JPH10504197A

JPH10504197A - Improved cleaning composition

Info

Publication number: JPH10504197A
Application number: JP8507603A
Authority: JP
Inventors: シーバーネット，クリストファー; ミッチンソン，コリン; ディーパワー，スコット
Original assignee: ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド
Priority date: 1994-08-11
Filing date: 1995-08-09
Publication date: 1998-04-28
Also published as: HUT77748A; FI970563A0; CO4440440A1; WO1996005295A3; WO1996005295A2; NZ291984A; EP0775201A2; MX9700776A; AU686007B2; BR9508582A; PL318209A1; AU3366295A; KR970704872A; NO970609D0; CN1158637A; CA2197203A1; NO970609L; FI970563A

Abstract

(57)【要約】自然発生あるいは組換えαアミラーゼのＤＮＡ配列から派生した新規αアミラーゼ変異体が開示されている。一般に、変異αアミラーゼは、プレカーサーαアミラーゼのアミノ酸配列中の１以上の酸化可能なアミノ酸残基の置換（置き換え）または欠失を生じさせるために、自然発生または組換えαアミラーゼをコードしているプレカーサーＤＮＡを生体外で改変することにより得られる。このような変異αアミラーゼは、プレカーサーと比較して、改変された酸化安定性および／または改変されたｐＨ作用特性および／または改変された温度安定性を有する。変異アミラーゼの使用方法並びに変異アミラーゼを含む洗剤およびデンプン液化組成物もまた開示されている。特に、好ましいのは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のＭＥＴ１９７またはＭＥＴ１５においてまたはＴＲＰ１３８の残基において改変された変異体αアミラーゼ、あるいは他の微生物源（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のαアミラーゼの相当する残基を改変されたものである。 (57) Abstract A novel α-amylase variant derived from the DNA sequence of a naturally occurring or recombinant α-amylase has been disclosed. Generally, the mutant α-amylase encodes a naturally occurring or recombinant α-amylase to cause a substitution (replacement) or deletion of one or more oxidizable amino acid residues in the amino acid sequence of the precursor α-amylase. It is obtained by modifying the precursor DNA in vitro. Such a mutant α-amylase has altered oxidative stability and / or altered pH-effect properties and / or altered temperature stability compared to the precursor. Methods of using the mutant amylase and detergent and liquefied starch compositions comprising the mutant amylase are also disclosed. Particularly preferred is a mutant α-amylase modified in MET197 or MET15 from Bacillus licheniformis or at the residue of TRP138, or the corresponding residue of α-amylase from another microbial source (Bacillus, Aspergillus). It is a thing.

Description

【発明の詳細な説明】改善洗浄用組成物発明の分野本発明は、天然には見られないアミノ酸配列を有する新規αアミラーゼ変異体に関するものであり、このような変異体は、１またはそれ以上のプレカーサーα アミラーゼのアミノ酸残基が、特に何れかの酸化可能なアミノ酸が、異なったアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有する。本発明の変異体酵素は、改変酸化安定性、改変ｐＨ作用特性、改変比活性および／または改変温度安定性を含むがこれに限定されない、改変安定性／活性特性を示す。発明の背景 αアミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．１）は、デンプン中の内部α−１，４−グリコシド結合を大きくランダムに加水分解し、分子量の小さいマルトデキストリンを生成する。αアミラーゼはかなりの商業的価値を有し、デンプン加工の最初の段階（液化）において；アルコール製造において；洗剤母体中の洗浄剤として；およびデンプンのり抜きのために繊維産業において用いられている。αアミラーゼは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｔｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなどの微生物源から生産された最も商業的なアミラーゼとともに、ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを含む幅広い微生物によって生産されている。近年、商業的利用において好ましい酵素は、少なくとも中性および弱アルカリｐＨでの温度安定性と作用から、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のものである。以前から、何れの残基がアミラーゼの触媒活性に重要であるかを調べるため、および／または、いろいろなアミラーゼの活性中心内部の特定のアミノ酸の改変の影響を調べるために（Ｖｉｈｉｎｅｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｃｈｅｍ．１０７：２６７−２７２；Ｈｏｌｍ，Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９０）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ３：１８１−１９１；Ｔａｋａｓｅ，Ｋ．ｅｔａｌ．（１９９２）ＢｉｏｃｈeｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，１１２０：２８１−２８８；Ｍａｔｓｕｉ，Ｉ．ｅｔａｌ．（１９９２）ＦｅｂｓＬｅｔｔｅｒｓＶｏｌ．３１０，Ｎｏ．３；ｐｐ．２１６−２１８）；何れの残基が温度安定性に重要であるか（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．ｅｔａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８９３３ −１８９３８）；を調べるために、組換えＤＮＡ技術を用いた研究がされており、１つのグループはこのような方法を、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼ内のさまざまなヒスチジン残基に変異を導入するために用い、ヒスチジン残基において置換を生じさせる根拠は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼ（熱安定性であることが知られている）は、他の類似のバチルスアミラーゼと比較した場合、過剰のヒスチジン残基を有しており、それ故、ヒスチジン残基の入れ替えにより酵素の熱安定性が変化することが示唆されていたからである（Ｄｅｃｌｅｒｃｋ，Ｎ．ｅｔａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５４８１−１５４８８；ＦＲ２６６５１７８−Ａ１；Ｊｏｙｅｔ，Ｐ．ｅｔａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１５７９− １５８３）。 αアミラーゼは、過酸化水素および他の酸化剤によって、ｐＨ４と１０．５の間で、ここでの実施例に記載されているように不活性化されることが明らかとなった。商業的には、αアミラーゼ酵素は、商業用途に応じて、高および低両方のｐＨ条件等の、劇的に異なった条件下で用いられる。例えば、αアミラーゼは、低ｐＨ（ｐＨ＜５．５）で行われるのが好ましい工程であるデンプンの液化に用いられ得る。他方で、アミラーゼは、漂白剤や過酸等の酸化剤をしばしば含む、よりアルカリ条件下にある商業的皿用または洗濯用洗剤中に用いられることもある。多様な条件下でのアミラーゼ酵素の安定性または活性特性を変化させるため、例えばメチオニン、トリプトファン、チロシン、ヒスチジンまたはシステイン等の酸化可能なアミノ酸を選択的入れ替え、置換、欠失が、そのプレカーサーと比較して改変された変異酵素の特性という結果となることが判明した。現在市販されているアミラーゼは多様な条件下では許容できない（安定ではない）ので、改変された安定性および／または活性特性を有するアミラーゼが必要とされている。野生型またはプレカーサー酵素と比較して改変された安定性（酸化、温度、またはｐＨ作用特性）を、適度な酵素活性を維持しながら達成することができる。このような変異を導入することによって影響を受ける特徴は、熱安定性を維持しながらの酸化安定性の変化、またはその逆であっても良い。付加的には、αアミラーゼプレカーサー配列中の酸化可能なアミノ酸の他のアミノ酸での置換、または１またはそれ以上の酸化可能なアミノ酸の欠失は、プレカーサーαアミラーゼで最適と考えられていたｐＨ以外での改変された酵素活性という結果となることもある。換言すると、本発明の変異酵素は、酵素の促進された酸化安定性によるものであり得る、改変されたｐＨ作用特性もまた有する。発明の概要本発明は、αアミラーゼをコードしている変異ＤＮＡ配列の発現産物である新規αアミラーゼ遺伝子変異体、プレカーサーαアミラーゼから、１以上の酸化可能なアミノ酸の欠失または置換（入れ替え）によって派生した変異ＤＮＡ配列に関する。１つの好ましい本発明の態様においては、変異は、プレカーサーαアミラーゼ中の１またはそれ以上のメチオニン残基を異なったアミノ酸で置換することに由来している。別の本発明の好ましい態様においては、変異は、プレカーサーαアミラーゼ中の、１以上のトリプトファン残基だけの、または１以上のメチオニン残基と組合せた置換を含む。このような変異体αアミラーゼは、一般に、プレカーサーのアミノ酸配列中の、１以上のアミノ酸残基を置換または欠失してコードするように、自然発生または組換えαアミラーゼをコードしているプレカーサーＤＮＡ配列を生体外で改変することにより得られる。好ましくは、１以上のアミノ酸の置換又は欠失は、このような配列中の、１以上のメチオニン、トリプトファン、システイン、ヒスチジン、またはチロシン残基の入れ替えによるものであり、最も好ましくは、変えられる残基はメチオニン残基である。酸化可能なアミノ酸残基は、２０の天然アミノ酸の何れによっても入れ替えられ得る。もし、所望の効果が、プレカーサーの酸化安定性を改変することであれば、アミノ酸残基は、酸化可能ではないアミノ酸（例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニンまたはバリン）または他の酸化可能なアミノ酸（例えばシステイン、メチオニン、トリプトファン、チロシンまたはヒスチジン、最も容易に酸化されやすいものから容易には酸化されにくいものの順に列挙）で置換されてもよい。同様に、もし、所望の効果が熱安定性の改変であるならば、２０の天然アミノ酸の何れもが置換されてもよい（例えば、システインがメチオニンで置換されてもよい）。好ましい変異は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ中に見られるメチオニン残基（＋８、＋１５、＋１９７、＋２５６、＋３０４、＋３６６および＋４３８）の何れかに相当するメチオニン残基の置換である。最も好ましくは、入れ替えられるメチオニンは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ中の位置＋１９７または＋１５に相当するメチオニンである。メチオニンを位置＋１９７において入れ替えるために好ましい置換アミノ酸は、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、スレオニン（Ｔ）またはシステインである（Ｃ）。位置＋１５での好ましい置換アミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）およびイソロイシン（Ｉ）であるが、上記で特定されていない他の置換アミノ酸もまた有用であろう。２つの特に好ましい本発明の変異はＭ１９７ＴとＭ１５Ｌである。本発明の他の態様は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ（図２を参照）中に見られるトリプトファン残基の何れかに相当するトリプトファン残基の置換を含む変異体に関する。好ましくは、入れ替えられるトリプトファン残基は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ中の＋１３８に相当する位置のものである。トリプトファン残基の変異（置換）は、単独で成されても、または他の酸化可能なアミノ酸残基の変異との組合せで成されてもよい。特に、少なくとも１つのトリプトファンを、少なくとも１つのメチオニンと組み合わせて置換すること（例えば、二重変異＋１３８／＋１９７）により修飾することが有利である。本発明のαアミラーゼ変異体は、一般に、過酸化水素および漂白剤または過酸等のその他の酸化剤、より詳細にはクロラミン−Ｔ等の穏やかな酸化剤、の存在下で、改変された酸化安定性を示す。促進された酸化安定性を有する変異酵素は、貯蔵寿命の延長、漂白剤、ペルオキシホウ酸、ペルオキシ炭酸、または過酸と、洗浄製品中で用いられるアミラーゼとの共存性を拡張するために有用である。同様に、減少された酸化安定性は、迅速で効率的な酵素活性の消失が要求される産業工程において有用である。本発明の変異酵素はまた、拡大されたｐＨ作用特性を示し、それにより、Ｍ１５Ｌ等の変異体は、低ｐＨデンプン液化工程のための安定性を示し、Ｍ１９７Ｔ等の変異体は、高ｐＨ洗浄製品条件における安定性を示す。本発明の変異体はまた、改変された温度安定性を示し、それにより、変異体は高または低いずれの温度においても安定性を示す。プレカーサーと比較した何れの変異体の酵素的特性の変化（増加または減少）も、変異αアミラーゼの最終利用に応じて有利なものとなり得る。デンプン加工と洗浄用途に加えて、本発明の派生アミラーゼは、公知のアミラーゼが用いられている何れの用途においても用いることが出来、例えば、派生アミラーゼは織物加工、食品加工等で利用できる。特に、Ｍ１９７Ｃ等の派生酵素は、酸化剤で容易に不活性化されてしまうが、工程の最後で完全にアミラーゼ活性を除去することが要求される、例えば冷凍食品加工用途等の工程において有用であることが観察された。好ましい本発明のαアミラーゼ変異体は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｔｓ、およびＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等のバシルス株、そして最も好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから派生される。本発明の別の態様においては、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓによって通常生産されるαアミラーゼの新しい型が提供されている。この新しい型は、Ａ４型と命名され、分泌されたアミラーゼのＮ末端に４つの付加的なアラニン残基を有している（図４ｂ）。αアミラーゼのＡ４型の派生体または変異体は、本発明に含まれる。Ａ４型の派生体または変異体により、本発明は、例えば、１またはそれ以上の酸化可能なアミノ酸の変異（置換、入れ替えまたは欠失）等の、１以上の付加的な変異を有するＡ４型αアミラーゼを含む。本発明の組成物の態様においては、液体、ゲルまたは粒状で、ここに記載されているαアミラーゼ変異体を含む洗剤組成物が提供されている。特に好ましいものは、＋１９７位置変異体を単独で、または、エンドグリコシダーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ等の他の酵素または他のアミラーゼ酵素との組み合わせで含有している洗剤組成物である。付加的には、本発明の組成物は１以上の部位特異的変異を有するαアミラーゼ変異体を含んでもよい。本発明のさらに別の組成物としての態様においては、デンプン加工、特にデンプン液化に有用な組成物が提供されている。本発明のデンプン液化組成物は好ましくは位置Ｍ１５に置換もしくは欠失を有するαアミラーゼ変異体を含んでいる。付加的には、このような組成物は、例えば、抗酸化剤、カルシウム、イオン等を含む、当業者に公知である成分を含有していてもよいことが観察された。本発明の工程としての態様においては、湿式または乾燥ミル工程からの、デンプン、特に粒状デンプンスラリーの液化のための方法が提供されている。一般に、デンプン分解工程の最初の段階においては、デンプンスラリーは比較的高温（約１１０℃まで）でゼラチン化される。デンプンスラリーがゼラチン化された後、それはαアミラーゼを用いて液化され、デキストリン化される。このような液化のための条件は、共通して譲渡された米国特許出願第０７／７８５６２４号および同第０７／７８５６２３号、および米国特許第５１８０６６９号に記載されており、それらの開示はここに参考文献として取り込まれている。本方法は、デンプンに本発明のαアミラーゼの有効量を、単独または、抗酸化剤等の付加的な賦形剤との組合せで添加し、スラリーを適当な時間および温度でデンプンを液化させるために反応させることから成るデンプンの液化のための方法である。本発明の更なる態様は、本発明の変異αアミラーゼ（Ａ４型およびその変異体を含む）をコードしているＤＮＡ、および当該ＤＮＡをコードしている発現ベクター並びにそのような発現ベクターで形質転換された宿主細胞を含む。図面の簡単な説明図１は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＮＣＩＢ８０６１）由来のαアミラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列、配列番号３１、および、Ｇｒａｙ，Ｇ．ｅｔａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ．１６６：６３５−６４３に記載されている推定翻訳産物を示している。図２は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＮＣＩＢ８０６１）由来のαアミラーゼの成熟アミノ酸配列、配列番号３２、を示している。図３は、バシルスαアミラーゼの１次構造を並列したものである。Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼ（Ａｍ−Ｌｉｃｈ）、配列番号３３、は、Ｇｒａｙ，Ｇ．ｅｔａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ．１６６：６３５−６４３に記載されており、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアミラーゼ（Ａｍ−Ａｍｙｌｏ）、配列番号３４、は、Ｔａｋｋｉｎｅｎ，Ｋ．ｅｔａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１００７−１０１３に記載されており；Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ａｍ−Ｓｔｅａｒｏ）、配列番号３５、は、Ｉｈａｒａ，Ｈ．ｅｔａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８：９５−１０３に記載されている。図４ａは、成熟αアミラーゼ派生体Ｍ１９７Ｔのアミノ酸配列、配列番号３６、を示す。図４ｂは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＮＣＩＢ８０６１由来のＡ４型 αアミラーゼのアミノ酸配列、配列番号３７を示す。番号付けはＮ末端からであり、４つの付加的なアラニンから始まる。図５は、プラスミドｐＡ４ＢＬを示しているが、そこにおいて、ＢＬＡＡは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ遺伝子、ＰＳｔＩからＳｓｔＩを指し；Ａｍｐ^RはｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子を指し；ＣＡＴはｐＣ１９４由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を指している。図６は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（配列番号３８）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号３９）、ｐＡ４ＢＬ中のＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（配列番号４０）およびｐＢＬａｐｒ中のＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（配列番号４１）に対するシグナル配列−成熟タンパク質結合部分を示している図７ａは、特定のαアミラーゼ（Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０およびＭ１９７Ｌ（Ａ４型））の、０．８８ＭＨ₂Ｏ₂、ｐＨ５．０、２５℃での不活性化を示している。図７ｂは、特定のαアミラーゼ（Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０、Ｍ１９７Ｔ）の、０．８８ＭＨ₂Ｏ₂、ｐＨ１０．０、２５℃での不活性化を示している。図７ｃは、特定のαアミラーゼ（Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０、Ｍ１５Ｌ）の、０．８８ＭＨ₂Ｏ₂、ｐＨ５．０、２５℃での不活性化を示している。図８は、Ｍ１９７Ｘカセット変異体の生産の模式図である。図９は、Ｍ１９７Ｘ派生体の発現を示す。図１０は、Ｍ１９７Ｘ派生体の、ｐＨ５．０、５ｍＭＣａＣｌ₂、９５℃で５分間の処理での熱安定性である。図１１ａおよび１１ｂは、自動皿洗い用洗剤における特定の酵素の不活性化を示している。図１１ａは、特定のアミラーゼのカスケード（登録商標）（市販の皿洗い用製品）中で６５℃での、デンプンの存在下または不在下での安定性である。図１１ｂは、特定のアミラーゼのサンライト（登録商標）（市販の皿洗い用製品）中で６５℃での、デンプンの存在下または不在下での安定性である。図１２は、Ｍ１５Ｘカセット変異体の生産の模式図を示す。図１３は、Ｍ１５Ｘ派生体の発現を示す。図１４は、Ｍ１５Ｘの可溶性デンプンに対する比活性を示す。図１５は、Ｍ１５Ｘ派生体の、９０℃、ｐＨ５．０、５ｍＭＣａＣｌ₂、５分間の処理での熱安定性である。図１６は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ野生型のパーセント活性の関数としての、Ｍ１５派生体の、デンプンおよび水溶性基質に対する比活性、およびｐＨ５．５でのジェット液化における作用を示したものである。図１７は、派生体Ｍ１９７Ａ（１．７ｍｇ／ｍｌ）およびＭ１９７Ｌ（１．７ｍｇ／ｍｌ）と比較した、クロラミン−Ｔ存在下、ｐＨ８．０でのＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ（ＡＡ２０、０．６５ｍｇ／ｍｌ）の不活性化を示す。図１８は、派生体Ｍ１９７Ａ（４．３ｍｇ／ｍｌ）およびＭ１９７Ｌ（０．５３ｍｇ／ｍｌ）と比較した、クロラミン−Ｔ存在下、ｐＨ４．０でのＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ（ＡＡ２０、０．２２ｍｇ／ｍｌ）の不活性化を示す。図１９は、二重派生体Ｍ１９７Ｔ／Ｗ１３８Ｆ（０．６４ｍｇ／ｍｌ）およびＭ１９７Ｔ／Ｗ１３８Ｙ（０．６０ｍｇ／ｍｌ）と比較した、クロラミン−Ｔ存在下、ｐＨ５．０でのＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ（ＡＡ２０、０．７５ｍｇ／ｍｌ）の不活性化を示す。図２０は、自動皿洗い用洗剤（ＡＤＤ）配合剤に取り込まれた多種のαアミラーゼ多重変異体の、室温から６５℃まで増加された温度での安定性試験の結果を示す。図２１は、特定のアミラーゼ変異体の（野生型と比較した）、自動皿洗い用洗剤中の、０−３０日にわたる、その時間で残存しているパーセント活性として決定された安定性を示している。図２２は、特定のアミラーゼ変異体の（野生型と比較した）、自動皿洗い用洗剤中の、０−３０日にわたる、３８℃（１００°Ｆ）、相対湿度８０％での安定性を示している。発明の詳細な説明デンプン液化に用いられるアミラーゼは、デンプンスラリー中に存在するいくつかの活性により、いくつかの不活性型となることを免れないであろうと信じられてきた（ここに参考文献として取り込まれた、共通して所有されている米国出願第０７／７８５６２４号および第０７／７８５６２３号および米国特許第５１８０６６９号、１９９３年１月１９日付与を参照されたい）。更には、例えば漂白剤−、または過酸−含有洗剤等の酸化剤の存在下でのアミラーゼの使用は、アミラーゼの部分的若しくは完全な不活性化という結果となり得る。それ故、本発明はアミラーゼの酸化感受性を改変することに焦点をあてている。本発明の変異酵素はまた、低または高ｐＨでの促進された酸化安定性によると思われる、改変されたｐＨ特性および／または改変された熱安定性を有している。ここで用いられるαアミラーゼは、天然に生じるアミラーゼ並びに組換体アミラーゼを含む。本発明の好ましいアミラーゼは、ここに開示されているようにＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓから派生したＡ４型αアミラーゼを含む、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから派生したαアミラーゼ、並びにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（例えばＡ．ｏｒｙｚａｅおよびＡ．ｎｉｇｅｒ等）から派生されたもの等の菌類αアミラーゼである。組換えαアミラーゼとは、天然αアミラーゼをコードしているＤＮＡ配列が、 αアミラーゼ配列内の１またはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失をコードする変異ＤＮＡ配列を製造するために改変されたものであるαアミラーゼを指す。適当な改変方法はここに記載されており、また共通して所有されている米国特許第４７６００２５号および第５１８５２５８号に開示されており、ここにそれらの開示が参考文献として取り込まれている。これまでに配列決定された、植物、哺乳類、細菌の範囲での、ほとんど全てのエンドアミラーゼの間にホモロジーが発見されている（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｒ．Ｔ．ｅｔａｌ．（１９８６）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３５５−３６０；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２８：４７０−４７６）。あるバシルスアミラーゼには特にホモロジーの高い４つの領域が、図３に示されるように存在し、下線をひかれた区分が高ホモロジー領域を示している。さらに、バシルスエンドアミラーゼの間の関係を地図に示すために配列の並列を用いた（Ｆｅｎｇ，Ｄ．Ｆ．ａｎｄＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０）。Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓとＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼとの間の相対的配列ホモロジーは、Ｈｏｌｍ，Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９０）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ３（３）ｐｐ．１８１−１９１で決定されたように約６６％であった。Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓとＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアミラーゼとの間の配列ホモロジーは、Ｈｏｌｍ，Ｌ．ｅｔａｌ．前出のように約８１％であった。配列ホモロジーも重要であるが、アミラーゼまたはその他の酵素との比較において、構造ホモロジーが重要であることが一般に認識されている。例えば、菌類アミラーゼと細菌（バシルス）アミラーゼとの構造ホモロジーが提案されており、および、それ故、菌類アミラーゼは本発明に含まれる。１つのαアミラーゼはプレカーサーαアミラーゼのアミノ酸配列から派生されたアミノ酸配列を有する。そのプレカーサーαアミラーゼは、天然に生成される αアミラーゼおよび組換えαアミラーゼ（定義されたとおり）を含む。αアミラーゼ変異体のアミノ酸配列は、プレカーサーアミノ酸配列の１またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入によりプレカーサーαアミラーゼのアミノ酸配列から派生される。このような修飾は、プレカーサーαアミラーゼ酵素それ自身の操作というよりはむしろ、プレカーサーαアミラーゼのアミノ酸配列をコードしているプレカーサーＤＮＡ配列の修飾である。適当な改変方法はここに記載されているもの、また共通して所有されている米国特許第４７６００２５号および第５１８５２５８号に開示されているものを含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼの位置Ｍ１９７、Ｍ１５およびＷ１３８に相当する特定の残基が、置換または欠失のために、全てメチオニン、ヒスチジン、トリプトファン、システインおよびチロシン位置としてここに同定された。アミノ酸位置番号（例えば＋１９７）は、図２に示されている成熟Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ配列に割り当てられた番号を指している。しかしながら本発明は、この特定の成熟 αアミラーゼ（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の変異に限定されるものではなく、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの成熟αアミラーゼ中の特に同定された残基に相当する位置にあるアミノ酸残基を含むプレカーサーαアミラーゼにも拡張される。あるプレカーサーαアミラーゼの１つの残基（アミノ酸）は、もしそれが、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのαアミラーゼの特定の残基もしくはその残基の部分と相同性（例えば１次構造または３次構造いずれかで位置が一致している等）または類似性であれば（例えば同一または類似の機能上の、結合、反応または化学的若しくは構造的相互作用能力を有する等）、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのαアミラーゼの残基に相当するものである。１次構造に対するホモロジーを実現するために、プレカーサーαアミラーゼのアミノ酸配列を直接、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのαアミラーゼの１次配列、特に配列が知られている全てのαアミラーゼで変化しないことが知られている一連のアミノ酸残基と、図３に示すように比較した。３次構造によって相当する残基を決定することもまた可能である：結晶構造は、ブタ膵臓αアミラーゼ（Ｂｕｉｓｓｏｎ，Ｇ．ｅｔａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：３９０９ −３９１６）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ由来タカアミラーゼＡ（Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｙ．ｅｔａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）９５：６９７−７０２）；およびＡ．ｎｉｇｅｒ由来酸性αアミラーゼ（Ｂｏｅｌ，Ｅ．ｅｔａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９：６２４４−６２４９）に報告されており、前者の２つの構造は類似している。Ｂａｃｉｌｌｕｓ αアミラーゼに関しては刊行された構造はないが、グルカナーゼの間の共通超２次構造にあると予測されており（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，Ｅ．Ａ＆Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，Ｂ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５９：１４５−１５２）および、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの酵素がタカアミラーゼＡのそれに基づいてモデル化されている（Ｈｏｌｍ，Ｌｅｔａｌ．（１９９０）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ３：１８１−１９１）。図３に示されている４つの高度保存領域は、活性部位の一部であると考えられている（Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｙ．ｅｔａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）９５：６９７−７０２）；Ｂｕｉｓｓｏｎ，Ｇ．ｅｔａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：３９０９−３９１６；Ｖｉｈｉｎｅｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２６７−２７２）、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの番号においてはＨｉｓ１０５；Ａｒｇ２２９；Ａｓｐ２３１；Ｈｉｓ２３５；Ｇｌｕ２６１およびＡｓｐ３２８を含む多くの残基を含んでいる。ここで用いられる発現ベクターとは、適切な宿主中でのＤＮＡの発現に影響することが可能である適当な制御配列に操作可能に連結されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡ構築物をいう。このような制御配列には、転写に影響するプロモーター、そのような転写をさらに制御可能な付加的なオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合サイトをコードしている配列、および転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれてもよい。好ましいプロモーターはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓａｐｒＥプロモーターである。ベクターはプラスミド、ファージ粒子、または単に潜在的ゲノムインサートであってもよい。一旦適切な宿主中に形質転換されると、ベクターは複製し宿主ゲノムとは独立に機能し、あるいはいくつかの例では、ゲノムそれ自体の中に組み込まれる。本明細書においては、プラスミドは現在最も一般的に用いられているベクターの形状であるので、プラスミドとベクターはしばしば相互交換可能に用いられる。しかしながら、本発明は、相当する機能を果たし、この分野で公知であるか公知となる他の形状の発現ベクターも含むことを意図している。本発明において有用である宿主菌株（または細胞）は、一般に、原核または真核宿主および、内部でαアミラーゼの発現が可能である何れの形質転換可能な微生物をも含む。特に、バシルス株等の、αアミラーゼが由来するものと同一の種または属の宿主株が好適である。好ましくは、αアミラーゼ陰性株（遺伝子を欠失）、および／または、αアミラーゼおよびプロテアーゼが欠失された、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＢＧ２４７３（ΔａｍｙＥ、Δａｐｒ、Δｎｐｒ）等のバシルス株が用いられる。宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターにより形質転換若しくは移入される。このような形質転換宿主細胞はαアミラーゼおよびその派生体（変異体）をコードしているベクターを複製すること、または所望のαアミラーゼを発現することのいずれをも行うことが可能である。好ましくは、本発明の変異体は発酵の間に培養用培地中に分泌される。例えばａｐｒＥシグナルペプチド等の、いずれの好適なシグナル配列を、分泌を実現するために用いてもよい。本発明のαアミラーゼ変異体の多くは、多様な洗剤組成物、特に特定の皿洗い用洗浄組成物、中でも公知の酸化剤を含む洗浄組成物の配合において有用である。本発明のαアミラーゼ変異体は、公知の粉末化、液体、またはゲル状の、６．５から１２．０までのｐＨを有する洗剤に配合されることができる。好適な粒状組成物は、ここに参考文献として取り込まれている、共通して所有されている米国特許出願第０７／４２９８８１号、第０７／５３３７２１号、第０７／９５７９７３号に記載されているように生成できる。これらの洗剤洗浄組成物は、例えば公知のプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、エンドグリコシダーゼ等の他の酵素または他のアミラーゼ、並びにビルダー、安定化剤、または他の当業者に知られた賦形剤を含んでもよい。これらの酵素は、共粒またはブレンドされた混合物またはその他の当業者に知られた方法で存在していても良い。さらに、多重変異体が洗浄若しくは他の用途において有用であることが本発明によって観察された。例えば、＋１５と＋１９７の両方で変化を有する変異体酵素は、洗浄用製品において有用な促進された作用を示し、または、＋１９７および＋１３８で変化を有する多重変異体は改善された作用を有しうる。洗浄用製品、皿洗い用配合物に用いるために特に好ましい酵素には、Ｍ１５Ｔ／Ｍ１９７Ｔ；Ｍ１５Ｓ／Ｍ１９７Ｔ；Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７Ｔ；Ｍ１５Ｓ／Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７Ｔ；およびＭ１５Ｔ／Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７Ｔが含まれるが、これに限定はされない。本発明の別の態様は、ここに記載されている変異体αアミラーゼと、他の酵素（即ち、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ等）、および好適には酸化安定性プロテアーゼとを組み合わせた組合せから成る。好適な酸化安定性プロテアーゼには、例えばここに参考文献として取り込まれているＵＳＲｅ３４６０６に記載されている遺伝子操作されたプロテアーゼ、並びにＤＵＲＡＺＹＭ（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）、ＭＡＸＡＰＥＮ（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ）およびＰＵＲＡＦＥＣＴＯＸＰ（ＧｅｎｅｎｃｏｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ．）等の市販の酵素が含まれる。このようなプロテアーゼ変異体（酸化安定性プロテアーゼ）を生産する好適な方法、および、特に、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ中の位置Ｍ２２２に相当するメチオニンの置換を有する変異体は、ＵＳＲｅ３４６０６に記載されている。他のスブチリシンの中で「相当する」位置を決定するために好適な方法は、ここに参考文献として取り込まれている、Ｒｅ３４６０６、ＥＰ２５７４４６およびＵＳＳＮ２１２２９１に記載されている。前述のとおり、本発明のαアミラーゼ変異体はデンプンの液化においてもまた有用である。デンプン液化、特に粒状デンプンスラリーの液化は、典型的には中性付近のｐＨおよび高温度で行われる。共通して所有されている米国出願第０７／７８８６２４号、第０７／７８８６２３号および米国特許第５１８０６６９号に記載されているとおり、数種類の酸化剤または不活性化剤が、典型的な液化工程において存在し、酵素活性に影響し得るように見える；このように、これらの関連特許出願においては、酵素を保護するために、抗酸化剤が添加されている。共通して所有された米国出願第０７／７８８６２４号、第０７／７８８６２３号および米国特許第５１８０６６９号に記載されているような好ましい液化工程の条件、即ち低いｐＨ、高い温度および潜在的酸化条件に基づいて、液化工程のために好ましい本発明の変異体は、改変されたｐＨ作用特性（即ち、低ｐＨ特性、ｐＨ＜６および好ましくはｐＨ＜５．５）、および／または改変された熱安定性（即ち、高温度、約９０−１１０℃）および／または改変された酸化安定性（即ち、促進された酸化安定性）を有するものである。このように、本発明により、改善されたデンプン液化方法が教示され、当該方法は、湿式または乾燥ミル工程由来の粒状デンプンスラリーを約４から６のｐＨで本発明のαアミラーゼ変異体を適当量、当該デンプンスラリーに添加して液化すること；付加的には、適当量の抗酸化剤または他の賦形剤をスラリーに添加すること；およびスラリーをデンプンを液化するために適当な時間と温度で反応させること、から成る。以下は実施例として示されており、クレームの範囲の限定として構築されたものではない。ここに用いられる略語、特に、３文字または１文字のアミノ酸の表記は、Ｄａｌｅ，Ｊ．Ｗ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆＢａｃｔｅｒｉａ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９８９）ＡｐｐｅｎｄｉｘＢに記載されている。実施例実施例１Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ中のメチオニン残基の入れ替え αアミラーゼ遺伝子（図１）が、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢａｃｔｅｒｉａ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、Ｓｃｏｔｌａｎｄより得られたＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＮＣＩＢ８０６１からクローン化された（Ｇｒａｙ，Ｇ．ｅｔａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１６６：６３５−６４３）。シグナル配列の最後の３残基、完全成熟タンパク質およびシグナル配列のターミネーター領域をコードしている１．７２ｋｂｐｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片を、Ｍ１３ＭＰ１８にサブクローン化した。合成ターミネーターをＢｃｌＩおよびＳｓｔＩサイトの間に、以下の型：の、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシン転写ターミネーターを含むよう設計された合成オリゴヌクレオチドカセットを用いて付加した（Ｗｅｌｌｓｅｔａｌ．（１９８３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ１１：７９１１−７９２５）。オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異は、必然的にＺｏｌｌｅｒ，Ｍ．ｅｔａｌ．（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００のプロトコルを用いた：簡潔に言うと、所望の変異をＭ１３−本鎖ＤＮＡテンプレートに導入するために５’加リン酸分解されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるもので、表Ｉに列挙されたオリゴヌクレオチドを、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ中に見出された７つのメチオニンのそれぞれを入れ替えるために用いた。各々の変異オリゴヌクレオチドはまた、制限エンドヌクレアーゼサイトを、連結された変異のスクリーンとして用いるために導入した。ヘテロ二本鎖を、Ｅ．ｃｏｌｉｍｕｔＬ細胞（Ｋｒａｍｅｒｅｔａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ３８：８７９）に移入するために用い、プラーク精製ののち、クローンはＲＦ１’ｓの制限酵素分析により解析された。陽性のものはジデオキシ配列決定（Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５４６３−５４６７）で確認し、各々のＰｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片をＥ．ｃｏｌｉベクター、プラスミドｐＡ４ＢＬ中にサブクローン化した。プラスミドｐＡ４ＢＬここに参考文献として取り込まれている、米国出願第８６０４６８号（Ｐｏｗｅｒｅｔａｌ．）に記載されている方法に従って、沈黙ＰｓｔＩサイトを、ｐＳ１６８−１由来のａｐｒＥ遺伝子（Ｓｔａｈｌ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄＦｅｒｒａｒｉ，Ｅ．（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ．１５８：４１１−４１８）のコドン＋１（シグナル分解サイトに続く最初のアミノ酸）に導入した。ａｐｒＥプロモーターおよびシグナルペプチド領域は、続いてｐＪＨ１０１プラスミド（Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｆ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ．１５４：１５１３−１５１５）からＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片としてクローン化され、ｐＵＣ１８−派生プラスミドＪＭ１０２（Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｅ．ａｎｄＨｏｃｈ，Ｊ．Ａ．（１９８９）Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ｅｄ．Ｃ．Ｒ．Ｈａｒｗｏｏｄ，ＰｌｅｎｕｍＰｕｂ．，ｐｐ．５７−７２）中にサブクローン化された。Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ由来のＰｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片の付加により、その結果生じる、図６に示されるａｐｒＥシグナルペプチド−アミラーゼ結合を有するｐＡ４ＢＬ（図５）が供与される。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中への形質転換ｐＡ４ＢＬは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製可能でＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ染色体中に組み込まれることが可能なプラスミドである。異なった派生体を含んでいるプラスミドはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中に形質転換され（Ａｎａｇｎｏｓｔｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．およびＳｐｉｚｉｚｅｎ，Ｊ．（１９６１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ．８１：７４１−７４６）、Ｃａｍｐｂｅｌｌタイプの機構（Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．（１９８４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：１６１３−１６２１）により、ａｐｒＥ座において染色体中に組み込まれた。ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＢＧ２４７３株は、アミラーゼ（ΔａｍｙＥ）および２つのプロテアーゼ（Δａｐｒ、Δｎｐｒ）を欠失されているＩ１６８（Ｓｔａｈｌ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄＦｅｒｒａｒｉ，Ｅ．（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ．１５８：４１１−４１８および米国特許５２６４３６６、参考文献としてここに取り込まれている）の派生体である。形質転換の後、ｓａｃＵ３２（Ｈｙ）（Ｈｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ．１７０：２９６−３００）変異をＰＢＳ−１媒介形質導入によって導入した（Ｈｏｃｈ，Ｊ．Ａ．（１９８３）１５４：１５１３−１５１５）。ｐＡ４ＢＬからＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中で発現されたアミラーゼのＮ−末端解析により、それが、４つの余分なアラニンを、分泌されたアミラーゼタンパク質のＮ末端に有して（Ａ４型）プロセシングされることが示された。これらの余分な残基は、Ａ４型アミラーゼの活性や熱安定性に対する顕著で有害な影響は有しておらず、いくつかの用途においては作用を促進しうる。引き続いての実験においては、正確にプロセシングされた型のｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼと変異体Ｍ１９７Ｔが、非常に類似した構築物（図６を参照）から作られた。特に、Ａ４構築物の５’末端がＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩＩ断片上に、ｐＡ４ＢＬ（図５）からＭ１３ＢＭ２０（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）中に、以下の変異オリゴヌクレオチドのためのテンプレートを得るためにサブクローン化された：このプライマーは余分な４つのＮ末端アラニンを除去し、訂正型はＰｓｔＩサイトの欠如により検索される。ＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩＩ断片をｐＡ４ＢＬベクター（図５）中に戻してサブクローン化し、プラスミドｐＢＬａｐｒとした。続いてＭ１９７Ｔの置換は、ＳｓｔＩＩ−ＳｓｔＩ断片上で、ｐＡ４ＢＬ（Ｍ１９７Ｔ）から相補的ｐＢＬａｐｒベクター中に移動させることが出来、プラスミドｐＢＬａｐｒ（Ｍ１９７Ｔ）を提供する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中でｐＢＬａｐｒから発現されたアミラーゼのＮ末端解析により、それがＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼにおいて見られるのと同じＮ末端でプロセシングされることが判明した。実施例２メチオニン変異体の酸化安定性例えばＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０（ＧｅｎｅｎｃｏｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ．より市販されている）等のＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼは、過酸化水素の存在により急速に不活性化される（図７）。多様なメチオニン変異体が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの振とうフラスコ培養および硫酸アンモニウム型で精製された粗上清中に発現された。アミラーゼは２０％飽和硫酸アンモニウム上清から、硫酸アンモニウムを７０％飽和まで引き上げることにより沈殿され、再懸濁された。派生体は続いてｐＨ５．０の０．８８Ｍ過酸化水素に２５℃でさらされた。Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ中の６つのメチオニン位置での変異体はさらに過酸化水素による酸化にさらされたが、位置＋１９７（Ｍ１９７Ｌ）での入替体は過酸化物酸化に対する抵抗性を示した（図７を参照されたい）。しかしながら、以下にさらに詳細に記述される引き続いての分析においては、派生体はｐＨ５．０、２５℃では酸化に感受性であるが、異なった条件（即ち液化）においては、改変された／改善された性質を示しうる。実施例３位置１９７での可能な全ての派生体の構築全てのＭ１９７派生体（Ｍ１９７Ｘ）が、Ａ４型でカセット変異により図８に略述されたように生産された：１）部位特異的変異（Ｍ１３中のプライマーエクステンションによる）を、以下の変異オリゴヌクレオチドを用いたＭ１９７Ａを生産するために用いた：このオリゴヌクレオチドはまた、ＥｃｏＲＶサイト（コドン２００−２０１）を、ＣｌａＩサイト（コドン２０１−２０２）を入れ替えて挿入した。２）プライマーＬＡＡＭ１２（表２）を、別の沈黙制限サイト（ＢＳｔＢＩ）をコドン１８６−１８８にかけて導入するために用いた。３）その結果生じたＭ１９７Ａ（ＢｓｔＢＩ＋、ＥｃｏＲＶ＋）変異体は、続いてプラスミドｐＡ４ＢＬ中にサブクローン化され（ＰｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片）、その結果生じたプラスミドをＢｓｔＢＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、大きなベクターを含む断片をアガロースゲルから電気溶出により単離した。４）合成プライマーＬＡＡＭ１４−３０（表２）を、それぞれ、だいたいは相補的である共通プライマーのＬＡＡＭ１３（表２）とアニーリングさせた。その結果生じた、全ての残りの天然アミノ酸を位置＋１９７においてコードしているカセットを、上記のように調製されたベクター断片に、個別に連結した。カセットはライゲーションにおいてＥｃｏＲＶサイトを破壊するよう設計されており、このようにＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を、この唯一のサイトの欠失に関して検索した。これに加えて、カセットの共通底部鎖はフレームシフトを含み、ＮｓｉＩサイトをコードし、このように、この鎖から派生した形質転換体は唯一のＮｓｉＩサイトの存在に関する検索により排除可能であり、何れの場合でも、活性型アミラーゼの発現につながることは期待されていない。制限分析で陽性であったものはシークエンスにより確認し、振とうフラスコ培地中での発現のためにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中に形質転換された（図９）。続いて、あるＭ１９７Ｘ変異体の比活性を水溶性基質アッセイにより決定した。以下のアッセイ方法により得られたデータを表３に示す。水溶性基質アッセイ：Ｍｅｇａｚｙｍｅ社（ＡＵＳｔ．）Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．によって供給されている最終点アッセイキットをもとにして、レートアッセイを開発した：各々の基質（ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド、ＢＰＮＰＧ７）のバイアルを、１０ｍｌの滅菌水に溶解させ、続いて１から４のアッセイバッファー（５０ｍＭリンゴ酸バッファー、ｐＨ６．７、５ｍＭ塩化カルシウム、０．００２％Ｔｗｅｅｎ２０）中での希釈を行った。１０μｌのアミラーゼを７９０ μｌのキュベット中の基質に２５℃で添加することによりアッセイを行った。加水分解のレートは、７５秒後の４１０ｎｍの吸光度の変化のレートとして測定した。このアッセイは、０．４吸光単位／分まで直線的であった。アミラーゼのタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８の方法に基づいた、牛血清アルブミンスタンダードを用いた標準的なＢｉｏ−Ｒａｄアッセイ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により測定した。デンプン加水分解アッセイ：Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０のαアミラーゼ活性のアッセイのための標準的な方法を用いた。この方法は、ここに参考文献として取り込まれている米国特許出願第０７／７８５６２４号の実施例１に詳述されている。天然デンプンは沃素と青色を形成するが、短いデキストリン分子に加水分解されるとそれが出来なくなる。基質は、リン酸バッファー、ｐＨ６．２（４２．５ｇｍ／ｌ二水素リン酸カリウム、３．１６ｇｍ／ｌ水酸化ナトリウム）中の、可溶性Ｌｉｎｔｎｅｒデンプン５ｇｍ／ｌである。試料を２５ｍＭ塩化カルシウムに添加し、活性は、３０℃で保温して、沃素試験で陰性となるまでにかかった時間として測定された。活性は、以下の公式に従って計算された、グラムまたはｍｌ（ＬＵ）あたりのリケフォン（ｌｉｑｕｅｆｏｎｓ）で記録した。ここで、ＬＵ＝リケフォン単位Ｖ＝試料の容量（５ｍｌ）ｔ＝デキストリン化時間（分）Ｄ＝希釈因子＝希釈容量／添加した酵素のｍｌまたはｇ。実施例４派生体Ｍ１５Ｌの特徴付け以前の実施例のとおりに生産されたＭ１５Ｌは、増加したアミラーゼ活性を示さず（表３）、過酸化水素でまだ不活性化された（図７）。しかしながら、デンプンのジェット液化において、特に以下の表４に示されるように低いｐＨにおいて、著しく増加された作用を示した。デンプン液化は、典型的には、混合チャンバーの後ろに２．５リッター遅延コイルを、および最終後部圧力バルブを備えたハイドロヒーターＭ−１０３−Ｍ蒸気ジェットを用いて行った。デンプンはモイノポンプ（Ｍｏｙｎｏｐｕｍｐ）によって加えられ、蒸気は１５０ｐｓｉ蒸気ラインによって、９０−１００ｐｓｉに減少されて供給される。温度プローブが、ハイドロヒーターのすぐ後ろで後部圧力バルブのすぐ前に設置されている。デンプンスラリーは、トウモロコシ湿式ミラーより得、２日以内に用いられた。デンプンを脱塩水で所望の固体レベルに希釈し、デンプンのｐＨは２％ＮａＯＨまたは飽和Ｎａ₂ＣＯ₃によって調整した。典型的な液化の条件は：デンプン３２％−３５％固体カルシウム４０−５０ｐｐｍ（３０ｐｐｍ添加）ｐＨ５．０−６．０ αアミラーゼ１２−１４ＬＵ／ｇ乾燥デンプンベースであった。デンプンを３５０ｍｌ／ｍｉｎでジェットに導入した。ジェット温度は１０５ ℃−１０７℃に保たれた。デンプンの試料は、ジェットクッカーから９５℃の第２段階の液化に移され、９０分間保持された。第２段階の液化の直後に、デンプン液化の度合を、ともにＳｔａｎｄａｒｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｏｆｔｈｅＭｅｍｂｅｒＣｏｍｐａｎｉｅｓｏｆｔｈｅＣｏｒｎＲｅｆｉｎｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＩｎｃ．、第６版に記載されている方法にに従って、標準分析法試料のデキストロース相当（ＤＥ）を決定すること、および生デンプンの存在を試験することにより測定した。デンプンを、上で与えられた条件下およびｐＨ６．０で処理した場合、一般に、生デンプン無しで約１０ＤＥの液化デンプンを得た。本発明の変異体を用いたデンプン液化試験の結果を、表４に示す。実施例５Ｍ１５Ｘ派生体の構築上記の実施例３に記述された工程に一般に従って、Ｍ１５における全ての派生体（Ｍ１５Ｘ）を、図１２に概要を示したように、天然Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ中でカセット変異により生産した：１）部位特異的変異（Ｍ１３中でのプライマーエクステンションによる）を、Ｍ１５コドンに隣接した唯一の制限サイトを導入し、変異カセットの挿入を実現するために用いた。特に、コドン１１−１３のＢｓｔＢＩサイト、およびコドン１８−２０のＭｓｃ１サイトを、以下に示すオリゴヌクレオチドを用いて導入した。２）続いて、Ｍ１５Ｘカセット変異のためのベクターを、変異アミラーゼ（ＢｓｔＢ１＋、Ｍｓｃ１＋）由来のＳｆｉ１−ＳｓｔＩＩ断片を、プラスミドｐＢＬａｐｒ中にサブクローン化することにより構築した。その結果生成されたプラスミドを、続いて、ＢｓｔＢ１およびＭｓｃ１で消化し、そして大きなベクター断片をポリアクリルアミドゲルから電気溶出により単離した。３）変異カセットをＭ１９７Ｘ派生体に関して生産した。コドン１５での入れ替えをそれぞれコードしている合成オリゴマーを、共通底プライマーとアニーリングさせた。カセットとベクターとの適切なライゲーションにより、Ｍｓｃ１は破壊され、このサイトの欠失により陽性形質転換体の検索が可能となった。底プライマーは唯一のＳｎａＢ１サイトを有し、底鎖から派生した形質転換体を、ＳｎａＢ１サイトの検索により排除することを可能にした。このプライマーはまた、共通底鎖から派生した変異体のアミラーゼ発現を排除するフレームシフトを含有している。合成カセットは表５に列挙され、一般にカセット変異戦略は図１２に記載されている。実施例６Ｍ１５Ｘでのベンチ液化実施例５のとおりに生産された１１のＭ１５置換派生体について活性を測定し、ｐＨ５．５でベンチ液化システムを用いた液化において、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０（ＧｅｎｅｎｃｏｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．より市販）と比較した。ベンチスケール液化システムは、前面端から約１２インチの距離にある、７インチ長静的混合要素を備えたステンレススチールコイル（直径０．２５インチ、容積約３５０ｍｌ）および後面端部に３０ｐｓｉ後部圧力バルブから成る。コイルは、それぞれの端を除いて、熱静力学的に制御されたバスを１０５−１０６℃に保温していた加熱要素を備えたグリセロール−ウォーターバス中に浸されていた。酵素を含むデンプンスラリーを、撹拌により懸濁液状に保ち、ピストン駆動メータリングポンプにより７０ｍｌ／ｍｉｎで、反応コイル中に導入した。デンプンをコイルの端から回収し、第２保持（９５℃、９０ｍｉｎ）へ移送した。第２保持の直後に液化デンプンのＤＥを、実施例４に記述されているように測定した。結果を図１６に示す。実施例７Ｍ１９７Ｘ派生体の特徴付け図９に見られるように、Ｍ１９７Ｘ（Ａ４型）派生体によって示された幅広いアミラーゼ活性（水溶性基質により測定）の範囲があった。アミラーゼは、２倍量のエタノールでの沈殿および再懸濁により上清から部分精製した。それらを熱安定性に関して、１０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．０、５ｍＭ塩化カルシウムの存在下で９５℃で５分間加熱することによりスクリーニングした（図１０）；Ａ４野生型は保温後２８％の活性を保持していた。Ｍ１９７ＷおよびＭ１９７Ｐに関しては、活性なタンパク質を上清から回収することは出来なかった。配列決定において、Ｍ１９７Ｈは、第２の変異Ｎ１９０Ｋを含んでいることが判明した。Ｍ１９７Ｌは、別個の実験によって試験されたが、最も熱安定性の低い派生体の１つであった。アミラーゼ活性の発現と熱安定性との間には幅広い関連があるように思われた。ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼは、位置１９７に何れのアミノ酸を受け入れることが出来るかに関して、熱安定性の保持または促進の見地から制限を受けている：システインおよびスレオニンは、これらの条件の下での最高の熱安定性には好ましいものであった一方で、アラニンおよびイソロイシンは中間的な安定性であった。しかしながら、位置＋１９７での他の置換は、他の用途においては有用であるかもしれない低下された熱安定性という結果となった。さらに、＋１９７での異なった置換は、他の有利な性質、例えば改変されたｐＨ作用特性または改変された酸化安定性を有しているかもしれない。例えば、Ｍ１９７Ｃ派生体は、容易に空気酸化によって不活性化されるがことが判明したが、促進された熱安定性を有していた。逆に、Ｍ１９７Ｌ派生体と比較して、Ｍ１９７ＴおよびＭ１９７Ａは高い熱安定性（図１０）のみならず高い活性（表３）を保持している一方で、ｐＨ５からｐＨ１０で過酸化物による不活性化に対して耐性を有していた（図７）。実施例８洗剤配合物における安定性および作用Ｍ１９７Ｔ（Ａ４型）、Ｍ１９７ＴおよびＭ１９７Ａ（Ａ４型）の、自動皿洗い用洗剤（ＡＤＤ）母体中での安定性を測定した。２ｐｐｍのＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）（プロテアーゼで、ＮｏｖｏＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓから市販されており、ＡＤＤで普通に用いられるタイプ）を、２つの市販の漂白剤含有ＡＤＤである：Ｃａｓｃａｄｅ（登録商標）（ＰｒｏｃｔｅｒａｎｄＧａｍｂｌｅ，Ｌｔｄ）およびＳｕｎｌｉｇｈｔ（登録商標）（Ｕｎｉｌｉｖｅｒ）に添加し、アミラーゼ派生体およびＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ａ／Ｓより入手可能な熱安定性αアミラーゼ）の、６５℃での不活性化のタイムコースを続いて行った。両方の場合において用いられたＡＤＤ製品の濃度は、「ｐｒｅ−ｓｏａｋ」条件に相当している：水１リットルに対して１４ｇｍ（ガロンあたり７グラムの硬度）。見られるとおり（図１１ａおよび１１ｂ）、両方の型のＭ１９７Ｔ派生体は、最初のアッセイが行われる前に不活性化されたＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）およびＭ１９７Ａ（Ａ４型）と比較して顕著に安定であった。この安定性の利点は、以下の手順に従って決定されたように、デンプンの存在下または非存在下で見られた。アミラーゼを、試験管内で前もって温められた５ｍｌのＡＤＤおよびＳａｖｉｎａｓｅ（登録商標）に添加し、ボルテックスした後、可溶性基質アッセイを用いて活性を時間の関数として測定した。「＋デンプン」管は、側面に焼き付けた（１４０℃、６０分）スパゲティデンプンを有していた。結果は図１１ａおよび１１ｂに示した。実施例９Ｍ１５Ｘ派生体の特徴付け全てのＭ１５ＸをＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて増加させ、発現レベルを図１３に示したようにモニターした。アミラーゼを分離し、２０−７０％の硫酸アンモニウム法により部分精製した。これらの派生体の水溶性基質にたいする比活性は実施例３と同様に測定した（図１４）。Ｍ１５Ｘアミラーゼの多くは、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０のそれより大きい比活性を有していた。ベンチトップ（ｂｅｎｃｈｔｏｐ）熱安定性アッセイを、アミラーゼを９０℃で５分間、５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ５．０中、５ｍＭ塩化カルシウム存在下で加熱することにより行った（図１５）。派生体のほとんどが、本アッセイにおいてＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０と同様に作用した。このアッセイにおいて相応の安定性を示した派生体（相応の安定性とは、少なくともＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０の熱安定性の６０％の有するものとして定義）を、デンプンに対する比活性とｐＨ５．５での液化作用について試験した。これらの変異体のうち、最も興味深いものを図１６に示す。Ｍ１５Ｄ、ＮおよびＴ、ならびにＬは、ｐＨ５．５の液化において、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＡ２０を上回る性能を示し、水溶性基質とデンプン加水分解活性の両方のアッセイにおいて増加した比活性を有していた。一般に、位置１５のメチオニンを置換することにより、増加された低ｐＨ液化作用および／または増加された比活性を有する派生体を提供可能であることが発見された。実施例１０トリプトファンの酸化感受性クロラミンＴ（Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンイミドナトリウム）は、選択的酸化剤であり、中性またはアルカリ性のｐＨでメチオニンをメチオニンスルホキシドに酸化する。酸性ｐＨにおいては、クロラミンＴはメチオニンおよびトリプトファンの両方を修飾する（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ｙ．，Ｂｕｒｓｔｅｉｎ，Ｙ．ａｎｄＰａｔｃｈｏｒｎｉｋ，Ａ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１４（２０）４４９７−４５０３）。図１７は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼの、ｐＨ８．０でのクロラミンＴでの不活性化を示す（ＡＡ２０＝０．６５ｍｇ／ｍｌ、Ｍ１９７Ａ＝１．７ｍｇ／ｍｌ、Ｍ１９７Ｌ＝１．７ｍｇ／ｍｌ）。このデータは、位置１９７のメチオニンをロイシンまたはアラニンに変えることにより、αアミラーゼの不活性化を防止可能であることを示している。これとは逆に、図１８に示されるように、ｐＨ４．０では、Ｍ１９７Ａおよび、Ｍ１９７Ｌの不活性化は進行するが、より多くのクロラミンＴ当量が必要である（図１８；ＡＡ２０＝０．２２ｍｇ／ｍｌ、Ｍ１９７Ａ＝４．３ｍｇ／ｍｌ、Ｍ１９７Ｌ＝０．５３ｍｇ／ｍｌ；２００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）。このことは、トリプトファン残基も、クロラミンＴ仲介不活性化事象において関与していることを示唆している。さらに、トリプティック（ｔｒｙｐｔｉｃ）マッピングおよびそれに続くアミノ酸配列決定により、位置１３８にあるトリプトファンがクロラミンＴにより酸化されることが示唆された（データは示さず）。これを証明するために、部位特異的変異をトリプトファン１３８に以下に示したように導入した。αアミラーゼ二重変異体Ｗ１３８およびＭ１９７の調製特定の派生体Ｗ１３８（Ｆ、ＹおよびＡ）を、Ｍ１９７Ｔである二重変異体として作成した（実施例３の記載と同様に作成された）。二重変異体は実施例１および３記載の方法に従って作成された。一般に、単一陰性鎖のＤＮＡを、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼＭ１９７Ｔ変異体の配列（ＰｓｔＩ− ＳｓｔＩ）をコードしている１．７２ｋｂのＭ１３ＭＰ１８クローンより調製した。部位特異的変異を、以下に列挙したプライマーを用いて、Ｔ４遺伝子３２タンパク質およびＴ４ポリメラーゼをクレノーで代用したことを除いては、本質的にＺｏｌｌｅｒ，Ｍ．ｅｔａｌ．（１９８３）の方法に従って行った。全てのプライマーは、適切な変異を有するクローンを同定するための唯一のサイトを、所望の変異と同様に有していた。トリプトファン１３８をフェニルアラニンへトリプトファン１３８をチロシンへトリプトファン１３８をアラニンへ −このプライマーはまた、位置１３８の上流および下流の唯一のサイトを操作している。変異体を制限分析で同定し、Ｗ１３８ＦおよびＷ１３８ＹをＤＮＡ配列決定により確認した。Ｗ１３８Ａ配列は唯一のＢｓｐＩおよびＸｍａＩサイトとの間に、ヌクレオチドの欠失があることが判明したが、残りの遺伝子は正確に配列決定された。Ｗ１３８ＸおよびＭ１９７Ｔ変異の両方を有する１．３７ｋｂのＳｓｔＩＩ−ＳｓｔＩ断片を、Ｍ１３ＭＰ１８から発現ベクターｐＢＬａｐｒ中に移動させ、ｐＢＬａｐｒ（Ｗ１３８Ｆ、Ｍ１９７Ｔ）およびｐＢＬａｐｒ（Ｗ１３８Ｙ、Ｍ１９７Ｔ）をその結果生産した。唯一のＢｓｐＥＩおよびＸｍａＩサイトを含む断片を、ｐＢＬａｐｒ（ＢｓｐＥＩ、Ｘｍａｌ、Ｍ１９７Ｔ）中にクローン化したが、それは位置１３８に他のアミノ酸の置換を含んでいるクローニングカセットのために有用であるからである。アミノ酸位置１３８の単一の変異以前の実施例に一般に記載された方法に従って、特定のＷ１３８（Ｆ、Ｙ、Ｌ、ＨおよびＣ）単一派生体を生成した。実施例７のプラスミドｐＢＬａｐｒ（Ｗ１３８Ｘ、Ｍ１９７Ｔ）の、Ｍ１９７Ｔ変異を有しているＡｓｐ７１８−ＳｓｔＩ断片を、１９７にメチオニンを有する野生型断片で入れ替え、ｐＢＬａｐｒ（Ｗ１３８Ｆ）、ｐＢＬａｐｒ（Ｗ１３８Ｙ）およびｐＢＬａｐｒ（ＢｓｐＥＩ、ＸｍａＩ）を生成した。変異体Ｗ１３８Ｌ、Ｗ１３８ＨおよびＷ１３８Ｃは、合成カセットをｐＢＬａｐｒ（ＢｓｐＥＩ、ＸｍａＩ）ベクター中に以下のプライマーを用いてライゲーションすることにより調製した。トリプトファン１３８をロイシンへトリプトファン１３８をヒスチジンへトリプトファン１３８をシステインへ二重変異体Ｍ１９７Ｔ／Ｗ１３８ＦおよびＭ１９７Ｔ／Ｗ１３８ＹとクロラミンＴの反応を、野生型と比較した（ＡＡ２０＝０．７５ｍｌ、Ｍ１９７Ｔ／Ｗ１３８Ｆ＝０．６４ｍｇ／ｍｌ、Ｍ１９７Ｔ／Ｗ１３８Ｙ＝０．６０ｍｇ／ｍｌ；５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）。図１９に示された結果は、トリプトファン１３８の変異は、変異体がクロラミンＴに対してより抵抗性となることを引き起こしていたことを示している。実施例１１多重変異体の調製実施例１、３、５および１０の方法に従い、以下の多重変異体を作成した：Ｍ１５Ｔ／Ｍ１９７Ｔ；Ｍ１５Ｓ／Ｍ１９７Ｔ；Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７Ｔ；Ｍ１５Ｓ／Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７ＴおよびＭ１５Ｔ／Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７Ｔ。これらの多重変異体のあるものは、例えば、Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７Ｔが実施例１０において作成、試験されたように、以前に実験された。多重変異体は制限分析で同定した。本発明の範囲に含まれる多様な多重変異体を、さらに、洗浄製品（自動皿洗い機用洗剤）添加物としての作用について試験した。これらの試験は以下に詳述する。安定性試験過ホウ酸およびＴＡＥＤを含む自動皿洗い用洗剤（ＡＤＤ）の４０００ｐｐｍの溶液を、硬度７ｇｐｇの水中に調製した。上記の特定のアミラーゼ変異体を、このＡＤＤに、Ｃｅｒａｌｐｈａ法（Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ａｕｓｔｒ．）Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．，Ｐａｒｒａｍａｔｔａ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によるアッセイで比率０．４を得るように添加した。１セットの試料を、室温（２１−２３ ℃）で約３０分保温した（非加熱）。第２のセットを室温から約６５℃まで、酵素の添加後に温めた（加熱）。酵素添加の３０分後、アミラーゼ変異体の活性を測定し、酵素添加時の活性に対する相対活性を計算した（相対活性％）。図２０に示されたこの結果は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのαアミラーゼの位置＋１９７にあるメチオニンは、ＡＤＤ＋過ホウ酸＋ＴＡＥＤを有する配合物における安定性のためには修飾されるべきであることを示唆している。デンプン加水分解アッセイ過ホウ酸およびＴＡＥＤを含む自動皿洗い用洗剤（ＡＤＤ）の４０００ｐｐｍの溶液を、硬度７ｇｐｇの水中に調製し、調理された屈曲マカロニ（ｅｌｂｏｗｍａｃａｒｏｎｉ）の３つの破片を添加した。上記のアミラーゼ変異体を、このＡＤＤ溶液に終濃度で５ｐｐｍ活性酵素となるよう添加した。チューブを５０ ℃で約３０分保温し、解離した還元糖の濃度を、ジニトロサリチル酸法を用いて、グルコース標準曲線に対して測定した。結果を表６に示す。表６に示された結果は、Ｍ１５Ｔ／Ｍ１９７Ｔ；Ｍ１５Ｓ／Ｍ１９７Ｔ；Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７Ｔ；Ｍ１５Ｓ／Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７ＴおよびＭ１５Ｔ／Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７Ｔは、酵素の無い、および野生型αアミラーゼ対照と比較して良好に作用した。オートミールの染み調理し、混合したオートミールのペーストで、均等に皿を汚し、３７℃で一晩乾燥させた。皿をＡＳＫＯモデル７７０皿洗い機中に入れ、４５℃で急速洗浄サイクルで５％過ホウ酸、３％ＴＡＥＤおよび１１ｍｇの特定のアミラーゼ酵素を含む、１０ｇの自動皿洗い用洗剤を用いて洗浄した。プレートを、汚す前、汚した後、および洗浄後に重さを計り、全てのプレートから除去された汚れの平均％を計算した。データを以下の表７に示す。データは、変異体酵素は、野生型酵素によって提供されるより大きな利益を提供することを示している。オートミール除去において、野生型酵素は、酵素なしのＡＤＤより２０％大きい利益を提供した。実施例１２皿洗い組成物野生型および変異体アミラーゼの１％（ｗ／ｗ）粒子を、５％（ｗ／ｗ）過ホウ酸一水素ナトリウムおよび３％（ｗ／ｗ）ＴＡＥＤを添加したＫｏｒｅｘ自動皿洗い機用洗剤とともに配合した。これらの配合物の試料を、室温（２１−２３ ℃）、または８０％の相対湿度および３８℃、で４週間放置した。結果を図２１および２２に示す。この結果は、Ｃｅｒａｌｐｈａ法によって測定された、野生型アミラーゼの活性が、洗剤中での貯蔵時間の増加とともに減少していることを示している。室温では、変異体酵素は完全に安定であった。３８℃および８０％相対湿度においては、すべての変異体酵素は野生型より安定であった。これらの変異体アミラーゼを自動皿洗い機用洗剤に配合する利点とは、これらの変異体は、過ホウ酸およびＴＡＥＤの存在下において野生型より顕著に安定であり、それらは洗浄中、デンプンの食物の汚れの除去において顕著に作用する利益を提供することである。実施例１３酸化安定性プロテアーゼ／酸化安定性アミラーゼの安定性の研究１）野生型プロテアーゼおよび野生型アミラーゼ；または２）ＵＳＲｅ３４６０６に記載された方法によって生成された漂白剤安定性プロテアーゼ（ＧＧ３６−Ｍ２２２Ｓ）および漂白剤安定性アミラーゼ（ＡＡ２０−Ｍ１５Ｔ−Ｗ１３８Ｙ−Ｍ１９７Ｔの何れかを含む酵素粒子を、０．１Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ１０．２および０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０を含むバッファー中に、各々の酵素１２．５ｍｇの濃度で溶解させた。これらの溶液の９ｍｌに、１ｍｌの水または１ｍｌの３０％過酸化水素を添加した。溶液を２５℃で３０分間保温した後、プロテアーゼおよびアミラーゼ活性を測定し、元々の活性の％として示した。データを以下の表８に示す。データは、両方とも酸化に感受性であるアミノ酸残基の変異を有する漂白剤安定性アミラーゼ変異体および漂白剤安定性プロテアーゼ変異体の組合せは、漂白剤による不活性化に対して耐性である配合物中でのプロテアーゼおよびアミラーゼの組み合わされた利益をもたらした。漂白剤安定性アミラーゼと漂白剤安定性プロテアーゼの組合せは、漂白剤中で３０分後においてもその初期活性のほとんどを保持していたが、野生型酵素の組合せは、同じ期間の時点で初期活性の８０％以上を失っていた。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Improved cleaning composition Field of the invention The present invention relates to a novel α-amylase variant having an amino acid sequence not found in nature Such a variant comprises one or more precursor α The amino acid residues of the amylase, especially any oxidizable amino acids, are different It has an amino acid sequence that is substituted with a amino acid. The variant enzyme of the present invention may comprise a modified acid Including modified stability, modified pH action characteristics, modified specific activity and / or modified temperature stability Show modified stability / activity properties, including but not limited to:Background of the Invention α-amylase (α-1,4-glucan-4-glucanohydrolase, EC3. 2.1.1) significantly increases the internal α-1,4-glycosidic bonds in starch To produce maltodextrin with low molecular weight. α-amylase Has considerable commercial value and in the first stage of starch processing (liquefaction); In the manufacture of alcohol; as a detergent in the detergent matrix; and for the removal of starch For use in the textile industry. α-amylase is a B.A. licheni formis, B.S. amyloliquefactants, B.A. subtil is or B. Produced from microbial sources such as stearothermophilus Bacillus and Asperg, along with the most commercial amylase It is produced by a wide range of microorganisms, including illus. In recent years, commercial use Preferred enzymes work with temperature stability at least at neutral and slightly alkaline pH. From the business, B. licheniformis. To determine which residues are important for the catalytic activity of amylase, And / or modification of specific amino acids inside active centers of various amylases (Vihinen, M. et al. (1990) JB ichem. 107: 267-272; Holm, L .; et al. (1990 ) Protein Engineering 3: 181-191; Taka se, K .; et al. (1992) Biochemica et Bioph. ysica Acta, 1120: 281-288; Matsui, I .; et al. (1992) Febs Letters Vol. 310, no. 3; p p. 216-218); Which residues are important for temperature stability (Suzuki) , Y. et al. (1989) J. Am. Biol. Chem. 264: 18933 -18938); studies using recombinant DNA technology have been conducted. One group describes such a method in B.S. licheniformis amira Used to introduce mutations at various histidine residues in the histidine residue. The basis for causing substitution in the group licheniformis amirror Ze, which is known to be thermostable, works with other similar Bacillus amylase When compared, they have an excess of histidine residues and therefore It was suggested that the replacement would change the thermostability of the enzyme (D eclerck, N.M. et al. (1990) J. Am. Biol. Chem. 26 5: 15481-15488; FR 2 665178-A1; Joyet, P. . et al. (1992) Bio / Technology 10: 1579-. 1583). α-amylase is produced at pH 4 and 10.5 by hydrogen peroxide and other oxidants. In between, it is clear that they are inactivated as described in the examples herein. Was. Commercially, α-amylase enzymes are available in both high and low Used under dramatically different conditions, such as pH conditions. For example, α-amylase For liquefaction of starch, a process that is preferably carried out at low pH (pH <5.5) You can be. Amylases, on the other hand, often contain oxidizing agents such as bleach and peracids, It may also be used in commercial dish or laundry detergents under more alkaline conditions. You. To alter the stability or activity characteristics of the amylase enzyme under a variety of conditions, For example, methionine, tryptophan, tyrosine, histidine or cysteine Selective substitution, substitution, or deletion of oxidizable amino acids It was found that this resulted in the properties of the modified mutant enzyme. Currently marketed Amylase is not acceptable (unstable) under a variety of conditions and There is a need for amylase with altered stability and / or activity properties . Altered stability (oxidation, temperature, or temperature) compared to wild-type or precursor enzymes Or pH action properties) can be achieved while maintaining adequate enzyme activity. Features affected by the introduction of such mutations maintain thermal stability. The change in oxidative stability while doing so, or vice versa, may be used. Additionally, alpha Substitution of an oxidizable amino acid for another amino acid in the Is the deletion of one or more oxidizable amino acids Results in altered enzyme activity at a pH other than the optimum considered There is also. In other words, the mutated enzymes of the present invention rely on the enhanced oxidative stability of the enzyme. It also has modified pH-acting properties, which can be:Summary of the Invention The present invention relates to a novel expression product of a mutant DNA sequence encoding α-amylase. One or more oxidizable amino acid mutants from the precursor α-amylase Mutated DNA sequences derived from deletion or substitution (replacement) of functional amino acids Related. In one preferred aspect of the invention, the mutation is the precursor alpha amino acid. Substituting one or more methionine residues in the It is derived from. In another preferred aspect of the invention, the mutation is a precursor. -Only one or more tryptophan residues, or one or more Includes substitutions in combination with onine residues. Such mutant α-amylases are generally Substituting or deleting one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the precursor Pre-coding encoding a naturally occurring or recombinant α-amylase as it encodes Obtained by modifying the DNA sequence of the DNA in vitro. Preferably, one or more amino acid substitutions or deletions occur in one or more of such sequences. Methionine, tryptophan, cysteine, histidine, or tyrosine residue Most preferably, the residue to be changed is methionine. Residue. Oxidizable amino acid residues can be any of the twenty natural amino acids. Can be interchanged. If the desired effect alters the oxidative stability of the precursor Optionally, the amino acid residue is an amino acid that is not oxidizable (eg, alanine, Arginine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, guri Syn, isoleucine, leucine, lysine, phenylalanine, proline, serine , Threonine or valine) or other oxidizable amino acids (eg, cysteine Methionine, tryptophan, tyrosine or histidine, most easily oxidized In the order from those that are easily oxidized to those that are not easily oxidized) . Similarly, if the desired effect is a modification of the thermostability, the 20 natural amino acids Any of the acids may be substituted (eg, when cysteine is replaced by methionine Good). Preferred mutations are described in licheniformis alpha amylase Methionine residues (+8, +15, +197, +256, +304, +366 and And +438) for methionine residues. Most preferred Is methionine to be replaced, licheniformis α Amira Methionine corresponding to position +197 or +15 in the ose. Methionine A preferred replacement amino acid for replacement at position +197 is alanine (A ), Isoleucine (I), threonine (T) or cysteine (C). Rank Preferred substituted amino acids at the position +15 are leucine (L), threonine (T), Sparagine (N), aspartic acid (D), serine (S), valine (V) and Other substituted amino acids that are isoleucine (I) but not specified above are also Will be useful. Two particularly preferred mutations of the invention are M197T and M15L . Another embodiment of the present invention relates to licheniformis α-amylase (FIG. 2) Tryptophan residues corresponding to any of the tryptophan residues found in Variants that include substitution of groups. Preferably, the tryptophan residue to be replaced The group is licheniformis corresponds to +138 in α-amylase Of the position. Mutation (substitution) of a tryptophan residue can be performed alone, Alternatively, it may be made in combination with mutation of another oxidizable amino acid residue. Especially, Combining at least one tryptophan with at least one methionine Can be modified by substitution (eg, double mutation + 138 / + 197). It is advantageous. The α-amylase variants of the present invention generally comprise hydrogen peroxide and a bleach or peracid. The presence of other oxidants, such as chloramine-T, and more particularly mild oxidants, such as chloramine-T. Below, an altered oxidative stability is shown. Mutant enzymes with enhanced oxidative stability With shelf life, bleach, peroxyboric acid, peroxycarbonic acid, or peracid It is useful for extending compatibility with amylase used in cleaning products. Similarly, reduced oxidative stability requires rapid and efficient loss of enzyme activity Useful in industrial processes. The mutant enzymes of the present invention also provide enhanced pH action characteristics. So that mutants such as M15L can be used for low pH starch liquefaction processes. Mutants such as M197T are stable under high pH washing product conditions. Is shown. The variants of the present invention also exhibit altered temperature stability, thereby Variants exhibit stability at either high or low temperatures. Compared to the precursor Any change (increase or decrease) in the enzymatic properties of any of the mutants It can be advantageous depending on the end use. In addition to starch processing and cleaning applications, the derived amylase of the present invention can It can be used in any application where the enzyme is used. Millase can be used in textile processing, food processing and the like. In particular, derivative enzymes such as M197C Is easily inactivated by an oxidizing agent, but is completely amylase-activated at the end of the process. Useful in processes requiring removal of water, such as frozen food processing applications Was observed. Preferred α-amylase variants of the invention are those described in licheniformis, B. amyloliquefactants, and B.A. stearother Bacillus strains, such as B. mophilus, and most preferably Bacillus. licheniformis. In another embodiment of the present invention, usually by licheniformis New types of alpha-amylase to be produced have been provided. This new type is A4 type And four additional alanine residues at the N-terminus of the secreted amylase. (FIG. 4b). Derivatives or variants of the A4 type of α-amylase are described in the present invention. included. Depending on the type A4 derivative or variant, the invention provides, for example, One or more mutations (substitutions, substitutions or deletions) in one or more oxidizable amino acids A4 type α-amylase having an additional mutation of In embodiments of the composition of the present invention, described herein are in liquid, gel or granular form. Detergent compositions comprising the disclosed α-amylase variants are provided. Especially preferred The +197 position mutant alone or the endoglycosidase, cellular Combination with other enzymes such as enzymes, proteases, lipases or other amylase enzymes It is a detergent composition contained in the composition. Additionally, the composition of the present invention may comprise one or more An α-amylase variant having a site-specific mutation may be included. In yet another compositional aspect of the present invention, starch processing, especially starch Compositions useful for pour liquefaction are provided. The liquefied starch compositions of the present invention are preferred. Or an α-amylase variant having a substitution or deletion at position M15 . Additionally, such compositions may include, for example, antioxidants, calcium, ions, etc. It has been observed that it may contain components known to those skilled in the art, including: In a process embodiment of the invention, the densities from a wet or dry mill process are A method is provided for the liquefaction of a starch, especially a granular starch slurry. In general In the first stage of the starch degradation process, the starch slurry is relatively hot ( (Up to about 110 ° C.). After the starch slurry has been gelatinized , It is liquefied and dextrinized using α-amylase. Such liquid The conditions for the conversion are described in commonly assigned U.S. patent application Ser. No. 07 / 785,624. No. 07 / 785,623 and US Pat. No. 5,180,669. And their disclosures are incorporated herein by reference. This method is An effective amount of the α-amylase of the present invention is added to the starch, alone or in an additional Added in combination with excipients, slurries starch at appropriate time and temperature For the liquefaction of starch. A further aspect of the present invention relates to a mutant α-amylase of the present invention (type A4 and mutants thereof). And an expression vector encoding the DNA. As well as host cells transformed with such expression vectors.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. α-ami from L. licheniformis (NCIB8061) DNA sequence of the Rase gene, SEQ ID NO: 31, and Gray, G .; et al . (1986) J. Am. Bacter. 166: 635-643. The constant translation product is shown. FIG. α-ami from L. licheniformis (NCIB8061) SEQ ID NO: 32 shows the mature amino acid sequence of the lase, SEQ ID NO: 32. FIG. 3 shows the primary structures of Bacillus α-amylase arranged side by side. B. lic heniformis amylase (Am-Lich), SEQ ID NO: 33, comprises Gr ay, G .; et al. (1986) J. Am. Bacter. 166: 635-64 3 and B.3. amyloliquefaciens amylase (A m-Amylo), SEQ ID NO: 34, is described in Takkinen, K .; et al. ( 1983) J. Biol. Chem. 258: 1007-1010 B; stearothermophilus (Am-Stearo), distribution Column number 35 is from Ihara, H .; et al. (1985) J. Amer. Bioche m. 98: 95-103. Figure 4a shows the amino acid sequence of the mature α-amylase derivative M197T, SEQ ID NO: 36. Is shown. FIG. A4 type derived from L. licheniformis NCIB8061 SEQ ID NO: 37 shows the amino acid sequence of α-amylase. Numbering is from the N-terminus Starting with four additional alanines. FIG. 5 shows plasmid pA4BL, in which BLAA is B. licheniformis α-amylase gene, PStI to SstI Refers to; Amp^RRefers to the ampicillin resistance gene from pBR322; CAT Indicates a chloramphenicol resistance gene derived from pC194. FIG. licheniformis (SEQ ID NO: 38); subti lis (SEQ ID NO: 39), B. lac in pA4BL. licheniformis (distribution Column no. 40) and B. in pBLapr. licheniformis (sequence number No. 41) shows the signal sequence-mature protein binding portion FIG. 7a shows that certain α-amylases (Spezyme® AA20 and 0.88 MH of M197L (A4 type)_TwoO_TwoInactive at pH 5.0, 25 ° C Shows sexualization. FIG. 7b shows the specific α-amylase (Spezyme® AA20, M1 97T), 0.88 MH_TwoO_TwoShows inactivation at pH 10.0 and 25 ° C. ing. FIG. 7c shows a specific α-amylase (Spezyme® AA20, M1 5L), 0.88 MH_TwoO_TwoAt pH 5.0, 25 ° C. . FIG. 8 is a schematic diagram of the production of the M197X cassette mutant. FIG. 9 shows expression of M197X derivatives. FIG. 10 shows the M197X derivative, pH 5.0, 5 mM CaCl2._Two5 at 95 ° C Thermal stability in minutes of processing. 11a and 11b show the inactivation of certain enzymes in automatic dishwashing detergents. Is shown. FIG. 11 a shows a specific amylase cascade® (commercially available). Stability at 65 ° C in the presence or absence of starch in dishwashing products). You. FIG. 11b shows a specific amylase, Sunlight® (a commercial dishwasher). Stability at 65 ° C. in the presence or absence of starch. FIG. 12 shows a schematic diagram of the production of the M15X cassette mutant. FIG. 13 shows expression of M15X derivatives. FIG. 14 shows the specific activity of M15X on soluble starch. FIG. 15 shows the M15X derivative at 90 ° C., pH 5.0, 5 mM CaCl 2._Two5 minutes Thermal stability in the interim processing. FIG. licheniformis wild-type percent activity and Specific activity of M15 derivatives against starch and water-soluble substrates, and p It shows the effect of jet liquefaction at H5.5. FIG. 17 shows that derivatives M197A (1.7 mg / ml) and M197L (1.7 mg / ml) in the presence of chloramine-T at pH 8.0. lich Inactivation of eniformis α-amylase (AA20, 0.65 mg / ml) Shows FIG. 18 shows derivatives M197A (4.3 mg / ml) and M197L (0.5 mg / ml). 3 mg / ml) in the presence of chloramine-T at pH 4.0. lic Inactivation of heniformis α-amylase (AA20, 0.22 mg / ml) Indicates sexualization. FIG. 19 shows the dual derivatives M197T / W138F (0.64 mg / ml) and Chloramine-T presence compared to M197T / W138Y (0.60 mg / ml) In the presence of B.I. licheniformis α-amylase (AA2 0, 0.75 mg / ml). FIG. 20 shows various α-amillas incorporated in an automatic dishwashing detergent (ADD) formulation. The results of stability studies of multiple mutants at elevated temperatures from room temperature to 65 ° C. Show. FIG. 21 shows automatic dishwashing of specific amylase variants (compared to wild type). Determined as the percent activity remaining in the formulation over the period of 0-30 days It shows a defined stability. FIG. 22 shows automatic dishwashing of specific amylase variants (compared to wild type). Stable at 0 ° C (100 ° F), 80% relative humidity for 0-30 days in the formulation Shows sex.Detailed description of the invention Amylase used for starch liquefaction is present in the starch slurry Believe that some activity would inevitably result in some inactive forms (Commonly owned U.S. origin, incorporated herein by reference) Nos. 07 / 785,624 and 07 / 785,623 and US Pat. 80669, issued January 19, 1993). Furthermore, for example, drift The use of amylase in the presence of oxidizing agents such as whitening agent- or peracid-containing detergents is This can result in partial or complete inactivation of the milases. Therefore, Akira focuses on modifying the oxidation sensitivity of amylase. Mutations of the invention Enzymes may also be modified by increased oxidative stability at low or high pH. Modified pH properties and / or modified thermal stability. As used herein, α-amylase includes naturally occurring amylase and recombinant amylase. Including lase. A preferred amylase of the present invention is a B-amylase as disclosed herein. . , including an A4-type α-amylase derived from B. licheniformis. l icheniformis or B.i. stearothermophilus or Α-amylase derived from Aspergillus (eg, A. oryz) a e and A. niger et al.) and other fungal α-amylases. Recombinant α-amylase is a DNA sequence encoding a natural α-amylase, Replacement, insertion or deletion of one or more amino acids in the α-amylase sequence Α-amylase that has been modified to produce a mutated DNA sequence Point. Suitable modifications are described here and are commonly owned rice Nos. 4,476,0025 and 5,185,258, which are incorporated herein by reference. Their disclosure is incorporated by reference. Almost any sequence of plants, mammals and bacteria ever sequenced Homology has been discovered between endoamylases (Nakajima, R .; T. et al. (1986) Appl. Microbiol. Biotech nol. 23: 355-360; Rogers, J.M. C. (1985) Bioc hem. Biophys. Res. Commun. 128: 470-476). One particular basyl amylase has four particularly homologous regions shown in FIG. And the underlined sections indicate regions of high homology. further Used sequence alignments to map the relationship between Bacillus endoamylases (Feng, DF and Doolittle, RF (1987) J . Molec. Evol. 35: 351-360). B. stearother mophilus and B.M. licheniformis amylase Sequence homology is described in Holm, L .; et al. (1990) Protein Engineering 3 (3) pp. About 181-191 66%. B. licheniformis and B. amylolique sequence homology with S. facilens amylase is described in Holm, L .; et a l. As mentioned above, it was about 81%. Sequence homology is also important, but It is important to note that structural homology is important in comparison with zeolites or other enzymes. It is generally recognized. For example, fungal amylase and bacterial (Bacillus) amylase Have been proposed and, therefore, the fungal amylase of the present invention include. One α-amylase is derived from the amino acid sequence of the precursor α-amylase Having an amino acid sequence of Its precursor α-amylase is produced naturally Includes α-amylase and recombinant α-amylase (as defined). α Amira The amino acid sequence of the protease variant may include one or more of the precursor amino acid sequences. Amino acid substitution of the precursor α-amylase by amino acid substitution, deletion or insertion Derived from the column. Such modifications can be made by the precursor α-amylase enzyme itself. Encodes the amino acid sequence of the precursor α-amylase, rather than Modification of the precursor DNA sequence. Suitable modification methods are described here. And commonly owned U.S. Patent No. 4760025 and No. 5,185,258. Position M19 of Bacillus licheniformis α-amylase 7, certain residues corresponding to M15 and W138 have, due to substitution or deletion, All methionine, histidine, tryptophan, cysteine and tyrosine positions As identified here. Amino acid position numbers (eg, +197) are shown in FIG. Mature Bacillus licheniformis α-amylase sequence Points to the number assigned to the column. However, the present invention α-amylase (B. licheniformis) No, B. licheniformis, specifically identified in mature α-amylase Also extends to the precursor α-amylase containing the amino acid residue at the position corresponding to the residue. Is stretched. One residue (amino acid) of a precursor α-amylase is However, B. licheniformis α-amylase Homology (e.g., position matches in either primary or tertiary structure) Or similar) (e.g., the same or similar functional, binding, Or have the ability to interact chemically or structurally). licheni formis α-amylase. To achieve homology to the primary structure, the precursor α-amylase The amino acid sequence can be directly licheniformis α-amylase primary sequence It is known that the sequence, especially the sequence, does not change with all known α-amylases. A series of amino acid residues were compared as shown in FIG. Equivalent by tertiary structure It is also possible to determine the residues: porcine pancreatic α-amylase ( Buisson, G .; et al. (1987) EMBO J .; 6: 3909 -3916); Aspergillus oryzae-derived Taka-amylase A ( Matsuura, Y .; et al. (1984) J. Amer. Biochem. (To kyo) 95: 697-702); Niger-derived acid α-amylase (Boel, E. et al. (1990) Biochemistry 29: 6244-6249), and the former two structures are similar. B There is no published structure for A. acillus α-amylase, but (MacGregor, EA). & Svensson, B .; (1989) Biochem. J. 259: 14 5-152) and B.I. Stearothermophilus enzyme is hawk It has been modeled based on that of amylase A (Holm, L et al. . (1990) Protein Engineering 3: 181-191. ). The four highly conserved regions shown in FIG. 3 are considered to be part of the active site. (Matsuura, Y. et al. (1984) J. Bioche. m. (Tokyo) 95: 697-702); Buisson, G .; et al . (1987) EMBO J .; 6: 3909-3916; Vihinen, M .; et al. (1990) J. Am. Biochem. 107: 267-272), l His105 in the number of geniformis; Arg229; As p231; His235; many residues including Glu261 and Asp328. Contains. An expression vector as used herein affects the expression of DNA in a suitable host. Having a DNA sequence operably linked to a suitable control sequence capable of Refers to a DNA construct. Such control sequences include promoters that affect transcription, Additional operator sequences that can further control such transcription, appropriate mRNAs Controls sequences encoding the ribosome binding site and termination of transcription and translation Control sequences may be included. Preferred promoters are subtilis aprE promoter. Vectors can be plasmids, phage particles, or May be a potential genomic insert. Once transformed into a suitable host And the vector replicates and functions independently of the host genome, or in some cases , Integrated into the genome itself. As used herein, the plasmid Most Is also in the form of a commonly used vector, so the plasmid and vector Often used interchangeably. However, the present invention does not And also include other forms of expression vectors known or known in the art. Is intended. Host strains (or cells) useful in the present invention are generally prokaryotic or eukaryotic. A nuclear host and any transformable microparticle capable of expressing α-amylase therein. Including living things. In particular, the same species as that from which α-amylase is derived, such as a Bacillus strain Or a host strain of the genus is preferred. Preferably, an α-amylase-negative strain (lacking the gene) Bac) in which α-amylase and protease have been deleted illus subtilis BG2473 (ΔamyE, Δapr, Δnp Bacillus strains such as r) are used. Host cells are constructed using recombinant DNA technology The vector is transformed or transferred. Such a transformed host cell Vesicles replicate vectors encoding α-amylase and its derivatives (mutants) Or express the desired α-amylase. Noh. Preferably, the variants of the invention are secreted into the culture medium during fermentation. For example Any suitable signal sequence, such as an aprE signal peptide, can be used to achieve secretion. May be used for Many of the α-amylase variants of the present invention can be used in a variety of detergent compositions, especially in certain dishwashing. Cleaning compositions, particularly useful in formulating cleaning compositions containing known oxidizing agents. . The α-amylase variant of the present invention may be a known powdered, liquid, or gel-form. It can be incorporated into detergents having a pH from 5 to 12.0. Suitable granular The composition is a commonly owned rice, incorporated herein by reference. National Patent Application Nos. 07 / 429,882, 07 / 533,721, 07/957 No. 973. These detergent cleaning compositions, for example, Other known proteases, lipases, cellulases, endoglycosidases and other Enzymes or other amylases, as well as builders, stabilizers, or other Excipients may be included. These enzymes are co-granulated or blended Or may be present in other ways known to those skilled in the art. In addition, multiple variables Different It has been observed by the present invention that the body is useful in cleaning or other uses . For example, a mutant enzyme that has changes at both +15 and +197 can be used in cleaning products. Or a change at +197 and +138. Having multiple variants may have improved action. For cleaning products and dishwashing formulations Particularly preferred enzymes for use include M15T / M197T; M15S / M19. 7T; W138Y / M197T; M15S / W138Y / M197T; and M 15T / W138Y / M197T, but is not limited thereto. Another aspect of the present invention relates to the variant α-amylases described herein and other enzymes. (Ie, proteases, lipases, cellulases, etc.), and preferably oxidative stability It consists of a combination with a protease. Suitable oxidatively stable protease Include, for example, US Re 34606, incorporated herein by reference. The engineered proteases described, as well as DURAZYM (Nov o Nordisk), MAXAPEN (Gist-brocades) and PURAFECT OXP (Genencor International) Inc. ) And other commercially available enzymes. Such protease variants (ammonium oxide Suitable methods for producing qualitative proteases) and, in particular, B. amyloli A variant having a methionine substitution corresponding to position M222 in P. quefaiens. Variants are described in US Re 34606. Among other subtilisins, Suitable methods for determining the "equivalent" position are incorporated herein by reference. Re 34606, EP 257446 and USSN 212291 Are listed. As mentioned above, the α-amylase variant of the present invention also provides for starch liquefaction. Useful. Starch liquefaction, particularly liquefaction of granular starch slurries, is typically medium It is carried out at a pH near the pH and at a high temperature. Commonly Owned US Application No. 07 No. 7,788,624, 07 / 788,623 and US Pat. No. 5,180,669. Several oxidizers or deactivators are used in typical liquefiers, as described in Appear to be able to affect enzymatic activity; In related patent applications, antioxidants have been added to protect the enzymes. Commonly owned U.S. application Ser. Nos. 07 / 788,624, 07 / 788,623. Liquefaction process as described in US Pat. No. 5,180,669 and US Pat. No. 5,180,669. Under the conditions of low pH, high temperature and potential oxidation conditions. Preferred variants of the present invention are those that have altered pH-acting properties (ie, low pH properties). PH <6 and preferably pH <5.5), and / or modified heat Stability (ie high temperature, about 90-110 ° C.) and / or modified oxidative stability (Ie, enhanced oxidative stability). Thus, the present invention teaches an improved starch liquefaction method, The method comprises the steps of bringing the granular starch slurry from the wet or dry mill process to a pH of about 4 to 6. Then, an appropriate amount of the α-amylase variant of the present invention is added to the starch slurry to liquefy. And, optionally, add an appropriate amount of an antioxidant or other excipient to the slurry. And reacting the slurry for a suitable time and temperature to liquefy the starch. To consist of The following are provided as examples and have been constructed as a limitation of the scope of the claims. Not. Abbreviations used herein, especially tables of three or one letter amino acids See, Dale, J. et al. W. , Molecular Genetics of B acteria, John Wiley & Sons, (1989) Appe ndix B.Example Example 1 B. replacement of methionine residues in L. licheniformis α-amylase e α-amylase gene (Fig. 1) of Industrial Bacteria, Aberdeen, Scot B. obtained from B.land. licheniformis NCIB8061 Cloned (Gray, G. et al. (1986) J. Bacter ology 166: 635-643). Last 3 residues of signal sequence, complete Encoding the terminator region of the mature protein and signal sequence The 72 kbstI-SstI fragment was subcloned into M13MP18. Combination Insert the terminator between the BclI and SstI sites, with the following types: B. amyloliquefaciens subtilisin transcription terminator Was added using a synthetic oligonucleotide cassette designed to contain ells et al. (1983) Nucleic Acid Research ch 11: 7911-7925). Site-directed mutagenesis using oligonucleotides is inevitable in Zoller, M .; et al. (1983) Meth. Enzymol. 100: 468-500 Briefly, the desired mutation was introduced into the M13-stranded DNA template. Oligonucleotide primers that have been 5'-phosphorylated for incorporation into rates Using the oligonucleotides listed in Table I with B.I. licheni each of the seven methionines found in the formis α-amylase Used to replace. Each mutant oligonucleotide also has a restriction endonuclease. Aasesite was introduced for use as a screen for ligated mutations. The heteroduplex is designated E. coli. coli mutL cells (Kramer et al. (1984) Cell 38: 879) and used for plaque purification. The clone was subsequently analyzed by RF1's restriction enzyme analysis. Positive ones Deoxy sequencing (Sanger et al. (1977) Proc. Nat). l. Acad. Sci. U. S. A. 74: 5463-5467), Each PstI-SstI fragment was replaced with E. coli. coli vector, plasmid pA4BL Subcloned intoPlasmid pA4BL U.S. application Ser. No. 860,468 (Pow, incorporated herein by reference). er et al. ) According to the method described in The aprE gene from pS168-1 (Stahl, ML and Ferr ari, E .; (1984) J. Amer. Bacter. 158: 411-418) +1 (the first amino acid following the signal degradation site). aprE pro The motor and signal peptide regions were subsequently transferred to the pJH101 plasmid (Fe rrari, F.R. A. et al. (1983) J. Amer. Bacter. 154: 1 513-1515) as a HindIII-PstI fragment, pUC18-derived plasmid JM102 (Ferrari, E. and Hoc) h. A. (1989) Bacillus, ed. C. R. Harwood, Plenum Pub. Pp. 57-72). B. attachment of a PstI-SstI fragment derived from L. licheniformis α-amylase In addition, the resulting aprE signal peptide-Amira shown in FIG. PA4BL (FIG. 5) having a ribose bond is provided.B. Transformation into subtilis pA4BL is E. coli. E. coli and can be replicated. in the subtilis chromosome It is a plasmid that can be integrated. Plastic containing different derivatives Sumid is B.I. subtilis (Anagnostpoulo) s, C.I. And Spizizen, J. et al. (1961) J.I. Bacter. 81: 741-746), a Campbell-type mechanism (Young, M. (198) 4) J.I. Gen. Microbiol. 130: 1613-1621), It integrated into the chromosome at the aprE locus. Bacillus subtil The isBG2473 strain contains amylase (ΔamyE) and two proteases. I168 (Stahl, M.L.an) which has been deleted for (.DELTA.apr, .DELTA.npr). d Ferrari, E .; (1984) J. Amer. Bacter. 158: 411-4 18 and US Pat. No. 5,264,366, which are incorporated herein by reference.) Is a derivative of After transformation, sacU32 (Hy) (Henner, DJ). . et al. J. Bacter. 170: 296-300) Mutation with PBS-1 Introduced by mediated transduction (Hoch, JA (1983) 154: 15). 13-1515). pA4BL to B.I. N-terminal solution of amylase expressed in subtilis Analysis revealed that four extra alanines were secreted into the secreted amylase protein. At the N-terminus (type A4). These extra Residues have significant and detrimental effects on A4 amylase activity and thermostability And may promote action in some applications. For subsequent experiments A correctly processed form of licheniformis amylase And mutant M197T were made from a very similar construct (see FIG. 6). Special Next, the 5 'end of the A4 construct was placed on the EcoRI-SstII fragment, pA4BL (Fig. From 5) to M13BM20 (Boehringer Mannheim), Subcloning to get template for mutant oligonucleotides below Was: This primer removes the extra four N-terminal alanines and the corrected version is PstI Searched for lack of site. The EcoRI-SstII fragment was converted to a pA4BL vector. (FIG. 5) and subcloned to obtain a plasmid pBLapr. Continued The replacement of M197T was performed on the SstII-SstI fragment with pA4BL (M197 T) can be transferred into the complementary pBLapr vector and the plasmid p BLapr (M197T) is provided. B. pBLapr in subtilis N-terminal analysis of the amylase expressed from lichenifo Processed at the same N-terminus as found in rmis α-amylase It has been found. Example 2 Oxidation stability of methionine mutants For example, Spezyme (registered trademark) AA20 (Genencor Inter national Inc. B.). lichenifo rmis α-amylase is rapidly inactivated by the presence of hydrogen peroxide (Fig. 7). Various methionine variants have been identified in B.A. Subtilis shake flask culture And expressed in the crude supernatant purified in ammonium sulfate form. Amylase 2 Raise ammonium sulfate to 70% saturation from 0% saturated ammonium sulfate supernatant Precipitated and resuspended. The derivative is subsequently 0.88 at pH 5.0 M Hydrogen peroxide at 25 ° C. B. licheniformis α-ami Mutants at the six methionine positions in the lase are further subject to oxidation by hydrogen peroxide. However, the replacement at position +197 (M197L) is resistant to peroxide oxidation. It showed resistance (see FIG. 7). However, described in more detail below In a subsequent analysis performed, the derivative was susceptible to oxidation at pH 5.0 and 25 ° C. Susceptible but modified / improved in different conditions (ie liquefaction) Can exhibit properties. Example3 Construction of all possible derivatives at position 197 All M197 derivatives (M197X) are of type A4 and are shown in FIG. Produced as outlined: 1) Site-specific mutation (due to primer extension in M13) The following mutant oligonucleotides were used to produce M197A: This oligonucleotide also contains an EcoRV site (codons 200-201). The ClaI site (codons 201-202) was replaced and inserted. 2) Primer LAAM12 (Table 2) with another silencing restriction site (BStBI) Used to introduce codons 186-188. 3) The resulting M197A (BstB I +, EcoRV +) mutant And subcloned into plasmid pA4BL (PstI-SstI fragment) The resulting plasmid was digested with BstBI and EcoRV, The fragment containing the vector was isolated by electroelution from an agarose gel. 4) The synthetic primers LAAM14-30 (Table 2) were each Annealed with the target common primer, LAAM13 (Table 2). The result The resulting amino acid encoding all remaining natural amino acids at position +197 The sets were individually ligated to the vector fragments prepared as described above. Cassettes are designed to destroy EcoRV sites in ligation Thus, E. E. coli transformants were deleted for deletion of this unique site. I searched. In addition to this, the common bottom chain of the cassette includes a frameshift and N Transformants encoding the siI site and thus derived from this chain are the only transformants It can be eliminated by searching for the presence of the NsiI site, and in any case, It is not expected to lead to the expression of sexual amylase. Those that were positive by restriction analysis were confirmed by sequencing, and cultured in shake flasks. B. for expression in the ground. subtilis was transformed (FIG. 9). Continued Thus, the specific activity of one M197X mutant was determined by a water-soluble substrate assay. Less than Table 3 shows data obtained by the above assay method.Water-soluble substrate assay : Megazyme (AUSt.) Pty. Ltd. To Therefore, open a rate assay based on the supplied end-point assay kit. Emitted: Each substrate (p-nitrophenyl maltoheptaoside, BPNPG7) Are dissolved in 10 ml of sterile water, followed by 1 to 4 assay buffers. (50 mM malate buffer, pH 6.7, 5 mM calcium chloride, 0. 002% Tween 20). Add 10 μl amylase to 790 The assay was performed by adding at 25 ° C. to the substrate in a μl cuvette. Addition The rate of water splitting was measured as the rate of change in absorbance at 410 nm after 75 seconds. Was. The assay was linear up to 0.4 absorbance units / minute. Amylase protein concentration is determined by the method of Bradford, M .; (1976) Ana l. Biochem. 72: 248, based on the method of bovine serum albuminstan Standard Bio-Rad Assay with Bio-Rad (Bio-Rad Labor) atories).Starch hydrolysis assay : Α Amira of Spezyme® AA20 The standard method for assaying for protease activity was used. This method is here Reference is made to Example 1 of US patent application Ser. No. 07 / 785,624, which is incorporated by reference. Has been described. Natural starch forms a blue color with iodine, but short dextrin molecules When it is hydrolyzed to The substrate was a phosphate buffer, pH 6. 2 (42.5 gm / l potassium dihydrogen phosphate, 3.16 gm / l sodium hydroxide 5 gm / l of soluble Linner starch. Sample is 25 mM salt Add to calcium iodide and keep the activity at 30 ° C until the iodine test becomes negative It was measured as the time taken. The activity was calculated according to the following formula: Recorded in liquefons per ram or ml (LU) . here, LU = Rikephone unit V = volume of sample (5 ml) t = Dextrinization time (min) D = dilution factor = dilution volume / ml or g of enzyme added. Example 4 Characterization of derivative M15L M15L produced as in the previous example shows increased amylase activity. Without (Table 3), it was still inactivated with hydrogen peroxide (FIG. 7). However, Den In jet liquefaction of pun, especially at low pH as shown in Table 4 below Showed a markedly increased effect. Starch liquefaction typically involves a 2.5 liter delay core behind the mixing chamber. And a hydro-heater M-103-M with a final rear pressure valve. This was performed using an air jet. Starch is Moyno pump And the steam is 90-100 ps by a 150 psi steam line. i. Temperature probe just behind the hydro heater It is installed just before the head pressure valve. Starch slurry was obtained from corn wet mirror and used within 2 days . Dilute the starch to the desired solids level with demineralized water and adjust the pH of the starch to 2% NaO H or saturated Na_TwoCO_ThreeAdjusted by Typical liquefaction conditions are: Starch 32% -35% solids Calcium 40-50ppm (30ppm added) pH 5.0-6.0 α-amylase 12-14 LU / g dry starch base Met. Starch was introduced into the jet at 350 ml / min. Jet temperature is 105 C.-107.degree. C. was maintained. Starch samples were taken from a jet cooker at 95 ° C. It was transferred to a two-stage liquefaction and held for 90 minutes. Immediately after the second stage of liquefaction, the degree of starch liquefaction is Analytical Methods of the Member Com panies of the Corn Refiners Associate ion Inc. , According to the method described in the sixth edition, Determining dextrose equivalent (DE) and testing for the presence of raw starch It was measured by doing. When the starch is treated under the conditions given above and at pH 6.0, generally A liquefied starch of about 10 DE without raw starch was obtained. Using the mutant of the present invention Table 4 shows the results of the starch liquefaction test. Example 5 Construction of M15X derivative All derivations in M15 generally follow the steps described in Example 3 above. The body (M15X) was prepared as described in FIG. lichenifo Produced by cassette mutation in rmis: 1) Site-specific mutation (due to primer extension in M13) Introduce a unique restriction site adjacent to the 15 codons to allow insertion of the mutation cassette Used for In particular, the BstBI site at codons 11-13, and codon 1 The 8-20 Msc1 site was introduced using the oligonucleotides shown below. . 2) Subsequently, the vector for the M15X cassette mutation was replaced with a mutant amylase (Bs tB1 +, Msc1 +) from the plasmid pB Constructed by subcloning into Lapr. The resulting plastic The sumid was subsequently digested with BstB1 and Msc1 and the large vector Fragments were isolated from polyacrylamide gels by electroelution. 3) A mutant cassette was produced for the M197X derivative. Replacement at codon 15 Synthetic oligomers that encode each Let me do it. Proper ligation of the cassette with the vector breaks Msc1. The site was destroyed, and the deletion of this site made it possible to search for positive transformants. Bottom plastic The immer has a unique SnaB1 site and transforms derived from the bottom chain with Sn It was made possible to eliminate by searching the aB1 site. This primer also Contains a frameshift that eliminates amylase expression in mutants derived from the common bottom chain doing. Synthetic cassettes are listed in Table 5 and generally the cassette mutation strategy is described in FIG. ing. Example 6 Bench liquefaction with M15X The activity was measured on 11 M15 substituted derivatives produced as in Example 5. , In liquefaction using a bench liquefaction system at pH 5.5, Spezyme (registered) Trademark) AA20 (Genencor International, Inc. (Commercially available). Bench-scale liquefaction system measures approximately 12 inches from front edge Stainless steel coil with a 7 inch long static mixing element at a distance of 0.25 inch diameter, about 350 ml volume) and 30 psi rear pressure bar at rear end Consisting of lubes. Coils are thermostatically controlled buses, except at each end Glycerol-water with heating element that had been kept at 105-106 ° C Was immersed in the bus. The starch slurry containing the enzyme is kept in suspension by stirring, and the piston drive It was introduced into the reaction coil at 70 ml / min by a motoring pump. Demp Was recovered from the end of the coil and transferred to the second holding (95 ° C., 90 min). Second Immediately after the retention, the DE of the liquefied starch was measured as described in Example 4. . FIG. 16 shows the results. Example 7 Characterization of M197X derivative As can be seen in FIG. 9, the broad spectrum exhibited by the M197X (type A4) derivative There was a range of amylase activities (measured by water-soluble substrate). Amylase is 2 times It was partially purified from the supernatant by precipitation with an amount of ethanol and resuspension. Heat them For stability, 10 mM acetate buffer pH 5.0, 5 mM calcium chloride Screened by heating at 95 ° C. for 5 minutes in the presence (FIG. 10); 4 Wild type retained 28% of the activity after the incubation. M197W and M197P As for active protein, it was not possible to recover it from the supernatant. Sequencing Showed that M197H contained the second mutation N190K. M197L was tested in a separate experiment but was found to be the least thermostable derivative. There was one. There is a wide link between the expression of amylase activity and thermostability It seemed like licheniformis amylase has any position at position 197. Look for retention or enhancement of thermal stability as to whether amino acids can be accepted. Limited from the ground: cysteine and threonine are subject to these conditions Alanine and isoleucine, while preferred for the highest thermal stability of Was of intermediate stability. However, other substitutions at position +197 Results in reduced thermal stability which may be useful in Was. In addition, different substitutions at +197 have other advantageous properties, such as altered It may have pH action properties or altered oxidative stability. For example, The M197C derivative was found to be easily inactivated by air oxidation Had enhanced thermal stability. Conversely, compared to the M197L derivative, 197T and M197A have high activity (Table 3) as well as high thermal stability (FIG. 10). ), While at pH 5 to pH 10 against peroxide inactivation (Fig. 7). Example 8 Stability and action in detergent formulations Automatic dish washing of M197T (A4 type), M197T and M197A (A4 type) The stability in a detergent (ADD) matrix was measured. 2ppm Savinase ® (protease, commercially available from Novo Industries) And commonly used in ADD), two commercial bleach-containing ADDs Is Cascade® (Procter and Gamble) , Ltd.) and Sunlight® (Uniliver). , Amylase derivatives and Termamyl® (Novo Nord) inactivation of thermostable α-amylase available from isk, A / S at 65 ° C. Followed the time course. The concentration of the ADD product used in both cases The degree corresponds to the "pre-soak" condition: 14 g per liter of water m (7 grams hardness per gallon). As can be seen (FIGS. 11a and 11b) , Both types of M197T derivatives were inactivated before the first assay was performed. Significantly compared to Termamyl® and M197A (type A4) It was stable. The advantage of this stability is as determined by following the procedure below. Found in the presence or absence of starch. Amylase in advance in vitro Add to 5 ml of warmed ADD and Savinase®, After texing, activity was measured as a function of time using a soluble substrate assay . The “+ starch” tube was baked on the side (140 ° C., 60 minutes) spaghetti den Step Had. The results are shown in FIGS. 11a and 11b. Example 9 Characterization of M15X derivatives All M15X were increased in Bacillus subtilis and The current level was monitored as shown in FIG. Amylase is separated and 20-7 It was partially purified by the 0% ammonium sulfate method. For water-soluble substrates of these derivatives The specific activity was measured in the same manner as in Example 3 (FIG. 14). M15X amylase Many have specific activities greater than that of Spezyme® AA20 Was. Benchtop thermostability assay was performed with 9 amylase. 5 mM calcium chloride in 50 mM acetate buffer, pH 5.0, at 0 ° C. for 5 minutes Performed by heating in the presence (FIG. 15). Most of the derivatives are In A, it acted similarly to Spezyme (registered trademark) AA20. This asse Derivatives that have shown a reasonable stability in (a) (defined as having 60% of the thermal stability of zyme® AA20) , Starch, and liquefaction at pH 5.5. these Among the mutants, the most interesting one is shown in FIG. M15D, N and T, In addition, L.P. Outperforms both water soluble substrates and starch hydrolytic activity assays. And had increased specific activity. In general, by replacing the methionine at position 15, increased low pH liquefaction It has been found that derivatives which have an effect and / or an increased specific activity can be provided. Was seen. Example 10 Oxidation sensitivity of tryptophan Chloramine T (sodium N-chloro-p-toluenesulfonimide) is selected It is an alternative oxidizing agent that converts methionine to methionine sulfone at neutral or alkaline pH. Oxidizes to foxide. At acidic pH, chloramine T is methionine and Modifies both liptophans (Schechter, Y., Burstein) , Y. and Patchhornik, A (1975) Biochemistr y 14 (20) 4497-4503). FIG. licheniform 2 shows the inactivation of is α-amylase with chloramine T at pH 8.0 (A A20 = 0.65 mg / ml, M197A = 1.7 mg / ml, M197L = 1 . 7 mg / ml). This data indicates that methionine at position 197 is replaced with leucine or amino acid. Shows that changing to Lanine can prevent inactivation of α-amylase doing. Conversely, as shown in FIG. 18, at pH 4.0, M197 A and the inactivation of M197L proceed, but more chloramine T equivalents Required (FIG. 18; AA20 = 0.22 mg / ml, M197A = 4.3 mg) / Ml, M197L = 0.53 mg / ml; 200 mM sodium acetate, pH 4 . 0). This indicates that tryptophan residues also contribute to chloramine T-mediated inactivation events. Suggest that they are involved. In addition, tryptics ic) By mapping and subsequent amino acid sequencing, it is at position 138. It was suggested that tryptophan was oxidized by chloramine T (data shown Not). To prove this, a site-specific mutation was added to tryptophan 138 as follows: Was introduced as shown.Preparation of α-Amylase Double Mutants W138 and M197 Certain derivatives W138 (F, Y and A) are identified as double mutants that are M197T. (Prepared in the same manner as described in Example 3). The double mutant was prepared in Example 1 and And 3. Generally, a single negative strand of DNA is l sequence of P. ichieniformis α-amylase M197T mutant (PstI- SstI) was prepared from a 1.72 kb M13MP18 clone encoding Was. The site-specific mutation was determined using the primers listed below, Essentially, except that protein and T4 polymerase were substituted for Klenow Zoller, M .; et al. (1983). All of Primers provide a unique site for identifying clones with the appropriate mutation, As well as the desired mutation. Tryptophan 138 to phenylalanine Tryptophan 138 to tyrosine Tryptophan 138 to alanine-this primer is also located at position 138 Operates the only site downstream and downstream. Mutants were identified by restriction analysis and W138F and W138Y were used for DNA sequencing. More confirmed. The W138A sequence is between the unique BspI and XmaI sites. Found that there was a nucleotide deletion, but the remaining genes were correctly sequenced Was done. 1.37 kb Sst with both W138X and M197T mutations Transfer the II-SstI fragment from M13MP18 into the expression vector pBLapr PBLapr (W138F, M197T) and pBLapr (W138 Y, M197T) as a result. The only BspE I and XmaI size The fragment containing the fragment was cloned into pBLapr (BspEI, Xmal, M197T). Was cloned, but it contained a clone containing another amino acid substitution at position 138. This is because it is useful for a printing cassette.Single mutation at amino acid position 138 According to the method generally described in the previous example, the specific W138 (F, Y, L , H and C) Single derivatives were generated. The plasmid pBLapr (W 138X, M197T), Asp718-Sst carrying the M197T mutation The I fragment was replaced with a wild type fragment having methionine at 197, and pBLapr ( W138F), pBLapr (W138Y) and pBLapr (BspE I , Xmal). Mutants W138L, W138H, and W138C use the synthetic cassette pBLa ligated using the following primers in the pr (BspE I, XmaI) vector: It was prepared by adding Tryptophan 138 to leucine Tryptophan 138 to histidine Tryptophan 138 to cysteine Double mutants M197T / W138F and M197T / W138Y and chlorami T response was compared to wild type (AA20 = 0.75 ml, M197T / W1 38F = 0.64 mg / ml, M197T / W138Y = 0.60 mg / ml; 50 mM sodium acetate, pH 5.0). The results shown in FIG. Mutation of phan 138 causes the mutant to be more resistant to chloramine T. It shows that it was awake. Example 11 Preparation of multiple mutants According to the methods of Examples 1, 3, 5 and 10, the following multiple mutants were made: M 15T / M197T; M15S / M197T; W138Y / M197T; M15 S / W138Y / M197T and M15T / W138Y / M197T. these Some of the multiple mutants described in, for example, W138Y / M197T are described in Example 10. It was previously experimented as was created and tested. Multiple variants identified by restriction analysis did. The various multiple mutants included in the scope of the present invention can be further purified by washing products (automatic dishwashing). The effect as an additive (machine detergent) additive was tested. These tests are detailed below. You.Stability test 4000 ppm of automatic dishwashing detergent (ADD) containing perboric acid and TAED Was prepared in water having a hardness of 7 gpg. The above specific amylase mutant, This ADD was added to the Ceralpha method (Megazyme (Austr.) Pty). . Ltd. , Parramatta, NSW, Australia) It was added to obtain a ratio of 0.4 in sodium chloride. One set of samples was placed at room temperature (21-23). C) for about 30 minutes (not heated). Transfer the second set from room temperature to about 65 ° C Warmed (heated) after addition of the element. 30 minutes after enzyme addition, the activity of the amylase variant It was measured and the relative activity to the activity at the time of addition of the enzyme was calculated (relative activity%). This result, shown in FIG. licheniformis alpha amirror The methionine at position +197 of the enzyme has a structure with ADD + perboric acid + TAED. It suggests that it should be modified for stability in the compound.Starch hydrolysis assay 4000 ppm of automatic dishwashing detergent (ADD) containing perboric acid and TAED Was prepared in water of 7 gpg hardness and cooked bent macaroni (elbow). macaroni) were added. The above amylase variant is Was added to the ADD solution of (5) so that the final concentration was 5 ppm active enzyme. 50 tubes C. for about 30 minutes and the concentration of dissociated reducing sugars was determined using the dinitrosalicylic acid method , Measured against a glucose standard curve. Table 6 shows the results. The results shown in Table 6 are for M15T / M197T; M15S / M197T; W1 38Y / M197T; M15S / W138Y / M197T and M15T / W1 38Y / M197T was free of enzyme and compared to wild-type α-amylase control It worked well.Oatmeal stain Cook the dishes evenly with the mixed oatmeal paste and overnight at 37 ° C. Let dry. Place the dishes in an ASKO model 770 dishwasher and wash quickly at 45 ° C. 5% perboric acid, 3% TAED and 11 mg of specific amylase enzyme Washed using 10 g of automatic dishwashing detergent. Before soiling the plate, soiling Weight after washing and after washing, the average% of soil removed from all plates Was calculated. The data is shown in Table 7 below. The data show that mutant enzymes offer greater benefits than those provided by wild-type enzymes. It is shown to provide. For oatmeal removal, wild-type enzyme is free of enzyme Provided 20% more profit than ADD. Example 12 Dishwashing composition 1% (w / w) particles of wild-type and mutant amylase were added to 5% (w / w) Korex Auto with sodium monohydrogen oxalate and 3% (w / w) TAED Formulated with dishwasher detergent. Samples of these formulations were run at room temperature (21-23). C), or 80% relative humidity and 38 C for 4 weeks. FIG. 21 shows the results. And 22. This result indicates that the activity of wild-type amylase was measured by the Ceralpha method. Shows that the properties decrease with increasing storage time in the detergent. room temperature The mutant enzyme was completely stable. At 38 ° C and 80% relative humidity Showed that all mutant enzymes were more stable than wild type. The advantages of incorporating these mutant amylases into automatic dishwashing detergents are: Mutant is significantly more stable than wild type in the presence of perboric acid and TAED. And they have a significant effect in the cleaning of starch food stains during washing. To provide benefits. Example 13 Study on stability of oxidatively stable protease / oxidatively stable amylase 1) wild-type protease and wild-type amylase; or 2) US Re34 Bleach stable protease (GG3) produced by the method described in US Pat. 6-M222S) and bleach-stable amylase (AA20-M15T-W13) Enzyme particles containing any of 8Y-M197T were added to 0.1 M sodium borate pH 1 Each enzyme 1 in a buffer containing 0.2 and 0.005% Tween 80 Dissolved at a concentration of 2.5 mg. To 9 ml of these solutions, add 1 ml of water or 1 ml of 30% hydrogen peroxide was added. After keeping the solution at 25 ° C for 30 minutes, Thease and amylase activities were measured and expressed as% of the original activity. data Is shown in Table 8 below. Data show bleach stability with mutations in amino acid residues that are both susceptible to oxidation. The combination of the qualitative amylase variant and the bleach-stable protease variant Proteases and Amylases in Formulations Resistant to Agent Inactivation Ze brought the combined benefits. Bleach stability amylase and bleach stability The combination of proteases has almost no initial activity in bleach even after 30 minutes. However, the combination of wild-type enzymes had an initial activity of 80% at the same time period. Had lost more than%.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:10） (72)発明者ミッチンソン，コリンアメリカ合衆国カリフォルニア州 94080 サウスサンフランシスコキンボールウェイ 180 ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド内 (72)発明者パワー，スコットディーアメリカ合衆国カリフォルニア州 94080 サウスサンフランシスコキンボールウェイ 180 ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド内──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI // (C12N 9/28 C12R 1:10) (72) Inventor Mitchinson, Colin United States of America 94080 South San Francisco Kimball Way 180 Genencor Within the International Inc. (72) Inventor Power, Scott Dee United States California 94080 South San Francisco Kimball Way 180 Within Genencor International Inc.

Claims

【特許請求の範囲】１．漂白剤含有組成物にαアミラーゼをコードする変異ＤＮＡ配列の発現産物である変異体αアミラーゼを添加されており、前記変異ＤＮＡ配列が、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのαアミラーゼ中のＭ＋１９７に相当する位置でのメチオニンの置換およびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのαアミラーゼ中のＭ＋１５またはＷ＋１３８に相当する位置でのメチオニンまたはトリプトファンの１またはそれ以上の置換により、プレカーサーαアミラーゼから派生されたものであるという改良点を有することを特徴とする改良漂白剤含有洗浄組成物。２．前記洗浄組成物が皿洗い用洗浄組成物であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の改良洗浄組成物。３．前記変異αアミラーゼが、Ｍ１５Ｔ／Ｍ１９７Ｔ；Ｍ１５Ｓ／Ｍ１９７Ｔ；Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７Ｔ；Ｍ１５Ｓ／Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７ＴおよびＭ１５Ｔ／Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７Ｔから成る群より選択されたことを特徴とする請求の範囲第１項記載の改良洗浄組成物。４．プロテアーゼをコードしている変異ＤＮＡ配列の発現産物である変異プロテアーゼをさらに含み、前記変異ＤＮＡ配列がＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのプロテアーゼ中のＭ＋２２２に相当する位置でのメチオニンの置換によりプレカーサープロテアーゼから派生されたものであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の改良洗浄組成物。５．前記変異プロテアーゼが、アラニン、システインおよびセリンから成るアミノ酸の群より選択された置換を含むことを特徴とする請求の範囲第４項記載の改良洗浄組成物。６．Ｍ１５Ｔ／Ｍ１９７Ｔ；Ｍ１５Ｓ／Ｍ１９７Ｔ；Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７Ｔ；Ｍ１５Ｓ／Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７ＴおよびＭ１５Ｔ／Ｗ１３８Ｙ／Ｍ１９７Ｔから成る群より選択されたαアミラーゼ変異体、および、Ｍ２２２Ｃ、Ｍ２２２ＳおよびＭ２２２Ａから成る群より選択されたプロテアーゼ変異体を含有することを特徴とする改良洗浄組成物。７．粒状組成物であることを特徴とする請求の範囲第６項記載の改良洗浄組成物。[Claims] 1. The expression product of a mutant DNA sequence encoding α-amylase in a bleach-containing composition A mutant α-amylase has been added, and the mutant DNA sequence lic methionine at a position corresponding to M + 197 in H.formis α-amylase Substitution of nin and B. M + 15 in C. licheniformis α-amylase Or one of methionine or tryptophan at the position corresponding to W + 138 Is derived from the precursor α-amylase by further substitution A cleaning composition containing an improved bleaching agent, characterized in that the cleaning composition has an improved point. 2. The cleaning composition according to claim 12, wherein the cleaning composition is a dishwashing cleaning composition. An improved cleaning composition according to claim 1. 3. The mutant α-amylase is M15T / M197T; M15S / M197T; W138Y / M197T; M15S / W138Y / M197T and M15T / Claims are selected from the group consisting of W138Y / M197T. An improved cleaning composition according to claim 1. 4. A mutant protein which is the expression product of a mutant DNA sequence encoding a protease. And the mutated DNA sequence is Bacillus amyloli. meththiones at a position corresponding to M + 222 in the protease It is derived from the precursor protease by substitution of nin. An improved cleaning composition according to claim 1 characterized by the following. 5. The mutant protease is an amino acid comprising alanine, cysteine and serine. 5. The modification according to claim 4, wherein the modification comprises a substitution selected from the group of carboxylic acids. Good cleaning composition. 6. M15T / M197T; M15S / M197T; W138Y / M197T; M15S / W138Y / M197T and M15T / W138Y / M197T Α-amylase variants selected from the group consisting of: M222C, M222S And a protease variant selected from the group consisting of M222A An improved cleaning composition, characterized in that: 7. 7. The improved cleaning composition according to claim 6, wherein the composition is a granular composition. .