JPH10503187A - Corticotropin releasing factor-binding protein inhibitors and uses thereof - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 脳内の遊離コルチコトロピン放出因子（CRF）のレベルは、CRF/CRF結合タンパク質複合体のリガンドインヒビターの患者への投与により上昇する。リガンドインヒビターは、CRF結合タンパク質に結合し、CRFの放出を引き起こす。リガンドインヒビターはCRFまたは関連タンパク質由来のペプチド、あるいは非ペプチドであり得る。リガンドインヒビターの投与は学習および記憶の改善を提供し得、食物摂取の減少を生じ、あるいは脳内の低レベルのCRFに関連する病気、特にアルツハイマー病の処置を提供し得る。哺乳動物へのインビボ投与に特に有効なCRFアンタゴニストを選択するための化合物のスクリーニング方法もまた提供される。   (57) [Summary] The level of free corticotropin releasing factor (CRF) in the brain is increased by administration of a ligand inhibitor of the CRF / CRF binding protein complex to a patient. The ligand inhibitor binds to the CRF binding protein and causes the release of CRF. The ligand inhibitor can be a peptide from CRF or a related protein, or a non-peptide. Administration of a ligand inhibitor may provide improved learning and memory, may result in reduced food intake, or may provide treatment for diseases associated with low levels of CRF in the brain, particularly Alzheimer's disease. Also provided are methods of screening compounds to select CRF antagonists that are particularly effective for in vivo administration to mammals.

Description

【発明の詳細な説明】 コルチコトロピン放出因子−結合タンパク質インヒビターおよびその使用 本発明のいくつかの局面は、米国国立衛生研究所により付与された認可番号DK -26741およびHD-13527の下で政府の支援を受けた。政府は、本発明に一定の権利 を有する。the University of Readingおよびthe Medical Research Council of Great Britainが本出願に対して一定の権利を有する。関連出願の引用 本出願は、1994年7月15日に出願された米国特許出願第08/276,240号の一部継 続出願である。技術分野 本発明は、一般に、神経ペプチドの内因性レベルを上昇させる方法に関し、そ して詳細には、脳内のコルチコトロピン放出因子レベルを上昇させる方法に関す る。発明の背景 最近の臨床データは、CRFが神経精神疾患、およびアルツハイマー病のような 神経変性疾患に関連していることを示している。アルツハイマー病は、進行性の 記憶喪失および痴呆をもたらす神経変性脳疾患である。最近の見積りによると、 合衆国において200万人を超える個体がこの病気にかかっている。特に、いくつ かの系列の証拠は、CRFがアルツハイマー病（AD）に関連していることを示して いる。第１に、CRFが劇的に（50％以上）減少し、（Bissetteら、JAMA 254:3067 、1985；DeSouzaら、Brain Research 397:401、1986；Whitehouseら、Neurology 37:905、1987；DeSouza、Hospital Practice 23:59、1988；Nemeroffら、Regul ．Peptides 25:123、1989）、そしてADで影響を受ける大脳皮質領域のCRFレセプ ターが逆に増加する（DeSouzaら、1986；DeSouza、1988）が、CRFもCRFレセプタ ー もいずれも皮質の影響を受けない領域では量は変化しない（DeSouzaら、1986） 。第２に、化学的親和性架橋研究は、ADにおいて大脳皮質で増加したCRFレセプ ター集団は正常な生化学的特性を有することを示す（Grigoriadisら、Neurophar macology 28:761、1989）。さらに、脳脊髄液におけるCRF濃度の低下が観察され ること（Mouradianら、Neural Peptides 8:393、1986；Mayら、Neurology 37:53 5、1987）は、神経精神学的損傷の等級全体に有意な相関関係があり、これは、 より大きな認識損傷が脳脊髄液中のより低いCSF濃度に関連することを示唆する （Pomaraら、Biological Psychiatry 26:500、1989）。 痴呆の処置のために利用可能な治療は非常に限定されている。最近承認された 薬物であるTacrine^TMは、アルツハイマー患者においてかろうじて記憶の改善を 生じるにすぎず、そして肝酵素を上昇させる望ましくない副作用を有する。 脳CRF含量の変化はまた、パーキンソン病および進行性核上麻痺においても見 出されており、これらはADとともに一定の臨床的および病理学的特徴を共有する 神経学的疾患である。パーキンソン病の場合は、CRF含量は減少し、そしてADの 症例に類似の染色パターンを示す（Whitehouseら、1987；DeSouza、1988）。進 行性核上麻痺の場合は、CRFは、前頭葉、側頭葉、および後頭葉においてコント ロール値の約50％に減少する（Whitehouseら、1987；DeSouza、1988）。 いくつかの鬱疾患もまたCRFのレベルの減少と関連する。季節性鬱病の鬱状態 の患者および慢性疲労症候群の患者は、脳脊髄液においてCRFのより低いレベル を示す（Vanderpoolら、J．Clin．Endocrinol．Metab．73:1224、1991）。 場合によって鬱病は高い改善率を有し、そして多くの場合は結果的に自己限定 性であるが、患者の回復速度に主要な差異がある。治療の主要な目標は、徴候の 強度を低減させてこのタイプの鬱病の回復速度を促進すること、ならびに再発お よび回帰を防止することである。代表的には抗鬱剤が投与されるが、重篤な副作 用（例えば、フルオキセチンによる自殺行動、ブプロピオンによる痙攣）が生じ 得る。（Klermanら、Clinical Evaluation of Psychotropic Drugs: Principles and Guidelines、R.F．PrienおよびD.S．Robinson(編)、Raven Press，Ltd．N. Y.、1994、281頁を参照のこと）。 低いCRFレベルにより示されるようなストレス系の機能低下は、他の疾患にお いても同様に役割を果たし得る。例えば、肥満症のいくつかの形態は、機能低下 した視床下部-下垂体-副腎軸によって特徴づけられ（Kopelmanら、Clin．Endocr inol（Oxford）28:15、1988；Berniniら、Horm．Res．31:133、1989）、外傷後 ストレス症候群の患者は低いコルチゾル***を有し（Masonら、J．Neu．Men．Di s．174:145、1986）、そして禁煙中の患者はアドレナリンおよびノルアドレナリ ンの***の減少、ならびに血中のコルチゾル量の減少を有する（Westら、Psycho pharmacology 84:141、1984；Puddyら、Clin．Exp．Pharmacol．Physiol．11:42 3、1984）。CRFが視床下部-下垂体-副腎軸の主要なレギュレーターであるので、 これらの発現は全てこれらの疾患におけるCRFの中心的役割を示す。 これらの疾患の処置はあまり有効性がない。例えば、肥満症を処置するために 最も有効なアプローチは、行動変更プログラムである。しかし、目標体重に到達 する参加者はほとんどなく、そして再発率が高い（Halmiら、Clinical Evaluati on of Psychotropic Drugs: Principles and Guidelines、R.F．PrienおよびD.S . Robinson(編)、Raven Press，Ltd．N.Y.、1994、547頁を参照のこと）。 このような疾患および病気の処置における欠点を考慮すると、より有効な処置 が必要とされる。本発明は、低減したCRFレベルと種々の神経生理学に基づく疾 患および病気との相関関係を利用して、遊離CRFのレベルを上昇させることによ りこのような病気を効果的に処置し、そしてさらに他の関連の有利点を提供する 。発明の要旨 本発明は、有効量のCRF/CRF結合タンパク質（CRF/CRF-BP）複合体のリガンド インヒビターを患者に投与することにより、脳内の遊離CRFレベルを上昇させる 方法を提供する。リガンドインヒビターの投与はCRF結合タンパク質からのCRFの 放出を引き起こす。リガンドインヒビターは、CRFの「放出」を引き起こし得る ものであれば、CRF由来のペプチド、CRFに相同なペプチド、またはCRFに関連の ないペプチドであり得る。リガンドインヒビターはまた、天然または合成化学物 質ライブラリーから単離される非ペプチド化合物であり得る。本発明の１つの実 施態様の範囲内では、リガンドインヒビターはh/rCRF（アミノ酸６〜33）、h/rC RF（アミノ酸９〜33）、およびh/rCRFからなる群より選択されるペプチドである 。 関連する局面の範囲内で、治療組成物が提供され、これはリガンドインヒビター を、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含有する。 本発明の他の局面の範囲内では、学習および記憶を改善する方法、食物摂取を 減少させる方法、CRF神経回路系(neurocircuitry)を活性化する方法、脳内の低 レベルのCRFに関連する病気を処置する方法、アルツハイマー病に関連する徴候 を処置する方法、肥満症を処置する方法、異型鬱病を処置する方法、分娩後鬱病 を処置する方法、加齢性関連の記憶喪失を処置する方法、および物質乱用の禁断 症状を処置する方法が提供される。このような方法の範囲内では、治療有効量の CRF/CRF結合タンパク質のリガンドインヒビターが、これらの症状の処置のため に患者に投与される。治療用の候補物質を選択するための基準、ならび処置の有 効性を評価する方法を示す。 特定の治療目的を達成する目的で、ヒトCRF-BPに対して高い親和性を有する特 定の薬剤が投与され得ることが見出されている。この薬剤は、CRF-BPとの複合体 形成においてヒトCRFと効果的に競合し、そしてこのようにして、内因性hCRFの 哺乳動物での有効インビボ濃度、および／またはこのような薬剤とともに任意に 投与されるCRFアゴニストまたはCRFアンタゴニストの有効濃度を上昇させる。す なわち、これらの薬剤は、CRF-BPの効果をブロックし、このためCRF-BPが存在す る身体の領域における内因性CRFの濃度を上昇させるために用いられる。より詳 細には、約19〜28残基の間の長さのペプチドは、hCRF-BPに対する高い親和性を 有するが、それ自体がCRFレセプターに結合する傾向が比較的少ないことを示す ことが発見されている。結果として、このようなペプチドは、特定の領域からの 内因性CRFのクリアランスを抑制するために投与され得、それによってインビボ てのCRFの生物学的効果を刺激し、そしてある場合には、CRFまたはCRFアゴニス トとともにこのようなペプチドを投与することが有利であり得る。これらの薬剤 の真の性質は、潜在的な望ましくない副作用が最小化されるかあるいは全体的に 除去されることである。特にCRFアンタゴニストがhCRF-BPに対してかなり高い結 合親和性を有する場合、これらの薬剤はまた標的領域からのいくつかのCRFアン タゴニストのクリアランスを抑制するためにCRFアンタゴニストとともに投与さ れ得る。しかし、その効果は、その他の点でCRF-BPに結合される内因性CRFの放 出によってある程度まで妨げられる。これらの薬剤は、妊娠において分娩を促進 するための、呼吸系を刺激するための、肥満症に対処するための、ならびにアル ツハイマー病および慢性疲労症候群の影響を妨げるための治療処置に有用である ；しかし、これらの適応のいくつかは、薬剤が、脳内に送達されるような方法で 投与されなければならない。 さらに、CRFが天然のCRFレセプターに結合する能力をブロックする能力を決定 するために、そしてこのような候補CRFアンタゴニストとhCRF-BPとの間の結合親 和性を決定するためにも、このような可能性のあるアンタゴニストの二重スクリ ーニングアッセイを行うことにより、特に有効なCRFアンタゴニストをスクリー ニングする方法が提供される。 神経ペプチド結合タンパク質をスクリーニングするための方法もまた提供され る。関連する局面では、神経ペプチド／神経ペプチド結合タンパク質複合体のリ ガンドインヒビター、特にCRF/CRF-BP複合体のリガンドインヒビターをスクリー ニングする方法が提供される。１つの実施態様の範囲内では、この方法は、水溶 液中でリガンドインヒビターの存在下でCRFをCRF-BPと接触させる工程、さらに 非イオン性界面活性剤中で混合する工程、非イオン性界面活性剤と水溶液とを分 離する工程、および水溶液中のCRF量を検出し、それによってリガンドインヒビ ターがCRF/CRF-結合タンパク質複合体を破壊するか否かを決定する工程を包含す る。ある実施態様では、混合は非イオン性界面活性剤の曇り点より高い温度で行 われ、そしてオクチルフェノキシポリエトキシエタノールが好適な非イオン性界 面活性剤である。 これらおよび他の局面は以下の詳細な説明および添付の図面を参照にして明ら かになる。図面の簡単な説明 図１は、ヒト由来CRF（hCRF）（配列番号１）およびヒツジ由来CRF（oCRF）（ 配列番号４）のアミノ酸配列を示す。 図２は、CRF-BPに結合したCRFおよび遊離CRFのレベルを示すグラフである。CR Fレベルは、アルツハイマー病患者および正常な年齢に適したコントロールから の脳組織において測定した。CRF-BPリガンドインヒビターであるα-ヘリックス ヒツジCRF(9-41)を添加して、または添加しないで、レベルを確立させた。 図３は、正常コントロールまたはアルツハイマー病患者から採取した脳組織の ４つの領域におけるCRF（パネルＡ）およびCRF-BP（パネルＢ）のレベルを示す グラフである。 図４は、ビヒクルまたはCRF(6-33)またはCRF(1-41)の脳室内(ICV)注射後のMor ris水中迷路(water maze)および高架式迷路(elevated plus-maze)のテスト結果 を示す。ラットに対し、７〜10匹のグループで、テストを行う15分前にICV注射 を行った。Morris水中迷路テストでは、プラットフォームに達する時間を記録し た。高架式迷路テストでは、オープンアームにおいて費やされたパーセント時間 を記録した。星印は、統計学的に有意差があることを示す。 図５は、Ｙ迷路テストにおけるラットのテスト結果を示す図である。７〜10匹 のラットのグループに、テストを行う15分前に、ICV注射で０、１、５、または2 5μgのいずれかのCRF(6-33)を与えた。正確な応答のパーセントを測定した。星 印は、統計学的に有意差があることを示す。 図６は、依存症誘導レベルのニコチンの連続注入（依存症期）間および２週間 禁断（禁断症状期）間のラットの体重変化および食物摂取のテスト結果を示す。 体重は、ハッチング棒で示し、グラム表示される；食物摂取は、線で示し、グラ ム表示される。 図７は、リガンドインヒビターであるh/r CRF(6-33)の投与後の食物摂取にお けるニコチン依存症からの禁断症状の影響を示す図である。発明の詳細な説明 本発明を記載する前に、本明細書中で以後に用いられる用語の定義を記載する ことは、本発明を理解するために有用であり得る。 「CRF」は、下垂体からのアドレノコルチコトロピン(ACTH)、β-エンドルフィ ン、および他のプロオピオメラノコルチン(POMC)由来ペプチドの放出を調節する ペプチドのことである。ヒト、ラット、および他の種において、CRFのアミノ酸 配列は決定されており、これを図１に示す（配列番号１）。ラットCRFおよびヒ トCRFのアミノ酸配列は同一であり、そしてこのタンパク質を「h/rCRF」と称す る。「遊離CRF」は、CRF結合タンパク質またはCRFレセプターに複合体化または 結合していないCRFのことである。 「CRF結合タンパク質」(CRF-BP)は、ヒト血漿中の可溶性因子として存在する か、または細胞膜と結合して存在する１つまたは複数のタンパク質のことである 。これは、以下の２つの方法のうち一方で測定されるように、CRFの機能を阻害 する能力を有する：(1)下垂体培養細胞または灌流ラット下垂体前葉系からのCRF 誘導ACTH放出、または(2)CRFレセプターを有する細胞またはクローン化CRFレセ プターでトランスフェクトした細胞からのCRF誘導cAMP形成。CRF-BPをコードす るcDNAクローンの例は、ヒト肝臓およびラット脳から単離されている（Potterら 、Nature 349:423，1991）。 「CRF/CRF-BP」は、CRFとCRF-BPとの複合体のことである。CRFとCRF-BPとの結 合は、疎水性相互作用、イオン性相互作用、または共有結合相互作用により行わ れ得る。 「ヒトCRF結合タンパク質」(hCRF-BP)は、インビトロおよびインビボにおいて 、hCRFを特異的に結合することにより、ACTH分泌促進物質としてのhCRFを不活性 化する37kDa血清タンパク質のことである。ヒトCRF-BPは、hCRFに対して高い親 和性を有し、そしてoCRFに対して低い親和性を有する。これにより、hCRF-BPが 、末梢血漿hCRFの除去を促進させることが示唆される。hCRFは、hCRF-BPに結合 されたとき、インビトロおよびインビボにおいて、ACTHを刺激する能力を喪失す る。Ｃ末端が主にレセプター親和性の原因となるが、CRFの最初の８アミノ酸が レセプター活性化に関与していると考えられる。hCRF-BPは、中央部のドメイン に結合することにより、hCRFが副腎皮質刺激ホルモン産生細胞を刺激することを 防ぐようであり、このためリガンドがレセプターと相互作用できず、ACTH放出が 起こらない。CRF/CRF 結合タンパク質のリガンドインヒビター 上述したように、本発明は、CRFがCRF-BPから放出されるように、有効量のCRF /CRF-BP複合体のリガンドインヒビターを投与することにより、脳内の遊離CRFレ ベルを増加させる方法を示す。 「CRF/CRF-BP複合体のリガンドインヒビター」は、可逆性または不可逆性のい すれかの様式でCRFを置換する。置換は、結合CRF分子が遊離CRFになるようにす ることにより、起こり得る。さらに、リガンドインヒビターの結合は、ヒトhCRF -BPへの高い親和性のために遊離CRFのCRF-BPへの結合を阻害し得、hCRF-BPへの 結合に関して内因性CRFと競合する。CRFの可逆性または不可逆性の置換は、CRF 結合部位に直接結合するリガンドインヒビターによるか、またはCRF結合部位で はない部位に結合し、結合CRFのアロステリック置換を引き起こすリガンドイン ヒビターにより、媒介され得る。リガンドインヒビターは、CRFまたはCRF関連配 列に由来するペプチド、または結合CRFの置換を引き起こすように設計されたラ ンダムペプチドであり得る。さらに、リガンドインヒビターは、小分子の天然ラ イブラリーに由来する非ペプチド分子、天然分子の合成アナログ、CRF/CRF-BP結 合複合体の物理的特性に基づいて特異的に設計された小分子、または他のリガン ドインヒビターであり得る。リガンドインヒビターはまた、投与化合物の代謝産 物であり得る。リガンドインヒビターは、CNSにより投与されるか、または全身 投与されて、脳に到達できるものでなければならない。好ましくは、リガンドイ ンヒビターの特性は、そのインヒビターがCRFレセプターで低い親和性のアンタ ゴニストである（Ｋ_i≧１μＭ）か、またはCRF結合タンパク質に対する100倍の 選択性を有する（Ｋ_i≦10nM）ような特性である。CRF-BPリガンドインヒビター はまた、CRFレセプターで幾分かの中程度のアゴニスト活性を示し得る（Ｋ_i≧50 nＭ）。 CRF-BPに結合し、かつ内因性CRFを置換するペプチド配列は、CRFペプチド配列 、CRF関連ペプチド配列、または非関連ペプチド配列に由来し得る。長さ約19お よび28残基の間の比較的短いペプチドが、hCRF-BPに競合的に結合するのに有効 であり、同時にCRFレセプターに対して非常に低い親和性を示すことが分かって いる。結果として、この特定のペプチド群は、hCRF-BPに結合するが、CRFレセプ ターには実質的に結合せず、かつ／またはこのレセプターと相互作用しない。単 独で与えられる場合、これらのペプチドは、内因性遊離CRFの量を増加させる効 果を有する。このことは、CRFレセプターと相互作用し得る状態を維持する。従 っ て、これらのペプチドが用いられて、特定の領域または身体器官における内因性 CRFの効果を確実にするかまたは増大させ得る。これらのペプチドは、カクテル においてCRFレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストと共に与えられる場 合、同様に、これらの物質の効率を増大させるために用いられ得る。しかし、CR Fアンタゴニストとの投与は、内因性CRFの放出により幾分か中和される。CRF関 連タンパク質の例は、ウロテンシン(urotensin)およびソーバギン(sauvagine)を 含む。好ましいペプチドは、h/rCRFに由来するペプチドである。この点において 、多くの異なるペプチドが、内因性結合CRFを置換するために、本発明の情況内 で用いられ得る。このようなペプチドは、αヘリックスoCRF（ヒツジCRF）(9-41 )（括弧内の数はアミノ酸を指す）、h/rCRF(6-33)、h/rCRF(9-33)、ウロテンシ ンＩ、ソーバギン、およびh/rCRFである。好ましいペプチドは、h/rCRF(6-33)、 h/rCRF(9-33)、およびh/rCRF(1-41)OHである。これらのペプチドは、適当な親和 性でCRF-BPに結合するがCRFレセプターには結合しないからである。Ｃ末端の遊 離酸(OH)は、天然CRFにおいて見出されるアミド化よりも、特に好ましい。h/rCR FのＣ末端アミノ酸の脱アミド化は、CRF-BPに対する結合親和性に影響を与えな いが、CRFレセプターに対するh/rCRFの親和性を大きく減少させる。これらの因 子のＮ末端は、アシル化による分解（例えば、アセチル(Ac)による）に対して保 護され得、このような修飾ペプチドは等価物であるとみなされる。CRFレセプタ ーと有意に相互作用することなくCRF-BPに結合することが見出されたCRFの最小 配列は、アミノ酸９〜33である。特に、アミノ酸残基22〜25は、CRF-BPへの結合 において重大な役割を果たしているようである。 他のペプチドは、上記ペプチドシリーズに対する相同性に基づいて設計され得 る。上述したように、ペプチドを設計する場合には、Ｃ末端アミノ酸は遊離酸基 を含有することが好ましい。図１は、既知のCRFおよびCRF関連分子のアミノ酸配 列の比較を示す。上述したように、残基９〜33は、CRF-BPへの結合に必要とされ る最小配列を含み、そして残基22、23、および25は、結合において重大な役割を 果たしていると考えられる。ペプチドの設計において好ましい指針は、残基22に 相当するアミノ酸残基はアラニンであり、残基23に相当するアミノ酸残基は塩基 性アミノ酸（アルギニンまたはリジン）であり、そして残基25に相当するアミノ 酸残基はグルタミン酸である。 適切なペプチドの例は、以下の配列を有するヒトCRFのフラグメント、すなわ ちhCRF(1-41)を含む： Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Gl u-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Ar g-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile（配列番号１）。 用いられる１つの好ましいフラグメントは、以下の配列を有するhCRF(6-33)で ある：Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Al a-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser（配列番号１）。このフラグ メントは、配列において残基を除去することにより、Ｎ末端で４残基まで、かつ ／またはＣ末端で５残基まで短縮され得る。このフラグメントは、例えば、hCRF (9-33)、hCRF(6-30)、およびhCRF(8-29)である。代わりに用いられ得る他のペプ チドの例は、例えば、以下のようなhCRF(6-33)アナログを含む：[Nle²¹]-hCRF(6 -33)、[Nle²¹]-hCRF(9-33)、[Ile²⁴]-hCRF(6-33)、[Asn²⁶]-hCRF(6-33)、[Nle^{18 ,21} ]-hCRF(6-33)、[Ile²⁷]-hCRF(6-33)、[Va²⁸]-hCRF(6-33)、[Asn^29,30]-hCRF( 6-33)、[Lys¹⁶]-hCRF(6-33)、[Asp¹⁷]-hCRF(6-33)、[Leu¹²]-hCRF(6-33)、[Arg^{1 3} ]-hCRF(6-33)、[Glu⁹]-hCRF(6-33)、[Va³¹]-hCRF(6-33)、[Thr³³]-hCRF(6-33) 、[Arg³²]-hCRF(6-33)、[Ile¹⁰]-hCRF(6-33)、および[Ile¹⁴]-CRF(6-33)。 この目的において用いられ得る他のペプチドは、以下の配列（配列番号２）に より定義される：Xaa₄-Xaa_5'-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₉-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Xaa₁₃-X aa₁₄-Xaa₁₅-Xaa₁₆-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Xaa₂₁-Ala-Xaa₂₃-Xaa₂₄-Glu-Xaa₂₆ -Xaa₂₇-Xaa₂₈-Xaa₂₉-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Xaa₃₂-Xaa₃₃または生物学的に活性なそれらの フラグメント。このフラグメントは、配列中でＮ末端から１〜８残基、または配 列中でＣ末端から１〜５残基、またはその両方の欠失により形成される。ここで 、Xaa₂₃は、ArgまたはLysであり、Xaa₂₄は、Ala、Ile、Asn、Met、Nle、またはL euであり、そして残りの各Xaaは、ヒトCRF(1-41)においてそれぞれの位置に存在 する残基、または別の天然に存在するアミノ酸、好ましくは天然に存在する残基 の保存的置換を表す。 別の好ましいペプチド群は、以下の配列（配列番号２）により定義される：Xa a₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₉-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Xaa₁₃-Xaa₁₄-Xaa₁₅-Xaa₁₆-Xa a₁₇-Xaa₁₈ -Xaa₁₉-Xaa₂₀-Xaa₂₁-Ala-Xaa₂₃-Xaa₂₄-Glu-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Xaa₂₈-Xaa₂₉-Xaa₃₀-Xaa₃₁ -Xaa₃₂-Xaa₃₃、および生物学的に活性なそれらのフラグメント。このフラグメ ントは、配列中でＮ末端から１〜８残基、または配列中でＣ末端から１〜５残基 、またはその両方の欠失により形成される。ここで、Xaa₆はIle、Met、Leu、ま たはNleであり；Xaa₈は、LeuまたはIleであり；Xaa₁₄は、Leu、Met、またはNle であり；Xaa₁₇は、GluまたはAsnであり；Xaa₁₈は、Val、Met、Leu、またはNleで あり；Xaa₁₉は、LeuまたはIleであり；Xaa₂₀は、GluまたはHisであり；Xaa₂₁は 、Met、Leu、Nle、またはArgであり；Xaa₂₃は、ArgまたはLysであり；Xaa₂₄は、 Ala、Ile、Asn、Met、Nle、またはLeuであり；Xaa₂₆は、Gln、ASn、またはGlyで あり；Xaa₂₇は、Leu、Glu、またはGlnであり；Xaa₂₈は、AlaまたはArgであり；X aa₂₉は、GlnまたはGluであり；Xaa₃₂は、His、Glu、またはLeuであり；Xaa₃₃は 、Ser、Leu、またはIleであり；そして残りの各Xaaは、ヒトCRF(1-41)において それぞれの位置に存在する残基、または別の天然に存在するアミノ酸、好ましく は天然に存在する残基の保存的置換を表す。好ましくは、２〜５残基までがＮ末 端から欠失される。最も好ましくは、Xaa₇は、Serであり、Xaa₉は、Aspであり、 Xaa₁₀は、Leuであり、Xaa₁₁は、Thrであり、Xaa₁₂は、Pheであり、Xaa₁₃は、His であり、Xaa₁₅は、Leuであり、Xaa₁₆はArgであり、Xaa₃₀はGlnであり、そしてXa a₃₁は、Alaである。 別の好ましいペプチド群は、以下の配列（配列番号３）により定義される：Pr o-Pro-Ile-Ser-Xaa₈-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Glu -Xaa₂₁-Ala-Arg-Xaa₂₄-Glu-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Xaa₂₈-Xaa₂₉-Gln-Ala-Xaa₃₂-Xaa₃₃、ま たは生物学的に活性なそれらのフラグメント。このフラグメントは、配列中でＮ 末端から１〜８残基、または配列中でＣ末端から１〜５残基、またはその両方の 欠失により形成される。ここで、Xaa₈は、LeuまたはIleであり；Xaa₁₇は、Gluま たはAsnであり；Xaa₁₈は、Val、Met、Leu、またはNleであり；Xaa₁₉は、Leuまた はIleであり；Xaa₂₁は、Met、Leu、またはNleであり；Xaa₂₄は、Ala、Ile、また はAsnであり；Xaa₂₆は、GlnまたはAsnであり；Xaa₂₇は、Leu、Glu、またはGlnで あり；Xaa₂₈は、AlaまたはArgであり；Xaa₂₉は、GlnまたはGluであり；Xaa₃₂は 、HisまたはGluであり；そしてXaa₃₃は、SerまたはLeuである。 後者の群のうち、hCRFの上述のフラグメント以外に特に好ましいペプチドは、 以下のアナログを含む： [Ile^8,19,24、Asn^17,26、Met¹⁸、Glu^27,29、Arg²⁸、Gly³²、Leu³³]-hCRF(6-33) [Asn^17,26、Nle¹⁸、Ile^19,24、Glu^27,29、Arg²⁸、Gly³²、Leu³³]-hCRF(9-33) [Ile^8,19,24、Asn^17,26、Met¹⁸、Glu²⁷、Arg²⁸]-hCRF(4-28) [Ile^19,24、Asn^17,26、Nle¹⁸、Glu²⁷、Arg²⁸]-hCRF(7-31) [Ile^8,19、Asn^17,24,26、Met¹⁸、GLN²⁷、Arg²⁸、Glu²⁹、Gly³²、Leu³³]-hCRF(6- 33) [Asn^17,24,26、Met¹⁸、Ile¹⁹、Gln²⁷、Arg²⁸、Glu²⁹、Gly³²、Leu³³]-hCRF(9-33 ) [Ile^8,19、Asn^17,24,26、Met¹⁸、Gln²⁷、Arg²⁸]-hCRF(8-28) [Ile^8,19、Asn^17,24,26、Nle¹⁸、Gln²⁷、Arg²⁸、Glu²⁹、Gly³²]-hCRF(8-32) [Ile^8,19、Asn^17,24,26、Nle¹⁸、Gln²⁷、Arg²⁸、Glu²⁹、Gly³²]-HCRF(8-32) [Met^6,14,18,24、Ile^8,19,33、Asn¹⁷、His²⁰、Arg^21,28、Lys²³、Gly²⁶、Glu^{27, 29} 、Leu³²]-hCRF(6-33) [Ile^8,19,33、Met^14,18,24、Asn¹⁷、His²⁰、Arg^21,28、Lys²³、Gly²⁶、Glu^27,29 、Leu³²]-hCRF(9-33)。 [Nle^6,14,18,24、Ile^8,19,33、Asn¹⁷、His²⁰、Arg^21,28、Lys²³、Gly²⁶、Glu^{27, 29} 、Leu³²]-hCRF(6-33)。 [Ile^8,19、Nle^14,18,24、Asn¹⁷、His²⁰、Arg^21,28、Lys²³、Gly²⁶、Glu^27,29]-h CRF(8-30)。 ペプチド命名法は、SchroderおよびLubke，「The Peptides」、Academic Pres s(1965)に見出され得、ここでは、従来の表示に従って、アミノ基を左側に、そ してカルボキシル基を右側に記載する。標準的な３文字表記を用いてαアミノ酸 残基を同定し、そしてこのアミノ酸が異性体を有する場合、他に何も示されてい ない限り、表示アミノ酸はＬ型である。例えば、Ser＝L-セリン、Orn＝L-オルニ チン、Nle＝L-ノルロイシン、Nva＝L-ノルバリン、Har＝L-ホモアルギニン、お よびCML＝L-C^αMeLeu。 ペプチドは、適切な方法により合成される。この方法としては、もっぱら固相 合成によるか、部分的固相合成によるか、フラグメント縮合によるか、または古 典的な解離付加(solution addition)による。ペプチドの化学合成は、適切な保 護基での種々のアミノ酸部分の不安定側鎖基の保護を用い、その部位で起こる化 学反応を防ぎ、最後にこの基を除く。ほとんどの方法はアミノ酸またはフラグメ ント上のαアミノ基を保護し、一方その保護したものはカルボキシル基で反応し 、次いでこのαアミノ保護基を選択的に除去することにより、次の反応をその位 置で生じさせる。このような代表的なペプチド合成の例は、米国特許第5,235,03 6号（1993年８月10日発行、この開示内容は本明細書中に参考として援用される ）において提供される。 hCRF(6-33)およびhCRF(9-33)のようなペプチドならびに上記に特に述べた他の アナログは、米国特許第4,489,163号（この開示内容は、本明細書中に参考とし て援用される）に記載のように、固相法を用いて手動で合成されるか、またはBe ckman Model 990ペプチド合成機で自動合成される。簡単に述べれば、第３級ブ トキシカルボニル(Boc)をαアミノ保護のために用い、そしてTFA-CH₂Cl₂(3:2)を 脱保護のために用いる。標準的カップリングは、1,3-ジイソプロピルカルボジイ ミド(DIC)により媒介され、一方困難なカップリングは、2-(1H-ベンゾトリアゾ ール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸(HBTU)を 用いて達成される。保護化ペプチド樹脂は、３％硫化メチルの存在下で無水フッ 化水素酸(HF)を用いて開裂され、HFは、真空下で続けて除去される。粗ペプチド は、多段階逆相HPLCを用いて精製される。 ポリペプチドアナログは、本明細書中に特に示される配列と実質的に同一のア ミノ酸残基配列を有する任意のポリペプチドを含む。このポリペプチドでは、１ つまたはそれ以上の残基が、上述した位置において、別のアミノ酸残基と置換さ れている。保存的置換は、そのポリペプチドが遊離CFRの増加を引き起こす能力 を（例えば、CRF-BPに強く結合することにより）示すのであれば、機能的に類似 する側鎖を有する残基を用いて行われ得る。保存的置換の一般的な例は、ある非 極性（疎水性）残基（例えば、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、ロ イシン、またはメチオニン）と別の残基を置換すること；ある極性（親水性）残 基と別の残基を置換すること（例えば、リジンのアルギニンへの置換、アスパラ ギンのグルタミンへの置換、セリンのトレオニンへの置換）；ある塩基性残基（ 例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン）と別の残基を置換すること； およびある酸性残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）と別の残基 を置換することを含む。表現「保存的置換」はまた、そのようなポリペプチ ドが所望の結合活性を示すのであれば、非誘導化残基の代わりに化学的誘導化残 基を用いることも含む。上述したように、このような保存的置換は、残基Xaa₆〜 Xaa₂₁およびXaa₂₆〜Xaa₃₃の１つまたはそれ以上の残基について行われ得る；好 ましい保存的置換の例を以下の表１に示す。 「化学的誘導体」とは、官能性側鎖の反応により化学的に誘導体化される１つ 以上の残基を有する対象ポリペプチドをいう。このような誘導体化分子としては 、例えば、遊離アミノ基が誘導体化され、アミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル 基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基また はホルミル基を形成する分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は誘導体化され 、塩、メチルエステルおよびエチルエステルあるいは他のタイプのエステルまた はヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は誘導体化され、O-アシル誘導 体またはO-アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導 体化され、N-im-ベンジルヒスチジンを形成し得る。化学的誘導体はまた、標準 のアミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体の１つ以上を含有するペプチドを包 含する。例えば、プロリンは、4-ヒドロキシプロリンで置換され得、リジンは、 5-ヒドロキシリジンで置換され得、ヒスチジンは、3-メチルヒスチジンで置換さ れ得、セリンは、ホモセリンで置換され得、そしてリジンは、オルニチンで置換 され得る。 さらに、ランダムペプチドが合成され、続いてスクリーニングされ、以下によ り詳細に議論するように、CRF/CRF-BP複合体由来のCRFの置換の機能的基準を満 足するペプチドを同定し得る。ランダムペプチドは、生物学的方法によるか、ま たは組合わせ化学技術により生成され得る（Gallopら、J.Med.Chem．37:1234、1 994を参照のこと）。 ランダムペプチドを生成する生物学的方法としては、少なくとも４つの異なる 方法が挙げられる。第１に、ランダムヌクレオチドは、微生物の表面上にペプチ ドを提示するために宿主遺伝子に挿入され得る（Charbitら、Embo.Journal 5:30 29、1986；Agterbergら、Gene88:37、1990；Fuchsら、Bio/Tech 9:1369、1991； Theryら、Appl.Environ.Microbiol．55:984、1989）。このような方法では、細 菌の種々の細胞表面タンパク質は、オリゴヌクレオチドが挿入される融合パート ナーとして使用され、タンパク質の細胞外ループの１つに融合されたペプチドを 産生する。LamB、OmpA、PhoE、PAL、およびピリンタンパク質は全て、細菌上の ペプチド提示のためのビヒクルとして機能する。バクテリオファージの表面上に ペプチドを提供する別の系が、好ましい方法である。使用されるベクターは、線 維状ファージ（例えば、M13、f1、およびfd）由来である。代表的には、コー トタンパク質（例えば、pIIIまたはpVIII）は、ペプチド発現ビヒクルとして機 能する。（Smith、Science 228:1315、1985；ParmleyおよびSmith、Gene 73:305 、1988；Cwirlaら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:6378、1990；Marklandら、 Gene 109:13、1991、米国特許第5,223,409号）。ファージ提示および細菌提示方 法の両方を用いると、ペプチドとペプチドをコードするDNAとの間の物理的連結 が存在し、これによりDNA配列の容易な単離および増殖が可能となる。第３に、 ペプチドをそのＣ末端でDNA結合タンパク質LacIに融合することにより、ペプチ ドはプラスミドに結合され得る（Cullら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:1865 、1992）。次いで融合タンパク質を、ペプチドがそれをコードするDNA配列と特 異的かつ安定に結合するようにプラスミド上のLacオペレーターに結合する。第 ４に、ペプチドは失速翻訳（stalling translation）後にポリソーム上で提示さ れ得る。それらをコードするRNAになお連結されている発生期のペプチドを含むR NAおよびポリソームの蓄積を引き起こすことにより（Gallopら、J．Medicinal C hem．37:1233、1994）、ペプチドをコードする遺伝物質を回収し得る。これらの 全ての方法において、先導ペプチドとしてCRFに基づく変異体のライブラリーは 、挿入されている「不正確な」塩基の比例するレベルを制御することにより合成 され得る。 生物学的方法に加えて、組合わせ化学技術に基づくアプローチが、ランダムペ プチドを生成するために使用され得る。種々の方法が、アッセイに利用可能な複 数の均質ペプチドを合成するために開発されている。これらの方法としては、マ ルチピン（multi-pin）合成（Geysenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3998 、1984；Valerio、Anal．Biochem．197:168、1991；Brayら、Tetrahedron Lett ．32:6163、1991）および「ティーバッグ（tea bag）」法（Houghtenら、Proc． Natl．Acad．Sci．USA 82:5131、1985；Houghtenら、Int．J．Pept．Protein Re s．27:673、1986）が挙げられる。複数の縮重ペプチドがまた、使用のために合 成され得る。アミノ酸混合物の単一の樹脂支持体への同時結合は、複数のペプチ ドを合成するための一般的方策である。近年、可溶性ペプチド（Houghtenら、Na ture 354:84、1991；Houghtenら、Biotechniques 13:412、1992）および固体支 持体に結合したペプチド（Lamら、Nature 354:82、1991）の組合わせライブラリ ーが、 「分割合成（split synthesis）」法により合成されている。ペプチド構造に対 する識別子を含むビーズ上でのペプチド合成（PCT WO 93/06121）を包含する、 これらの合成に対する多数の改変法が開発されている（概説のため、Gallopら、 前出を参照のこと）。このような識別子の１つは、オリゴヌクレオチド配列であ る（Needelsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:10700、1993）。ランダムペプ チドの他の合成は周知であり、当業者により容易に実施され得る。 天然または合成の非ペプチド小分子もまた、リガンドインヒビターとして使用 され得る。CRF/CRF-BP複合体のリガンドインヒビターについてスクリーニングさ れる小分子のライブラリーは、土壌サンプル、植物抽出物、海洋微生物、発酵ブ ロス、真菌ブロス、薬学的化学ライブラリー、組合わせライブラリー（化学的お よび生物学的の両方）などから得られる。このようなライブラリーは、種々の供 給源（市販および私有の両方）から得られ得る。 候補化合物と類似であるが、同一ではない構造を有する分子は、下記のように 合成され、そしてリガンド阻害について試験され得る。小ペプチド配列は、CRF の溶液NMR構造に関して設計され得る。上記のように、CRF-BPへの結合のためのC RFにおける鍵となる接触残基は、残基22、23、および25である。従って、残基20 〜27由来のペプチド配列は、ヒトCRFの参照溶液構造から設計され得、この構造 は1H NMRおよび制限された分子動力学（restrained molecular dynamics）をと もなう隔りの幾何学形状（distance geometry）により決定される（Protein Eng ineering 6:149、1993）。インタクトのCRF分子が、設計の基礎として使用され る。なぜなら、欠失が大きくなると、CRFのαらせん構造が失われる可能性があ るからである。次いで、重要な接触残基にまたがる小ペプチドの3-D構造は、ペ プチド構造を模倣する非ペプチド分子についてのコンピューターバンクを検索す るために使用され得る。出発分子よりも低いIC-50値を有する分子が選択される 。さらなる分子は、開始化合物およびそれらの分子の物理的および生化学的特性 に基づいて合成される。特に好ましい候補は、10nM以下のIC-50値を有する。 上記の任意のインヒビターが必要な特性を有するかどうかの決定は、インヒビ ターのCRF/CRF-BP結合複合体からCRFを置換する能力をアッセイし、次いでイン ヒビターのCRFレセプターを結合する能力を評価することによりなされ得る。 候補リガンドインヒビターは、生物学的アッセイまたはインビトロアッセイに より、CRF/CRF-BP複合体からCRFを置換するそれらの能力についてスクリーニン グされ得る。１つの適切な生物学的アッセイは、培養した下垂体細胞からのACTH 放出の測定である。このアッセイは、以下の方法で実施される。ラット由来の下 垂体前葉は、無菌HEPES緩衝液で６回洗浄され、そしてコラゲナーゼを含有する 溶液に移される。続いて25mlのBellco分散フラスコに移した後、下垂体を37℃で 30分間撹拌し、すりつぶし、さらに30分間インキュベートし、そして再度すりつ ぶす。次いで部分的に分散した細胞を、遠心分離により採集する。細胞ペレット は、10mlのノイラミニダーゼに再懸濁され、そして再度遠心分離により採集され る。このペレットを25mlのBBM-P（BBM（Irvine Scientific）＋100μg/L コルチ ゾル、１μg/L インスリン、0.1μg/L EGF₂、0.4μg/L T₃、0.7μg/L PTH、10μ g/L グルカゴン、および２％ウシ胎児血清）中で再構築し、再度遠心分離し、そ して得られるペレットを最終的にBBM-P中で再構築する。次いで細胞は、50,000 〜100,000/ウェルの密度で48ウェルプレートにプレートされ、そして２日間イン キュベートされる。アッセイ当日に、細胞は、ペプチド候補またはCRFでの刺激 の準備に、BBM-Tで１回洗浄される。細胞はh/rCRF（１nM）の最大刺激用量で刺 激され、ACTH放出はRIAまたは免疫放射性分析アッセイにより測定される。阻止 濃度のCRF-BPが添加される場合、放出されるACTHの量は減少し、そして最大放出 の画分として発現される。リガンドインヒビターは、種々の用量で添加される。 CRF-BPからCRFを置換するペプチドの能力は、与えられたCRF単独により引き起こ された最大放出の画分として発現されるACTH放出の量により測定される。 候補リガンドインヒビターをスクリーニングする好ましい様式は、インビトロ リガンド免疫放射性分析アッセイ（LIRMA）による。LIRMAについて、CRF-BPは、 脳組織、血清または組換え形態を発現する細胞から単離され得る。組換えhCRF-B Pは、pSG5-hA3およびRSV-neoプラスミドを有するチャイニーズハムスター卵巣（ CHO）細胞において産生され得る。安定なCHOトランスフェクタントは、G418（Si gma Chemical、St．Louis、MO）選択下で希釈することによりクローン化され、 そして２mM L-グルタミンおよび３％ウシ胎児血清を補充したDulbeccoの改変イ ーグル培地中に維持される。hCRF-BPの産生をスケールアップするために、 トランスフェクトされたCHO細胞は、10,000 MWCOバイオリアクター（Cell Pharm Micro Mouse、Unisyn Technologies、Tustin、CA）に接種される。富化培地は 、バイオリアクターから毎日採取され、そして精製まで-20℃で保存される。あ るいは、組換え細胞および組織培養培地を含む閉鎖ローラーボトル（closed rol ler bottle）（37℃の環境でゆっくり回転させる）が使用され得る。 hCRF-BPは、各工程由来の画分が下記のアッセイを用いて評価される３つの工 程のプロセスにより精製され得る。第１に、富化培地は、Bio Pilotクロマトグ ラフィー装置（Pharmacia LKB Biotechnology、Uppsala、Sweden）を用いてアフ ィニティー精製される。ヒトCRFは、N-ヒドロキシスクシンイミドを用いて、１ 級アミノ基を介してAffi-Prep 10（Bio Rad Laboratories、Richmond、CA）に結 合される。結合後、アフィニティーゲルは、XK16または等価なカラム（Pharmaci a LKB Biotechnology、Uppsala、Sweden）に充填される。アフィニティー精製は 、富化培地を２ml/分でカラムに通して濾過する工程、５ml/分で10ベッド容量の 100mM HEPES HCl（pH7.5）で洗浄する工程、および５ml/分で20％アセトニトリ ルを含有する80mMトリエチルアンモニウムホルメート（pH3.0）を用いて１ベッ ド容量の画分を溶出する工程からなる。あるいは、穏和な塩基性条件（例えば、 pH約10.5）下での溶出が使用され得る。 第２の精製はゲルクロマトグラフィーを利用する。アフィニティー的に純粋な hCRF-BPは、凍結乾燥され、そして0.1M酢酸アンモニウム（pH4.75）で緩衝化さ れた６Mグアニジン-HCl中で再構築される。FPLC装置は、この精製工程のために 直列に連結された２つのSuperose 12 HR 10/30カラム（Pharmacia LKB Biotechn ology、Uppsala、Sweden）と共に使用される。アフィニティー的に純粋なhCRF-B Pは、１ml中で充填され、続いて0.4ml/分で６Mグアニジン HCl/0.1M酢酸アンモ ニウム（pH4.75）で溶出され、毎分画分が採集される。 次いで、第２の精製からの活性画分は、逆相HPLCに供される。HPLC装置は、２ つのmodel 100Aポンプ（Beckman、Palo Alto、CA）、Axxiom HPLCコントローラ ー（Cole Scientific、Calabasas、CA）、Spectroflow 773吸光度検出器セット （214nmに対する）（Kratos Analytical、Ramsey、NJ）、およびPharmacia．mod el 482チャートレコーダー（Pharmacia LKB Biotechnology、Uppsala、Sweden） からなる。緩衝液Ａは、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）／５％アセトニトリルで あり、緩衝液Ｂは、0.1％ TFA／80％アセトニトリルである。続いて、アフィニ ティー的に純粋な、同サイズのhCRF-BPの１ml注入液を、25％ Ｂ緩衝液中2.5ml/ 分の流速で、イソクラチックな条件下で半分取C4 HPLCカラム（Vydac、Hesperia 、CA）に付与する。最終塩ピークの通過後、単一勾配の溶出を、25％ Ｂ緩衝液 から始めて30分かけて95％ Ｂ緩衝液まで増加させて実施する。次いで、優勢な 吸光度ピークを、hCRF-BP IRMAおよびアミノ酸分析により定量する。 LIRMAにおいて、脳組織、血清、または組換え形態を発現する細胞から単離さ れたCRF-BPは、結合緩衝液（50mMリン酸緩衝化生理食塩水中の0.02％ NP-40）中 で、96ウェルプレートのウェル、小さなポリプロピレンミクロ微小遠心管、また はホウケイ酸ガラスチューブに添加される。¹²⁵I-h/rCRF（New England Nuclear ）および10μMの候補リガンドインヒビターが添加され、そして反応物は室温で １時間インキュベートされる。適切に希釈された抗CRF-BP抗体（例えば、ウサギ 抗hCRF-BP（Potterら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:4192-4196、1992）を、 各チューブに添加し、そしてさらなるインキュベーション後、結合複合体は、ヤ ギ抗ウサギ抗体をさらに添加することにより沈澱する。¹²⁵I-CRFを含む沈殿物を 、遠心分離により採集し、そしてペレット中の放射活性の量を、ガンマ線カウン ターにより測定する。候補リガンドインヒビターがCRF-BPからCRFを置換する場 合、ペレットは、候補ペプチドが添加されないコントロールと比較して、含まれ る放射活性が少ない。¹²⁵I-h/rCRFのCRF-BPへの結合の最大阻害（すなわち、100 ％）は、10μMのCRF-BPペプチドリガンドh/rCRF（6-33）とのインキュベーショ ン後にペレットに残存する放射活性の量により定義される。従って、候補リガン ドインヒビターの結合能力は、標準h/rCRF（6-33）の能力に対して測定される。 好ましくは、リガンドインヒビターが存在する場合、少なくとも50％の阻害が存 在する。 阻害の結合アフィニティー定数（K_i）は重要である；このアッセイから、0.17 +0.01ナノモーラー（nM）であると見出されるヒトCRFに対するK_iに対するその値 に従って適切な予想で調査される。従って、hCRFのK_iよりも低いK_iを有するリガ ンドは、hCRF自体よりもhCRF-BPに強力に結合し、そしてより高い値を有するリ ガンドは、相対的により低い結合アフィニティーを有する。それゆえ、hCRF-BP との結合に対してhCRFと合理的かつ効果的に競合することが望まれるので、試薬 またはペプチドがより低いK_i値を有するほど、この目的に対してより有益である 。好ましくは、試薬は、約20nM以下のK_i値、より好ましくは約10nM以下のK_i値、 最も好ましくは約５nM未満のK_i値を有する。hCRF（6-33）はアッセイされ、3.5+ 0.44nMのK_i値を有することが見出された。この試薬はまた、ヒトCRFレセプター に対して低い結合アフィニティー（すなわち、1000nMを超える阻害の結合定数） を有し、そしてoCRFの約0.1％未満のCRFアゴニズム（agonism）を示すので、本 発明の方法における使用に対して優れた選択であると考えられる。ヒトCRF（9-3 3）は11+0.36nMのK_i値を有し、そしてそれはまた1000nMを超えるレセプターK_iを 有し、かつより弱いCRFアゴニストでもあるので、これもまた本発明の方法に非 常に有用である。他の類似の試薬およびペプチド（特に、19と28との間の残基を 有するようなhCRFのアナログ）が合成され、そしてこの簡単な方法で試験され、 インビボでの内因性hCRFの有効濃度を増加するためのこれらの有益な方法におけ るそれらの有効性を測定し得る。本明細書中に特に列挙されるペプチドは、特に 有益であるように思われる。例えば、(Ile^8,19,4、Asn^17,26、Met¹⁸、Glu²⁷、Ar g²⁸]-hCRF(4-28)は、1.7+1.2のK_iおよびhCRFレセプターに対して比較的低い結合 アフィニティーを有する。 従って、記載されるようなLIRMAアッセイまたはACTH放出および2-部位ELISAを 包含する他の方法を用いる高処理量スクリーニングが使用され、CRF/CRF-BP複合 体からCRFを置換する小分子を同定し得る。スクリーニングの第１ラウンドにお いて、全ての潜在的候補は、10μMの単一用量でアッセイされる。次いで、10μM で50％を超える阻害を与える任意の化合物は、さらなるスクリーニングのために 選択される。この基準を満足する全ての候補の活性は、６ポイントの用量応答曲 線を用いてスクリーニングの第２ラウンドにより確認される。IC-50値が計算さ れ、そして10μM〜100μMの範囲の値を有する候補がさらに試験され、候補化合 物がCRF/CRF-BP複合体からCRFを置換し、そしてCRF-BPへの抗体結合を妨害しな いことを確実にする。CRFの特異的置換は、非標識CRF-BPの代わりに0.2nM ¹²⁵I- hCRF-BPを添加したこと以外は、LIRMAについて記載されるように実施したアッセ イにおいて証明される。 リガンドインヒビターはまた、結合CRFおよび遊離CRFが界面活性剤相分離によ り分離されるインビトロアッセイによりスクリーニングされ得る。簡潔に述べれ ば、１つの実施態様内で、上記のように単離されたCRF-BPは、結合緩衝液（50mM リン酸緩衝化生理食塩水中の0.02％ NP-40）中、¹²⁵I-h/rCRFおよび10μMの候補 リガンドインヒビターとインキュベートされる。室温で１時間〜２時間のインキ ュベーション後、界面活性剤（例えば、オクチルフェノキシポリエトキシエタノ ール、Triton X-114^TMとして市販されている）が添加され、そしてボルテックス により混合される。Triton X-114^TMおよび他の非イオン性界面活性剤は、それら の曇点を超える温度では水に不溶である。この温度で、微視的相分離が起こる。 この温度未満では、界面活性剤は透明なミセル溶液を形成し、この温度を超える と、透明な２相（１つの相は界面活性剤が枯渇し、もう一方の相は界面活性剤が 濃縮されている）が形成される。Triton X-114^TMの曇点温度は20℃である。この ように、Triton X-114^TMが好ましい。両親媒性αらせんを有するCRFは、Triton X-114^TM中により可溶であり、それゆえ界面活性剤相に分配される。対照的に、C RF-BPに結合したCRFは、水溶液中により可溶である。従って、Triton X-114^TMと 水溶液との相分離は、結合CRFおよび遊離CRFを分離する。相分離は、遠心分離に より都合良く達成される。水相（上部）が取り出され、¹²⁵I-h/rCRFの量が測定 され得る。リガンドインヒビター非存在下で得られた放射活性に対する放射活性 の減少は、リガンドインヒビターがCRF-BPからCRFを置換したことを意味する。^{1 25} I-h/rCRFのCRF-BPへの結合の最大阻害（すなわち、100％）は、10μMのCRF-BP ペプチドリガンドh/rCRF（6-33）とのインキュベーション後の水相中の放射活性 の量により定義される。従って、候補リガンドインヒビターの結合能力は、標準 h/rCRF（6-33）の能力に対して測定される。好ましくは、リガンドインヒビター が存在する場合、少なくとも50％の阻害が存在する。 さらに、このアッセイは、神経ペプチド結合タンパク質一般のスクリーニング において広範な用途を有する。いくつかの神経ペプチド（例えば、NPY）は、CRF と類似の物理特性を有する。なぜなら、両方とも非常に疎水性であり、そしてα らせんを有するからである。このように、NPYは、水溶液中よりも非イオン性界 面活性剤（例えば、Triton X-114^TM）中により可溶であるべきである。目的のNP Yまたは他の神経ペプチドが、一般に、Triton X-114^TM界面活性剤相に分配され ると仮定すると、上記の方法は、一般的に使用され、神経ペプチド結合タンパク 質をスクリーニングし得る。簡潔に述べれば、例示により、種々の器官由来の組 織は、１％ NP-40/PBS可溶化緩衝液中で均質化される。粒子状物質は、3000 x g で10分間遠心分離することにより取り除かれる。上清からの50μlのアリコート は、500pMの¹²⁵I-標識神経ペプチドとインキュベートされ、そしてアッセイは上 記のように実施される。血清または血漿もまた、神経ペプチド結合タンパク質の 潜在的供給源として使用され得る。所定の濃度範囲（0.1nM〜1000nM）の非標識 神経ペプチドは、放射標識神経ペプチドと同時インキュベートされ、推定の結合 タンパク質が放射標識神経ペプチドを特異的に結合するかどうかを評価する。結 合が特異的である場合、Triton X-114^TM分離後の水相中に残存する放射活性は減 少する。この方法を用いて、IC-50値は、神経ペプチドおよび組織抽出物の各々 に対して確立され得る。 さらに、この方法が使用され、その神経ペプチド結合タンパク質に対する神経 ペプチドのリガンドインヒビターについてスクリーニングされ得る。簡潔に述べ れば、放射標識神経ペプチドを、神経ペプチド結合タンパク質または可溶性レセ プターとインキュベートし、そして反応を上記のように実施する。これらのアッ セイには、組換え神経ペプチド結合タンパク質またはレセプター、あるいは組織 サンプルから単離された粗神経ペプチド結合タンパク質のいずれかが使用され得 る。 好ましいリガンドインヒビターは、CRFレセプターに対して低いアフィニティ ーアンタゴニスト効果を有するか、またはCRF結合タンパク質に対して100倍の選 択性を有するかのいずれかである。従って、10μM〜100μMの範囲のIC-50値およ びCRF/CRF-BP複合体の特異的阻害を有する化合物は、CRFレセプターに対する結 合についてさらに試験される。リガンドインヒビターのCRFレセプターについて 拮抗する能力は、cAMP産生アッセイにおいて評価される。このアッセイは、CRF レセプターに結合する遊離CRFのレベルを増加し、そしてcAMP産生を刺激するリ ガンドインヒビターの能力を比較する。試験細胞株は、安定なトランスフェクタ ントとしてCRFレセプターを発現する。このアッセイは、わずかな改変を有するB attagliaら（Synapse 1:572、1987）に従って実施される。試験細胞は、種々のC RF濃度およびリガンドインヒビター濃度で１時間インキュベートされる。細胞を 洗浄し、そして細胞内cAMPは、16時間〜18時間の細胞のインキュベーションの際 に放出され、続いて20mM HCl、95％エタノール中に抽出される。溶解液は凍結乾 燥され、続いて酢酸ナトリウム緩衝液中に可溶化される。cAMPのレベルは、単一 の抗体キット（例えば、Biomedical Technologies（Stoughton、MA）製のキット ）を用いて測定される。 前記の競合インビトロ評価アッセイを実施するための代替物として、リガンド インヒビターは、ヒトCRFレセプターを用いる結合アッセイにおいて評価され得 る。ヒトCRFレセプターならびにこのようなレセプターおよびヒトCRFのための結 合アッセイは、Chenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:8967-8971、1993（こ の開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。試薬は、放 射標識された[Nle²¹、Tyr³²]oCRFを用いて評価され、阻害の結合アフィニティー 定数（K_i）を計算し得る。好ましくは、試薬は、少なくとも約100nM、より好ま しくは1000nMを超えるレセプターK_iを有する。あるいは、ラットCRFレセプター の使用は満足のいくものである。なぜなら、ヒトCRFとラットCRFとは、同一のア ミノ酸配列を有するからである。 ACTH分泌を測定するための、ラット下垂体前葉細胞を用いるさらなるアッセイ が実施され、リガンドインヒビターがhCRFレセプターのCRFアゴニストとして機 能するかどうかを決定し得る。使用される手法は、リガンドインヒビターのみが 細胞に添加されること以外は、一般に上記に示す通りである。アンタゴニスト作 用は、攻撃誘発用量のCRF存在下でアッセイを実施することにより決定され得る 。リガンドインヒビターの性能は、この目的のための標準のアンタゴニストとな る物（例えば、CD-Phe¹²、Nle^21,38]-rCRF(12-41)またはαらせんCRF(AHC)のフ ラグメント（例えば、AHC(9-41)の性能と比較される。 ACTH分泌の刺激の見地からCRFアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を測 定するための上記で同定したインビトロアッセイは、hCRF(6-33)およびhCRF(9-3 3)を用いて実施され得る。このようなアッセイの結果として、hCRF(6-33)は、仮 に1.0であると考慮される標準のoCRFよりもかなり低いCRFアゴニストの生物活性 を有することが示される。このペプチドは、実質的なCRFアンタゴニスト活性を 示さない。このペプチドは、標準のペプチドの約0.1％未満のCRFアゴニスト活性 しか有さないので、この見地から受容可能である。ペプチドhCRF(9-33)は、oCRF の活性の0.01％未満しか実質的に有さない弱いCRFアゴニストでもある。使用さ れる試薬は、CRFレセプターに強力に結合しないことが望まれる。試薬は、oCRF のCRFアゴニスト活性の約25％未満しか有さないべきであり、そして実質的なCRF 競合アンタゴニスト活性を示すべきでないと、一般に考えられる。好ましくは、 試薬は、本発明の標準ペプチド[DPhe¹²、Nle^21,38]-hCRF(12-41)のアンタゴニス ト活性の５％未満しか有さないべきである。しかし、CRFレセプターへの結合の 結果として、潜在的阻止効果が最小になるので、このようなアッセイにおいてそ の値が低下すれば、この方法において試薬がより良好に機能することが理解され るべきである。 治療的処置の方法を提供することに加えて、本発明はまた、哺乳動物へのイン ビボ投与に用いる、より効果的なCRFアンタゴニストを選択するためのペプチド または他の薬剤をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング手順 を行うために、候補ペプチドをまず、前記の周知のアッセイで評価する。このア ッセイは、試験用量のCRFによるラット下垂体前葉(interior)細胞の培養物から のACTH分泌の刺激を阻害する、候補ペプチドの生物学的効果を測定することによ って行われる。次いで、候補ペプチドは、そのK_iを決定するために、前記のhCRF -BP競合結合アッセイで評価される。K_iは前記のようにhCRF-BPへの結合親和性の 指標であり、これは注入したペプチドが指向する標的細胞の部位からの注入ペプ チドの除去の傾向を示す。これらの２つのアッセイの結果の評価に基づいて、特 に有効なCRFアンタゴニストが選択され得る。このアンタゴニストは、CRFアンタ ゴニズムアッセイで高い値を有し、さらに、高い(CRF-BP)K_iもまた有しており、 相対的に低いhCRF-BPへの結合親和性を表すことを示している。現在の実験標準 品であるCRFアンタゴニスト[D-Phe¹²，Nle^21、38]-hCRF(12-41)は、培養された下 垂体細胞からのACTH分泌によって測定したときに、非常に良好なアンタゴニスト 特性を有しており、K_i値は、約60±10nMである。その(CRF-BP)K_iは、300±20nM である。別の良好なCRFアンタゴニスト、すなわちAHC(9-41)、これは現在の標準 品ほど有効ではないが、非常に低い0.10±0.036nMというK_i値を有する。[D-Phe^{1 2} ，Nle^21、38,CML³⁷]-hCRF(12-41)は、下垂体細胞培養でACTH分泌アッセイを行っ たときに、1000nMより大きい(CRF-BP)K_iを有し、そして45±11nMのIC₅₀を有して いた。従って、現在の実験標準品よりもいっそう高く位置づけられる。従って、 これらのスクリーニングアッセイに基づけば、後者のペプチドまたはこの実験標 準品は、AHC(9-41)と比較してえり抜きのペプチドであり、インビボでhCRF-BPに より複合体化されそして除去されるより大きな傾向を有する。このように、この スクリーニングアッセイは、新規に合成されたペプチドをスクリーニングして、 インビボ処置のための潜在的なCRFアンタゴニストとしての、これらのペプチド の相対的な価値を全体的に評価するための貴重な道具を提供する。CRF のレベルの上昇 本発明は、CRF/CRF-BP複合体のリガンドインヒビターの投与を介して、脳中の 遊離CRFのレベルを上昇させる方法を提供する。遊離CRFのレベルの上昇は、イン ビトロアッセイ（例えば、ELISA、ACTH放出の刺激、あるいはcAMP生成の刺激） により測定され得る。任意のこれらのアッセイにおいて、リガンドインヒビター の投与による遊離CRFの増加は、参照リガンドインヒビター（この場合はh/rCRF( 6-33)）と比較して測定される。最少の許容される増加値は、h/rCRF(6-33)につ いての値の10%である。中程度の値は50%であり、好ましい値は80%であり、そし て特に好ましい値は、100%である。 本明細書に記載された方法の範囲内では、遊離CRFのレベルが、脳サンプル、 脳脊髄液あるいは他の身体の組織および体液のホモジネートに対する2-部位ELIS Aで測定され得る。総CRFはまず、以下のように定量される。ELISAプレートのウ ェルを抗-CRF抗体（例えば、プロテインG精製-ヒツジ抗-CRF）でコートする。プ レートを洗浄し、そして無関係なタンパク質（例えば、カゼイン、ウシ血清アル ブミン等）でプレート上の非結合部位をブロックする。調製した組織サンプルお よび既知の量のCRFを含む標準品をウェルに加え、そして室温で結合させる。結 合後、プレートを再度洗浄し、そして異なる抗-CRF抗体（例えば、RC-70、ウサ ギの抗-ヒトCRF抗体）を加える。RC-70は、異なる種から得られるだけではなく 、プレートをコートするのに用いたヒツジ抗CRF以外の異なるエピトープを検出 する。洗浄後、RC-70を検出する酵素接合抗体あるいはその等価物を加える。あ るいは、RC-70抗体が酵素と接合され得る。好適な接合物は、西洋ワサビペルオ キシダーゼおよびアルカリホスファターゼであるが、しかし当業者には、多くの 異なる、許容し得る代替物（酵素の代わりに放射ラベルを含む）が利用できるこ とが認識される。酵素基質が添加され、そして発色させる。反応終了後、吸光度 測定を用いて、組織サンプル中に存在する総CRF量を定量する。当業者にはモノ クローナル抗体または抗体フラグメントが、このアッセイにおいてポリクローナ ル抗体の代わりに使用され得ることが認識される。 同様な方法で、プレートを抗CRF-BP抗体でコートし、次いで、結合したCRFを 抗CRF抗体で検出するELISAにより、結合したCRFが定量され得る。結合したCRFは 、CRF-BPリガンドαらせんoCRF(9-41)によって特異的に置換され、検出されるシ グナルが減少する。αらせんoCRF(9-41)は、RC-70(抗CRF抗体)と交差反応しない ので、置換に用いられる。さらに、次いで、上清中の置換されたCRFは、上記の2 -部位ELISAでアッセイされ得る。次いで、遊離CRFは、次に総CRFと結合CRFの間 の差異を計算することによって、あるいは直接的アッセイにより測定され得る。 直接的アッセイにおいては、結合複合体を抗CRF-BPモノクローナル抗体によって 捕獲した後に、上清を取り、そして遊離CRFを上記の2-部位ELISAにおいて測定す る。 リガンドインヒビターであるαらせんヒツジCRF、が正常個体およびアルツハ イマー病患者の両方の脳組織中の遊離CRFレベルを上昇させることが、本明細書 に示されている。2-部位ELISAを用いて、総CRFおよび結合CRFの量を測定した。 αらせんヒツジCRFの添加により、すべての結合CRFが放出された（図２および実 施例５を参照のこと）。 組織あるいは脳脊髄液中の総CRF、結合CRFおよび遊離CRFの量を測定する記載 したインビトロアッセイに加えて、他の手順がインビボで行われ得る。これらに は、MRI、PETSCAN、分光走査(spectscanning)あるいはその他の類似の画像化技 術が含まれ、これらのうちのいくつかは、CRF-BPまたはCRFレセプターに対する 放射標識リガンドを用いる。好ましい方法は、PET陽電子射出(position-emittin g)リガンド（例えば、¹¹C、¹⁸F）または単光子放出リガンド（例えば、CRF-BPあ るいはCRFレセプターに対する¹²³I標識されたリガンド）を用いる画像解析であ る。遊離CRFレベルは、放射標識リガンドの結合量と相関する。遊離CRFレベルの 上昇は、CRF-BPおよびCRFレセプターに対する放射標識リガンドの結合の減少に より明らかになる。この画像化技術の範囲内では、約10〜30%またはそれ以上の 遊離CRFレベルの上昇が、本発明の関係においては、十分である。 本発明の関係においては、CRF/CRF-BP複合体のリガンドインヒビターの有効量 を投与を用いて、CRFレベルが減少している疾患または症候群の処置が行われ得 る。CRFレベルは、脳脊髄液においてまたは脳内で、画像化法によって直接、あ るいは他の方法（例えば、cAMP産生、ACTH放出または2-部位ELISA）によって、 測定され得る。このような疾患または症候群は以下を包含する：痴呆または学習 および記憶喪失の症状、肥満症、慢性疲労症候群、異型鬱病、分娩後鬱病、季節 性鬱病(seasonal depression)、甲状腺機能低下、外傷後ストレス症候群、ニコ チン禁断症状、炎症性疾患に対する感受性(vulnerability to inflammatory dis ease)。これらの症候群（肥満症、慢性疲労症候群、および炎症性疾患に対する 感受性を除く）の定義は、Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disor ders（第４版）、American Psychiatric Association，Washington，D.C.,1994 （以下、DSM-IV）に提供されている。学習と記憶の改善 上記のように、本発明は、CRF/CRF-BP複合体のリガンドインヒビターの治療的 有効量を患者に投与して学習および記憶を改善する方法を提供する。このような 患者は、痴呆、または学習および記憶喪失の症状に基づく臨床診断を通して同定 され得る。健忘的障害を有する個体は、新情報を学習する能力が損なわれている か、または以前に学習した情報または過去の事象を思い出せない。記憶欠損は、 自発的想起を必要とする課題において最も明らかであり、そしてまた試験者が個 人に後の時点で想起するように刺激を提供した場合に明らかである。記憶障害は 、社会的あるいは職業的機能の著しい欠陥を引き起こす程十分に重篤でなければ な らず、そして以前の機能レベルからの有意な変化を示さなければならない。 痴呆は、以前の機能レベルからの有意な変化を表す多数の臨床的に重要な認識 欠損により特徴付けられる。新しい題材を学習できないこと、または以前に学習 した題材を忘れることを含む記憶欠陥は、痴呆の診断をするのに必要とされる。 記憶は、正式には、個人に情報の記録、保持、想起および認識を質問することに より試験され得る。痴呆の診断はまた、以下の少なくとも一つの認識障害が必要 である：失語症、失行症、失認、あるいは実行機能の障害。それぞれ、言語、運 動動作、対象認識、および抽象的思考におけるこれらの欠損は、記憶欠損と関連 して職業的機能または社会的機能の欠陥を引き起こすために十分に重篤であるに 相違なく、そして以前のより高い機能レベルからの低下を示すに相違ない。 さらに、CRFのレベルと損なわれた学習および記憶との相関関係を示す多数の 生化学的試験が利用され得る。例えば、脳脊髄液中の遊離CRFのレベルが、ELISA あるいはRIAにより測定され得る。さらに、またはこのアッセイの代わりに、上 記のCRF-BPまたはCRFレセプターに特異的な標識リガンドを用いる脳の画像化を 用いて、遊離のレセプターあるいはCRF-BPを定量し得る。従って、遊離CRFが減 少したことを知ることができる。最後に、結合していないCRFに特異的なリガン ドを用いる脳の画像化は、脳中の遊離CRFの量を直接アッセイするために用いら れ得る。 患者のミニメンタル(minimental)状態が、学習および記憶のミニメンタル試験 で記録される。この試験は、患者が損なわれた学習および記憶を有するか否かを 決定するために臨床医により用いられる標準的な試験である(Folsteinら、J.Psy chiatric Res．12:185，1975)。この試験は、多数の簡単な課題と書面の質問を 含んでいる。例えば、「対連合子」の学習能力は、頭部の外傷、コルサコフ病， または卒中を患う患者を含むいくつかのタイプの健忘症患者において損われる(S quire,1987)。10組の無関係な言葉（例えば、軍隊知能検査表(army-table)）を 被験体に読ませる。次いで、被験体はそれぞれの組の第一の言葉を与えられたと きに第二言葉を思い出すために質問される。記憶欠陥の尺度は、対応コントロー ル群に対応する、思い出した対連合子の言葉の減少数である。これは、痴呆傾向 の障害または健忘障害の初期段階で急速に衰退する種類の短期作動記憶の指標と して供される。 学習と記憶の改善は、(a)プラセボ群のメンバーの作業と比較してリガンド-イ ンヒビター処置患者の作業との間の統計的に有意な差;または、(b)疾患モデルに 適切な尺度における正常性の方向への作業の統計的に有意な変化、のいずれかを 構成する。このストラテジーは、記憶の改善に治療的に有用なコリン作動性物質 の同定にうまく適用されている。疾患の動物モデルまたは臨床例は、定義によっ て正常のコントロールから区別できる症状を示す。従って、効果的な薬物療法の 尺度は、有意であるが、しかし必ずしも完全でない、症状の逆転である。記憶作 業の遂行を改善するように作用する臨床的に有効な「認識強化」薬剤によって、 記憶病理学の動物モデルおよびヒトモデルの両方において改善が促進され得る。 例えば、アルツハイマー型の痴呆および記憶喪失を患う患者における置換療法で コリン作動性物質として作用する認識エンハンサーは、対連合子課題のような範 例において、短期作動記憶を著しく改善する(DavidsonおよびStern，1991)。記 憶欠陥に対する治療的介入への他の潜在的な適用は、加齢マウスにおける最近の 記憶の長期的研究によって、効果的にモデル化される作業における加齢性欠損に より示唆されている(ForsterおよびLal,1992)。 動物において、学習および記憶のいくつかの樹立されたモデルを利用して、CR F-感受性ニューロンの活性化の有益な認識強化効果および潜在的な不安関連副作 用効果を検討する。認識強化効果は、モリス迷路(StewartおよびMorris、Behavi oral Neuroscience，R．Saghal編(IRL Press，1993)107頁)およびY迷路(Britsら 、Brain Res．Bull．6，71(1981))試験により測定される；不安関連効果は高架 式プラス迷路(elevated plus-maze)試験により評価される(Pellowら、J．Neuros ci．Meth．14:149，1985)。 モリス水迷路は、学習および記憶の最も有効なモデルの一つであり、そして種 々の薬理学的薬剤の認識強化効果に対して感度がよい(McNamaraおよびSkelton,B rain Res．Rev．18:33，1993)。迷路の中で行われる課題は、脳の海馬の操作に 対して、特に感度がよい。海馬は、動物における空間的学習およびヒトにおける 記憶強化にとって重要な脳の領域である。さらに、モリス水迷路行動における改 善は、化合物の認識エンハンサーとしての臨床的効力を予測させる。例えば、コ リンエステラーゼインヒビターまたは選択的ムスカリン様コリン作用性アゴニス トを用いる処置は、学習および記憶についてのモリス迷路動物モデル、ならびに 痴呆を有する臨床個体群における学習欠損を逆転する(MacNamaraおよびSkelton, 1993；DavidsonおよびStern,1991；McEnteeおよびCrook,1992；Dawsonら、1992) 。さらに、この動物範例は、加齢に伴う欠陥の増加程度（Levyら、1994）、およ び、予備試験の遅延または干渉に対する記憶痕跡の増加した感受性(vulnerabili ty)(StewartおよびMorris、1993)（これは健忘症患者の特徴である）を正確にモ デル化する。 この試験は、単純な空間的学習課題であり、ここでは、動物が粉ミルクの添加 により不透明であるぬるま湯の中に置かれる。動物は、迷路および試験部屋の中 に位置する視覚的な合図に関連するプラットホームの位置を学習する；この学習 を、場所学習という。 以下により詳細に述べる（実施例６参照）ように、1〜3日目のそれぞれの訓練 の15分前に、動物群に、コントロール溶液か、あるいは0.1、1、5、または25μg のリガンドインヒビターペプチドh/rCRF(6-33)またはh/rCRF（これは、そのうえ に、CRFレセプターにおけるアゴニストである）のICV注入を与える。非ペプチド インヒビターを用いる場合、注入量はそれに応じて調整される。コントロール動 物は典型的には、３日間の訓練後、５から10秒以内にプラットホームに到着する 。リガンドインヒビターの記憶調整効果の尺度は、この時間のシフトである。リ ガンドインヒビターの投与により、シナプスCRFの有効性における用量依存性増 加ならびに習得および記憶保持における行動の用量依存性増加となる。毎日の試 験前のh/rCRFおよびh/rCRF(6-33)の投与により、モリス水迷路試験で学習を有意 に強化した（図４、上のパネル）。学習と記憶の増加を生むためにはもう少し高 いCRF(6-33)の用量が必要であった。 視覚的弁別に基づくY迷路試験は、動物における学習および記憶の別のアッセ イである。この迷路では、迷路の２つのアームの末端が半透明のプラスチックパ ネルになっており、このパネルの後ろには40ワットの電球がある。スタートボッ クスは、第３のアームから手動のギロチンドアで分離されている。最初の試行で は、すべての動物に５分間迷路を探査させ、そして各アームでは食餌ペレットが 入手可能である。２日目には、それぞれの動物をドアを閉めたスタートボックス におく。ドアをあけると、動物はアームに沿って移動して、両方のアームに置い てある食餌ペレットを摂食することができる。第３日目には、３匹づつのグルー プで６回の試行を受ける。このとき、１つのアームは、選択ポイントで閉じられ ており、識別し得る刺激はなく、そして２つの食餌ペレットが、開いたゴールボ ックスで入手可能である。第4〜10日目には、食餌ペレットのあるアーム末端の ライトが照らされており、そして再び３匹づつのグループで10回の試行を行う。 動物が食餌ペレットに到達するために要する時間を記録する。 Y迷路における学習および記憶を改善するリガンドインヒビターの効果を以下 のように試験する。それぞれのブロックの第4〜10日目の訓練試行の15分前に、 動物群にコントロールか、あるいは1、5、または25μgのペプチドリガンドイン ヒビターのICV注入を行う。さらに、非ペプチドリガンドインヒビターを用いる 場合、用量はそれに応じて調整される。コントロール動物は、50％の正しい選択 をすると期待される。記憶に対する処置の効力の尺度は、正しい応答の増加であ る。毎日の試験前のCRF(6-33)リガンドインヒビターの投与により、正しい応答 の有意な増加が示された（図５）。 高架式プラス迷路試験は、接近回避状況における不安により生ずる応答(anxio genic response)を測定するが、この状況は、暗い閉鎖空間に対する開放された 光を照射する空間を含んでいる。両方の空間とも高所にあり、そしてプラスの記 号の形態で交差している２つの走路として組み立てられる。このタイプの接近回 避状況は、「情緒性」の古典的な試験であり、そして脱抑制およびストレスを生 み出す処置に非常に感度が高い。動物は迷路の中心に置かれ、そして５分間の試 験期間に全ての４つのアームに自由に出入りできる。それぞれのアームで過ごし た時間を記録する。 学習及び記憶を増加させる、ICV注入によるh/rCRFの用量の毎日の試験前の投 与はまた、これは高架式プラス迷路試験の結果により示されるように不安を生じ た（図４、下のパネル）。用量依存性の探査の抑制が観察された。このように、 記憶および学習の欠損（これは、CRFのレベルが減少することによる）の処置に 対するCRFレセプターアゴニスト（即ち、K_i≦1nM）の有用性は、これに伴う副作 用のために、あいまいな価値がある。著しく対照的に、リガンドインヒビターで あるCRF(6-33)（これは、CRFレセプターに対して低い親和性を有する）は、高架 式プラス迷路試験における不安の行動を変えなかった（図４、下のパネル）。さ らに、h/rCRFの投与で示されたような明白な行動の変化はなかった。これらのデ ータは、認識強化および不安効果が別々に制御され得ることを示す。これらのデ ータはまた、CRF/CRF-BP複合体のリガンドインヒビターを投与する治療的価値を 示す。 ヒトにおいて、学習および記憶を改善する方法は、ウェックスラー記憶スケー ルまたは対連合子記憶課題のような試験によって測定され得る。ウェックスラー 記憶スケールは、認識機能および記憶容量の、広く用いられている鉛筆と紙の試 験である。正常な個体群では、標準検査は平均100および標準偏差15を得る。そ のため、軽度の健忘症では、この点数が10〜15点減少することで検出され得、よ り重度の健忘症では、20〜30点減少する、等である(Squire,1987)。臨床面接の 間に、ミニメンタル試験、ウェックスラー記憶スケール、あるいは、対連合子学 習を含むが、これらに限定されない一連の試験が症候性記憶喪失の診断に適用さ れる。これらの試験は、一般的な認識欠陥および学習/記憶容量の特定の損失の 両方に一般的な感度を提供する(Squire,1987)。痴呆症あるいは健忘障害の特定 の診断とは別に、これらの臨床器具はまた、加齢性関連の認識低下を同定する。 この認識低下は、その人の年齢に与えられる正常な制限内にある加齢プロセスの 結果として起こる精神機能における他覚的な低下を反映する(DSM IV,1994)。上 記のように、学習および記憶における「改善」は、例えば、リガンドインヒビタ ー処置患者とプラセボ群のメンバーとの行動間で、または同じ患者に与えられる 連続する試験間で、統計学的有意差が対連合子試験において正常性の方向に存在 すれば、本発明の範囲内にある。減少する食物摂取 上記のように、本発明は、CRF/CRF-BP複合体のリガンドインヒビターの治療的 有効量を患者に投与することを介して、食物摂取を低減させる方法を提供する。 このような患者は、肥満であることにより同定され得る。肥満個体は、その人の 年齢、性別、および身長について正常と考えられる目標体重より重く、そして客 観的に、同じ参照個体群の百分位数の85番目またはそれ以上の体重指数(BMI-体 重(Kg)/身長(ｍ)²として計算される)により同定され得る(National Center for Health Statistics，“Obese and Overweight Adults in the United States.” 第11集，第BO集，U.S．Government Printing Office，Washington D.C.,1983)。 さらに、特定の個人にCRFが関与する証拠は、脳脊髄液中のCRFレベルの減少を示 すことによって、または上記の脳画像化によって、得られ得る。視床下部は、食 物摂取および内分泌パラメターに対するCRFの効果を媒介する共通の脳領域であ るので、下垂体ホルモン濃度の変化もまた、視床下部CRFのレベルの変化を反映 し得る。 食物摂取の減少は、食事開始の遅延および食物消費の継続時間または量の全体 の減少により測定され得る。Smith、「Satiety and Problem of Motivation,」 、D.W.Pfaff(編)、The Physiological Mechanisms of Motivation，Springer-Ve rlag，New York，133-143頁，1982。さらに、食物選択状況下の特定栄養の選択 は、特定の空腹の補足的な尺度として役に立つ(Rozin，Adv．Study Behav．6:21 ，1976)。 食欲調節の２つの樹立動物モデルがある。第１は、単純な食物摂取の測定であ り、そして第２は、カフェテリア環境下での食物の自己選択の測定である。第１ の方法では、食物摂取は24時間制限され、次いで、動物の家庭用ケージ内の予め 重量を測定した実験食物に２時間、アクセスさせる。食物摂取は、60分と120分 に、残りのペレットを計量することにより測定される。これらの試験はまた、遺 伝的変異による肥満動物にも行われ得、そしてこれは、過食および混乱した栄養 ingら、Endocrinol．132:1939，1993)。 カフェテリア環境において、食物を、多量養素(例えば、炭水化物、タンパク 質、および脂肪)の異なる割合で特別に処方し、感覚的誘因性または食物摂取後 の利益に基づく特定の栄養素に対する嗜好を測定できるようにした。食物の選択 は、広い種類の神経化学的システムによって、一部、変化する。これらの試験は 、食物摂取調節の微妙な変化の検出に有用である。食物摂取調節は、熱望あるい は 空騒ぎのような現象に強く影響し、そして摂取障害(例えば、神経性食欲不振お よび肥満症)の診断に関連している。動物のベースラインを確立した後、それぞ れの動物は、試験の15分前にコントロール溶液か、あるいは1、5、または25μg の用量のペプチドリガンドインヒビター、あるいは適切な用量の非ペプチドリガ ンドインヒビターのICV注入を受ける。食物の摂取は、摂取試験でまたはカフェ テリア環境下での食物の自己選択で記載したように測定され、そして試験結果は ベースラインと比較される。 ヒトにおいては、肥満症は過食に関連するだけではなく、甘味食物あるいは脂 肪性食物の不釣り合いな大量摂取などの栄養的に不均衡な食物の消費にも関連し 得る。(Drewnowskiら、Am．J．Clin．Nutr．46:442，1987)。このように食事調 節の臨床的発現は、制御された実験食物、または量、食事時間および選択の見地 から摂取パターンを記録するカフェテリア自己選択プロトコールを用いることに より、容易に検出される。(Kissileff，Neurosci．Biobehav．Rev．8:129，1984 )。これらの試験では、個体それぞれのベースラインの決定後、食物摂取または カフェテリア環境下の自己選択の測定が測定される。肥満症処置に関連する改善 は、プラセボ群のメンバーと比較して処置患者により表される、体重の減少また は食物摂取の減少を構成する。さらに、このストラテジーは、肥満症に対するセ ロトニン作用性のアゴニストの同定に成功している。低レベルCRFに関連する疾患 上述したように、本発明は、CRF／CRF-BP複合体のリガンドインヒビターを治 療有効量で患者に投与することによって低レベルCRFに関わる疾患を治療するた めの方法を提供する。このような患者は、摂取障害、神経内分泌障害およびアル ツハイマー病などの認知障害の診断により同定することができる。さらに、異形 鬱病、季節性鬱病、慢性疲労症候群、肥満症、炎症疾患に対する脆弱性、心的外 傷後ストレス障害、精神刺激剤禁断症状などのCRFレベルの減少に伴うその他の 病態により、甲状腺機能不全症のプロフィールおよびストレス系活性の低下が現 れることが多い。これらは、尿遊離コルチゾールおよび血漿ACTHの減少によって 特徴的に同定される。このため、これらの疾患および病態は、脳内CRFレベルの 修復または効力によって一部は解決されると思われる(ChrousosおよびGold，JAM A 267:1244，1992)。 このようなヒトにおける様々な疾患状態は、脳内CRFの乱れ(derangement)を伴 うと考えられる下垂体-副腎軸の調節異常(dysregulation)によって同定される。 したがって、CRF／下垂体-副腎系を実験動物において実験的に変化させることに より、上述した症候群、すなわち行動上の自暴自棄(despair)(Pepinら、1992)、 運動に対する倦怠感(RivestおよびRichard，1990)、肥満症(Rothwell，1989)お よび精神刺激剤禁断症状に関連している過喚起症(hyperarousal)(Koobら、1993; Swerdlowら、1991)の主な特徴が再現されるという事実は、内因性CRFレベルを 正常化するよう設計された薬物治療の広範な実用性を示唆する。 季節性鬱病(季節パターンを有する重症鬱病性障害)の主な特徴は、１年のうち の特徴的な時期での重症鬱病症状の発症の開始および緩解である。ほとんどの症 例において、発症は秋または冬に始まり、春には緩解する。季節パターンで起こ る重症鬱病発症は、顕著なアネルギー、睡眠過剰、過食、体重増加および炭水化 物に対する渇望によって特徴付けられることが多く、少なくとも2週間持続する 。この間は、殆ど全ての活動において憂鬱な気分になるかまたは興味や歓びが失 われる。 心的外傷後ストレス障害の主な特徴は、実際の死または瀕死の状態あるいは個 体自身または他人の肉体的な完全性に対する重篤な傷害を包含する事象に対する 直接的な個人経験を包含する極端な心的外傷ストレッサーに曝された後に、特徴 的な症状が発症することである。この事象に対する個人応答には、強烈な怖れ、 無力感、または恐怖が含まれている。払っても消えない記憶または悪夢として外 傷性事象を再び経験し、これがきっかけとなって強烈な心理学的窮迫または生理 学的反応が引き起こされる。１ヶ月を超える期間にわたって完全な症状状態が存 在し、臨床的に顕著な窮迫あるいは社会的橙能または職業上の機能に欠陥が引き 起こされる。 ニコチン禁断症状(ニコチン誘導性障害)の主な特徴は、長期間(少なくとも数 週間)ニコチンを含有している製品を使用し、その使用を急に中止または使用回 数を少なくした後に発症する特徴的な禁断症状症候群が存在することである。ニ コチン禁断症状と診断されるには、精神不安または憂鬱な気分、不眠症、癇癪ま たは怒り、不安、集中不可、落ち着きがなくなるまたは短気になる、心拍数の減 少および食欲増進または体重増加のうち4つ以上が当てはまることが必要である 。これらの症状は、臨床的に顕著な窮迫あるいは社会的機能または職業上の機能 の欠陥を引き起こす。 改善は、(a)疾患モデルに関連する尺度に基づいてベースラインまたは治療前 の状態と比較した、治療した個体の症状の統計的に有意な変化または、(b)リガ ンドインヒビターで治療した患者とプラセボ群のメンバーとの統計的に有意な症 状の差異のいずれかからなる。疾患の臨床例には、定義により、正常なコントロ ールとは区別される症状が見られる。鬱病については、いくつかの鬱病評価スケ ールが使用される。(Klermanら、Clinical Evaluation of Psychotropic Drugs: Principles and Guidelines，PrienおよびRobinson(編)，Raven Press，Ltd., New York，1994を参照のこと)。鬱病の評価には、ハミルトンの鬱病評価スケー ル(Hamilton Rating Scale for Depression)というテストが広く用いられている 。このテストは、処置応答における症状の変化を評価するのにも使用されている 。その他のテストや評価については、DSM-IVマニュアルに記載されている。ニコ チン禁断症状およびその他の障害については、障害の重篤度の評価用のテストが DSM-IVマニュアルに記載されている。アルツハイマー病 上述したように、本発明は、CRF／CRF-BP複合体のリガンドインヒビターを治 療有効量で患者に投与することによってアルツハイマー病を処置するための方法 を提供する。他の原因には起因しない痴呆または学習能喪失および記憶喪失の症 状に基づいて、臨床的に診断することによりこのような患者は同定される。さら に、核磁気共鳴映像法による脳萎縮の診断により患者であると同定することもで きる。 CRFレベル減少はアルツハイマー病に関与することが分かっている。ADに罹患 した10の個体および神経学的に正常な10のコントロールから死後に得た脳を研究 用に選択した。大脳前頭極、頭頂極、大脳側頭極および大脳後頭極の標準的な領 域を新鮮な脳から切断し、ドライアイス中で凍結し、-70℃で保存した後、CRPラ ジオイムノアッセイおよびCRF-BPアッセイによって処理した。大脳皮質および海 馬のホルマリン固定試料をパラフィン中に埋め、続いて切片にしてヘマトキシリ ン／エオシンおよび銀浸漬によって染色した。AD患者の脳から得た染色切片を試 験したところ、ADに典型的な大量の神経炎プラークおよび神経細線維のもつれが 示されたが、コントロール患者では何も示されなかった。 アルツハイマー患者およびコントロールの大脳皮質におけるCRFおよびCRF-BP のレベルを測定した。ラットの脳、ヒツジの脳およびヒトの血漿においてCRF-BP を予め同定して特徴付けした。ここで研究した脳の大脳皮質では、CRF-BPの大部 分(>85%)が膜と結合していた。コントロールまたはAD患者のヒト脳膜のいずれか からの可溶化させたCRF-BPの薬理学的な特徴は、可溶性血漿CRF-BPの組換え形態 と比較して、CRFおよびリガンドインヒビターに対する結合特性に何ら差異はな いことが分かった。アルツハイマー患者の脳において、前頭、頭頂および側頭の 大脳皮質におけるCRFレベルは正常な脳と比較すると大幅に減少したが、後頭皮 質におけるレベルは僅かに減少したのみであった(図3A)。これとは対照的に、CR F-BPレベルは、AD患者の脳と正常なコントロールの脳とで類似していた(図3B)。 これらのデータは、正常な脳組織およびAD脳組織にCRF-BPが存在しているという 直接的な証拠となり、そしてADにおいて認められたCRFレベルの低下はニューロ ンの喪失によるものではなく、CRFの合成量の減少または分解量の増加に起因し 得ることを示唆する。ADにおいてニューロンが喪失されると、CRF-BPは非CRFニ ューロンに対して優先的に局在定位され得る。 CRF-BPに対する複合体化したCRFの比率を脳組織およびフリープール(free poo l)で測定することによって、ヒトの脳組織におけるCRFとCRF-BPとの相互作用の 性質を決定した。総CRFおよび結合CRFに特異的なアッセイを使用したところ、正 常大脳皮質抽出物では総CRFの約40%、アルツハイマー大脳皮質抽出物では総CRF の約60%がCRF-BPと複合体化されていることが分かった。さらに、CRFはCRF-BPに 可逆的に結合していた。なぜならヒトCRF(6-33)またはα-らせんoCRF(9-41)で組 織を処理すると、CRF/CRF-BP複合体からCRFが追い出されたからである(図2)。こ れらのデータから、CRF-BPリガンドインヒビターはCRFの遊離濃度を増加させる ということが直接的に示される。さらに、CRF-BPインヒビターで処理することに よって、正常な脳における遊離CRFレベルに対してAD脳における遊離CRFレベルは 上昇した。 コリン作動性低下に的を絞って確立された何例かのアルツハイマー病動物モデ ルが利用可能である。コリン作動性低下のADにおける主な役割は十分に確立され ている。ADでは、前頭葉、後頭葉および側頭葉におけるコリンアセチルトランス フェラーゼ活性の減少とCRFレベルの減少との間に有意な正相関が認められる(De Souzaら、1986)。同様に、これら3カ所の皮質(Id)においてコリンアセチルトラ ンスフェラーゼ活性の減少とCRFレセプター数の増加との間には負相関が認めら れる。その他2つの神経変性疾患では、パーキンソン病でCRFとコリンアセチルト ランスフェラーゼ活性との間に極めて有意な相関が認められるが、進行性核上麻 痺における相関はわずかしかない(Whitehouseら、1987)。 ラットにおける解剖学的研究および行動上の研究から、CRFとコリン作動系と の間の相互作用が証明される。第1に、いくつかの脳幹核において、CRFとアセチ ルコリンエステラーゼは共に局在化され、そしてコリン作動性ニューロンの中に はCRFを含有しているものもある。第2に、CRFはカルバコール誘導性挙動(カルバ コールはムスカリン性コリン作動性レセプターのアンタゴニストである)を阻害 し、このことからCRFはコリン作動系に影響を及ぼすことが示唆される(Crawley ら、Peptides 6:891，1985)。もう1つのムスカリン性コリン作動性レセプターの アンタゴニストであるアトロピンての処置は、CRFレセプターの増加をもたらす( DeSouzaおよびBartaglia，Brain Res．397-401，1986)。総合すると、これらの データからCRFとコリン作動系とはヒトおよび動物において同様に相互作用する ということがわかる。 スコポラミンは、アセチルコリンによるシナプス後部レセプターの刺激をブロ ックする非選択性シナプス後部ムスカリン性レセプターのアンタゴニストである 。スコポラミンを投与することによって、コリン作動性低下に的を絞ったアルツ ハイマー病の動物モデルを得る。これらの動物において、受動的回避または遅延 適合対位置(delayed-matching-to-position)テストによる測定により記憶喪失が 容易に明らかになる。これらのテストによって、実験処置の運動性低下または知 覚 低下と健忘症または認識増強効果とは区別される。このように、スコポラミン誘 導性健忘症後にMorris迷路テストおよびY迷路テストを使用して、記憶力低下お よびその後のリガンドインヒビター投与後の記憶力増強度をテストする。Morris 迷路では、本質的に上述したように実験を設計するが、1〜3日目は毎日トレーニ ング30分前にスコポラミン臭化水素酸をip注射して処置する(0.3 mg/kg)ように 修正する。スコポラミンが健忘症用量になると、ラットにおける空間学習パラダ イムおよび回避学習パラダイムの獲得および保持に障害を及ぼす。ペプチドリガ ンドインヒビター1μg、5μgまたは25μgあるいは適切な用量の非ペプチドリガ ンドインヒビターの抗健忘症効果は、スコポラミンを与えられたまたは与えられ ていない同時並行コントロール群に比較して測定される。Y迷路を使用するスコ ポラミン誘導性健忘症の可逆性に対するリガンドインヒビターの評価は、上述し たY迷路テストと同様に行われる。5〜10日目は、毎日トレーニングの30分前にス コポラミン臭化水素酸をip注射して処置する(0.3 mg/kg)ようにテストを修正す る。1μg、5μgまたは25μgのICV投与されたペプチドリガンドインヒビターある いは中枢神経投与または全身投与された等用量の非ペプチドリガンドインヒビタ ーの抗健忘症効果は、同時並行コントロールおよびスコポラミン処置コントロー ル群と比較して測定される。 ADにおける認知挙動を測定するいくつかのテスト設計がされている。(Gershon ら、Clinical Evaluation of Psychotropic Drugs: Principles and Guidelines , PrienおよびRobinson(編)，Raven Press，Ltd.，New York，1994，p．467を参 照のこと。)これらのテストのうちの1つであるBCRSでは、集中力、記銘力、過去 の記憶、順応性、機能性およびセルフケアを測定する。BCRSは認知機能のみを測 定するよう設計されている。このテストおよびウェシュラー記憶スケール(Wesch ler Memory Scale)およびアルツハイマー病関連スケール(Alzheimer's Disease- Associated-Scale)を使用して、リガンド阻害による治療処置後の改善を測定し 得る。上述したように、ウェシュラー記憶スケールテストにおいて、例えばリガ ンドインヒビター処置患者とプラセボ群のメンバーとの行動を比較した場合、ま たは同一の患者に対してなされるその後のテスト間で、正常性に統計的に有意な 差異が認められる場合、アルツハイマー病における「改善」は本発明の意図する 改善とされる。さらに、ヒトにおけるスコポラミン誘導性健忘症をモデル系とし て使用してリガンドインヒビターの有効性をテストし得る。リガンドインヒビターの投与 本明細書中で使用される用語「薬学的に受容可能な」、「生理学的に許容可能 な」およびこれらの文法上の変形は、組成物、キャリア、希釈液および薬剤を指 す場合には互換的に用いられるものとする。好ましくは、これらの物質は、吐気 、目眩感、胃の不調などの望ましくない生理学的効果を生じることなく哺乳動物 に投与し得る。 CRF/CRF-BP複合体のリガンドインヒビターを治療有効量で患者に投与する。治 療有効量とは、脳の遊離CRFレベルを増加させる、学習および記憶力を改善する 、食物摂取を減少させる、脳のCRF神経回路系を活性化する、脳の低CRFレベルに 関わる疾患を治療する、アルツハイマー病に関する症状を治療する、肥満を治療 する、異形鬱病を治療する、薬物乱用禁断症状を治療する、分娩後鬱病または加 齢性記憶喪失を治療する、のいずれかの所望の効果を達成するために算出された 量である。特定の治療により、そしてペプチドリガンドインヒビターまたは非ペ プチドリガンドインヒビターのいずれを投与するかにより、投与経路が変わり得 ることは当業者には明らかである。投与経路は非観血的であっても観血的であっ てもよい。非観血的な投与経路としては、経口、頬／舌下、直腸、鼻、局部(経 皮および眼を含む)、膣、膀胱内および肺などが挙げられる。観血的な投与経路 としては、ICV、動脈内、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、クモ膜下腔内 および眼内が挙げられる。 動物において以下のように脳室内(ICV)注射を実施する。ハロタンで動物を麻 酔し、KOPF***に固定する。ステンレス鋼製の2つのねじと歯科用セメントに よって、側脳室上に的をあてたガイドカニューレを頭蓋に移植して固定する。注 射のために、60cmのPE 10チューブに取り付けた30ゲージのステンレス鋼製カニ ューレを、先端から1mm出るところまでガイドを介して挿入する。流れが生じる まで単にチューブを動物の頭より高く上げることで、重力流によって1分間かけ て2マイクロリットのリガンドインヒビタールを注射する。その他の投与経路に ついての手順は当該分野において周知である。 特定の処置および投与経路によって必要な用量は変化し得る。一般に、ペプチ ドリガンドインヒビターの用量は、脳組織1.5gあたり約50〜125μgすなわち組織 1.5gあたり15〜38nmolの最終濃度が得られるような量とする。しかしながら、タ ンパク質またはポリペプチドの大きさに応じて、比較的大用量または少用量にす ることもできる。これらの処置を1週間に2、3回実施する。治療効果を維持する ために処置を連続的なものとすることが必要になる場合もある。上述したように 画像化することによって大脳脊髄液または脳におけるCRFレベルを評価すること によって患者をモニタリングする。さらに、各処置について説明したように様々 なテスト下での行動を評価することによって患者をモニタリングする。 治療投与は医師の指導下で行い、そして薬学的組成物は薬学的に受容可能なキ ャリア中にリガンドインヒビターを含有する。これらのキャリアは当該分野にお いて周知であり、代表的には非毒性塩および緩衝液を含有する。このようなキャ リアは、生理学的に緩衝化された生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水などの緩 衝液、グルコース、マンノース、スクロース、マンニトールまたはデキストラン のような炭水化物、グリシンなどのアミノ酸、酸化防止剤、EDTAまたはグルタチ オンなどのキレート剤、アジュバントおよび保存剤を含有し得る。受容可能な非 毒性塩としては、酸添加塩または例えば亜鉛、鉄、カルシウム、バリウム、マグ ネシウム、アルミニウムなどとの金属錯体(本発明の目的では添加塩として考え られる)が挙げられる。このような酸添加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸 塩、硫酸塩、リン酸塩、タンニン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩 、アルギン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩 、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などが挙げられる。活性成分を錠剤 形態で投与する場合、錠剤は、トラガカント、コーンスターチまたはゼラチンの ような結合剤；アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑 剤を含有す得る。液体形態での投与が望ましい場合には、甘味料および／または 香料を使用し得、等張生理食塩水、リン酸緩衝液中での静脈内投与も有効であり 得る。 医師の指導下で投与されるペプチドは、通常はリガンドインヒビターおよび従 来の薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物の形態である。通常、 投薬量は1日あたり宿主動物の体重1kgあたりペプチド約1〜約1000マイクログラ ムであり、多くの場合には約100μgと約1mgとの間であるが、最大約10mgまで変 化させ得る。これらのペプチドでの被験体の処置を実施して、症状を軽減したり 、アルツハイマー病患者および慢性疲労症候群患者に起こる比較的低い周囲CRF レベルの特徴である有害な症状の発現を矯正することが可能である。前者の場合 、処置によって短期記憶および中期記憶が改善される。しかしながら、食欲抑制 を包含するこれらの徴候の多くについては脳にペプチドを送達する必要があり、 好ましくはこのペプチドと血液-脳関門を透過することのできる薬剤とを結合さ せる。静脈内、筋肉内または皮下注射による投与によってコルチゾールレベルが 高まり、疲労を軽減し得る。これらのリガンドインヒビターでの被験体の処置を 実施して、脳に達する投与によって遊離CRFの生物学的有効濃度を急激に上昇さ せ、ヒトの呼吸系を刺激することも可能である。物質または病理学的な薬剤によ る心臓血管停止およびショックなどの医療上の救急時における状態での処置のた めに、静脈内、筋肉内または皮下注射で投与することによってコルチゾールレベ ルを上昇させ得る。妊娠時に分娩を促進するために、必要に応じてhCRF(または そのアナログ)をさらに含むリガンドインヒビターを投与して血漿中の遊離hCRF 濃度を少なくとも約250pmole/l、好ましくは少なくとも約0.1ng/mlまで高めるこ とができる。また、コルチゾール濃度が低いことの多いAIDS罹患患者に同様に投 与し得、その結果、このようなCRF-BPブロック剤(blocker)によってACTHおよび コルチゾールを上昇させ得る。 CRFまたはCRFのアゴニストと共に薬剤を投与する場合、このようなCRFペプチ ドは、宿主動物の体重1kgあたりCRFペプチド約1〜約200マイクログラムの日用量 で投与し得る。適切なCRFのアゴニストの例として、米国特許第4,415,558号、第 4,489,163号、第4,594,329号、第5,112,809号、第5,235,036号および第5,278,14 6号（これらの開示は、本明細書中に参考として援用する）に記載されているよ うなアゴニストが挙げられる。CRFのアンタゴニストと共に試薬を投与する場合 、このCRFのアンタゴニストは、宿主動物の体重1kgあたりペプチドが約0.01〜約 10mgとなる量で投与し得る。適切なCRFのアンタゴニストとして、米国特許第4,6 05, 642号、5,109,111号および5,245,009号（これらの開示は、本明細書中に参考と して援用する）に開示されているようなアンタゴニストが挙げられる。好ましい CRFのアンタゴニストとしては、[D-Phe¹²，N^21,38]-hCRF(12-41)および[D-Phe¹² ，Nle^21,38，CML³⁷]-hCRF(1241)が挙げられる。好ましいCRFのアゴニストとして は、[His²⁰，Nle²¹，Leu³⁸]-hCRF、[D-Phe¹²，Nle^21,38，Leu³⁶]-hCRF、[D-Pro⁴ ，D-Phe¹²，Asp²⁵，Nle^21,38]-hCRFおよび[D-Pro⁴，D-Phe¹²，Nle^21,38，CML³⁷] -hCRFが挙げられる。 以下の実施例は例示のためのものであり、限定されるものではない。 実施例1 CRF-BR からCRFを追い出すリガンドインヒビターの能力を アッセイするためのリガンド-免疫放射線アッセイ(LIRMA) 600μlのポリプロピレン遠心チューブまたは96ウェルプレートにおいてアッセ イを実施する。まず、50μlの精製組換えCRF-BP(250ng/ml)を150μlのPBS結合緩 衝液(50mMリン酸ナトリウム、0.15M NaClおよび0.02%NP-40)に添加する。次に、¹²⁵ I-h/r CRFを最終濃度200pMになるように添加し、そして10〜100μM濃度のリ ガンドインヒビター50μlを添加して室温にて1時間インキュベートする。反応に 対し、アッセイ緩衝液て1:1000に希釈した50μlの抗CRF-BP抗体5144を各チュー ブに添加し、さらに1時間室温にて結合させる。アッセイ緩衝液で全チューブの 総容量を300μlに調節する。1%正常ウサギ血清、4%PEG、50mMリン酸ナトリウム 、0.1%アジ化ナトリウム中の沈澱したヤギ抗ウサギ(GAR)二次抗体(20：１)を添 加することによって結合複合体を沈澱させた後、室温にて1時間インキュベート する。次に、Beckman GS-15R遠心機にて4℃で20分間遠心分離(3000×g)すること によって抗体結合¹²⁵I-CRF沈澱物を回収する。Beckman Biomer 1000ロボットワ ークステーションを使用することによって、チューブを吸引し、PBSおよび0.02% NP-40(600μl)で1回洗浄する。次に、ペレットを含むチューブを12×74mmの計 数チューブに移し、γカウンタで計数する。 Munsonら、Anal．Biochem．107:220，1980のLIGANDコンピュータプログラムお よびVax/VMSコンピュータシステムで算出されたパラメータを使用して、阻害結 合親和定数(Ki)値を測定する。誤差は、３連の結合アッセイの平均標準誤差を表 す。 実施例2 CRF のCRF-BRからのリガンドインヒビターの追い出しをアッセイするためのデタ ージェント相分離 200ng/mlのヒト組換えCRF-BPを放射線標識¹²⁵I-h/r CRF(80pM)と一緒に結合緩 衝液(リン酸緩衝塩水、pH7.4/0.02% NP-40)中にて室温で2時間インキュベートす る。インキュベート後、アッセイ緩衝液オクチルフェノキシポリエトキシエタノ ール(octylphenoxypolyethoxyethanol)(SIGMA)中のTriton X-114^TMの1:10希釈液 を添加することによって結合CRFおよび遊離CRFを分離する。Triton X-114^TMは室 温では水に不溶であり、水溶液中ではデタージェント相に分離される。Triton X -114^TMを添加した後、チューブをボルテックスで撹拌し、速やかに12,000×gで5 分間室温にて遠心分離を行う。デタージェント相はチューブの底に認められ、水 相は上に残ったままである。両親媒性αらせんとしてのCRFは分離してデタージ ェント相になる。しかしながら、CRFがCRF-BPと結合している場合には、CRF/CRF -BP複合体は水相に残る。したがって、水性相のアリコート50μlを12×74mmのプ ラスチックチューブに移して計数する。上清に残った放射線活性の量を測定する 。 実施例3 遊離CRFのACTH放出アッセイ 4匹のラットを断頭して屠殺し、下垂体前葉を取り出す。この下垂体前葉を滅 菌HEPES緩衝液で6回洗浄し、20mlのコラゲナーゼ溶液(4mg/ml)に移す。次に、コ ラゲナーゼ中の下垂体を25mlのBellco分散フラスコに移し、37℃で30分間攪拌す る。30分後、10mlのピペットで下垂体を吸い出すことによって下垂体細胞懸濁物 を粉砕し、さらに30分間インキュベートした後にさらに粉砕する。細胞懸濁物を さらに45分間インキュベートし、部分的に分散した細胞を50mlの減菌チューブに 移し、4000rpmで4分間遠心分離する。細胞ペレットを10mlのノイラミニダーゼ(8 μg/ml)中にて再構成し、ボルテックスする。懸濁物を、9分間水浴中におき、再 度4分間ボルテックスにして再度遠心分離する。上清を注ぎ出し、BBM-P(BBM-T 2 50mlプラス2%ウシ胎仔血清5ml)25ml中でボルテックスにすることによって細胞ペ レットを再構成する。遠心分離によって細胞を収集し、最後に懸濁物をBBM-P 22 ml中で再構成する。次に、48ウェルプレート中に50〜100,000／ウェルの密度で 細胞をプレートし、加湿CO₂チャンバ内にて2日間インキュベートする。アッセイ 当日、細胞を、種々の関連類似物での刺激のためにBBM-Tで1回洗浄する。 ブロッキング濃度のCRF-BP(5nM)の存在下および非存在下で最大刺激容量のh/r CRF(1nM)で細胞を刺激する。この濃度のCRF-BPは、h/rCRFに結合することにより 下垂体細胞から放出されるACTHの量を減らす。この減少量は、CRF-BPの非存在下 で1nM CRFによって放出されるACTHの量の分数として表される。h/rCRF(1nM)と結 合しているCRF-BP(5nM)を、ある濃度範囲のリガンドインヒビター(例えばCRF-BP リガンドh/rCRF(6〜33)の一般的な濃度は、0.1〜1000nMである)とともにインキ ュベートする。リガンドインヒビターはCRF-BPと結合し、そして複合体をCRFに 置き換える。これによって、CRF-BPによるh/rCRF誘導されたACTH分泌の阻害の可 逆性は用量依存になる。CRF-BPリガンドの効力は、1nM CRF単独での刺激によっ て得られるACTH放出の分数として表される。 実施例4 遊離CRFを測定するためのcAMP産生アッセイ CRF刺激アデニル酸シクラーゼ活性を検出するためのアッセイを、わずかな修 正を加えた以外は上述した(Battaglia ら、.，1987)ように実施する。標準アッ セイ混合物は、DMEM緩衝液中に2mM L-グルタミン、20mM HEPES、1mM IBMX(イソ ブチルメチルキサンチン(isobutylmethyl xanthine))を含有する。刺激研究にお いて、CRFレセプターをコード化するクローンでトランスフェクトされた細胞を 、24ウェルプレートにプレートし、種々の濃度のCRF関連ペプチドおよびCRF非関 連ペプチドとともに37℃で1時間インキュベートする。インキュベーションの後 、培地を吸引し、新鮮な培地でウェルを穏やかに1回洗浄し、吸引する。95%エタ ノールおよび20mM HClの溶液300μl中で20℃にて16〜18時間細胞を溶解した後に 細胞内cAMPの量を測定する。ライゼートを1.5mlのEppendorfチューブに移し、ウ ェルをさらに200μlのEtOH/HClでウェルを洗浄し、そして洗浄物をライゼートと 一 緒にプールする。ライゼートを凍結乾燥させ、pH6.2の酢酸ナトリウム緩衝液500 μlに再懸濁し、cAMPを、Biomedical Technologies Inc.(Stoughton，MA)由来の 単一抗体キットで測定する。CRFレセプターアンタゴニストの機能を評価するた めに、cAMP生成を80%刺激する単一濃度のCRFまたは関連のペプチドを、種々の濃 度(10^-12〜10^-6M)の競合組成物とともにインキュベートする。cAMPに関するイン キュベーション条件および測定条件を上述したように実行する。 実施例5 CRF 濃度を測定するための２部位ELISA A．脳組織試料の調製 剖検試料を秤量し、10%スクロース5ml中で均質化した。各試料1mlを室温にて1 0分間10,000×gで遠心分離し、これによって得られた膜ペレットをSPEA(0.25%ウ シ血清アルブミン(BSA)および1%NP-40を含有する50mMリン酸ナトリウム、pH7.4 、0.1M NaCl、25mM EDTA、0.1％アジ化ナトリウム)で再構成した。TTBS(0.5% Tw een-20、1% NP-40、1% BSAを有するTris緩衝化生理食塩水)200μlを添加するこ とによって大脳皮質ホモジネート(10%スクロース中)800μlをさらに抽出し、1分 間ボルテックスした。試料を室温にて10分間10,000×ｇで遠心分離した。上記の ようにして得られた上清を、２部位CRF ELISAを用いる「全CRF」「結合CRF」(す なわち、CRF-BPに結合したCRF)および「遊離CRF」の分析のために保存した。 B．全CRFの測定 簡単に説明すると、ELISAプレートを、37℃で2時間、pH9.5の50mM炭酸水素ナ トリウム緩衝液中に希釈したタンパク質G精製ヒツジ抗CRF抗体(20μg/ml)で被覆 した。プレートをTTBSで1回洗浄し、TBS中の1%カゼインで室温にて1時間ブロッ クした。100μlの試料またはスタンダードを各ウェルに添加し、室温で結合させ た。TTBSでプレートを5回洗浄した。RC-70ウサギ抗ヒトCRF抗体(TTBS/1%BSA中に 1:1000に希釈)を添加した。室温にて1時間インキュベーションの後、プレートを TTBS緩衝液で5回洗浄し、次にプレートを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ 抗ウサギ(GAR)二次抗体に室温にて1時間曝露した。プレートを、最後にTTBSで5 回洗浄し、TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質溶液(Kikegaard and Perry Laboratories，Inc.)100μlの添加により発色させた。450nMでの吸光度を測定し た。 C．結合CRFの測定 抗ヒトCRF-BPモノクローナル抗体(pH9.5の50mM炭酸水素ナトリウム緩衝液中の 抗体5μg/ml)で予め被覆したウェルにおけるCRF/CRF-BP複合体の捕捉によって結 合CRFを測定した後、本質的に全CRF ELISAについて上述したようにしてRC-70抗 ヒトCRF抗体で結合CRFを検出した。 D．遊離CRFの測定 抗CRF-BPモノクローナル抗体によって結合複合体を捕捉した後、上清において 遊離CRFを測定する。試料物質の結合の後、上清をプロテインG精製ヒツジ抗CRF 抗体で被覆した新たなELISAプレートに移す。次に上述したようにしてアッセイ を実施して全CRFレベルを測定する。 実施例6 リガンドインヒビターのスクリーニング 候補リガンドインヒビターを、CRF/CRF-BP複合体をCRFに置き換える能力につ いて、スクリーニングし得る。培養下垂体細胞からのACTH放出(実施例2参照)ま たは２部位LIMRA(実施例1参照)などの適切なアッセイを使用して、それぞれ遊離 CRF濃度およびCRF-BP濃度を測定する。 LIMRAアッセイでは、実施例1の手順にほぼ従う。濃度10μMのリガンドインヒ ビターを¹²⁵h/rCRFと一緒に反応に添加する。候補リガンドインヒビターがCRF-B PをCRFに置き換える場合、ペレットは、候補ペプチドを添加していないコントロ ールと比較すると低い放射線活性を含有する。6点用量曲線を使用して候補ペプ チドを再スクリーニングする。IC-50値を算出する。 リガンドインヒビターヒトCRF、α-らせんヒツジCRF(9−41)、ヒトCRF(6−33) およびヒツジCRFをCRF/CRF-BP複合体に対してこの方法でスクリーニングした。 クローン化ヒト下垂体CRFレセプターに対するこれらのペプチドの親和性を、予 め特徴付けされた放射リガンド結合アッセイを使用して、LtK^-マウスの線維芽細 胞におけるレセプターの安定したトランスフェクタントの膜調製物において測定 した(DeSouza，J．Neurosci．7:88，1987)。 これらのアッセイの結果を以下の表に示す。さらに、これらのリガンドインヒ ビターを、アルツハイマー病に罹患した個体およびコントロール個体の大脳皮質 のCRF-BPについてテストした。 これらの結果は、ヒトCRF、α-らせんヒツジCRF(9-41)、およびヒトCRF(6〜33 )は、CRF/CRF-BP複合体をCRFに置き換えることにおいてほぼ等しく効果的であっ たことを示す。対照的に、ヒツジCRFはCRFの置き換えには有効ではなかった。罹 患個体または正常な個体由来の大脳皮質におけるCRF-BPは、組換え形態と等価で あった。これら3種類の最も優れたリガンドインヒビターのうち、ヒトCRFおよび α-らせんヒツジCRF(9-41)は、ほぼ同じようにヒトCRF-Rと結合した。これとは 極めて対照的に、ヒトCRF(6〜33)は、2〜3log低効率で結合する。 実施例7 リガンドインヒビターによる処理 アルツハイマー患者から得た５つの大脳皮質試料および同一年齢の正常なコン トロールから得た５つの大脳皮質試料を、実施例4のようにして調製してプール した。全CRF、結合CRF、および遊離CRFの濃度を実施例４に記載のようにして測 定した。図２に示されるように、正常な個体から得た脳抽出物では全CRFの40%が CRF-BPと複合体化し、そしてアルツハイマー病患者から得た脳抽出物では総CRF の60%がCRF-BPと複合体化していた。 高親和性CRF-BPリガンドの結合CRFを置き換える効果を、50nMのα-らせんヒツ ジCRF(9-41)の存在下におけるCRF/CRF-BP複合体のモノクローナル捕捉の後に評 価した。置き換えられた遊離CRFを、CRF ELISAによってCRF-BPモノクローナル抗 体捕捉した後に残った上清において測定した。図２に示されるように、脳組織を リガンドインヒビターで処理することによって、アルツハイマー病の組織とコン トロール組織のいずれにおいても全ての結合CRFが放出された。さらに、アルツ ハイマー病の大脳皮質をリガンドインヒビターで処理することによって、遊離CR F濃度は、同一年齢のコントロールに見られるレベルにまで戻った。 組織をまた、50nMのリガンドインヒビターα-らせんヒツジCRF(9-41)とともに インキュベートした。次に、上清を、実施例4に記載した２部位ELISAアッセイに より、置き換えられたCRFについてアッセイした。 実施例8 Morris 水迷路試験 Morris水迷路試験は、最小限のストレスおよび経験しか必要ない簡単な空間学 習課題である。ショックや食物摂取量の減少などの動機付けの強制は必要ない。 動物を、粉乳の添加により不透明になっている生ぬるい水の中に入れる。隠れた プラットホームを見つけるまでの潜在時間をモニタリングする。動物は、迷路お よび試験室内にある目に見える手がかりに対するプラットホームの位置を学習す る；この学習を位置学習と呼ぶ。この試験は、動物における空間学習およびヒト における記憶固定に関与する重要な脳領域である海馬の操作に対して特に敏感な ものである。 この試験で使用した装置は、不透明な水(22℃〜25℃)を23cmの深さまで満たし たプール(直径46.4cm、高さ45.7cm)である。加重した標的プラットホームの一番 上の直径10cmの部分を、水面から1〜2cm下に位置させる。プールの４つの四分円 を内面のデザインによって区別する。動物を、タンクの決められた四分円に入れ 、隠れたプラットホームに近づいて登るまでの時間を測定する；被検体を置く位 置およびプラットホームの位置は実験中を通して一定にする。プラットホームの 一番上に登った後、動物を20秒間休ませる。60秒以内にプラットホームを見つけ なかった被検体をプラットホームの上に置き、20秒間休ませる。 ラットを、試験の15分前にリガンドインヒビターh/rCRF(6〜33)またはCRFレセ プターアゴニストh/rCRFのいすれかのICV注射により処理した。h/rCRF(6〜33)の 用量は、0、1、15、25、50または125μgであった。h/rCRFの用量は、0、0、1、1 または2.5μgであった。1グループあたり7〜10匹のラットを処理した。統計的な 分析によって、h/rCRF(6〜33)(p<0.05)またはCRF(p<0.05)で処理した後の行動に は顕著な改善が見られることが確認された(図４)。時間が経過した後にも同様に 行動に有意な改善が見られた(p<0.0001)。 実施例9 Y 迷路可視区別試験 Y迷路可視区別試験は、動物に最小限のストレスを与えて学習に対する正の強 化を利用する学習試験である。被検体に食餌を与えず、訓練セッションの終了後 にのみ食餌を与える。動物は応答しないという選択肢を選ぶこともあるが、ほと んどの場合には、通常の餌よりもラットが好む食餌ペレットの正な強化特性のた めに応答する。 Y迷路は、同じ長さ(長さ61cm、幅14cm、高さ30cm)のアームを含有する。1本の アームはスタートボックスとして使用され、手動式のギロチンドアによって他の 2本のゴールアームと分離されている。２本の遠位のアームの端の垂直面には、 ８ワットの電球が備えられている。訓練の１日目に、各ゴールアームの端に2個 の食餌ペレット(45mg Noyes)を置き、体重の80%まで食餌を与えられていないラ ッ トを5分間迷路に放した。２日目に、各ラットをペレットをおいた各ゴールアー ムの下を１トリップさせた。３日目に、選択した点で1本のゴールアームを閉じ 、開いたゴールボックスで45mgのペレット2個を得られるようにしてはあるが、 区別するための可視的な刺激は与えずに(ライトをオフにしておく)３匹の動物か らなるグループでラットに6つの空間試験をした。オープンアームを6回の試験を 通して左から右に往復させ、被検体から被検体へと往復させた。４日目から10日 目では、両方のゴールアームを開いてゴールアームの端のライトに灯りをつけた 。試験と試験との間の時間が約90秒になるように3例の動物からなるグループで1 日10回の試験を行った。訓練の最後に毎日かごの中で被検体に実験室食餌15gを 与えた。 4〜10日目に、試験直前にリガンドインヒビターのICV注射をすみやかに与えた 。7〜9匹のラットからなるグループに0、1、5、または25μgのいずれかリガンド インヒビターh/rCRF(6〜33)を与えた。パーセント補正応答を記録した。5μgお よび25μgのCRF(6〜33)を与えられたラットは、0または1μgのリガンドインヒビ ターを与えられたラットよりも統計的に顕著に良好な行動をした。 実施例10 高架プラス迷路試験 高架プラス迷路試験によって、露出されて照明のあてられた空間に対して暗い 閉じられた領域に関する近接回避状況に動物がどのように応答するかを予測する ことができる。迷路において、両空間を地面から持ち上げ、プラスの符号の形に 交差している2つの通路を構成する。この種の近接回避状況は、「情緒性」につ いての古典的な試験であり、脱抑制(鎮静剤または催眠剤)およびストレスを生じ させる処理に対して極めて敏感である。動機付けの強制は必要なく、動物は暗闇 の中に居続けるか、またはオープンアームから外に出ることができる。 高架プラス迷路装置は、互いに直交して床から持ち上げられて(50cm)いる４本 のアーム(長さ50cm、幅10cm)を有する。これらのアームのうちの2本は壁(高さ40 cm)で囲まれ、そして2本のアームは壁を有しない(オープンアーム)。被検体をそ れぞれ迷路の中央におき、5分間の試験期間中は4本のアーム全てに自由に接近し 得るようにした。光電池の光線およびコンピュータインタフェースによって各ア ームに滞在した時間を自動的に記録した。 7〜10匹のラットからなるグループにリガンドインヒビターh/rCRF(6〜33)また はh/rCRF(1〜41)のICV注射を与えた。ラットにh/rCRF(1〜41)を0、0.1、1または 25μg与えた。h/rCRF(1〜41)の1および25μgの用量では、オープンアームにおい て統計的に顕著により多い時間滞在し、不安度が増したことを示した(第5図)。 これとは極めて対照的に、CRF(6〜33)の記憶改善用量ならびに2〜5倍多い用量(5 0〜125μg)では、行動に変化はなく、h/rCRF(1〜41)に匹敵する明白な挙動変化 は産生されなかった。h/rCRF(1〜41)はCRFレセプターアゴニストであることが知 られている。したがって、これらのデータは、リガンドインヒビターについての 効率的な認知改善および不安誘発性（anxiogenic）副作用の明瞭な機能的解離を 示す。 実施例11 肥満動物モデル 肥満は、エネルギー消費量を上回る量のエネルギーを摂取することで生じる過 剰の体脂肪に関する。臨床集団における肥満の複合病因は、過食、異常な脂質代 謝、インスリン過剰および運動不足に関与し得る。これらの現象および結果とし て生じる体の大きさの増加は、遺伝的に肥満状態のラットおよびマウス、脳の視 床下部領域に病変を有する動物、様々な投薬処理を長期にわたって施された動物 を用いて、動物においてモデル化し得る。 中枢投与されたCRFは、遺伝的に肥満状態のZuckerラットにおける過剰な体重 増加を停止させる上で効果のある食欲不振作用を生じる。内因性CRFの食欲抑制 作用については、CRF/CRF-結合タンパク質複合体すなわちCRF(6〜33)を使用して 最近解明されつつある。このリガンドインヒビターは、間接的なCRFアゴニスト として作用し、脳の遊離非結合CRFのシナプスレベルを増加させる。24時間断食 させた動物に飼料を2時間与える直前にh/rCRF(6〜33)を中枢投与したところ、食 欲に用量依存抑制が認められる。CRFと比較して、h/rCRF(6〜33)は、食欲減退に おいて効力は有意に少なく効率も低い。CRFとは対照的に、断食をしていない被 検体における2時間平均の摂取量を変化させない。さらに、別の試験で、h/rCRF( 6〜33)の食欲不振用量は、CRF自体を中枢投与した後に予期される恐れのような 挙動を誘導しなかった。これらの結果は、h/rCRF(6〜33)での薬学的処置が、内 因性CRFレベルにおいて生理学的に意味のある増大を刺激することによって選択 的かつ適度に食欲が抑制されることが分かる。 体重増加および過食は、ニコチンの禁断症状の好ましくない特徴であり、エネ ルギーバランスおよび食欲制御のために、脱制御された生物学的および神経化学 的物質を薬学的に標的化することによって解決され得る。空腹感の増大および体 重増加は少なくとも6ヶ月続き、喫煙をやめた後1年間で平均4〜6ポンド体重が増 えることが多い。喫煙をやめた喫煙者の3／4を上回る人に生じるこのような状況 肥満は、標準的な挙動体重減少ストラテジーでは効率よく修復されてはいない。 臨床現象の例として、禁酒をしている女性の体重は、カロリー摂取量は正常な範 囲内にあったが、飲酒をやめた後26週間でベースラインよりも9ポンドも多くな ったと報告した調査員がいる。このような長期にわたる禁断症状は、喫煙にかわ って主要な役割をはたし得る。 禁煙後の食欲および体重の障害は、動物でモデル化したニコチン離脱症候群の 再現可能な構成要素である。図６は、依存誘導濃度で2週間を超える日数にわた ってニコチンを連続的に注入し、ニコチン投与をやめた後2週間離脱させて得た 実験室ラットにおける体重および食物摂取量の変化を示す。慢性的にニコチンを 投与するとビヒクル処理したグループに対して食物摂取量および体重増加率が減 少するが、これに続くニコチンの禁断症状によって過食およびコントロールに対 して体重の正常化が誘導される。ニコチン置換治療は禁断症状における食欲およ び体重の乱れに対して解毒作用的なものであるため、喫煙停止のエネルギーバラ ンスに対する影響はニコチンを突然取り除くことによって生じるように思われる 。この臨床観察は、ニコチン注入停止後24時間の時点で測定された挙動の乱れお よび全体としての離脱徴候が、ニコチンの急激な全身投与により緩和される動物 モデルによって確認される。 ニコチンの禁断症状誘導性過食においてCRF-BPアンタゴニストの有利な食欲不 振特性を証明するために設計された実験において、ニコチン投与停止後4日目の2 時間にわたる食餌の直前に非依存およびニコチン離脱被検体にh/rCRF(6〜33)を 投与した。図７は、リガンドインヒビターWrCRF(6〜33)はニコチン未処置コント ロールにおいて食欲を変化させることはなかったが、ニコチン離脱被検体は食物 摂取レベルが増し、これはh/rCRF(6〜33)を投与することによって有意に減少す るということを示す。まとめると、これらの結果は、全く食餌を与えなかった動 物または自然に空腹になった動物の食欲を変化させない用量のリガンドインヒビ ターが、食物断食またはニコチンの禁断症状により刺激された過剰な食欲を効果 的に減弱することを開示している。 以上から、本発明の特定の実施例について例示の目的で説明したが、本発明の 趣旨および範囲を逸脱することなく様々な改変を施し得ることが明らかである。 したがって、本発明は添付の請求の範囲以外には限定されない。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION    Corticotropin releasing factor-binding protein inhibitors and uses thereof   Some aspects of the invention are directed to grant number DK, assigned by the National Institutes of Health. Government support under -26741 and HD-13527. The government has certain rights in this invention. Having. the University of Reading and the Medical Research Council of  Great Britain has certain rights in this application.Related application citations   This application is a continuation-in-part of U.S. Patent Application No. 08 / 276,240, filed July 15, 1994. It is a continuation application.Technical field   The present invention generally relates to a method for increasing the endogenous level of a neuropeptide. And more specifically on how to increase corticotropin-releasing factor levels in the brain. You.Background of the Invention   Recent clinical data suggests that CRF may be associated with neuropsychiatric disorders, and Alzheimer's disease. It indicates that it is related to a neurodegenerative disease. Alzheimer's disease is progressive A neurodegenerative brain disease that results in memory loss and dementia. According to recent estimates, More than two million individuals in the United States suffer from the disease. In particular, how many Line of evidence suggests that CRF is associated with Alzheimer's disease (AD) I have. First, the CRF decreased dramatically (over 50%), (Bissette et al., JAMA 254: 3067 1985; DeSouza et al., Brain Research 397: 401, 1986; Whitehouse et al., Neurology.  37: 905, 1987; DeSouza, Hospital Practice 23:59, 1988; Nemeroff et al., Regul . Peptides 25: 123, 1989), and CRF receptors in the cerebral cortex affected by AD Conversely increases (DeSouza et al., 1986; DeSouza, 1988), but CRF is also a CRF receptor ー Do not change in areas unaffected by the cortex (DeSouza et al., 1986) . Second, chemical affinity cross-linking studies indicate that increased CRF receptors in the cerebral cortex in AD Populations have normal biochemical properties (Grigoriadis et al., Neurophar macology 28: 761, 1989). Furthermore, a decrease in CRF concentration in cerebrospinal fluid was observed. (Mouradian et al., Neural Peptides 8: 393, 1986; May et al., Neurology 37:53). 5, 1987) has a significant correlation across grades of neuropsychiatric injury, Greater cognitive impairment suggests that it is associated with lower CSF levels in cerebrospinal fluid (Pomara et al., Biological Psychiatry 26: 500, 1989).   The treatments available for treating dementia are very limited. Recently approved Tacrine is a drug^TMBarely improves memory in Alzheimer's patients Only occur and have the undesirable side effect of raising liver enzymes.   Changes in brain CRF content are also seen in Parkinson's disease and progressive supranuclear palsy. And they share certain clinical and pathological features with AD It is a neurological disease. In Parkinson's disease, CRF content is reduced, and AD The cases show a similar staining pattern (Whitehouse et al., 1987; DeSouza, 1988). Progress In cases of supranuclear nucleus paralysis, CRF is controlled in the frontal, temporal, and occipital lobes. It decreases to about 50% of the roll value (Whitehouse et al., 1987; DeSouza, 1988).   Some depressions are also associated with decreased levels of CRF. Seasonal depression Patients and patients with chronic fatigue syndrome have lower levels of CRF in cerebrospinal fluid (Vanderpool et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 73: 1224, 1991).   In some cases depression has a high rate of improvement, and often results in self-limiting However, there are major differences in the rate of patient recovery. The main goal of treatment is Reducing the intensity to accelerate the rate of recovery of this type of depression, as well as And to prevent regression. Typically, antidepressants are given, but serious side effects (Eg suicide by fluoxetine, convulsion by bupropion) obtain. (Klerman et al., Clinical Evaluation of Psychotropic Drugs: Principles  and Guidelines, R.F. Prien and D.S. Robinson (eds.), Raven Press, Ltd. N. Y., 1994, p. 281).   Impairment of the stress system, as indicated by low CRF levels, Can play a role as well. For example, some forms of obesity Hypothalamic-pituitary-adrenal axis (Kopelman et al., Clin. Endocr inol (Oxford) 28:15, 1988; Bernini et al., Horm. Res. 31: 133, 1989), after trauma Patients with stress syndrome have low cortisol excretion (Mason et al., J. Neu. Men. Di. s. 174: 145, 1986), and smoking cessation patients are adrenaline and noradrenaline With reduced excretion of steroids and reduced cortisol levels in the blood (West et al., Psycho pharmacology 84: 141, 1984; Puddy et al., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 11:42 3, 1984). Because CRF is the major regulator of the hypothalamus-pituitary-adrenal axis All of these expressions indicate a central role for CRF in these diseases.   Treatment of these diseases is not very effective. For example, to treat obesity The most effective approach is a behavior change program. But reach the target weight Have few participants and a high recurrence rate (Halmi et al., Clinical Evaluati on of Psychotropic Drugs: Principles and Guidelines, R.F. Prien and D.S Robinson (eds.), Raven Press, Ltd. N.Y., 1994, p. 547).   Given the shortcomings in the treatment of such diseases and conditions, more effective treatments Is required. The present invention addresses reduced CRF levels and various neurophysiological disorders. By increasing the level of free CRF using the correlation with disease and disease Effectively treats such diseases and provides yet other related advantages .Summary of the Invention   The present invention relates to an effective amount of a ligand for a CRF / CRF binding protein (CRF / CRF-BP) complex. Increases free CRF levels in the brain by administering inhibitors to patients Provide a way. Administration of the ligand inhibitor will reduce the amount of CRF from the CRF binding protein. Causes release. Ligand inhibitors can cause "release" of CRF If it is a CRF-derived peptide, a peptide homologous to CRF, or a CRF-related May not be a peptide. Ligand inhibitors can also be natural or synthetic chemicals. Non-peptidic compounds isolated from a quality library. One embodiment of the present invention Within embodiments, the ligand inhibitor is h / rCRF (amino acids 6-33), h / rC RF (amino acids 9 to 33), and a peptide selected from the group consisting of h / rCRF . Within a related aspect, there is provided a therapeutic composition comprising a ligand inhibitor In combination with a physiologically acceptable carrier or diluent.   Within other aspects of the invention, methods for improving learning and memory, How to reduce, how to activate CRF neurocircuitry, how low in the brain To treat diseases associated with high levels of CRF, signs associated with Alzheimer's disease To treat obesity, to treat obesity, to treat atypical depression, postpartum depression To treat age-related memory loss and withdrawal of substance abuse Methods are provided for treating a condition. Within such methods, a therapeutically effective amount of Ligands inhibitors of CRF / CRF binding proteins may be used to treat these conditions Administered to patients. Criteria for selecting candidate therapeutics and treatment options The method for evaluating efficacy is shown.   It has a high affinity for human CRF-BP for the purpose of achieving a specific therapeutic purpose. It has been found that certain drugs can be administered. This drug is a complex with CRF-BP Effectively competes with human CRF for formation and, thus, promotes endogenous hCRF An effective in vivo concentration in a mammal, and / or optionally with such an agent. Increase the effective concentration of the administered CRF agonist or CRF antagonist. You In other words, these drugs block the effect of CRF-BP, and It is used to increase the concentration of endogenous CRF in areas of the body. More details In particular, peptides between about 19 and 28 residues have high affinity for hCRF-BP. Has a relatively low tendency to bind to the CRF receptor itself That has been discovered. As a result, such peptides can be Can be administered to suppress the clearance of endogenous CRF, thereby Stimulates the biological effects of all CRF, and in some cases, CRF or CRF agonis It may be advantageous to administer such a peptide together with the peptide. These drugs The true nature of is that potential unwanted side effects are minimized or overall Is to be removed. In particular, CRF antagonists have significantly higher results for hCRF-BP. If they have affinities, these agents may also have some CRF amplification from the target region. Administered with a CRF antagonist to suppress the clearance of Can be However, its effects are limited by the release of endogenous CRF that is otherwise bound to CRF-BP. It is hindered to a certain extent by exit. These drugs promote delivery in pregnancy To stimulate the respiratory system, to address obesity, and to Useful for therapeutic treatment to prevent the effects of Zuheimer's disease and chronic fatigue syndrome However, some of these indications are based on how the drug is delivered into the brain Must be administered.   In addition, determine the ability of CRF to block the ability to bind to the native CRF receptor And the binding parent between such candidate CRF antagonists and hCRF-BP The double screen of such potential antagonists should also be used to determine compatibility. Screening assays to screen for particularly effective CRF antagonists. A method for training is provided.   Also provided are methods for screening for neuropeptide binding proteins. You. In a related aspect, the neuropeptide / neuropeptide binding protein complex Screen for gand inhibitors, especially ligand inhibitors of CRF / CRF-BP complex A method for training is provided. Within one embodiment, the method comprises the steps of: Contacting CRF with CRF-BP in the presence of a ligand inhibitor in a solution, Mixing in a nonionic surfactant, separating the nonionic surfactant and the aqueous solution. Separating and detecting the amount of CRF in the aqueous solution, thereby Determine whether the protein disrupts the CRF / CRF-binding protein complex. You. In some embodiments, the mixing is performed at a temperature above the cloud point of the nonionic surfactant. And octylphenoxypolyethoxyethanol are suitable nonionic It is a surfactant.   These and other aspects are apparent with reference to the following detailed description and accompanying drawings. It will be.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 shows that human-derived CRF (hCRF) (SEQ ID NO: 1) and sheep-derived CRF (oCRF) ( 2 shows the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4)   FIG. 2 is a graph showing the levels of CRF bound to CRF-BP and free CRF. CR F levels from controls suitable for Alzheimer's disease patients and normal age Was measured in the brain tissue. Α-helix, a CRF-BP ligand inhibitor Levels were established with or without sheep CRF (9-41).   FIG. 3 shows brain tissues collected from normal control or Alzheimer's disease patients. Shows the levels of CRF (panel A) and CRF-BP (panel B) in four regions It is a graph.   FIG. 4 shows Mor after intraventricular (ICV) injection of vehicle or CRF (6-33) or CRF (1-41). ris water maze and elevated plus-maze test results Is shown. ICV injection in rats in groups of 7-10 animals 15 minutes before testing Was done. Morris Underwater Maze test records the time to reach the platform Was. Percent time spent in open arms in elevated maze test Was recorded. An asterisk indicates that there is a statistically significant difference.   FIG. 5 is a diagram showing test results of rats in the Y maze test. 7-10 animals Groups of rats were given 0, 1, 5, or 2 ICV injections 15 minutes prior to testing. 5 μg of either CRF (6-33) was given. The exact percent response was measured. Star The mark indicates that there is a statistically significant difference.   FIG. 6 shows the dependence induction levels of nicotine during continuous infusion (dependency phase) and for 2 weeks [Fig. 4] Fig. 4 shows test results of weight change and food intake of rats during withdrawal (withdrawal phase). Body weight is indicated by a hatched bar and expressed in grams; food intake is indicated by a line and expressed in grams. Is displayed.   FIG. 7 shows the food intake after administration of the ligand inhibitor h / r CRF (6-33). FIG. 3 is a diagram showing the effects of withdrawal symptoms from nicotine dependence on nicotine dependence.Detailed description of the invention   Before describing the present invention, definitions of terms used hereinafter will be described. This can be useful for understanding the present invention.   “CRF” refers to adrenocorticotropin (ACTH), β-endorphy Modulates the release of insulin and other proopiomelanocortin (POMC) -derived peptides Peptide. Amino acids in CRF in humans, rats, and other species The sequence has been determined and is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). Rat CRF and human The amino acid sequence of CRF is identical, and this protein is called "h / rCRF". You. "Free CRF" can be complexed or bound to a CRF binding protein or CRF receptor. An unbound CRF.   "CRF binding protein" (CRF-BP) exists as a soluble factor in human plasma Or one or more proteins present in association with the cell membrane . This inhibits CRF function as measured in one of two ways: (1) CRF from pituitary cell culture or perfused rat anterior pituitary system Stimulated ACTH release, or (2) cells with CRF receptors or cloned CRF receptors CRF-induced cAMP formation from puter transfected cells. Code CRF-BP Examples of cDNA clones have been isolated from human liver and rat brain (Potter et al.). Nature 349: 423, 1991).   “CRF / CRF-BP” is a complex of CRF and CRF-BP. Connection between CRF and CRF-BP Mediated by hydrophobic, ionic, or covalent interactions Can be   "Human CRF binding protein" (hCRF-BP) Inactivates hCRF as an ACTH secretagogue by specifically binding hCRF 37kDa serum protein. Human CRF-BP is a high parent for hCRF Is compatible and has low affinity for oCRF. As a result, hCRF-BP It is suggested that it promotes the removal of peripheral plasma hCRF. hCRF binds to hCRF-BP Loses the ability to stimulate ACTH in vitro and in vivo when administered You. The C-terminus is primarily responsible for receptor affinity, but the first eight amino acids of the CRF It is thought to be involved in receptor activation. hCRF-BP is a central domain HCRF stimulates adrenocorticotropic hormone-producing cells by binding to Seems to prevent the ligand from interacting with the receptor and ACTH release Does not happen.CRF / CRF Ligand inhibitors of binding proteins   As mentioned above, the present invention provides an effective amount of CRF such that CRF is released from CRF-BP. By administering a ligand inhibitor of the CRF / CRF-BP complex, free CRF Show how to increase the bell.   “CRF / CRF-BP complex ligand inhibitors” are reversible or irreversible Replace the CRF in any way. The substitution causes the bound CRF molecule to become free CRF. This can happen. In addition, binding of the ligand inhibitor is based on human hCRF Can inhibit binding of free CRF to CRF-BP due to its high affinity to hCRF-BP Compete with endogenous CRF for binding. The reversible or irreversible substitution of CRF By a ligand inhibitor that binds directly to the binding site or at the CRF binding site Ligands that bind to a site that is not Inhibitors can be mediated. Ligand inhibitors can be CRF or CRF-related Peptides derived from the sequence, or lac designed to cause displacement of the bound CRF It can be a random peptide. In addition, ligand inhibitors are small natural Non-peptide molecules derived from libraries, synthetic analogs of natural molecules, CRF / CRF-BP binding Small molecules or other ligands specifically designed based on the physical properties of the complex It can be a inhibitor. Ligand inhibitors may also inhibit metabolic production of administered compounds. Things. Ligand inhibitors can be administered by the CNS or It must be able to be administered and reach the brain. Preferably, the ligand The properties of an inhibitor are such that its inhibitor is a low-affinity antagonist at the CRF receptor. Gonist (K_i≧ 1 μM) or 100 times higher than CRF binding protein Selectivity (K_i≦ 10 nM). CRF-BP ligand inhibitor May also show some moderate agonist activity at the CRF receptor (K_i≧ 50 nM).   The peptide sequence that binds to CRF-BP and replaces endogenous CRF is a CRF peptide sequence , CRF-related peptide sequences, or unrelated peptide sequences. About 19 length Shorter peptides, between 28 and 28 residues, are effective at competitively binding to hCRF-BP And at the same time show very low affinity for the CRF receptor. I have. As a result, this particular group of peptides binds to hCRF-BP, but Does not substantially bind to the receptor and / or does not interact with the receptor. single When given alone, these peptides are effective in increasing the amount of endogenous free CRF. Have fruit. This maintains the ability to interact with the CRF receptor. Obedience Tsu In addition, these peptides can be used to produce endogenous The effect of CRF may be ensured or increased. These peptides are Given together with CRF receptor agonists or antagonists in In that case, they can likewise be used to increase the efficiency of these substances. But CR Administration with F antagonists is somewhat neutralized by the release of endogenous CRF. CRF related Examples of linked proteins include urotensin and sauvagine. Including. Preferred peptides are those derived from h / rCRF. In this regard In the context of the present invention, many different peptides replace endogenous binding CRF Can be used. Such peptides are known as α-helix oCRF (sheep CRF) (9-41 ) (Numbers in parentheses indicate amino acids), h / rCRF (6-33), h / rCRF (9-33), urotensin I, Sorvagin, and h / rCRF. Preferred peptides are h / rCRF (6-33), h / rCRF (9-33) and h / rCRF (1-41) OH. These peptides have the appropriate affinity This is because it binds to CRF-BP but does not bind to CRF receptor. C-terminal play Acid liberation (OH) is particularly preferred over amidation found in natural CRF. h / rCR Deamidation of the C-terminal amino acid of F does not affect the binding affinity for CRF-BP. However, it greatly reduces the affinity of h / rCRF for the CRF receptor. These factors The N-terminus of the offspring is protected against degradation by acylation (eg, by acetyl (Ac)). And such modified peptides are considered equivalents. CRF receptor Of CRF found to bind to CRF-BP without significantly interacting with The sequence is amino acids 9-33. In particular, amino acid residues 22-25 bind to CRF-BP Seems to play a significant role in   Other peptides can be designed based on homology to the peptide series. You. As described above, when designing a peptide, the C-terminal amino acid is a free acid group. Is preferable. Figure 1 shows the amino acid sequences of known CRF and CRF-related molecules Indicates a column comparison. As mentioned above, residues 9-33 are required for binding to CRF-BP. Residues 22, 23, and 25 play a critical role in binding It is considered to be playing. A preferred guideline in peptide design is at residue 22. The corresponding amino acid residue is alanine, and the amino acid residue corresponding to residue 23 is a base. Amino acid (arginine or lysine) and the amino acid corresponding to residue 25 The acid residue is glutamic acid.   An example of a suitable peptide is a fragment of human CRF having the sequence: Including hCRF (1-41):       Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Gl u-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Ar g-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile (SEQ ID NO: 1).   One preferred fragment used is hCRF (6-33) having the following sequence: Yes: Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Al a-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser (SEQ ID NO: 1). This flag Is reduced to four residues at the N-terminus by removing residues in the sequence, and And / or may be shortened to 5 residues at the C-terminus. This fragment is, for example, hCRF (9-33), hCRF (6-30), and hCRF (8-29). Other pep that could be used instead Examples of tides include, for example, hCRF (6-33) analogs as follows: [Nle^{twenty one}] -hCRF (6 -33), [Nle^{twenty one}] -hCRF (9-33), [Ile^{twenty four}] -hCRF (6-33), [Asn²⁶] -hCRF (6-33), [Nle^{18 ,twenty one} ] -hCRF (6-33), [Ile²⁷] -hCRF (6-33), [Va²⁸] -hCRF (6-33), [Asn^29,30] -hCRF ( 6-33), [Lys¹⁶] -hCRF (6-33), [Asp¹⁷] -hCRF (6-33), [Leu¹²] -hCRF (6-33), [Arg^{1 Three} ] -hCRF (6-33), [Glu⁹] -hCRF (6-33), [Va³¹] -hCRF (6-33), [Thr³³] -hCRF (6-33) , [Arg³²] -hCRF (6-33), [Ile^Ten] -hCRF (6-33), and [Ile¹⁴] -CRF (6-33).   Other peptides that can be used for this purpose include the following sequence (SEQ ID NO: 2) Defined by: Xaa_Four-Xaa_Five'-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₉-Xaa_Ten-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Xaa₁₃-X aa₁₄-Xaa_Fifteen-Xaa₁₆-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Xaa_{twenty one}-Ala-Xaa_{twenty three}-Xaa_{twenty four}-Glu-Xaa₂₆ -Xaa₂₇-Xaa₂₈-Xaa₂₉-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Xaa₃₂-Xaa₃₃Or those biologically active Fragment. This fragment contains 1 to 8 residues from the N-terminus in the sequence, or It is formed by deletion of 1-5 residues, or both, from the C-terminus in the sequence. here , Xaa_{twenty three}Is Arg or Lys, and Xaa_{twenty four}Is Ala, Ile, Asn, Met, Nle, or L eu, and each of the remaining Xaas is at each position in human CRF (1-41) Or another naturally occurring amino acid, preferably a naturally occurring residue Represents a conservative substitution of   Another preferred group of peptides is defined by the following sequence (SEQ ID NO: 2): Xa a_Four-Xaa_Five-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₉-Xaa_Ten-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Xaa₁₃-Xaa₁₄-Xaa_Fifteen-Xaa₁₆-Xa a₁₇-Xaa₁₈ -Xaa₁₉-Xaa₂₀-Xaa_{twenty one}-Ala-Xaa_{twenty three}-Xaa_{twenty four}-Glu-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Xaa₂₈-Xaa₂₉-Xaa₃₀-Xaa₃₁ -Xaa₃₂-Xaa₃₃, And biologically active fragments thereof. This flag 1 to 8 residues from the N-terminal in the sequence, or 1 to 5 residues from the C-terminal in the sequence , Or both deletions. Where Xaa₆Are Ile, Met, Leu, Or Nle; Xaa₈Is Leu or Ile; Xaa₁₄Is Leu, Met, or Nle And Xaa₁₇Is Glu or Asn; Xaa₁₈Is Val, Met, Leu, or Nle Yes; Xaa₁₉Is Leu or Ile; Xaa₂₀Is Glu or His; Xaa_{twenty one}Is , Met, Leu, Nle, or Arg; Xaa_{twenty three}Is Arg or Lys; Xaa_{twenty four}Is Ala, Ile, Asn, Met, Nle, or Leu; Xaa₂₆Is Gln, ASn, or Gly Yes; Xaa₂₇Is Leu, Glu, or Gln; Xaa₂₈Is Ala or Arg; X aa₂₉Is Gln or Glu; Xaa₃₂Is His, Glu, or Leu; Xaa₃₃Is , Ser, Leu, or Ile; and each of the remaining Xaas is in human CRF (1-41) A residue at each position, or another naturally occurring amino acid, preferably Represents a conservative substitution of a naturally occurring residue. Preferably, 2 to 5 residues are N-terminal Deleted from the end. Most preferably, Xaa₇Is Ser and Xaa₉Is Asp, Xaa_TenIs Leu and Xaa₁₁Is Thr and Xaa₁₂Is Phe and Xaa₁₃Is His And Xaa_FifteenIs Leu and Xaa₁₆Is Arg and Xaa₃₀Is Gln, and Xa a₃₁Is Ala.   Another preferred group of peptides is defined by the following sequence (SEQ ID NO: 3): Pr o-Pro-Ile-Ser-Xaa₈-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Glu -Xaa_{twenty one}-Ala-Arg-Xaa_{twenty four}-Glu-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Xaa₂₈-Xaa₂₉-Gln-Ala-Xaa₃₂-Xaa₃₃Ma Or biologically active fragments thereof. This fragment contains N in the sequence. 1 to 8 residues from the terminal, or 1 to 5 residues from the C-terminal in the sequence, or both Formed by deletion. Where Xaa₈Is Leu or Ile; Xaa₁₇Is Glu Or Asn; Xaa₁₈Is Val, Met, Leu, or Nle; Xaa₁₉Is Leu Is Ile; Xaa_{twenty one}Is Met, Leu, or Nle; Xaa_{twenty four}Is Ala, Ile, and Is Asn; Xaa₂₆Is Gln or Asn; Xaa₂₇Is Leu, Glu, or Gln Yes; Xaa₂₈Is Ala or Arg; Xaa₂₉Is Gln or Glu; Xaa₃₂Is , His or Glu; and Xaa₃₃Is Ser or Leu.   Among the latter group, particularly preferred peptides other than the aforementioned fragments of hCRF are: Including the following analogs: [Ile^8,19,24, Asn^17,26, Met¹⁸, Glu^27,29, Arg²⁸, Gly³², Leu³³] -hCRF (6-33) [Asn^17,26, Nle¹⁸, Ile^19,24, Glu^27,29, Arg²⁸, Gly³², Leu³³] -hCRF (9-33) [Ile^8,19,24, Asn^17,26, Met¹⁸, Glu²⁷, Arg²⁸] -hCRF (4-28) [Ile^19,24, Asn^17,26, Nle¹⁸, Glu²⁷, Arg²⁸] -hCRF (7-31) [Ile^8,19, Asn^17,24,26, Met¹⁸, GLN²⁷, Arg²⁸, Glu²⁹, Gly³², Leu³³] -hCRF (6- 33) [Asn^17,24,26, Met¹⁸, Ile¹⁹, Gln²⁷, Arg²⁸, Glu²⁹, Gly³², Leu³³] -hCRF (9-33 ) [Ile^8,19, Asn^17,24,26, Met¹⁸, Gln²⁷, Arg²⁸] -hCRF (8-28) [Ile^8,19, Asn^17,24,26, Nle¹⁸, Gln²⁷, Arg²⁸, Glu²⁹, Gly³²] -hCRF (8-32) [Ile^8,19, Asn^17,24,26, Nle¹⁸, Gln²⁷, Arg²⁸, Glu²⁹, Gly³²] -HCRF (8-32) [Met^6,14,18,24, Ile^8,19,33, Asn¹⁷, His²⁰, Arg^21,28, Lys^{twenty three}, Gly²⁶, Glu^{27, 29} , Leu³²] -hCRF (6-33) [Ile^8,19,33, Met^14,18,24, Asn¹⁷, His²⁰, Arg^21,28, Lys^{twenty three}, Gly²⁶, Glu^27,29 , Leu³²] -hCRF (9-33). [Nle^6,14,18,24, Ile^8,19,33, Asn¹⁷, His²⁰, Arg^21,28, Lys^{twenty three}, Gly²⁶, Glu^{27, 29} , Leu³²] -hCRF (6-33). [Ile^8,19, Nle^14,18,24, Asn¹⁷, His²⁰, Arg^21,28, Lys^{twenty three}, Gly²⁶, Glu^27,29] -h CRF (8-30).   Peptide nomenclature is described in Schroder and Lubke, "The Peptides", Academic Pres. s (1965) where the amino group is on the left, according to conventional notation. And the carboxyl group on the right. Alpha amino acids using standard three letter code If a residue is identified and this amino acid has isomers, nothing else is indicated. Unless indicated, the indicated amino acids are in the L-form. For example, Ser = L-serine, Orn = L-orni Tin, Nle = L-norleucine, Nva = L-norvaline, Har = L-homoarginine, And CML = L-C^αMeLeu.   The peptide is synthesized by a suitable method. This method involves exclusively solid phase Synthetic, partial solid-phase synthesis, fragment condensation, or By typical solution addition. Chemical synthesis of peptides should be performed Protection of labile side groups of various amino acid moieties with protecting groups Chemical reaction and finally remove this group. Most methods use amino acids or fragments Protects the α-amino group on the label while the protected one reacts with a carboxyl group. Then, by selectively removing this α-amino protecting group, the next reaction In place. Examples of such representative peptide synthesis are described in U.S. Pat. No. 6, issued August 10, 1993, the disclosure of which is incorporated herein by reference. ).   Peptides such as hCRF (6-33) and hCRF (9-33) and other peptides specifically mentioned above Analogs are disclosed in U.S. Pat. No. 4,489,163 (the disclosure of which is incorporated herein by reference). Synthesized manually using solid phase methods, or as described in Synthesized automatically on the ckman Model 990 peptide synthesizer. Briefly, tertiary class Toxicarbonyl (Boc) was used for α-amino protection and TFA-CH_TwoCl_Two(3: 2) Used for deprotection. The standard coupling is 1,3-diisopropylcarbodii The difficult coupling is mediated by amide (DIC), while 2- (1H-benzotriazo 1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Achieved by using The protected peptide resin is treated with anhydrous fluorocarbon in the presence of 3% methyl sulfide. Cleavage using hydrofluoric acid (HF), which is subsequently removed under vacuum. Crude peptide Is purified using multi-step reverse phase HPLC.   Polypeptide analogs have substantially the same sequence as the sequences specifically set forth herein. Includes any polypeptide having a amino acid residue sequence. In this polypeptide, 1 One or more residues are replaced with another amino acid residue at the position described above. Have been. Conservative substitutions will cause the polypeptide to cause an increase in free CFR Are functionally similar (eg, by binding strongly to CRF-BP) This can be done using residues having different side chains. A common example of a conservative substitution is Polar (hydrophobic) residues (eg, isoleucine, valine, alanine, glycine, Substitution of another residue for isine or methionine); some polar (hydrophilic) residue Substituting a group with another residue (eg, substitution of lysine for arginine, Substitution of gin for glutamine, substitution of serine for threonine); Replacing another residue with, for example, lysine, arginine, or histidine; And one acidic residue (eg, aspartic acid or glutamic acid) and another . The expression “conservative substitution” also refers to such polypeptides If the compound exhibits the desired binding activity, a chemically derivatized residue may be substituted for the non-derivatized residue. Including the use of groups. As mentioned above, such conservative substitutions may result in residues Xaa₆~ Xaa_{twenty one}And Xaa₂₆~ Xaa₃₃For one or more residues; Examples of preferred conservative substitutions are shown in Table 1 below.   A "chemical derivative" is one that is chemically derivatized by the reaction of a functional side chain. Refers to a target polypeptide having the above residues. Such derivatized molecules include E.g., where the free amino group is derivatized, amine hydrochloride, p-toluenesulfonyl Group, carbobenzoxy group, t-butyloxycarbonyl group, chloroacetyl group or Is a molecule forming a formyl group. Free carboxyl groups are derivatized , Salts, methyl and ethyl esters or other types of esters or Can form hydrazides. Free hydroxyl groups are derivatized and O-acyl derived Or O-alkyl derivatives. Histidine induces imidazole nitrogen And can form N-im-benzylhistidine. Chemical derivatives are also standard A peptide containing one or more naturally occurring amino acid derivatives of the amino acids Include. For example, proline can be substituted with 4-hydroxyproline and lysine Histidine can be substituted with 3-methylhistidine. Wherein serine can be replaced by homoserine and lysine can be replaced by ornithine Can be done.   In addition, random peptides were synthesized and subsequently screened, As discussed in more detail, the functional criteria for substitution of CRF from the CRF / CRF-BP complex The additional peptide can be identified. Random peptides can be obtained by biological methods or Or by combinatorial chemistry techniques (Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1234, 1 994).   At least four different biological methods for generating random peptides Method. First, random nucleotides are introduced on the surface of the microorganism (Charbit et al., Embo. Journal 5:30 29, 1986; Agterberg et al., Gene 88:37, 1990; Fuchs et al., Bio / Tech 9: 1369, 1991; Thery et al., Appl. Environ. Microbiol. 55: 984, 1989). In such a method, The various cell surface proteins of the bacterium are fused parts into which oligonucleotides are inserted. Peptide fused to one of the extracellular loops of the protein Produce. LamB, OmpA, PhoE, PAL, and pilin proteins are all found on bacteria Functions as a vehicle for peptide presentation. On the surface of bacteriophage Another system for providing peptides is a preferred method. The vector used is the line It is derived from fibrous phage (eg, M13, f1, and fd). Typically, Proteins (eg, pIII or pVIII) serve as peptide expression vehicles. Works. (Smith, Science 228: 1315, 1985; Parmley and Smith, Gene 73: 305. 1988; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378, 1990; Markland et al. Gene 109: 13, 1991, U.S. Patent No. 5,223,409). Phage display and bacterial display Using both methods, a physical link between the peptide and the DNA encoding the peptide Exists, which allows for easy isolation and propagation of the DNA sequence. Third, By fusing the peptide at its C-terminus to the DNA binding protein Lacl, the peptide Can be ligated to a plasmid (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865). , 1992). The fusion protein is then identified with the DNA sequence for which the peptide encodes. Bind to the Lac operator on the plasmid for differential and stable binding. No. 4. The peptide is displayed on polysomes after stalling translation. Can be R containing nascent peptides still linked to the RNA encoding them By causing the accumulation of NA and polysomes (Gallop et al., J. Medicinal C hem. 37: 1233, 1994), the genetic material encoding the peptide can be recovered. these In all methods, a library of mutants based on CRF as the lead peptide Synthesized by controlling the proportional level of inserted "incorrect" bases Can be done.   In addition to biological methods, approaches based on combinatorial chemistry techniques Can be used to generate peptides. A variety of methods are available for the assays available It has been developed to synthesize a number of homogeneous peptides. These methods include: Multi-pin synthesis (Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998. Valerio, Anal. Biochem. 197: 168, 1991; Bray et al., Tetrahedron Lett. . 32: 6163, 1991) and the "tea bag" method (Houghten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131, 1985; Houghten et al., Int. J. Pept. Protein Re s. 27: 673, 1986). Multiple degenerate peptides may also be combined for use. Can be achieved. Simultaneous binding of a mixture of amino acids to a single resin support can This is a general strategy for synthesizing a code. Recently, soluble peptides (Houghten et al., Na Nature 354: 84, 1991; Houghten et al., Biotechniques 13: 412, 1992) and solid supports. Combinatorial library of peptides bound to a carrier (Lam et al., Nature 354: 82, 1991) ー It is synthesized by the "split synthesis" method. For peptide structures Peptide synthesis on beads containing the identifiers (PCT WO 93/06121), Numerous modifications to these syntheses have been developed (for review, Gallop et al., See above). One such identifier is an oligonucleotide sequence. (Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10700, 1993). Random pep Other syntheses of tides are well known and can be readily performed by those skilled in the art.   Non-peptide small molecules, natural or synthetic, can also be used as ligand inhibitors Can be done. Screened for ligand inhibitors of CRF / CRF-BP complex Libraries of small molecules include soil samples, plant extracts, marine microorganisms, Ross, fungal broth, pharmaceutical chemical libraries, combinatorial libraries (chemical And biological). Such libraries are available from a variety of sources. It can be obtained from sources (both commercial and private).   Molecules having a similar but not identical structure to the candidate compound are: Can be synthesized and tested for ligand inhibition. The small peptide sequence is CRF Can be designed for the solution NMR structure of As described above, C for binding to CRF-BP The key contact residues in RF are residues 22, 23, and 25. Thus, residue 20 The peptide sequence from ~ 27 can be designed from the reference solution structure of human CRF, Offers 1H NMR and limited molecular dynamics Determined by the distance geometry of each other (Protein Eng ineering 6: 149, 1993). Intact CRF molecules are used as the basis for the design You. The reason is that larger deletions may result in the loss of the CRF α-helix structure. This is because that. The 3-D structure of the small peptide spanning the critical contact residues is then Search computer banks for non-peptide molecules that mimic peptide structures Can be used to Molecule with lower IC-50 value than starting molecule is selected . Further molecules are the starting compounds and the physical and biochemical properties of those molecules Are synthesized based on Particularly preferred candidates have IC-50 values of 10 nM or less.   Determining whether any of the above inhibitors have the required properties depends on the inhibitor. Assay for the ability to displace CRF from the CRF / CRF-BP binding complex This can be done by assessing the ability of the inhibitor to bind the CRF receptor.   Candidate ligand inhibitors can be used in biological or in vitro assays. Better screen their ability to displace CRF from CRF / CRF-BP complex Can be One suitable biological assay is ACTH from cultured pituitary cells. Measurement of release. This assay is performed in the following manner. Below rat origin Anterior pituitary gland is washed 6 times with sterile HEPES buffer and contains collagenase Transfer to solution. The pituitary gland was then transferred to a 25 ml Bellco dispersion flask at 37 ° C. Stir for 30 minutes, grind, incubate for another 30 minutes, and grind again Kill The partially dispersed cells are then collected by centrifugation. Cell pellet Was resuspended in 10 ml neuraminidase and collected again by centrifugation. You. This pellet is mixed with 25 ml of BBM-P (BBM (Irvine Scientific) +100 μg / L corti Sol, 1μg / L insulin, 0.1μg / L EGF_Two, 0.4μg / L T_Three, 0.7μg / L PTH, 10μ g / L glucagon, and 2% fetal calf serum), centrifuge again, and The resulting pellet is finally reconstituted in BBM-P. The cells are then 50,000 Plated in 48-well plates at a density of ~ 100,000 / well, and It is cubated. On the day of the assay, cells are stimulated with peptide candidates or CRF. Wash once with BBM-T to prepare. Cells were implanted at the maximum stimulating dose of h / rCRF (1 nM). Once stimulated, ACTH release is measured by RIA or immunoradiometric assay. Blocking When a concentration of CRF-BP is added, the amount of ACTH released decreases and the maximum release Expressed as a fraction. The ligand inhibitor is added at various doses. The ability of a peptide to displace CRF from CRF-BP is caused by a given CRF alone It is measured by the amount of ACTH release expressed as the fraction of the maximum release given.   A preferred mode of screening for candidate ligand inhibitors is in vitro By ligand immunoradiometric assay (LIRMA). About LIRMA, CRF-BP It can be isolated from brain tissue, serum or cells expressing the recombinant form. Recombinant hCRF-B P is the Chinese hamster ovary (pSG5-hA3 and RSV-neo plasmid containing CHO) cells. Stable CHO transfectants are G418 (Si gma Chemical, St. Louis, MO) cloned by dilution under selection, And a modified Dulbecco enzyme supplemented with 2 mM L-glutamine and 3% fetal bovine serum. Maintained in Google media. To scale up production of hCRF-BP, Transfected CHO cells were used in a 10,000 MWCO bioreactor (Cell Pharm  Micro Mouse, Unisyn Technologies, Tustin, CA). The enrichment medium is , Collected daily from the bioreactor and stored at -20 ° C until purification. Ah Or closed roller bottles containing recombinant cells and tissue culture media ler bottle) (slowly rotating in a 37 ° C. environment) may be used.   hCRF-BP consists of three processes in which the fraction from each step is evaluated using the following assay. Can be purified by this process. First, the enrichment medium is BioPilot Chromatog Raffy equipment (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden) Purified by affinity. Human CRF was prepared using N-hydroxysuccinimide and Affi-Prep 10 (Bio Rad Laboratories, Richmond, CA) via primary amino group Are combined. After binding, the affinity gel was run on an XK16 or equivalent column (Pharmaci a LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden). Affinity purification Filtering the enriched medium through a column at 2 ml / min, 10 bed volumes at 5 ml / min. Washing with 100 mM HEPES HCl (pH 7.5) and 20% acetonitrile at 5 ml / min Buffer with 80 mM triethylammonium formate (pH 3.0) containing Eluting a fraction of the volume of the fraction. Alternatively, under mild basic conditions (eg, Elution under a pH of about 10.5) may be used.   The second purification utilizes gel chromatography. Affinity pure hCRF-BP was lyophilized and buffered with 0.1 M ammonium acetate (pH 4.75). Reconstituted in 6M guanidine-HCl. FPLC equipment is used for this purification process. Two Superose 12 HR 10/30 columns connected in series (Pharmacia LKB Biotechn. ology, Uppsala, Sweden). Affinity-pure hCRF-B P is filled in 1 ml, followed by 6 M guanidine HCl / 0.1 M ammonium acetate at 0.4 ml / min. Eluted with chromium (pH 4.75) and fractions are collected every minute.   The active fraction from the second purification is then subjected to a reverse phase HPLC. HPLC equipment is 2 One model 100A pump (Beckman, Palo Alto, CA), Axxiom HPLC controller -(Cole Scientific, Calabasas, CA), Spectroflow 773 absorbance detector set (To 214 nm) (Kratos Analytical, Ramsey, NJ), and Pharmacia. mod el 482 chart recorder (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden) Consists of Buffer A is 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) / 5% acetonitrile Yes, buffer B is 0.1% TFA / 80% acetonitrile. Next, Affini A 1 ml infusion of tee pure, same size hCRF-BP was added to 2.5 ml / h in 25% B buffer. Semi-preparative C4 HPLC column under isocratic conditions (Vydac, Hesperia , CA). Following passage of the final salt peak, a single gradient elution was performed with 25% B buffer. And increase to 95% B buffer over 30 minutes. Then dominant The absorbance peak is quantified by hCRF-BP IRMA and amino acid analysis.   In LIRMA, isolated from brain tissue, serum, or cells expressing a recombinant form CRF-BP in binding buffer (0.02% NP-40 in 50 mM phosphate buffered saline) Wells of a 96-well plate, small polypropylene microcentrifuge tubes, and Is added to the borosilicate glass tube.¹²⁵I-h / rCRF (New England Nuclear ) And 10 μM of candidate ligand inhibitor are added, and the reaction is allowed to run at room temperature. Incubate for 1 hour. Properly diluted anti-CRF-BP antibody (eg, rabbit Anti-hCRF-BP (Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4192-4196, 1992) After addition to each tube and after further incubation, the binding complex is Precipitation occurs by further addition of a goat anti-rabbit antibody.¹²⁵Precipitate containing I-CRF Collected by centrifugation, and determine the amount of radioactivity in the pellet by gamma counting. It is measured by a thermometer. When a candidate ligand inhibitor displaces CRF from CRF-BP If not, the pellet is included compared to the control without the candidate peptide added. Low radioactivity.¹²⁵Maximal inhibition of I-h / rCRF binding to CRF-BP (ie, 100 %) Is the incubation with 10 μM CRF-BP peptide ligand h / rCRF (6-33). It is defined by the amount of radioactivity remaining in the pellet after loading. Therefore, candidate ligans The binding capacity of the inhibitor is measured relative to the capacity of the standard h / rCRF (6-33). Preferably, when a ligand inhibitor is present, at least 50% inhibition is present. Exist.   Inhibition binding affinity constant (K_i) Is important; from this assay, 0.17 K for human CRF found to be +0.01 nanomolar (nM)_iIts value for Will be investigated with appropriate expectations. Therefore, hCRF K_iLower than k_iRiga with Gland binds more strongly to hCRF-BP than hCRF itself and has higher values. Gand has a relatively lower binding affinity. Therefore, hCRF-BP It is desirable to reasonably and effectively compete with hCRF for binding to Or lower K peptide_iHaving a value is more beneficial for this purpose . Preferably, the reagent has a K of about 20 nM or less._iValue, more preferably a K of about 10 nM or less_ivalue, Most preferably, less than about 5 nM K_iHas a value. hCRF (6-33) was assayed and 3.5+ 0.44nM K_iIt was found to have a value. This reagent also contains the human CRF receptor Binding affinity (ie, binding constant for inhibition greater than 1000 nM) And has a CRF agonism of less than about 0.1% of oCRF, It is considered an excellent choice for use in the method of the invention. Human CRF (9-3 3) 11 + 0.36nM K_iValue, and it also has a receptor K above 1000 nM_iTo As well as being a weaker CRF agonist, Always useful. Other similar reagents and peptides (especially residues between 19 and 28) Analogs of hCRF) are synthesized and tested in this simple manner, In these beneficial methods for increasing the effective concentration of endogenous hCRF in vivo, Can determine their effectiveness. The peptides specifically listed herein are particularly Seems to be useful. For example, (Ile^8,19,4, Asn^17,26, Met¹⁸, Glu²⁷, Ar g²⁸] -hCRF (4-28) is 1.7 + 1.2 K_iLow binding to hCRF and hCRF receptors Has affinity.   Therefore, the LIRMA assay or ACTH release and two-site ELISA as described High-throughput screening using other methods including CRF / CRF-BP Small molecules that displace CRF from the body can be identified. In the first round of screening And all potential candidates are assayed at a single dose of 10 μM. Then 10 μM Any compound that gives more than 50% inhibition at Selected. The activity of all candidates meeting this criterion is a 6 point dose response Confirmed by a second round of screening using lines. IC-50 value calculated And candidates with values ranging from 10 μM to 100 μM are further tested and Displaces CRF from the CRF / CRF-BP complex and does not interfere with antibody binding to CRF-BP. Make sure that Specific substitution of CRF is 0.2 nM instead of unlabeled CRF-BP¹²⁵I- Assays performed as described for LIRMA, except for the addition of hCRF-BP Proven in b.   Ligand inhibitors also demonstrate that bound and free CRF can be separated by detergent phase separation. Can be screened by in vitro assays that are isolated. Be concise For example, within one embodiment, the CRF-BP isolated as described above may comprise a binding buffer (50 mM In 0.02% NP-40 in phosphate buffered saline,¹²⁵I-h / rCRF and 10 μM candidates Incubate with the ligand inhibitor. 1 hour to 2 hours ink at room temperature After incubation, a surfactant (eg, octylphenoxypolyethoxyethanol) , Triton X-114^TMIs commercially available as) and vortexed By mixing. Triton X-114^TMAnd other nonionic surfactants Insoluble in water at temperatures above the cloud point of At this temperature, microscopic phase separation occurs. Below this temperature, the surfactant forms a clear micellar solution, above which And two transparent phases (one phase is depleted of surfactant and the other phase is depleted of surfactant Concentrated) is formed. Triton X-114^TMHas a cloud point temperature of 20 ° C. this So, Triton X-114^TMIs preferred. CRF with amphipathic alpha helix is Triton X-114^TMIt is more soluble in and therefore partitions to the surfactant phase. In contrast, C CRF bound to RF-BP is more soluble in aqueous solution. Therefore, Triton X-114^TMWhen Phase separation from aqueous solution separates bound and free CRF. Phase separation, centrifugation More conveniently achieved. The aqueous phase (top) is removed¹²⁵The amount of I-h / rCRF is measured Can be done. Radioactivity versus radioactivity obtained in the absence of ligand inhibitor A decrease indicates that the ligand inhibitor displaced CRF from CRF-BP.^{1 twenty five} The maximum inhibition (ie, 100%) of binding of I-h / rCRF to CRF-BP is 10 μM CRF-BP Radioactivity in aqueous phase after incubation with peptide ligand h / rCRF (6-33) Defined by the amount of Therefore, the binding capacity of the candidate ligand inhibitor is Measured for h / rCRF (6-33) capability. Preferably, the ligand inhibitor When is present, there is at least 50% inhibition.   In addition, this assay screens for general neuropeptide binding proteins. Has a wide range of applications. Some neuropeptides (eg, NPY) Has similar physical properties to Because both are very hydrophobic and α This is because it has a helix. Thus, NPY is more nonionic than aqueous solution. Surfactants (eg, Triton X-114^TM) Should be more soluble during Target NP Y or other neuropeptides are generally Triton X-114^TMPartitioned into the surfactant phase Assuming that, the above method is commonly used to Quality can be screened. Briefly, by way of example, sets from various organs The tissue is homogenized in 1% NP-40 / PBS solubilization buffer. 3000 x g particulate matter Removed by centrifugation at for 10 minutes. 50 μl aliquot from supernatant Is 500pM¹²⁵Incubate with I-labeled neuropeptide and assay It is implemented as described. Serum or plasma is also Can be used as a potential source. Unlabeled in a given concentration range (0.1 nM to 1000 nM) Neuropeptides are co-incubated with radiolabeled neuropeptides and putative binding Assess whether the protein specifically binds the radiolabeled neuropeptide. Conclusion If specificity is specific, Triton X-114^TMRadioactivity remaining in the aqueous phase after separation is reduced Less. Using this method, IC-50 values were determined for each of the neuropeptides and tissue extracts. Can be established for   In addition, this method is used to determine the neural peptide binding protein It can be screened for ligand inhibitors of the peptide. Briefly state Radiolabeled neuropeptides can be Incubate with the putter and perform the reaction as described above. These Say includes recombinant neuropeptide binding protein or receptor, or tissue Any of the crude neuropeptide binding proteins isolated from the sample can be used You.   Preferred ligand inhibitors have low affinity for the CRF receptor -Has antagonistic effect or 100-fold selection for CRF binding protein Either of them is optional. Therefore, IC-50 values in the range of 10 μM to 100 μM and And compounds with specific inhibition of the CRF / CRF-BP complex bind to the CRF receptor. Will be tested further. About ligand inhibitor CRF receptor The ability to antagonize is assessed in a cAMP production assay. This assay uses CRF A receptor that increases the level of free CRF binding to the receptor and stimulates cAMP production Compare the abilities of Gand inhibitors. The test cell line is a stable transfector Express the CRF receptor as a This assay is based on B with minor modifications. Performed according to attaglia et al. (Synapse 1: 572, 1987). Test cells were tested for various C Incubate for 1 hour at RF concentration and ligand inhibitor concentration. Cells Wash, and intracellular cAMP is And subsequently extracted into 20 mM HCl, 95% ethanol. Lysis solution freeze-dried Dried and subsequently solubilized in sodium acetate buffer. Single cAMP level Antibody kits (eg, kits from Biomedical Technologies (Stoughton, MA) ).   As an alternative to performing the competitive in vitro evaluation assays described above, ligands Inhibitors can be evaluated in binding assays using the human CRF receptor. You. Human CRF receptor and binding for such receptor and human CRF The combined assay is described in Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8967-8971, 1993 (this Is disclosed herein by reference). Reagents are released [Nle^{twenty one}, Tyr³²] Binding affinity for inhibition, assessed using oCRF Constant (K_i) Can be calculated. Preferably, the reagent is at least about 100 nM, more preferably Or more than 1000 nM receptor K_iHaving. Alternatively, rat CRF receptor The use of is satisfactory. This is because human and rat CRFs have the same This is because it has a amino acid sequence.   Additional assays using rat anterior pituitary cells to measure ACTH secretion Is performed, and the ligand inhibitor acts as a CRF agonist of the hCRF receptor. You can decide if it works. The technique used is that only the ligand inhibitor is Except for being added to the cells, it is generally as described above. Antagonist production Can be determined by performing the assay in the presence of an inducing challenge dose of CRF . The performance of ligand inhibitors makes them standard antagonists for this purpose. Objects (eg, CD-Phe¹², Nle^21,38] -rCRF (12-41) or α-helical CRF (AHC) Lugment (eg, compared to AHC (9-41) performance.   Measure CRF agonist activity and antagonist activity from the viewpoint of stimulation of ACTH secretion The in vitro assays identified above for determining hCRF (6-33) and hCRF (9-3 3). As a result of such an assay, hCRF (6-33) Biological activity of CRF agonists significantly lower than the standard oCRF considered to be 1.0 Is shown. This peptide has substantial CRF antagonist activity Not shown. This peptide has less than about 0.1% CRF agonist activity of the standard peptide Is acceptable from this point of view. The peptide hCRF (9-33) is oCRF It is also a weak CRF agonist with substantially less than 0.01% of its activity. Used The desired reagent does not bind strongly to the CRF receptor. Reagent is oCRF Should have less than about 25% of the CRF agonist activity of It is generally believed that no competitive antagonist activity should be exhibited. Preferably, The reagent is a standard peptide of the present invention [DPhe¹², Nle^21,38] -hCRF (12-41) Antagonis It should have less than 5% of its activity. However, binding to the CRF receptor As a result, the potential blocking effect is minimized and therefore It is understood that the lower the value of Should be.   In addition to providing a method of therapeutic treatment, the present invention also provides a method for injecting a mammal. Peptides for selecting more effective CRF antagonists for in vivo administration Alternatively, a method for screening other drugs is provided. This screening procedure To do so, the candidate peptide is first evaluated in the well-known assay described above. This The assay was performed from a culture of rat anterior pituitary cells with a test dose of CRF. By measuring the biological effect of the candidate peptide on inhibiting the stimulation of ACTH secretion It is done. The candidate peptide then has its K_iTo determine the hCRF -Assessed in BP competitive binding assay. K_iIs the binding affinity to hCRF-BP as described above. This is an indicator, which is an injection peptide from the site of the target cell to which the injected peptide is directed. Shows a tendency for removal of tide. Based on the evaluation of the results of these two assays, Can be selected for a CRF antagonist that is effective. This antagonist is a CRF High values in the gonism assay, and also high (CRF-BP) K_iAlso have It shows that it exhibits a relatively low binding affinity to hCRF-BP. Current experimental standards CRF antagonist [D-Phe¹², Nle^{21, 38}] -hCRF (12-41) Very good antagonist as measured by ACTH secretion from pituitary cells Has the characteristics, K_iThe value is about 60 ± 10 nM. Its (CRF-BP) K_iIs 300 ± 20nM It is. Another good CRF antagonist, namely AHC (9-41), which is the current standard Not as effective as the product, but very low K of 0.10 ± 0.036nM_iHas a value. [D-Phe^{1 Two} , Nle^{21, 38}, CML³⁷] -hCRF (12-41) performs ACTH secretion assay in pituitary cell culture Is greater than 1000 nM (CRF-BP) K_iAnd 45 ± 11 nM IC₅₀Have Was. Therefore, it is positioned higher than the current experimental standard. Therefore, Based on these screening assays, the latter peptide or this experimental standard The preparation is a peptide of choice compared to AHC (9-41), and is converted to hCRF-BP in vivo. It has a greater tendency to be more complexed and removed. Thus, this Screening assays screen newly synthesized peptides, These peptides as potential CRF antagonists for in vivo treatment It provides a valuable tool for globally assessing the relative value ofCRF Level rise   The present invention provides for the administration of a ligand inhibitor of the CRF / CRF-BP complex in the brain. Methods are provided for increasing the level of free CRF. An increase in the level of free CRF In vitro assays (eg, ELISA, stimulation of ACTH release, or stimulation of cAMP production) Can be measured by In any of these assays, the ligand inhibitor Increases in free CRF by administration of a reference ligand inhibitor (in this case, h / rCRF ( 6-33)). The minimum permissible increase is based on h / rCRF (6-33). 10% of the value of The medium value is 50%, the preferred value is 80%, and A particularly preferred value is 100%.   Within the scope of the methods described herein, the level of free CRF is 2-site ELIS for cerebrospinal fluid or other homogenates of body tissues and fluids Can be measured in A. Total CRF is first quantified as follows: ELISA plate c The gel is coated with an anti-CRF antibody (eg, protein G purified-sheep anti-CRF). Step The rate is washed and extraneous proteins (eg, casein, bovine serum Block non-binding sites on the plate with e.g. Prepared tissue samples and A standard containing a known amount of CRF is added to the wells and allowed to bind at room temperature. Conclusion After binding, the plate is washed again and a different anti-CRF antibody (eg, RC-70, Anti-human CRF antibody). RC-70 is not only obtained from different species Detects different epitopes other than sheep anti-CRF used to coat plates I do. After washing, an enzyme-conjugated antibody that detects RC-70 or its equivalent is added. Ah Alternatively, the RC-70 antibody can be conjugated to the enzyme. A preferred conjugate is horseradish peru Oxidases and alkaline phosphatases, but those skilled in the art will recognize many Different and acceptable alternatives (including radiolabels instead of enzymes) are available. Is recognized. An enzyme substrate is added and the color is developed. After the reaction, absorbance The measurement is used to quantify the amount of total CRF present in the tissue sample. For those skilled in the art A clonal antibody or antibody fragment is It will be appreciated that it can be used in place of the antibody.   In a similar manner, the plate is coated with an anti-CRF-BP antibody and the bound CRF is then Bound CRF can be quantified by ELISA with an anti-CRF antibody. The combined CRF Is specifically displaced and detected by the CRF-BP ligand α helix oCRF (9-41). Gunnar decreases. α helix oCRF (9-41) does not cross-react with RC-70 (anti-CRF antibody) So it is used for substitution. Further, the displaced CRF in the supernatant was then -Can be assayed by site ELISA. The free CRF is then in turn between the total CRF and the bound CRF. Or by a direct assay. In a direct assay, the binding complex was raised by an anti-CRF-BP monoclonal antibody. After capture, the supernatant is removed and free CRF is measured in a two-site ELISA as described above. You.   Α-helix sheep CRF, a ligand inhibitor, is present in normal individuals and Increasing free CRF levels in both brain tissues of Immer's disease patients is described herein. Is shown in A two-site ELISA was used to determine the amount of total and bound CRF. Addition of α-helical sheep CRF released all bound CRF (Fig. 2 and See Example 5).   Description for measuring the amount of total CRF, bound CRF and free CRF in tissue or cerebrospinal fluid In addition to the in vitro assays described, other procedures can be performed in vivo. To these Include MRI, PETSCAN, spectral scanning, or other similar imaging techniques Surgery, some of which are directed against CRF-BP or CRF receptors. A radiolabeled ligand is used. A preferred method is PET positron emission (position-emittin g) ligands (eg,¹¹C,¹⁸F) or a single-photon emitting ligand (eg, CRF-BP Or to the CRF receptor^{one two Three}Image analysis using I-labeled ligand) You. Free CRF levels correlate with the amount of radiolabeled ligand bound. Of free CRF level The increase is due to a decrease in binding of radiolabeled ligand to CRF-BP and CRF receptor. It will be clearer. Within this imaging technology, about 10-30% or more Elevated free CRF levels are sufficient in the context of the present invention.   In the context of the present invention, an effective amount of a ligand inhibitor of the CRF / CRF-BP complex Can be used to treat diseases or syndromes with reduced CRF levels You. CRF levels are measured directly in the cerebrospinal fluid or in the brain by imaging methods. Or by other methods (eg, cAMP production, ACTH release or 2-site ELISA) Can be measured. Such diseases or syndromes include: dementia or learning And symptoms of memory loss, obesity, chronic fatigue syndrome, atypical depression, postpartum depression, season Sexual depression (seasonal depression), hypothyroidism, post-traumatic stress syndrome, nicotine Tin withdrawal symptoms, vulnerability to inflammatory dis ease). These syndromes (obesity, chronic fatigue syndrome, and inflammatory diseases) Definition of Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disor ders (4th edition), American Psychiatric Association, Washington, D.C., 1994 (Hereinafter referred to as DSM-IV).Improve learning and memory   As described above, the present invention relates to the therapeutic use of CRF / CRF-BP complex ligand inhibitors. Methods are provided for administering an effective amount to a patient to improve learning and memory. like this Patients are identified through clinical diagnosis based on symptoms of dementia or learning and memory loss Can be done. Individuals with amnesia have impaired ability to learn new information Or cannot remember previously learned information or past events. Memory loss It is most evident in tasks that require spontaneous recall, and also This is evident when a person is provided with a stimulus to recall at a later point in time. Memory disorder Is not severe enough to cause significant impairment of social or professional functioning What And show significant changes from previous functional levels.   Dementia is a number of clinically important perceptions that represent significant changes from previous functional levels Characterized by a defect. Inability to learn new material or previous learning Memory deficits, including forgetting the subject, are needed to diagnose dementia. Remembering is formally asking the individual to record, retain, recall and recognize information. Can be more tested. Diagnosis of dementia also requires at least one cognitive impairment: Is: aphasia, apraxia, agnosia, or impaired executive function. Language, luck, respectively These deficits in movement, object recognition, and abstract thinking are associated with memory deficits Serious enough to cause deficits in professional or social functioning No difference, and no difference from previous higher functional levels.   In addition, a number of correlates of CRF levels with impaired learning and memory Biochemical tests can be used. For example, the level of free CRF in cerebrospinal fluid is Alternatively, it can be measured by RIA. Additionally or instead of this assay, Brain imaging using labeled ligands specific for the CRF-BP or CRF receptor described above It can be used to quantify free receptor or CRF-BP. Therefore, free CRF is reduced. You can know a little. Finally, a ligand specific for unbound CRF Brain imaging using chromosomes is used to directly assay the amount of free CRF in the brain. Can be   The patient's minimental status is a learning and memory minimental test Recorded in. This test determines whether patients have impaired learning and memory. Standard test used by clinicians to determine (Folstein et al., J. Psy chiatric Res. 12: 185, 1975). This exam involves a number of simple tasks and written questions. Contains. For example, the learning abilities of "anti-alliance children" include head trauma, Korsakoff disease, Or impaired in some types of amnesic patients, including patients with stroke (S quire, 1987). 10 sets of unrelated words (for example, army-table) Have the subject read. Subjects were then given the first word of each set You are asked a question to remember the second word. The measure of memory deficits is the corresponding control This is the number of words of the paired pupil recalled that correspond to the group. This is a dementia tendency Indicators of short-term working memory of a type that declines rapidly in the early stages of sleep disorders or amnesia Served.   Improvements in learning and memory are compared to (a) the work of members of the placebo group A statistically significant difference between the work of the inhibitor-treated patient; or (b) Statistically significant change in work towards normality on the appropriate scale, Constitute. This strategy is a cholinergic substance that is therapeutically useful for improving memory Has been successfully applied to the identification of Animal models or clinical cases of the disease are, by definition, And show symptoms that can be distinguished from normal controls. Therefore, effective drug therapy The measure is a reversal of symptoms that is significant, but not necessarily complete. Memory work With clinically effective “cognition-enhancing” drugs that act to improve the performance of work, Improvements can be promoted in both animal and human models of memory pathology. For example, replacement therapy in patients with Alzheimer's dementia and memory loss Recognition enhancers that act as cholinergic substances are in a category like the In an example, short-term working memory is significantly improved (Davidson and Stern, 1991). Record Another potential application to therapeutic intervention for memory deficits is the recent Long-term memory studies show age-related deficits in effectively modeled work More suggested (Forster and Lal, 1992).   In animals, several established models of learning and memory have been used to Beneficial cognitive enhancement effects of activation of F-sensitive neurons and potential anxiety-related side effects Consider the effect. The cognitive enhancement effect is based on the Morris maze (Stewart and Morris, Behavi oral Neuroscience, R.S. Saghal (IRL Press, 1993), p. 107) and the Y maze (Brits et al. , Brain Res. Bull. 6, 71 (1981)); anxiety-related effects are elevated As assessed by the elevated plus-maze test (Pellow et al., J. Neuros ci. Meth. 14: 149, 1985).   The Morris water maze is one of the most effective models of learning and memory, and Sensitive to the cognitive-enhancing effects of various pharmacological agents (McNamara and Skelton, B rain Res. Rev. 18:33, 1993). The task in the maze is to manipulate the hippocampus of the brain On the other hand, the sensitivity is particularly good. The hippocampus plays a role in spatial learning in animals and in humans It is an important area of the brain for memory enhancement. In addition, breaks in Morris water maze behavior Good predicts a compound's clinical efficacy as a cognitive enhancer. For example, Phosphoesterase inhibitors or selective muscarinic cholinergic agonis Treatments with the morris maze animal model for learning and memory, and Reverse learning deficits in a clinical population with dementia (MacNamara and Skelton, 1993; Davidson and Stern, 1991; McEntee and Crook, 1992; Dawson et al., 1992). . In addition, this animal paradigm shows the extent to which age-related defects increase (Levy et al., 1994), and And increased susceptibility of memory traces to delays or interference in preliminary testing (vulnerabili ty) (Stewart and Morris, 1993) (which is characteristic of amnestic patients) Dell.   This test is a simple spatial learning task in which the animal Placed in lukewarm water which is more opaque. Animals are in the maze and test room Learn the position of the platform in relation to the visual cues located at; Is called place learning.   As described in more detail below (see Example 6), each training on days 1-3 Fifteen minutes before, the animals receive a control solution or 0.1, 1, 5, or 25 μg Ligand inhibitor peptide h / rCRF (6-33) or h / rCRF (which Are given ICV infusion (which is an agonist at the CRF receptor). Non-peptide If an inhibitor is used, the injection volume will be adjusted accordingly. Control action Objects typically arrive on the platform within 5 to 10 seconds after 3 days of training . A measure of the memory-modulating effect of a ligand inhibitor is this shift in time. Re Gand inhibitor administration increases dose-dependent increase in synaptic CRF efficacy In addition, there is a dose-dependent increase in behavior in learning and retention. Daily trial Pre-experimental administration of h / rCRF and h / rCRF (6-33) significantly improved learning in Morris water maze test (FIG. 4, upper panel). Slightly higher to generate increased learning and memory A higher dose of CRF (6-33) was required.   The Y-maze test, based on visual discrimination, is a separate assay for learning and memory in animals. I. In this maze, the ends of the two arms of the maze are translucent plastic Behind this panel is a 40 watt light bulb. Start box The box is separated from the third arm by a manual guillotine door. On the first try Let all animals explore the maze for 5 minutes, and in each arm a food pellet Available. On the second day, a start box with each animal closed Place. When the door is opened, the animal moves along the arm and places it on both arms. Food pellets can be consumed. On the third day, glue each three Receive 6 trials at At this time, one arm is closed at the selected point With no discernible stimulus and two food pellets Available in the box. On days 4-10, the end of the arm with the diet pellet The light is illuminated, and again 10 trials are performed in groups of three. The time required for the animal to reach the diet pellet is recorded.   Below are the effects of ligand inhibitors to improve learning and memory in the Y maze Test as follows. 15 minutes before the training trial on days 4-10 of each block, Controls or 1, 5, or 25 μg of peptide ligand-in An ICV injection of the inhibitor is performed. In addition, use non-peptide ligand inhibitors If so, the dose will be adjusted accordingly. Control animals are 50% correct choice Is expected to do. A measure of the efficacy of treatment on memory is the increase in correct response. You. Correct response with daily pre-test administration of CRF (6-33) ligand inhibitor (FIG. 5).   The elevated plus maze test is a response (anxio genic response), but the situation is open to a dark enclosed space Includes space for irradiating light. Both spaces are at high altitude, and a plus sign Assembled as two runways intersecting in the form of a signal. This type of approach Evacuation is a classic test of “emotional” and produces disinhibition and stress. Very sensitive to the treatment that comes out. Animals are placed in the center of the maze, and a 5 minute test Free access to all four arms during the test. Spend in each arm Record the time spent.   Daily pre-study doses of h / rCRF by ICV infusion to increase learning and memory This also caused anxiety as indicated by the results of the elevated plus maze test. (FIG. 4, lower panel). A dose-dependent suppression of exploration was observed. in this way, For treatment of memory and learning deficits, due to reduced levels of CRF CRF receptor agonist (ie, K_i≤1nM) is a side effect For business, it is of ambiguous value. In marked contrast, ligand inhibitors Certain CRF (6-33), which has a low affinity for the CRF receptor, are elevated The anxiety behavior in the formula plus maze test did not change (FIG. 4, lower panel). Sa Furthermore, there were no apparent behavioral changes as shown by administration of h / rCRF. These de Data show that cognitive enhancement and anxiety effects can be controlled separately. These de Data also show the therapeutic value of administering ligand inhibitors of the CRF / CRF-BP complex. Show.   In humans, a way to improve learning and memory is the Wexler memory scale. Or associative memory tests. Wexler Memory scale is a widely used pencil and paper test of recognition and storage capacity. Test. In a normal population, the standard test gives an average of 100 and a standard deviation of 15. So Therefore, mild amnesia can be detected by reducing this score by 10 to 15 points, In severe amnesia, it is reduced by 20 to 30 points, etc. (Squire, 1987). Clinical interview In between, mini-mental exam, Wexler memory scale, or anti-association A series of tests, including but not limited to habits, have been applied to diagnose symptomatic memory loss. It is. These tests are designed to address common cognitive deficits and certain losses of learning / memory capacity. It provides a general sensitivity for both (Squire, 1987). Identification of dementia or amnesia Apart from the diagnosis of, these clinical devices also identify age-related cognitive decline. This cognitive decline is a consequence of the aging process within the normal limits imposed on the person's age. Reflects a consequent decrease in mental function (DSM IV, 1994). Up As noted, "improvement" in learning and memory can be, for example, a ligand inhibitor. -Given between the treatment patient and the behavior of the placebo group members or to the same patient Statistical significance between consecutive trials in the direction of normality in paired association test This is within the scope of the present invention.Decreased food intake   As described above, the present invention relates to the therapeutic use of CRF / CRF-BP complex ligand inhibitors. Methods are provided for reducing food intake through administering an effective amount to a patient. Such patients can be identified by being obese. Obese individuals are Heavier than target weight considered normal for age, gender, and height, and Objectively, the 85th or higher percentile weight index (BMI-body) of the same reference population Weight (Kg) / Height (m)^Two(Calculated as) (National Center for Health Statistics, “Obese and Overweight Adults in the United States.” Vol.11, Book BO, U.S. Government Printing Office, Washington D.C., 1983). In addition, evidence that CRF is involved in certain individuals indicates reduced levels of CRF in cerebrospinal fluid. Or by brain imaging as described above. The hypothalamus A common brain area that mediates the effects of CRF on food intake and endocrine parameters. Therefore, changes in pituitary hormone levels also reflect changes in hypothalamic CRF levels I can do it.   Decreased food intake can be attributed to delayed meal initiation and overall duration or volume of food consumption. Can be measured. Smith, `` Satiety and Problem of Motivation, '' , D.W.Pfaff (eds.), The Physiological Mechanisms of Motivation, Springer-Ve rlag, New York, 133-143, 1982. Furthermore, selection of specific nutrition under food selection situation Is useful as a supplementary measure of a particular hunger (Rozin, Adv. Study Behav. 6:21 , 1976).   There are two established animal models of appetite regulation. The first is a simple measure of food intake. And the second is the measurement of food self-selection in a cafeteria environment. First In this method, food intake is restricted for 24 hours, and then Allow access to weighed experimental food for 2 hours. Food intake is 60 minutes and 120 minutes Is measured by weighing the remaining pellets. These tests are also It can also be done in obese animals due to genetic mutations, and this can lead to overeating and disrupted nutrition ing et al., Endocrinol. 132: 1939, 1993).   In a cafeteria environment, food is consumed with macronutrients (e.g., carbohydrates, proteins). Specially prescribed in different proportions (quality, and fat), sensory triggers or after food intake Preferences for specific nutrients based on the benefits of Food choice Is, in part, altered by a wide variety of neurochemical systems. These tests are It is useful for detecting subtle changes in food intake regulation. Food intake regulation is eager or aspiring Is It strongly affects phenomena such as fuss, and impaired intake (e.g., anorexia And obesity). After establishing an animal baseline, These animals receive control solution 15 minutes before testing or 1, 5, or 25 μg Dose of peptide ligand inhibitor, or appropriate dose of non-peptide Receive an ICV injection of a second inhibitor. Food intake should be taken at an intake test or in a cafe. Measured as described for self-selection of food in a terrier environment, and the test results are Compared to baseline.   In humans, obesity is not only associated with overeating, but also on sweet foods or fats. It is also associated with the consumption of nutritionally unbalanced foods, such as disproportionately large intakes of fatty foods. obtain. (Drewnowski et al., Am. J. Clin. Nutr. 46: 442, 1987). Like this The clinical manifestation of a node is a controlled experimental food, or a quantity, mealtime and choice perspective Using a cafeteria self-selection protocol to record intake patterns from food More easily detected. (Kissileff, Neurosci. Biobehav. Rev. 8: 129, 1984 ). In these studies, after determining the baseline for each individual, food intake or A measure of self-selection in a cafeteria environment is measured. Improvements associated with obesity treatment Weight loss or loss represented by treated patients as compared to placebo group members Constitute a reduction in food intake. In addition, this strategy is We have successfully identified rotonin agonists.Diseases associated with low-level CRF   As described above, the present invention cures ligand inhibitors of the CRF / CRF-BP complex. For treating diseases associated with low-level CRF by administering therapeutically effective amounts to patients Provide a method for Such patients may have intake disorders, neuroendocrine disorders and It can be identified by diagnosis of cognitive impairment such as Tuheimer's disease. In addition, variant Depression, seasonal depression, chronic fatigue syndrome, obesity, vulnerability to inflammatory diseases, emotional Others associated with decreased CRF levels, such as post-injury stress disorder, psychostimulant withdrawal symptoms Pathophysiology reveals reduced thyroid dysfunction profile and stress system activity Often. These are due to reduced urinary free cortisol and plasma ACTH. Characteristically identified. As a result, these diseases and conditions are It may be partly resolved by repair or efficacy (Chrousos and Gold, JAM A 267: 1244, 1992).   These various disease states in humans are accompanied by CRF derangement in the brain. It is identified by a possible pituitary-adrenal axis dysregulation. Therefore, experimentally altering the CRF / pituitary-adrenal system in experimental animals More from the syndromes described above, behavioral desperation (despair) (Pepin et al., 1992), Fatigue to exercise (Rivest and Richard, 1990), obesity (Rothwell, 1989) and And hyperarousal associated with psychostimulant withdrawal symptoms (Koob et al., 1993;  The fact that the main features of Swerdlow et al., 1991) are reproduced is that endogenous CRF levels Suggests the widespread utility of drug treatments designed to normalize.   The main characteristics of seasonal depression (severe depressive disorder with seasonal pattern) Onset and remission of severe depressive symptoms at the characteristic time. Most diseases In examples, onset begins in the fall or winter and remits in the spring. Wake up with seasonal pattern Severe depression is associated with significant anergy, excessive sleep, overeating, weight gain and carbohydrates Often characterized by a craving for things, lasting at least 2 weeks . During this time, almost all activities become depressed or lose interest or pleasure. Will be   A key feature of post-traumatic stress disorder is the actual or dying condition or individual For events involving serious injury to the physical integrity of the body or others Characteristics after exposure to extreme trauma stressors, including direct personal experience Symptoms develop. The personal response to this event was intensely fearful, Helplessness or fear is included. Outside as a memory or nightmare that will not disappear even if you pay Re-experience a traumatic event that triggers severe psychological distress or menstruation Elicit a biological response. Complete symptom status for more than one month Presents a clinically significant distress or impaired social or professional function woken up.   The main characteristics of nicotine withdrawal symptoms (nicotine-induced disorders) are long-term (at least several Weekly) Use a product containing nicotine and discontinue or use it suddenly There is a characteristic withdrawal syndrome that develops after a low number. D To be diagnosed with cotin withdrawal symptoms, mental anxiety or depressed mood, insomnia, Or anger, anxiety, difficulty concentrating, restless or impatient, reduced heart rate It is necessary that at least 4 of low and appetite or weight gain apply . These symptoms may be clinically significant distress or social or occupational functioning. Cause defects.   Improvement is based on (a) baseline or pre-treatment based on the scale associated with the disease model A statistically significant change in the symptoms of the treated individual compared to the status of Statistically Significant Symptoms of Patients Treated with a Hand Inhibitor and Members of the Placebo Group Consists of any of the shape differences. Clinical cases of the disease, by definition, have normal control Symptoms that are distinct from the For depression, some depression assessment schemes Rules are used. (Klerman et al., Clinical Evaluation of Psychotropic Drugs:  Principles and Guidelines, Prien and Robinson (eds.), Raven Press, Ltd., New York, 1994). Depression assessment includes the Hamilton Depression Assessment Scale. (Hamilton Rating Scale for Depression) test is widely used . This test has also been used to assess changes in symptoms in treatment response . Other tests and evaluations are described in the DSM-IV manual. Nico For tin withdrawal symptoms and other disorders, tests to assess the severity of the disorder are available. It is described in the DSM-IV manual.Alzheimer's disease   As described above, the present invention cures ligand inhibitors of the CRF / CRF-BP complex. Method for treating Alzheimer's disease by administering to a patient in a therapeutically effective amount I will provide a. Dementia or learning and memory loss symptoms not due to other causes Based on the condition, such patients are identified by clinical diagnosis. Further In addition, it is possible to identify a patient by diagnosing brain atrophy by nuclear magnetic resonance imaging. Wear.   Decreased CRF levels have been shown to be involved in Alzheimer's disease. Affected by AD Study post-mortem brains from 10 individuals and 10 neurologically normal controls Selected for Standard regions of the frontal, parietal, temporal and occipital poles Regions were cut from fresh brain, frozen in dry ice and stored at -70 ° C before Processed by geoimmunoassay and CRF-BP assay. Cerebral cortex and sea Horse formalin-fixed samples are embedded in paraffin and subsequently sectioned with hematoxylin. Stained by immersion / eosin and silver immersion. Test stained sections from the brain of AD patients Experiments showed that a large number of neuritic plaques and neurofibrillary tangles typical of AD Although shown, nothing was shown in the control patients.   CRF and CRF-BP in the cerebral cortex of Alzheimer patients and controls Was measured. CRF-BP in rat brain, sheep brain and human plasma Were previously identified and characterized. In the cerebral cortex of the brain studied here, most of CRF-BP Minutes (> 85%) were associated with the membrane. Either control or human brain membrane of AD patients The pharmacological characteristics of solubilized CRF-BP from E. coli are the recombinant form of soluble plasma CRF-BP No difference in binding properties to CRF and ligand inhibitors compared to It turned out. In the brain of Alzheimer's patients, the frontal, parietal and temporal CRF levels in the cerebral cortex were significantly reduced compared to normal brain, but Levels in quality were only slightly reduced (FIG. 3A). In contrast, CR F-BP levels were similar in the brains of AD patients and normal control brains (FIG. 3B). These data suggest that CRF-BP is present in normal and AD brain tissue. Direct evidence, and the observed decrease in CRF levels in AD Not due to loss of CRF, but due to decreased CRF synthesis or increased degradation Suggest to get. When neurons are lost in AD, CRF-BP becomes non-CRF Localization can be preferentially localized for urones.   The ratio of complexed CRF to CRF-BP was determined using brain tissue and free pool. l) to determine the interaction between CRF and CRF-BP in human brain tissue. The properties have been determined. Using assays specific for total and bound CRF, Approximately 40% of total CRF in paracerebral cortex extract, total CRF in Alzheimer cerebral cortex extract Was found to be complexed with CRF-BP. In addition, CRF becomes CRF-BP Reversibly bound. Because of human CRF (6-33) or α-helix oCRF (9-41) This was because the processing of the tissue displaced the CRF from the CRF / CRF-BP complex (FIG. 2). This From these data, CRF-BP ligand inhibitors increase CRF free concentration This is directly shown. In addition, to process with CRF-BP inhibitor Thus, the free CRF level in AD brain is higher than the free CRF level in normal brain Rose.   Some Alzheimer's Disease Animal Models Established Focusing on Reduced Cholinergic Activity Is available. Major role of hypocholinergic in AD is well established ing. In AD, choline acetyl trans in the frontal, occipital and temporal lobes There is a significant positive correlation between the decrease in ferase activity and the decrease in CRF levels (De Souza et al., 1986). Similarly, choline acetyl trauma in these three cortices (Id) Negative correlation was observed between the decrease in phosphatase activity and the increase in the number of CRF receptors. It is. The other two neurodegenerative diseases are CRF and choline acetyltoxin in Parkinson's disease. There is a very significant correlation with the transferase activity, There is little correlation in paralysis (Whitehouse et al., 1987).   Anatomical and behavioral studies in rats indicate that CRF and cholinergic system The interaction between is proved. First, in some brain stem nuclei, CRF and acetyl Rucholinesterase is co-localized and in cholinergic neurons Some contain CRF. Second, CRF has carbachol-induced behavior (carbacol). Cole is a muscarinic cholinergic receptor antagonist) This suggests that CRF affects the cholinergic system (Crawley Et al., Peptides 6: 891, 1985). Another muscarinic cholinergic receptor Treatment with the antagonist atropine results in an increase in the CRF receptor ( DeSouza and Bartaglia, Brain Res. 397-401, 1986). Taken together, these Data show that CRF and the cholinergic system interact similarly in humans and animals It turns out that.   Scopolamine blocks the stimulation of postsynaptic receptors by acetylcholine. Are antagonists of non-selective postsynaptic muscarinic receptors . Alz focused on reducing cholinergic activity by administering scopolamine Obtain an animal model for Heimer's disease. In these animals, passive avoidance or delay Memory loss as measured by a delayed-matching-to-position test It will be easily apparent. These tests can reduce the motility or knowledge of the experimental procedure. Sense A distinction is made between reduction and amnesia or cognition-enhancing effects. In this way, scopolamine invitation Use the Morris Maze Test and Y Maze Test after conductive amnesia to And memory enhancement following administration of the ligand inhibitor. Morris In the maze, the experiment is designed essentially as described above, but on days 1-3 30 minutes before scopolamine hydrobromide injection (0.3 mg / kg) Fix it. At the dose of scopolamine at the amnesic dose, a spatial learning paradox in rats Impairs the acquisition and retention of the im and avoidance learning paradigm. Peptide Riga 1 μg, 5 μg or 25 μg of non-peptide ligand The anti-amnesic effect of shampolamine is given or given scopolamine It is measured in comparison to a non-concurrent control group. Sco using Y maze Evaluation of ligand inhibitors for reversibility of polamine-induced amnesia is described above. It is performed in the same way as the Y maze test. On days 5-10, every day 30 minutes before training Test modified to treat ip with copolamine hydrobromide (0.3 mg / kg) You. 1 μg, 5 μg or 25 μg ICV administered peptide ligand inhibitor Or non-peptide ligand inhibitor administered centrally or systemically Anti-amnesic effect of control-concurrent and scopolamine-treated controls It is measured in comparison with the group.   Several test designs have been designed to measure cognitive behavior in AD. (Gershon Et al., Clinical Evaluation of Psychotropic Drugs: Principles and Guidelines , Prien and Robinson (eds.), Raven Press, Ltd., New York, 1994, p. See 467 Teru. ) One of these tests, BCRS, focuses on Measures memory, adaptability, functionality and self-care. BCRS measures cognitive function only It is designed to determine This test and the Weschler memory scale (Wesch ler Memory Scale) and the Alzheimer's Disease- Associated-Scale) to measure the improvement after therapeutic treatment due to ligand inhibition. obtain. As mentioned above, in the Wechsler memory scale test, for example, Riga When comparing the behaviors of patients treated with the inhibitor with those in the placebo group, Or between subsequent tests performed on the same patient, If a difference is found, "improvement" in Alzheimer's disease is intended by the present invention. It is an improvement. Furthermore, scopolamine-induced amnesia in humans is used as a model system. Can be used to test the efficacy of a ligand inhibitor.Administration of ligand inhibitors   As used herein, the terms "pharmaceutically acceptable", "physiologically acceptable" And their grammatical variants refer to compositions, carriers, diluents and drugs. In this case, they shall be used interchangeably. Preferably, these substances are Mammals without undesirable physiological effects such as dizziness, stomach upset May be administered.   The patient is administered a therapeutically effective amount of a ligand inhibitor of the CRF / CRF-BP complex. Cure A therapeutically effective dose increases free CRF levels in the brain, improves learning and memory Reduce food intake, activate brain CRF neural circuitry, lower brain CRF levels Treat related diseases, treat symptoms related to Alzheimer's disease, treat obesity Treating post-partum depression, treating atypical depression, treating substance abuse withdrawal symptoms, Treating age-related memory loss, calculated to achieve any desired effect Quantity. Depending on the particular treatment, and whether the peptide ligand inhibitor or non-peptide The route of administration may vary depending on which peptide ligand inhibitor is administered. It will be apparent to those skilled in the art. The route of administration may be non-invasive or invasive. You may. Non-invasive routes of administration include oral, buccal / sublingual, rectal, nasal, (Including skin and eyes), vagina, intravesical and lung. Invasive administration route As ICV, intraarterial, intravenous, intradermal, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, intrathecal And intraocular.   Intraventricular (ICV) injections are performed in animals as follows. Hemp animals with halothane Get drunk and fix to the KOPF localizer. To two screws and dental cement made of stainless steel Thus, a guide cannula targeted to the lateral ventricle is implanted and fixed in the skull. note A 30-gauge stainless steel crab mounted in a 60 cm PE 10 tube for shooting Insert the ure through the guide until it comes out 1 mm from the tip. Flow occurs Simply raise the tube above the animal's head until gravity flow for 1 minute And inject 2 microlitres of ligand inhibitor. Other routes of administration Procedures are well known in the art.   The required dosage may vary with the particular treatment and route of administration. Generally, pepti Doligand inhibitor doses range from about 50-125 μg per 1.5 g of brain tissue or tissue. The amount is such that a final concentration of 15-38 nmol per 1.5 g is obtained. However, Depending on the size of the protein or polypeptide, use relatively large or small doses. You can also. These treatments are performed a few times a week. Maintain therapeutic effect This may require that the treatment be continuous. As mentioned above Assess CRF levels in cerebrospinal fluid or brain by imaging Monitor the patient by: In addition, as described for each treatment, Monitor patients by assessing their behavior under appropriate tests.   Therapeutic administration is under the guidance of a physician, and the pharmaceutical composition is a pharmaceutically acceptable key. Carriers contain ligand inhibitors. These carriers are in the field And typically contains non-toxic salts and buffers. Such a camera The rear is a buffer such as physiologically buffered saline or phosphate buffered saline. Buffer, glucose, mannose, sucrose, mannitol or dextran Carbohydrates, amino acids such as glycine, antioxidants, EDTA or glutachi Chelating agents such as on, adjuvants and preservatives can be included. Non-acceptable Toxic salts include acid addition salts or, for example, zinc, iron, calcium, barium, mag Metal complexes with nesium, aluminum, etc. ). Examples of such acid addition salts include hydrochloride, hydrobromic acid Salt, sulfate, phosphate, tannate, oxalate, fumarate, gluconate , Alginate, maleate, acetate, citrate, benzoate, succinate , Malate, ascorbate, tartrate and the like. Tablets with active ingredients When administered in form, tablets may contain tragacanth, corn starch or gelatin. Such as binders; disintegrators such as alginic acid; lubrication such as magnesium stearate Agent may be included. If administration in liquid form is desired, sweeteners and / or Perfume can be used, and intravenous administration in isotonic saline and phosphate buffer is also effective. obtain.   Peptides administered under the guidance of a physician are usually In the form of a pharmaceutical composition containing a conventional pharmaceutically acceptable carrier. Normal, Dosages range from about 1 to about 1000 micrograms of peptide / kg of host animal body weight per day. And often between about 100 μg and about 1 mg, but can vary up to about 10 mg. Can be converted. Treatment of subjects with these peptides may be used to reduce symptoms or Low peripheral CRF occurs in patients with Alzheimer's disease and chronic fatigue syndrome It is possible to correct the onset of adverse symptoms that are characteristic of the level. In the former case The treatment improves short-term and mid-term memory. However, appetite suppression For many of these indications, including the need to deliver peptides to the brain, Preferably, the peptide is conjugated to an agent that can penetrate the blood-brain barrier. Let Cortisol levels are increased by intravenous, intramuscular or subcutaneous injection Can increase and reduce fatigue. Treatment of a subject with these ligand inhibitors Administration to reach the brain, resulting in a rapid increase in the biologically effective concentration of free CRF. To stimulate the human respiratory system. By substance or pathological drug Treatment during medical emergencies such as cardiovascular arrest and shock The cortisol level by intravenous, intramuscular or subcutaneous injection. Can be raised. HCRF (or as needed) to promote delivery during pregnancy (An analog thereof) to give free hCRF in plasma by administering a ligand inhibitor. Increase the concentration to at least about 250 pmole / l, preferably to at least about 0.1 ng / ml. Can be. Similarly, patients with AIDS, who often have low levels of cortisol, should And thus ACTH and ACTH by such a CRF-BP blocker Cortisol can be raised.   When administering drugs with CRF or agonists of CRF, such CRF peptides Is a daily dose of about 1 to about 200 micrograms of CRF peptide per kilogram of body weight of the host animal. Can be administered. Examples of suitable agonists of CRF include U.S. Pat. No. 4,489,163, No. 4,594,329, No. 5,112,809, No. 5,235,036 and No. 5,278,14 No. 6 (the disclosures of which are incorporated herein by reference). Such agonists. When administering reagents with CRF antagonists This CRF antagonist has a peptide content of about 0.01 to about 1 kg / kg body weight of the host animal. It can be administered in an amount of 10 mg. As suitable CRF antagonists, U.S. Pat. 05, Nos. 642, 5,109,111 and 5,245,009 (the disclosures of which are incorporated herein by reference). And antagonists as disclosed in US Pat. preferable [D-Phe¹², N^21,38] -hCRF (12-41) and [D-Phe¹² , Nle^21,38, CML³⁷] -hCRF (1241). Preferred CRF agonist Is [His²⁰, Nle^{twenty one}, Leu³⁸] -hCRF, [D-Phe¹², Nle^21,38, Leu³⁶] -hCRF, [D-Pro^Four , D-Phe¹², Asp^{twenty five}, Nle^21,38] -hCRF and [D-Pro^Four, D-Phe¹², Nle^21,38, CML³⁷] -hCRF.   The following examples are intended to be illustrative and not limiting.                                 Example 1           CRF-BR The ability of ligand inhibitors to drive out CRF from           Ligand-immunoradiation assay (LIRMA) for assays   Assay in a 600 μl polypropylene centrifuge tube or 96-well plate. Implement b. First, 50 μl of purified recombinant CRF-BP (250 ng / ml) was added to 150 μl of PBS-binding buffer. Add to the buffer (50 mM sodium phosphate, 0.15 M NaCl and 0.02% NP-40). next,¹²⁵ I-h / r CRF was added to a final concentration of 200 pM, and a 10-100 μM Add 50 μl of gand inhibitor and incubate for 1 hour at room temperature. To the reaction On the other hand, 50 μl of anti-CRF-BP antibody 5144 diluted 1: 1000 in assay buffer was added to each tube. And allowed to bind for an additional hour at room temperature. Assay buffer for all tubes Adjust the total volume to 300 μl. 1% normal rabbit serum, 4% PEG, 50 mM sodium phosphate With a goat anti-rabbit (GAR) secondary antibody (20: 1) precipitated in 0.1% sodium azide. Precipitate bound complexes by adding, then incubate for 1 hour at room temperature I do. Next, centrifuge (3000 xg) at 4 ° C for 20 minutes in a Beckman GS-15R centrifuge. By antibody binding¹²⁵Collect the I-CRF precipitate. Beckman Biomer 1000 Robot Wa Aspirate the tube by using a work station, PBS and 0.02%  Wash once with NP-40 (600 μl). Next, the tube containing the pellet was Transfer to a few tubes and count with a gamma counter.   Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220, 1980 LIGAND computer program Using parameters calculated with the Vax / VMS computer system The affinity constant (Ki) value is measured. Errors represent the average standard error of the triplicate binding assay. You.                                 Example 2 CRF Data for assaying displacement of ligand inhibitors from CRF-BR -Gent phase separation   Radiolabeled 200 ng / ml human recombinant CRF-BP¹²⁵Coupling with I-h / r CRF (80pM) Incubate for 2 hours at room temperature in buffer (phosphate buffered saline, pH 7.4 / 0.02% NP-40) You. After incubation, assay buffer octylphenoxypolyethoxyethanol X-114 in octylphenoxypolyethoxyethanol (SIGMA)^TM1:10 dilution Separate bound and free CRF by adding. Triton X-114^TMIs a room It is insoluble in water at warm temperatures and separates into a detergent phase in aqueous solutions. Triton X -114^TMAfter adding, vortex the tube and immediately add 12,000 xg Centrifuge at room temperature for minutes. The detergent phase is found at the bottom of the tube and The phase remains on top. CRF as an amphipathic α helix separates and deters Event phase. However, if CRF is combined with CRF-BP, CRF / CRF -BP complex remains in the aqueous phase. Therefore, a 50 μl aliquot of the aqueous phase was transferred to a 12 × 74 mm plate. Transfer to a plastic tube and count. Measure the amount of radioactivity remaining in the supernatant .                                 Example 3                         ACTH release assay for free CRF   Four rats are decapitated and sacrificed, and the anterior pituitary is removed. Destroy the anterior pituitary gland Wash 6 times with bacterial HEPES buffer and transfer to 20 ml collagenase solution (4 mg / ml). Next, Transfer the pituitary gland in lagenase to a 25 ml Bellco dispersion flask and stir at 37 ° C for 30 minutes You. 30 minutes later, pituitary cell suspension by aspirating the pituitary with a 10 ml pipette And further incubated for 30 minutes before further grinding. Cell suspension Incubate for an additional 45 minutes and transfer the partially dispersed cells to a 50 ml sterile tube. Transfer and centrifuge at 4000 rpm for 4 minutes. The cell pellet is washed with 10 ml of neuraminidase (8 (μg / ml) and vortex. Place the suspension in a water bath for 9 minutes and re- Vortex for 4 minutes and centrifuge again. Pour out the supernatant and add BBM-P (BBM-T 2 Vortex in 25 ml (50 ml plus 2% fetal calf serum 5 ml) to remove cells. Reconfigure the let. Harvest cells by centrifugation and finally suspend the suspension with BBM-P 22 Reconstitute in ml. Next, at a density of 50-100,000 / well in a 48-well plate Plate cells and humidify CO_TwoIncubate in chamber for 2 days. Assay On the day, cells are washed once with BBM-T for stimulation with various relevant analogs.   Maximum stimulation volume h / r in the presence and absence of blocking concentration of CRF-BP (5 nM) Stimulate cells with CRF (1 nM). This concentration of CRF-BP binds to h / rCRF Reduce the amount of ACTH released from pituitary cells. This decrease was observed in the absence of CRF-BP. , Expressed as a fraction of the amount of ACTH released by 1 nM CRF. h / rCRF (1nM) Combined CRF-BP (5 nM) can be combined with a range of ligand inhibitors (e.g., CRF-BP (Typical concentrations of ligand h / rCRF (6-33) are 0.1-1000 nM). Lab. Ligand inhibitor binds to CRF-BP and converts the complex to CRF replace. This allows CRF-BP to inhibit h / rCRF-induced ACTH secretion. Inversion becomes dose dependent. The potency of CRF-BP ligand is increased by stimulation with 1 nM CRF alone. Expressed as the fraction of ACTH release obtained.                                 Example 4                 CAMP production assay to measure free CRF   Assays for detecting CRF-stimulated adenylate cyclase activity may be slightly modified. The procedure is as described above (Battaglia et al.,., 1987) except for the addition of a positive. Standard The Say mixture was prepared in DMEM buffer at 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, 1 mM IBMX (ISO Contains butylmethylxanthine). For stimulation research Cells transfected with the clone encoding the CRF receptor , Plate in a 24-well plate and add various concentrations of CRF-related peptide and Incubate with the running peptide for 1 hour at 37 ° C. After incubation Aspirate media, gently wash wells once with fresh media, and aspirate. 95% eta After lysing the cells for 16-18 hours at 20 ° C. in 300 μl of a solution of ethanol and 20 mM HCl The amount of intracellular cAMP is measured. Transfer the lysate to a 1.5 ml Eppendorf tube. Wash the wells with an additional 200 μl EtOH / HCl and wash the wash with lysate. one Pool at the beginning. The lysate is lyophilized and pH 6.2 sodium acetate buffer 500 resuspended in μl and cAMP was removed from Biomedical Technologies Inc. (Stoughton, Mass.). Measure with a single antibody kit. To evaluate the function of CRF receptor antagonist To achieve this, a single concentration of CRF or related peptide that stimulates cAMP production by 80% Degree (10^-12~Ten^-6Incubate with the competitor composition of M). Inn on cAMP The incubation conditions and measurement conditions are performed as described above.                                 Example 5                    CRF Two-site ELISA for measuring concentration               A. Preparation of brain tissue sample   Necropsy samples were weighed and homogenized in 5 ml of 10% sucrose. 1 ml of each sample at room temperature Centrifuge at 10,000 xg for 0 minutes and pellet the resulting membrane with SPEA (0.25% 50 mM sodium phosphate, pH 7.4, containing sera albumin (BSA) and 1% NP-40 , 0.1 M NaCl, 25 mM EDTA, 0.1% sodium azide). TTBS (0.5% Tw een-20, 1% NP-40, Tris-buffered saline with 1% BSA) Further extract 800 μl of cerebral cortex homogenate (in 10% sucrose) with 1 minute Vortexed between. Samples were centrifuged at 10,000 xg for 10 minutes at room temperature. above The supernatant obtained in this manner was used for “all CRF” and “bound CRF” ( Ie, CRF bound to CRF-BP) and saved for "free CRF" analysis.               B. Measurement of all CRF   Briefly, ELISA plates were incubated at 37 ° C for 2 hours at pH 9.5 with 50 mM bicarbonate. Coated with protein G purified sheep anti-CRF antibody (20μg / ml) diluted in thorium buffer did. Wash the plate once with TTBS and block with 1% casein in TBS for 1 hour at room temperature. Clicked. Add 100 μl of sample or standard to each well and allow to bind at room temperature. Was. Plates were washed 5 times with TTBS. RC-70 rabbit anti-human CRF antibody (TTBS / 1% BSA (1: 1000 dilution) was added. After 1 hour incubation at room temperature, remove the plate Wash 5 times with TTBS buffer and then wash the plate with horseradish peroxidase-conjugated goat Exposure to anti-rabbit (GAR) secondary antibody for 1 hour at room temperature. Plate, 5 times with TTBS Wash twice, and add TMB microwell peroxidase substrate solution (Kikegaard and Perry Laboratories, Inc.) was developed by the addition of 100 μl. Measure absorbance at 450 nM Was.               C. Measurement of combined CRF   Anti-human CRF-BP monoclonal antibody (in 50 mM sodium bicarbonate buffer at pH 9.5) Binding by capturing the CRF / CRF-BP complex in wells pre-coated with After measuring the combined CRF, the RC-70 antibody was essentially isolated as described above for all CRF ELISAs. Bound CRF was detected with a human CRF antibody.               D. Measurement of free CRF   After capturing the binding complex with an anti-CRF-BP monoclonal antibody, Measure free CRF. After binding of the sample material, the supernatant was washed with protein G purified sheep anti-CRF. Transfer to a new ELISA plate coated with antibody. Then assay as described above To measure all CRF levels.                                 Example 6                   Screening for ligand inhibitors   The ability of candidate ligand inhibitors to replace CRF / CRF-BP complexes with CRF And can be screened. ACTH release from cultured pituitary cells (see Example 2) Or using a suitable assay such as a two-site LIMRA (see Example 1). Measure CRF concentration and CRF-BP concentration.   In the LIMRA assay, the procedure of Example 1 is almost followed. 10 μM concentration of ligand inhibitor Bitter¹²⁵Add to reaction with h / rCRF. Candidate ligand inhibitor is CRF-B When replacing P with CRF, the pellet should be in a control without added candidate peptide. It has a lower radioactivity compared to the Candidate pep using a 6-point dose curve Rescreen the tide. Calculate the IC-50 value.   Ligand inhibitor human CRF, α-helix sheep CRF (9-41), human CRF (6-33) And sheep CRF were screened by this method against the CRF / CRF-BP complex. Predict the affinity of these peptides for the cloned human pituitary CRF receptor Using the characterized radioligand binding assay, LtK^-Mouse fibroblast Of transfectants with stable receptor translocation in membrane preparations (DeSouza, J. Neurosci. 7:88, 1987).   The results of these assays are shown in the table below. In addition, these ligand inhibitors Bitter was used in the cerebral cortex of individuals affected by Alzheimer's disease and control individuals. CRF-BP was tested.   These results indicate that human CRF, α-helical sheep CRF (9-41), and human CRF (6-33 ) Is almost equally effective in replacing the CRF / CRF-BP complex with CRF. Indicates that In contrast, sheep CRF was not effective in replacing CRF. Suffering CRF-BP in the cerebral cortex from affected or normal individuals is equivalent to the recombinant form there were. Of these three best ligand inhibitors, human CRF and α-helical sheep CRF (9-41) bound human CRF-R in much the same way. What is this In sharp contrast, human CRF (6-33) binds with 2-3 log low efficiency.                                 Example 7                      Treatment with ligand inhibitors   Five cerebral cortex samples obtained from Alzheimer patients and normal controls of the same age Five cerebral cortex samples from trolls were prepared and pooled as in Example 4. did. Total CRF, bound CRF, and free CRF concentrations were measured as described in Example 4. Specified. As shown in FIG. 2, 40% of the total CRF in a brain extract obtained from a normal individual Complexed with CRF-BP and total CRF in brain extracts from Alzheimer's disease patients 60% were complexed with CRF-BP.   The effect of high-affinity CRF-BP ligand displacing bound CRF was demonstrated by 50 nM Evaluation after monoclonal capture of CRF / CRF-BP complex in the presence of di-CRF (9-41) Valued. The displaced free CRF was analyzed by CRF ELISA using a CRF-BP monoclonal antibody. It was measured in the supernatant remaining after body capture. As shown in FIG. 2, brain tissue Treatment with Alzheimer's disease tissue by treatment with a ligand inhibitor All bound CRF was released in any of the trawl tissues. In addition, Alz The treatment of free CR by treating the cerebral cortex of Heimer disease with a ligand inhibitor F levels returned to levels found in controls of the same age.   Tissue was also treated with 50 nM of the ligand inhibitor α-helix sheep CRF (9-41). Incubated. Next, the supernatant was subjected to the two-site ELISA assay described in Example 4. Assayed for displaced CRF.                                 Example 8                             Morris Water maze test   The Morris water maze test is a simple space science that requires minimal stress and experience This is a learning task. No motivation, such as shock or reduced food intake, is required. Animals are placed in lukewarm water which has been rendered opaque by the addition of milk powder. hidden Monitor the potential time to find a platform. Animals are in the maze And learn the position of the platform relative to visible cues in the laboratory This learning is called position learning. This test is designed for spatial learning in animals and human Is particularly sensitive to hippocampal manipulation, a key brain area involved in memory consolidation in children Things.   The equipment used in this test was filled with opaque water (22 ° C to 25 ° C) to a depth of 23 cm. The pool is 46.4cm in diameter and 45.7cm in height. Top of the weighted target platform The upper 10 cm diameter part is placed 1-2 cm below the water surface. Four quadrants of the pool Are distinguished by the inner design. Put the animal in the designated quadrant of the tank Measure the time it takes to approach and climb the hidden platform; The location of the platform and platform is constant throughout the experiment. Platform After climbing to the top, let the animals rest for 20 seconds. Find the platform within 60 seconds Place the missing subject on the platform and let it rest for 20 seconds.   Rats are dosed with ligand inhibitor h / rCRF (6-33) or CRF receptor 15 minutes prior to testing. Treated by ICV injection of any of the puter agonist h / rCRF. h / rCRF (6-33) The dose was 0, 1, 15, 25, 50 or 125 μg. The dose of h / rCRF is 0, 0, 1, 1 Or 2.5 μg. 7-10 rats were treated per group. Statistical The analysis showed that the behavior after treatment with h / rCRF (6-33) (p <0.05) or CRF (p <0.05) It was confirmed that marked improvement was observed (FIG. 4). After the time has passed There was a significant improvement in behavior (p <0.0001).                                 Example 9                            Y Maze visual discrimination test   The Y-maze visual discrimination test provides a positive stress on learning with minimal stress on animals. This is a learning test that makes use of computerization. Subject is not fed and after the end of the training session Only feed. Animals may choose to not respond, but most likely In most cases, the positive enhancement properties of the diet pellets preferred by rats over normal To respond.   The Y maze contains arms of the same length (61 cm long, 14 cm wide, 30 cm high). One The arm is used as a start box and other guillotine doors It is separated from the two goal arms. On the vertical plane at the ends of the two distal arms, An 8 watt light bulb is provided. On the first day of training, two at the end of each goal arm Place the food pellet (45 mg Noyes) in a diet that is not fed to 80% of body weight. Tsu Was released into the maze for 5 minutes. On the second day, each rat puts each goal on the pellet. I made one trip under the system. On the third day, close one goal arm at the selected point , But with the goal box open, you can get two 45mg pellets, 3 animals without any visible stimulus (lights off) In a group consisting of six rats, six spatial tests were performed. 6 tests with open arms The specimen was reciprocated from left to right, and reciprocated from subject to subject. 4th to 10th In the eyes, I opened both goal arms and lit the lights at the ends of the goal arms . 1 in a group of 3 animals so that the time between tests is approximately 90 seconds The test was performed ten times a day. At the end of the training, the subject receives 15 g of laboratory diet daily in a basket. Gave.   Immediately received ICV injection of ligand inhibitor on days 4-10 immediately prior to testing . 0, 1, 5, or 25 μg of any of the ligands in groups of 7-9 rats Inhibitor h / rCRF (6-33) was given. The percent corrected response was recorded. 5 μg Rats given CRF and 25 μg CRF (6-33) receive 0 or 1 μg of ligand inhibitor. Performed statistically significantly better than the rats fed the teratology.                                 Example 10                            Elevated plus maze test   Elevated plus maze test, dark against exposed and illuminated space Predict how animals respond to proximity avoidance situations with respect to enclosed areas be able to. In the maze, lift both spaces from the ground and make them into a plus sign Construct two intersecting passages. This type of proximity avoidance situation is related to “emotional” Is a classic test that produces disinhibition (sedatives or hypnotics) and stress. It is extremely sensitive to the process to be performed. No motivation needed, animals are dark You can stay inside or go out of the open arm.   The elevated plus maze devices are four (50 cm) lifted off the floor at right angles to each other Arm (length 50 cm, width 10 cm). Two of these arms are on the wall (40 cm), and the two arms have no walls (open arms). Remove the subject Each is placed in the center of the maze, with free access to all four arms during the 5 minute test period. I got it. Photovoltaic light beam and computer interface allow each The time spent in the room was automatically recorded.   Groups of 7-10 rats were given ligand inhibitors h / rCRF (6-33) or Gave ICV injections of h / rCRF (1-41). Rats are given h / rCRF (1-41) at 0, 0.1, 1 or 25 μg was given. At doses of 1 and 25 μg of h / rCRF (1-41), They stayed statistically significantly longer, indicating an increase in anxiety (Figure 5). In sharp contrast, memory-improving doses of CRF (6-33) as well as 2-5 fold higher doses (5 (0-125 μg), no apparent change in behavior, comparable to h / rCRF (1-41) Was not produced. h / rCRF (1-41) is known to be a CRF receptor agonist. Have been. Therefore, these data are not relevant for ligand inhibitors. Efficient cognitive improvement and clear functional dissociation of anxiogenic side effects Show.                                 Example 11                              Obesity animal model   Obesity is an excess that occurs when you consume more energy than you consume. Regarding excess body fat. The combined etiology of obesity in the clinical population is overeating, abnormal lipid Xie, may be involved in insulin overload and lack of exercise. These phenomena and consequences The resulting increase in body size is caused by genetically obese rats, mice, and the brain. Animals with lesions in the lower bed area, animals that have been treated with various medications for a long time Can be used to model in animals.   Centrally administered CRF is associated with excessive body weight in genetically obese Zucker rats It produces anorexia which is effective in stopping the increase. Appetite suppression of endogenous CRF For action, using the CRF / CRF-binding protein complex or CRF (6-33) It is being elucidated recently. This ligand inhibitor is an indirect CRF agonist Acts as and increases synaptic levels of free unbound CRF in the brain. 24-hour fast The h / rCRF (6-33) was administered centrally just before feeding the fed animals for 2 hours. There is a dose-dependent suppression of greed. Compared to CRF, h / rCRF (6-33) reduces appetite The efficacy is significantly lower and the efficiency lower. In contrast to CRF, non-fasting subjects Do not change the 2-hour average intake in the sample. In another test, h / rCRF ( Anorexic doses of 6-33) are likely to be expected after central administration of CRF itself. Did not induce behavior. These results indicate that pharmacological treatment with h / rCRF (6-33) Selection by stimulating physiologically significant increases in causative CRF levels It can be seen that appetite is appropriately and moderately suppressed.   Weight gain and overeating are undesirable features of nicotine withdrawal and Deregulated biological and neurochemical for energy balance and appetite control The problem can be solved by pharmacologically targeting the target substance. Increased hunger and body Severe gain lasts at least 6 months and gains an average of 4-6 pounds in one year after quitting smoking Often. This situation occurs in more than three-quarters of smokers who quit smoking Obesity is not efficiently repaired by standard behavioral weight loss strategies. As an example of a clinical phenomenon, the weight of abstinent women may be in the normal range of caloric intake. Was in the yard, but £ 9 more than baseline 26 weeks after stopping drinking One investigator reported that Such long-term withdrawal symptoms can be a sign of smoking. Can play a major role.   Impaired appetite and weight after smoking cessation are associated with nicotine withdrawal syndrome modeled in animals. It is a reproducible component. FIG. 6 shows that the dependent induction concentration was greater than 2 weeks Nicotine was injected continuously and withdrawn from nicotine for 2 weeks after cessation 2 shows changes in body weight and food intake in laboratory rats. Chronically nicotine Administration reduced food intake and body weight gain for the vehicle-treated group To a lesser extent, subsequent nicotine withdrawal symptoms may prevent overeating and control. Normalization of body weight is induced. Nicotine replacement therapy can reduce appetite and Detoxifying against disturbed body weight and weight; Effects appear to be caused by sudden removal of nicotine . This clinical observation was based on disturbances in behavior measured 24 hours after nicotine infusion was stopped. And animals whose signs of withdrawal are alleviated by acute systemic nicotine administration Confirmed by model.   CRF-BP antagonist favors anorexia in nicotine withdrawal-induced hyperphagia In an experiment designed to demonstrate vibratory properties, two days after stopping nicotine administration H / rCRF (6-33) for independent and nicotine withdrawal subjects immediately before diet over time Was administered. FIG. 7 shows that the ligand inhibitor WrCRF (6-33) was not treated with nicotine. The appetite was not altered in the roll, but nicotine withdrawal Increased intake levels, which are significantly reduced by administering h / rCRF (6-33) It indicates that In summary, these results indicate that no food was fed. Dose of a ligand inhibitor that does not alter the appetite of animals or naturally hungry animals Benefits excessive appetite stimulated by food fasting or nicotine withdrawal It is disclosed that it is attenuated.   The foregoing has described specific embodiments of the present invention by way of example. Obviously, various modifications can be made without departing from the spirit and scope. Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バール， ウィリー ダブリュー． ジュ ニア アメリカ合衆国 カリフォルニア 92037, ラ ホヤ，バルデズ 1643 (72)発明者 ヘインリッヒ， スティーブン シー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92037, ラ ホヤ，ビア マローカ ナンバーシ ー 8611 (72)発明者 サットン， スティーブン ダブリュー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92014, デル マー，ピー．オー．ボックス 2964 （番地なし) (72)発明者 リビア， ジーン イー． エフ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92037, ラ ホヤ，ブラックゴールド ロード 9674 (72)発明者 デサウザ， エロル アメリカ合衆国 カリフォルニア 92014, デル マー，サウス レーン 4507────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, C Z, EE, FI, GE, HU, IS, JP, KG, KP , KR, KZ, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SI, S K, TJ, TM, TT, UA, UZ, VN (72) Barr, Willie W. Inventors. Ju             near             United States California 92037,               La Jolla, Valdez 1643 (72) Inventor Heinrich, Stephen C.             United States California 92037,               La Jolla, Via Maloka Numbersi             ー 8611 (72) Inventor Sutton, Stephen W.             United States California 92014,               Del Mar, P. Oh. Box             2964 (No address) (72) Inventor Libya, Gene E. F.             United States California 92037,               La Jolla, Black Gold Road             9674 (72) Inventor Desauza, Errol             United States California 92014,               Del Mar, South Lane 4507

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．脳内の遊離CRFレベルを上昇させる医薬品の製造に使用するための、CRF/C RF結合タンパク質複合体のリガンドインヒビターであって、CRF結合タンパク質 からCRFの放出を引き起こし得るか、または遊離CRFのCRF結合タンパク質への結 合を抑制し得る、リガンドインヒビター。 ２．前記リガンドインヒビターが、h/rCRF（アミノ酸６〜33）、h/rCRF（アミ ノ酸９〜33）、およびh/rCRFからなる群より選択されるペプチドである、請求項 １に記載のリガンドインヒビター。 ３．前記リガンドインヒビターがペプチドである、請求項１に記載のリガンド インヒビター。 ４．前記リガンドインヒビターが非ペプチドである、請求項１に記載のリガン ドインヒビター。 ５．学習および記憶を改善する医薬品の製造に使用するための、CRF/CRF結合 タンパク質複合体のリガンドインヒビターであって、CRF結合タンパク質からCRF の放出を引き起こし得るか、または遊離CRFのCRF結合タンパク質への結合を抑制 し得る、リガンドインヒビター。 ６．食物摂取を減少させる医薬品の製造に使用するための、CRF/CRF結合タン パク質複合体のリガンドインヒビターであって、CRF結合タンパク質からCRFの放 出を引き起こし得るか、または遊離CRFのCRF結合タンパク質への結合を抑制し得 る、リガンドインヒビター。 ７．脳内の低レベルのCRFに関連する病気を処置する医薬品の製造に使用する ための、CRF/CRF結合タンパク質複合体のリガンドインヒビターであって、CRF結 合タンパク質からCRFの放出を引き起こし得るか、または遊離CRFのCRF結合タン パク質への結合を抑制し得る、リガンドインヒビター。 ８．前記病気がアルツハイマー病である、請求項７に記載のリガンドインヒビ ター。 ９．前記病気が、慢性疲労症候群、異型鬱病、肥満症、分娩後鬱病、および加 齢性記憶喪失からなる群よれ選択されるか、あるいは遊離CRFのCRF結合タンパク 質への結合を抑制している、請求項７に記載のリガンドインヒビター。 １０．前記リガンドインヒビターがペプチドである、請求項５〜９のいずれか に記載のリガンドインヒビター。 １１．前記リガンドインヒビターが非ペプチドである、請求項５〜９のいずれ かに記載のリガンドインヒビター。 １２．前記リガンドインヒビターが薬学的に受容可能なキャリア中で投与され る、請求項５〜９のいずれかに記載のリガンドインヒビター。 １３．アルツハイマー病に関連する徴候を処置する医薬品の製造に使用するた めの、CRF/CRF結合タンパク質複合体のリガンドインヒビターであって、CRF結合 タンパク質からCRFの放出を引き起こし得るか、または遊離CRFのCRF結合タンパ ク質への結合を抑制し得る、リガンドインヒビター。 １４．肥満症を処置する医薬品の製造に使用するための、CRF/CRF結合タンパ ク質複合体のリガンドインヒビターであって、CRF結合タンパク質からCRFの放出 を引き起こし得るか、または遊離CRFのCRF結合タンパク質への結合を抑制し得る 、リガンドインヒビター。 １５．異型鬱病を処置する医薬品の製造に使用するための、CRF/CRF結合タン パク質複合体のリガンドインヒビターであって、CRF結合タンパク質からCRFの放 出を引き起こし得るか、または遊離CRFのCRF結合タンパク質への結合を抑制し得 る、リガンドインヒビター。 １６．物質乱用の禁断症状を処置する医薬品の製造に使用するための、CRF/CR F結合タンパク質複合体のリガンドインヒビターであって、CRF結合タンパク質か らCRFの放出を引き起こし得るか、または遊離CRFのCRF結合タンパク質への結合 を抑制し得る、リガンドインヒビター。 １７．分娩後鬱病を処置する医薬品の製造に使用するための、CRF/CRF結合タ ンパク質複合体のリガンドインヒビターであって、CRF結合タンパク質からCRFの 放出を引き起こし得るか、または遊離CRFのCRF結合タンパク質への結合を抑制し 得る、リガンドインヒビター。 １８．前記リガンドインヒビターがペプチドである、請求項１３〜１７のいず れかに記載のリガンドインヒビター。 １９．前記リガンドインヒビターが非ペプチドである、請求項１３〜１７のい ずれかに記載のリガンドインヒビター。 ２０．活性治療物質としての使用のために、CRF結合タンパク質からCRFの放出 を引き起こし得るか、または遊離CRFのCRF結合タンパク質への結合を抑制し得る 、リガンドインヒビター。 ２１．リガンドインヒビターをスクリーニングするための方法であって、 候補リガンドインヒビターをCRF/CRF結合タンパク質複合体とともにインキュ ベートする工程；および アッセイにより遊離CRFを測定する工程、 を包含する方法。 ２２．遊離CRFがインビトロリガンド免疫放射アッセイにより測定される、請 求項２１に記載の方法。 ２３．遊離CRFが生物学的アッセイにより測定される、請求項２１に記載の方 法。 ２４．CRFまたはCRFアナログのインビボでの活性を増強させる医薬品の製造に 使用するための、ヒトCRF結合タンパク質に対する高い親和性を有しかつヒトCRF レセプターに対する低い親和性を有する薬剤であって、CRFレセプターへの結合 に利用可能な内因性hCRFの濃度を上昇させるために十分なCRF-BPとの複合体を形 成するために効果的である、薬剤。 ２５．CRF、またはアゴニストもしくはアンタゴニストであるCRFのアナログを さらに含む、請求項２４に記載の薬剤。 ２６．前記薬剤が約19〜約28残基の間の長さのペプチドである、請求項２４に 記載の薬剤。 ２７．前記ペプチドがhCRF(9-33)である、請求項２６に記載の薬剤。 ２８．前記ペプチドがhCRF(6-33)である、請求項２６に記載の薬剤。 ２９．請求項２６に記載の薬剤であって、前記ペプチドが、配列（配列番号２ ）：Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₉-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Xaa₁₃-Xaa₁₄-Xaa₁₅-Xa a₁₆-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Xaa₂₁-Ala-Xaa₂₃-Xaa₂₄-Glu-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Xaa₂₈- Xaa₂₉-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Xaa₃₂-Xaa₃₃、あるいは、配列中のＮ末端から１〜８残基、 または配列中のＣ末端から１〜５残基、または両方を欠失することにより形成さ れるその生物学的に 活性なフラグメントを有し、ここで、Xaa₂₃がArgまたはLysであり；Xaa₂₄がAla 、Ile、ASn、Met、NleまたはLeuであり、そして他のそれぞれのXaaが独立して天 然のアミノ酸の残基である、薬剤。 ３０．各Xaaが独立してヒトCRF(1-41)のそれぞれの位置に存在する残基または その保存的置換を示す、請求項２９に記載の薬剤。 ３１．請求項２９に記載の薬剤であって、前記ペプチドが、配列（配列番号３ ）：Pro-Pro-Ile-Ser-Xaa₈-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Xaa₁₉ -Glu-Xaa₂₁-Ala-Arg-Xaa₂₄-Glu-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Xaa₂₈-Xaa₂₉-Gln-Ala-Xaa₃₂-Xaa₃₃ 、あるいは、配列中のＮ末端から１〜８残基、または配列中のＣ末端から１〜 ５残基、または両方を欠失することにより形成されるその生物学的に活性なフラ グメントを有し、ここで、Xaa₈がLeuまたはIleであり；Xaa₁₇がGluまたはAsnで あり；Xaa₁₈がVal、Met、Leu、またはNleであり；Xaa₁₉がLeuまたはIleであり； Xaa₂₁がMet、Leu、またはNleであり；Xaa₂₄がAla、Ile、またはAsnであり；Xaa_{2 6} がGlnまたはAsnであり；Xaa₂₇がLeu、Glu、またはGlnであり；Xaa₂₈がAlaまた はArgであり；Xaa₂₉がGlnまたはGluであり；Xaa₃₂がHisまたはGluであり；そし てXaa₃₃がSerまたはLeuである、薬剤。 ３２．前記ペプチドが式：（Ile^8,19,24、Asn^17,26、Met¹⁸、Glu²⁷、Arg²⁸]-h CRF(4-28)である、請求項２９に記載の薬剤。 ３３．前記ペプチドが式：（Ile^8,19,24、Asn^17,26、Met¹⁸、Glu^27,29、Arg²⁸ 、Gly³²、Leu³³]-hCRF(6-33)である、請求項２９に記載の薬剤。 ３４．前記ペプチドが式：（Asn^17,24,26、Met¹⁸、Ile¹⁹、Gln²⁷、Arg²⁸、Glu²⁹ 、Gly³²、Leu³³]-hCRF(9-33)である、請求項２９に記載の薬剤。 ３５．妊娠雌における分娩を促進する医薬品の製造に使用するための、ヒトCR F結合タンパク質に対する高い親和性を有しかつヒトCRFレセプターに対する低い 親和性を有する薬剤であって、血漿中の遊離hCRFの濃度を少なくとも約250ピコ モル／リットルのレベルに上昇させるために十分な量で存在する、薬剤。 ３６．前記薬剤がペプチドである、請求項３５に記載の薬剤。 ３７．アルツハイマー病の処置のための請求項３５に記載の薬剤であって、該 薬剤がペプチドであり、そして脳内の遊離の内因性CRFの増加の結果、短期から 中期の記憶の改善を生じるために有効な量で存在する、薬剤。 ３８．配列（配列番号３）：Pro-Pro-Ile-Ser-Xaa₈-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu -Leu-Arg-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Glu-Xaa₂₁-Ala-Arg-Xaa₂₄-Glu-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Xaa₂₈ -Xaa₂₉-Gln-Ala-Xaa₃₂-Xaa₃₃、あるいは、配列中のＮ末端から１〜８残基、また は配列中のＣ末端から１〜５残基、または両方を欠失することにより形成される その生物学的に活性なフラグメントを有するペプチドであって、ここで、Xaa₈が LeuまたはIleであり；Xaa₁₇がGluまたはAsnであり；Xaa₁₈がVal、Met、Leu、ま たはNleであり；Xaa₁₉がLeuまたはIleであり；Xaa₂₁がMet、Leu、またはNleであ り；Xaa₂₄がAla、Ile、またはAsnであり；Xaa₂₆がGlnまたはAsnであり；Xaa₂₇が Leu、Glu、またはGlnであり；Xaa₂₈がAlaまたはArgであり；Xaa₂₉がGlnまたはGl uである；Xaa₃₂がHisまたはGluであり；そしてXaa₃₃がSerまたはLeuである、ペ プチド。 ３９．hCRF(6-33)；hCRF(9-33)；[Ile^8,19,24、Asn^17,26、Met¹⁸、Glu^27,29、 Arg²⁸、Gly³²、Leu³³]-hCRF(6-33)；[Asn^17,24,26、Met¹⁸、Ile¹⁹、Glu²⁷、Arg^{2 8} 、Glu²⁹、Gly³²、Leu³³]-hCRF(9-33)；[Met^6,14,18,24、Ile^8,19,33、Asn¹⁷、H is²⁰、Arg^21,28、Lys²³、Gly²⁶、Glu^27,29、Leu³²]-hCRF(6-33)；およびhCRF-BP に対して高親和性で結合するＣ末端および／またはＮ末端短縮されたそれらのフ ラグメントからなる群より選択される、請求項３８に記載のペプチド。 ４０．哺乳動物へのインビボ投与に有効なCRFアンタゴニストを選択するため のスクリーニング方法であって、 (a)ヒトCRFレセプター（hCRF-R）を著しく活性化することなく該レセプターに 結合する各候補ペプチドの親和性、および(b)hCRF結合タンパク質（hCRF-BP）に 結合する各候補ペプチドに対する親和性を決定するために、CRFアンタゴニスト 候補ペプチドの群をスクリーニングする工程； 該親和性決定(a)および(b)の両方を各候補について比較する工程；および 該レセプターを著しく活性化することなくhCRF-Rへの結合に比較的高い親和性 を示し、そしてhCRF-BPへの結合に対して比較的低い親和性も示す、候補ペプチ ドを選択する工程、 を包含する方法。 ４１．前記第１に記載の決定(a)が、培養された下垂体細胞を用い、そしてCRF のチャレンジ用量によるACTHの分泌をブロックする効果について各候補を試験す ることにより成し遂げられる、請求項４０に記載の方法。 ４２．前記第２の決定(b)が、各候補ペプチドが、hCRF-BPとhCRF-BPに対する 公知の結合親和性を有する適切に標識された所定量のリガンドとを有する溶液中 に配置される阻害結合親和性アッセイを行うことにより成し遂げられる、請求項 ４０に記載の方法。 ４３．CRF/CRF結合タンパク質複合体のリガンドインヒビターをスクリーニン グする方法であって、 (a)水溶液中で候補リガンドインヒビターの存在下でCRFをCRF-BPと接触させる 工程； (b)該工程(a)の溶液に非イオン性界面活性剤を加える工程； (c)該水溶液から該非イオン性界面活性剤を分離する工程；および (d)該水溶液中の結合CRF量または該非イオン性界面活性剤中の遊離CRF量のい ずれかを検出し、それによって該候補リガンドインヒビターがCRF/CRF-結合タン パク質複合体を破壊するか否かを決定する工程、 を包含する方法。 ４４ 工程(b)が前記非イオン性界面活性剤の曇り点より高い温度で行われる 、請求項４３に記載の方法。 ４５．前記非イオン性界面活性剤がオクチルフェノキシポリエトキシエタノー ルである、請求項４３に記載の方法。[Claims]   1. CRF / C for use in the manufacture of pharmaceuticals that increase free CRF levels in the brain A ligand inhibitor of an RF binding protein complex, wherein the CRF binding protein Can cause the release of CRF from A ligand inhibitor that can inhibit binding.   2. The ligand inhibitor is h / rCRF (amino acids 6 to 33), h / rCRF (amino acid). No. 9-33), and a peptide selected from the group consisting of h / rCRF. 2. The ligand inhibitor according to 1.   3. 2. The ligand of claim 1, wherein said ligand inhibitor is a peptide. Inhibitor.   4. 2. The ligand of claim 1, wherein said ligand inhibitor is a non-peptide. Doin inhibitor.   5. CRF / CRF binding for use in manufacturing pharmaceuticals that improve learning and memory A ligand inhibitor of a protein complex, wherein the CRF binding protein May cause the release of or inhibit binding of free CRF to CRF binding proteins A ligand inhibitor.   6. CRF / CRF-binding tandems for use in the manufacture of pharmaceuticals that reduce food intake A ligand inhibitor of the protein complex that releases CRF from CRF-binding proteins. Or can inhibit binding of free CRF to CRF binding proteins. A ligand inhibitor.   7. Used in the manufacture of medicines to treat diseases associated with low levels of CRF in the brain A ligand inhibitor of a CRF / CRF binding protein complex for Can cause the release of CRF from the synthesized protein, or A ligand inhibitor capable of suppressing binding to protein.   8. 8. The ligand inhibitor of claim 7, wherein said disease is Alzheimer's disease. Tar.   9. The condition may be chronic fatigue syndrome, atypical depression, obesity, postpartum depression, and CRF binding protein selected from the group consisting of age-related memory loss or free CRF The ligand inhibitor according to claim 7, which suppresses binding to a substance.   10. 10. The method according to claim 5, wherein the ligand inhibitor is a peptide. 2. The ligand inhibitor according to item 1.   11. 10. The method of claim 5, wherein the ligand inhibitor is a non-peptide. Or a ligand inhibitor according to any one of the above.   12. Wherein said ligand inhibitor is administered in a pharmaceutically acceptable carrier. A ligand inhibitor according to any one of claims 5 to 9.   13. Use in the manufacture of a medicament for treating symptoms associated with Alzheimer's disease A ligand inhibitor of the CRF / CRF binding protein complex for CRF binding A CRF binding protein that can cause the release of CRF from the protein or A ligand inhibitor capable of suppressing binding to a protein.   14． CRF / CRF binding proteins for use in the manufacture of a medicament for treating obesity A ligand inhibitor of a cytoplasmic complex that releases CRF from a CRF-binding protein Or can inhibit binding of free CRF to CRF binding proteins , Ligand inhibitors.   15. CRF / CRF binding tandem for use in the manufacture of a medicament for treating atypical depression A ligand inhibitor of the protein complex that releases CRF from CRF-binding proteins. Or can inhibit binding of free CRF to CRF binding proteins. A ligand inhibitor.   16. CRF / CR for use in the manufacture of a medicinal product for treating substance abuse withdrawal symptoms A ligand inhibitor of the F-binding protein complex, the CRF-binding protein Can cause the release of CRF or binding of free CRF to CRF binding proteins A ligand inhibitor that can suppress   17． CRF / CRF binding tag for use in the manufacture of a medicament for treating postpartum depression A ligand inhibitor of a protein complex, which binds CRF from a CRF-binding protein. Can cause release or inhibit binding of free CRF to CRF binding proteins Obtain a ligand inhibitor.   18. 18. The method of any of claims 13 to 17, wherein said ligand inhibitor is a peptide. A ligand inhibitor according to any of the preceding claims.   19. 18. The method of claims 13 to 17, wherein the ligand inhibitor is a non-peptide. A ligand inhibitor according to any of the preceding claims.   20. Release of CRF from CRF binding proteins for use as active therapeutics Or can inhibit binding of free CRF to CRF binding proteins , Ligand inhibitors.   21. A method for screening for a ligand inhibitor, comprising:   Incubate candidate ligand inhibitors with CRF / CRF binding protein complex Batting; and   Measuring free CRF by an assay, A method comprising:   22. Free CRF is measured by an in vitro ligand immunoradiometric assay. 22. The method according to claim 21.   23. 22. The method of claim 21, wherein free CRF is measured by a biological assay. Law.   24. For the manufacture of pharmaceuticals that enhance the in vivo activity of CRF or CRF analogs High affinity for human CRF binding protein and human CRF for use A drug with low affinity for the receptor that binds to the CRF receptor Forms a complex with sufficient CRF-BP to increase the concentration of endogenous hCRF available to A drug that is effective to produce.   25. CRF or an analog of CRF that is an agonist or antagonist 25. The medicament of claim 24, further comprising:   26. 25. The method of claim 24, wherein the agent is a peptide between about 19 and about 28 residues in length. The drug as described.   27. 27. The agent of claim 26, wherein said peptide is hCRF (9-33).   28. 27. The agent according to claim 26, wherein said peptide is hCRF (6-33).   29. 27. The agent of claim 26, wherein the peptide has the sequence (SEQ ID NO: 2). ): Xaa_Four-Xaa_Five-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₉-Xaa_Ten-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Xaa₁₃-Xaa₁₄-Xaa_Fifteen-Xa a₁₆-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Xaa_{twenty one}-Ala-Xaa_{twenty three}-Xaa_{twenty four}-Glu-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Xaa₂₈- Xaa₂₉-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Xaa₃₂-Xaa₃₃Or 1 to 8 residues from the N-terminus in the sequence, Or by deleting 1-5 residues, or both, from the C-terminus in the sequence. Be biologically Having an active fragment, where Xaa_{twenty three}Is Arg or Lys; Xaa_{twenty four}Is Ala , Ile, ASn, Met, Nle or Leu, and each other Xaa is independently Drugs that are natural amino acid residues.   30. Each Xaa is independently a residue present at each position of human CRF (1-41) or 30. The agent of claim 29 which exhibits a conservative substitution.   31. 30. The agent of claim 29, wherein the peptide has the sequence (SEQ ID NO: 3). ): Pro-Pro-Ile-Ser-Xaa₈-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Xaa₁₉ -Glu-Xaa_{twenty one}-Ala-Arg-Xaa_{twenty four}-Glu-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Xaa₂₈-Xaa₂₉-Gln-Ala-Xaa₃₂-Xaa₃₃ Alternatively, 1 to 8 residues from the N-terminus in the sequence, or 1 to 8 residues from the C-terminus in the sequence Its biologically active flag formed by deleting 5 residues, or both. Where Xaa₈Is Leu or Ile; Xaa₁₇Is Glu or Asn Yes; Xaa₁₈Is Val, Met, Leu, or Nle; Xaa₁₉Is Leu or Ile; Xaa_{twenty one}Is Met, Leu, or Nle; Xaa_{twenty four}Is Ala, Ile, or Asn; Xaa_{Two 6} Is Gln or Asn; Xaa₂₇Is Leu, Glu, or Gln; Xaa₂₈But Ala Is Arg; Xaa₂₉Is Gln or Glu; Xaa₃₂Is His or Glu; Xaa₃₃Is Ser or Leu, the drug.   32. The peptide has the formula: (Ile^8,19,24, Asn^17,26, Met¹⁸, Glu²⁷, Arg²⁸] -h 30. The agent of claim 29 which is CRF (4-28).   33. The peptide has the formula: (Ile^8,19,24, Asn^17,26, Met¹⁸, Glu^27,29, Arg²⁸ , Gly³², Leu³³30. The agent according to claim 29, which is] -hCRF (6-33).   34. The peptide has the formula: (Asn^17,24,26, Met¹⁸, Ile¹⁹, Gln²⁷, Arg²⁸, Glu²⁹ , Gly³², Leu³³30. The agent of claim 29, which is] -hCRF (9-33).   35. Human CR for use in the manufacture of a medicament to promote delivery in pregnant females High affinity for F-binding proteins and low for human CRF receptor An affinity drug, wherein the concentration of free hCRF in plasma is at least about 250 pico A drug that is present in an amount sufficient to raise it to a mole / liter level.   36. 36. The drug of claim 35, wherein said drug is a peptide.   37. The agent of claim 35 for the treatment of Alzheimer's disease, The drug is a peptide, and from the short term, as a result of increased free endogenous CRF in the brain A drug that is present in an amount effective to produce mid-term memory improvement.   38. Sequence (SEQ ID NO: 3): Pro-Pro-Ile-Ser-Xaa₈-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu -Leu-Arg-Xaa₁₇-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Glu-Xaa_{twenty one}-Ala-Arg-Xaa_{twenty four}-Glu-Xaa₂₆-Xaa₂₇-Xaa₂₈ -Xaa₂₉-Gln-Ala-Xaa₃₂-Xaa₃₃Or 1 to 8 residues from the N-terminus in the sequence, or Is formed by deleting 1-5 residues, or both, from the C-terminus in the sequence A peptide having a biologically active fragment thereof, wherein Xaa₈But Leu or Ile; Xaa₁₇Is Glu or Asn; Xaa₁₈Are Val, Met, Leu, Or Nle; Xaa₁₉Is Leu or Ile; Xaa_{twenty one}Is Met, Leu, or Nle Xaa_{twenty four}Is Ala, Ile, or Asn; Xaa₂₆Is Gln or Asn; Xaa₂₇But Leu, Glu, or Gln; Xaa₂₈Is Ala or Arg; Xaa₂₉Is Gln or Gl u; Xaa₃₂Is His or Glu; and Xaa₃₃Is Ser or Leu, Puchido.   39. hCRF (6-33); hCRF (9-33); [Ile^8,19,24, Asn^17,26, Met¹⁸, Glu^27,29, Arg²⁸, Gly³², Leu³³] -hCRF (6-33); [Asn^17,24,26, Met¹⁸, Ile¹⁹, Glu²⁷, Arg^{Two 8} , Glu²⁹, Gly³², Leu³³] -hCRF (9-33); [Met^6,14,18,24, Ile^8,19,33, Asn¹⁷, H is²⁰, Arg^21,28, Lys^{twenty three}, Gly²⁶, Glu^27,29, Leu³²] -hCRF (6-33); and hCRF-BP C-terminal and / or N-terminal truncated fragments that bind with high affinity to 39. The peptide of claim 38, wherein the peptide is selected from the group consisting of a fragment.   40. To select effective CRF antagonists for in vivo administration to mammals Screening method,   (a) human CRF receptor (hCRF-R) without significant activation Affinity of each candidate peptide to bind, and (b) hCRF binding protein (hCRF-BP) To determine the affinity for each candidate peptide that binds, use a CRF antagonist Screening a group of candidate peptides;   Comparing both the affinity determinations (a) and (b) for each candidate; and   Relatively high affinity for binding to hCRF-R without significantly activating the receptor Candidate peptids, which also show relatively low affinity for binding to hCRF-BP The process of selecting the code, A method comprising:   41. The determination (a) according to the first, wherein the cultured pituitary cells are used and CRF Each candidate for the effect of blocking the secretion of ACTH by different challenge doses 41. The method of claim 40, wherein the method is accomplished by:   42. Said second decision (b) is that each candidate peptide has a hCRF-BP and a hCRF-BP In a solution having a predetermined amount of an appropriately labeled ligand having a known binding affinity Claims: Achieved by performing an inhibitory binding affinity assay located at 40. The method according to 40.   43. Screening ligand inhibitor of CRF / CRF binding protein complex A way to   (a) contacting CRF with CRF-BP in the presence of a candidate ligand inhibitor in an aqueous solution Process;   (b) adding a nonionic surfactant to the solution of step (a);   (c) separating the nonionic surfactant from the aqueous solution; and   (d) the amount of bound CRF in the aqueous solution or the amount of free CRF in the nonionic surfactant And thereby detecting the candidate ligand inhibitor as a CRF / CRF-binding protein. A step of determining whether to destroy the protein complex, A method comprising:   44 Step (b) is performed at a temperature higher than the cloud point of the nonionic surfactant 44. The method of claim 43.   45. The nonionic surfactant is octylphenoxypolyethoxyethanol 44. The method of claim 43, wherein