituted derivatives produced as in Example 5.
,
In liquefaction using a bench liquefaction system at pH 5.5, Spezyme (registered)
Trademark) AA20 (Genencor International, Inc.
(Commercially available). Bench-scale liquefaction system measures approximately 12 inches from front edge
Stainless steel coil with a 7 inch long static mixing element at a distance of
0.25 inch diameter, about 350 ml volume) and 30 psi rear pressure bar at rear end
Consisting of lubes. Coils are thermostatically controlled buses, except at each end
Glycerol-water with heating element that had been kept at 105-106 ° C
Was immersed in the bus.
The starch slurry containing the enzyme is kept in suspension by stirring, and the piston drive
It was introduced into the reaction coil at 70 ml / min by a motoring pump. Demp
Was recovered from the end of the coil and transferred to the second holding (95 ° C., 90 min). Second
Immediately after the retention, the DE of the liquefied starch was measured as described in Example 4.
. FIG. 16 shows the results.
Example 7
Characterization of M197X derivative
As can be seen in FIG. 9, the broad spectrum exhibited by the M197X (type A4) derivative
There was a range of amylase activities (measured by water-soluble substrate). Amylase is 2 times
It was partially purified from the supernatant by precipitation with an amount of ethanol and resuspension. Heat them
For stability, 10 mM acetate buffer pH 5.0, 5 mM calcium chloride
Screened by heating at 95 ° C. for 5 minutes in the presence (FIG. 10);
4 Wild type retained 28% of the activity after the incubation. M197W and M197P
As for active protein, it was not possible to recover it from the supernatant. Sequencing
Showed that M197H contained the second mutation N190K.
M197L was tested in a separate experiment but was found to be the least thermostable derivative.
There was one. There is a wide link between the expression of amylase activity and thermostability
It seemed like licheniformis amylase has any position at position 197.
Look for retention or enhancement of thermal stability as to whether amino acids can be accepted.
Limited from the ground: cysteine and threonine are subject to these conditions
Alanine and isoleucine, while preferred for the highest thermal stability of
Was of intermediate stability. However, other substitutions at position +197
Results in reduced thermal stability which may be useful in
Was. In addition, different substitutions at +197 have other advantageous properties, such as altered
It may have pH action properties or altered oxidative stability. For example,
The M197C derivative was found to be easily inactivated by air oxidation
Had enhanced thermal stability. Conversely, compared to the M197L derivative,
197T and M197A have high activity (Table 3) as well as high thermal stability (FIG. 10).
), While at pH 5 to pH 10 against peroxide inactivation
(Fig. 7).
Example 8
Stability and action in detergent formulations
Automatic dish washing of M197T (A4 type), M197T and M197A (A4 type)
The stability in a detergent (ADD) matrix was measured. 2ppm Savinase
® (protease, commercially available from Novo Industries)
And commonly used in ADD), two commercial bleach-containing ADDs
Is Cascade® (Procter and Gamble)
, Ltd.) and Sunlight® (Uniliver).
, Amylase derivatives and Termamyl® (Novo Nord)
inactivation of thermostable α-amylase available from isk, A / S at 65 ° C.
Followed the time course. The concentration of the ADD product used in both cases
The degree corresponds to the "pre-soak" condition: 14 g per liter of water
m (7 grams hardness per gallon). As can be seen (FIGS. 11a and 11b)
, Both types of M197T derivatives were inactivated before the first assay was performed.
Significantly compared to Termamyl® and M197A (type A4)
It was stable. The advantage of this stability is as determined by following the procedure below.
Found in the presence or absence of starch. Amylase in advance in vitro
Add to 5 ml of warmed ADD and Savinase®,
After texing, activity was measured as a function of time using a soluble substrate assay
. The “+ starch” tube was baked on the side (140 ° C., 60 minutes) spaghetti den
Step
Had. The results are shown in FIGS. 11a and 11b.
Example 9
Characterization of M15X derivatives
All M15X were increased in Bacillus subtilis and
The current level was monitored as shown in FIG. Amylase is separated and 20-7
It was partially purified by the 0% ammonium sulfate method. For water-soluble substrates of these derivatives
The specific activity was measured in the same manner as in Example 3 (FIG. 14). M15X amylase
Many have specific activities greater than that of Spezyme® AA20
Was. Benchtop thermostability assay was performed with 9 amylase.
5 mM calcium chloride in 50 mM acetate buffer, pH 5.0, at 0 ° C. for 5 minutes
Performed by heating in the presence (FIG. 15). Most of the derivatives are
In A, it acted similarly to Spezyme (registered trademark) AA20. This asse
Derivatives that have shown a reasonable stability in (a)
(defined as having 60% of the thermal stability of zyme® AA20)
, Starch, and liquefaction at pH 5.5. these
Among the mutants, the most interesting one is shown in FIG. M15D, N and T,
In addition, L.P.
Outperforms both water soluble substrates and starch hydrolytic activity assays.
And had increased specific activity.
In general, by replacing the methionine at position 15, increased low pH liquefaction
It has been found that derivatives which have an effect and / or an increased specific activity can be provided.
Was seen.
Example 10
Oxidation sensitivity of tryptophan
Chloramine T (sodium N-chloro-p-toluenesulfonimide) is selected
It is an alternative oxidizing agent that converts methionine to methionine sulfone at neutral or alkaline pH.
Oxidizes to foxide. At acidic pH, chloramine T is methionine and
Modifies both liptophans (Schechter, Y., Burstein)
, Y. and Patchhornik, A (1975) Biochemistr
y
14 (20) 4497-4503). FIG. licheniform
2 shows the inactivation of is α-amylase with chloramine T at pH 8.0 (A
A20 = 0.65 mg / ml, M197A = 1.7 mg / ml, M197L = 1
. 7 mg / ml). This data indicates that methionine at position 197 is replaced with leucine or amino acid.
Shows that changing to Lanine can prevent inactivation of α-amylase
doing. Conversely, as shown in FIG. 18, at pH 4.0, M197
A and the inactivation of M197L proceed, but more chloramine T equivalents
Required (FIG. 18; AA20 = 0.22 mg / ml, M197A = 4.3 mg)
/ Ml, M197L = 0.53 mg / ml; 200 mM sodium acetate, pH 4
. 0). This indicates that tryptophan residues also contribute to chloramine T-mediated inactivation events.
Suggest that they are involved. In addition, tryptics
ic) By mapping and subsequent amino acid sequencing, it is at position 138.
It was suggested that tryptophan was oxidized by chloramine T (data shown
Not). To prove this, a site-specific mutation was added to tryptophan 138 as follows:
Was introduced as shown.Preparation of α-Amylase Double Mutants W138 and M197
Certain derivatives W138 (F, Y and A) are identified as double mutants that are M197T.
(Prepared in the same manner as described in Example 3). The double mutant was prepared in Example 1 and
And 3. Generally, a single negative strand of DNA is l
sequence of P. ichieniformis α-amylase M197T mutant (PstI-
SstI) was prepared from a 1.72 kb M13MP18 clone encoding
Was. The site-specific mutation was determined using the primers listed below,
Essentially, except that protein and T4 polymerase were substituted for Klenow
Zoller, M .; et al. (1983). All of
Primers provide a unique site for identifying clones with the appropriate mutation,
As well as the desired mutation.
Tryptophan 138 to phenylalanine
Tryptophan 138 to tyrosine
Tryptophan 138 to alanine-this primer is also located at position 138
Operates the only site downstream and downstream.
Mutants were identified by restriction analysis and W138F and W138Y were used for DNA sequencing.
More confirmed. The W138A sequence is between the unique BspI and XmaI sites.
Found that there was a nucleotide deletion, but the remaining genes were correctly sequenced
Was done. 1.37 kb Sst with both W138X and M197T mutations
Transfer the II-SstI fragment from M13MP18 into the expression vector pBLapr
PBLapr (W138F, M197T) and pBLapr (W138
Y, M197T) as a result. The only BspE I and XmaI size
The fragment containing the fragment was cloned into pBLapr (BspEI, Xmal, M197T).
Was cloned, but it contained a clone containing another amino acid substitution at position 138.
This is because it is useful for a printing cassette.Single mutation at amino acid position 138
According to the method generally described in the previous example, the specific W138 (F, Y, L
, H and C) Single derivatives were generated. The plasmid pBLapr (W
138X, M197T), Asp718-Sst carrying the M197T mutation
The I fragment was replaced with a wild type fragment having methionine at 197, and pBLapr (
W138F), pBLapr (W138Y) and pBLapr (BspE I
, Xmal).
Mutants W138L, W138H, and W138C use the synthetic cassette pBLa
ligated using the following primers in the pr (BspE I, XmaI) vector:
It was prepared by adding
Tryptophan 138 to leucine
Tryptophan 138 to histidine
Tryptophan 138 to cysteine
Double mutants M197T / W138F and M197T / W138Y and chlorami
T response was compared to wild type (AA20 = 0.75 ml, M197T / W1
38F = 0.64 mg / ml, M197T / W138Y = 0.60 mg / ml;
50 mM sodium acetate, pH 5.0). The results shown in FIG.
Mutation of phan 138 causes the mutant to be more resistant to chloramine T.
It shows that it was awake.
Example 11
Preparation of multiple mutants
According to the methods of Examples 1, 3, 5 and 10, the following multiple mutants were made: M
15T / M197T; M15S / M197T; W138Y / M197T; M15
S / W138Y / M197T and M15T / W138Y / M197T. these
Some of the multiple mutants described in, for example, W138Y / M197T are described in Example 10.
It was previously experimented as was created and tested. Multiple variants identified by restriction analysis
did.
The various multiple mutants included in the scope of the present invention can be further purified by washing products (automatic dishwashing).
The effect as an additive (machine detergent) additive was tested. These tests are detailed below.
You.Stability test
4000 ppm of automatic dishwashing detergent (ADD) containing perboric acid and TAED
Was prepared in water having a hardness of 7 gpg. The above specific amylase mutant,
This ADD was added to the Ceralpha method (Megazyme (Austr.) Pty).
. Ltd. , Parramatta, NSW, Australia)
It was added to obtain a ratio of 0.4 in sodium chloride. One set of samples was placed at room temperature (21-23).
C) for about 30 minutes (not heated). Transfer the second set from room temperature to about 65 ° C
Warmed (heated) after addition of the element. 30 minutes after enzyme addition, the activity of the amylase variant
It was measured and the relative activity to the activity at the time of addition of the enzyme was calculated (relative activity%).
This result, shown in FIG. licheniformis alpha amirror
The methionine at position +197 of the enzyme has a structure with ADD + perboric acid + TAED.
It suggests that it should be modified for stability in the compound.Starch hydrolysis assay
4000 ppm of automatic dishwashing detergent (ADD) containing perboric acid and TAED
Was prepared in water of 7 gpg hardness and cooked bent macaroni (elbow).
macaroni) were added. The above amylase variant is
Was added to the ADD solution of (5) so that the final concentration was 5 ppm active enzyme. 50 tubes
C. for about 30 minutes and the concentration of dissociated reducing sugars was determined using the dinitrosalicylic acid method
, Measured against a glucose standard curve. Table 6 shows the results.
The results shown in Table 6 are for M15T / M197T; M15S / M197T; W1
38Y / M197T; M15S / W138Y / M197T and M15T / W1
38Y / M197T was free of enzyme and compared to wild-type α-amylase control
It worked well.Oatmeal stain
Cook the dishes evenly with the mixed oatmeal paste and overnight at 37 ° C.
Let dry. Place the dishes in an ASKO model 770 dishwasher and wash quickly at 45 ° C.
5% perboric acid, 3% TAED and 11 mg of specific amylase enzyme
Washed using 10 g of automatic dishwashing detergent. Before soiling the plate, soiling
Weight after washing and after washing, the average% of soil removed from all plates
Was calculated. The data is shown in Table 7 below.
The data show that mutant enzymes offer greater benefits than those provided by wild-type enzymes.
It is shown to provide. For oatmeal removal, wild-type enzyme is free of enzyme
Provided 20% more profit than ADD.
Example 12
Dishwashing composition
1% (w / w) particles of wild-type and mutant amylase were added to 5% (w / w)
Korex Auto with sodium monohydrogen oxalate and 3% (w / w) TAED
Formulated with dishwasher detergent. Samples of these formulations were run at room temperature (21-23).
C), or 80% relative humidity and 38 C for 4 weeks. FIG. 21 shows the results.
And 22.
This result indicates that the activity of wild-type amylase was measured by the Ceralpha method.
Shows that the properties decrease with increasing storage time in the detergent. room temperature
The mutant enzyme was completely stable. At 38 ° C and 80% relative humidity
Showed that all mutant enzymes were more stable than wild type.
The advantages of incorporating these mutant amylases into automatic dishwashing detergents are:
Mutant is significantly more stable than wild type in the presence of perboric acid and TAED.
And they have a significant effect in the cleaning of starch food stains during washing.
To provide benefits.
Example 13
Study on stability of oxidatively stable protease / oxidatively stable amylase
1) wild-type protease and wild-type amylase; or 2) US Re34
Bleach stable protease (GG3) produced by the method described in US Pat.
6-M222S) and bleach-stable amylase (AA20-M15T-W13)
Enzyme particles containing any of 8Y-M197T were added to 0.1 M sodium borate pH 1
Each enzyme 1 in a buffer containing 0.2 and 0.005% Tween 80
Dissolved at a concentration of 2.5 mg. To 9 ml of these solutions, add 1 ml of water or 1
ml of 30% hydrogen peroxide was added. After keeping the solution at 25 ° C for 30 minutes,
Thease and amylase activities were measured and expressed as% of the original activity. data
Is shown in Table 8 below.
Data show bleach stability with mutations in amino acid residues that are both susceptible to oxidation.
The combination of the qualitative amylase variant and the bleach-stable protease variant
Proteases and Amylases in Formulations Resistant to Agent Inactivation
Ze brought the combined benefits. Bleach stability amylase and bleach stability
The combination of proteases has almost no initial activity in bleach even after 30 minutes.
However, the combination of wild-type enzymes had an initial activity of 80% at the same time period.
Had lost more than%.
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
//(C12N 9/28
C12R 1:10)
(72)発明者 ミッチンソン,コリン
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94080 サウス サン フランシスコ キ
ンボール ウェイ 180 ジェネンコア
インターナショナル インコーポレーテッ
ド内
(72)発明者 パワー,スコット ディー
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94080 サウス サン フランシスコ キ
ンボール ウェイ 180 ジェネンコア
インターナショナル インコーポレーテッ
ド内──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI // (C12N 9/28 C12R 1:10) (72) Inventor Mitchinson, Colin United States of America 94080 South San Francisco Kimball Way 180 Genencor Within the International Inc. (72) Inventor Power, Scott Dee United States California 94080 South San Francisco Kimball Way 180 Within Genencor International Inc.